Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические и экологические особенности штаммов иерсиний, циркулирующих на территории Якутии

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические и экологические особенности штаммов иерсиний, циркулирующих на территории Якутии"

На правах рукописи

СОФРОНОВА Октябрина Николаевна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ШТАММОВ ИЕРСИНИЙ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ

ЯКУТИИ

03.02.03 - микробиология

25 ИАР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005561320

Санкт-Петербург - 2014

005561320

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Ценева Галина Яковлевна

Официальные оппоненты:

Кветная Ася Степановна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства России», отдел микроэкологии человека, ведущий научный сотрудник, руководитель

Сбойчаков Виктор Борисович - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, кафедра микробиологии, заведующий

Ведущее учреждение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится <<^>> 2015 г. в часов на заседании диссер-

тационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, http ://www. gabrich.ru

Автореферат разослан «

» 03 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного со

доктор медицинских наук

Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Ежегодно в мире инфекционные и паразитарные болезни регистрируются более чем у 2 млрд. людей. Одним из важных факторов роста заболеваемости является изменение вирулентности патогенных микроорганизмов (Онищенко Г.Г., 2006). В четвертом оценочном Докладе Межправительственной группы экспертов по изменению климата (МГЭИК -IPCC) в 2008 г. особое внимание уделяется опасности увеличения инфекционной заболеваемости на Севере, в связи с изменением климата и, как следствие, смещению ареала возбудителей и переносчиков инфекционных болезней. С эпидемиологической точки зрения это означает возможность расширения ареалов обитания ряда видов грызунов, являющихся источниками возбудителей многих инфекций (Ревич Б.А. и соавт., 2011). В этой связи реально появление новых подвидов микроорганизмов с измененными биологическими, в том числе, генетическими свойствами (Ценева Г.Я., 2006).

Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica распространены во многих странах мира, являясь причиной спорадической и групповой заболеваемости.

Многолетняя динамика выделения иерсиний на всей территории Якутии имеет волнообразный характер. Надо полагать, что заболеваемость иерсиниозами а территории Якутии распространена повсеместно, однако, в большинстве районов пинико-лабораторная диагностика и, следовательно, регистрация иерсиниозов не едется. Это объясняется и тем, что сельская местность имеет наибольшую ерриториальную зависимость и трудность в транспортной инфраструктуре Тырылгин М.А., 2008).

Природные очаги бактериальных инфекций на Севере отличаются ир1сумполярным распространением, адаптацией возбудителей к типичным для евера представителям фауны, способностью к размножению в переносчиках и во нешней среде при температуре (+2 - +4°С) вечной мерзлоты. Многие икробиологические и экологические аспекты, связанные с иерсиниями в условиях евера, оставались неизученными, а официальная статистика не отражает их стинного распространения. Практически не изучалась распространенность ерсиний среди диких и сельскохозяйственных животных. Мало данных о степени бсемененности объектов окружающей среды. Не проводилось изучение енетических детерминант вирулентности выделенных штаммов и молекулярно-енетических особенностей популяций иерсиний.

Таким образом, к началу нашей работы информация о распространенности азличных видов иерсиний на Северных территориях отсутствовала, еленаправленные комплексные исследования в этом направлении не проводились.

этой связи организация и проведение микробиологических мониторинговых сследований на территории Якутии представляется актуальной.

Степень разработанности темы исследования

В Якутии первая вспышка псевдотуберкулеза была зарегистрирована в 1974 г. | дальнейшем до 1998 г. было зарегистрировано еще 12 вспышек псевдотуберкулеза кишечного иерсиниоза (Егоров И.Я. и соавт., 2000).

В 90-х годах в Якутии при групповых заболеваниях кишечным иерсиниозом т людей выделяли Y. kristensenii. Этот вид иерсиний способен продуцировать энте-

ротоксин YKST, вызывающий симптомы пищевого отравления. Данные по распространению редких видов иерсиний ограничены, требовалось уточнение значимости их этиологической роли (Sulakvelidze А., 2000).

Использование многопраймерной ПЦР - перспективное направлением детекции видов бактерий рода Yersinia. Обнаружение генетического материала непатогенных - Y. kristensenii, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. bercovieri, Y. mollaretii, Y. rohdei в биологических образцах больного человека может свидетельствовать о том, что клинические проявления инфекционного заболевания могут быть вызваны видами иерсиний, считавшимися ранее непатогенными (Стенкова A.M. и соавт., 2008).

Вопреки установившемуся мнению, что температурный оптимум для размножения патогенных микробов находится в пределах +37 °С, и они являются мезофи-лами, полученные данные на модели (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) позволили подтвердить другую концепцию в экологии этих микробов. Культивирование Y. pseudotuberculosis при +8 °С в условиях низкой аэрации увеличивает их адгезивную и инвазивную активность (Сомов Г.П. и соавт., 2001). Эти свойства могут быть следствием адаптации микроорганизма к разным условиям обитания в различных географических зонах. Между тем, сведения о распространении ведущих серо-биотипов и их биологических характеристиках по отдельным географическим зонам России представлены не полностью.

У. enterocolitica 1А не имеет классических факторов патогенности: плазмиды (pYV), гена адгезии (ail), энтеротоксина (ystA). Однако, у непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен ген ystB, кодирующий термостабильный энтеротоксин YST В, который может играть роль в патогенезе диарей (Ramamurthy Т., 1997). До настоящего времени циркулирующие на Севере Y. enterocolitica биотипа 1А по признаку патогенности не изучались, равно, как и больные с диарейным синдромом на иерсиниозы не обследовались.

Цель исследования: микробиологическая характеристика штаммов иерсиний, циркулирующих на территории Якутии, и разработка тактики микробиологического мониторинга иерсиниозов.

Задачи исследования:

1. Установить распространенность представителей рода Yersinia на территории Якутии в различных объектах окружающей среды, в том числе, в популяциях мелких млекопитающих.

2. Охарактеризовать штаммы по наличию генетических детерминант вирулентности. Оценить генетическое родство штаммов иерсиний различных видов, изолированных в антропургических и природных очагах Якутии.

3. Оценить заболеваемость иерсиниозами и этиологическую значимость иерсиний, циркулирующих на территории Якутии, при ретроспективном иммунологическом обследовании людей и сельскохозяйственных животных.

4. Разработать тактику микробиологического мониторинга за циркуляцией иерсиний для территорий Якутии.

Научная новизна

На основе комплексного микробиолого-эпидемиологического изучения возбудителей иерсиниозов у людей, животных и в объектах окружающей среды установлена циркуляция различных видов бактерий рода Yersinia (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. kristensenii, Y.intermedia, Y.frederiksenii) на территориях народнохозяйственного освоения Якутии.

Получены новые знания о выделении и частоте распространения иерсиний «редких» видов (Y. kristensenii; Y.intermedia) от грызунов и из воды открытых водоемов. Выделенные на территории Якутии Y. enterocolitica биотипа 1А от грызунов, з овощей и других объектов окружающей среды, ранее, отнесенные к непатоген-ым иерсиниям, обладают патогенным потенциалом.

Выявлено, что в 80% случаев штаммы Y. enterocolitica биотипа 1А, считаются непатогенными, содержат ген ystB, опосредующий продукцию термостабиль-ого энтеротоксина, что позволяет судить о наличии патогенного потенциала у бак-ерий, и может обуславливать диарейные проявления у больных с острыми кишеч-ыми инфекциями неустановленной этиологии.

