Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные различия HMS-области генома Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные различия HMS-области генома Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis"

0034Б53Б(

На правах рукописи г/'Ч

V

СУХОНОСОВ Илья Юрьевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ ЯМУ-ОБЛАСТЕЙ ГЕНОМОВ YERSINIA PESTIS И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.00.07 - микробиология 03.00.15 ~ генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

к?

Саратов - 2008

003465367

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

кандидат медицинских наук Булгакова Елена Германовна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна

кандидат медицинских наук, доцент Пронина Елена Александровна

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока»

оо

Защита состоится «21» сх>лр£л А_2009 г. в 1часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «/?-» ^Мо-рТСК 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старшин научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Три патогенных для человека вида иерсиний -Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica вызывают разные по тяжести и эпидемической значимости заболевания. Возбудитель чумы вызывает быстротечное заболевание с генерализацией процесса и летальным исходом и явился причиной нескольких пандемий, унесших миллионы человеческих жизней. Два других вида микроорганизмов вызывают энтериты разной степени тяжести. Патогенные штаммы всех трех видов содержат ведущие факторы вирулентности: хромосомную область пигментации (pgm) и плазмиду кальцийзависимости (pCad). У возбудителей чумы и псевдотуберкулеза эти генетические структуры имеют высокую степень гомологии, но при этом выявлены небольшие как видовые, так и внутривидовые различия в их структурной организации и фенотипическом проявлении. Учитывая исключительную важность этих детерминант для проявления вирулентных свойств микробов, выявление и характеристика даже небольших структурных и функциональных различий может приблизить нас к пониманию причин высокой патогенности возбудителя чумы, поможет в разработке систем молекулярного типирования и идентификации этого патогена. Основные сведения о структуре и функциональной активности ведущих детерминант патогенности получены на зарубежных штаммах. Однако на территории стран СНГ существует 42 природных очага чумы, в которых циркулируют различающиеся по фенотипу и вирулентности штаммы. Исследование геномов этих штаммов находится на начальном этапе. Поэтому сравнительное изучение структурно-функциональной организации детерминант патогенности штаммов разного происхождения с неодинаковой эпидемической значимостью и штаммов псевдотуберкулезного микроба, особенно 01 серотипа - наиболее близкой к чумному микробу эволюционной ветви, будет еще долгое время актуальным.

Область pgm Yersinia pestis (102 т.п.н.) состоит из двух регионов: «острова высокой патогенности» - оперона сидерофорзависимой системы утилизации железа и hms региона, обеспечивающего сорбцию гемина на поверхности микробной клетки [Fetherston et al., 1992]. Оба региона участвуют в обеспечении чумного микроба необходимым для жизни микроэлементом - железом. «Острова высокой патогенности» у иерсиний высококонсервативны. Гены, расположенные на «острове высокой патогенности», не кодируют белки агрессии, но необходимы для выживания и нормального размножения в организме теплокровных животных [Kutyrev V.V. et al., 1992; Heesemann et al., 1993].

Регион hms включает три функциональные области: кластер генов мембранных белков, hms оперон и ast оперон, отвечающий за утилизацию аргинина. Экспрессию hms генов, обеспечивающих сорбцию гемина, связывают со способностью чумного микроба к образованию блока преджелудка у блох и относят к факторам, способствующим трансмиссивному пути передачи патогена [Hinnebusch, B.J., R.D. Perry, T.G. Schwan, 1996]. В настоящее время основным биологическим свойством, детерминируемым этим регионом считается образование биопленки, способствующей блокообразованию. Интересно, что биопленку образуют как штаммы чумного, так и штаммы псевдотуберкулезного микроба, но способность блокировать преджелудок блох отмечается только у штаммов чумного микроба. Причины этого пока не ясны. Штаммы биоваров oriental's, medievalis, antiqua и microtus в зависимости от географического происхождения имеют некоторые

различия в структурной организации pgm области, что выражается в различной стабильности признаков пигментации (Hms) и чувствительности к пестицину (Psn), ассоциированных с pgm областью, а также в различных типах мутаций по этим признакам [Itemah, et al., 1993]. У штаммов псевдотуберкулезного микроба выявлены структурные особенности pgm области, отличающие их от классических штаммов чумного микроба, но сближающих со штаммами биовара microtus с ослабленной вирулентностью. Примером этого может служить отсутствие IS 100 элемента, ограничивающего pgm область со стороны hms оперона, приводящее к отсутствию образования Apgm мутантов, у штаммов псевдотуберкулезного микроба [Buchriesier et al., 1998] и авирулентных для человека штаммов биовара microtus [Zhou et al., 2004]. В то время как, у высоковирулентных штаммов биоваров orientalis, medievalis и antiqua pgm область фланкирована двумя IS 100 элементами, вызывающими рекомбинационный процесс с утратой всей области [Portnoy, Falkow, 1981; Fetherston et al., 1992].

Штаммы чумного микроба пяти подвидов: основного и неосновных -кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского и таласской группы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, имеют фенотипические различия, связанные с генами pgm области. Штаммы неосновных подвидов редко образуют Hms" мутанты (10"7). Штаммы основного подвида образуют такие мутанты в результате делеции всей области пигментации с частотой 10~5 [Зудина И.В., 2000]. Структурная организация hms региона штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не изучена. Выявление областей вариабельных для чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба с одной стороны, даст новые сведения об эволюции патогенных иерсиний, с другой стороны, послужит основой при разработке тест-систем для идентификации и молекулярного типирования этих патогенов. С этой точки зрения представляется важным провести видовое и внутривидовое сравнительное изучение структурной организации hms региона у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Цель работы - провести сравнительный структурно-функциональный анализ hms - областей Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis.

Задачи исследования:

1. Подобрать и охарактеризовать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения по основным признакам, ассоциированным с вирулентностью, и их генетическим детерминантам. Создать коллекцию штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis для сравнения хромосомного сегмента пигментации.

2. Выявить и охарактеризовать вариабельные области на сегменте пигментации для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с помощью метода ПЦР.

3. Определить и сравнить нуклеотидные последовательности hms оперонов и вариабельных концевых частей сегмента пигментации (ген порина) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба разного происхождения.

4. Разработать экспериментальную ПЦР систему для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения и для выявления авирулентных штаммов (клонов), утративших область пигментации.

5. Установить механизмы Hms" Psn" мутаций у вакцинного штамма Yesinia pestis EV линии НИИЭГ.

Научная новизна работы

Выявлены видовые и внутривидовые различия в стабильности сохранения признаков, ассоциированных с детерминантами вирулентности (pgm областью и pCad) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Установлено, что частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба. Эти данные свидетельствуют о том, что у штаммов чумного микроба в процессе эволюции произошла стабилизация основных детерминант вирулентности — генов области пигментации и плазмиды pCad. Обнаружена группа штаммов чумного микроба основного подвида с частотой мутаций по Hms признаку, характерной для штаммов неосновных подвидов. Показано, что снижение частоты и тип мутаций по Hms признаку у этой группы штаммов связаны со структурными особенностями краевого региона области пигментации - отсутствием одного из фланкирующих IS 100 элементов. Впервые было показано, что у штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 и 03 серотигга к Psn" фенотипу приводят разные типы мутаций. Впервые выявлены и охарактеризованы штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа с областью пигментации, фланкированной IS 100 элементами. Установлено, что ориентация IS 100 элемента и сайт встраивания его в ген порина, различны у штаммов чумного микроба основного подвида и группы штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа. Впервые установлено, что концевая часть области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа не содержит последовательности гена порина и гена сукцинилглютаматдесукцинилазы агиЕ аргининового оперона.

Впервые выявлены четыре области перспективные для разработки системы типирования методом мультилокусного секвенирования вариабельные для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Три из них расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (YP01967). Впервые выявлена область, проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях. Эта область локализована между генами hutG и YP01967.

Получены новые сведения о высокой консервативности нуклеотидных последовательностей hms оперонов у штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы, что свидетельствует о важной биологической роли этой структуры.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне получены доказательства делетирования области пигментации у вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств.

Практическая значимость работы

По результатам работы получены патенты на изобретения зарегистрированные в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464. Составлены методические рекомендации: «Способ дифференциации авирулентных

вследствие потери области пигментации и потенциально вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба», «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения», одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол №1 от 16.03.2007г., протокол №2 от 17.04.2007г., протокол №5 от 22.06.2007г. -соответственно) и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Создана коллекция штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, пригодная для проведения сравнительного анализа их hms областей.

2. Возбудители чумы и псевдотуберкулеза имеют выраженные отличия по частоте наследования основных признаков, связанных с вирулентностью. Частота потери этих признаков в 100 - 1000 раз выше у штаммов псевдотуберкулезного микроба, чем у штаммов чумного микроба.

3. Структурная организация сегмента пигментации (hutG - YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов имеет существенные видовые и внутривидовые различия. Выявлены четыре вариабельные области, которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа содержат полноценный ybt регион. Psn" мутанты у штаммов псевдотуберкулезного микроба образуются в результате трех типов мутаций.

5. Разработанные экспериментальные ПЦР системы пригодны для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и для выявления авирулентных штаммов, утративших область пигментации.

6. Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, что исключает у него спонтанную реверсию вирулентности.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006 и 2007 гг.), а так же на конференции «Молодые учёные в медицине», (IX Всероссийская научно-практическая конференции Молодые учёные в медицине посвященная 190-летию Казанского государственного медицинского университета, Казань 2004г.) и симпозиуме «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва 2004г. Выступления на конференциях (Казань, 2004 и Москва, 2004) были высоко оценены оргкомитетами с присуждением дипломов за лучший доклад. Так же результаты исследования были представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, «Инфекции, обусловленные иерсиниями» Санкт-Петербург 2006; IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва 2007; VI Всероссийского научно-практическая, конференция Москва 2007; X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье» Санкт-Петербург, 2007; VIII Межгосударственная научно-практическая конференции государств участников СНГ

Саратов 2007; Экофорум Санкт-Петербург 2008, IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств участников СНГ Волгоград, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, одна - в изданиях рекомендованных ВАК и две оформлены в виде патентов на изобретения «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.

Структура и объём диссертации

Диссертация представлена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в т.ч., одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель содержит 208 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы. Работа выполнена на 67 штаммах Yersinia pestis и 68 штаммах Yersinia pseudotuberculosis. Для работы были отобраны типичные (в соответствии с классификацией, принятой на Совещании по таксонамии и номенклатуре чумного микроба в Саратове в 1985г.) штаммы основного, алтайского, гиссарского, кавказского, удэгейского подвидов и таласской группы из соответствующих природных очагов чумы, а так же вакцинные и экспериментальные штаммы. Штаммы Yersinia pseudotuberculosis представлены в основном группами 01 и 03 серотипов. Все штаммы получены из ГКПБ «М»1 РосНИПЧИ «Микроб». Штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ получен из лаборатории препаратов против чумы и других ООН ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Методы

Микробиологические методы

Исследование свойств возбудителя чумы проводили согласно рекомендациям «Руководства по профилактике чумы» [1992].

Для выращивания и определения фенотипических признаков использовали следующие среды:

-культивирование микроорганизмов осуществляли на агаре LB;

-признак пигментации (Hms) у штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов определяли, высевая взвесь односуточной агаровой культуры исследуемого штамма на поверхность полусинтетической среды с Конго красным (среда Hmsd);

-признак кальцийзависимости определяли по методике Higuchi К. и Smith J. [1961];

-определение чувствительности к пестицину (Psn) проводили методом отсроченного антагонизма [Fredericq, 1957].

Генетические методы

Скрининг плазмидной ДНК осуществляли по методике Kado С. и Liu S.-T. [1981].

Анализ геномов микроорганизмов проводили с использованием нуклеотидных последовательностей генетической базы данных NCBI GenBank, программы Mega,

1 Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»

алгоритма BLAST. Подбор праймеров осуществляли с помощью программ DNAMAN и PrimerExpress. Аминокислотную последовательность и вторичную структуру порина определяли с помощью программы DNAMAN.

Праймеры синтезировали фосфоамидитным методом на автоматическом синтезаторе ДНК " ASM-800" (ТОО "Биоссет", Россия).

Подготовку препаратов ДНК тестируемых штаммов проводили по схеме описанной в Методических указаниях МУ 3.5.5.-1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп при работе методом ПЦР».

Полимеразную цепную реакцию проводили в микропробирках объемом 0,6 мл на программируемых термоциклерах Терцик МС 2 ("ДНК-технология", Россия) и БИС-2 ("Вектор", Россия).

Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 0,9 - 1,8 %-ном агарозном и 5% полиакриламидном гелях, который выполняли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководствах Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Для документирования полученных результатов гели сканировали с помощью системы "GelDoc 2000" ("BioRad",ClllA).

Секвенирование полученных в ПЦР ампликонов проводили на автоматическом секвенаторе «АВ1 PRISM® 3100 Genetic Analyzer».

Результаты исследований

1.Характеристика коллекции штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения по признакам, ассоциированным с основными детерминантами вирулентности

Для изучения вариабельности hms сегмента хромосомной области пигментации у двух патогеных видов иерсиний был проведен подбор штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения. В коллекцию вошли 47 штаммов чумного микроба пяти подвидов (основного, гиссарского. алтайского, кавказского, удэгейского) и таласской группы, циркулирующих на территории стран бывшего СНГ и Монголии и 68 штаммов псевдотуберкулезного микроба различных серотипов, выделенных с 1926 по 1986 г.г., в разных географических регионах. Коллекция штаммов чумного микроба включает представителей из очагов всех типов: сусликового, сурочьего, песчаночьего, пищухового и полевочьего. Коллекция штаммов псевдотуберкулезного микроба представлена двумя группами штаммов - 01 серотипа - близкой к чумному микробу эволюционной ветви и 03 серотипа, включающей «бадхызские» штаммы, таксономическое положение которых долгое время оставалось неясным и высказывались предположения об их принадлежности к виду У. pestis. Все штаммы были проверены по признакам, коррелирующим с вирулентностью: признаку пигментации, чувствительности к пестицину (для штаммов кавказского подвида и штаммов псевдотуберкулезного микроба), зависимости роста от ионов кальция при температуре 37 °С и плазмидному составу. Для изучения признака пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба была модифицирована среда Hmsd, так как на оригинальной среде штаммы псевдотуберкулезного микроба вырастали очень быстро и дифференциация Hms+ и Hms" клонов была не четкой или отсутствовала.

Сравнение экспериментальных данных по фенотипу, плазмидному скринингу и ПЦР - анализу hms оперона и ybt региона свидетельствует о том, что основные генетические детерминанты вирулентности - гены области пигментации и плазмида

кальцийзависимости у штаммов чумного микроба проявляют более высокую степень стабильности, чем у штаммов псевдотуберкулезного микроба.

