Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное моделирование внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих для изучения антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика
Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Петрова, Анна Валентиновна
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
ГЛАВА 1. БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ С ЭФФЕКТОРНЫМ ЗВЕНОМ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МАКРООРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩЕГО И ОСОБЕННОСТИ
ИММУНИТЕТА ПРИ ИЕРСИНИОЗАХ.
ГЛАВА 2. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ, ПАТОГЕНЕЗА И КЛИНИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ
ВЫЗЫВАЕМЫХ ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЙ.
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Бактериальные штаммы и питательные среды.
3.2. Антигены.
3.3. Клеточные линии и культуральные среды.
3.4. Реактивы и растворы.
3.5. Биофизические и иммунохимические методы.
3.5.1. Электрофорез.
3.5.2. Непрямой твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА).
3.5.3. ДОТ-иммуноанализ (ДИА).
3.5.4. Иммуноблоттинг.
3.6. Оборудование и приборы.
3.7. Лабораторные животные.
3.8. Статистические методы.
ГЛАВА 4. БИОФИЗИЧЕСКОЕ МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ, ИМИТИРУЮЩЕЙ IN VITRO ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ ПАРАЗИТИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.
4.1. Сравнительный анализ пролиферативной активности Y. pestis EV НИИЭГ на различных питательных средах.
4.2. Стимуляторы роста как компонент экспериментальных питательных сред при биофизическом моделировании условий паразитирования бактерий in vivo.
4.3. Изучение зависимости пролиферации чумного микроба в условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом, от содержания в питательной среде различных концентраций аминного азота.
4.4. Сравнительная характеристика пролиферации вирулентного штамма Y. pestis 231 при молекулярном моделировании внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих.
4.5. Зависимость пролиферации бактерий Y. pestis EV от продолжительности культивирования в физико-химических условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным.
ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ БИОФИЗИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНОЙ СРЕДЫ МАКРОФАГОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ДРУГИХ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ.
5.1. Пролиферативная активность У. pseudotuberculosis на различных питательных средах при молекулярном моделировании условий, приближенных к внутрифаголизосомальным.
5.2. Характеристика активности пролиферации Y. enterocolitica в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосомы, на различных питательных средах.
5.3. Изучение зависимости пролиферативной активности возбудителя псевдотуберкулеза от продолжительности культивирования в физико-химических условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих.
5.4. Особенности пролиферации кишечноиерсиниозных бактерий в зависимости от продолжительности культивирования в условиях in vitro, приближенных к внутрифаголизосомальным.
ГЛАВА 6. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ ПАТОГЕННЫХ
ИЕРСИНИЙ, СИНТЕЗИРУЕМЫМ В УСЛОВИЯХ, ПРИБЛИЖЕННЫХ К ВНУТРИФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫМ.
6.1.1. Модификация антигенной структуры бактерий Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica при культивировании на экспериментальных питательных средах, имитирующих физико-химические условия фаголизосом.
6.1.2. Получение и характеристика поликлональных антител к эффекторным Yops патогенных иерсиний.
6.1.3. Применение мышиных поликлональных антител для характеристики антигенов, синтезируемых близкородственными иерсиниями в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосомы макрофагов млекопитающих.
6.1.4. Изучение особенностей экспрессии эффекторных Yops при моделировании ранней стадии попадания патогенных иерсиний в интрацеллюлярные условия с помощью гомологичных поликлональных антител.
6.2. Получение и применение панели комплементарных моноклональных антител для изучения эпитопной специфичности антигенов Y. pestis, синтезируемых в условиях, имитирующих внутрифаголизосомальную среду макрофагов млекопитающих.
ГЛАВА 7. ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИНЦИПОВ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ.
7.1. Дифференциация pCad+ и pCad" штаммов псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактерий по способности пролиферировать при низких значениях рН питательной среды.
7.2. Конструирование экспериментальных тест-систем на основе специфических антител для выявления pCad+ штаммов патогенных иерсиний методами ДИА и иммуноблота.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное моделирование внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих для изучения антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями"
Инфекционные заболевания, вызываемые патогенными для человека иерсиниями, представляют реальную угрозу для здоровья общества ввиду своего повсеместного распространения, растущей заболеваемости, выраженного полиморфизма клинических проявлений и большого количества осложнений [25, 98, 127, 128, 201]. Согласно современной классификации, к ним относят трех представителей рода Yersinia — Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica [98, 127, 156]. Отличительной особенностью физического взаимодействия этих бактерий с макроорганизмом млекопитающего считают выраженную способность вирулентных штаммов преодолевать систему противомикробной резистентности макроорганизмов млекопитающих, в первую очередь, благодаря устойчивости к фагоцитозу, которая опосредована присутствием в геноме указанных микроорганизмов плазмиды кальцийзависимости (pLcr, pCad), обозначенной ранее как «плазмида вирулентности» [29, 30, 53, 67, 109, 132, 147, 149, 163, 229-231, 252, 262].
Работами отечественных и зарубежных ученых установлено, что данный плазмидный репликон обеспечивает иерсиниям продукцию ряда факторов, существенно влияющих на протекание физико-химических процессов в фагоцитирующей клетке, среди которых ключевое значение для ингибирования и блокирования бактерицидной активности фагоцитов, интрацеллюлярного размножения и реализации цитотоксичности с последующей деструкцией эукариотических клеток, результирующих в итоге незавершенность фагоцитоза при чуме и других иерсиниозах [11, 16, 29, 30, 53, 57, 109, 141, 158], имеют так называемые белки внешней мембраны или Yops [19, 25, 58, 67, 109, 162, 163, 179, 255, 257, 260]. В настоящее время эти антигены подразделяются на две основные группы: интрацеллюлярные эффекторы (Yop Е, Yop Н, Ypk A/Yop О, Yop P/Yop J, Yop M и Yop T) и транслокаторы (Yop В, Yop D и Lcr V), секреция которых реализуется III типом секреторных систем pCad+ штаммов патогенных иерсиний при температуре культивирования 37°С в условиях, имитирующих внутриклеточную (в том числе, внутрилейкоцитарную) среду макроорганизма [147, 148, 163, 164, 212, 222, 258, 262].
Для изучения закономерностей продукции Yops в макроорганизме наиболее приемлемым является конструирование молекулярно-биологической модели, представляющей собой вышеназванные бактерии, культивируемые в условиях, имитирующих по ряду физико-химических показателей реальную среду пребывания этих микробов в организме теплокровного животного. Долгое время считалось, что биофизические параметры, определяющие оптимальные условия для биосинтеза Yops in vitro можно обеспечить, используя рутинную бактериологическую среду с добавлением 20 шМ ионов Mg2+ [19, 32, 54, 55, 58, 272] и, по данным ряда авторов, 0,1% галактозы [29, 30, 52]. Однако в последние годы стало известно, что, попадая в фагоцит, т.е. на стадии интрацеллюлярного роста, патогенные иерсинии оказываются внутри фаголизосомы [25, 260], характерной особенностью которой является закисление рН среды до 3,5-4,5 за счет большого количества протеолитических ферментов [198]. В модельных экспериментах in vitro с использованием в качестве основной питательной среды бульона Хоттингера (БХ) для культивирования вакцинного штамма У pestis EV НИИЭГ и его изогенных производных, была подтверждена активная пролиферация pCad+ штаммов бактерий, продукция этими микроорганизмами основных эффекторных Yops, а также обнаружена способность к биосинтезу ряда «кислых» белков [119, 172], ранее выявленных R. Perry et al. [224] при секвенировании нуклеотидной последовательности pCDl штамма У pestis KIM5. Причем среди указанных антигенов, помимо детерминированных pCad, были выявлены дополнительно хромосомно-зависимые субстанции [119, 172], что подтверждает наблюдения ряда авторов об участии последних, хотя и в меньшей степени по сравнению с продуктами pCad, в защите возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза от фагоцитоза [28, 29, 124]. В то же время по данным литературы известно о неполной идентичности ДНК плазмидных репликонов патогенных иерсиний - так, гомология между pCad Y. pestis и Y. enterocolitica составляет около 50% [231], между Y. pestis и Y. pseudotuberculosis - около 90% [271]. Хотя ранее с помощью адсорбированной анти-pCad сыворотки было установлено иммунологическое родство большинства продуктов pCad Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica [19, 58, 144, 157, 162, 163, 177, 192, 231, 249, 271], вышеизложенное диктует необходимость более детальной характеристики основных эффекторных Yops, изучения биофизических закономерностей их продукции в условиях, симулирующих внутреннюю среду фаголизосом макрофагов млекопитающих, изучения иммунореактивности и иммунохимической идентичности полипептидов, синтезируемых интрацеллюлярно при нейтральных и кислых значениях рН, с учетом их потенциальной диагностической значимости для конструирования современных иммунодиагностических методов лабораторной диагностики иерсиниозов [216]. Неясным остается также вопрос - когда именно синтезируются указанные антигенные субстанции - в период контакта микробных клеток с фагоцитом (клеткой-мишенью) [188], интрацеллюлярно внутри фаголизосомы или экстрацеллюлярно до попадания патогена в эукариотическую клетку, и как это связано с молекулярной организацией Yops и других антигенов, синтезируемых в указанных физико-химических условиях, а также с модификацией антигенной структуры возбудителя чумы (на модели вакцинного и вирулентного штаммов) в целом. Не менее важно выяснить -имеет ли место данный феномен у других патогенных иерсиний, несущих pCad, являются ли условия культивирования, разработанные ранее для бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, оптимальными для вирулентных штаммов возбудителей псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, какие питательные среды -содержащие натуральные компоненты, синтетические или культуральные - в большей степени in vitro симулируют стадию интрацеллюлярного роста иерсиний in vivo и т.д. Данные вопросы представляют как практический, так и теоретический интерес и могут быть решены с помощью комплексного использования биофизических и микробиологических приемов, а также методов молекулярной иммунологии, в том числе, с помощью панели поликлональных, моноспецифических и разноэпитопных моноклональных антител (МКА). Это позволит не только исследовать структуру конкретных антигенов на уровне индивидуального эпитопа, но и разработать на основе полученных данных новые простые способы идентификации вирулентных (рСасГ) штаммов патогенных иерсиний и их дифференциации с авирулентными (рСасГ) вариантами бактерий.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ - конструирование молекулярно-биологической предметной модели, имитирующей по основным физико-химическим параметрам внутрифаголизосомальные условия макрофагов млекопитающих для выявления, идентификации и сравнительной иммунохимической характеристики антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Разработка и оптимизация практического применения оригинальной системы культивирования патогенных иерсиний in vitro для создания молекулярно-биологической предметной модели внутренней среды фаголизосом млекопитающих с применением рутинных бактериологических и культуральных сред, адекватных количеств ионов магния и модификацией рН среды выращивания.