На основе выявленных положительных результатов серологических исследо-аний проб больных, страдающих ОКИ, гастроэнтероколитами, здоровых людей, а акже животных, получена информация о распространенности иерсиниозов на тер-итории Якутии, которые свидетельствуют о широкой циркуляции иерсиний на изу-енной территории.

Теоретическая и практическая значимость работы

Установлена широкая распространенность бактерий рода Yersinia различных идов (У. enterocolitica, Y. kristensenii, Y. pseudotuberculosis; Y. intermedia; Y. rederiksenii; Yersinia spp.) на территории Якутии в «условиях вечной мерзлоты», оказано, что наиболее часто встречается Y. enterocolitica и Y. kristensenii, основным езервуаром которых в природных и антропургических очагах являются разные ви-ы мелких млекопитающих (серые крысы, полевки, лемминги), что является осо-енностью территории.

Для исследованных штаммов Y. kristensenii и Y. intermedia раскрыты илогенетические связи и установлены генетические различия, обусловленные олиморфизмом гена gyrB, что вносит существенный вклад в характеристику опуляции иерсиний данных видов.

На основе полученных данных, комплексного изучения иерсиний на террито-ии Якутии, разработан алгоритм микробиологического мониторинга за иерсиния-и, включающий порядок организации и проведения лабораторной диагностики с четом климатических условий, который будет способствовать осуществлению эф-ективного эпидемиологического надзора за иерсиниозной инфекцией.

Изученные штаммы и их характеристики представлены в коллекции Референс ентра по мониторингу за иерсиниозами при ФБУН НИИ эпидемиологии и микро-иологии имени Пастера.

Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза и кишечного ерсиниоза в организациях здравоохранения Якутии внедрены методы ИФА (акт недрения от 26.12.2011 г. и 26.11.2013 г.) и ПЦР (акт внедрения от 25.12.2012 г.).

В ФГБУ «НЦЭСМП» МЗ России депонирован штамм Y. kristensenii № 1511, выделенный со смыва из местного картофеля и содержащий хромосомный ген термостабильного энтеротоксина ykst, который может быть использован в качестве тест-штамма при проведении мониторинга за Y. kristensenii.

Полученные данные были использованы при создании документов:

1. Профилактика иерсиниоза: санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.7.2615-10 / Ю.В. Демина, С.В. Сенников, Г.Я. Ценева, Е.А Воскресенская, Е. А. Богумильчик, О.Н. Софронова, М.В. Чеснокова, В.Т. Климов, К.А Тирских, О.А. Бургасова, J1.K. Иванова, Т.В. Каримова, J1.B. Саяпина - М.: Изд-во ФГУЗ «ФЦГЭ Роспотребнадзора». - 2010. - 19 с.

2. Микробиологический мониторинг циркуляции иерсиний в Республике Саха (Якутия): республиканские методические рекомендации. (MP) / И.Ю. Самойлова, В.И. Григорьева, О.Н. Софронова, В.Ф. Чернявский, О.Н. Никифоров, И.А.Романова, П.С. Дьячковская, Е.А. Воскресенская, Г.Я, Ценева - СПб.: ВМемА - 2013. - 84 с.

Методология и методы исследования

Методология данной работы соответствует поставленной цели. Предметом исследования явилось выделение иерсиний с целью изучения распространения штаммов, обитающих на территории Якутии, их молекулярно-генетическая характеристика. Анализ научной литературы, посвященной проблеме, проведен на основе формально-логических методов исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, проводилось на основе общенаучных и специфических методов.

В работе использован материал и следующие методы (Таблица 1).

Штаммы. Всего на территории Якутии бактериологическим методом выделено 237 штаммов бактерий рода Yersinia. Исследовано молекулярно-генетическими методами 171 свежевыделенных штаммов и 3 штамма, выделенные в 1994, 2000, 2001 гг., которые хранились при - 80° С. Также использованы референс - штаммы Y. enterocolitica IP 8081 (из коллекции института Пастера, Париж); охраноспособный штамм Y. enterocolitica КМ 205 и охраноспособный штамм Y. pseudotuberculosis КМ 211 (из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», г. Саратов).

Бактериологический метод. Выделение, идентификацию и культивирование иерсиний проводили в соответствии с МУ 3.1.1.2438 - 09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза» посевом в 1 % пептонно-калиевую среду накопления с «Холодовым» обогащением при температуре +4 - +8 °С и с последующим высевом материала на 2-3, 5-7, 10-14 сутки на плотную питательную среду с бромтимоловым синим (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск). Видовую идентификацию выделенных культур проводили с использованием набора реактивов, питательных сред для идентификации энтеробактерий (ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск; ФГУП НПО «Микроген», г. Махачкала), «Тест-системы для дифференциации видов и биотипов бактерий рода Yersinia» (Патент на изобретение № 2518297 от 08.04.2014.), разработана во ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

Таблица 1. Объем проведенных исследований различными методами

Методы

Число

1. Бактериологический:**

1.1. Исследование проб из объектов окружающей среды 1.2Исследование биоматериала от людей

1.3. Биохимическая идентифицикация выделенных штаммов бактерий рода Yersinia из объектов окружающей среды:

• Y. pseudotuberculosis

• Y. enterocolitica

• Y. kristensenii

• Y.intermedia

• Y.frederiksenii

• Бактерии рода Yersinia (неидентифицированные до вида)

1.4. Идентификация вирулентных иерсиний (РА со СВИ)***

1.5. Серотипирование выделенных штаммов:*** Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica_

44709 пробы 1634 пробы

237 штаммов 4 штамма 122 штамма 85 штаммов

2 штамма

3 штамма 21 штамм 102 штамма

102 штамма

2. Молекулярно-генетический:

2.1. Выделение бактериальной ДНК из штаммов стандартным методом фенол-хлороформной депротеинизации

2.2. Идентификация до вида бактерий рода Yersina методом многопраймерной ПЦР на основе выявления гена ompF

2.3. Секвенирование участка гена gyrB:

• Y. pseudotuberculosis

• Y. enterocolitica биотипов 1A, 2, 4

• Y. kristensenii

• Yersinia spp.

2.4. Исследование штаммов методом ПЦР на наличие генов: yscQ (pYV), урт А/С, irp2, ail, ystA, ystB, ykst

2.5." Исследование методом ПЦР проб:**

- из объектов окружающей среды

- биоматериал (испражнения) от людей

68 штаммов 68 штаммов

18 6 4 2 6

штаммов

штаммов

штамма

штамма

штаммов

171 штамм

3257 пробы 203 пробы

3. Иммунологический:

1. Определение уровня антител в сыворотках крови людей:** РИГА ИФА

3.2. Определение уровня антител в сыворотках крови**

животных методом РНГА 3.2. Детекция антигенов Y. pseudotuberculosis:**

- метод флуоресцирующих антител

- ИФА* _

1687 ОСК 170 ОСК

125 ОСК

4 штамма 40 проб

5. Биоинформатические: анализ последовательностей, полученных при секвенировании участка гена gyrB с использованием

программы MEGA v.4.***_

* Работа выполнялась в лаборатории особо опасных инфекций Центра гигиены и пидемиологии в Республике Саха (Якутия) с участием автора.

** Работа выполнялась в лаборатории ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиоло-ии имени Пастера, С- Петербург и ФГБУН « Тихоокеанский институт биооргани-еской химии» ДВО РАН, Владивосток.

Серотипирование штаммов У. pseudotuberculosis проводили с использованием оновалентных сывороток к серотипам У. pseudotuberculosis 0:1 и 0:3; штаммов У. nterocolitica с использованием набора моновалентных сывороток к 13 серотипам ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург).