У штаммов чумного микроба основного подвида по признакам пигментации и чувствительности к пестицину наблюдается частота мутаций 10° - 10"5. Их совместная утрата происходит в результате делеции области пигментации. Нами выявлена небольшая группа штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа с низкой частотой мутаций по Hms признаку, такой же, как и у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы. Мутанты по Hms признаку у этих штаммов образуются с частотой 10"7 - 10"9. Однако причины, приводящие к появлению таких мутантов, нами не установлены. Появление Psrf мутантов у штаммов кавказского подвида происходит с частотой 1(Г9. По данным Hare [1999] у штамма биовара medievalis KIM неохарактеризованные повреждения каждого из генов hms оперона появляются с частотой в сорок раз меньшей, чем делеции области пигментации, а повреждения psn гена с частотой 10"7. Как видим, внутригенные мутации hms оперона и ybt региона достаточно редкое событие для штаммов чумного микроба.

Штаммы псевдотуберкулезного микроба обладают слабой выраженностью признака пигментации. Они легко утрачивают Hms и Psn признаки в лабораторных условиях. У штаммов псевдотуберкулезного микроба непигментированные и нечувствительные к пестицину клоны образуются в результате независимых мутаций в области hms оперона и ybt региона. Штаммы псевдотуберкулезного микроба утрачивают признак пигментации с частотой 10"' до 10"2, в результате неидентифицированных нами мутаций (вероятно, точечных или небольших по протяженности). Наиболее частым (Ю-3) типом мутаций в области ybt региона также являются неидентифицированные нами мутации (вероятно, точечные или небольшие по протяженности). Двадцать шесть из сорока семи резистентных к пестицину штаммов не обнаружили повреждений при ПЦР скрининге генов ybt региона. Дополнительно у штаммов 01 серотипа образование резистентных к пестицину клонов происходит в результате утраты всего ybt региона, а у штаммов 03 серотипа с частотой 10"5- в результате протяженных делеций, захватывающих psn ген. Как видно из приведенных результатов, гены области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба в большей степени подвержены мутациям, приводящим к потере Hms и Psn признаков, чем гены штаммов чумного микроба. Более того, характер мутационных процессов, затрагивающих, большие участки этой области у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов различны.

Для второй обязательной детерминанты вирулентности - pCad также выявлены различия в стабильности сохранения плазмиды и признака кальциийзависимости у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба. Среди исследованных штаммов чумного микроба обнаружены лишь единичные, лишенные плазмиды pCad. Штаммы псевдотуберкулезного микроба легко утрачивают как признак кальцийзависимости, так и плазмиду pCad при культивировании и хранении на искусственных питательных средах (более половины изначально вирулентных исследованных нами штаммов лишены плазмиды pCad). При этом утрата признака кальцийзависимости у штаммов псевдотуберкулезного микроба происходит не только при элиминации плазмиды, но и при нарушении ее структуры.

Все вышесказанное свидетельствует об эволюционном процессе стабилизации основных детерминант вирулентности: области пигментации и плазмиды pCad у

патогенных иерсиний. Вероятно, этот факт оказался важным при освоении новых экологических ниш чумным микробом и способствовал увеличению его патогенности.

2.Генетические вариации региона /ш/С-УР01950 области пигментации у штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения

2. ¡.Тактика поиска и выявление различий в регионе кшй-УР01950 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения

Изучение структурной организации области /шЮ-УР01950 у штаммов чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба проведено в несколько этапов. На первом этапе необходимо было выявить вариабельные области региона методом ПЦР скрининга ДНК типичных штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы. На втором этапе проведен ПЦР анализ аллелей вариабельных областей на 47 штаммах чумного микроба и 68 штаммах псевдотуберкулезного микроба разного происхождения. На третьем этапе два региона, важные для экспрессии признака пигментации, - сравнили у типичных штаммов иерсиний методом определения нуклеотидных последовательностей. На последнем этапе, на базе полученных новых сведений о структурной организации /ш/С-УР01950 региона чумного и псевдотуберкулезного микробов, осуществлена разработка экспериментальных ПЦР систем для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба.

На основе нуклеотидной последовательности генома штамма С092 биовара ОпетаПэ (АЬ590842), депонированной в ОепВапк [ВисИпеБег й а1., 1999] рассчитаны 59 пар праймеров на гены /шЮ-УР01950 региона.

Для сравнения структурной организации области йшС-УР01950 выбраны 8 типичных штаммов разных подвидов - два штамма основного подвида: 231(708) (Аксайский высокогорный очаг, серый сурок), КМ 803 (А-1822) (Кызылкумский пустынный очаг, от блохи из норы большой песчанки); штаммы неосновных подвидов - два штамма алтайского подвида: КМ 683 (И-2359) (монгольская пищуха), И-3086 (полевка Брандта); штамм улэгейского подвида - И-3069 (полевка Брандта); штамм гиссарского подвида - А-1249 (арчевая полевка); штамм кавказского подвида - 1146 (обыкновенная полевка); штамм таласской группы - А-1802 (21/10) (блохи мыши полевки). В выборке присутствуют два штамма основного подвида, представляющие группы с высокой (10"5) и низкой (Ю-7) степенью частоты Нтэ мутаций (231(708) и КМ 803 (А-1822) штаммы соответственно). Двумя штаммами из разных очагов представлен и алтайский подвид. Штамм КМ 683 (И-2359) - выделен в Алтайском горном очаге пищухового типа, а штамм И-3086 - в аймаке Убурхангай (Монголия) с основным носителем - полевкой Брандта.

При ПЦР скрининге ДНК типичных штаммов чумного микроба подавляющее большинство ампликонов, образованных одноименными праймерами не различались по подвижности в агарозном геле. Выявлены только четыре четко различающиеся по размеру области у штаммов чумного микроба разного происхождения (Рисунок 1).

1 область содержащая вариабельные танлемиые повторы - (CAAGTAAT)n

2 область содержащая вариабельные танлемные повторы - ( ATA G A A A G )п

3 область содержащая ген YP0I967 с трункирующим IS 100 элементом

4 область содержащая вариабельные танлемные повторы - (СААСАТ)п

Рисунок 1. Вариабельные области fe</G-YP01950 региона у штаммов Yersinia pestis разного происхождения.

Ярко выраженные внутривидовые отличия обнаружены в области гена порина YP01967 (вариабельная область 3). Это проявилось в нарушении гена вставкой IS 100 у штаммов биоваров orientalis, medievalis, antiqua и у штамма основного подвида из Аксайского высокогорного очага в противоположность интактному гену у штаммов биовара microtus, возбудителя псевдотуберкулеза 1Р32953. а также штаммов всех неосновных подвидов, таласского и штамма основного подвида из Кызылкумского пустынного очага. Учитывая одинаковое состояние гена порина у штаммов биовара microtus. циркулирующих в угодье Ксилин Гол Китая и на Кингхай Тибетском плато и штаммов неосновных подвидов, можно было ожидать и другие признаки их сходства. Как известно, все они ферментируют рамнозу, не способны ферментировать арабинозу и редуцировать нитраты, обладают избирательной вирулентностью для лабораторных животных. Однако, второй характерной структурной особенности штаммов биовара microtus. связанной с pgm областью, вставки 1S285 в гене гипотетического протеина YP01956 у штаммов неосновных подвидов, таласской группы и штамма из Кызылкумского пустынного очага не обнаружено.

Результаты ПЦР-скрининга /ztóG-YP01950 региона референтных штаммов чумного микроба разных подвидов сопоставлены с нуклеотидными последовательностями этого региона штаммов биовара orientalis - С092. биовара medievalis - KIM. биовара antiqua - Antiqua, биовара microtus - 91001 и штамма возбудителя псевдотуберкулеза 1Р32953. Компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей штаммов чумного микроба разных биоваров показал, что вариабельные для подвидов области 1, 2 и 4 отличаются не только у штаммов разных подвидов, но и у штаммов разных биоваров.

2.2.ПЦР - анализ вариабельных областей 1 и 2 hutG-YPO¡950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба

Области 1 и 2 расположены в пространстве между геном hutG и геном порина YP01967. Этот регион анализировался с помощью праймеров HSI75 - HSI76 (размер фрагмента для штамма Y. pestis С092 - 446 п.н.) и HSI75 - HSI78 (размер фрагмента для штамма Y. pestis С092 - 872 п.н.). Праймер HS178 комплементарен последовательности ДНК. расположенной в начале гена hutG. Праймер HSI75 захватывает 11 нуклеотидов IS 100 и 10 нуклеотидов гена порина YP01967 за счет чего ампликоны с данной парой праймеров могут образовываться как у штаммов с

геном порина YP01967, трункированным 1S100, так и с интактным. Праймер HSI76 отстоит на 71 нуклеотид от гена hutG (Рисунок 2).

2 IHI j ни

hutG /' 'Г' f

-Г — ■ II II, t , -—--дшивс

i 4 >«"'»■1

KSI78 "SI 76 HSI 75

Рисунок 2. Положение праймеров, использованных для анализа 1 и 2 вариабельных областей у штаммов чумного микроба разного происхождения.

При амплификации фрагментов ДНК штаммов алтайского и улэгейского подвидов, выделенных в Убурхангае (Монголия) от полевки Брандта, с праймерами HSI75 - HSI76 образуются ампликоны одинакового размера, с ДНК остальных штаммов - ампликоны различающиеся по размеру не более чем на 100 п.п.. Ампликоны. образованные с праймерами HSI75 - HSI78, также различаются для всех подвидов чумного микроба, кроме алтайского и улэгейского подвидов из Монголии. Штамм кавказского подвида с этими праймерами образует ампликон размером около 2292 п.н., что значительно превышает аналогичный фрагмент штамма С092 биовара orientalis. Это может свидетельствовать о встраивании в область, фланкированную праймерами HSI76 - HSI78 какого-либо мобильного элемента. Ампликоны штаммов псевдотуберкулезного микроба отличались по размеру от ампликонов, образованных штаммами любых подвидов чумного микроба. Более того, большая группа штаммов псевдотуберкулезного микроба (штамм Mollaret III, «бадхызские» штаммы и штаммы, выделенные на территориях Астраханской области (Аст.2, Аст.207 - 3 серотипа, 343) не образовывала ампликоны с праймерами HSI75 - HSI76.

Анализ нуклеотидной последовательности штамма У. pestis С092 (биовар orientalis), ограниченной праймерами HSI75 - HSI78, выявил две области вариабельных тандемных повторов (VNTR). Область 1 (CAAGTAAT)4 расположена между праймерами HSI76 -HS178. область 2 (ATAGAAAG)8 расположена вне гена порина между праймерами HSI75 - HSI76. С помощью программы BLAST выявлена вариабельность этого региона у штаммов разных биоваров.

Как показывают результаты наших экспериментов и приведенные данные GenBank, вариабельные области региона /miG-YP01967 могут оказаться перспективными для идентификации и дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, типирования штаммов чумного микроба разного происхождения. Все изученные нами штаммы объединяются в группы согласно подвидам, а штаммы основного, алтайского, улэгейского подвида, дополнительно, в группы согласно очаговой принадлежности. Штаммы основного подвида разделились натри группы согласно очаговой принадлежности. Таласские штаммы и штаммы гиссарского подвида образовывали мономорфные группы из трех и шести штаммов соответственно. Штаммы алтайского подвида представлены тремя группами в соответствии с очаговой и мезоочаговой принадлежностью. Штаммы улэгейского подвида разделились на две группы: первая группа представлена штаммами из аймака Убурхангай. вторая - штаммами из Баян-Улэгейского аймака. Штаммы алтайского и улэгейского подвидов, выделенные в Монголии в аймаке Убурхангай от полевки Брандта. попадают в одну группу. Как известно, штаммы неосновных подвидов проявляют высокую степень родства и многими молекулярно-

генетическими методами типирования не дифференцируются. Поэтому использование вариабельных областей 1 и 2 для типирования штаммов неосновных подвидов чумного микроба это, пожалуй, первый эффективный опыт.

2.3.ПЦР - анализ вариабельной области 3 hutG - YP01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения

Область 3 представляет собой ген порина YP01967 поврежденный IS100 элементом у штамма У. pestis С092. Для анализа этой области у штаммов чумного микроба разного происхождения использовали три пары праймеров (IH1-IH2, IH3-IH4 и IH1-1H4). Праймеры IH2 и IH3 комплементарны областям ISI00 элемента, праймеры 1Н1 и IH4 - областям гена порина, фланкирующим место встраивания IS100 элемента (размер фрагмента для штамма С092 - 2690 п.н.) (Рисунок 3).

Ш1 III4 IH I Ш4

| IS100 | j AIS 100 1

| | YP01967 ГРОМ ^ | УРШЧ6 7

A IH 2 IH3 Б Ш2 |нз

A - ген YP01967 штаммов основного подвида

Б - ген YP01967 штаммов основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и штаммов неосновных подвидов

Рисунок 3. Структурная организация гена порина YP01967 у штаммов Yersinia pestis разного происхождения.

Штамм У. pestis 231(708) основного подвида с праймерами 1Н1- IH2 и IH3-1H4 образует специфичные ампликоны размером 787 п.н. и 796 п.н. (соответственно). В то время как, штаммы неосновных подвидов и штамм основного подвида КМ 803 (А-1822) (Кызылкумский пустынный очаг) не образует специфичные ампликоны. Однако эти штаммы образуют ампликоны размером 733 п.н. с праймерами IH1-1H4. фланкирующими IS100, интегрированный в ген порина. Длина синтезированного фрагмента ДНК соответствует суммарному размеру частей гена YP01967. ограниченных праймерами. что свидетельствует об отсутствии IS100 в данном гене. Ампликон размером 2690 п.н. (с последовательностью 1S100 элемента) синтезировался только у 231(708) штамма чумного микроба основного подвида. ПЦР

- скрининг 47 штаммов чумного микроба разного происхождения с праймерами ГН1

- 1Н4 показал, что ген YP01967 штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа интактный. Ген YP01967 у остальных исследованных штаммов основного подвида нарушен включением IS100 элемента.

Поскольку высокая частота образования Hms" мутантов у штаммов с геном порина YP01967 нарушенным 1S100 элементом связана с делецией области пигментации в результате гомологичной рекомбинации двух фланкирующих IS100 элементов, отсутствие одного из них должно резко снижать частоту возникновения Hms" мутантов, что и наблюдается у всех перечисленных штаммов с интактным геном порина.

Сопоставляя данные, полученные в наших экспериментах, с данными зарубежных исследователей, приходим к выводу, что отсутствие IS100 элемента в гене порина у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа и штаммов

биовара microtus приводит к отсутствию возможности делеции pgm области и снижает частоту Hms" мутаций до 10"7. Среди штаммов основного подвида штаммы с интактным геном обнаружены впервые.

2.4.ПЦР - анализ вариабельной области 3 hutG-YPOl95Q региона штаммов псевдотуберкулезного микроба из разных географических регионов

Вариабельность гена порина штаммов возбудителя псевдотуберкулеза изучалась в ПЦР с праймерами IHl - IH4. Были выявлены 6 штаммов, у которых образовывался фрагмент размером 2690 п.н. Это штаммы, выделенные в Алматы -А17, А2526, в Дагестане - 251Д, 141Д, 414, в Туркмении - В19. При тестировании штаммов праймерами IHl - IH2 и IH3 - IH4 специфичные ампликоны не образовывались. Мы предположили, что IS 100 элемент встраивается в ген порина псевдотуберкулезного микроба в обратной ориентации по сравнению с его ориентацией в гене порина чумного микроба. Поэтому, были рассчитаны две пары праймеров (HSI81 - IH2 и IH3 - HSI84) на концевые участки инвертированного IS 100 элемента (Рисунок 4).

