Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические аспекты вирулентности Yersinia enterocolitica и их значение для микробиологической диагностики иерсиниоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические аспекты вирулентности Yersinia enterocolitica и их значение для микробиологической диагностики иерсиниоза"

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ тени И. К. СЕЧЕНОВА

на правах рукописи

СМИРНОВ Игорь Владимирович

УДЯ 616.98: 576, 851.45

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВИРУЛЕНТНОСТИ УЩЗДН1А вдгштлпсл Н ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДОЯ ЫИНРОЕИОЛОГИЧЕСКСЙ ШПЮСГГИКИ ИЕРСИКИОЗА

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 1992

1 тдол |

..... ■ ",ч"|оота пкполиеиа га кмодро япкрсбполопя, ю<муиологяи и

гарусологип Рязанского иедтряского шютитута ш.акяд.И.П.И.гплор-»

Научил!; консультант - заслулзпний дсятзль пауки РС-ТСР,доктор мс!диц;п1скга наук,профессор Р.Н.Ребротю,

(Кпппалышг оппоненты: . '

- дохстор медицинских нзук, про*.гесср С.А.Дратпшг

- доктор нспццшсготс наук, В.П.Шит'Ов

~ доктор медицинских паут;, профессор К.А.Ведннша

Ведуи?л организация - Московский шучпо-иесладсвателъски;\ пчотчтут згтага е-.гворотож гетени И.Л.('е'Ш1!т{ова

Защита состоится " " 19Э2 г в час,

па заседании Специализ:!ров?нного Ученого совета ДС74.05.10 ггрп Московской подпцшюкой акодэшги нпенп '/.".Сеченова /. г.Москга, ул.Б.Пироговская, д.2/0 /

С дяссертяцвой нолю ознакомиться в библиотеке академии / г.Москва, Зубовский оульвгр, д.37/1 /

Автореферат разослан " № " __1992 г

Учений секретарь Сигциализкрованиого Ученого совета, гезкдндат медицинских наук

Гаоота вкгомша на к&одрз >!ико.->ла:.ог1,:!> с-лунок-гик к вирусологии гыэпгкэго иодицгаюкого тс-ютигут »>жяю «исздемила ПЛ.иавто;-.

Научный консультант - в&служешшй деятель науки НЖ1Р, доктор медицинских наук, профессор Р.Н.Реброва,-

Омшиглышэ оппоненте:

1. Лоетор модиццнеких наук, профессор С.А.Драгвин

2. Доктор нздвцгаюких наук, профессор ВЛ.Щошов

3. докгор медицинских наук, .профессор Е.А. Ведьмина

Ведущая организация - Московский научно-исследовательски;! институт вакцин и сывороток им. И. II. Мечникова

Защита состойся "_"_ 1992 г в_тс.

на. заседании Специализированного Ученого совета Д074.С5.10 при Московской медицинской академии им.К.Н.Сечзнова ( г.Москва, ул. Б.Пирогосскрл, д.2/6 )

С диссертацией мепт опткгиптхея б библиотеке академии Автореферат разослан "___"__,_1092 г.

Учгнчй секретарь Специализирванного Ученого совет, Ш'идидрт мгдицик.пких наук

Л.'Й.МпрШЮБ

ОЕЦДЛ Х^Р/ЛСШ^ЖСА PACOTU

Актуальность проблемы. В настоящее гремя отмечается неуклонной кзрасташю числа инфекций, илзщассых потенциально-патогенными бактериями. Ото обртловлеяо, d частности, формированием йогах клонов возбудителей, обладающих достаточно ижония патогенным потенциалов ( Finlay, I'alkow, 1989 ), Разработка методов шягления у микроорганизмов генетических детерминантов, определявших этот потенциал, и 'к феноткпичесних паркеров является актуальной задачей здравоохранения в клинической и противоэпидемической практика.

Иерсичиоз составляет гшачительнуп часть инфекционной патологии, особенно среди детей. Несмотря на отсутствие ( до 1987 г ) п СССР официальной регистрации заболеваний, шзнзаемот Y.enteroooiitica , данные литературы позволяет считать, что они распространены практически повсеместно.

Лабораторная диагностика иерсиниоза до настоящего времени остается иалоэффектигной из-за длительности выделения, применения слок-üux селективных сред и трудоемкой идентификации иерс^язий ( Бороть«-•цева и соавт., 1987; Королвк, 1984; Тимофеева и соавт., 1983 ). Внутривидовая дифференциация штаммов при этом ограничивается лиаь определением биопара, а при наличии типовых сывороток - 0-серогара. ¡Значительная биохимическая, аытигсиная и экологическая неоднородность этой группы микроорганизмов, их широкие антигенные связи с другими энтеробактериями и неодинаковый патогенный потенциал существенно осложняют оценку этиологического и впидемиологического значен ния выделяемых итагаов иерсиний.

Известно, что патогенные свойства лгерскиий частично контролируются генами плазмидм pW ( Cover, 1989; Skurnik , 1905; v/olf-Wata , 1987 ). Однако, до настоящего времени остаются неясными вопросы генетического детерминирования патогенных свойств у возбудителя иер-синиоза различны* сероваров, циркулирующих на территории страна, не разработаны методы тестирования маркеров вирулентности возбудителя, непосредственно связанных с патогенезом инфекции, как и адекватные экспериментальные модели для определения вирулентности in vivo. Необходимо усовершенствование серодиагностики иерсинноаа, которая традиционно проводится путем выявления иммунного ответа на антигены возбудителя, лишь косвенно связанные с его патогенными свойствами и, кроме того, перекрестно реагирующие с антигенами других микроорганизмов ( Pc.erreea.ard et al. , 1988 ).

Решение этих вопросов диктуется необходимостью корректной идентификации патогенных штампов Г клонов ) иерсиний, уточнения особен-

ногтей микробиологии, клишкн, эпидемиологии и профилактики иерсиниоза, екодогии его возбудителя.

Цель исследования заключалась в усовершенствовании микробиологической диагностики иерсиниоза на основе изучения генотипи-чесшх особенностей снтеропатогенных Гогв1п1е. е!иегоео111:1с£

Основные задачи исследования:

1. Изучение особенностей генетического контроля патогенных свойств основных сероваров возбудителя иерсишова и близкородственных микроорганизмов в плане их дифференциации.

2. Исследование плазмидного спектра местных шталмов иерсиний

и его значенил в проявлении вирулентности и других биологических свойств отих микроорганизмов..

3.'Разработка микробиологических методик и препаратов для идеи- -тификации возбудителя иерсиниоза на основе определения его генетических детердинантовпатогегаюсти и ассоциированных

с ними (^ештипических признаков в целях усовершенствования диагностики иерсиниоза.

4. Оценка распространенное!и некоторых маркеров вирулентности

у штаммов иерсиний, ввделенннх от ладей и из различных объектов внешней среды.

5. Разработка нового подхода к выявлению специфического антительного ответа при персиниоэе на основе фенотипических особенностей здтеропатогенных иерсиний.

Основные положения ,■ выноскмне на защиту.

I. Изученные итамщ энтерспатогеших иерсиний, являющиеся основными возбудителями иерсиниоза в Европейской части страны, ¡шеш характерный пдазииднш. профиль. Абсолютное большинство свеяевццеленных шташов возбудителя содержит плазмвду виру- ' Лентности ( ПВ }, которая по основным гено- и фенотипическим характеристики соответствует плазмадзм группы.рУУ . Наличие указанной плазмиди в значительной пере определяет выраженность патогенных свойств У.епгегосоШхса .'тестируемых на различных моделях.

2. Тесты ферментации салицина и лактозц, аутоагглютинации, кальцийэависимости, чешературозависимой морфологии колоний и выявление ПВ-ассоциировантл; антигенов, наряду с биоваром и сероварон, целесообразно использовать для оценки этиологического и эпидемиологического значения ввделлемых маниов ( клонов ) иереиний.