Серотипирование 2 штаммов У. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР по методике Bogdanovich Т. (Bogdanovich, 2003).

Идентификацию вирулентных иерсиний проводили с использованием диагностической сыворотки СВИ (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург).

Молекулярно-генетические методы. Для выделения ДНК из образцов фекалий, эмульсий органов грызунов, помета птиц, погадок хищных птиц использовали коммерческий набор "ДНК-сорб-В" (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва); ДНК из смывов, овощей, воды, почвы выделяли с использованием набора "ДНК-сорб-С" (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва), согласно прилагаемым инструкциям.

Для выявления участков ДНК У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis в пробах использовали коммерческие тест-системы:

«АмплиСенс® Yersinia enterocolitica-Eph, «АмплиСенс® Yersinia pseudotuberculosis-Eph (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва), ПЦР проводили в термостате ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) с электрофоретической детекцией продукта амплификации в 1% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия;

- «АмплиСенс® Yersinia enterocolitica/Yersinia pseudotuberculosis-FL», вариант FEP/FRT-50, с набором реагентов ПЦР - смесь -1- FEP/FRT У. enterocolitica/ Y. pseudotuberculesis и ПЦР- смесь -1- FEP/FRT У. enterocolitica type (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) с гибридизационно - флуоресцентной детекцией. Амплификацию, анализ и учет результатов проводили при помощи прибора Rotor -Gene Q (Qiagen, Германия), в режиме «реального времени» (FRT) или детекцию результатов проводили с помощью ПЦР- детектора Ala 1А с версией программного обеспечения 5.1.0.,согласно прилагаемым инструкциям.

Методом ПЦР штаммы изучены на наличие генетических детерминант вирулентности: У. enterocolitica - ail, ystA, ystB, yscQ (pYV) yksf, Y. pseudotuberculosis -ypm A/C, yscQ, irp2. Штаммы Yersinia других видов были исследованы на наличие всех вышеперечисленных генов.

Для получения лизатов бактерии выращивали на агаре Хоттингера, готовили взвесь с концентрацией 108 м.к./мл в стерильной дистиллированной воде, 100 мкл взвеси кипятили 5 мин, центрифугировали при 10 тыс. об/мин - 1 мин, использовали надосадок. Применяли пары праймеров (ООО «Синтол», г. Москва). Реакционную смесь для проведения ПЦР готовили с использованием стандартных реагентов («Fermentas», Литва) согласно прилагаемой инструкции. ПЦР проводили в термостате ТП4-ПЦР-01 -«Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по программе: 1 цикл 95 °С - 2 мин; 30 циклов 94 °С - 45 сек, 55 °С ; 72 °С - 45 сек; 1 цикл 72 °С -10 мин. Результаты учитывали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия.

Изучение генетических особенностей популяционной структуры иерсиний выполнялось на основе генотипирования гена gyrB, кодирующего В-субъединицу ДНК-гиразы, и гена ompF. кодирующего белок наружной мембраны. Для gyrB-генотипирования геномную ДНК выделяли из штаммов стандартным методом фенол-хлороформной депротеинизации с протеиназой К и набором Genomics DNA Purification Kit («Fermentas», Литва). Видовую идентификацию иерсиний проводили

на основе секвенирования и анализа участка гена gyrB (Stenkova A.M.,2012). Фрагменты получали с использованием прямого YgyrF 5v-CCCACl"l М АТАССТ-З4 и обратного YgyrR 5Ч-СССАСТТТАТАССТ-3Ч праймеров (ЗАО «Евроген», г. Москва). ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси с использованием HSTaq- полимеразы («Евроген», Россия). Амплификацию осуществляли в термоциклере Gene Amp 2700 (Applied Biosystems, США) по программе: 1 цикл 95° С - 5 мин, 40 циклов: 94° С -20 с, 60° С - 20с, 72° С - 30с. Результаты ПЦР учитывали с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием. ПЦР-фрагменты очищали с помощью набора DNA Extraction Kit («Fermentas», Литва) и секвенировали на автоматическом ДНК анализаторе 3130xL (Applied Biosystems, США) методом флюоресцентномеченых терминаторов - 2-, 3-дидезоксинуклеозидтрифосфатов Big Dye™ с использованием вышеприведенных праймеров. Последовательности анализировали с использованием программы MEGA v.4. (Tamura К., 2007).

Идентификацию патогенных видов рода Yersina осуществляли методом мно-гопраймерной ПЦР на основе выявления гена ompF (Стенкова A.M., 2008). Результаты ПЦР учитывали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия.

Иммунологические методы. Для специфической индикации возбудителя псевдотуберкулеза в пробах (селезенке и печени грызунов) и для идентификации выделенных культур использовали прямой МФА. Применяли «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие псевдотуберкулезные, адсорбированные лошадиные» (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов).

Для выявления антигена возбудителя псевдотуберкулеза использовали тест-систему «Тест - система иммуноферментная для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серовара» (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург), согласно инструкции.

Для выявления антител к иерсиниям использовали РНГА с эритроцитарными диагностикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными 0:3 и 0:9 (производство НИИВС, г. Санкт-Петербург), согласно прилагаемым инструкциям.

Для выявления иерсиниозных антител методом ИФА использовали:

1) Коммерческие тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» (ООО «Омникс», г. Санкт-Петербург; ЗАО «Вектор Бест», Россия). Постановку реакций проводили согласно инструкциям.

2) Тест-системы, разработанные в ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосток, на основе видо - и родоспецифических белков-поринов НМ У. pseudotuberculosis и У. enterocolitica (Портнягина О.Ю., 2010). Анализ проводили согласно МУ 3.1.1.001-98 «Определение антител в сыворотках людей методом ИФА для диагностики псевдотуберкулеза».

3) Конструировали дополнительный набор для выявления антител к возбуди-елю кишечного иерсиниоза, используя стандартные ингредиенты. Применяли непрямой вариант ИФА. В лунках планшета сорбировали антиген по 1 мкг. В качестве

нтивидовых антител использовали иммуноферментные конъюгаты («Invitrogen», ЛИ А) Результаты учитывали на спектрофотометре (iQuant, ВЮ-ТЕК «INSTRUMENTS.INC», США) при 492 нм.

Эпидемиологический метод. Анализ заболеваемости населения в республике Саха (Якутия) проводили за период с 2002 г. по 2012 г. по статистическим данным и историям болезни.

Статистический метод. Статистическая обработка данных проведена методами статистического анализа при помощи программного пакета Microsoft Exel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t) и величины вероятности (р). За достоверность различий принимали значение р<0,05, вероятность различий составляла 95% и более. Оценка 95% доверительных интервалов для показателя с бинарным типом шкалы произведена по методу Клоппера-Пирсона, критерий хи-квадрат применяли для сравнения категориальных переменных.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. На территории Якутия в природных и антропургических очагах установлено распространение иерсиний 5 видов. Популяции мелких млекопитающих, объекты животного и растительного происхождения инфицированы в подавляющем большинстве У. enterocolitica биотипов 1А, и биотипов 2 и 4, серотипов 0:3; 0:9; 0:7,8; 0:5; 0:6,31.

2. Охарактеризованы патогенные штаммы Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica биотипов 2, 4, выделенные от больных и из объектов окружающей среды, а также Y. enterocolitica биотипа 1А и У. kristensenii в качестве возможных этиологически значимых на основании содержания генетических детерминант вирулентности - хромосомных генов термостабильных энтеротоксинов ystB и ykst. Для штаммов У. enterocolitica и других видов, выделенных в «условиях вечной мерзлоты», выявлено генетическое разнообразие и экологические особенности: У. enterocolitica биотипа 1А формирует собственную генетическую ветвь в пределах вида, а для штаммов У. kristensenii, У. intermedia свойственна высокая генетическая гетерогенность, что обусловлено полиморфизмом гена gyrB.