Фрагменты HSI81-IH2 и IH3 - HSI84, рассчитанные для инвертированного встраивания IS 100 в сайт ТСТСТ гена порина Y. pestis С092 имеют размеры 1145 п.н. и 442 п.н. соответственно. Реальные размеры ампликонов составляли около 950 п.н. и 650 п.н. соответственно. Это предполагает разные сайты интеграции IS 100 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Предположение было подтверждено при секвенировании гена порина псевдотуберкулёзного микроба.

Большинство исследованных штаммов псевдотуберкулезного микроба с праймерами IHl - IH4 образовывали ампликоны размером 733 п.н., а, значит, они содержат интактный гена порина. Выявлена довольно многочисленная группа штаммов, у которой с праймерами IHl - IH4 ампликоны не образовывались. К этой группе штаммов относятся: штамм Mollaret III, «бадхызские» штаммы и штаммы, выделенные на территории Астраханской области (Аст.2, Аст.207 - 03 серотипа), 343 (серотип не определен). Эта же группа штаммов не образовывала ампликоны с праймерами HSI75-HSI76. Отсутствие двух перекрывающихся фрагментов при амплификации говорит о существовании довольно протяженной делеции в этой области. Поэтому штаммы анализировались с помощью дополнительных пар праймеров для выяснения размера отсутствующей области. Левая граница делеции была установлена быстро. Фрагмент ДНК, ограниченный праймерами HSI75-HSI78 включает в себя начало гена hutG. В области гена hutG перекрываются фрагменты ДНК, образованные праймерами HSI75-HS178 и HSI79-HSI80. С праймерами HSI79-HSI80 образовались ампликоны размером 714 п.н. Следовательно, в хромосоме исследуемых штаммов присутствует ген hutG гистидинового оперона.

Для определения правой границы использовали перекрывающиеся пары праймеров HSI71-HSI72, HSI73-HSI74 (на область начала гена порина YP01967); HSI69-HS170, HS167-HS168 (на область межгенного пространства YP01967- агиЕ) и HSI65-HSI66, HSI61-HSI62 (на ген агиЕ). Ни с одной из этих пар праймеров не происходила амплификация ДНК изучаемых штаммов. Только с праймерами HSI57-HSI58, HSI55-HSI56 (на область гена агиВ) ДНК тестируемых штаммов образовали специфические ампликоны размерами 755 п.н. и 619 п.н. соответственно. Следует отметить, что праймер HSI58 комплементарен области межгенного пространства агиЕ - агиВ. Таким образом, правой границей делеции является ген агиВ, а сама делеция включает ген порина и ген агиЕ. Судя по тому, что большинство штаммов с

делецией области, начинающейся от гена /шЮ, относятся к 03 серотипу, а серотип двух других штаммов не определен, можно отнести эту делению к структурным особенностям хромосомы штаммов 03 серотипа.

£ £ У. ^ ^~ 7 v. ~

1 - ген порина штаммов выделенных в Алматы. Дагестане, Туркмении, Астраханской области.

2 - ген порина характерный для большинства штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа.

3 - hutG - аги регион, характерный для штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа.

— отсутствующий фрагмент ДНК

4 - сайты посадки праймеров на область hutG - аги

Рисунок 4. Структурная организация аналога гена порина YP01967 и прилегающих к нему областей у штаммов Yersinia pseudotuberculosis выделенных в разных регионах.

До настоящего времени у штаммов возбудителя псевдотуберкулеза был выявлен только интактный ген порина. Нами впервые обнаружены штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа. несущие ген порина трункированный 15100 элементом. Мобильный элемент встроен в ген порина этих штаммов в ориентации обратной по сравнению с ориентацией в гене порина чумного микроба. Возможно, при анализе большего количества штаммов псевдотуберкулезного микроба будут обнаружены штаммы с геном порина аналогичным по структуре гену штаммов основного подвида чумного микроба. Наши данные свидетельствуют о существовании независимых эволюционных цепочек штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с интактным и нарушенным геном порина. Протяженная делеция области ИшС-агиВ у штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа и «бадхызских» штаммов подтверждает значительную эволюционную отдаленность этих штаммов от штаммов чумного микроба.

2.5.ПЦР - анализ вариабельной области 4 hutG-YPO 1950 региона у штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения

Область 4 расположена между геном гипотетического мембранного белка YP01961 и геном регуляторного белка семейства GntR YP01960. Для анализа этой области использовали праймеры HS135 - HS136 и HSI37 - HSI38. Праймер HSI35 расположен в области гена YP01960. праймер HSI36 - между генами YP01960 и YP01961 (размер фрагмента для штамма С092 - 768 п.н.) (Рисунок 5).

HS1 36 HS! 37 шиС « j YP01960

—«saiüísi-«ш-1-..........-II " —

| YPÚI96I |

HSI 38 HS1 35

Рисунок 5. Структурная организация вариабельной области 4 Yersiniapestis.

Праймер HSI37 расположен в конце гена YP01960, праймер HSI38 - в начале гена агиС (размер фрагмента для штамма С092 - 839 н.). Подвижность в 2 % агарозном геле ампликонов, образованных при ПЦР с ДНК восьми типичных штаммов чумного микроба и праймерами HSI35- HS136 была различной для группы штаммов неосновных подвидов (altaica, ulegeica, hissarica, caucasica), штамма группы talassica, штаммов основного подвида из Аксайского высокогорного очага и Кызылкумского пустынного очага. Аналогичная картина наблюдалась при ПЦР -анализе восьми типичных штаммов с праймерами HSI37 - HSI38. Разница в размере ампликонов HSI35- HSI36 и HSI37 - HSI38 одинакова для всех исследованных штаммов. Следовательно, различие в размере ампликонов связано с фрагментом ДНК, ограниченным праймерами HSI37 и HSI36. Этот фрагмент ДНК расположен и пространстве между генами YP01960 и YP01961 и в геноме штамма С092 содержит пять гексануклеотидных повторов АТСААС. Вероятно, именно различие числа тандемных повторов является причиной различного размера ампликонов у штаммов чумного микроба разного происхождения.

Разница в размерах ампликонов HS135 - HSI36 и HSI37 - HSI38 у штаммов разных подвидов небольшая. Кроме того, ампликоны, образованные с ДНК штаммов четырех неосновных подвидов, имеют одинаковую подвижность в агарозном [еле. Исследование 47 штаммов чумного микроба подтвердило невысокие дифференцирующие возможности этой области для штаммов чумного микроба. Поэтому как мишень для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба методом ПЦР эта вариабельная область имеет ограниченное применение. В тоже время, она может оказаться полезной ДНК - мишенью при типировании методом мультилокусного секвенирования. У штаммов псевдотуберкулезного микроба эта область позволяет различать три группы штаммов: штаммы 01 серотипа, «бадхызские» штаммы, штаммы 03 серотипа.

Суммируя экспериментальные данные можно заключить, что у штаммов чумного микроба разного происхождения области hms и аги оперонов довольно консервативны. При ПЦР анализе нами не выявлены структурные различия в этих регионах. Более вариабельны эти регионы у штаммов псевдотуберкулезного микроба. Так, штаммы 03 серотипа лишены области hutG-aruB. Штаммы 03 серотипа отличаются от штаммов 01 серотипа и штаммов чумного микроба также и способностью образовывать Psn" мутанты с отсутствием гена (части гена) psn. Для

штаммов 01 серотипа, в свою очередь, характерно образование Psn" мутантов за счет утраты уЫ региона. Нами установлено, что образование Apgm Hms'Psn" мутантов у штаммов неосновных подвидов, тапасской группы, а также группы штаммов основного подвида из очагов песчаночьего типа невозможно. Это объясняется отсутствием IS 100 элемента в гене порина YP01967, ограничивающим область пигментации, а также отсутствием этого элемента в других генах и межгенных пространствах перед hms опероном. Исследованные нами штаммы псевдотуберкулезного микроба, также не могут образовывать Hms'Psn' мутанты с делецией области пигментации, хотя некоторые из них содержат поврежденный IS 100 элементом ген порина. В данном случае обратная ориентация IS 100 элемента не позволяет осуществляться реципрокной рекомбинации между мобильными элементами и, как следствие, делеции области пигментации. Наиболее частыми мутациями, приводящими к изменению Hms и Psn фенотипа у штаммов псевдотуберкулезного микроба, вероятно, являются точковые мутации и небольшие делеции. Три вариабельные области, содержащие VNTR последовательности, выявлены нами в межгенных пространствах области ferfG-YP01950. Изучение распространения аллелей этих областей у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба показало возможность использования этих областей для создания генетических систем идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

З.Определенне нуклеотидных последовательностей вариабельных областей региона hutG- YP01950

3.¡.Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей гена порина YP01967 чумного и псевдотуберкулёзного микробов, выделенных в разных географических регионах

Для секвенирования генов порина использовали праймеры IH2 и IH3, комплементарные нуклеотидной последовательности IS 100 элемента, и праймеры IH1, IH4, HSI81, HSI82, HSI83, HSI84, HSI71 HSI72, комплементарные нуклеотидным последовательностям гена порина. Сиквенс гена порина осуществлен у восьми типичных штаммов К pestis пяти подвидов и таласской группы, одного штамма Y. pseudotuberculosis Аст.2618 с интактным геном и пяти штаммов К pseudotuberculosis с псевдогеном порина. Все штаммы Y. pseudotuberculosis, выбранные для секвенирования гена порина относятся к 01 серотипу.

3.1.1 .Нуклеотидная последовательность интактного гена порина и первичная структура порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

При сравнении нуклеотидных последовательностей гена порина штамма основного подвида чумного микроба из Кызылкумского пустынного очага, всех штаммов неосновных подвидов, таласской группы штаммов и штамма У. pseudotuberculosis Аст.2618 с помощью компьютерной программы Mega обнаружена их идентичность. Изучение гомологии нуклеотидной последовательности общей для экспериментальных штаммов и последовательностей, депонированных в GenBank, проведено с помощью программы BLAST. Нуклеотидные последовательности экспериментальных штаммов оказались идентичными нуклеотидным последовательностям гена порина Yersinia pestis штаммов Angola биовара antiqua; Pestoides F кавказского подвида, 91001 биовара microtus, а также штамма У. pseudotuberculosis IP32953.

Открытая рамка считывания (ОРС) интактного гена порина размером 1080 п.н. начинается с кодона ATG, определяющего синтез метионина и заканчивается стоп-кодоном ТАА (ochre кодон). Предполагаемый полипептидный продукт состоит из 360 ак. Молекулярная масса порина - 39561 Да. Это кислый белок с pi - 5,53.

В геномах всех представителей рода Yersinia содержится несколько разных генов поринов. Практически все эти порины имеют близкие размеры аминокислотных последовательностей (346 - 374 ак). Довольно высокий процент гомологии (79 - 81 %) выявлен с разными поринами патогенных и непатогенных представителей рода. Наиболее близкими оказались белки внешних мембран (порины) Yersinia intermedia АТСС 29909; Yersinia mollaretii АТСС 43969; Yersinia bercovieri АТСС 43970; Yersinia frederiksenii АТСС 33641.

3.1.2.Нуклеотидная последовательность трункированных генов порина порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

Ген порина YP01967 с встроенным IS 100 элементом занимает краевую часть области пигментации размером 3046 п.н. С помощью программы DNAMAN выявлена открытая рамка считывания (ОРС) гена порина, начинающаяся с кодона ATG и заканчивающаяся стоп-кодоном ТАА. Мобильный элемент интегрирован в сайт ТСТСТ гена порина через 870 п.н. после старта. Последовательность ТСТСТ фланкирует IS 100 элемент, т.к. при встраивании произошла ее прямая дупликация. Мобильный элемент несет на концах несовершенные инвертированные повторы протяженностью 28 п.н. В составе IS 100 элемента выявлены две, перекрывающиеся на один нуклеотид ОРС. Нуклеотидная последовательность гена порина штамма основного подвида из Аксайского высокогорного очага идентична нуклеотидной последовательности гена порина YP01967 штамма С092 биовара orientalis.

Нуклеотидные последовательности гена порина штаммов Y. pseudotuberculosis с нарушенным геном порина включают полную последовательность IS100 элемента в инвертированной ориентации (II) по сравнению с ориентацией IS 100 в гене порина штамма С092. Интеграция IS 100 элемента в ген порина у псевдотуберкулезного микроба произошла через 670 п.н. после старта в сайт - AGAAAG.

Суммируя данные по структурной организации части pgm области, несущей ген порина, можно выделить три варианта организации этого сегмента ДНК. У большинства штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа, штаммов чумного микроба с низкой эпидемической значимостью всех неосновных подвидов, таласской группы и биовара microtus, а также отдельных филогенетических линий высоковирулентных штаммов чумного микроба основного подвида и биовара antiqua ген порина находится в интактном состоянии. ОРС гена порина позволяет транслировать полипептид с молекулярной массой 39561 Да. Большинство высоковирулентных штаммов чумного микроба основного подвида, биоваров antiqua, medievalis. orientalis и некоторые филогенетические линии псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа содержат трункированные гены порина, но с различными сайтами интеграции IS 100 элементов и ориентацией. Штаммы псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа лишены протяженного сегмента ДНК, включающего гены порина и агиЕ.

3.2.Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей hms оперонов штаммов Yersinia pestis, выделенных в разных географических регионах

Нуклеотидную последовательность hms оперона (7651 п.н.) определили у типичных штаммов чумного микроба основного подвида (К pestis 231 (708), Y. pestis

KM 803 (A-l 822)), кавказского подвида (У. pestis 1146), алтайского подвида (К pestis КМ683(И-2359)), удэгейского подвида (У. pestis И-3069), гиссарского подвида (У. pestis А-1249) и штамма из Таласского высокогорного очага - Y. pestis А-1802 (21/10). При выравнивании нуклеотидных последовательностей в программе Mega выявлен высокий консерватизм оперона у штаммов пяти подвидов и таласской группы. Структура hms оперонов всех штаммов оказалась идентичной за исключением последовательности штамма кавказского подвида. У этого штамма обнаружены две нуклеотидные замены. В промоторной области hmsH гена штамма кавказского подвида выявлена единичная нуклеотидная замена А на G. Нуклеотидная замена в гене hmsV через 778 п.н. после старта уникальна и может служить генетической меткой штаммов У. pestis caucasica.

Для сравнения полученных последовательностей с генетическим банком данных использовали компьютерную программу Blast. Нуклеотидные последовательности hms оперона (Таблица 14) у штаммов всех подвидов, кроме Y. pestis subsp. caucasica, идентичны последовательности штамма KIM биовара medievalis. Штаммы С092 биовара orientalis и Antiqua биовара antiqua отличаются от штамма KIM биовара medievalis заменой Т на G через 149 нуклеотидов после страта гена hmsR. Штамм биовара microtus несет нуклеотидную замену С на Т через 523 нуклеотида после старта гена hmsR. Наибольшее количество нуклеотидных различий во всех генах оперона выявлено у штамма У. pseudotuberculosis 1Р32953 при сравнении его со штаммом KIM биовара medievalis. В гене hmsH - пять замен, в гене hmsF - три, в hmsR - четыре и в гене hmsS - одна замена.