3. Специфичность выявляемого антительного ответа при иерсиниозе может быть повшена путе;,! определения антител к антигенам возбудителя, экспрессия которых происходит при температуре тела хозяина ( 37°С ). Использование (в качества антигена) микробных масс изогенитяс ПВ'Ь и ПВ" вариантов иереиний, выращенных: при 37°С, позволяет в агглвтинациокном тесте выявлять эти антитела.

4. Определение детерминантов патогенности и ассоциированного с ними фенотипа птаммов, а также выявление антительного ответа на связанные с вирулентность» антигены иерсиниЯ способствует. повьшению точности микробиологической диагностики иерсиниоза.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное изучение детерминируемых хромосомными и плазмиднычи генами фенотипических признаков, связан-нык с вирулентностью, у шташоп иереиний, циркулирующих на территории нескольких областей Европейской части страны, что позволило идентифицировать у большинства штаммов возбудителя плазмеду вирулентности рУТ (ПВ). Создана первая отечественная коллекция генетически охарактеризованных ПВ+ и ПВ" штаммов возбудителя иерсиниоза основных сероваров (03, 09), предназначенных для определения вирулентности выделяемых штаммов У.егиегссоИ-и-са, производства разработанного нами препарата СВИ для серологической идентификации энтеропатогенных штадаов (клонов) иереиний, а также получения вшокоспецифичних антигенов, использует« в реакции агглютинации ( РА ) с целью выявления антительного ответа при игрсини-озе. Тестчлтамм КМ—ЗЗС201) серо вара 03, предложенный для сравнительной характеристики свойств У.ег^эгосоНиса , связанных с ьи-

рулентностыо, защищен авторским свидетельством ( А.С.СССР Щ427837). По заявке № 4902269/13 "Штамм бактерий. Yersinia enterocolitica 955Ь серовара 03, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза" получено положительное решение ВНИИГПЭ о вьщаче авторского свидетельства ( от 16.04.91 ); при этом впервые для получения высокоспецифичного корпускулярного антигена для агглотинацион-ного теста предложено использовать культуру иерсиний, выр&ценнув при 37°С.

На основе изучения культуральных особенностей,вирулентных иерсиний показана возможность и разработаны критерии их дифференциации от близкородственных микроорганизмов, не связанных с возникновением иерсиниоза. Выявленные закономерности легли в основу разработанного и защищенного авторским свидетельством "Способа диагностики иерсиниозов" ( A.C. СССР №1683690 ).

Показана возможность оптимизации серодиагностики иерсиниоза с учетом генетических детерминантов патогенности его возбудителя. Впервые предложено проводить дифференциацию антительного ответа при иерсиниозе 09 и бруцеллезе на основе выявления антител к ПВ--ассоциированньм антигенам иерсиний. Предложенный "Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза 09 и бруцеллёза" защищен авторским свидетельством ( A.C. СССР №1703119 ).

Обоснован новый подход к микробиологической диагностике иерсиниоза, базирующийся на определении детерминантов патогенности и ассоциированного с ними фенотипа штаммов, а также выявлении иммунного ответа на антигены иерсиний, связанные с вирулентностью.

, Практическая значимость работы. Проведенное исследования позволили установить четкую связь чеящу ПВ-ассоциированными патогенными свойствами штаммов иерсиний и их принадлежностью к группе возбудителей иерсиниоза. Разработаны и усовершенствованы методы идентификации и-дифференциации этих микроорганизмов на основе выявления маркеров вирулентности в простых тестах in vitro с использованием сред и ингредиентов отечественного производства.

Создана коллекция региональных референсных штаммов возбудителя иерсиниоза. Эти штаммы депонированы в национальной коллекции патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на базе музея живых культур ПСК им.Л.А.Тарасевича С коллекционные Jftt 188, 189 и 207; справки о депонировании от 16.03.89 и 19.11.90 ) и музея живых культур В!М№1 "Микроб" ( КМ-33(201) и ИМ-Э<5 (241); справки о депонировании от 02.12.BG ). Использование референсных штаммов обеспе-сравнимость проводимых исследований.

Разработан и внедряется в производство диагностический препарат СВИ для серологической идентификации вирулентных иереиний, использование которого, в частности, позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики иерсиниоза и уточнить эпидемиологическое значение ввделяемых штаммов иереиний в ходе микробиологического слежения за состоянием различных объектов. Техническое задание на разработку препарата СВИ утвервдено МЗ СССР ( 05.08.91 ). Разработанная нами ( совместно со специалистами Ленинградского НИИЭ'.! им.Пастера ) необходимая научно-техническач документация ( экспериментально-производственный регламент, временная фармакопейная • статья, инструкция по применению > и лабораторные серии препарата СВИ находятся на рассмотрении в Комитете MIHI.

На основа результатов проведенных исследований изданы "Методические рекомендации по определению связанных с вирулентностью признаков иереиний" ( Рязань, 1989 ), которые внедрены в практических и исследовательских лабораториях.

Предложенный диагностический подход с Ориентацией на выявление маркеров вирулентности возбудителя иерсиниоза и соответствующие методические рекомендации вошли в Инструкцию по эпидемиологии, организации и проведению противоэпидемических мероприятий и лабораторной диагностике псевдотуберкулёэа и иерсиниоза № 15-6/48, утвержденную МЗ СССР 30.10.90 ( Составители: Багрянцев В.Н., Дайтер А.Б., Лдтлов Ф.Г., Калошина Л.А., Куляшова Л.Б., Читрикова Л.А., Саргсян С.С., Степанове Г.С., Смирнов И.В., Ценева Г.Я., Шубин Ü.H., Гщенко Г.В, ). Реализация этих положений позволит более корректно оценивать этиологическое и эпидемиологическое значение штаммов иереиний.

Полученные данные по выявлению антительного ответа на антигены иереиний, связанные с вирулентностью, предложенной штамм я способ получения антигена для РА, как и способ серологической дифференциации иерсиниоза 09 и бруцеллёза,' позволяют повысить точность и экономичность серодиагностики иерсиниоза.

Методические рекомендации, штаммы и препарат СВИ широко апробированы и уже используются в Ленинградской городской санэпидстанции, Московской городской санэпидстанции, Ленинградском НШ31Ч им. Пастера, Рязанской централизованной диагностической бактериологической лаборатории, на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Рязанской опорной базы Всесоаэноги центра по иерсинио-

зам и псевдотуберкулезу в рамках Комплексной программы научных исследований по проблеме "Иерсиниозы и псевдотуберкулёз", утвержденной Министерством здравоохранения СССР ( № 004-23/3 от 09.09.85 ).

Апробация работы. Материалы настоящей работы доложены на I Всесоюзной научно-практической конференции "Иерсиниозы: микробиология, опадемиология, клиника, патогенез, иммунология" ( Владивосток , 1986 ), на Всесоюзном семинаре "Колонизационная резистентность, и химиотерапевтические антибактериальныэ препараты" ( Москва, 1988 ), на Всесоюзной научно-практической конференции "Иерсиниозы. Микробиология, оппдемиологпЯ, клиника, патогенез, лабораторная диагностика" ( Владивосток, 1989 ), на Итоговой объединенной научно-практической конференции молодых'ученых, специалистов и студентов Дагестана по медицине ( Махачкала, 1589 ), на Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" . ( Махачкала, 1990 ), на Всесоюзной научно-практической конференции "Эффективность проводимых лечебно-диагностических, санитарно-гигиенических мер по снижению заболеваемости килечными инфекциями" ( Москва, 1990 ) | на Международном симпозиуме Н!.1олекулярно-биологические аспектк взаимодействия паразит-хозяин" ( Ленинград, 1987 ),' на Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация, СПИД" ( Ленинград, 1991 ), на С-м Всероссийском съезде научного общества микробиологов, опидомиологов и паразитологов .( Нижний Новгород, 1931 ), на семинаре для бактериологов лабораторий особо опасных' инфекций г.Москвы { МосгорСЭС, 1990 ), на Итоговой научно-практической конференции Ленинградского НИИЗД им.Пастера . ( Ленинград, 19Ш ), на заседаниях Рязанского отделения Всесоюзного научного общества микробиологов,; ишдшиологов и. паразитологов ( Гаэань, 198?, 1988, 1Ш9, 1990 ) .