3. На территории Якутии наблюдается спорадическая заболеваемость без клинического симптомокомплекса болезни, характерна неравномерность территориального распространения, широкая циркуляция иерсиний на территориях обследования. Разработан алгоритм микробиологического мониторинга циркуляции иерсиний, включающий порядок организации и проведения лабораторной диагностики учреждениями Роспотребнадзора с учетом климатических условий и медико-географических зон территории Якутии.

Степень достоверности и апробация результатов

Штаммы, представленные в работе, выделены от больных, животных, с объектов окружающей среды в ходе расследования вспышек кишечного иерсиниоза и/или псевдотуберкулеза, а также спорадических случаев.

Полученные данные обработаны и систематизированы с помощью методов описательной статистики, пакетов компьютерных программ и информационных баз данных и представлены в виде таблиц и графических изображений.

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера», протокол №6 от 24.09.2014 г.

Основные результаты исследований доложены на российских и международных конференциях: Ш Всероссийской НПК с международным участием «Инфекции,

обусловленные иерсиниями» (г. Санкт- Петербург, 2011 г.); межрегиональной НПК «Инфекционные болезни: вчера, сегодня, завтра» (г. Якутск, 2012 г.); I Республиканской НПК «Проблемы антибиотикорезистентности в многопрофильном стационаре» (г. Якутск, 2012 г.); V Региональной НПК с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии на Дальнем Востоке» (г. Хабаровск, 2012 г.); семинаре по подготовке бактериологов республики на базе Центра гигиены и эпидемиологии (г. Якутск, 2010, 2011, 2012 гг.); семинаре по подготовке кадров специалистов по ветеринарии Якутской государственной сельскохозяйственной академии (г. Якутск, 2010, 2011 гг.); семинаре по стандартизации лабораторного мониторинга иерсиниозов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург, 2013 г.); конгрессе «Экология и здоровье человека на Севере» (СВФУ г. Якутск, 2013 г.).

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 19 печатных работах, в том числе, 4 статьи опубликованы в рецензируемых изданиях, 8 - в других изданиях, 7 - в материалах конференций.

Личный вклад автора. Автором составлен план исследования, проведен аналитический обзор литературы, выполнен весь объем бактериологических исследований, сформирована выборка исследуемых штаммов; иммунологические исследования ОСК пациентов методами РНГА и ИФА. Исследования проб методом ПЦР, осуществлены автором совместно с бактериологом Романовой И.А. в лаборатории особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Саха (Якутия)». Дифференциация вирулентных штаммов, серотипирование, определение генетических детерминант вирулентности проведены совместно с к.б.н. Воскресенской Е.А. и н.с. Богумильчик Е.А на базе ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург. Определение родственных связей иерсиний на основе gyrB-гeнoтипиpoвaния, исследования ОСК методом ИФА с использованием тест-системы на основе поринов НМ проведено совместно с к.м.н. Исаевой М.П., к.б.н. Портнягиной О.Ю. на базе ФГБУН ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосток. Соискатель провела систематизацию, статистическую обработку полученных данных, сформулировала выводы и практические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, перспективы дальнейшей разработки, сокращений, литературы. Диссертация содержит 24 таблицы и 11 рисунков. Список литературы содержит 60 источников отечественных и 34 источника зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика заболеваемости иерсиниозами на территории Якутии

Первичные регистрационные данные по заболеваемости в Якутии были получены в 1974 г. В период с 1974 по 1998 гг. зарегистрировано 13 вспышек псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. Заболевания возникали в детских учреждениях и в рабочих поселках в весенне-осенний периоды года. Все вспышки носили пищевой характер и были связаны с употреблением салатов из «свежих овощей». Иерси-ниозная этиология заболеваний обоснована клинико-эпидемиологическими данными, выделением культур иерсиний и обнаружением специфических антител.

Ретроспективный анализ заболеваемости псевдотуберкулезом и кишечным иерсиниозом показал, что иерсиниозы в Якутии встречаются повсеместно, с неравномерным их распределением по территории республики - чаще регистрируют в крупных городах (Нерюнгри, Мирный, Якутск), а также в некоторых сельскохозяйственных центральных районах (Горный). В 2009-2010 гг. отмечена тенденция к подъему заболеваемости кишечным иерсиниозом.

Заболеваемость населения региона кишечным иерсиниозом во все годы была ниже среднероссийского уровня в 2 - 4,5 раза. Из числа заболевших дети составляли 55,6%. Заболеваемость регистрировали как среди детей дошкольного, так и школьного возраста (Рисунок 1).

Дети до 14 лет в том числе:

60,00 -50,00 40,00 -30,00 \

S'5 Г—1

жЖ.

-N. 20.00 Iм-1--------

-—-523S-------------

1,73-----

01-2 гола Е 3-6 лет ® школьники "7-14 л

г

/ Л/

Рисунок 1. Заболеваемость детей кишечным иерсиниозом в районах Якутии в 2002 - 2013 гг.

За аналогичный период зарегистрировано 6 случаев псевдотуберкулеза, в том числе, среди детей до 14 лет; 4 случая, из них по 1 случаю в Булунском, Горном, Нерюнгринском, районах и в г. Якутске.

В феврале 2014 г. выделены 2 культуры У. kristensenii из испражнений двух больных детей с острым аппендицитом. Изоляция таких штаммов от больных, при отсутствии других возбудителей, свидетельствовала об их потенциальной роли в качестве этиологических агентов.

Можно полагать, что истинная распространенность иерсиниозов значительно выше регистрируемой, поскольку в большом проценте случаев ОКИ, с которыми иерсиниоз имеет общие симптомы, этиологический агент не был выявлен, а исследований на иерсиниозы не проводилось.

Особенности распространения иерсиний на территории Якутии

В течение 2002-2012 гг. из объектов окружающей среды бактериологическим методом выделено 237 культур, в том числе 4 культуры У. pseudotuberculosis (1,7%), 122 культуры У. enterocolitica биотипов 1А, 2, 4 (51,5%), а также 111 культур других видов иерсиний (Y. kristensenii, У. intermedia, Y. frederiksenii)- 46,8% (Таблица 2). Чаще иерсинии выделяли от мелких млекопитающих.

Таблица 2. Результаты обнаружения бактерий рода Yersinia в объектах окружающей среды бактериологическим методом в 2002-2012 гг.

№ Всего исследований Выделены бактерии рода Yersinia Всего выделено

Yersinia pseudotubeculosis Yersinia enterocolitica Другие виды

всего биотипы Абс. %

1A 2,4

1 Смывы с объектов хранения и переработки овощей, в том числе, с овощей и фруктов 40940 100 95 5 7 107 0,2

2 Мелкие млекопитающие 3058 4 19 14 5 101 124 4,0

3 Вода из открытых водоемов 377 - 1 1 - 1 2 0,5

4 Сточная вода 13 - - - - - - -

5 Почва 53 - 1 1 - - 1 1,8

6 Прочие 268 - 1 1 - 2 3 1Д

ИТОГО 44709 4 122 112 10 111 237 0,5

Для идентификации иерсиний в ходе мониторинговых исследований объектов окружающей среды используется метод ПЦР. Его применение позволило существенно чаще обнаруживать иерсинии. Доля положительных результатов, полученных этим методом (детекция ДНК Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica), составила 72% от всех положительных находок в исследовании.