Все замены в гене hmsH (1 - ACG/ACA {У.pseudotuberculosis /У.pestis) - Thr; 2 -GAG / GAA- Glu; 3 - ATC/ATA- Ile), в гене hmsY (1 - ACC /АСА -Thr; 3 - GTT/ GTG - Val; 4 - TTG/TTA - Leu), в гене hrrtsR (1 - CTG /TTG - Leu; 3 - CGT/CGC- Arg; 4 -АТТ/ АТС- He) привели к образованию кодонов-синонимов. В гене hmsF штамма кавказского подвида чумного микроба и pestoides F миссенс мутация СТА/САА вызвала замену нейтральной гидрофобной аминокислоты Leu на нейтральную полярную аминокислоту Gin. Замена 187 нуклеотида в гене hmsR у штаммов биоваров orientalis и antiqua (GTC/GGC), привела к замене аминокислоты Val на Gly (обе нейтральные гидрофобные). В гене hmsS замена нуклеотида А на G в триплете GTC приводит к замене одной нейтральной гидрофобной аминокислоты на другую (изолейцин на валин). Выявленные нуклеотидные замены, различающие штаммы биоваров orientalis, medievalis, microtus и штаммы кавказского подвида, предполагают возможность использования вариабельных областей hms оперона для создания системы типирования методом мультилокусного секвенирования.

Как видим, внутривидовые различия hms оперона чумного микроба невелики, и во всех случаях происходит замена одной нейтральной аминокислоты на другую. Оперон hms чумного микроба отличается единичными нуклеотидными заменами во всех генах от hms оперона псевдотуберкулезного микроба, но практически все замены образуют кодоны-синонимы, что не должно приводить к изменению способности сорбировать кислые красители чумного микроба. Поэтому остается не выясненным вопрос о том, что приводит к слабой пигментсорбирующей способности у штаммов псевдотуберкулезного микроба и высокой частоте мутаций, приводящих к утрате Hms фенотипа и отсутствию способности блокировать преджелудок блох.

4.Разработка экспериментальных ПЦР систем для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения

4. ¡.Мультиплексная ПЦР система для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения

При разработке мультиплексной ПЦР системы для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения мы выбрали ДНК - мишени из двух областей генома обязательных для проявления вирулентных свойств.

В качестве первой ДНК-мишени выбран ген порина УР01967, так как структурные особенности этого гена в большинстве случаев позволяют дополнительно различать штаммы основного подвида с универсальной вирулентностью и штаммы неосновных подвидов с избирательной вирулентностью. Отсутствие 18100 элемента в гене порина исключает возможность делетирования области пигментации, а, следовательно, резко снижает частоту образования авирулентных клонов. Образование точечных мутантов по генам острова патогенности явление чрезвычайно редкое (частота - менее 10"9), поэтому штаммы с интактным геном можно всегда считать потенциально вирулентными. Для конструирования мультиплексной ПЦР использовали праймеры 1Н1 и 1Н4, фланкируюшие 18100, встроенный в ген УР01967 у штаммов основного подвида. Образующийся в ПЦР с ДНК вирулентных штаммов ампликон имеет размер 2690п.н. Авирулентные штаммы основных подвидов с праймерами 1Н1 - 1Н4 ампликонов не образуют, т.к. не содержат последовательности нуклеотидов, комплементарной праймеру 1Н4. Штаммы неосновных подвидов и штаммы основного подвида из Кызылкумского пустынного очага с этими праймерами образуют ампликон размером 733 п.н.

Специфичность ампликонов подтверждена методом секвенирования. Таким образом, предлагаемая пара праймеров позволяет различать потенциально вирулентные и авирулентные штаммы основного подвида; потенциально вирулентные штаммы неосновных подвидов и штаммы из Кызылкумского пустынного очага основного подвида по наличию или отсутствию области пигментации.

В качестве второй ДНК - мишени тестировались гены родоспецифичной плазмиды кальцийзависимости, которая имеет высокую степень гомологии у патогенных иерсиний. Однако даже внутри вида К резШ имеются различия структурной организации плазмиды. Чтобы определить вторую область для тестирования в качестве ДНК-мишени был проведен компьютерный анализ известных нуклеотидных последовательностей плазмиды рСас! штаммов чумного микроба разных биоваров. Поиск второй пары праймеров для мультиплексной ПЦР был предпринят в области генов усрЫ и /сгН, имеющих одинаковую структуру у всех штаммов чумного микроба. Подходящая пара праймеров не комплементарная паре праймеров 1Н1 и 1Н4, обозначенная 1сг7-1сгб, обнаружена в области гена 1сг\\ и инициирует образование специфичного ампликона размером 262 п.н. Специфичность ампликона подтверждена методом секвенирования. Эффективность мультиплексной ПЦР проверена на 47 штаммах У. реэСи разных подвидов. Параллельно все штаммы протестированы праймерами на внутренние гены области пигментации (ЬпиБ и рэп) и на плазмидный состав. Во всех случаях наличие

ампликонов в мультиплексной ПЦР коррелировало с наличием плазмиды pCad и наличием ампликонов генов hmsS и psn, а также вирулентностью штамма. Сочетание двух пар праймеров, рассчитанных на гены YP01967 и IcrW, позволяет определять наличие или отсутствие двух обязательных детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды кальцийзависимости.

4.2.Разработка ПЦР для дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба

Поиск пары праймеров для выявления делеции области пигментации проведен в регионах, граничащих с IS 100 элементом, оставшимся после делетирования области пигментации. Подходящая пара праймеров IH1-IY4 с ДНК штаммов (клонов) чумного микроба, утративших область пигментации, образует ампликон размером 2468 п.н. Этот ампликон образован фрагментом гена YP01967 (196 п.н.), IS 100 элементом (1949 п.н.) и фрагментом YP01898 гена-модулятора вирулентности (322 п.н.).

Специфичность ПЦР с праймерами IH1-IY4 определяли на ДНК штамма К pestis 231Apgm, отсутствие области пигментации которого было установлено ранее с помощью праймеров IH1 - IH4 и праймеров на внутренние гены области пигментации (hmsS и psn).

Эффективность выявления авирулентных штаммов чумного микроба изучена на 18 вакцинных, кандидатов в вакцинные и авирулентных штаммах, депонированных в ГКПБ «Микроб». Все восемнадцать штаммов были проверены на наличие признака пигментации. Штаммы, лишенные области пигментации, были бесцветными, а контрольный - К pestis 231(708) и штаммы TWJ, 707 (Касуга) (они имеют в своем геноме область пигментации) на HmsD среде приобретали ярко красное окрашивание. Кандидаты в вакцинные штаммы TWJ, 707 (Касуга) авирулентны в результате отсутствия плазмиды кальцийзависимости. Далее штаммы анализировали на наличие генов области пигментации (hms оперона и ybt региона) восемью парами праймеров. Отсутствие ампликонов со всеми парами праймеров у всех штаммов, которые на среде Hmsd оставались не окрашенными, подтвердило делетирование у них области пигментации.

Для определения специфичности ампликонов IH1 - IY4 было проведено секвенирование ампликона штамма EV линии НИИЭГ. Сиквенс ампликона показал, что в его состав входят: фрагмент гена YP01967 (196 п.н.), IS 100 элемент (1952 п.н.), ограничивающий область пигментации со стороны ybt региона и фрагмент YP01898 гена-модулятора вирулентности (320 п.н.) идентичные таковым у штамма биовара orientalis - С092. Таким образом, ПЦР с праймерами IH1 - IY4 специфично и эффективно выявляет авирулентные штаммы (клоны) чумного микроба у которых произошла делеция области пигментации.

ПЦР система, для выявления мутантов с делецией области пигментации может быть успешно применена для изучения опасности (безвредности) вакцинных штаммов, полученных много лет назад, когда подтверждение авирулентных свойств штамма на генетическом уровне было невозможно. Тем более что в литературных источниках (даже относительно новых), встречаются противоречивые сведения о биологической безопасности вакцинных штаммов, которые в настоящее время используются для вакцинации людей.

На основании ПЦР анализа восьми генов hms оперона и ybt региона области пигментации, а также с помощью ПЦР, выявляющей делеции области пигментации и

определения нуклеотидной последовательности ампликона IH1-IY4 было установлено, что механизм образования вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ и других исследованных вакцинных штаммов заключается в делеции области пигментации с сохранением правого фланкирующего IS100 элемента. Неоспоримое доказательство отсутствия области пигментации у мутантных штаммов получено при постановке ПЦР с праймерами IH1-IY4 комплементарными нуклеотидным последовательностям, находящимся непосредственно за областью пигментации с обеих её сторон. С этой парой праймеров мутантные штаммы, но не вирулентный, образовали ампликон размером 2468 п.н., соответствующим суммарной длине IS100 элемента и прилегающих фрагментов ДНК до последовательностей, комплементарных праймерам IH1 и IY4, что подтверждено определением нуклеотидной последовательности ампликона. Потеря з/бг-региона, входящего в состав области пигментации, резко снижает способность чумного микроба выживать в условиях макроорганизма и делает штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ авирулентным и, следовательно, допускает применение его в качестве живой вакцины.

В ГКПБ «М» института «Микроб» имеется экспериментальный штамм EV НИИЭГ 131, заявленный как вирулентный ревертант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Наши исследования этого штамма с помощью праймеров IH1-IY4 и праймеров на гены hms и ybt регионов показали, что у него сохранена область пигментации. На среде Hmsd этот штамм образовывал пигментированные и непигментированные колонии. Авторы штамма отмечали, что одновременно с реверсией вируленности, у него появлялась зависимость от лейцина и восстановилась способность к расщеплению глицерина. Наши эксперименты подтвердили наличие этой способности у штамма ревертанта. Штамм EV относится к биовару orientalis. Все штаммы этого биовара не способны расщеплять глицерин, т.к. ген glpD (ген glp оперона, определяющего способность штаммов расщеплять глицерин) несет делецию 93 п.н. [Motín et al., 2002]. Приобретение штаммом EV линии НИИЭГ области пигментации размером 102 т.п.н. во время пассажей через организм животных и одновременное восстановление способности расщеплять глицерин представляется более чем сомнительным. Дополнительно к проведенному исследованию штамма EV НИИЭГ 131 было осуществлено сравнение ампликонов, образующихся с праймерами HSI75 - HSI78 (вариабельные области 1-2), у разных вариантов лабораторных штаммов EV. Оказалось, что все лабораторные варианты штаммов EV, кроме EV НИИЭГ 131 образовывали ампликоны одного размера - 848 п.н.. Ампликон штамма EV НИИЭГ 131 был немного меньшего размера - 845 п.н. Рассчитанные размеры области, заключенной между праймерами HSI75 и HSI78, у штаммов биовара orientalis - 852 п.н. и 848 п.н. для С092 (Колорадо, США) и 6/69 (выделен на о. Мадагаскар) соответственно. Обращает на себя внимание, что у штаммов восточного биовара, выделенных в одном географическом регионе (о. Мадагаскар - штаммы EV и 6/69), с праймерами HSI75 и HSI78 образуются ампликоны одинакового размера. Ампликон HSI75 - HSI78 вирулентного ревертанта EV НИИЭГ 131 не соответствует по размеру ни одному из штаммов биовара orientalis.

Как видим, штамм EV НИИЭГ 131 имеет значительные отличия от исходного штамма EV и не принадлежит к биовару orientalis.

Исследование области Ziu/G—YPO i 950 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов позволило выявить видовые и внутривидовые структурные различия, которые послужили базой для разработки экспериментальной мультилокусной ПЦР системы для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и ПЦР для выявления авирулентных штаммов чумного микроба вследствие утраты области пигментации. С помощью второй ПЦР впервые получены неоспоримые доказательства отсутствия области пигментации у вакцинного штамма У. pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов: EV исходный, EV76, EV(76)51"f', EV(76)51Mfg Iot2.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция, включающая штаммы чумного микроба характерные для пяти подвидов и таласской группы из всех типов очагов, и штаммы псевдотуберкулезного микроба, представленные в основном 01 и 03 серотипом. Выборка штаммов охарактеризована по признакам, ассоциированным с вирулентностью.

2. Частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба.

3. На сегменте пигментации (hutG- YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов обнаружены четыре вариабельные области (одна - в области гена порина, три - в межгенных пространствах), которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Показано наличие полноценного ybt региона в области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа. Выявлено три типа Psn" мутаций у штаммов псевдотуберкулезного микроба: утрата всего ybt региона; протяженная делеция, включающая ген psn; внутригенные мутации.

5. Показано, что две разработанные ПЦР позволяют дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба разного происхождения. Мультилокусная ПЦР с праймерами на ген порина YP01967 и /сгН плазмиды pCad обладает способностью дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба всех подвидов и таласской группы; ПЦР с праймерами, ограничивающими область пигментации, выявляет авирулентные штаммы чумного микроба, утратившие область пигментации.

6. Получены молекулярно-генетические доказательства того, что вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, и как следствие возможность реверсии вирулентности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. ПЦР - анализ концевого фрагмента HMS - области у штаммов патогенных иерсиний // Пробл. особо опасных инф.-Саратов-2003.-Вып. 86-С. 96-101.

2. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. Структурные изменения области пигментации у непигментированных, нечувствительных к пестицину мутантов чумного микроба // Молодые учёные в медицине: Матер. IX Всерос. науч.-практ. конф., поев. 190-летию Казанского гос. мед. ун-та. - Казань, 2004. - С. 47-48.

3. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Кутырев В.В. ПЦР-анализ области пигментации штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ // Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития: Матер, симпозиума - М., 2004. - С. 412.

4. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Новичкова Л.А., Анисимова Л.В., Кутырев В.В. Фенотипическая молекулярно-генетическая характеристика штаммов Yersinia pseudotuberculosis, выделенных в разных регионах России и сопредельных государст // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Матер. II Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием. - СПб., 2006. - С. 127-128.

5. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Киреев М.Н., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические портреты штаммов возбудителя чумы // Матер. IX съезда Всерос. науч.-практ. об-ва эпидемиол.. микробиол. и паразитол. - М., 2007. - Т. 3. - С. 17-18.

6. Булгакова Е.Г., Гаева А.В., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Разработка способа дифференциации чумного и псевдотуберкулезного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба // Генодиагностика инф. болезней (Мол. диагностика): Матер. VI Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2007. -Т. 1.-С. 353-354.

7. Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Кутырев В.В. Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации. RU, №2288275 С1, опубл. 27.11.2006, Бюл. №33.

8. Булгакова Е.Г., Гаева А.Н., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба. RU, №2332464 С1, опубл. 27.08.2008, Бюл. №24.

9. Куклев В.Е., Сухоносов И.Ю., Осина Н.А., Яшечкин Ю.И., Булгакова Е.Г., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Применение мультилокусной ПЦР для ускоренной идентификации Y. pestis II Генодиагностика инф. болезней. (Мол. диагностика): Матер. VI Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2007. - Т. 1. - С. 376-377.

10. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П. Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Сравнение hms оперона штаммов Yersinia pestis разного происхождения и Yersinia pseudotuberculosis II Генодиагностика инф. болезней. (Мол. диагностика): Матер. VI Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2007. - Т. 1.-С. 400-401.