Публикации» Основные материалы диссертации опубликованы в 1986-1С9Х гг в 22 работах ( из них 16 - в центральной печати ). Работа сшолнена лично автором на кафедре микробиологии, иммунологии и гаруеологии Рязанского медицинского института им.акад.И.П.Павлова.

Стр.уотура и обгеи диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав собственных исследований с обзором литературы к каздой главе, заключения, выводов,'указателя литературы, включающего 386 наименований { 126 отечественных и 260 зарубеднкх источников ), 6 приложений. Текст диссертации изложен на 290 страницах машино- ' ппен и иллюстрирован 1С таблицами и £2. рисунками.

.'¡АТЕРИАХЛ II iIETCV;j

Объектами наследования Служили 623 штамма Yersinia enterocolitica различных бис- и сероваров a tow числе 21 'эталонный из международной коллекции Института Паетера в Пг;píate ), 62 итамка других представителей рода Yersinia ( Y.pseudotuberculosis, Y.frederiJcee-, nil, Y.krittenaenii , 1 .intermodia ), Y.peatis ISV ( вакцинный ), а таие 45 штампов, отнесенных к другим 7 родам ünterobacteria -свае. Большинство ко указанных штаммов выделены от больных с различными формами кшечшх заболевания и-от здоровых лиц ( преимущественно из кала ), остальное - ис различных объектов внешней среды. Пслользсванние штаммы иереиний врделени, в основном, на территории Европейской части страны ( а Ленинграде, "омеге, Рязани, Новгородской, Брестской области ) общепринят^«! методами. Идентификации культур проводили по морфологическим, культуральнъ-м, биохимическим признакам и антигенной структуре ( Королюк, 1984; 'Ацеи-КО, 1985; Ber&ey' s Manual ..., 1904 ). Субкультивиросакие иереиний 'проводили, как правило, при 26°0, других энтеробактерий - при 37°С.

Биотюшрование Y.enterocolitica проводили по схеме Kilehv, ( 1969 ); оеровзр определяли по схеме в реакции агглютинации с адсорбированным типовыми диагностическими ci'воротками производства Ленинградского НИШ им.Павтера.

Буделенне плазмидной T'ÍCC проводили методом щелочной зистранции о додецнлеульфатои »атрия ( Portnoy u Milte , Ю84 ), a также с помощью обработки лиэоц1мом и последующего кипячения лизатов ( Holrr.mi u Guigley , 1981 ). Препараты ДНК изучали поеле электрофореза d

агарозном геле с применением стандартной трис-боратной буферной системы ( Герхавд, 1984 ) на приборах вертикальной и горизонтальной конструкций, Молекулярную массу плаэмид определили по электрофоретическоЯ подвижности в сравнении с подвижностью маркерных плазмид: Я27 \И2 í$), И1 <62 ЦП,), B446b (47 !1Д). »3<33 МД), а также плазмид из штамма Y.pestio 13V( б, 45 и 65 '{"., }. Всего получено и проанализировано 367 препаратов /Ш.

Опыты по элиминации плазииди вирулентности и и--плазмид иьрзн-н.иЯ проводили в L-бульоне с добавлением бромистого этвдия пли суб-бастерностатичоских концентраций антибиотиков при 57VC f ¡acnel-Briand et al. , 1963 ).

Опиты по нониогационному переносу íí-плазиид ставили в жидкой среде ( Герхарц, IQ81 ). Культу]« ?,<ящл и реципиента, вь'разовиме при оптимальной температур.?, смешивали С 1:5 - 1:10 > и инкубировали при оптимальной для донора тег/лературс-. Пр.". определении группы нс'сов юстимости IIB тнольаовъли рцтш-шике имччгг-ы пергтиФ,

устойчивые к рифашицину; донорами служили L.coli К12 35-3 > несущие стандартнее плазчиды 14-ти известных групп несовместимости. Соотношение частот передачи члазыиди ( pro donor ) в плетки ПВ+ к ПВ" вариантов определяли как индекс поверхностного исключения

Филлипов и соаст., 1987 ). С целью преодоления растрикционкого барьера при конъюгациопнем переносе использовали прогревание реци-пиентных клеток иерсиний перед скрещиванием ( Cornelia u Colcon, 1975 ).

Для оценки патогенных свойств у штаммов иерсиний использовали комплекс методик, включающий инфицирование культуры ткани Шр-2", чтеральное заражение взрослых мьшеП, коныонктивальноо заражение ,рских свинок, анальную пробу на дашах-сосунках*. Для инфицирования мокослся №'р-2 использовали агаровь-е культур" штампов в S-фор-ме, Еырадсннот при Рб°С, при посевной дозе 3x10' и.к./мл. Через 2, 5 и ГЛ ч мшубироьания при Е7°С готовили tipcnapa-ты для световой микроскопии, пкршпемнда по Лейшнану-РоыаноЕСкому-Гимзи. Учитывали но менее, чем по ICO клеток понослоя в трех препаратах, Взятых в каждчй срок; определяли процент "пораженных" клеток ( соде ряа'дих бактерии в цитоплазме или на плаэчолеме ) и число бактерий в ( или на ) клетках.

Для йктералыюго заражения использовали бееппродных белых mi прей массой 16-20 г, которкм вводили 10® г..к. иерсиний после ¿-суточного голодания или без него. Определяли признаки диареи ( Schlemaim u Deven! eli» 1982 ), а также длительность колонизации килечника -путем посевов на селоктивнне среды, генерализацию инфекции - по результатам посерев крови и гочегенетов внутренних органов, долгих на 3, б, 9, 14 и П сутки

Морских емэюк миссий 200-300 Г заражали конъюнктирально ( Полоцкий и соавт., I9B5 ): 1-2-суточную агаровую культуру, стращен-ную при ?6'JC, вводили бактериологической пст.-еР диаметром о мм в дозе 109-10Ю и.к. в оцш глаз ' второй служил контролем ). В течение недели еяедневго регистрировали изменения в глазу; проводили бактериологическое исследование отделяемого конъюнктивы и го-мзгенатов внутренних органов,

Гнтг ротоксигсндасть устанавливали по способности к продукции тсрмостабильного энтеротАгсзр^а ( СТ ) на методике СикрносоЛ Х.Л. ¡i г.оавт. í IS7G ). йильтрат надоседочно" падкости культур иерси-

Исследования проведены в Ленинградском МЭМ ич.Иастера.

cof'.'tcti»!) с Г.Я.Ц-ьбвой

ний, выращен«« я бухьоно Хоттиигера ssp.i в течение -58 ч, вводили через анальное отверстие м15лйм-сосутсьл. КооН-ициент расширения ! i£P ) при этом определялся как отношение массы тонкой иитг к остальной массе тела. За положительн..-Я результат принимали показатель i£P, провисающий 0,075.

¡,1а.ркорн вирулентности иарсшшй ( аугоагглютинацна, кальцийзави-симость роста ) виявляли нзвестнычи методами laird u Covanauch 1080; Bienciii и saith , 1961 )» а также раэработлинг-т в ходе,- настоящего исследования. ,Тлд вглвления паркера то'лпорптурозивисимой морфологии колоний вирулентных иерешшй излопьэовали разработанную и&ми методику, основанную на сравнения диаметров колший, порученных на среде АГВ при Ш°П и ЬГ/'С ( Смирнов и Цснева, Т991 }. Определение ПВ-ассоциирог,аншх чнткгенов иерсиний проводили в реакции агглютинации на стекле р полученной нами диагностической кроличьей' сывороткой к вируленттм иерзлниям ( СБН ).