2. Сравнительный анализ пролиферативной активности вирулентных (pCad+) и авирулентных (pCad") штаммов возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в биофизических модельных экспериментах.
3. Исследование влияния физико-химических условий культивирования на антигенную структуру патогенных иерсиний в целом, продукцию основных эффекторных Yops и других антигенов, потенциально задействованных в обеспечении интрацеллюлярной резистентности данных бактерий к фагоцитозу.
4. Получение поликлональных моноспецифических и моноклональных антител к очищенным препаратам основных эффекторных Yops, а также поликлональных сывороток к антигенам, синтезируемым близкородственными иерсиниями в условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным, для эпитопной характеристики, изучения иммунореактивности и особенностей продукции соответствующих антигенных субстанций на основных стадиях фагоцитоза - контакта с клеткой-мишенью и интрацеллюлярного роста патогенных иерсиний в биофизических модельных экспериментах in vitro.
5. Изучение диагностической значимости полученных антител и конструирование на их основе экспериментальной тест-системы для выявления в дот-иммуноанализе (ДИА) и иммуноблоте pCad+ штаммов патогенных иерсиний по их способности продуцировать маркерный белок Yop Е.
6. Определение перспективы практического применения феномена повышения пролиферативной активности pCad+ штаммов указанных возбудителей при закислении среды культивирования для дифференциации с pCad" вариантами бактерий.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые показана принципиальная возможность создания молекулярно-биологической предметной модели in vitro ранней стадии паразитирования in vivo! в организме чувствительных млекопитающих возбудителей чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Впервые генерирована панель поли- и моноклональных антител к отдельным иммунореактивным антигенам, синтезируемым рСасГ штаммами указанных возбудителей во внутрифаголизосомальной среде фагоцитов млекопитающих. В результате применения антител в сочетании с методами биофизики, микробиологии и молекулярной иммунологии получены новые приоритетные сведения о молекулярной организации, структурно-функциональных, иммунохимических и иммунобиологических свойствах эффекторных Yops, других антигенов и ассоциированных с ними отдельных иммунореактивных эпитопов, синтезируемых патогенными иерсиниями в физико-химических условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом макрофагов организма хозяина. Эти данные позволяют прояснить роль эффекторного звена иммунокомпетентной системы в защите макроорганизма от близкородственных иерсиний; установить особенности биофизических процессов, модификации антигенной структуры и поведения бактерий Y. pestis в сравнении с другими патогенными иерсиниями, имеющими высокую степень гомологии (до 80%) геномов [140], в модельных экспериментах, симулирующих физико-химические условия при их взаимодействии in vivo с клеткой-мишенью, что, несомненно, во многом определяет развитие и исход инфекционного процесса, а также, вероятно, существующие принципиальные различия в иммуно- и патогенезе вызываемых ими заболеваний.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Впервые сконструированы оригинальные питательные среды, приближенные по составу к внутрифаголизосомальной среде макрофагов млекопитающих, с применением рутинных бактериологических (синтетических и приготовленных на основе натуральных ингредиентов) и культуральных сред, с добавлением ионов магния в физиологических концентрациях и варьированием рН, что позволяет имитировать одну из ключевых стадий паразитирования патогенных иерсиний. Впервые проведено сравнительное изучение влияния различных физических и физико-химических условий культивирования (в том числе, отдельных компонентов сред, различных стимуляторов роста, температуры и длительности культивирования и других факторов) на пролиферативную активность pCad+ и pCad" штаммов указанных микроорганизмов. Важным для практического здравоохранения может быть разработанный методический прием ранней дифференциации указанных бактерий на потенциально вирулентные и авирулентные для человека варианты на основании различий в пролиферативной активности несущих и лишенных pCad штаммов при низких значениях рН среды культивирования. Впервые получена панель поли- и моноклональных антител к отдельным эффекторным Yops и другим антигенам, синтезируемым возбудителями чумы, псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в физико-химических условиях, симулирующих внутрифаголизосомальную среду фагоцитов млекопитающих. На основе полученных антител разработаны экспериментальные иммунодиагностические тест-системы для выявления pCad+ штаммов патогенных иерсиний методами дот-иммуноанализа и иммуноблота.
ДОСТОВЕРНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ. Достоверность результатов, представленных в работе, обусловлена использованием апробированных, широко применяемых в научной и клинической практике биофизических, бактериологических, иммунохимических методов, а также физических методов анализа и обработки экспериментальных данных. Статистический анализ полученных результатов проводили с вычислением средней арифметической абсолютных и относительных величин (М), средней ошибки средней арифметической (ш), коэффициента достоверности различия средних (t) по И.П. Ашмарину и А.А. Воробьеву [7]. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей и воспроизводятся при повторении экспериментов.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Для моделирования in vitro физико-химических условий, приближенных к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих при культивировании патогенных иерсиний с использованием в качестве основы БХ, BUI, RPMI с добавлением ионов магния и варьированием рН оптимальной питательной средой является БХ.
2. Штаммы Y pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, несущие pCad, и бесплазмидные варианты, так же как и Y. pestis способны активно пролиферировать в условиях, имитирующих внутрифаголизосомальные, несмотря на принципиальные отличия в уровне пролиферации указанных микроорганизмов.
3. Культивирование pCad+ и pCad" штаммов патогенных иерсиний в условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным, на основе БХ, BHI и RPMI обеспечивает изменения продукции спектра антигенов белковой и углеводной природы, в том числе эффекторных Yops, более выраженные при использовании в качестве базовой среды БХ.
4. При биофизическом исследовании с помощью сочетанного применения методов электрофореза, иммуноблота и панели поли- и моноклональных антител среди антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями в приближенных к внутрифаголизосомальным условиях, обнаружены, по крайней мере, 5 эффекторных Yops с различной эпитопной специфичностью. Принципиально различаются сроки, количество и иммунореактивность Yops, синтезируемых Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и У. enterocolitica.
5. Мышиные поликлональные моноспецифические антитела к препарату Yop Е имеют диагностическое значение, а сконструированные на их основе экспериментальные тест-системы позволяют идентифицировать плазмидсодержащие и бесплазмидные штаммы патогенных иерсиний методами ДИА и иммуноблота.
6. Особенности пролиферативной активности плазмидсодержащих и бесплазмидных штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica при закислении среды культивирования могут быть использованы для дифференциации pCad+ и pCad" штаммов указанных микроорганизмов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы были представлены на Международном Конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы», посвященном 80-летию института им. Пастера, С.-Петербург, 2003; Всероссийской юбилейной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологической безопасности Российской Федерации», посвященной 75-летию образования научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны РФ, Киров, 2003; Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекций», Саратов, 2003; III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004; 69-ой Итоговой научно-практической конференции сотрудников КГМУ, Курск, 2004; Научной конференции, посвященной 70-летию противочумной службы России «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны», Москва, 2004; Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век», Саратов, 2004; Юбилейной конференции «Новые технологии в профилактике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ, Н. Новгород, 2004; II Конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования», Египет, Хургада, 2005; Конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», Объединенные Арабские Эмираты, Дубай, 2005; VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», Волгоград, 2005; Итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2004, 2005, 2006.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ. Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении экспериментальных исследований, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка задач исследований осуществлялась научными руководителями д.м.н., с.н.с. В.А. Федоровой и д.м.н., профессором Ю.Ю. Елисеевым. Препараты очищенных белков Yop Е, Yop В, Yop Н/М, Yop D/N любезно предоставлены к.б.н. Н.А. Видяевой и к.б.н. А.Н. Микеровым.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (5 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 273 источника, из них зарубежных - 139. Объем диссертации составляет 197 страниц машинописного текста, включая 15 таблиц и 37 рисунков.
Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Петрова, Анна Валентиновна
выводы
1. При молекулярном моделировании условий, приближенных по ряду основных физико-химических параметров к внутренней среде фаголизосом млекопитающих установлено, что синтетические питательные среды (BHI, RPMI) даже с применением стимуляторов роста в меньшей степени пригодны для культивирования патогенных иерсиний по сравнению с БХ.
2. Доказано, что подобно возбудителю чумы, другие патогенные иерсинии также способны увеличивать численность своей популяции в указанных выше условиях, но оказываются менее требовательными к составу и качеству питательных сред.