11. Сухоносов И.10., Краснов Я.М. Нуклеотидная последовательность генов hms-оперона у штаммов Yersinia pestis разного происхождения // Фундаментальная наука и клин, медицина: Матер. X Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье» СПб., 2007. - С. 440-441.

12. Анисимова Л.В., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Сухоносов И.Ю., Гусева Н.П., Новичкова J1.A., Кутырев В.В. Вариабельность нуклеотидной последовательности генов IcrV, yopN, уорМ плазмиды кальцийзависимости // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 154 — 155.

13. Сухоносов И.10., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Вариабельность гена порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов разного происхождения // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 294 - 296.

14. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Кутырев В.В. Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках: Матер. VIII Межгос. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 296 - 298.

15. Гаева A.B., Булгакова Е.Г., Сухоносов И.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Индикация и внутривидовая дифференциация вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - №3 (23) - Приложение 2. -Ч. II.-С. 322.

16. Сухоносов И.Ю., Булгакова Е.Г., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В. Генетический отбор авирулентных клонов чумного микроба при конструировании живых вакцин // Вестник российской военно-медицинской академии. - СПб., 2008. - №3 (23) - Приложение 2. - Ч. II. - С. 320 - 321.

17. Булгакова Е.Г., Краснов Я.М., Гаева A.B., Сухоносов И.Ю., Гусева Н.П., Анисимова Л.В., Новичкова Л.А., Кутырев В.В.. Молекулярное типирование штаммов чумного микроба разного происхождения // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Матер. IX Межгос. науч-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. — С. 40-42.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.

Гарнитура Тайме. Усл. п. л. 1,2. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Сухоносов, Илья Юрьевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14 1.1 .Современные классификации патогенных иерсиний: возбудителей чумы и псевдотуберкулеза

1.2.Область пигментации патогенных иерсиний: структура и функции

1.2.1 .Организацияpgm области Yersiniapestis

1.2.2,Организация pgm области Yersinia pseudotuberculosis 25 1.2.3 .Мутации, возникающие в пределах pgm области хромосомы у природных штаммов Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis 27 1.3.Полимеразная цепная реакция как метод молекулярной индикации и идентификации чумного микроба

1.3.1 .Полимеразная цепная реакция и её модификации 31 1.3.2.Индикация и идентификация Yersinia pestis методом полимеразной цепной реакции

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 .Бактериальные штаммы

2.2.Питательные среды, препараты и реактивы

2.3.Методы исследований

ГЛАВА 3.ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ

ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПО ПРИЗНАКАМ, АССОЦИИРОВАННЫМ С

ОСНОВНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ ВИРУЛЕНТНОСТИ 59 3.1.Характеристика штаммов чумного микроба, использованных для изучения распространения аллелей вариабельных локусов hutG—

YP01950 региона области пигментации

3.2.Характеристика штаммов псевдотуберкулезного микроба, использованных для изучения распространения аллелей вариабельных локусов /ш?0-УР01950 региона области пигментации

ГЛАВА 4.ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАЦИИ РЕГИОНА /шЮ-УР01950 ОБЛАСТИ ПИГМЕНТАЦИИ У ШТАММОВ ЧУМНОГО И ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБОВ РАЗНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ

4.1.Тактика поиска и выявление различий в регионе /шЮ-УР01950 у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения

4.2.ПЦР - анализ вариабельных областей 1 и 2 /шЮ—УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения и штаммов псевдотуберкулезного микроба

4.3.ПНР - анализ вариабельной области 3 /шЮ - УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения

4.4.ПЦР - анализ вариабельной области 3 /шЮ-УР01950 региона штаммов псевдотуберкулезного микроба из разных географических регионов

4.5.ПЦР - анализ вариабельной области 4 /шЮ-УР01950 региона у штаммов чумного микроба разного происхождения

ГЛАВА 5.ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ОБЛАСТЕЙ

РЕГИОНА \iutQ - УР

5 Л .Определение и сравнение нуклеотидных последовательностей гена порина УР01967 чумного и псевдотуберкулёзного микробов, выделенных в разных географических регионах

5.1.1.Нуклеотидная последовательность интактного гена порина и первичная структура порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

5.1.2.Нуклеотидная последовательность трункированных генов порина порина чумного и псевдотуберкулёзного микробов

5.2.0пределение и сравнение нуклеотидных последовательностей hms оперона штаммов Yersinia pest is, выделенных в разных географических регионах

ГЛАВА 6 .РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПЦР СИСТЕМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА РАЗНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 143 6 Л .Мультиплексная ПЦР система для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения

6.2.Разработка ПЦР для дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные различия HMS-области генома Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis"

Актуальность проблемы. Три патогенных для человека вида иерсиний — Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica вызывают разные по тяжести и эпидемической значимости заболевания. Возбудитель чумы вызывает быстротечное заболевание с генерализацией процесса и летальным исходом и явился причиной нескольких пандемий, унесших миллионы человеческих жизней. Два других вида микроорганизмов вызывают энтериты разной степени тяжести. Патогенные штаммы всех трех видов содержат ведущие факторы вирулентности: хромосомную область пигментации (pgm) и плазмиду кальцийзависимости (pCad) [108]. У возбудителей чумы и псевдотуберкулеза эти генетические структуры имеют высокую степень гомологии, но при этом выявлены небольшие как видовые, так и внутривидовые различия в их структурной организации и фенотипическом проявлении [143]. Учитывая исключительную важность этих детерминант для проявления вирулентных свойств микробов, выявление и характеристика даже небольших структурных и функциональных различий может приблизить нас к пониманию причин высокой патогенности возбудителя чумы, поможет в разработке систем молекулярного типирования и идентификации этого патогена. Основные сведения о структуре и функциональной активности ведущих детерминант патогенности получены на зарубежных штаммах. Однако на территории стран СНГ существует 42 природных очага чумы, в которых циркулируют различающиеся по фенотипу и вирулентности штаммы. Исследование геномов этих штаммов находится на начальном этапе. Поэтому сравнительное изучение структурно-функциональной организации детерминант патогенности штаммов разного происхождения с неодинаковой эпидемической значимостью и штаммов псевдотуберкулезного микроба, особенно 01 серотипа - наиболее близкой к чумному микробу эволюционной ветви, будет еще долгое время актуальным.

Область pgm Yersinia pestis (102 т.п.н.) состоит из двух регионов: «острова высокой- патогеиности» - оперона сидерофорзависимой системы утилизации; железа и hms региона, обеспечивающего сорбцию гемина на поверхности; микробной клетки: [125]. Оба региона участвуют в обеспечении чумного микроба необходимым для» жизни микроэлементом - железом. «Острова высокой патогенности»- у иерсиний • высококонсервативны. Гены,: расположенные на «острове1 высокой патогенности»¡j не кодируют белки;-агрессии,, но необходимы для выживания и нормального размножения; в организме теплокровных животных [139,153J.

Регион hms включает три функциональные области:, кластер генов, мембранных белков, hms оперон и- ast оперой, отвечающий за утилизацию аргинина. Экспрессию- hms генов, обеспечивающих сорбцию, гемина, связывают, со способностью чумного;' микроба- к образованию блока преджелудка у блох, и относят к факторам, способствующим трансмиссивному пути передачи патогена [142]. 13 настоящее время, основным биологическим, свойством, детерминируемым' этим регионом'; считается образование биопленки^ способствующей блокообразованию: Интересно; что бйопленку образуют как штаммы чумного, так и штаммы псевдотуберкулезного микроба, но способность, блокировать преджелудок блох отмечается только у штаммов чумного; микроба. Причины этого; пока-не ясны. Штаммы биоваров orientalis, medievalis, antiqua и microtias в зависимости от географического происхождения имеют некоторые различия в структурной организации: pgm области, что выражается; в различной- стабильности признаков пигментации (Hms) и; чувствительности к пестицину (Psn), ассоциированных с pgm областью, а также в различных типах мутаций- по этим признакам [149]. У штаммов- псевдотуберкулезного микроба выявлены структурные особенности pgm - области, отличающие их от классических штаммов чумного - микроба,. но сближающих со штаммами биовара microtias; с. ослабленной вирулентностью; > Примером этого может служить отсутствие IS 100 элемента, ограничивающего pgm область со стороны hms оперона, приводящее к отсутствию образования Дpgm мутантов, у штаммов псевдотуберкулезного микроба [103] и авирулентных для человека штаммов биовара microtus [207]. В то время как, у высоковирулентных штаммов биоваров orientalis, medievalis и antiqua pgm область фланкирована двумя IS 100 элементами, вызывающими рекомбинационный процесс с утратой всей области [125, 177].

Штаммы чумного микроба пяти подвидов: основного и неосновных — кавказского, алтайского, гиссарского, улэгейского и таласской группы, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, имеют фенотипические различия, связанные с генами pgm области. Штаммы неосновных подвидов у редко образуют Hms" мутанты (10" ). Штаммы основного подвида образуют такие мутанты в результате делеции всей области пигментации с частотой 10"5 [33]. Структурная организация hms региона штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба не изучена. Выявление областей вариабельных для чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба с одной стороны, даст новые сведения об эволюции патогенных иерсиний, с другой стороны, послужит основой при разработке тест-систем для идентификации и молекулярного типирования этих патогенов. С этой точки зрения представляется важным провести видовое и внутривидовое сравнительное изучение структурной организации hms региона у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Цель работы - провести сравнительный структурно-функциональный анализ hms — областей Yersiniapestis и Yersinia pseudotuberculosis.

Задачи исследования:

1. Подобрать и;охарактеризовать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения по основным? признакам, ассоциированным , с вирулентностью, и их генетическим детерминантам. Создать коллекцию штаммов : Yersinia pestis ■ и Yersinia- pseudotuberculosis для сравнения хромосомного^ сегмента пигментации;

2. Выявить, и охарактеризовать вариабельные: области на сегменте пигментации для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов разного происхождения с помощью метода ПЦР.

3. Определить и сравнить нуклеотидные. последовательности./мил оперонов и вариабельных , концевых частей сегмента: пигментации (ген пори на) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба: разного происхождения.:

4. Разработать экспериментальную ПЦР систему для, дифференциации» вирулентных ' и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения и для выявления авирулентных штаммов (клонов), утративших область пигмеитации.

5. Установить механизмы I-Ims" Psn" мутаций у вакцинного штамма Yesinia pestis EV линии 11ИИЭГ. . .

Научная новизна работы

Выявлены видовые и внутривидовые различия в стабильности" сохранения признаков, ассоциированных с детерминантами вирулентности-(pgm областью и pCad) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Установлено, что частота мутаций по Hmsy Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба. Эти данные свидетельствуют о том, что у штаммов чумного микроба в процессе-эволюции произошла стабилизация основных детерминант вирулентности - генов области пигментации и плазмиды pCad. Обнаружена группа штаммов чумного микроба основного подвида с частотой мутаций по

Hms признаку, характерной для штаммов неосновных подвидов. Показано, что снижение частоты и тип мутаций по Hms признаку у этой группы штаммов связаны со структурными особенностями краевого региона области пигментации — отсутствием одного из фланкирующих IS 100 элементов. Впервые было показано, что у штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 и 03 серотипа к Psn" фенотипу приводят разные типы мутаций. Впервые выявлены и охарактеризованы штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа с областью пигментации, фланкированной IS 100 элементами. Установлено, что ориентация IS 100 элемента и сайт встраивания его в ген порина, различны у штаммов чумного микроба основного подвида и группы штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа. Впервые установлено, что концевая часть области пигментации штаммов псевдотуберкулезного микроба 03 серотипа не содержит последовательности гена порина и гена сукцинилглютаматдесукцинилазы агиЕ аргининового оперона.

Впервые выявлены четыре области перспективные для разработки системы типирования методом мультилокусного секвенировапия вариабельные для штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Три из них расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (YP01967). Впервые выявлена область, проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях. Эта область локализована между генами hutG и YP01967.

Получены новые сведения о высокой консервативности нуклеотидных последовательностей hms оперонов у штаммов чумного микроба пяти подвидов и таласской группы, что свидетельствует о важной биологической роли этой структуры.

Впервые на молекулярно-генетическом уровне получены доказательства делегирования области пигментации у вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств.

Положения, выносимые на защиту

1. Создана коллекция штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов, пригодная для проведения сравнительного анализа их hms областей.

2. Возбудители чумы и псевдотуберкулеза имеют выраженные отличия по частоте наследования основных признаков,' связанных с вирулентностью. Частота- потери этих признаков в 100 — 1000 раз выше у штаммов псевдотуберкулезного микроба, чем у штаммов чумного микроба.

3. Структурная организация сегмента пигментации (hutG - YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов -' имеет существенные видовые и* внутривидовые различия. Выявлены четыре вариабельные области, которые могут быть использованы для усовершенствования, методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного1 микроба ОЗ серотипа- содержат полноценный уЫ регион. Psn" мутанты у штаммов псевдотуберкулезного микроба образуются в результате трех типов мутаций.

5. Разработанные экспериментальные ПЦР системы пригодны для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба и для выявления авирулентных штаммов, утративших область пигментации.

6. Вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, что исключает у него спонтанную реверсию вирулентности.

Практическая значимость работы

По результатам работы получены патенты на изобретения зарегистрированные в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации- чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464. Составлены методические рекомендации: «Способ дифференциации авирулентных вследствие потери области пигментации и потенциально вирулентных штаммов (клонов) чумного микроба», «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-биологических экспериментов», «Мультиплексная ПЦР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов Yersinia pestis разного происхождения», одобренные Учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» (протокол №1 от 16.03.2007г., протокол №2 от 17.04.2007г., протокол №5 от 22.06.2007г. - соответственно) и утвержденные директором Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» по учрежденческому уровню внедрения.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006 и 2007 гг.), а так же на конференции «Молодые учёные в медицине», (IX Всероссийская научно-практическая конференции Молодые учёные в медицине посвящённая 190-летию Казанского государственного медицинского университета, Казань 2004г.) и симпозиуме «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва 2004г. Выступления на конференциях (Казань, 2004 и Москва, 2004) были высоко оценены оргкомитетами с присуждением дипломов за лучший доклад. Так же результаты исследования были представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием, «Инфекции, обусловленные иерсиниями» Санкт-Петербург 2006; IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва 2007; VI Всероссийского научно-практическая. конференция Москва 2007; X Всероссийская медикобиологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" Санкт-Петербург, 2007; VIII Межгосударственная научно-практическая конференции государств участников СНГ Саратов 2007; Экофорум Санкт-Петербург 2008, IX Межгосударственная научно-практическая конференция государств участников СНГ Волгоград, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, одна - в изданиях рекомендованных ВАК и две оформлены в виде патентов на изобретения «Способ определения утраты вирулентности штаммами чумного микроба вследствие потери области пигментации» №2288275 и «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464.

Структура и объём диссертации

Диссертация представлена на 201 странице машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 40 рисунками. Библиографический указатель содержит 208 отечественных и зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сухоносов, Илья Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция, включающая штаммы чумного микроба характерные для пяти подвидов и таласекой группы из всех типов очагов, и штаммы псевдотуберкулезного микроба, представленные в основном 01 и ОЗ серотипом. Выборка штаммов охарактеризована по признакам, ассоциированным с вирулентностью.