Белки наружной менбранп из разрушение ультразвуком клеток иер-синий вццеляли по Ad.ar.ua et el.( 1980 )" путем экстрагирования ЗДГА-содержацим буфером из оиодочечной фракции, осажденной ультрацентрифугированием i после удаления цитоплавматическоП мембраны в буфере с тритоном X-IC0 ). Полученное препарат» БК.1 изучали в им-муиоблоте. Олектрофоретичсское разделение белков, осуществляли в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по Навез u Hick -. "rood. { 1981 ). После переноса на нитроцеллюлоз««» фильтр» последние обрабатывали либо порокеццааныч кшгшгнтим иммуноглобулинов к ПВ+шт?.мму иерскний, либо кроличьей .антисивороткой к ПВ+птачму с последующим троекратшм промнванием и обработкой балком А, мече-itai п е ро кс ид а я о Й.

Исследование сывороток крови лещей ( Э65 ) и животннх ( 1Й2 ) на наличие иерсиниознкх антител проводили в РИГА и/или РА по общепринятым методика! и в нашей модификации. В качестве дополнительных контролей использовали постановку РГНГА с полит антигеном из микробннх масс референенкх штамчов иерсиний и адсорбцию перекрест-до реагирующих антител по Кастелланн.

Экспериментальные даннпе подвергали статистической обработке общепринятыми методами ( Ашчарин и Воробьев, IC63 ).

х ['«следования по получению препаратов ( ВШ ) и iix анализу в к.'-Сму-ноблоте проьйденц в Ленинградеяпч YTJ^iA им .Паст ера совместно с Л.В.Куляионой и Г.Я.Ценевой

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Признаки патогенности возбудителя иерсиниоза и особенности их генетического контроля.

Оценка вирулентности возбудителя,иерсиниоза требует определения выраженности комплекса дискретт/х патогенных свойств, которые обусловливают способность иерсиний преодолевать естественные барьеры и противостоять защиткьм реакциям макроорганизча. С учетом специфики взаимодействия возбудителя и организма на комплексе экспериментальных моделей изучали патогенные свойства' 53 ПВ+ и ПВ-штачмов Y.enterocolitica и близкородственных видов различного происхождения .

Установлено, что часть ПВ+' культур возбудителя иерсиниоза серо-варов 03 и 09 вызывает слабый или умеренный серозно-гнойный или гнойный конъюнктивит, максимально вьраженннй на 3 сутки и стихающий к 6-7 суткам. Отдельное овежеввдсленнкх штаммы серовара 09 вызывали выраженный гнойный конъюнктивит, а с 3-4 суток - быстро проходящее помутнение роговицы. Развитие инфекционного процесса сопровождалось колонизацией конъюнктивы, откуда иерсинии обоих серо- ■ варов в виде гомогенной ПВ+ популяции могли быть высеяны в течение 7-10 дней. Генерализации инфекции не отмечали, равно как и гибели зараженных животных, йзогеннке ЙВ'варианты иерсиний серсваров 03 и 09 зачетных изменений в глазу не вызывали и не высевались, начиная с 2-3 дня после инфицирования.

Все испытанные штаты возбудителя псевдотуборкулёэа вызывали в разной степени выраженные конъюнктивит и кератит. Наиболее виру-лентнме ПВ+втам»яц.с 2-3 суток выбывали развитие гнойного коыыоикти-вита, а с 3-5 - выраженной кератит с генерализацией инфекции и гибелью ливотных. ПВ~пр<.:изБодннк возбудителя также проявили способность к инициация инфекционного процесса, однако степень его выраженности, как правило, была меньшой,-а рэ максимум наступал позже, чей у родительского ПВ^штамма. О 2-4 суток отмечали развитие серозно-гнойного конъюнктивита, с 4-6 - слабого преходящего кератита, Несколько нше была концентрация возбудителя в органах, гибели животных не отмечали.

Напротив, вс штаммы T.entororcolitica биоваря I ( серовары 04, 32, 03, 06, "О, 07,Б, С1П,7, 018 ), а такие п ре дет зрители "новых" видев не вмзнвали рлкстных нэмеигниЧ конт-янктовы и роговицы зараженных животных к не опрг1,г(и'.!.г;ксь бактериологическим методом в отделяемом кс((1Ш',ктиеы и гомогг.натах т'утренник аргешов во вое сроки

исследования, начиная с 3-х суток.

- По даннда взаимодействия иерсиний с клетками Шр-2, наибольшую вирулентность проявили штаммы псевдотуберкулёзного микроба, независимо от содержания ПВ. Они показали внраяенную адгезивную и инва-зивную активность, а также повреждающий эффект в клетках некоелоя. Процент "пораженных" эукариотическнх клеток составил на 2 часа 94-96, на 5 часов - 98-100. К 5 часам нарастало количество внутри-клеточно расположенных микробов, прогрессировали цитопатические изменения, которые к 24 ч нередко вели к разрушению монослоя.

Менее выражение адгезивные и инвазивные свойства обнаружены у штаммов Х.е^егосоП-Исй , содержащих плазглиду вирулентности. Однако, количество инвазировавких бактерий бмло достаточно большим, особенно у представителей серовара 09 ( несколько десятков ); эти штаммы обладали способностью к внутриклеточному размножению. Установлено, что количественные показатели взаимодействия у ПВ"произ-водных У.ег^егосоИ-Ыса 03 и 09 по сравнению с ПВ+ значительно сни. женн. В этом случае прикрепляется меньшее количество бактерий, не характерно внутриклеточное размножение. Ни один из иепытангогх штаммов т.ег^егосоП-Ыса не вызывал впракенного цитспатического действия и разрушения монослоя.

Все штаммы иерсиний, не относящийся к энтеропатогенным вариантам и не содержащие ПВ ( представители биовара I ) имели самые низкие показатели адгезявности и инвазисности, без признаков внутриклеточного размножения. Количество "пораженных" иерсининми клеток не превгаало 15-"С%, а количество бактерий на клетку составило 2,5-е,I .

Проведение анальной иробп на м^чвах-сосунках позволило установить, что способностью продуцировать энтсротокскн обладают многие шта'лны У.еп1егосо1:И;хса оеровзров 03 и 09. Среди них отмечены как ПВ+, так и ПВ~варианты. Ли но обнаружили связи между содержанием • ПВ и энтеритоксигенностью иерешшй этих сероваров ( = 0,34 ). Почти все рстальние итамкы этого вида, в том числе с вежеЕ1 деленные ( серовари 04,32, 05, 06,30, 07,8 ) кнели весьма низкие значения КР ( 0,046-0,061 ) и отнесены к неонтеротокенгенным на данной модели.

В опытах энтерального заражения взрослых нь®»;й получены неодинаковее результаты, п зависимости от использованных итамчов, хотя в целом эти данга^ совпадали о получендами при использовании других моделей. Ктвккн У.еп+егосо111:1еа серовара 05, тдчленнт от больных овлокненним иерл'нилгещ, поражали внутренние органы живот-

них, размножались в гих, вызывая энтероколит и генерализацию инфекции с максимальной концентрацией возбудителя в органах на 9-е Сутки ( более IÖ3 КОЕ/г ). Диссеминация-бесплазмидных ( ЦВ~ ) производных наблюдалась в значительно меньшей степени. Иерсин'йи, как правило, локализовались в кишечнике и .мезентериальных лимфоузлах, их количество в органах во все сроки исследования-было существенно меньшим по сравнению с родительскими ПВ+штаммами.