3. В сравнительных биофизических модельных экспериментах в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих, показаны принципиальные отличия в пролиферативной активности патогенных иерсиний (у Y. pestis наиболее высокой, у Y. enterocolitica самой низкой), выращивание которых в указанных условиях сопровождается модификацией их антигенной структуры, более выраженной у Y. pestis и Y. pseudotuberculosis по сравнению с Y. enterocolitica. При этом наличие плазмиды кальцийзависимости обеспечивает более интенсивное размножение м.кл. и более серьезную антигенную перестройку псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактерий.
4. Установлено, что в процессе адаптации указанных микроорганизмов к имитирующим внутрифаголизосомальные физико-химическим условиям, принимают участие не только продукты белковой природы, по м.м. соответствующие известным эффекторным Yops и «кислым» белкам, синтез которых детерминирован плазмидой или хромосомой, но и антигены углеводной природы.
5. Впервые генерирована панель поли- и моноклональных антител к препаратам Yops (Yop Е, Yop В, Yop Н/М, Yop M/N, Yop D/N) и антигенам, синтезируемым патогенными иерсиниями, в условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным. С помощью полученных антител среди выявленных полипептидов обнаружен ряд ранее охарактеризованных Yops (Yop Е, Yop Н/М), несущих эпитопы с различной специфичностью. Показаны различия в молекулярной структуре, иммунореактивности, особенностях биосинтеза антигенов У pestis, У pseudotuberculosis, У enterocolitica при моделировании разных этапов фагоцитоза (стадии адгезии, фагосомы, фаголизосомы) in vitro.
6. Предложен оригинальный, технически простой и относительно быстрый метод, позволяющий по более выраженной пролиферативной активности pCad+ штаммов У. pseudotuberculosis и У enterocolitica при рН 4,0 среды культивирования дифференцировать их от pCad" вариантов указанных микроорганизмов.
7. На основе мышиных поликлональных моноспецифических антител к Yop Е сконструированы экспериментальные иммуноглобулиновые тест-системы, позволяющие идентифицировать плазмидсодержащие и бесплазмидные штаммы патогенных иерсиний методами ДИА и иммуноблота.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение закономерностей, лежащих в основе взаимодействия живых систем между собой, представляет безусловно важную, но весьма непростую задачу современной биофизики [22, 23, 27, 92, 95]. Поскольку прямое наблюдение за изменением жизнедеятельности каждой из биосистем на различных стадиях их физического контакта далеко не всегда возможно, перспективным является применение с этой целью метода моделирования [94]. В медицине и биологии используют различные категории моделей в зависимости от задач эксперимента. В частности, для исследования особенностей поведения патогенной бактерии и модификации ее антигенной структуры в организме человека наиболее целесообразно создание in vitro молекулярно-биологической модели определенных этапов паразитирования микроба с максимально точным соблюдением ключевых физико-химических условий, в которых пребывает микроорганизм in vivo [92, 94, 95].
Как известно, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica являются факультативными внутриклеточными паразитами [31, 85, 101, 102, 233]. Попадая в макроорганизм и противодействуя его системе неспецифической защиты, они сохраняют жизнеспособность и размножаются внутри фагоцитов организма хозяина [11, 14, 28-31, 53, 91, 101, 102, 124, 132]. В экспериментах с макрофагами мыши и морской свинки in vivo и in vitro с использованием электронной микроскопии установлено, что эти микроорганизмы оказываются заключенными в фаголизосому [11, 28-30, 53, 91, 124, 132], где в результате их цитопатического действия происходит ингибирование респираторного взрыва, и, как следствие, прекращение фагоцитоза [6, 11, 15, 28-30, 53, 91, 124, 127, 132]. Это ведет к гибели эукариотических клеток-мишеней, выходу патогенов во внутреннюю среду организма млекопитающего и их диссеминации [11, 16, 29, 30, 53, 57, 109,141, 158].
Способность преодолевать фагоцитарный барьер макроорганизма связывают в основном с наличием в геноме патогенных иерсиний плазмиды кальцийзависимости [29, 30, 53, 67, 109, 132, 147, 149, 163, 229-231, 252, 262]. Данный плазмидный репликон обеспечивает иерсиниям продукцию ряда факторов, среди которых ключевое значение практически на всех этапах фагоцитоза при чуме и других иерсиниозах имеют так называемые белки внешней мембраны или Yops [19, 25, 58, 67, 109, 138, 162, 163, 165, 166, 179, 255, 257, 260]. Реализация их функций определяет исход фагоцитоза. Принципиальные отличия в иммуно-, патогенезе и клинических проявлениях заболеваний, вызываемых возбудителями чумы, псевдотуберкулеза, кишечного иерсиниоза [1, 38, 86, 98, 101, 102, 134], являются следствием особенностей развития фагоцитарных реакций и функционирования эффекторного звена иммунокомпетентной системы в организме чувствительных млекопитающих и, соответственно, молекулярных механизмов реализации вирулентности патогенных иерсиний [25, 30, 31, 101, 102, 125].
Вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования, целью которого явилось сравнительное изучение молекулярных механизмов интрацеллюлярной резистентности патогенных иерсиний при моделировании in vitro условий, приближенных к внутрифаголизосомальным, а также идентификация и иммунохимическая характеристика с помощью панели поликлональных и моноклональных антител антигенов, синтезируемых на заключительных этапах фагоцитоза и играющих ключевую роль в защите м.кл. от факторов агрессии со стороны организма хозяина.
Как известно, индукция биосинтеза кальцийзависимых белков иерсиниями in vitro осуществляется при добавлении к среде культивирования ионов магния при температуре 37°С, в физико-химических условиях, соответствующих внутриклеточной среде, а также внутри фаголизосомы, где происходят процессы, результирующие исход иммунологических реакций и определяющие развитие иммунного ответа макроорганизма [72, 80, 82, 93]. Отличительной особенностью этой среды является снижение рН до 3,5-4,5 [198]. В модельных экспериментах in vitro при закислении рутинной бактериологической среды -БХ - до 4,0 была подтверждена способность вакцинного штамма Y. pestis EV и его изогенных производных активно пролиферировать и продуцировать не только Yops, но и ряд «кислых» белков [119, 172], детерминируемых как pCad, так и хромосомой [119, 172], существование которых было предсказано ранее R.
Perry et al. [224] при секвенировании нуклеотидной последовательности pCDl штамма Y. pestis KIM5.
На первом этапе нашей работы изучали возможность использования синтетических бактериологических и культуральных питательных сред для молекулярного моделирования in vitro внутрифаголизосомальных условий, чтобы установить является ли их применение более перспективным по сравнению со средами, приготовленными из натурального сырья. Синтетические питательные среды (ВШ, RPMI и др.) широко используются за рубежом и в нашей стране, благодаря ряду преимуществ. Для ответа на этот вопрос было проведено сравнительное изучение пролиферативной активности бактерий чумы в условиях, приближенных по ряду ключевых биофизических параметров к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих, созданных на основе БХ, ВШ, RPMI.
Как известно, вирулентность штамма во многом определяет исход фагоцитоза [57]. Вирулентные и аттенуированный вакцинный (К pestis EV-76) штаммы при температуре 37°С на искусственных питательных средах в присутствии ионов магния проявляют сходство в поведении [154, 193, 194], однако первые вызывают инфекционное заболевание, а второй - вакцинальный процесс. В связи с этим в настоящей работе использовали бактерии Y. pestis 231 и Y pestis EV НИИЭГ.
Поскольку способность чумных бактерий размножаться внутри фаголизосомы предположительно связывают с существованием у возбудителя чумы специфического механизма ингибирования фибринолитической активности при закислении среды культивирования [119, 172], то изучение закономерностей пролиферативной активности проводили также у бактерий моноплазмидного изогенного варианта вакцинного штамма - Y. pestis КМ-216, несущего только pPst, которая детерминирует синтез фибринолизина и пестицина [90, 223].
Оказалось, что бактерии вакцинного штамма Y. pestis EV и его изогенного производного активно размножались на БХ в физико-химических условиях, имитирующих внутреннюю среду фаголизосом макрофагов млекопитающих in vitro. Бактерии 231 штамма чумы в указанных условиях увеличивали численность популяции не только на БХ, но и на RPMI, причем этот процесс у них был намного активнее, чем у вакцинного штамма Y. pestis, что, на наш взгляд, определяет исход заключительной стадии фагоцитоза и обусловливает принципиальные отличия в развитие специфических иммунологических реакций в ходе вакцинального и инфекционного процессов, вызываемых Y. pestis EV и Y. pestis 231, соответственно.
Отсутствие пролиферации у м.кл. вакцинного штамма на BHI и RPMI возможно было связано с недостаточным содержанием в этих средах необходимых питательных веществ, потребность в которых у бактерий, находящихся в «кислых» условиях, закономерно возрастает [9]. К тому же известно, что пептон, являющийся основой ВШ, в присутствии ионов щелочноземельных металлов образует преципитаты аминокислот, препятствующие размножению микробов за счет резкого снижения ростовых свойств среды [265]. Аналогичное явление может вызвать любое отклонение рН среды от нейтрального. Видимо, сходные причины также могли инициировать ингибирование пролиферации Y. pestis EV и на RPMI.
Данные, полученные при использовании БХ для биофизического моделирования условий внутренней среды фаголизосом макрофагов млекопитающих согласуются с результатами других исследователей в экспериментах in vivo [19, 54, 55, 58, 207], поэтому, с нашей точки зрения, БХ является наиболее подходящей средой, позволяющей моделировать in vitro вышеуказанные условия.