При бактериологическом исследовании мелких млекопитающих частота выделения Y. pseudotuberculosis составила 0,13%, Y. enterocolitica биотипов 1А, 2, 4 -0,62%, Y. kristensenii - 3,3%.

Всего выделено 124 культуры иерсиний, из которых У. pseudotuberculosis составляет 3,2%; У. enterocolitica -15,3%; У. kristensenii - 63,7%; У. frederiksenii - 1,6%; Yersinia не идентифицированные до вида - 16,1%.

Из объектов окружающей среды выделено 113 культур, в том числе, 98 штаммов У. enterocolitica биотипа 1А (86,8%), 5 культур биотипа 2 и 4 (4,4%), а также 10 штаммов других видов иерсиний (8,8%). При исследовании смывов методом ПЦР из различных объектов окружающей среды частота находок ДНК У. enterocolitica составила 6,4 % от общего числа исследованных смывов.

С 2002 г. в районах промышленного освоения Якутии впервые начали прово-ить микробиологический мониторинг за иерсиниями.

Установлено, что в районах промышленного освоения территорий Якутии: строительства нефтепровода «ВСТО», в зонах алмазодобывающего комплекса в Арктических районах, на участках прохождения железной дороги - иерсинии обнаруживали значительно чаще, по сравнению с сельскохозяйственными районами, бактериологическим методом: 0,86±0,06% и 0,03±0,01%, соответственно, а также методом ПЦР: 41±1,96% и 2,9±0,36%, соответственно. В таблице 3 представлены данные наблюдений за 10 лет.

Таблица 3. Частота выделения иерсиний из объектов окружающей среды на участках освоения промышленных территорий Якутии в 2002-2012 гг.

Районы Грызуны Смывы, овощи, вода водоемов

Всего Исследовано проб Выделено культур Абс (%) Всего Исследовано ггооб Выделено культур Абс (%)

Y.pseudotu-berculosis У. entero-colitca Y.kristensenii Y.entero-colitica Y.kristensenii Y.intermedia Y.frede-riksinia

Участок железной дороги Беркакит- Ниж-ний-Бестях 239 4 (1,6) 3 (1,2) 43 (17,9) 11836 100 (0,8) 3 (0,01) 1 (0,008) 1 (0,008)

Нефтегазопровод «ВСТО» 382 1 (0,2) 2 (0,5) 3818 "

Зона строительства алмазодобывающих комплексов 729 - 9 (1,2) 51 (6,9) 3834 1 (0,02) 3 (0,07) - -

Сельскохозяйственные и непромышленные районы (19) 210 - 4 (0,1) - 21771 4 (0,01) - - -

Установление источников и факторов распространения иерсиний на территориях промышленного освоения Якутии позволяет сделать заключение о циркуляции на указанных территориях не только У. еШегосоШка (патогенных биотипов), но и У. кп$1етепи, патогенность которых в данном исследовании установить не удалось.

Результаты ПЦР могут служить сигнальными показателями для дальнейших целенаправленных бактериологических исследований.

Полученные результаты исследований подтвердили необходимость проведения ретроспективных серологических обследований населения в промышленных районах с целью установления истинной заболеваемости иерсиниозами.

Характеристика биологических свойств иерсиний, циркулирующих в условиях изменения климата Якутии

В результате проведенных исследований получены данные о распространении на территории Якутии Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и Y. enterocolitica пяти серотипов - 0:3 (биотип 4) - 7,1%; 0:9 (биотип 2) -3%; 0:5; 0:6,31; 0:7,8 (биотип 1А) -89,9%. Наибольшее число штаммов Y. enterocolitica принадлежало серотипу 0:5 биотипу 1А (44,4%) (Таблица 4).

Таблица 4. Результаты серотипирования штаммов иерсиний

Объект У. pseudotuberculosis У. enterocolitica

Серотип

0:1 0:3 | 0:9 | 0:6,31 | 0:7,8 | 0:5

Биотип

4 2 1А 1А 1А

Мелкие млекопитающие 3 3 2 4 3 7

Смывы ООС - 2 1 5 10 15

Овощи - 2 - 7 13 22

Вода открытых водоемов - - - 1 -

Почва - - - - 1 -

Прочие - - - 1 - -

Итого, абс (%) 3 (100) 7 (7,1) 3(3) 18 (18,2) 27 (27,3) 44 (44,4)

Применение ПНР для исследования проб из объектов окружающей среды и клинического материала от больных

За 2006-2012 гг. методом ПЦР проведено 2810 исследований проб из объектов окружающей среды. В результате исследования обнаружены ДНК Y. pseudotuberculosis в 5 пробах (от грызунов (0,1%) и из воды открытых водоемов (0,6%), У. enterocolitica в 319 пробах (от грызунов (12%), из воды открытых водоемов (5,5%), почвы (1,4%) и других пробах (8%), что составило 0,17% и 11,3%, соответственно.

В 2013 г. методом ПЦР исследовано 447 проб из объектов окружающей среды, обнаружены ДНК У. enterocolitica - в 119 пробах (26,6%); из 164 смывов, в том числе, с овощей - в 47 пробах (28,6%), из 199 проб органов мелких млекопитающих - в 45 (22,6%), из 15 проб воды открытых водоемов в 9 пробах (60%), из 28 образцов фекалий крупного рогатого скота - в 4 пробах (14,2%), из 23 образцов органов свиней - в 14 (60,8%).

В 2011-2012 гг. метод ПЦР был внедрен в клиническую практику. В результате обследования 203 больных, в том числе, 32 детей с состоянием дисбиоза (амбулаторные пациенты) и 171 стационарных больных из кишечного отделения Якутской городской инфекционной клинической больницы с диагнозами ОКИ, ОГЭК, частота обнаружения ДНК У. enterocolitica у больных составила 6,4% , в том числе, у взрослых - 5,8%, у детей - 9,3%.

Комплексный подход, сочетающий ПНР с бактериологическим методом исследования, существенно повышает эффективность лабораторной диагностики, равно как и мониторинговых исследований за циркуляцией иерсиний.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов по наличию некоторых генетических детерминант вирулентности

Впервые изучена генетическая характеристика штаммов, выделенных на территории Якутии, по плазмидным и хромосомным факторам вирулентности: ail, ystA, ystB, урт а/с, irp2, pYV (yscQ), ykst методом ПЦР.

С целью выявления генетических детерминант вирулентности исследован 171 штамм, в том числе У. pseudotuberculosis - 3 штамма, Y. enterocolitica - 99, Y. kristensenii - 50, Y. intermedia - 2, Y. frederiksenii - 2, не идентифицированные до вида Yersinia -15 штаммов.

Результаты исследования показали, что у 3 штаммов Y. pseudotuberculosis выявлен хромосомный ген, кодирующий суперантиген (урт А/С), а также ген, локализованный на плазмиде вирулентности иерсиний pYV 42-48 МДа (yscQ). У 10 штаммов Y. enterocolitica биотипов 2, 4 обнаружены генетические детерминанты вирулентности: локус прикрепления и инвазии (ail), ген термостабильного энтеротоксина ystA. У 71 штамма Y. enterocolitica биотипа 1А при анализе генома выявлено наличие хромосомного гена ystB, с которым связывают продукцию термостабильного энтеротоксина, играющего важную роль в патогенезе диарей. Полученные данные свидетельствуют о том, что изолированные культуры иерсиний обладают детерминантами патогенности. У 4 штаммов У. kristensenii также определен ген ykst.