2. Частота мутаций по Hms, Psn и Cad признакам у штаммов псевдотуберкулезного микроба на два - четыре порядка выше, чем у штаммов чумного микроба.

3. На сегменте пигментации (hutG- YP01950 регион) у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов обнаружены четыре вариабельные области (одна - в области гена порина, три - в межгенных пространствах), которые могут быть использованы для усовершенствования методов идентификации и типирования штаммов чумного микроба.

4. Показано наличие полноценного уЫ региона в области пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба ОЗ серотипа. Выявлено три типа Psn" мутаций у штаммов псевдотуберкулезного микроба: утрата всего уЫ региона; протяженная делеция, включающая ген psn; внутригенные мутации.

5. Показано, что две разработанные ПЦР позволяют дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба разного происхождения. Мультилокусная ПЦР с праймерами на ген порина YP01967 и IcrH плазмиды pCad обладает способностью дифференцировать вирулентные и авирулентные штаммы чумного микроба всех подвидов и таласской группы; ПЦР с праймерами, ограничивающими область пигментации, выявляет авирулентные штаммы чумного микроба, утратившие область пигментации.

6. Получены молекулярно-генетические доказательства того, что вакцинный штамм Yersinia pestis EV линии НИИЭГ утратил область пигментации, и как следствие возможность реверсии вирулентности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Молекулярно-генетические исследования - двух генетически близких микроорганизмов; Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis позволяют говорить о том, что дивергенция этих видов произошла сравнительно недавно^ — 1,5-20 тыс. лет назад [87]. Геномы-чумного и псевдотуберкулезного микроба имеют очень высокую степень гомологии — более 90% [95]. В тоже время . клинические проявления- чумы и псевдотуберкулеза: и способы передачи инфекции резко отличаются. Несмотря на то, что в зависимости от особенностей ферментативных: , систем штаммы чумного микроба подразделяются на четыре биовара: antiqua, medievalis, orientalis, microtus и пять подвидов: pestis, altaica, hissarica, caucasica и ulegeica, клиническая картина при заражении; всеми; вариантами; штаммов чумного микроба практически не отличается и характеризуется сепсисом,. быстрой генерализацией процесса и быстрым;. летальным, исходом. Заражение происходит либо трансмиссивным способом, либо воздушно-капельным. Для штаммов, псевдотуберкулезного микроба характерен алиментарный ' путь заражения. Но при этом различают несколько форм болезни:' скарлатиноподобная, абдоминальная, желтушная, артралгическая и генерализованная [3 0]; Разнообразие клинической картины псевдотуберкулеза и значительные различия по антигенным, биохимическим, генетическим признакам возбудителя говорят о высоком полиморфизме таксона. Штаммы псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа относят к предшественникам чумного микроба [87]; Эти штаммы в структуре генома содержат детерминанты вирулентности, которые для чумного микроба считают основными — остров высокой, патогенности и плазмиду кальцийзависимости. Но несмотря на это штаммы 01 серотипа вызывают не самую тяжелую клинику. Наиболее, тяжелое течение заболевания , отмечается при скарлатиноподобной форме (Дальневосточная скарлатиноподобная

•'■• . . . .166 лихорадка). Геном штаммов, вызывающих ДСГШ не "содержит ни острова высокой' патогенности, ни; плазмиды; кальцийзависимости. Вирулентность; возбудителя ДСПЛ определяется: другими генетическими"структурами; [123]. Сравнение ! экспрессии , и структурной организации основных детерминант вирулентности у штаммов разного происхождения чумного микроба й наиболее, близкой; эволюционной ветви штаммов псевдотуберкулезного микроба может внести ясность в вопрос о том, какие- эволюционные , изменения детерминант способствовали; трансформации из сапрофитного паразита в облигатный.

Настоящая-i работа посвящена, изучению полиморфизма сегмента hms (YP01937 - YP01967 - обозначение, дано по хромосоме Y pestis С092) области пигментации патогенных иерсиниШ (одной; из основных детерминант; . вирулентности) у штаммов. Yersinia, pestis и Yersinia pseudotuberculosis, циркулирующих на:территории России, стран СНГ и Монголии.

Для работы были: отобраны иохарактеризованыпоосновным признакам, ассоциированным, с вирулентностью и детерминируемым; областью пигментации' и плазмидой кальцийзависимости,. 47 штаммов чумного и 68 штаммов псевдотуберкулезного микробов: Выборка; штаммов чумного микроба включает штаммы пяти подвидов и таласской группы. Штаммы псевдотуберкулезного микроба, использованные в работе; практически не были-охарактеризованы до настоящего- момента. Самая многочисленная, группа выборки из 28 штаммов относится к 01 серотипу. Это наиболее близкая? к возбудителю чумы эволюционная; ветвь ■ псевдотуберкулезного микроба. Следующая большая группа представлена шестнадцатью «бадхызскими» штаммами ОЗ серотипа, которые по-некоторым признакам проявляют большое сходство с возбудителем чумы. Довольно- большая группа штаммов (16), серотип которых не определен, дополняет основную группу штаммов по "географическим регионам, времени и источнику выделения. Три штамма псевдотуберкулезного микроба, выделенные в городе Иркутске интересны тем, что выделены из крови человека (И-199, 02 серотип), от блохи (И-406, серотип не определен) и из комара (И-270, Ol серотип). Источники выделения, свидетельствуют о том, что данные штаммы вызывали генерализованный инфекционный процесс. Мы надеялись выявить большее сходство основных детерминант вирулентности этих штаммов псевдотуберкулезного микроба с детерминантами чумного микроба, чем у других штаммов псевдотуберкулезного микроба.

Изучение фенотипа, плазмидного состава" и ПЦР — анализ hms оперона и ybt региона показали, что основные генетические детерминанты вирулентности - гены области пигментации и плазмида кальцийзависимости у штаммов чумного микроба- проявляют более высокую степень стабильности, чем у штаммов^ псевдотуберкулезного микроба. Среди. 47 исследованных штаммов чумного микроба выявлено-только' 15% атипичных: апигментированных, либо лишенных плазмид pFra или pGad. Штаммы с полноценным набором детерминант вирулентности, обладали соответствующим фенотипом.

RecA зависимые мутации, приводящие к делеции области .пигментации и одновременной утрате Hms и Psn признаков, у штаммов чумного микроба

О с происходят с частотой 1(Г-10 . Такой тип мутаций мы наблюдали у 19'из 24 исследованных штаммов чумного микроба основного подвида. Ранее аналогичные результаты по частоте мутаций на Y. pestis 231 (708) штамме основного подвида из Аксайского высокогорного очага были получены И.В. Зудиной- (2000) [33]. Это первый тип Hms мутаций, охарактеризованный у возбудителя-чумы биовара medievalis [125, 137]. RecA независимый тип Hms мутаций происходит с частой в сорок раз меньшей у штаммов данного биовара и, обычно не сопровождается утратой Psn признака [137]. Изучение Hms фенотипа у штаммов чумного микроба, циркулирующих, на территории России, стран СНГ и Монголии показало, что не все штаммы основного подвида утрачивают признак пигментации с высокой частотой. Группа штаммов основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и единичные штаммы из Приаральско-Каракумского пустынного и Прикаспийского СевероЗападного степного очагов образуют Hms мутанты с частотой 10" . Впервые низкую частоту Hms мутаций и реверсию этого признака с такой же частотой у штаммов основного подвида описал Мартиневский И.Л. с соавт. (1978) и подтвердил данный феномен Кутырев В.В. (1992) [47, 52]. Но в этих работах не была установлена причина низкой частоты Hms мутаций у штаммов* Кызылкумского пустынного очага. Такая же частота Hms мутаций проявляется у штаммов чумного микроба всех неосновных подвидов и таласской группы. В нашей работе представлены доказательства, что у всех штаммов с частотой Hms мутаций 10"7как основного, так и неосновных подвидов отсутствует один из IS 100 элементов, фланкирующих область пигментации. RecA зависимые делеции области пигментации возникают только при наличии двух IS 100 элементов, обеспечивающих процесс рекомбинации, поэтому штаммы, не имеющие одного из этих IS 100 элементов, лишены возможности* проявлять такой тип мутаций. У большинства1 штаммов^ псевдотуберкулезного микроба IS 100, ограничивающий hms сегмент также отсутствует и делеций области пигментации у них не происходит, что согласуется с результатами Buchrieser С. с соавторами (1998) [103]. Однако штаммы псевдотуберкулезного микроба,

1 О утрачивают Hms признак с частотой от 10" до 10" . Более того, даже штаммы Y. pseudotuberculosis, способные к сорбции кислых красителей проявляют этот признак неодинаково и во всех случаях хуже, чем штаммы чумного микроба. Большая часть штаммов псевдотуберкулезного микроба отчетливо проявляет этот признак только на модифицированной нами среде Hmsdpstbc. Многие штаммы псевдотуберкулезного микроба были лишены этого признака при проверке высевов лиофилизированных музейных культур. Экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что утрата признака пигментации у штаммов псевдотуберкулезного микроба не связана с крупными делециями или вставками. Hare and McDonough (1999) [137], также говорят о неидентифицированнь1х небольших по протяженности или точковых мутациях во всех генах Hms оперона, характерных для возбудителя псевдотуберкулеза.

Признак чувствительности к пестицину штаммы кавказского подвида в. наших экспериментах утрачивали с частотой 10"7 - 10"9. Штаммы- других подвидов по этому признаку не. тестировались, так как: содержали плазмиду пестициногенности и были резистентны, к пестицину. Наши- данные по частоте Psn мутаций хорошо согласуются с данными Зудиной,- полученными для единичных представителей штаммов: чумного микроба разных, подвидов; и результами Hare and: McDonough, 1999 [137], полученными на штамме'биовара medievalis. Поэтому мы не проводили эксперименты по элиминации1 плазмиды пестициногенности из?, штаммов; представленных в данной работе. Мы показали, что штаммы псевдотуберкулезного микроба утрачивают признак • гчувствительности к пестицину с. частотой Г0: - 107 . Staggs T.M:', Perry R.E)t . ' (1992).; BuchrieserG. с соавторами (1998) и Martins C.H.G. с соавторами; (200,7)' i .■•;' считают, что полноценный, остров патогенности присутствует только у штаммов 01 серотипа [103, 160, 197]. У штаммов ОЗ серотипа. jyZtf 'регион

I лишен фрагмента около 9 т.п.н., включающего гены ybtE, psn и IS 100 элемента, а штаммы ©2, 04 и. Об серотипов» вообще не содержат остров высокой патогенности. Нами, установлено, что штаммы как О Г, так и ОЗ серотипов {; содержат остров высокой патогенности. Но штаммы псевдотуберкулезного

I микроба 01 серотипа- легко утрачивают ybt регион, а с ним* и; признак чувствительности к пестицину, а у штаммов; ОЗ серотипа делетирует только; | часть региона;, захватывающая psn ген (вероятно, описанные; выше делеции 9 t т.п.н.). То; что зарубежные исследователи не обнаружили штаммы ОЗ: серотипа с полноценным островом патогенности, говорит о высокой частоте: возникновения 9 т.п.н. делеций1 в; этом регионе: По нашим данным ; штаммы обоих серотипов могут утрачивать.признак чувствительности к пестицину еще f и в результате неидентифицированных точечных или небольших мутаций. У

I двух исследованных нами штаммов псевдотуберкулезного микроба 02 и Об р. • ' . ■ • * серотипов остров высокой патогенности отсутствовал. Но, в связи с малым количеством наблюдений, это не может служить подтверждением мнения об отсутствии острова у всех штаммов этих серотипов. Сочетанная утрата Hms и Psn признаков у штаммов псевдотуберкулезного микроба происходит с частотой - околоЮ"5 в результате независимых неидентифицированных мутаций в области hms оперона и ybt региона.

Стабильность второго обязательного фактора вирулентности патогенных иерсиний - плазмиды кальцийзависимости также оказалась выше у штаммов чумного микроба, чем у штаммов псевдотуберкулезного микроба. Лишь единичные штаммы чумного микроба, присутствующие в выборке были лишены плазмиды pCad. Другая картина наблюдалась при исследовании высевов лиофилизированных культур штаммов псевдотуберкулезного микроба. Все штаммы псевдотуберкулезного микроба по паспортным данным были выделены от больных людей, грызунов или переносчиков, а, значит, изначально обладали вирулентными свойствами. Но более половины из них при скрининге не содержали плазмиду pCad, а 37 % штаммов, содержащих плазмиду, утратили признак кальцийзависимости.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что в процессе эволюции патогенных иерсиний у штаммов чумного микроба произошла стабилизация основных детерминант вирулентности: генов области пигментации и плазмиды pCad. Стабилизация детерминант вирулентности, несомненно, способствовала увеличению патогенных свойств чумного микроба и, вероятно, оказалась важной при освоении новых экологических ниш. Стабилизация острова высокой патогенности и плазмиды кальцийзависимости обеспечивает лучшую приживаемость микроба в организме теплокровного хозяина и более эффективное уклонение от защитных сил макроорганизма, а стабилизация hms оперона и признака пигментации - эффективное блокирование преджелудка блох.

Поиск- структурных различий /шЮ-УР01950 региона области пигментации у штаммов* чумного микроба разного происхождения и вирулентных штаммов псевдотуберкулезного микроба выявил четыре вариабельные области, хорошо различающиеся при ПЦР скрининге. Три области расположены в межгенных пространствах и одна - в области гена порина (УР01967). Вариабельность областей межгенных пространств, вероятно, связана с расположенными в них локусами вариабельных тандемных повторов. Изучение нуклеотидных последовательностей, депонированных в ОепВапк, показало, что в регионе /шЮ — УР01967 область 1 включает локус тандемных повторов (СААОТААТ)п, область 2 включает локус тандемных повторов (АТАОАААО)п (ОепВапк - АЬ590842, ВисМевег С. ег а1., 1999) [105]. В агарозном геле ампликоны штаммов чумного микроба разных подвидов и псевдотуберкулезного микроба, образованные с праймерами на эти области имеют различную подвижность. Сравнение депонированных в ОепВапк нуклеотидных последовательностей штаммов чумного микроба разных биоваров и псевдотуберкулезного микроба- выявило межбиоварную вариабельность аллелей областей тандемных повторов. Перспективность использования этих областей в качестве ДНК мишеней при разработке системы; типирования штаммов чумного микроба методом мультилокусного секвенирования не вызывает сомнений. Альтернативно может быть разработана ПЦР для идентификации и внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Таким образом, нами впервые выявлена область, локализованная между генами /шЮ и УР01967 и проявляющая для чумного микроба вариабельность на видовом и подвидовом уровнях.

Вариабельная область 4 расположена в межгенном пространстве УР01960 (ген гипотетического мембранного белка) - УР01961 (ген регулятор семейства в^Я) и содержит локус тандемных повторов (АТСААС). Дифференциирующие способности этой области оказались ниже, чем у первых двух, но могут дополнять их в системе мультилокусного секвенирования.