При культивировании Y. pestis EV на синтетических питательных средах при рН 4,0 отмечалась ростовая рестрикция, хотя известно, что эти среды в обычных условиях при рН, близких к нейтральным, по ростовым качествам превосходят БХ [24, 51, 104, 105]. В связи с этим следующим этапом исследования явилось использование стимуляторов роста для активации пролиферативной активности на ВШ и RPMI, учитывая, что в экспериментах in vivo внутри фаголизосомы наблюдалось выраженное увеличение численности клеточной популяции чумных бактерий [237-239, 241, 242]. Наряду с традиционными стимуляторами роста, применяемыми при культивировании чумного микроба (гемолизированная кровь, сульфит натрия, витамин В1, фетальная сыворотка, кислотный гидролизат казеина) [24, 31, 51, 73, 74, 78, 103-105, 113, 122, 223] в работе использовали также глюкозу, галактозу, ионы кальция, BSA [2, 10, 193, 194, 205]. В ходе исследования оказалось, что только BSA обеспечивал выживание и активную пролиферацию бактерий Y. pestis EV в указанных выше условиях. Естественно полагать, что его применение при культивировании чумных бактерий открывает возможность использования ВШ при добавлении адекватной концентрации ионов магния и рН 4,0.
Дальнейшим этапом работы явилось улучшение ростовых свойств БХ как оптимальной основы для имитации внутрифаголизосомальных физико-химических условий. С этой целью м.кл. вакцинного штамма чумы выращивали на БХ в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом, в присутствии азотсодержащих веществ химического происхождения (хлористого аммония или сульфата аммония) [69]. В других экспериментах варьировали содержание аминного азота в среде культивирования. Указанные азотсодержащие вещества не обеспечивали стимулирующего влияния на пролиферацию бактерий чумы, а потребность в аминном азоте зависела от режима культивирования бактерий вакцинного штамма. Так, для активной пролиферации при выращивании при температуре 28°С в течение 24 ч с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч микробным клеткам требовалось от 100 до 150 мг% аминного азота, а при температуре 37°С в течение 24 ч - 120-180 мг%.
В отдельных экспериментах проводили детальное изучение особенностей пролиферации вакцинного и вирулентного штаммов чумы в первые часы пребывания м.кл. внутри фаголизосомы. Для этого бактерии выращивали на указанных ранее средах в течение 12 ч. Оценку пролиферативной активности проводили через 0,5-12 ч от начала культивирования. В ходе исследования было установлено, что бактерии вирулентного штамма начинали пролиферировать уже в течение первых 30 мин в условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным, тогда как у бактерий вакцинного штамма этот процесс начинался в более поздние сроки. Следует отметить,что концентрация м.кл. вирулентного штамма существенно превышала таковую вакцинного. При этом выявленная закономерность регистрировалась на всех использованных в настоящей работе питательных средах. Полученные результаты указывают на принципиальные различия в поведении бактерий вирулентного и вакцинного штаммов чумных бактерий в условиях, приближенных по основным физико-химическим показателям к внутренней среде фаголизосом фагоцитов млекопитающих, что определяет особенности развития интрацеллюлярной иммунологической резистентности при инфекционном и вакцинальном процессах, вызываемых У. pestis.
Хотя плазмиды вирулентности патогенных иерсиний имеют высокую гомологию, однако они не являются идентичными [231, 271]. В связи с этим проводили изучение поведения других патогенных иерсиний в аналогичных условиях, в ходе которого было показано, что Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, также как и чумной микроб, пролиферировали в условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом макрофагов млекопитающих. Однако бактерии псевдотуберкулеза размножались активнее по сравнению с кишечноиерсиниозными. Та же закономерность наблюдалась при сравнении pCad+ и pCad" штаммов: последние делились менее интенсивно. Характерной особенностью явилось и то, что при культивировании Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica при температуре 37°С они оказались менее требовательными к составу и качеству питательных сред независимо от продолжительности срока инкубации (от 0,5 ч до 24 ч). Однако несмотря на это, пролиферативная активность Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica при молекулярном моделировании внутрифаголизосомальных условий оказалась значительно ниже по сравнению с бактериями чумы, что отражает различную степень интрацеллюлярной резистентности данных микроорганизмов к фагоцитозу и, соответственно, способности преодолевать этот важный барьер иммунной системы организма чувствительных к соответствующим инфекциям млекопитающих [11, 28-30, 53, 91, 119, 124, 132, 172].
Так как любые изменения условий культивирования бактерий инициируют активацию адаптивных механизмов м.кл., сопровождающуюся антигенной перестройкой [9, 19, 58, 68, 116, 119, 172, 258], а к моменту проведения наших исследований уже имелись сведения об антигенной структуре вакцинного штамма в условиях, приближенных к внутрифаголизосомальным [119, 172], то несомненный интерес представляло исследование спектра антигенов у других патогенных иерсиний, а также Y. pestis EV на синтетических средах в аналогичных экспериментах (БХ с добавлением 20 mM Mg2+ и 0,1% галактозы, рН 4,0). Согласно полученным данным, у всех патогенных иерсиний наблюдалось изменение спектра синтезируемых антигенов, более выраженное на БХ. Характерно, что у чумных бактерий вакцинного штамма регистрировались более глубокие изменения антигенной структуры по сравнению с другими близкородственными иерсиниями. У Y. pseudotuberculosis, в свою очередь, этот процесс был выражен сильнее, чем у кишечноиерсиниозных бактерий. Причем у рСасГ штаммов количество антигенов, синтезируемых в приближенных к внутрифаголизосомальным условиях, преобладало над pCad" штаммами соответствующих микроорганизмов. Это объясняет различия в способности плазмидсодержащих и бесплазмидных вариантов иерсиний противостоять фагоцитозу и соотносится с данными настоящей работы и других исследователей [29, 124], подтверждающими менее выраженные адаптивные механизмы у последних.
В результате исследования удалось выявить ряд белков, которые по м.м. соответствовали некоторым известным Yops, а также «кислым» полипептидам [19, 58, 116, 146, 149, 223, 224, 257]. Для подтверждения того, являются ли выявленные нами антигены описанными ранее Yops, были получены мышиные поликлональные антитела к очищенным белкам Yops и другим антигенам, синтезируемым в имитирующих внутрифаголизосомальные условиях. С их помощью проводили изучение серологической иммунореактивности выявленных субстанций в реакциях, основанных на взаимодействии антигена с антителом. Было установлено, что в физико-химических условиях in vitro, приближенных к внутрифаголизосомальным, патогенные иерсинии синтезировали ряд полипептидов, в том числе, калыдайзависимые белки, которые являлись серологически родственными у трех патогенных для человека представителей рода Yersinia. Интересно, что чумной микроб обладал большим количеством иммунореактивных антигенов по сравнению с псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозным микробами.
Помимо этого с помощью полученных поликлональных моноспецифических антител в модельных биофизических экспериментах проводилось изучение особенностей экспрессии основных эффекторных Yops на разных стадиях фагоцитоза. Методом ДИА было установлено, что патогенные иерсинии синтезировали как минимум 5 эффекторных Yops (Yop Е, Yop Н/М, Yop Р, Yop Т), которые оказались серологически родственными у Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Однако следует отметить принципиальные отличия в уровне продукции и иммунореактивности этих антигенов у каждого из данных микроорганизмов. В настоящем исследовании при моделировании in vitro соответствующих условий удалось выявить, что у чумных бактерий биосинтез всех вышеуказанных субстанций происходил в течение всего периода взаимодействия с фагоцитами млекопитающих, в том числе, внутрифаголизосомально. Другие патогенные иерсинии кратковременно продуцировали упомянутые Yops преимущественно в фагосоме и лишь в небольших количествах - в фаголизосоме. Данное наблюдение также объясняет различия в развитии иммунного ответа при заболеваниях, вызываемых этими микроорганизмами, связанные с презентацией антигенов, формированием В-клеток памяти и, в целом, индукцией адаптивного иммунитета к соответствующим инфекциям.
Для изучения тонкой структуры антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями в физико-химических условиях, приближенных к внутренней среде фаголизосом, на уровне индивидуального эпитопа и определения их иммунобиологических и иммунохимических свойств была получена панель комплементарных МКА. С их помощью удалось установить, что у ряда антигенных субстанций сохранялись родоспецифические иммунореактивные эпитопы, которые выявлялись при выращивании патогенных иерсиний на средах, имитирующих внутрифаголизосомальные условия, а также появлялись антигенные детерминанты с иной специфичностью. Данное обстоятельство позволяет предполагать, что в основе молекулярных механизмов иммунологической резистентности к фагоцитозу у патогенных иерсиний лежат сходные, но не идентичные иммунологические реакции.
Повсеместное распространение патогенных для человека иерсиний, растущая заболеваемость инфекциями, вызываемыми этими микроорганизмами, выраженный полиморфизм клинических проявлений, большое количество осложнений наряду с отсутствием эффективной диагностики [25, 98, 127, 128, 201] определило направление дальнейших исследований. Выявленные в настоящей работе особенности пролиферативной активности рСасГ и pCad" штаммов псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактерий в «кислых» условиях были подтверждены на микроорганизмах других штаммов патогенных иерсиний со сходными характеристиками. Это открывает перспективу использования наблюдаемого феномена для дифференциации плазмидсодержащих и бесплазмидных штаммов указанных микроорганизмов.
Учитывая особенности экспрессии патогенными иерсиниями Yop Е и его ключевую роль в индукции интрацеллюлярной резистентности [258], он может служить универсальным маркером для диагностики инфекций, вызываемых указанными микроорганизмами. С помощью мышиных моноспецифических антител к этому белку также была показана принципиальная возможность идентификации рСасГ и pCad" штаммов современными методами иммунохимического анализа - ДИА и иммуноблота.