Изучение генетических характеристик штаммов, обусловленных генами gyrB и ompF

Идентификацию патогенных видов рода Yersinia осуществляли методом мно-гопраймерной ПЦР по выявлению гена ompF, кодирующего порин OmpF.

Изучены 68 штаммов, выделенных из объектов окружающей среды и от больных, в том числе, 6 - У. pseudotuberculosis, 45 - У. enterocolitica 1А, 2,4 биотипов; 2 -У. kristensenii, 15- У. spp.

51

в Угр 1501 5вч13Э в Угр 1502 Ееч14С О Ует 1531 5еч1Ю

• Уеп! 1462 гвчЮС Уе1245 Уе 1215 Уе 1234 - Уе 1Р2222 1 а

• Ует 1464 зесре УтаББ 1533 геч13

73!» Ует 1450 геч12Э I- Уе №0 1а Уе 8С61 Уе 221

Уе 2720/87 Уе 6579 Уе 108-С 62'Уе РЬРВО Уе1 -УГ 33641

I хиЬ. еп{егосо|№са

*иЬ.ра|еа(с||са

У.елГегосо//Ь'са

-УГОЛ АТСС43380

-О Ук 1491 seq5G

.в Уэр 1439 зеч7С —Угр 1483 еечВЭ I а Ук 1513 Бечго Ук 6572 Ук Н17-36/83 Ук АТСС33638

_р-Уа1с1 У112

зэ1 УаШ АТСС35236

— Угис АТСС29473

- У12043

99 , УЬ Н632-36/85

ч-

981-'

' УЬ АТСС43970 - Уа1ек У159

- Ут 87-36/87

ЭЭ|-Ф Уэр 1506 эея43

У1 6044 -У| 29909

- У| 6270

У./л/егтеЛ'а

- Уе1т У233

г Ур5 1Р32953 *- Урэ 1500 5ея15С Урэ 1498 геч163 Урэ 1497 геч17С ' Ург 1330 ееч18в Ур5 1276 ееч190 " Урэ 1073 веч200 Урэ 1Р31758

У.р$еис1ЫиЬегси/а§13

Рисунок 2. Филогенетическое дерево иерсиний, построенное методом ближайших соседей на основе гена %угВ.1

1 Символом • показаны штаммы исследуемых иерсиний, последовательности остальных штаммов иерсиний представлены в базе данных СепеВапк.

Для быстрой детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica штаммы были разделены на четыре группы: Y. spp. (один ПДР-фрагмент длиной 450 п.н.), У. pseudotuberculosis (два ПЦР-фрагмента - 426 и 756 п.н.), У. enterocolitica (два ПЦР-фрагмента - 465 и 663 п.н.). и У. enterocolitica subsp. palearctica (три ПЦР-фрагмента - 465, 663 и 270 п.н.).

Распределение по группам было следующим: в группе У. spp - 22 штамма, из j них 17 были определены как У. enterocolitica 1А, 2 штамма - У. kristensenii и 3 штам- . ма - У. spp. В группе У. pseudotuberculosis - 6 штаммов; в группе У. enterocolitica - 11 штаммов и в группе У. enterocolitica subsp. palearctica - 20 штаммов У. enterocolitica. Была найдена группа, которая включала 9 штаммов, дающих два ПЦР-фрагмента длиной 465 и 270 п.н. Проведен углубленный анализ исследуемых штаммов У. enterocolitica для точной видовой идентификации и молекулярно-генетической характеристики. В результате исследования определены нуклеотидные последовательности участка гена gyrB у 18 штаммов, представляющих все установленные ранее группы. На общем филогенетическом дереве штаммы У. enterocolitica биотипа 1А группируются с типовыми штаммами биотипа 1А, формируя собственную ветвь в пределах вида У. enterocolitica (Рисунок 2). Определен высокий уровень дивергенции у некоторых штаммов У. kristensenii и У. intermedia.

GyrB-генотипирование подтверждает гетерогенную структуру У. enterocolitica биотипа 1А.

Серологический скрининг антител к возбудителям псевдотуберкулеза и < кишечного иерсиниоза в районах Якутии

В 2002-2012 гг. серологическими методами обследовано 1687 больных и здоровых лиц с диагностической целью и ретроспективно в целях мониторинга заболеваемости иерсиниозами.

С помощью РНГА исследовано 1687 ОСК, обнаружены антитела к возбудителю псевдотуберкулеза - в 93 ОСК (5,5%), к возбудителю кишечного иерсиниоза 0:3 - в 337 ОСК (19,9%), 0:9 - в 14 ОСК (0,8%) (Рисунок 3).

п=1687

5,5 %

□ Г. pseudotuberculosis

□ Г. enterocolitica 0:3 Ш Y. enterocolitica 0:9

□ не обнаружено

Рисунок 3. Результаты определения антител к возбудителям иерсиниозов методом РНГА, (%)

В течение 2002-2012 гг. в Якутии с диагностической целью обследовано 415 пациентов. Больные были разделены на несколько групп: - с подозрением на псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз; - с острыми кишечными заболеваниями; - с гастроэнтероколитами; - с аллергическими заболеваниями; - длительно лихорадящие. ОСК от пациентов были исследованы с помощью РНГА. Установлено, что антитела к У. pseudotuberculosis обнаружены в 29 ОСК, к У. enterocolitica 0:3 в 108 ОСК, что составило 6,9% и 26%, соответственно. Антитела к возбудителям иерси-ниозов обнаружены среди всех групп больных.

Для изучения содержания специфических антител к У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis впервые проведено ретроспективное серологическое исследование сывороток крови здорового населения. Всего обследовано 719 человек с помощью РНГА. Антитела к возбудителю псевдотуберкулеза выявлены у 38 человек, к возбудителю кишечного иерсиниоза серовара 0:3 у 139 человек; 0:9 - у 4 человек, что составило 5,2%, 19,3% и 0,5%, соответственно (Рисунок 4).

В ОСК, полученных от здорового населения из сельскохозяйственных и промышленных районов, методом РНГА обнаружено практически одинаковое количество ОСК, содержащих противоиерсиниозные антитела - 22,7% и 25,1%, соответственно. ОСК, полученные от больных людей с различной патологией, чаще содержали противоиерсиниозные антитела по сравнению с ОСК, полученными от здоровых людей - 33%±2,31 и 24,1%±1,2 (р<0,05), соответственно.

Рисунок 4. Результаты определения антител у здоровых людей микрометодом РНГА, %

Полученные данные свидетельствуют об инфицировании обследованных лиц иерсиниями.

Серологический скрининг иерсиниозов у сельскохозяйственных животных

Исследовано 125 ОСК сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот - 88, лошади частных фермеров - 37). В результате обнаружены антитела к У. pseudotuberculosis серотипа 0:1 в 11 ОСК от общего количества ОСК (8,8%), в том числе, от крупного рогатого скота - 9, от лошадей - 2 и к У. enterocolitica серотипа 0:3 в 48 ОСК (38,4%), в том числе, крупного рогатого скота - в 40, лошадей -18; к У. enterocolitica серотипа 0:9 в 23 ОСК (18,4%), в том числе, крупного рогатого скота - 17, лошадей - 6 (Рисунок 5).

п=719

>

5.2%

0.5% □ Г pseudotuberculosis

□ У. enterocolitica 0:3 ■ ]' enterocolitica 0:9 Ш не обнаружено

п=125

8.8 %

н К р$еис1ошЬегси1оз1з О У. еШегосоИЧса 0:3 38,4%в у егиегосоШса 0:9 □ не обнаружено

Рисунок 5. Частота обнаружения антител к возбудителям иерсиниозов у сельскохозяйственных животных, %.