Третья вариабельная- область связана с геном; порина УРО 1967. Ранее было- показано,, что в штаммах биоваров апйциа, тесЦеуаНз и опе^аНБ ген порина; инактивирован 18100 элементом. У штаммов биовара писгоШб- ген порина;находится в интактном состоянии. По многим; признакам штаммы этого1 биовара близки штаммам; неосновных подвидов: и таласской; группе; В наших экспериментах показано; что у штаммов всех неосновных подвидов и таласской группы ген порина также; интактен. У подавляющего большинства-, штаммов основного подвида, как и у штаммов: трех биоваров ген порина; нарушен 18100 элементом. Но нами впервые, обнаружены штаммы; основного подвида из Кызылкумского пустынного очага и единичные штаммы из Приаральско-Каракумского пустынного и Прикаспийского Северо-Западного степного, очагов с интактным теном* порина. До/ сих пор считалось, что все штаммы псевдотуберкулезного микроба: несут интактный ген порина. [115]. Мы установили, что штаммы; псевдотуберкулезного * микроба; ©1г серотипа, как; правило; содержат интактный» ген; порина; но существуют штаммы; псевдотуберкулезного микроба ©1 серотипа с геном; порина;. нарушенным; 18100 элементом. У штаммов псевдотуберкулезного микроба ОЗ серотипа; концевая часть. области пигментации; штаммов- не содержит последовательностей гена порина и гена; сукцинилглютаматдесукцинилазы; агиЕ аргининового оперона. ' ' . .

Определение нуклеотидных последовательностей гена; порина у типичных штаммов пяти подвидов, таласской группы чумного микроба и шести штаммов псевдотуберкулезного микроба 01 серотипа, показало, что штаммы всех неосновных подвидов,, таласской? группы, штамм; основного подвида из; Кызылкумского пустынного; очага и штамм: псевдотуберкулезного микроба с интактным геном порина; несут идентичную функционально активную; открытую рамку считывания гена порина. Предполагаемый: полипептидный продукт состоит из 360 ак. Рассчитанная молекулярная масса порина - 39561 Да: Это кислый белок с рГ- 5,53. Вторичная структура порина характерна для: белков этого класса и содержит множество тяжей, образующих бета — складчатую структуру.

У штаммов псевдотуберкулезного микроба с трункированным геном порина встраивание IS 100 элемента произошло в сайт интеграции AGAAAG (у чумного микроба в сайт ТСТСТ), в ориентации обратной по сравнению с IS 100, ограничивающим ybt регион. Выявление штаммов псевдотуберкулезного микроба с трункированным геном порина свидетельствует о том, что образование псевдогенов, характерных для чумного микроба, свойственно и псевдотуберкулезному микробу, с другой стороны не у всех штаммов чумного микроба эти гены нарушены. Поэтому роль-псевдогенов в становлении Y. pestis как вида, может оказаться несколько преувеличенной. Скорее образование псевдогенов отражает процесс адаптации штаммов патогенных иерсиний к определенному комплексу эколого-географических и климатических факторов.

Впервые нами определена нуклеотидная последовательность hms оперона (7651 п.н.) у штаммов чумного микроба основного подвида (Y. pestis 231 (708), Y. pestis КМ803 (А-1822)), кавказского подвида (Г. pestis 1146), алтайского подвида (Y. pestis КМ683 (И-2359)), улэгейского подвида (Y. pestis И-3069), гиссарского подвида (Y. pestis А-1249) и штамма из Таласского высокогорного очага - Y. pestis А-1802 (21/10). Blast - сравнение hms оперона показало, что hms оперон чумного микроба отличается единичными нуклеотидными заменами во всех генах от hms оперона псевдотуберкулезного микроба, при этом почти все замены не приводят к замене аминокислоты. Поэтому не могут отражаться на функции кодируемого белка. Структурные различия hms оперона штаммов чумного микроба разного происхождения минимальны, но во всех случаях выражаются в замене одной нейтральной аминокислоты на другую. Однако, и эти замены аминокислот не приводят к нарушению или изменению способности чумного микроба сорбировать кислые красители. На сегодняшний день вопрос о том, что приводит к слабой пигментсорбирующей способности у штаммов псевдотуберкулезного микроба и высокой частоте мутаций, приводящих к утрате Hms фенотипа и отсутствию способности блокировать преджелудок блох, остается- открытым.

На основе полученных новых теоретических знаний нами определены вариабельные области hutG—YP01950 региона, которые можно использовать при создании системы типирования штаммов чумного микроба методом мультилокусного секвенирования, а одна из вариабельных областей перспективна для ПЦР1типированияг штаммов чумного микроба. Кроме этого, разработана мультилокусная ПНР для дифференциации вирулентных и авирулентных штаммов чумного5 микроба по двум основным детерминантам вирулентности.

С помощью разработанной ПЦР, выявляющей делецию области пигментации, впервые получено неоспоримое доказательство делетирования области пигментации у вакцинного штамма Y. pestis ЕV линии НИИЭГ и его лабораторных вариантов, а, следовательно, невозможности спонтанной реверсии вирулентных свойств. Специфичность ампликона, образованного праймерами, фланкирующими область пигментации, подтверждена* определением его нуклеотидной последовательности. Кроме того, нами исследован-один из штаммов, заявленных в качестве вирулентных ревертантов-вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. По фенотипическим признакам (способность ферментировать глицерин, способность редуцировать нитраты) вирулентный штамм EV НИИЭГ 131 не может быть отнесен к биовару orientalis. Среди всех вариантов вакцинных штаммов EV только этот штамм обладал способностями ферментировать глицерин и редуцировать нитраты. Дополнительно разные варианты лабораторных штаммов EV, включая EV НИИЭГ 131, исследованы праймерами на вариабельную область с подвидовой дифференцирующей способностью (HSI75-HSI78). То, что штамм EV НИИЭГ 131 отличался по размеру ото всех вариантов авирулентных штаммов EV, также свидетельствует о разном происхождении авирулентных вакцинных штаммов EV и вирулентного штамма EV НИИЭГ 131. Вероятно, сообщения о выделении вирулентных ревертантах вакцинного штамма EV линии НИИЭГ вызваны контаминацией вакцинных штаммов, использованных экспериментаторами, природными штаммами другого происхождения.

Таким образом, нами показано, что в процессе эволюции патогенных иерсиний произошла стабилизация генов основных детерминант вирулентности — области пигментации и плазмиды кальцийзависимости, которая нашла выражение в снижении частоты мутаций по признакам, ассоциированным с детерминантами вирулентности, частоты элиминации острова высокой патогенности и pCad и образования нарушений в их структурной организации. Выявлены вариабельные для штаммов псевдотуберкулезного и чумного микроба разного происхождения области сегмента пигментации. Показана перспективность их использования для создания молекулярно-генетических типирующих систем. Разработаны варианты ПЦР для идентификации вирулентных и авирулентных штаммов чумного микроба разного происхождения. Доказана безопасность применения штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ для вакцинации людей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Сухоносов, Илья Юрьевич, Саратов

1. Апарин Г.П., Ролубинский: Е.П. Микробиология чумы: Руководство. -Иркутск Текст. / Изд во Иркут. ун - та, 1989. — 90 с.

2. Балахонов С.В. Результаты скрининга плазмид штаммов Yersinia pestis из разных очагов центрально-азиатской зоны природной очаговости чумы Текст. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1989; - №4. - С: 39 — 42.

3. Балахонов C.B., Воронова Г.А.,. Базанова Л.П., Шестопалов М.Ю. Обнаружение Y pestis в блохах методом . направленной ферментативной амплификации генов плазмидной локализации Текст. // Chin. J. Contr. Endein. Dis: 1999. - V. 14, Spec. - P. 185-187.

4. Балахонов C.B., Воронова Г. А., Шестопалов; М.Ю., Базанова Л.П.,Токмакова Е.Г. К использованию полимеразной цепной; реакции длядетекции чумного микроба в блохах Текст. // Мед. паразитол. ипаразитар. бол. 2000.-N3'.-С. 29-31.

5. Бибикова\ В.А., Классовский JI.H., Мельников И.Ф. К вопросу об эпизоотологическом значении штаммов возбудителя чумы с ослабленной вирулентностью Текст. // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1968. - Вып. 4.-С. 180-186.

6. Быков JI.T., Пошевина Г.О., Красникова JI.B. Характеристика штаммов микроба чумы из Юго-Восточных Кызылкумов Текст. // Матер. VII научг. конфер: противочумн: учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 4 - 5.

7. Вершинина Т.И. О популяционной изменчивости возбудителя чумы из природных очагов Горного Алтая и Северо-Западной Монголии Текст. / Автореф: дис. канд. мед. наук. — Саратов, 1986: 16 с.

8. Воротников^ И.А., Толмачева JI.P. К характеристике штаммов чумного микроба, изолированных в период оздоровления Тянь-Шаньского природного очага Текст. // Актуал. вопр. эпиднадзора в природных очагах чумы. -Ставрополь, 1985. С. 174 -'176.

9. Гаранина С.Б., Самойлова JI.B., Подсвиров A.B., Санджиев В.Б.-Х., Величко JI.H:, Топорков В.П., Куличенко А.Н. Выявление некультивируемых форм возбудителя Y.pestis в полевом материале, собранном в Прикаспийском

10. Головко Э.Н., Пейсахис Л!А., Дерлятко К.И., Юсупов А.К., Сагимбеков У.А. Характеристика штаммов микроба' чумы, выделенных в Гиссаре летом 1970 года Текст. // Матер. VII науч. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. - С. 6 - 7.

11. Головко Э.Н., Гуляко Л.Ф., Дегтярева В.И. Некоторые особенности штаммов возбудителя чумы, выделенных в Гиссарском очаге в 1970 1987 г.г. Текст.4// Тез. XIII конфер. противочумн: учрежд. Ср. Азии и Казахст. — Алма-Ата, 1990.-С. 62-65.

12. Гольдфарб Л.М. Некоторые особенности чувствительных к пестицину I культур- возбудителей чумы и- псевдотуберкулеза и их- диагностическое значение Текст. // Пробл. особо опасных инф. 1968. - №1. - С. 86 - 88.

13. Гольдфарб Л.М., Дальвадянц С.М., Земцова И:Н., Пономарев И:Г. Некоторые особенности культур, выделенных на территории Северо-Западного Прикаспия в 1972 г. Текст. // Профилакт. особо опасных инф. Саратов, 1977. -Вып. 3. - С. 46-50.

14. Гольдфарб Л.М., Бурлаченко Т.А., Седина- С.Г. и др. Текст. // Профилакт. Особо опасных инфекций., Тез. докл. Всесоюзной научн.-практю. конф. Ставрополь, 1983.-С. 19-20

15. Трязнова Н.С, Субботина H.A. Текст. / Антибиотики и химиотерапия 1989. Т. 34. №12. . , .; ' . ; ;

16. Джафаров НИ., ТОндин Е.В. Характеристика' штаммов чумного микроба1 из ТерскогСунженского природного, очага чумы Текст. // Особо опасных инф; наКавказе;-Ставрополь, 1974. Вып.Г. -С. 36 - 37. ■'-.

17. Елкин- Ю.М., Михайлова P.C., Розанова Г.Н;, Тарасова В.Е., Лалазарова HiF., Ерамотина Л-И:, ОсиповаС.П;, Быкова:31А., Калмыкова Л;И. Возбудитель чумы очага Центрального Кавказа-Текст. // Пробл. особо опасных инф. 1977. - Вып. 3 (55). - С. 9 -12: ■ : •

18. Захаров А.И. Изучение биологии возбудителя; чумы из-Урало-Эмбенского автономного очага Текст.: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1988. - 163 с.

19. Зудина И.В; Сравнительная характеристика стабильности хромосомной, области пигментации и её отдельных регионов у штаммов пяти подвидов возбудителя чумы Текст.:;Дис.канд. биолог, наук. Саратов, 2000. - 138 с.

20. Зундуй Чимит, Апарин Г.П., Головачева В.Я., Тимофеева Л.А., Васюхина Л.В. О биологических свойствах культур чумного микроба^, выделенных в МНР Текст. // Особо опасные инф. в Сибири и на Д. Востоке.- Кызыл, 1966.- Вып. 7.-С. 103- 106.

21. Инокентьева Т.И;, Тарасова В.Е. Изменение вирулентности чумного-микроба при пассировании на монгольских пищухах Текст. // Изв. Иркутск, н.-и. противочумн. ин-та Сибири и ДВ, Иркутск 1968. - 27 - С. 439 - 450:

22. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты; эпидемии чумы Текст.: Дис:доктора мед. наук —Саратов, 1995 —392 с.

23. Кошенов У .А. Свойства штаммов; возбудителя чумы, выделенных в Зааральском автономном очаге в 1982 1983 гг. Текст. // XII Межреспубл. науч. - практ. конфер., противочумн. учрежд. Ср. Азии« и; Казахст.,— Алма-Ата; f 1985.-С. 18-20. : •';•'■:' " ,

24. Кошенов У.А. О свойствах возбудителя; чумы из Зааральского автономного 04ara:TeKCT.i"// Тез. XIII конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 19901-С. 72 -74. ' . ь'-.

25. Куличенко А.Н., 11оркина О.В., Гинцбург А.Л., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Оптимизация способа детекции штаммов чумного микроба при; помощи полимеразной цепной реакцией Текст. // Генетика 1994 - т.ЗО, №2, - с 167171 •-"''' Л 183

26. Кутырев BIB., Проценко O.A. Классификация и молекулярно-генстичсскис исследования Yersinia pestis Текст. // Пробл. особо опасных инф. -Саратов, 1989.- С. 11-22.

27. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы; Текст. ::Дис. докт. мед: наук. Саратов, 1992. - 332 с.'

28. Логачев Л.И., Михайлов Е.П. К характеристике вирулентности штаммов чумного микроба, выделенных в Горном Алтае Текст. // Ооврёмен. аспекты профилакт. зоонозных инф. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 50.

29. Мартиневский И.Л. Пигментсорбция у возбудителя чумы и ее роль в проявлении вирулентности. Обзор. Среднеаз. ПЧИ. Текст. Алма-Ата, 1988. -26 с. Деп. в ВИНИТИ 13.10.88. №7376-В88.

30. Мартиневский И.Л., Степанов В.М., Кенжебаев А.Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Текст. — Нукус: Каракалпакастан, 1990. — С. 89-91.

31. Новикова О. Д. Текст. Автореф. дис. .канд. биол. наук.— Владивосток. 1986.

32. Норкина О.В., Куличенко А.Н., Величко А.Н., Попов Ю.А., Кокушкин A.M., Дроздов И.Г. Обнаружение возбудителя чумы в блохах с использованием полимеразной цепной реакции Текст. // Пробл. ООИ Саратов - 1994 - №4 -158-164 с.

33. Осадчая Л.М., Мисалева О.С., Алексеева О.Е., Егорова Р.П., Чернова В:А. К характеристике возбудителя чумы из Северного Приаралья Текст. // Матер. VII науч. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. Алма-Ата, 1971. -С. 39-40.

34. Петров В.Н. Физиология и патология обмена железа Текст. Л.: Наука, 1982.-224 с.

35. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порииы как перспективные антигены для диагностики и- вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний Текст. // Вестник ДВО РАН. 2004. № 3 С. 35-44.

36. Сагимбеков У.А., Рапопорт Л.П. Об особенностях штаммов возбудителя чумы, выделенных в различных популяциях больших песчанок в Муюнкумах Текст. // Микробиол., генетика И;иммунол. чумы и холеры. Саратов; 1983'.- С. 11-13.