Обобщая весь представленный в настоящей диссертационной работе материал, следует отметить, что применение современных методов биофизики и микробиологии, в сочетании с иммунохимическими методами при моделировании физико-химических условий внутренней среды фаголизосом макрофагов млекопитающих позволило выявить ряд особенностей пролиферативной активности, изучить антигенную структуру и частично охарактеризовать эпитопную композицию основных антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями в указанных условиях, а также решить некоторые вопросы, связанные с разработкой методов дифференциации плазмидсодержащих и бесплазмидных штаммов этих бактерий.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Петрова, Анна Валентиновна, Саратов
1. Авцын А.Д., Жаворонков А.А. Патология иерсиниозов // Арх. пат. 1980. - Т.П.-Вып. 5.-С. 4-13.
2. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983.
3. Амброзиус X. Получение сывороток от различных животных. В кн.: Иммунологические методы. Под ред. Г. Фримеля. М.: Медицина, 1987. - С. 920.
4. Ананьева Л.П., Студенцов Е.Е., Левин Э.Б. Определение антиборрелиозных антител методом иммуноблоттинга при боррелиозе Лайма // Клин. лаб. диагностика. 2002. - № 6. - С. 45-47.
5. Антитела. Методы: В 2-х кн. / Под. ред. Д. Кэтти. Т. 1-2. М.: Мир, 1991.
6. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1., 2002.-С. 3-22.
7. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962.
8. Банникова В.А. Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для лабораторной диагностики хламидиоза: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 2004.
9. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. Москва, 2003.
10. Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф., Шубин Ф.Н., Тимченко Н.Ф. Влияние глюкозы и галактозы на морфологию и биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis IIЖМЭИ. 2005. - № 5. - С. 6-10.
11. Беседнова Н.Н., Тимченко Н.Ф., Горшкова Р.П., Сомов Г.П. Взаимодействие возбудителя псевдотуберкулеза с перитонеальными макрофагами иммунного и неиммунного организма // ЖМЭИ. 1975. - № 10. -С. 39-44.
12. Беседнова Н.Н. Экспериментальное и клинико-иммунологическое изучение псевдотуберкулезной инфекции: Автореф. дис. . докт. мед. наук. -М., 1979.-С. 47.
13. Биологические мембраны. Методы. / Под ред. Дж. Финдлея, У. Эванза. -М.: Мир, 1990.
14. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -Медицинское информационное агентство, Москва, 2002.
15. Васильева Г.И., Пустовалов В.Д., Таранова В.Н. Оценка "латентной" вирулентности вакцинных штаммов чумного микроба по степени завершенности фагоцитоза // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов. 1979. - Вып. 5(69). - С. 52-55.
16. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение // Журн. микробиол. 1996. - № 3. - С. 43-46.
17. Вертиев Ю.В., Шмитт К.К., Мейсик К.С., О' Брайен А.Д. Бактериальные токсины: друзья или враги? // Клин, микробиол. и химиотер. 2000. - № 2(1). -С. 4-15.
18. Видяева Н.А. Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis II Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1992.
19. Видяева Н.А., Кутырев В.В., Проценко О.А., Олейников П.Н., Анисимов П.И. Экспрессия антигенов чумного микроба, кодируемых плазмидой Са2+зависимости // Мол. генетика. 1990. - № 6. - С. 17-21.
20. Владимиров Ю.А., Рощупкин Д.И., Потапенко А .Я., Деев А.И. Биофизика. М.: Медицина, 1983.
21. Волькенштейн М.В. Биофизика. -М.: Наука, 1988.
22. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии. Т. 1. - М.: Мир, 1983.
23. Голубинский Е.П., Коновалова Ж.А., Дубровина В.И. Современные аспекты фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis II Журн. инфекционной патологии. -2001. -№ 2-3(8). С. 102-107.
24. Грашкин В.А. Эффективность использования различных вариантов иммуноферментного анализа для диагностики гонореи и трихомониаза: Автореф. дис.канд. мед. наук. Саратов, 2000.
25. Губанов Н.И., Утепбергенов А.А. Медицинская биофизика. М.: Медицина, 1978.
26. Дайтер А.Б., Полоцкий Ю.Е., Ценева Г.Я. Патогенные свойства иерсиний и их роль в патологии иерсиниозов // ЖМЭИ. 1987. - № 2. - С. 108-115.
27. Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Борсук Г.И., Балахонов С.В., Коновалова Ж.А. Особенности фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид // Мед. паразитология и паразит, болезни. 1999. - № 4. - С. 50-53.
28. Дубровина В.И. Механизмы фагоцитоза и его роль при формировании резистентности организма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии (экспериментальное исследование): Автореф. дис. . докт. биол. наук. Иркутск, 2004.
29. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998.
30. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991.
31. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977.
32. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985.-С. 196.
33. Заболотный Д.К. Сборник работ по чуме. Вып. 1. - Чума (Pestis bubonica), СПБ, 1907.
34. Залмовер И.Ю. Клиника дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ленинград, 1969.
35. Заренков М.И., Гончаров Е.К. Влияние 6 Md плазмиды Yersinia pestis EV76 на состав внешне мембранных белков Yersinia pseudotuberculosis YPIII // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1991. - № 3. - С. 16-19.
36. Захарова И .Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982.
37. Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988.
38. Иммуноферментный анализ / Под. ред. Нго Т., Ленхоффа Г. М.: Мир, 1988.
39. Исачкова Л.М. Псевдотуберкулез (пато- и морфогенез): Автореф. дис. . докт. мед. наук. Москва, 1991.
40. Исачкова Л.М., Жаворонков А.А., Антоненко Ф.Ф. Патология псевдотуберкулеза. Владивосток: Дальнаука, 1994. - С. 189.
41. Исупов И.В., Бугоркова С.А., Кутырев В.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры. Саратов, 2004.
42. Исупов И.В., Белобородов Р.А. Экспериментальная патоморфология при использовании живой чумной вакцины. Саратов, 1995.
43. Кетти Д., Райкундалия Ч. Получение поликлональных антител и контроль их качества. М., Мир, 1991.
44. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. 1. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (Обзор)//Биохимия.- 1993.-Т. 58.-Вып. 2.-С. 166-181.
45. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. II. Структура кора (Обзор) // Там же. С. 182-201.
46. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор)//Там же.-1994.-Т. 59.-Вып. 12.-С. 1784-1851.
47. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. -Москва, 1950.
48. Колонцов А.А., Устин А.В., Макаров В.В. Иммуноблотинг в вирусологии // Вопросы вирусологии. М.: Медицина. - 1987. - № 4. - С. 397-403.
49. Коновалова Ж.А. Бактерицидные механизмы фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид: Автореф. канд. . биол. наук. -Иркутск, 2002.
50. Коробов В.И. Получение очищенных препаратов V и W антигенов чумного микроба и их характеристика: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Ленинград, 1986.
51. Коробова О.В. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез V- и W- антигенов у штамма EV НИИЭГ чумного микроба // Проблемы специфической профилакт. чумы и холеры. Саратов, 1985. - С. 10-14.
52. Куклева JI.M. Сравнительное изучение фагоцитарной активности перитонеальных и альвеолярных макрофагов в отношении штаммов чумного микроба. Механизмы формирования иммунитета к особо опасным инфекциям. -Саратов, 1986.-С. 22-32.
53. Куклева JI.M. Фагоцитоз перитонеальными и альвеолярными макрофагами штаммов возбудителя чумы, отличающихся по вирулентности и антигенному составу: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1989.
54. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Автореф. дис. докт. мед. наук. Саратов, 1992.
55. Мазинг Ю.А. Гистологическая и цитохимическая характеристика экспериментальной и спонтанной псевдотуберкулезной инфекции: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Ленинград, 1982.
56. Малый В.П. Клинико-иммунологические, аллергические и иммуногенетические особенности безрецидивных, рецидивирующих, затяжных и микст-форм псевдотуберкулеза: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Москва, 1987.
57. Марданлы С.Г., Доровская С.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к индивидуальным белкам вируса иммунодефицита человека типа 1 методом иммуноблоттинга (вестерн-блот) // Клин. лаб. диагностика. 2004. - № 4. - С. 34-36.
58. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Медицина, 1986.
59. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М.: Мир, 1967.
60. Методы практической биохимии / Под ред. Уильямса Б., Уилсона К. М.: Мир, 1978.
61. Мецлер Д. Биохимия. Т. 1. -М.: Мир, 1980.
62. Мечников И.И. Успехи науки в изучении чумы и в борьбе с нею. Речь -СПБ, 1897, С. 18.
63. Микеров А.Н., Кутырев В.В. Белки внешней мембраны иерсиний, кодируемые плазмидой вирулентности // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1997.-№3.-С. 3-10.
64. Микеров А.Н. Секретируемые белки (Yop), кодируемые плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы: выделение и изучение иммунобиологических свойств: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1999.
65. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.
66. Моноклональные антитела / Под. ред. Кеннета Р.Г., Мак-Керна Т.Дж., Бетхол К.Б. М.: Медицина, 1983.
67. Мотавкина Н.С., Малый В.П., Туркутюков В.Б. Иммуногенетические исследования при псевдотуберкулезе (дальневосточной скарлатиноподобной лихорадке). ДСЛ. (Псевдотуберкулез человека). JL, 1978. - С. 122-127.
68. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. -Саратов, 1992.
69. Наумов А.В., Самойлова Л.В. Руководство по профилактике чумы. -Саратов, 1992.
70. Николаев Н.И. Руководство по профилактике чумы. Саратов, 1972.
71. Новикова О.Д., Вострикова О.П., Порнягина О.Ю., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Антигенные свойства поринов наружной мембраны рода иерсиний // БЭМБ 1996. - № 6. - С. 657-660.