Патогенные свойства изученных ытаммов серовара 03 на этой модели выражены в меньшей степени. При заражении мыией ПВ+штадаада. диарея отсутствовала, .микробы в течение всего срока наблюдения ( 21 сутки ) находились в кишечнике, мезентериальных лимфоузлах и изредка могли быть выделены из селезенки животных. Использованные для заражения ПВ~проиэводные обнаруживали только в кивечиике инфицированных животных, как правило, в течение первых 3 суток, Исследуемыэ органы были свободны от этих микроорганизмов в течение всего срока наблюдения.

Более Бьграгенные патогенные свойства на этой модели проявили ПВ+ и ПБ мтаммь! псевдотуберкулёэного микроба. Результаты опнгов с бесплаймидиыми производными отличались том, что пик инфекции наблюдался на 3-5 суток позднее, выраженность инвазии и генерализация инфекции заметно енжена, по сравнению с родительскими штаммами, ниже концентрация возбудителя в органах.

В отливке от этого, штаммъ! t.enterocolitica сероваров 05 , 06,30 и 07,8 ( биовар I ) при эктеральком заражении мышей не вызывали развития ийфекциоиного процесса, и, как правило, определялись у них бактериологически.! методом лишь в течение первых 3 суток. Только иерсинии серовара 06,30 ввделялй из кишечника некоторых животных в течение всего срока наблюдения.

Анализ полученных данных позволяет считать, что плаэицца вирулентности ( ПБ ) оказывает существенное влияние на выраженность патогенных свойств штаммов возбудителя иерсиниоза сероваров 03, 09 и, в меньшей степени, возбудителя псевдотуберкулйза. По данным различных экспериментальных моделей, наличие указанной плазмиды способствует повышении адгезивней и колонизирующей активности штаммов возбудителя иерсиниоза, обеспечивает им способность к внутриклеточному рагмнзлеемию и диссйминации в организме инфицированных животных. Вместе с тем антеротоксигеннме свойства выявлены у ряда ПВ+ и Щ-J'iTavMOB серовара 03 к 09, что подтверждает данные литературы о хромосомном контроле от ого признака ( Zink et al. , I960 Липекньв плазмиды вирулентности иерсинии сероваров СО и 09 ссхра-

няот ( особенно на клеточной модели ) в разной степени выраженную остаточнув вирулентность, обусловленную, по-видимому, также хромосомными детерминанта!ли. Вместе с тем на использованных моделях нам не удалось выявить энтвротокеигеншле и другие патогенные свойства у штаммов Y.enterocolitica других сЕроваров и "новых" ввдов иерсиний, имеющих широкое распространение и обычно не содержащих ГО."

Проведенные исследования по характеристике плазмидных профилей иерсиний показали, что многие' штаммы возбудителя нерсиниоза ( особенно,' с веже ввделенные ), как и возбудитель псевдотуберкулё-эа, содержат плазмиды с мол.массой 45-47 ЦЦ. В наших опытах установлено, что плазмиды штаммов Y.enterocolitioa сероваров 03 и 09 проявляют несовместимость с референсной плазмидой R336 из группы Хао и совместимы с плазмидами из других групп ( М, If, J, F1V, S, I X » К, X сС ). Характерная мол.масса, принадлежность к груп-,пе несовместимости Inc F1 , фенотипические маркеры ( способность к аут о агглютинации, кальцийзависимому росту, ряд патогенных свойств ') позволили отнести указанные плазмиды к классу рYV . Плазмиды этого класса описаны у штаммов энтеропатогенных иерсиний за рубежом.

Показано, что особенностью штаммов серовара 03, вццеленних от .больных иерсиниозои в Рязани, является наличие дополнительной небольшой ( менее 10 ГЛД ) неконъюгативной плазмиды, детерминирующий устойчивость возбудителя к стрептомицину. .Маркер стрептомицимре-зистентности не передавался в опытах кон-ыогационного скрещивания различным реципиентным штаммам иерсиний и С 600 5К. После' воздействия бромистого этвдия в опытах элиминации получены чувствительные производные, утратившие плазмидную Л®--

Напротив, признак атипичной ферментации лактозы и рафииоэн, имеющий, по-видимому, транспозонную природу, вцявлен у шташов иерсиний, не относящихся к основным возбудителям нерсиниоза, и не выявлен ни у одного из 219 изученных нами штаммов Y.enterocoli-tica 03 и 09. Полученные , в ходе скрещиваний трансконгюганты штамма С 600 5К с лактозньм маркером, по даннш электрофореза клеточных лизатов, не содержали плазмидной

Изучение стабильности наследования ПВ иерсиниями в различных , условиях показало, что культивирование на питательных средах при 3?°С способствует накоплению в популяции бесгиазмидных ( ПВ" ) клонов, которые через 10-15 пассяже.й в бульоне могуг полйостьо вытеснить исходные ПВ+клегки. При 8°С и, особенно, при 2б°С элими-

нация ИВ отмечалась значительно реке ( как правило, не более 10$ ПЕГклонов в течение всего срока наблюдения ). Установлено также, что к снижению стабильности наследования ПВ приводит культивирование на кальцийдефицитнои агаре или в присутствии бромистого этцция { 150 мкг/мл ). Количество ПЕГклонов при этом может возрастать в десятки раз, по сравнению с культивированием в бульоне при 2б°С. Суббактериостатические концентрации рибамлицина или девомицетина в наших исследованиях не оказывали залетного влияния на сохранение ПВ штаммами возбудителя.

С учетом возможного-влияния среды и температурного режима на состав популяций -иерсиний определяли содержание в них ПВ~клонов в ходе инкубирования в накопительных средах, обычно используемых в диагностической практике ; среде БК£, фосфатно-солевой буферной ореде с добавлением и без добавления сорбита и желчных солей ). Проведенние исследования позволили отметить довольно высокую стабильность наследования ПВ и отсутствие всаженных селективных преимуществ ПВ+ или ПВ~вариантов изученных штаммов Y.enterocolitica 03 и 09 на указанных средах, независимо от наличия сопутствующей Конечной микрофлоры. Целочная обработка материала перед посевом на плотные среды ( Зндо, Серова } также на приводила к существен»™ изменениям степени гомогенности популяций по признаку содержания ИВ (t<.2 ). Аналогичные результата полканы как после обработки смешанны* популяций в растворе гидроокиси калия, так и в растворе поташа. Анализ этих материалов позволяет отметить, что исходно вн-сокий уровень содержания бесплазмидных нлонов ( ПВ~ ) может длительно сохраняться как при размножении клеток в средах накопления, так и пссле щелочной обработки материала.

Оценка стабильности наследования ПВ ктаммами иерсиний в условиях макроорганиэма позволила выявить селективное преимущество ПВ+ клонов, которые неизменно вгеевали .из отделяемого коньюнктивм и кииочника животных, эаражекнг/х иеренниями серовэра 03 и 03. Гомогенность популяции ( более ЧЬ% ПВ"1" клонов ) отмечена и в случаях заражения культурами с 50-Х* бесплапуидннх кльток, что, по-видимому, связано с бмзгрой элиминацией последних под действием защитных сил макроорганизма.

Изученный генетические я другие характеристики плазмиды вирулентности итемчов возбудителя иерсиншйа явились предпосылкой для разработки и совершенствования истодов микробиологической диагностики стой инфекции.

2. Маркеры вирулентности возбудителя иерсиниоза и разработка методов шс выявления..