37. Сагимбеков У.А., Пошевина Г.О., Рапопорт Л.П. О соотношении Р+ и Р" клеток в штаммах чумного микроба в разные фазы эпизоотического процесса

38. Текст. // XII Межреспубл. науч. практ. конфер. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахст. - Алма-Ата, 1985. - С. 35 - 37.

39. Слудский A.A., К.И. Дерлятко, Э.Н: Головко, B.C. Агеев Гиссарский природный очаг чумы Текст. // Под редакцией доктора биологических наук A.A. Слудского, Саратов: Издательство Саратовского Университета, 2003. -248 с. :

40. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии: Текст. — М.: Медгиз. 1958. - 348 с.

41. Тимофеева Л.А., Апарин Г.П. Биологические свойства. штаммов чумного микроба, выделенных в 1961 1966 г.г. в чумных очагах Сибири и Монголии Текст.//Пробл. особо опасн: инф.-1969. - №4 . - С. 13 - 18.

42. Тимофеева JI.A., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н., Логачев А.И., Саран Мандалин Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 1971 гг. Текст. // Пробл. особо опасных инф. - 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

43. Тимченко Н.Ф. Патогенетическое значение психрофильности Yersinia pseudotuberculosis Текст.: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 1989.-39с.

44. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко O.A. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов Текст. // ЖМЭИ. 1992. - №3 - С. 10 - 13.

45. Филиппов A.A. Мобильные генетические элементы патогенных иерсиний Текст.: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 2001. - 370 с.

46. Фурсов В.В., Попов Ю.А. Исследование штаммов микроба чумы полевочьей разновидности методом электрофореза в агарозном геле Текст. // Профилакт. природноочаговых инф. Ставрополь, 1983. — С. 326 — 327.

47. Хайдаров Т.Б., Хакимов М.М., Мартиневский И.Л. О первых случаях выделения штаммов чумного микроба в Каршинской степи и их свойствах Текст. // Эпизоотол. и профилакт. природноочаг. инф. — Саратов, 1982. — С. 37 -39.

48. Aasa R., Malmstrom B.G., Saltman P., Vanngard J. Text. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V.75. -P. 203-222.

49. Achtman, M., K. Zurth, G. Morelli, G. Torrea, A. Guiyoule, and E. Carniel. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999 - V.96 - P. 1404314048.

50. Bearden S.W., Fetherston- J:D., Perry R.D. Genetic organization of the yersiniabactin biosynthetic region and construction- of avirulent mutants, in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. V. 65, № 5. - 1997. - P. 1659 - 1668.

51. Bearden S.W., Staggs T.M., Perry RD. An ABC transporter system of Y. pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB 11 Text. // J.Bacteriol. 1998. - Mar; 180(5): 1135-1147.

52. Bearden- S.W., Perry R.D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague Text. // Mol. Microbiol. -1999. V. 32, N 2. - P. 403-414.

53. Belgrader P., Benett W., Hadley D., Long G., Mariella R Jr., Milanovich F., Nasarabadi S., Nelson W., Richards J., Stratton P! Rapid" pathogen detection using a microchip PCR array instrument // Clin. Chem. 1998. - V. 44, N 10. - P. 2191-2194.

54. Brubaker R.R: Mutation rate to nonpigmentation in P. pestis Text. // J. Bacteriol: 1969. - V. 98, N 3. - P. 1404 - 1406.

55. Buchrieser C., Brosch R., Bach S., Guiyoule A., Carniel- E. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be1 insertedt into any of the three chromosomal1 asn /RNA genes Text.:// Mol; Microbiol. 1998. - V. 30. -P; 965-978.■ 190

56. Bullen J.J., Rogers I-I.J;, Griffiths E. Role of iron in bacterial infections: Text. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1978. - V. 80. - P. 1 - 35.

57. Bullen J.J. The significance of iron in infection Text. // Rev. Infect. Dis. -1981.-V.3.-P. 1127-1138.

58. Burrows T.W., Bacon- G;A. The basis of virulence in: Pasteurellaipestis; an* antigen determining virulence Text. // Brit. J. Exp. Pathol. 1956. - V. 37. - P. 481-■493-. • "

59. Carniel E., Mazigh D., Mollaret H.H. Expression of iron-regulated proteins in Гегаш/а species and their relation to virulence Text. // Infect. Immun. 1987. — V. 55.-P. 277-280;

60. Carniel E., Guiyoule A., Prentice M. Characterization of a large chromosomal . «high-pathogenicity island» in biotype 1В Yersinia enterocolitica Text. // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 6743 - 6751. ;

61. Darby;C,:Ji W.,Hsu, N; Ghorij.S^Falkow- Plague bacteria biofïlmv blocks fbodv intake Text. // Nature 2002 : Vol; 417 - P: 243 .

62. Darby C Uniquely insidious: Yersinia pestis biofilms Text., // Trends« Microbiol. 2008.

63. Efremenko V.l., Tyumentseva I.S., Song Zhizhong, Afanasiev E.N. Combined application of magnetoimmunosorbents and PGR a new method for the indication' of Yersinia pestis Text.,// Chin. J. Contr. Endem. Dis. 1999. - V. 14, Spec. - P. 72.

64. Engelthaler D.M., Gage K.Ü., Montenieri J.A;,. Chu* M., Carter L.G. PCR detection of yersinia pestis in fleas: comparison; with mouse inoculation Text. // J; Clin. Microbiol. 1999. - V. 37, N 6. - P.1980-1984.

65. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 839 - 841.

66. Fetherston J.D:, Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 Text.// Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

67. Fetherston J.D., Lillard J.W., Jr., Perry R.D. Analisis of the pesticin receptor from Yersinia pestis: role in iron-deficient growth and, possible regulation by its siderophore Text. // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 1824 - 1833.

68. Fetherston J.D., Bearden S.W., Perry R.D: YbtA, an AraC type regulator of the Yersinia pestis pesticin/yersiniabactin receptor Text. // Mol. Microbiol.- 1996. V. 22.-P. 315-325.

69. Fetherston J.D., Bertolino V.J., Perry R.D. YbtP and YbtQ: two ABC transporters required for iron uptake in Yersinia pestis Text. // Mol. Microbiol. -1999. V. 32, N 2. - P. 289-299.

70. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kookleva L.M., Protsenko O.A. Plasmid content in Yersinia pestis strains of different origin Text. // FEMS Microbiol. Lett. -1990.-V. 67.-P. 45-48.

71. Fredericq P. Collicins Text. //Ann. Rev. Microbiol. 1957. -V 11. - P. 7-22

72. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency Yersinia enterocolitica Text. //Infect. Immun. 1980. - V. 27. -P. 682-685.

73. Gong S., Bearden S.W., Geoffroy V.A., Fetherston J.D:, Perry R.D. Characterization of the Yersinia pestis Yfu ABC inorganic iron transport system Text. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 5. - P. 2829-2837.

74. Haag H., Hanke K., Drechsel H., Stojiljkovic I., Jung G., Zähner H. Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica Text. // Gen. Microbiol. 1993. - V.139. - P! 2159 - 2165.

75. Hacker J., Blum-Oehler G., Mühldorfer I., Tschäpe H. Pathogenicity islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution Text. // Mol. Microbiol:- 1997.- V. 23.-P. 1089 1097.

76. Hare J.M., McDonough K.A. High-frequency RecA-dependent and*4 -independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis Text.// J. Bacteriol. 1999: - V. 181, N 16. - P. 4896-4904.

77. Heesemann J., Schubert S., Rakin A. Ecological aspects of evolutionary development of bacterial pathogens Text. // Nova Acta Leopoldina NF. 1999. - V. 78,№307.-P. 23 -38.

78. Higuchi K., Smith J1L. Studies on the nutrition and phisiology of Pasteurella pestis. VI. A different plating medium for estimation of the mutation rate to aviru-lence Text. // Ibid. 1961. - V. 81. -P. 605-608.

79. Hinnebush B.J., Perry R.D., Schwan T.G. Role of the hemin storage (hms) locus of Yersinia,pestis in the transmission of plague by fleas Text. // Science. — 1996. V. 273. -P: 367 - 370.

80. Hinnebusch B.J: Bubonic plague: a molecular genetic case history of the emergence of an infectious disease Text.'// J. Mol. Med. 1997. - Sep;75(9):645-652.

81. Hongwei Z. J. L. The detection of a sputum sample from a patient of plague pneumonia'with polymerase chain reaction (PCR) method Text. // Scient. J. 2000. -N8.-P. 191-193.

82. Hornung J.M., Jones H.A., Perry R.D. The hmu locus of Yersinia pestis is essential for utilization of free haemin and haem-protein complexes as iron sources Text. I I Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 725 - 739.

83. Hu P.C., Brubaker R.R. Characterization of pesticin: separation of antibacterial activities Text. // J. Biol. Chemi- 1974. V. 249, № 15. - P: 4749 - 4753.

84. Iqbal S.S., Chambers J.P., Brubaker R.R., Goode M.T., Valdes J.J. Detection of Yersinia pestis using branched DNA Text. // Mol. Cell. Probes. 1999. - V. 13, N 4.-P. 315-320.

85. Jackson S., Burrows T.W. The virulence-enhancing effect of iron; on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis Text. // Br. J. Exp. Pathol.- 1956.-V. 37.-P. 577- 583.

86. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S., Protsenko O.A-. Analisis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence Text. // Microb. Pathog. 1992. - V. 12. - P. 177 - 186.

87. Leal N.C., Almeida A.M. Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR Text. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao. Paulo. 1999. - V. 41, N6.-P! 339-342.

88. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L., Pendrak., Perry R.D. Sequence and genetic analysis of the hemin storage (hms) system of Yersinia pestis Text. // Gene. 1997.-V. 193.-P. 13-21.

89. Lowe T., Sharefkin J., Yang Sh., Dieffenbach C.W. A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reaction Text. // Nucl. Acids Res. 1990.-V. 18.-P. 1157- 1161.

90. Lucier T.S., Fetherston J.D., Brubaker R.R., Perry R.D. Iron uptake and iron-repressible polypeptides in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1996. - V. 64. -P. 3023-3031.

91. Martins C.H.G, T.M. Bauab, C.Q.F. Leite; D.P! Falcao Ribotyping and virulence, markers of Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from, animals, in Brazil Text. // Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 2007. - V.102(5) - P.587592 ' . • . ,

92. Neubauer H., Meyer Hi, Prior; J'., Aleksic'S.,.Hensel A., Splettstosser W. A combinatiomof: different polymerasexh^^identification^ of Yersiniarpiestisr Text. // J. Vet. Medí B; Infect. Dis. Vet. Public. Health. 2000. - V. 47, N 8. - P. 573-580: .

93. Norkina O.V., Kulichenko AN., Gintsburg A.L. et al; Development of a: diagnostic test for Yersinia:pestis by the polymerase chain reaction Text. // J'. Appl. Bacteriol. 1994,- V. 76. - P. 240-245. . , 4 . "

94. Pelludat C., Rakin A., Jacobi C.A., Schubert S., Heesemann J: The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation. Text. // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 538 -546.

95. Pendrak M.L., Perry R.'D: Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis Text.;// Biol. Metals 1991. - V. 4. - P; 41 - 47.

96. Perry R.D., Straley S.G., Fetherston J.D., Rose D.J:, Gregor J:, Blattrier F.R; DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 Text. // Infect. Immun; 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611-4623. . '

97. Portnoy. D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis Text. // J-. Bacterid. 1981. - V. 148. - P: 877 — 883:

98. Portnoy D.A:, Moseley S.L., Falkow S;. Characterization' of plasmids. and plasmid-associatedi determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis Text. // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 775-782.

99. Rakin A., Saken E., Harmsen D., Heesemann J. The pesticin receptor of Yersinia enterocolitica: a novel virulence factor with dual function Text. // Mol. Microbiol. 1994a. - V. 13. - P: 253 - 263.

100. Rakin A., Schubert S., Pelludat C., Brem D., Heesemann Jt The high-pathogenicity island of Yersiniae Text. // Pathogenicity islands and other mobile virulence elements. Amer. Soc. Microbiol., 1999. - P. 77 - 90.'

101. Rossi M.S., Feterston J.D., Letoffe S., Carniel E., Perry R.D., Ghigo J.M. Identification and characterization of hemophore-dependent heme acquisition system of Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 11. - P. 6707-6717. •

102. Sanger F., Nicklen S., Goulson A.R. Text. //Proc. Natl. Acad:Sci. USA. -1977. Vol.74: -P.5463-5467.

103. Scarlato V., Arico B., Prugnola A., Rappuoli R. Sequential activation and enviromental regulation of virulence genes in Bordetella pertussis Text. // EMBO J.- 1991.-V. 10.-P. 3971 -3975.

104. Schubert S The Yersinia high-pathogenicity island (HPI): evolutionary and functional aspects Text. // Int J Med Microbiol 2004. - 294:83-94.

105. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Resistance to pesticin, storage- of iron, and invasion of HeLa cells by Yersiniae Text. // Infect. Immun. 1987. - V.55. - P. 572 — 578.

106. Sikkema D.J., Brubaker R.R. Outer membrane peptides of Yersinia pestis mediating siderophore-independent assimilation of iron Text. // Biol. Metals. 1989.- V. 2.-P. 174-184.

107. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analysis of the 9,5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2743 - 2748.

108. Song Y., Tong Z., Wang J., Wang I., Guo Z., et al. Complete genome sequence of Yersinia pestis strain 91001 an isolate avirulent of humans Text.'// DNA Res. — 2003.-V. 11.-P. 179- 197.••' " 200 .

109. Souza G, Abath F, Leal N, Farias A, Almeida A. Development and evaluation-of ä single tube nested PCR based approach (STNPCR) for the diagnosis of plague. Text. // Adv Exp Med Biol. 2007;603:351-9.

110. Staggs T.M., Perry R.D. Fur regulation in Yersinia species Text. // Mol. Microbiol. 1992. - V.6. - P. 2507 - 2516.

111. Stojiljkovicr Ii, Hantke^ R. Transport of haemim across the; ;cytoplasmic membrane: through a- heamin-specific peripiasmic binding-protein-dependent transport system in Yersinia enterocolitica. Text. // Mol. Microbiol: 1994. - V. 13. -P. 719-732.

112. Thompson J.M., Jones H.A., Perry R.D. Molecular characterization of the hemin uptake locus (hmu) from Yersinia pestis and analysis of hmu mutants for hemin and hemoprotein utilization Text. // Infect. Immun. 1999* - V. 67, N 8. - P. 3879-3892. \

113. Wu DY, Wallace RB. The ligation amplification reaction (LAR) -amplification of specific DNA sequences using: sequential rounds of template-dependent ligation Text. // Genomics. 1989 May;4(4):560-9.

114. Zharnikova I.V., Tyumentseva I.S., Afanasiev E.N. Development of magnetoimmunosorbent diagnosticums for the detection of Yersinia pestis using rapid methods Text. // Chin. J. Contr. Endem. Dis. 1999. - V. 14, Spec. - P. 73.

115. Zhou D., Qin L., Han Y., Qiu J., Chen Z., Li B., Song Y., Wang J., Guo Z., Zhai J., Du Z., Wang X., Yang R. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis Text. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 258, N 1. -P. 9-17.