72. Новые методы иммуноанализа / Под ред. Коллинза У.П. М.: Мир, 1991.
73. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ. Г.А. Заварзина. Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П., Стейли Дж., Уильямса С. В 2 т. - Москва: Мир, 1997.
74. Основы лабораторной техники при работе с возбудителями особо опасных инфекций. Алма-Ата, 1982.
75. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.
76. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1982.
77. Петров Р.В. Иммунология: учебник для студентов медицинских институтов. М., Медицина, 1987.
78. Плейфэр Д. Наглядная иммунология. М.: ГЭОТАР «Медицина», 1998.
79. Покровская М.П., Каганова П.С. Цитологический метод изучения механизма иммунитета. Свердловск: Медгиз, 1947.
80. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука, 1976.
81. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР «Медицина», 1999.
82. Покровский В.И., Ющенко Г.В. Псевдотуберкулез // Руководство по инфекционным болезням. М., 1986. - С.43-44.
83. Пол У. Иммунология: В 3-х т. Т. 1-3. М.: Мир, 1987-1989.
84. Практикум по биохимии / Под ред. Северина С.Е., Соловьевой Г.А. -Изд-во Московского ун-та, 1989.
85. Практикум по иммунологии / Под. ред. Кондратьевой И.А., Ярилиной А.А. М.: Academa, 2004.
86. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Усиление вирулентности Yersinia enterocolitica в процессе пассирования через инфузории и макрофаги млекопитающих (сравнительное исследование) // ЖМЭИ. 1991. - № 7. - С. 24.
87. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика. М.: Высш. школа, 1999.
88. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000.
89. Романовский Ю.М., Степенова Н.В., Чернавский Д.С. Математическое моделирование в биофизике. Введение в теоретическую биофизику. Москва-Ижевск: ИКИ НИЦ РХД, 2004.
90. Рубин А.Б. Биофизика: В 2-х т. Т. 1, 2. Москва, 1999.
91. Самелия Ж.Г. Изучение антигенной структуры различных серовариантов возбудителя псевдотуберкулеза с использованием поли- и моноклональных антител: Автореф. канд. . биол. наук. Саратов, 2002.
92. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985.
93. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы // Клин, микробиол. и антимикробн. химиотер. 2004. - № 1(6). - С. 10-21.
94. Соколова Е.Е. Совершенствование методов серологической идентификации серовара 09 и дифференциальной диагностики антигенного ответа при иерсиниозе и бруцеллезе: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. -Ростов-на-Дону, 1986.
95. Сомов Г.П. Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. М., 1979.
96. Сомов Г.П. и др. Псевдотуберкулез. М., 1990. - С.240.
97. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001 - С. 253.
98. Справочник биохимика. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991.
99. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. Биргера М.О. М.: Медицина, 1967.
100. Справочник по микробиологическим питательным средам / Под ред. Меджидова М.М. Махачкала, 1989.
101. Сырова Н.А. Получение, характеристика и биотехнологические аспекты применения поли- и моноклональных антител к антигенам Vibrio cholerae Ol Инаба и Огава: Автореф. канд. . биол. наук. Саратов, 2005.
102. Терешкина Н.Е. Изучение капсульных и бескапсульных форм Vibrio cholerae 0139 с использованием поли- и моноклональных антител: Автореф. канд. . мед. наук. Саратов, 2004.
103. Тимченко Н.Ф. Патогенетическое значение психрофильности Yersinia pseudotuberculosis: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Владивосток, 1989.
104. Тимченко Н.Ф. Факторы патогенности Yersinia pseudotuberculosis и некоторые аспекты патогенеза псевдотуберкулеза // ЖМЭИ. 1997. - № 5. - С. 25-29.
105. Туртюков В.Б. Гетерогенные антигены псевдотуберкулезных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Владивосток, 1978.
106. Уткин Д.В. Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител: Автореф. дис. канд. . биол. наук. Саратов, 2004.
107. Уткин Д.В., Девдариани З.Л., Федорова В.А., Дроздов И.Г. Получение и характеристика моноклональных антител к различным серовариантам Yersinia enterocolitica // Биотехнол. 2004. - № 1. - С. 91-96.
108. Фаллер Д.М., Шилдс Д. Молекулярная биология клетки / Руководство для врачей. Москва, Бином-Пресс, 2004.
109. Федорова В. А. Получение и научно-прикладное значение моноклональных антител к липополисахариду Yersinia pestis: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1994.
110. Федорова В.А. Теоретико-экспериментальные аспекты изучения белковых и углеводсодержащих антигенов возбудителей чумы и холеры с использованим поли- и моноклональных антител: Автореф. докт. . мед. наук. -Саратов, 2004.
111. Федорова В.А., Голова А.Б. Внеклеточная резистентность возбудителя чумы к фагоцитозу // Вестник РАМН. 2005. - № 10. - С. 19-25.
112. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л., Джапаридзе М.Н. Иммунохимическая характеристика липополисахарида Vibrio cholerae 0139 сероварианта и диагностическая значимость полученных к нему антител // Биотехнология. 1996. - № 11. - С. 33-37.
113. Фримель Г. Иммунологические методы. -М.: Медицина, 1987.
114. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989.
115. Хакимов Н.В. Биологические свойства иерсиний, выделенных из различных источников: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. -Н. Новгород, 1992.
116. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.Е., Смирнов И.В., Попов B.JL, Смирнова Н.С. Инвазивность и цитотоксичность как критерии оценки аттенуации иерсиний // ЖМЭИ. 1988. - № 9. - С. 10-15.
117. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Ефремов В.Е., Дмитриева Г.М., Полоцкий В.Ю. Характеристика инвазивности возбудителя псевдотуберкулеза // Журн. микробиол. 1984. - № 5. - С. 26-30.
118. Ценева Г.Я., Полоцкий Ю.Е., Манохина М.С., Лохматова С.А. Сравнительная оценка взаимодействия иерсиний с клетками НЕр-2 // ЖМЭИ. -1986.-№ 12.-С. 8-12.
119. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. и антимикр. химиотерапия. 2002. - № 3. - Т. 4. - С.
120. Ценева Г.Я., Сварваль А.В., Воскресенская Е.А. Методы идентификации вирулентных Yersinia enterocolitica // ЖМЭИ. 2003. - № 6. - С. 80-86.
121. Шашаев JI.H., Грибоедов А.В. Химические основы серологической специфичности псевдотуберкулезного микроба // ЖМЭИ. 1977. - № 3. - С. 2631.
122. Шмелев В.А., Новиков Е.А. Плазмиды Yersinia pseudotuberculosis // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 1990. - № 2. - С. 16-19.
123. Шувалова Е.П., Кроткова М.Р., Иващенко В.Д. Функциональное состояние фагоцитарной системы организма при иерсиниозах и возможности коррекции его нарушений // ЖМЭИ. 1993. - № 6. - С. 82-83.
124. Ющенко Г.В. Кишечные иерсиниозы: научный обзор. Москва, 1977.
125. Ющук Н.Д., Кареткина Г.Н., Проскурина Л.Н., Малов И.В., Вяльба Е.В., Валишин Д.А., Бродов Л.Е. О клинике, патогенезе и лечении иерсиниоза // Клин, медицина. 1989. -№ 5. - С. 91-97.
126. Achtman M., Zurth К., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96, № 24. - P. 14043-14048.
127. Andersson K., Carballeira N., Magnosson K.E., et al. Yop H of Yersinia pseudotuberculosis interrupts early phosphotyrosine signaling associated with phagocytosis // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20. - P. 1057-1069.
128. Andersson K., Magnusson К. E., Majeed M., Stenghal O., Fallman M. Yersinia pseudotuberculosis-induced calcium signaling in neutrophils is blocked by the virulence effector Yop H // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67. - P. 2567-2574.
129. Ben-Gurion R., Shafferman A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasmid // Plasmid. 1981. - Vol. 5. - P. 183-187.
130. Bliska J.B., Black D.S. Inhibition of the Fc receptor-mediated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis tyrosine phosphatase // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - № 2. - P. 681 -685.
131. Bliska J.B., Copass M.C., Falkow S. The Yersinia pseudotuberculosis adhesin Yad mediates intimate bacterial attachment to and entry into Hep-2 cells // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3914-3921.
132. Bliska J., Guan K., Dixon J., Falkow S. Tyrosine phosphate hydrolysis of host proteins by an essential Yersinia virulence determinant // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991.-Vol. 88-P. 1187-1191.
133. Bolin I., Forsberg A., Norlander L. Identification and mapping of the temperature inducible, plasmid-encoded proteins of Yersinia spp. // Infect. Immun. -1988.-Vol. 56.-P. 343-348.
134. Bolin I., Norlander L., Wolf-Watz H. Temperature-inducible outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid // Infect. Immun. 1982. - Vol. 37. - P. 506-512.
135. Bolin I, Portnoy D.A., Wolf-Watz H. Expression of the temperature-inducible outer membrane proteins of Yersinia II Infect. Immun. 1985. - Vol. 48. - P. 234240.
136. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1972. - Vol. 57. - P. 111-158.
137. Brubaker R.R. Growth of Pasteurella pseudotuberculosis in simulated intracellular and extracellular environments // J. Infect. Dis. 1968. - Vol. 117. - P. 293-302.
138. Brubaker R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersinia II Clin. Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 4. - P. 309-324.
139. Brubaker R.R., Sample A.K., Yu D.-Z. Proteolysis of V antigen from Yersinia pestis II Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 2. - P. 49-62.