В условиях лабораторий практического здравоохранения определение патогенных свойств и отдельных факторов латогенности возбудителя иерсиниоза осложняется из-за отсутствия полностью адекватных экспериментальных моделей, специального оборудования 11 трудоемкости этих исследований. Вместе с тем вопросы дифференциации штаммов возбудителя от множества близкородственных непатогенинх иерсиний остаются для практики весьма актуальными. • '

Фенотипический "портрет" иерсиний, способшх вызвать специфический процесс ( иерсиниоз человека ), включает ряд маркеров вирулентности, пасть из которых выполняет функции факторов патогекмости, а другие имеют с ними тесную корреляцию. К маркерам, находящимся под хромосомным контролем, отнесены: метаболический профиль ( включат; температурозависимув ауксотрофность, биовар, пиразикамздазнуа активность ), синтез сидергфоров, структура О-антигена {серовар), фа-го вар и синтез белк'ов наружной мембраны с мол.массой 15, 24, 103, 190 ВД . Установлено, что многие маркеры вирулентности контролируются генами ГШ: синтез фиибрий и гемагглютиника, ряд культуральннх признаков ( аутоэгглотинацил, кальцийзависимость роста, морфология колоний ), сорбция красителей и гвдрофобность клеточной поверхности, синтез V»' -антигонов и ряда мембранных, сокретируемых, цято-плапматических белков, а такие устойчивость к фагоцитозу и действию нормальней сыворотки крови.

В ходе настоящего исследования изучали способность к аутоягглп-тикации 163 штаммов иерсиний различна видов и вариантов на модифицированной среде Кларка. При этом наряду с пептснамн зарубежных фирм нспо,-ьзовали пептон отечественного производства, а также среду Игла с гС% сыворотки. Наиболее четкие результаты в тесте ауто-агглютиипция полученн при испытании гомогенных ПВ+ и ПЕГпопуляций штаммов У.ег^егосоИ1л.са. Кеное отчетливее результаты получены при тестировании многих музейных штаммов возбудителя иерсиниоза и культур после многократного субкультив1гровгния. Показано, что сомнительный и отрицательный результаты ( -у музейных штаммов серова-рев 03-и 09 - <12,6*6,;$ 1 могут бнть свяягля с поя^ошь-ч ыдерга-нгем ГПГклоиов в пепугяции.

/1га скрининга ПВ+клсисв иерсиний изми предлтаено определение феномена аутозгглмтиниции и,ч глюкзэо-пептоыней зроде ( Кларка ) в ланках пелистироловых пл пнисто в, ^иускпс-'Ь' отечественной псом"-;!-

денностш. В ходе сравнительного изучения аутоагглютинации на планшете и кальцийзавжимости у 61 штампа возбудителя серовара 03 ( 42 ПВ"* и 19 ПВ" ) совпадающие результаты получены .в 80,3$, локнополокительная аутоагглютинация - в 1,655 случаев. Методика скринингового исследования по .оценке содержания ПВ+ и ПВ"клонов в популяции может найти применение при изучении экологии передний, патогенеза вызываемой' ими инфекции, при характеристике ПВ--адсоциированных признаков. СкрининговыЯ тест ауто агглютинации дает более корректную информацию о содержании ПВ~клонов, чем известный тест калщийзависигдости, так как в последнем случае условия дефицита кальция в сочетании с температурой S7°C способствуют элиминации плазмиды.

Изучение Кальцийздвисимостй штаммов иерсиний на нескольких средах позволило установить, что наименее четкими дифференцирующими свойствами обладает агар по Хигучи-Смиту, приготовленный на основе коммерческого питательного агара Дагестанского НИШС;. добавление в среду бактоагара до .'конечной концентрации способствует уменьшению размеров .колоний, образуемых ПВ+клонами при 27°С, до 0,5 - 1,0.мм ( через 48 ч Ь " ! .

Более четкая дифференциация колоний ПВ+ и ПВ~иерсиний получена при использовании.кальцийдефицитной среды на основе модифицированного Ь -агара или на магний-океалатном агаре, приготовленном из коммерческой среды АГВ. В последнем случае плазмидосодержащие иер-синии при 37°С либо не давали роста, либо образовывали точечные'' колонии ( при обычном характере роста бесплазывдных клонов ). Показано, что при посеве штрихами на поверхности..этих сред возможно определение кальцяйзависимосги у нескольких; в том числе референ-сных, ПВ+ и ПВ~культур, засеянных на разные участки среды; при' этом удается идентифицировать не менее 95% 'ПВ+штаммов возбудителей иерсиниоза 03 и 09., Среда АГВ представляется более приемлемой для практического использования.с целью выявления маркера кальций-зависимости, так как она более доступна, проста в изготовлении и имеет стандартизованный составив частности, йо ионам кальция, концентрация которого,- в соответствии с рекомендациями ВОЗ для таких сред, должна находиться в пределах 50-100 мг/л { Гриднева и'соавт., 1982 ).

Изучение особенностей морфологии колоний вирулентных иерсиний проводили с.Использованием 62 штаммов энтеробактерий, из которых 50 представлены штаммами Y.enteroeolitica и других видов иерсиний. Установлено, что по сравнению с агаром Эндо или Хоттингера обычная

среда АГВ обладает преимуществом, имея более выражендае дифференцирующие- свойства в отношении ПВ+клонов иерсиний. Полученные нами даннне позволили сделать заключение) что вирулентные ( ПВ+ ) иер-синии обладаютдополнительном культуральным признаком, определяемым как тёшературозависимая морфология1 колоний. Он тесно связан с другими маркерами плазмиды вирулентности и не характерен для авирулентных иерсиний или сходных с ними энтеробактерий. Суть признака заключается в том, что при культивировании на питательном агарз ( АГВ ) в течение 24-48 ч вирулентные ( ПВ+) иерсинии образуют при Б7°С колонии меньшего диаметра, чем при 25°С (с достоверностью различий 1; > 4) и их размер при 37°С не превышает 1,0 мм. ■ Показано, что выявленной признак, наряду с кельцийзависимостью и другими ПВ-ассоциировандами маркерами может бить использован для дифференциации вирулентных вариантов иерсиний от других микроорганизмов. 1 . •

На практике отнесение выделенного отамча к возбудителям иереи-ниоза возможно лишь после тщательной биохимической идентификации и серотипировзния { при наличии типовых аятиенворотак В ходе настоящего исследован!« разработана технология получения и использования диагностической агглютинирующей енворотки для серологической идентификации вирулентных иерсиний ( СВИ }, которая не имеет коммерческих аналогов. Исходя из важной патогенетической роли спя-закнвх с ПВ по.-пшептидов, получали гипериммуннче кроличьи скворот-ки 9 антителами я ним, используя генетически охарактеризованное штаммы возбудителя иерскииоза. В качестве продуцента антител использовали гстамм У.еггЬегоео111::1.са серовара 03 ( 955, ПВ+ ), а в качества адсорбента перекрестно-реагирующих антител - микробное масс« босплазмидного ( ПВ~) производного атего штамма ( ) и

втамма У.епЬегосаИ^са серовара 09 ( 207, ПВ~ ). В ходе исследований экспериментально обоснованы условия проведения анализа, дана оценка физико-химических факторов, влияющих на результаты анализа.

Проверка специфической активности, специфичности и диагностической ценности препарата СВИ проводилась о реакции вгглютинации { на стекле и объемной ) с использованием 5 экспериментально-лабораторных серий и культурами.395 штаммов гнтеробэктерий 8 родов, з том числе 353 итпммов иерсиний, отличеишхея по виду, био-, сс-рэпзру и содержании ПВ. Во всех случаях положительная реакция с СВИ подтверждена рь'явлсдаем других мзркероп ПВ. В целом показана высокая специфическол актипнссть и специфичность препарата, что подтверждено данными, полуденными в лабораториях МоскорсксЯ и Лв-

нинградской городских Санэпидстанций, других учреждений, проводивших апробацию сыворотки ( акты прилагаются ). Диагностическая ценность препарата заключается в его универсальности и повышении точности диагностики благодаря шявлению антигенов иерсиний ( маркеров вирулентности ), принимающих непосредственное участие в развитии инфекционного процесса.