Таким образом, высокие показатели содержания специфических антител к возбудителям иерсиниозов у сельскохозяйственных животных свидетельствуют об интенсивной циркуляции иерсиний на территориях животноводческих хозяйств.

Разработка системы микробиологического мониторинга за циркуляцией иерсиний в условиях Крайнего Севера <!

На основании полученных результатов, предложен алгоритм микробиологического мониторинга за циркуляцией иерсиний (Рисунок 6). Наблюдение за циркуляцией возбудителей иерсиниозов рекомендуется проводить с профилактической целью в плановом порядке и по эпидемическим показаниям с учетом климатических условий и медико- географических зон территории Якутии.

Планово обследуют объекты общепита, жилые дома, детские и образовательные, лечебные учреждения и др. с целью определения степени заселенности грызунами. Проводят лабораторные исследования, чтобы определить частоту и динамику инфицированности грызунов, обсемененности сырья и продуктов питания (овощи-фрукты, молоко, мясо), обсемененности окружающей среды (тара, отсеки, емкости, оборудование, инвентарь и т.д.).

Отбор проб и исследования овощей, фруктов, смывов инвентаря, тары, оборудования проводятся специалистами центра гигиены и эпидемиологии по плану контрольно-надзорных мероприятий за соблюдением санитарного законодательства в соответствующих организациях (1 раз в 3 года), а так же бактериологические исследования проводятся с учетом Программы производственного контроля (СП 1.1.105801), ответственными за эту работу являются руководители соответствующих организаций (объекты общественного питания, образовательных учреждений, ЛПО, цеха обработки овощей, овощехранилища, продуктовые склады, птицефабрика и теплицы).

Алгоритм микробиологического мониторинга

I. Плановые (профилактические) исследования

Исследования проб от люден /

При контрольно-надзорных мероприятиях,осуществляемых по предписанию УРПН Р(С)Я проводят специалисты ЦГиЭ в Р(С)Я

II из объектов окружающей среды \

По программе производственного По ведомственной целевой контроля, осуществляются программе «Стоп инфекция»

предприятиями производства, хранения и реализации ^ |

растительной продукции

Дети, взрослые в очагах инфекции

обследование людей из групп «риска»

обследование объекты

объектов сельского

окружающей среды хозяйства и из природных очагов животноводства на осваиваемых территориях осуществляют специалисты ЦГиЭ в Р(С)Я

П. По эпидемическим показаниям

/ —Т \

Пищевые продукты в очаге

Смывы из объектов Грызуны окружающей среды

Рисунок 6. Алгоритм микробиологического мониторинга

С профилактической целью рекомендуется выборочно проводить серологический скрининг сельскохозяйственных животных и групп профессионального риска, особое значение также имеет выявление иерсиний среди мелких млекопитающих в природных и антропургических очагах.

По эпидемическим показаниям рекомендуем обследовать детей и взрослых из очагов инфекции. Лабораторному исследованию подлежит готовая продукция (яйца, тушки птиц, пастеризованное молоко, мясные продукты, салаты и др.), отбор и исследования проводится специалистами ФБУЗ «ЦГиЭ в РС (Я)».

Предложенный алгоритм позволит усовершенствовать микробиологический мониторинг за циркуляцией иерсиний, улучшить диагностику инфекций, обусловленных возбудителями иерсиниозов на территории Якутии.

Выводы

1. Установлено, что на территории Якутии распространены различные виды бактерий рода Yersinia; с преобладанием Y. enterocolitica - 51,6%; У. kristensenii -35,8%, а также циркуляция У. pseudotuberculosis - 1,6%; У. intermedia - 0,8%; У. frederiksenii - 1,2%; Yersinia spp.- 8,9%. Основным резервуаром в природных и ан-тропургических очагах являются разные виды мелких млекопитающих, в основном серые крысы, полевки, лемминги.

2. На основе gyrB-генотипирования установлено, что штаммы У. enterocolitica биотипа 1А имеют родство с типовыми штаммами биотипа 1А, формируя собственную ветвь в пределах вида У. enterocolitica. Штаммы У. kristensenii и У. intermedia имеют генетическое различие, обусловленное полиморфизмом гена gyrB. Из числа изученных штаммов У. enterocolitica биотипа 1А серотипов 0:6,31; 0:5; 0:7,8 традиционно отнесенных к непатогенным, 80% содержат хромосомный ген термостабильного энтеротоксина ystB.

3. Эпидемический процесс при иерсиниозах на территории Якутии характеризуется спорадической заболеваемостью, неравномерностью ее распределения по городам и районам. Серологическими методами подтверждена иерсиниозная природа заболеваний людей с различной патологией (ОКИ; гастроэнтероколиты; длительно лихорадящие) в 33% случаев. Антитела к иерсиниям обнаружены также у здоровых лиц в 25,1% и в 22,7% из промышленных и сельскохозяйственных районов, соответственно.

4. Разработанная тактика микробиологического мониторинга, циркулирующих штаммов иерсиний, на основе использования лабораторных методов (ИФА, ПЦР, в том числе, многопраймерной ПЦР, генотипирования, серотипирования) позволит на территории Якутии осуществлять эффективный эпидемиологический надзор за иерсиниозной инфекцией.

Практические рекомендации

1. Эпидемиологам центра гигиены и эпидемиологии, в том числе, филиалов и структурных подразделений Республики Саха (Якутия) при проведении плановых контрольно-надзорных мероприятий необходимо обследовать объекты общепита, жилые, детские, образовательные и лечебные учреждения с целью определения степени заселенности объектов грызунами.

2. Специалистам бактериологических лабораторий филиалов и структурных подразделений центра гигиены и эпидемиологии в соответствии с планами контрольно-надзорных мероприятий и производственного контроля проводить бактериологическое исследование сырья, продуктов питания и объектов окружающей среды с целью определения частоты и степени обсемененности иерсиниями.

3. Специалистам лаборатории особо опасных инфекций центра гигиены и эпидемиологии в соответствии с планами контрольно-надзорных мероприятий, производственного контроля и ведомственной целевой программы «Стоп инфекция» определять частоту и динамику инфицированное™ грызунов, частоту и степень обсемененности иерсиниями сырья, продуктов питания и объектов окружающей среды бактериологическим методом и методом ПЦР.

4.Специалистам лаборатории особо опасных инфекций центра гигиены и эпидемиологии проводить серологический скрининг групп людей профессионального риска и сельскохозяйственных животных. По эпидемическим показаниям с целью установления источника инфекции и фактора передачи параллельно с бактериологическим методом использовать метод ПЦР.

5. Врачам клинико-диагностических лабораторий первичного звена с целью выявления заболеваний, обусловленных возбудителями псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза, рекомендуется проводить диагностические исследования на иерсиниозы больных с диагнозами ОКИНЭ и ГЭК бактериологическим, иммунологическим методами и ПЦР.

Перспективы дальнейшей разработки темы

1. Планируется продолжить проведение микробиологического мониторинга за циркуляцией иерсиний на территории Якутии.

2. Продолжить углубленное изучение штаммов, выделенных на территории Якутии, с целью определения их генетических детерминант вирулентности и возможного влияния, обнаруженных генетических детерминант на патологический процесс, связанный с особенностями клинического проявления иерсиниозов.