140. Brubaker R. Yersinia pestis II2000, MI 48824-1101.- USA.
141. Brubaker R.R. Influence of Na+, dicarboxylic amino acids, and pH in modulating the low-calcium response of Yersinia pestis II Infect. Immun. 2005. - V. 73.-P. 4743-4752.
142. Brubaker R.R., Surgalla MJ. The effect of Ca2+ and Mg2+ on lysis, growth and production of virulence antigen Pasteurella pestis I I J. Infect. Dis. 1964. - Vol. 144. -P. 13-25.
143. Burrows T. W., Bacon G. A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence // Br. J. Exp. Pathol. 1956. - Vol. 37. - № 4. - P. 481-493.
144. Butler T. Plague and other Yersinia infections I I New York: Plenum Med. Book. Сотр. 1983. - P. 137.
145. Carniel E. Evolution of pathogenic Yersinia, some lights in the dark // 8th Intern. Symposium on Yersinia, September 4-8, Turku, Finland, 2002. P. 15.
146. Charnetzky W., Brubaker R.R. RNA synthesis in Yersinia pestis during restriction in calcium-deficient medium // J. Bacteriol. 1982. - Vol. 149. - P. 10891095.
147. Charnetzky W.T., Shuford W.W. Survival and growth of Yersinia pestis with in macrophages and an effect of the loss of the 47-megadalton plasmid on growth in macrophages // Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 234-241.
148. Cavanaugh D.C., Randall R. The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of flea-born plague // J. Immunol. -1959.-Vol. 83.-P. 348-363.
149. China В., Michiels Т., Cornelis G.R. The pYV plasmid of Yersinia encodes a lipoprotein Yip A, related to Tra T // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4. - P. 15851593.
150. Cornelis G.R. The Yersinia Ysc-Yop 'type III' weaponry // Nature reviews / Molecular cell biology. 2002. - Vol. 3. - P. 742-752.
151. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Soiy M.-P. Stainer I. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 1315-1352.
152. Cornelis G., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting euKariotic cells // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23 - P. 861-867.
153. Day J.B., Piano G.V. The Yersinia pestis YscY protein directly binds YscX, a secreted component of the type III secretion machinery // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182.- №7. -P. 1834-1843.
154. Du Y., Rosqvist R., Forsberg A. Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis // Infect. Immun. 2001. - Vol. 70. - № 3. - P. 1453-60.
155. Evdokimov A.G., Tropea J.E., Routzahn K.M., Waugh D.S. Three-dimensional structure of the type III secretion chaperone SycE from Yersinia pestis II Acta Crystallogr. D. Biol. Cr. 2002. - Vol. 58. - № 3. - P. 398-406.
156. Fathman C.G., Fitch F.W. Long-term culture of immunocompetent cells // In: Paul W. E. (ed) Fundamental Immunology, 1984. P. 301, Raven Press New York.
157. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Development, characterisation and diagnostic application of monoclonal antibodies against Yersinia pestis fibrinolysin and coagulase // J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49. - P. 261-269.
158. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Immunogeneity and structural organisation of some pLCR-coded proteins of Yersinia pestis II J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50(1).-P. 13-22.
159. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. New genes involved in Yersinia pestis fraction I biosynthesis // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 969-978.
160. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Expression of acid-stable proteins and modified lipopolysaccharide of Yersinia pestis in acidic growth medium // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 979-985.
161. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. The interaction of Yersinia pestis with erythrocytes // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 150-158.
162. Feodorova V.A., Golova A.B. Antigenic and phenotypic modification of Yersinia pestis in conditions simulating mammalian bloodstream // J. Med. Microbiol. -2005.-Vol. 54.-P. 435-441.
163. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis И Infect. Immun. -1981.-Vol. 31.-P. 839-841.
164. Fallman M., Angersson K., Hakansson S., Magnass K.-E., Stendahl O., Wolf-Watz H. Yersinia pseudotuberculosis inhibits Fc receptor-mediated phagocytosis in J774 cells // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 3117-3124.
165. Forsberg A., Bolin I., Norlander L. Molecular cloning and expression of calcium-regulated, plasmid-coded protein of Yersinia pseudotuberculosis II Microb. Pathogen. 1987. - Vol. 2. - P. 123-127.
166. Forsberg A., Rosqvist R. In vivo expression of virulence genes of Yersinia pseudotuberculosis И Infect. Agents Dis. 1993. - Vol. 2. - P. 275-278.
167. Forsberg A., Rosquist R., Wolf-Watz H. Regulation and polarized transfer of the Yersinia outer proteins (Yops) involved in antiphagocytosis // Trends Microbiol. -1994.-Vol. 2.-P. 14-19.
168. Forsberg A., Viitanen A.M., Skurnik M., Wolf-Watz H. The surface-located Yop N protein is involved in calcium signal transduction in Yersinia pseudotuberculosis II Mol. Microbiol. 1991. - Vol. 5. - P. 977-986.
169. Galfre G., Howe S.C., Milstein C., Butcher G.W., Howard J.C. Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines // Nature. 1977. -Vol. 266.-P. 550.
170. Galyov E., Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz H. A secreted protein kinase of Yersinia pseudotuberculosis showing homology with eukariotic Ser/Thrprotein kinases is an indispensable virulence determinant // Nature. 1993. - Vol. 361.-P. 730-732.
171. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1980. - Vol. 27. -P. 682-685.
172. Gemski P., Lazere J.R., Casey Т., Wohlhieter J.A. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. 1980. - Vol. 28. -P. 1044-1047.
173. Guan K., Dixon J.E. Protein tyrosine phosphatase activity of an essential virulence determinant in Yersinia II Science. 1990. - Vol. 249. - P. 553-556.
174. Gomes-Solecki M.J., Savitt A.G., Rowehl R., Glass J.D., Bliska J.B., Dattwyler R.J. LcrV capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Yersinia pestis from human samples // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - Vol. 12(2).-P. 339-46.
175. Hakansson S., Bergman Т., Vanooteghem J. C., Cornelis G., Wolf-Watz H. Yop В and Yop D constitute a novel class of Yersinia Yop proteins // Infect. Immun. - 1993.-Vol. 61.-P. 71-80.
176. Hartland E.L., Robins-Browne R.M. In vitro association between the virulence proteins, Yop D and Yop E, of Yersinia enterocolitica II FEMS Microbiol. Let. 1998.-Vol. 162.-P. 207-213.
177. Han Y.W., Miller V.L. Reevaluation of the virulence phenotype of the invyad A double mutants of Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. -P. 327-330.
178. Heesemann J., Gross U., Schmidt N., Laufs R. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins relased by enteropathogenic Yersinia sp. grown in calcium-deficient media // Infect. Immun. 1986. - Vol. 54. - P. 561-567.
179. Higuchi К., Kupferberg L.L., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis II J. Bacteriol. 1959. - Vol. 77. - P. 317-321.
180. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteur ella pestis. IV. A differential plating medium for the estimation of the mutation rate to avirulence // J. Bacteriol. 1961. - Vol. 81. - P. 605-608.
181. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacteriol. -1983.-Vol. 154.-P. 269-277.
182. Holmstrom A., Rosqvist R., Wolf-Watz H., Forsberg A. Virulence plasmid-encoded Yop К is essential for Yersinia pseudotuberculosis to cause systemic infection in mice // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 2269-2276.
183. Iriarte M., Cornelis G.R. Yop T, a new Yersinia Yop effector protein, affects the cyto skeleton of host cells // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 915-929.
184. Janeway C.A., Travers P. Immunobiology. The immune system in health and disease // Current Biol. Ltd., London, UK, 1997.
185. Janssen C.A., Surgalla M.J. Plague bacillus: survival within host phagocytes // Science. 1969. - Vol. 163. - P. 950-952.
186. Kaferstein F.K. Food safety: the fourth pillar in the strategy to prevent infant diarrhea // Bull. Wrld Hlth Org. 2003. - Vol. 81. - № 11. - P. 842-843.
187. Koornhof H.J., Smego R.A., Nicol M., Jr. Yersiniosis II: the pathogenesis of Yersinia infections // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999. - Vol. 18. - P. 87112.
188. Korte T, Fredriksson-Ahomaa M, Niskanen T, Korkeala H. Low prevalence of yadA-positive Yersinia enterocolitica in sows // Foodborne Pathog. Dis. 2004. -Vol. 1(1).-P. 45-52.
189. Kupferberg L.L., Higuchi К. Role of calcium ions in the stimulation of growth of virulent strains of Past, pestis II J. Bact. 1958. - Vol. 76. - № 1. - P. 120121.
190. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
191. Lawton W.D., Erdman R.L., Surgalla M.J. Biosynthesis and purification of V-and W- antigens in Pasteurella pestis II J. Immunol. 1963. - Vol. 91. - P. 179-184.
192. Leung K.Y., Reisner B.S., Straley S.C. Yop M inhibits platelet aggregation and is necessary for virulence of Yersinia pestis in mice // Infect. Immun. 1990. -Vol. 58.-P. 3262-3271.
193. Leung K.Y., Straley S.C. The yop M gene of Yersinia pestis encodes a released protein having homology with human platelet surface protein GPIb alpha // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 4623-4632.
194. Lian C.J., Hwang W.S., Pai C.H. Plasmid-mediated resistance to phagocytosis by Yersinia enterocolitica // Ibid. 1987. - Vol. 55. - P. 1176-1183.
195. Lian C.J., Pai C.H. Inhibition of human neutrophil hemoluminescence by plasmid-mediated quater membrane proteins of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1985.-Vol. 49.-P. 145-151.
196. Michiels Т., Wattiau P., Brasseur R., Ruysschaert J.-M., Cornelis G. Secretion of Yop proteins by Yersinia II Infect. Immun. 1990. - Vol. 58. - P. 2840-2849.