Полученные результаты свидетельствуют о пригодности и ойзектив-ности использования сыворотки СВИ в учреждениях здравоохранения для диагностики иерсиниоза, при планировании противоэпидемических мероприятий в отношении иерсиниоза.

Техническое задание на разработку препарата СВИ одобрено в Комитете МИШ и утверадело МЗ СССР ( 07.08.91 ). Документация, необходимая для промгаленнаго выпуска препарата ( проект временной фармакопейной статьи, экспериментально-производственный регламент, проект инструкции по применению ), находится на рассмотрении в Комитете МИШ.

• Разработанные в ходе' исследования методики и препараты предназначены для выявления ПВ+вариантов иерсиний, которое в настоящее время недоступно для большинства отечественных лабораторий. Их применение в комплексе с определением хромосом»,ж маркеров вирулентности ( метаболического профиля, -0-серовара и др. ) может способствовать совершенствованию диагностики иерсиниоза.

3. Диагностические критерии при бактериологическом исследовании на иерсиниоз.

Существующие схемы идентификации возбудителя иерсиниоза в основном ориентированы на определение принадлежности выделенного микроорганизма к виду Y.enterocolitica и дифференциацию с if.pseudotuberculosis или иерсиниями "новых" видов, причем для этого необходимо проведение не менее 15-17 морфолого-биохимических тестов. Дальнейшая внутривидовая дифференциация ( определенно биовара, серовара ) предусматривается как дополнительное исследование, необходимее для маркирования вь-деляемих шта.мов, расследования вепшек иерсиниоза ( Тимофеева исоавт., 1954; йденко , I9S5 )-. В методических рекомендациях по диагностике, опубликованных в насей стране, практически отсутствуют тесты для дифференциации in vitro патогеннкх U непатегенных штаммов Y.enterocolitica .

В настоящее время актуальном является вопрос об эпидемиологическом значзнин различных серо-бновароэ Y.enterocolitis и пред-

ставителей "новых" видов, который чаще ставится как вопрос о расширении-спектра возможных возбудителей иерсиниоза. Сложность диагностики иерсиниоза отряжается и в недостаточной изученности экологии его возбудителя. Решение этих вопросов должно опираться-на достоверную информацию о частоте выделения, преимущественной локализации, составе популяций иорсиний по признакам патогенности и вирулентнссти.

В ходе работ» нами изучены признаки вирулентности у 524 штаммов иерсиний клинического происхождения, большая часть которых выделена в Ленинграде от детей 1-14 лет с различными острыми кия:ечн>л*и заболеваниями. Ларксры аутоагглютинации, кальцийзависимости и тем-пературозависимой моррологии колоний, а таете ПВ-ассоциированше антигены выявлены у 179 штаммов, принздлежшцих к знтеропатогенным вдцаи и вариантам иерсиний ( У.^егосоНиса 03 - 140, 09 - 24, У.рзстйо-ьлегс-иХозгз I. - 15 ) к но выявлены ни у одного из 225 штаммов других варигнтов У.еп-Ьегосоииса , преимущественно принадлежащих к биовару I, а также у 62 штаммов Т.ГгеаогИ.вепИ, '¿. 1г^егпес11а и У.кН^епэепН . Все 55 свежевыделенных штпимсв возбудителя иерсиниоза ссровара 03 обладали маркерами вирулентности, тогдг как у музейных штвчмгп ПВ-ассоциированные маркеры выявлен!* лишь в 55,6^,9% случаев. Установлено, что сомнительные а отрицательные результаты определения этих мдркеров могут быть следствием потери ПВ частью или соей популяцией при субкультивчровонии на питательных средах. Выделение ПВ^клоноп способствует сосстановлс-нию четкой экспрессии соответствующих пр1!знаков вирулентности.

Распространенность хрогюсочнык и плазмвдр.-х мгркеров вирулентности изучали у 16? гстат.мв г.орсиний неклнничсскогг- прогсхо!\дения, видел енк-'х на территории '1ссквч, Ленингрпда, Рязани, Брестской области. ПВ-пссоцкироваии«с чархгр» и х?рзкторная п.-аомидо обнаружены только у одного из 71 изученного штамма 5r.eitorocoli.ticфт грызунов. Стот штамм (2771) выделен ст полевки, отловленной н~ территории овощной базы, и отнесен к пгтгенн>му биовару 4 (серовлр 03) остальные шгг.мы, в основном, представлены серовлрача 03, 00,30 и 07,8 бисварэ I. Установлено, что все uiTa-n.fi.' зтого гида, выл'-ленк-.-из смывов с овощей в мостах их хранения ( с г'ортгои?«» кллуеты, картофеля, свеклы ), тою?е относятся к биовару I и не шеют маркеров вирулентности или плазмвдадй ДНК, то есть но фенотоп)- соотгетстпу-ют штаммам от грызунов. Отсутствие тестируем« маркеров и.пдтоген-нух свойств у этих штлммов но печпол.тот оты^тн их к ЯОТеНЦИЛЛЬ' цом возбудителям иерсигиазо у челюека. д рёдкая ъ се~леноегь па-

•гогенннх вариантов иерсщий от грызунов позволяет ставить под сомнение их роль как основного источника инфекции при иерсиниозе.

Поскольку свиньи часто инфицированы возбудителем иерси^иоза, нами проведено изучение 54 штаммов иерсиний, циркулировавших в агроцено-зе, включающем крупный свинокомплекс ( получены от В.А.Гордейко ). Установлено, что для 50 из них характерна ферментация салицина, пре!:мущеотвенная принадлежность к сероварам 05, 06,20, 07 или не-тилируемым н отсутствие ПВ-ассоциирсванных маркеров. Вместе с тем 4 штамма зкспреосироЕали маркер) вирулентности и содерл;али плазми-дц с мол.массой 4? ЫД ( ПВ ); они отнесены к возбудителям иероини-оза серо вара 03 биовара 4. Два из них вццеленн из фекалий свиней н сточных вод свинокомплекса, два - из образцов почвы полей орокения.

Полученные результаты подтверждают необходимость тщательного изучения признаков вирулентности у штаммов иерсиний, циркулирующих во внешней среде, объекты которой довольно часто содержат микроорганизмы, относимые к роду Хига1п1а~ Такая необходимость связана, в частности, с различиями' в экологии патогенных и непатогенных иер-СКНаЙ ( АХйо^а е! а1. , КЮ; е1; Ы. , 1902 ).

В ходе настоящего исследования'определяли тагеке маркеры вирулентности у "атипичных" штаммов Х.ег^егосоП-и-са ( лактозополояитель-ньд, сорбатотрицательных, серологически нетилируемых ). Количество таких штаммов, выделяемых даже в хорошо оснащенных лабораториях, моает достигать 20-25!?. Всего изучено 152 "атипичных" штала, выделенных на разных территориях; в том числе 21 штамма, отнесенные Е виду У.;Сгес1ег1кзе1г11 и агглютинирующиеся типовой сывороткой к У,ег^егосо1:Ш.са патогенного серовара 00. Установлено, что ни ¡:дин из изученных штаммов не обладает тестируемыми маркерами, то есть биохимически и серологически атипичными признаками обладают, как правило, непатогенные штаммы иерсиний.

Таким образом, разработка простых и доступных методов тестирования маркеров вирулентности иерсиний с применением генетически охарактеризованных региональных ытаимов возбудителя иерсишюза позволила обосновать новый подход к диагностике этой инфекции, более полно, в той числе на генетическом уровне, учитывающий специфику возбудителя. Этст подход базируется на представлении о возбудителе иерсинисза как генетически обособленней внутри вида У.ег^егосоШ;!-еа группе шжроврганиэмов, объединенных структурным и функциональным сходством у них детерминантов и факторов патогенности, адаптированных к организму человека и способных вызывать закономерно про-

текащий внфскцисввь'П процесс. В связи с этим ochdjsww принципом бактериологической диагностики иерсинисза должна боть ориентация на целенаправленное вмдоление и идентификации возбудителя по комплексу фриотипичссках признаков, связанных с его хромоеомнмми -и плазмиднши ( ПВ ) детерминантами патогонности. Болео точная идентификация возбудителя возможна при определении: ферментации салицина и лактозн, серовара, аутоагглюткнацни, кальциЯэависнмости, температурозависимоЯ морфологии колоний, ПВ-ассоциированных г.нти-геков.