3. Для определения этиологической значимости иерсиний продолжить обследования больных с диагнозом острая кишечная инфекция неустановленной этиологии на территории Якутии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кершенгольц, Б.М. Влияние глобальных климатических изменений на реализацию потенциала инфекционных заболеваний населения в Российской Арктике (на примере Якутии)», обзор. / Б.М. Кершенгольц , В.Ф. Чернявский, В.Е. Репин, О.И. Никифоров, О.Н. Софронова // Экология человека. - 2009. - №6. - С. 34-39.

2. Никифоров, О.И. Эпидемиологический потенциал природно-очаговых инфекций в зонах прохождения меганефтепровода ВСТО на территории Республики Саха (Якутия) / О.И. Никифоров, В.Ф. Чернявский, В.Т. Климов, Е.И. Андаев, О.Н. Софронова, Н.А. Антонов, И.А. Романова// Журнал инфекционной патологии. - Иркутск, 2009. - том 16, №3. - С. 160-162.

3. Софронова, О.Н. К вопросу циркуляции Yersinia pseudotuberculosis среди мелких млекопитающих в Якутии / О.Н. Софронова, И.А. Романова, О.И. Никифоров, В.Ф. Чернявский, С.С. Теленков, Е.А. Богумильчик // Журнал инфекционной патологии. - Иркутск, 2009. - том 16, №3. - С. 202.

4. Чернявский, В.Ф. Эпизоотолого-эпидемиологический потенциал природно-очаговых инфекций в Якутии и его динамика в современных условиях / В.Ф. Чернявский, О.И. Никифоров, В.Е. Репин, Б.М. Кершенгольц, О.Н. Софронова // Якутский медицинский журнал. - 2009. - №1. - С. 58-61.

5. Богумильчик, Е.А. Изучение инфицированности Yersinia enterocolitica мелких млекопитающих в Якутии / Е.А. Богумильчик, О.Н. Софронова // Научный сборник «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». - СПб., 2010. - С. 90-91.

6. Григорьева, В.И. Мониторинг за возбудителями природно-очаговых инфекций в Якутии / В.И. Григорьева, О.Н. Софронова, И.А. Романова // Научный сборник «Вопросы региональной гигиены, санитарии, эпидемиологии и медицинской экологии». - Якутск, 2010. - С. 304-308.

7. Софронова, О.Н. Изоляция культур возбудителя псевдотуберкулеза и кишечного иер-синиоза из органов серых крыс в г. Якутске / О.Н. Софронова, И.А. Романова, О.И. Никифоров, В.Ф. Чернявский, Е.А. Воскресенская, Е.А. Богумильчик, Г.Я. Ценева // Научный сборник «Вопросы региональной гигиены, санитарии, эпидемиологии и медицинской экологии». -Якутск, 2010. - С. 313-316.

8. Богумильчик, Е.А. Изучение инфицированности иерсиниями мелких млекопитающих, обитающих на территории Якутии / Е.А. Богумильчик, О.Н. Софронова, Г.Я. Ценева, Е.А. Воскресенская // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями». - СПб., 2011. - С. 30-32.

9. Софронова, О.Н. О циркуляции иерсиний на территории Якутии / О.Н Софронова, Е.А. Богумильчик // III Всероссийская научно-практическая конференция «Инфекции, обусловленные иерсиниями». - СПб., 2011 - С. 98.

10. Софронова, О.Н. Микробиологический мониторинг иерсиниозов в Якутии / О.Н. Софронова, Е.А. Богумильчик, Е.А. Воскресенская, Г.Я. Ценева, В.Ф. Чернявский, И.А. Романова, О.И. Никифоров // Якутский медицинский журнал. - 2012. - №1 ( 37). - С. 69-72.

11. Софронова, О.Н. Молекулярно-генетические особенности циркуляции бактерий рода Yersinia на территории Якутии / О.Н. Софронова, A.M. Стенкова, Е.А. Богумильчик, Е.А. Воскресенская, М.П. Исаева // Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ». Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2, №1-2. - С. 323-324.

12. Софронова, О.Н. Методы лабораторной диагностики иерсиниозов в современных условиях / О.Н.Софронова, И.А. Романова // Материалы I республиканской научно-практической конференции «Проблемы антибиотикорезистентности в многопрофильном стационаре» - Якутск, 2012. - С. 111-115.

13. Софронова, О.Н. Молекулярно-биологические методы идентификации иерсиний, циркулирующих на территории Якутии / О.Н Софронова, М.П. Исаева, Е.А. Богумильчик, А.М. Стенкова, Н.М. Тищенко, К.В. Гузев, И.А. Романова, Г.Я. Ценева // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - Хабаровск, 2012. — № 20. - С. 77-83.

14. Тищенко, Н.М. Генетическая характеристика и антигенные свойства фосфолипа-зы А из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis / Н.М. Тищенко, С.И. Ба-холдина, О.Ю.Портнягина, О.Н. Софронова, К.В. Гузев, А.В. Ракин, М.П. Исаева // Якутский медицинский журнал. - 2012. - №4 (40). - С. 68-71.

15. Исаева, М.П. Эволюционно-популяционные основы гетерогенной структуры Yersinia pseudotuberculosis на основе MLST- анализа генов белков наружной мембраны / М.П. Исаева, А.М. Стенкова, К.В. Гузев, Е.П. Быстритская, Ф.Н. Шубин, Н.Ф. Тимченко, О.Н. Софронова, В.А. Рассказов, А.В. Ракин // Материалы I Всероссийской конференции «Гетерогенность популяций бактерий и вирусов и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней». - Владивосток, 2013. - С. 34-37.

16. Софронова, О.Н. К вопросу изучения молекулярно-генетических свойств бактерий рода Yersinia, циркулирующих на территории Якутии в условиях вечной мерзлоты / О.Н. Софронова, Е.А. Богумильчик, И.А. Романова, А.М. Стенкова, К.В. Гузев, М.П. Исаева, Г.Я. Ценева // Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т. 3, №2. - С. 174.

17. Софронова, О.Н. Дифференциальная диагностика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в Республике Саха (Якутия) / О.Н Софронова, О.Ю. Портнягина, О.П. Вострикова, П.С. Дьячковская // Сборник материалов I Международной научно-практической конференции «Система здравоохранения: Методики, проблемы, достижения». - Новосибирск, 2013. - С. 30-34.

18. Софронова, О.Н. Использование метода ПЦР для диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза в г. Якутске / О.Н. Софронова, И.А. Романова // Материалы I Всероссийской конференции «Гетерогенность популяций бактерий и вирусов и ее отражение в эпидемиологии и клинике инфекционных болезней». - Владивосток, 2013. -С. 94-96.

19. Sofronova, O.N. Circulation of Yersinia in the far North of Russia in conditions of permafrost / O.N. Sofronova, G.Y.Tseneva // Yersinia 2010. 10 International Symposiums. - Recife, Brazil, 2010.-P. 104.

Список сокращений

ВСТО - Восточная Сибирь - Тихий океан

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПО - лечебно - профилактическая организация

МФА - метод флуоресцирующих антител

НМ - наружная мембрана

НПК - научно-практическая конференция

ОГЭК - острый гастроэнтероколит

ОКИ - острые кишечные инфекции

ОКИНЭ - острые кишечные инфекции неустановленной этиологии ОСК - образец сыворотки крови п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция РНГА - реакция непрямой гемагглютинации СВИ - сыворотка к вирулентным иерсиниям

Подписано в печать 27.02.15. Формат 60x84/16. Гарнитура «Тайме».

Печ. л. 1,75. Уч.-изд. л. 2,19. Тираж 100 экз. Заказ № 56 Издательский дом Северо-Восточного федерального университета, 677891, г. Якутск, ул. Петровского, 5.

Отпечатано в типографии ИД СВФУ