197. Michiels Т., Vanooteghem J. C., Lambert de Rouvroit C., et al. Analisis of vir C, an operon involved in the secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica II J. Bacteriol. - 1991. - Vol. 173. - P. 4994-5009.
198. Monack D.M., Mecsas J., Ghori N., Falkow S. Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and Yop J is necessary for this cell death // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 10385-10390.
199. Neubauer H. Epidemiology and diagnostics of Yersinia infections // 8th International Symposium on Yersinia. Turku, Finland. - 2002. - P. 39-40.
200. Neyt С., Cornells G. Role of Syc D, the shaperone of the Yersinia Yop translocators Yop В and Yop D // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. - P. 143-156.
201. Neyt C., Cornelis G. Insertion of a Yop translocation pore into the macrophage plasma membrane by Yersinia enterocolitica: requirement for translocators Yop В and Yop D, but not Lcr G // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 33. -P. 971-981.
202. Nilles M.L., Fields K.A., Straley S.C. The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on Yop В and Lcr G // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 3410-3420.
203. Nilles M.L., Williams W., Skrzypek E., Straley S.C. Yersinia pestis Lcr V forms a stable complex with Lcr G and may have a secretion-related regulatory role in the low-Ca2+ response // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 1307-1316.
204. Perry R.D., Brubaker R.R. Vwa+ phenotype of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1983. - Vol. 40. - P. 166-171.
205. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clinical. Microbiol. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.
206. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D., Rose D.J., Gregor J., Blattner F.R. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 4611-4623.
207. Pettersson J., Holmstrom A., Hill J., et al. The V-antigen of Yersinia is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 32. - P. 961-976.
208. Portnoy D., Blank H.F., Kingsbury D.T., Falkow S. Genetic analysis of essential plasmid determinants of pathogenicity in Yersinia pestis II J. Infect. Dis. 1982. Vol. 148.-P. 297-304.
209. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1981. - Vol. 148. - P. 877-883.
210. Portnoy D.A., Martinez RJ. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1985. - Vol. 118. - P. 29-51.
211. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmidassociated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981.-Vol. 31.-P. 775-782.
212. Portnoy D.A., Wolf-Watz H., Bolin I., Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in the expression of outer membrane proteins // Infect. Immun. 1984. - Vol. 43. - P. 108-114.
213. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. The Yersinia pestis V antigen is a regulatory protein necessary for Ca-dependent growth and maximal expression of low-Ca-response virulence genes // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173 - P. 2649-2657.
214. Raetz C.R., Whitfield C.W. Lipopolysaccharide endotoxins. 2002. - Annu. Rev. Biochem. - Vol. 71. - P. 635-700.
215. Reisner B.S., Straley S.C. Yersinia pestis Yop M: thrombin binding and overexpression // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 5242-5252.
216. Rosqvist R., Bolin I., Wolf-Watz H. Inhibition of phagocytosis in Yersinia pseudotuberculosis', a virulence plasmid-encoded ability involving the Yop2b protein // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56(8). - P. 2139-2143.
217. Rosqvist R., Forsberg A., Wolf-Watz H. Microinjection of the Yersinia YopE cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption // Biochem. Soc. Trans. 1991.-Vol. 19(4).-P. 1131-1132.
218. Rosqvist R., Forsberg A., Wolf-Watz H. Intracellular targeting of the Yersinia Yop E cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption // Infect. Immun. 1991.-Vol. 59.-P. 4562-4569.
219. Rosqvist R., Forsberg A., Rimpilainen M., Bergman Т., Wolf-Watz H. The cytoxic protein Yop E of Yersinia obstructs the primary host defence // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4 - P. 657-667.
220. Rosqvist R., Magnusson K., Wolf-Watz H. Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells // EMBO.-1994.-Vol. 13.-P. 964-972.
221. Rosqvist R., Wolf-Watz H. Virulence plasmid-associated HeLa cell induced cytotoxicity of Yersinia pseudotuberculosis II Microb. Pathog. 1986. - Vol. 1(13). -P. 229-240.
222. Sarker M.R., Neut C., Stainier I., Cornelis G. The Yersinia Yop virulon: Lcr V is required for extrusion of the translocators Yop В and Yop D // J. Bacteriol. -1998.-Vol. 180.-P. 1207-1214.
223. Sarker M.R., Sory M.-P., Boyd A. P., Iriarte M., Cornelis G.R. Lcr G is required for efficient translocation of Yersinia Yop effector proteins into eukariotic cells // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2976-2979.
224. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in lcr V on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca response, and virulence of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177 - P. 2530-2542.
225. Skurnik M. Expression of antigens encoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different growth conditions // Infect. Immun. 1985. -Vol. 47.-P. 183-190.
226. Skurnik M., Bengoechea J.A. The biosynthesis and biological role of lipopolysaccharide O-antigens of pathogenic. 2003. - Yersinia. Carbohydr. Res. -Vol. 338.-P. 2521.
227. Skurnik M., Bolin I., Heihkinen H. Virulence plasmid-associated autoagglitination in Yersinia spp. // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 158. - P. 1033-1036.
228. Skurnik M., Toivanen P. Lcr F is the temperature-regulated activator of the yad A gene of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis II J. Bacterid. 1992. - Vol. 174. - P. 2047-2051.
229. Smirnov G.B. Molecular biology of the factors responsible for Yersinia virulence // Biomed. Sci. 1990. - Vol. 1. - P. 223-232.
230. Sonnevend A., Czirok E., Pal T. Yersinia Yop-specific IgA antibodies in Hungarian blood donors // Folia Microbiol (Praha). 2005. - Vol. 50(3). - P. 269-72.
231. Splettstoesser W.D., Grunow R., Rahalison L., Brooks T.J., Chanteau S., Neubauer H. Serodiagnosis of human plague by a combination of immunomagnetic separation and flow cytometry // Cytometry. 2003. - Vol. 53A. - № 2. - P. 88-96.
232. Straley S.C. The plasmid-encoded outer-membrane proteins of Yersinia pestis II Rev. Infect. Dis. 1988. - Vol. 10. - P. 323-326.
233. Straley S.C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae // Microb. Pathogen. 1991. - Vol. 10. - P. 87-91.
234. Straley S.C., Bowmer W.S. Virulence genes regulated at the transcriptional level by Ca2+ in Yersinia pestis include structural genes for outer membrane proteins // Infect. Immun. 1986.-Vol. 51.-№2.-P. 445-454.
235. Straley S., Brubaker R. Cytoplasmic and membrane proteins of Yersinia cultivated under conditions simulating mammalian intracellular environment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol. 78. - P. 1224-1228.
236. Straley S.C., Brubaker R.R. Localization in Yersinia pestis of peptides associated with virulence // Infect. Immun. 1982. - Vol. 36. - P. 129-135.
237. Straley S.C., Harmon P.A. Yersinia pestis grows within phagolysosomes in mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1984. - Vol. 45. - P. 655-659.
238. Straley S.C., Harmon P.A. Growth in mouse peritoneal macrophages of Yersinia pestis lacking established virulence determinants // Infect. Immun. 1984. -Vol. 45.-P. 649-654.
239. Straley S.C., Piano G.V., Skrzypek E., Haddix P.L., Fields K.A. Regulation by Ca2+ in the Yersinia low-Ca2+ response // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 8. - P. 1005-1010.
240. Straley S.C., Skrzypek E., Piano G.V., Bliska J.B. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 3105-3110.
241. Sugiyama Y., Takashima I., Hashimoto N. The analisis of V antigen of Yersinia species with monoclonal antibodies // Jap. J. Vet. Sci. 1987. - V. 49. - P. 267-278.
242. The Oxoid Manual of Cultural Media, ingredients and other laboratory services. OXOID Ltd., UK. - Fifth edition. - 1982.
243. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.
244. Tsai C.M., Frasch C.F. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 119. - P. 115-119.
245. Une T. Studies on the pathogenicity of Yersinia enterocolitica. I. Experimental infection in rabbits // Microbiol. Immunol. 1977. - Vol. 21. - P. 349377.
246. Visser L.G., Annema A., Van Furth R. Role of Yops in inhibition of phagocytosis and killing of opsonized Yersinia enterocolitica by human granulocytes //Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P. 2570-2575.
247. Wake A., Morita H., Wake M. Mechanisms of long- and short-term immunity to plague // Immunobiology. 1978. - Vol. 34. - № 6. - P. 1045-1052.
248. Wolf-Watz H., Portnoy D.A., Bolin I., Falkow S. Transfer of the virulence plasmid of Yersinia pestis to Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. 1985. -Vol. 48.-P. 241-243.
249. Zahorchak R.J., Brubaker R.R. Effect of exogenous nucleotides on Ca2+ dependence and V antigen synthesis in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1982. -Vol. 38.-P. 953-959.
250. Zink D.L., Feeley J.C., Wells J.G., Vanderzant C., Vickery J.C., O'Donovan G.A. Possible plasmid-mediated tissue invasiveness in Yersinia enterocolitica // Nature. 1980. - Vol. 283 - P. 224-225.
-
Петрова, Анна Валентиновна
-
кандидата медицинских наук
-
Саратов, 2006
-
ВАК 03.00.02
- Совершенствование лабораторного обеспечения системы эпидемиологического надзора за иерсиниозами
- Молоко как фактор передачи возбудителя кишечного иерсиниоза
- Ассоциация Yersinia pseudotuberculosis с цианобактериями
- Микробиологические и экологические особенности штаммов иерсиний, циркулирующих на территории Якутии
- Приготовление и использование агглютинирующих сывороток для идентификации и типирования Yersinia enterocolitica