Исходя из практической потребности в perm нальных референсных птаммах возбудителя иерсини^за, нами создана коллекция из 5 генетически охарактеризованных ПВ+ и ПВ* штаммов, относящихся к двум оснгень'м сероварам возбудителя ( 03 и 09 ) и исподьзуедах при определения вирулентности y.e-nterocolitiea, а такте при получения препарата СВИ. Штамш депенир. earn: в коллекции ПС1С им.Я.А .Tapaoeaittta и ВНШЧй "Микроб" ( справки о д'.пошрованнн прилагается >.

Изложенной подход и практические рекомендации по бактериологи-чоской диагностике иерсинииза, ос но вант'е на результатах наших исследований, предотавлень в Инструкции .'.13 СССР !f 15-5/42 от 30.10.90.

4. Пути оптимизации вкявлоння специфического антительного ответа при иерсиннозе.

В болы"1'нзтго отечественно/ лпбортгсриЛ серодиагностику иерсинн-оэа проводят с поморье ГНГА. и/ми РА. ,"гл ГНГА раррабиташ и серийно вь-пускаются оритрецхгорш'е оитигент-о диогностчуг* евроваров 03 и 09. Для постонсвта РЛ необходимо приготовление корпускулярнл--го онгигеиа из тнпогпх культур, котору-мм, к сожалпин», располагают но все лаборатории. Ввиду различия гепользуе'я-'х антигенов указанное реакции имест самостоятельное значение и дополняют друг друге .

Предаоягш-- различима спгсоби получения очтцоннкх сенситинов ( в основном, препаратов .ПС ) для конструирования более соверген-штх арптрсцитарт'х диагнсстикумов ( Коро/ол и пол.вт., 1969 }. /"ля поитениг споц'фгчностн корпускулярных антигенов иеро гагой применяют, как правило, подперкгн!»* стабильности tf-<J«"p.:K при культивировании зтал( нних гтэммов в тгмпгрптурном рсякчо .ниже 30°С с после-дурфзд тяучет.гем и стаби.'Ч^зцагй СИ- или О-янткгена ( Тнчо^гер-э и соавт., 19ЙЗ Эти онтпгенкьр структуры возбупитсмл играпт лишь косвенную роль п развит!',:! иерсингоза; кроме того, сохраняется возможность перекрестии* рэакцзй с другими микроорганизмами. В отой

связи представляется актуальной разработка доступных методов и .я в -лейка иммунного ответа на те антигенные структуры возбудителя, которые окспресаироваш в условиях макроорганизма, выполняют функции факторов патогенности пли четко ассоциированы с детерминантами па-тогенности иерсиняГ:.

Для приготовления высоксспецифичного корпускулярного антигена, используемого в РА для серодиагностики, нами предложен местный шта:« i.enterocolitica с ер:-вара 03 ( 9556 ), являющийся спонтанный ПВ"мугантом возбудителя. Его отличительными чертами является возможность получения гомогенных и достаточно стабильных суспензий после шращиЕаиия при S?°C, сниженный потенциал патогенности, длительное сохранение з -формы. Остальные свойства, оа исключением ПВ-ассоциированных признаков, типичны для возбудителя иерсиниоза 03. Оценку специфичности и чувствительности диашостикума, полученного из культурн штамма 9556, производили при испытаний 107 сывороток от болышх иерсиниозом и другими заболеваниями, а таксе от здоровых лиц в сравнении с антигеном из эталонного штамма I'.tnterocolitica гомологичного серо вара ( из йютктута Пастера в Париже }.

Установлено, что в большинстве сывороток большое иерсиниозом 03 ( 14 из 13 ) агглютинины к антигену из штамма 9556 определялись ь более высоком титре ' в 1,8 раза ), реакций с ним были более четкие, по сравнению с обычным диагностикумом. Б остальных сыворотках иерсиниозиые агглютинины, как правило,- отсутствовали; лишь в отдельных сыворотках ( 4,5$ } отмечзна положительная РА с антигеном 9556 в титрах 1:100-1:200. Следует отметить, что в присутствии 0,2-0,с% формалина достаточно высокая стабильность и чувствительность диагностику;,¡а из штамма €556 сохранялись в течение 12 месяцев { срок наблюдения ). По насей заявке на штамм S556, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза, получено положительное решение ВШИГОЭ с вадаче авторского свидетельства на изобретение ( !;• 4902269/13 ).

to предположили, что специфичность диагностических серологических реакций на иерсиниоэ может быть п.влаена за счет выявления антител к ЦВ--ааС1.циир.>вшиг>и антигенам иерспний при использовании получениях нами изог = Hiivx ( Г!В+ и ПВ~ ) пар везбупителя серсваров 03 и С? ( 955, ОЬоб, I2C, 1206 ). В предварительных исследованиях была установлена рог.ь RB ь проявлении патогенных свойств этих стьмыое; в т-гмунсГ-лого показано, что плазмиднпе гены кодируют у

Них синтез по крайней мере двух дополнительных белков в составе наружной мембраны ( около S0 и 36 КД ). Из указанных штаммов, выращенных при 37°С готовили корпускулярный антигены ( 03IB+, 03IB", 0ШВ+ я ОШВ", соответственно ), которые использовали как для ..заявления агглютининов в сыворотках, так и для перекрестной адсорбции по Кастеллани.

Установлено, что в сыворотках крови экспериментальных животных, зараженных ПВ+культурами Y.enterocolltica появляются антитела, реагирующие в РА на стекле с ПВ+ ( но не ПВ" ) диагностикумами гете-рологичнсго серовара. Эти антитела могли быть удалены при-адсорбции микробными массами ПВ+, но не ПВ~, варантов иерсиний, что подтверждает общность антигенных детерминант ПВ^иерсиний различных сероваров и возможность выявления в РА антител к ним.

При изучении 89 сывороток сельскохозяйственных животных ( свиной и крупного рогатого скота ) также выявлены иерсиниознке анти<-тела. Известно, что-эти животные могут быть инфицированы иерзини-ямм в естественных условиях и содеряать в сыворотке крови соответствующие агглютинины. Однако, при исследовании свиных сывороток .в РА с ПВ"диагдестикума!.;и ( 03 или 09 ) положительные результаты полнены в с ПВ+ - в 42,1±8,0£ случаев. В ряде положи-

тельно реагируюцих сывороток антитела общепринятыми методам,! { РА, FHTA ) не определялись, что, по-видимому, связано с недостаточно высокой чувствительность» последних.

Агглютинины к ПВ-ассоциированнш антигенам определяли такяа ■в 304 сыворотках лвдей, включая больных нерсиниозоп, другими заболеваниями и здорова лиц. В РА с антигенами вирулентных пэрсиний и сыворотками больных баетсриелогически и/или серологически под-твертденнш иерсшшсзсм положительные реакции С ++++, +++ ) составили 60,0*8,9 % , псевдотуберкулёзом - 55,6-18,1 %. В группе ки~ печных инфекций нсиерсишозной этиолог.ш и доноров крови ( -здоро-. вые ) они составили 6,3 * 2,5 % и 5,5 ± 2,2 % , соответственно, в группе больных сербкегативноЯ спсндпдсартропатией - 18,0 * ¿ 6,2 %. Более частое выявление подсжительдас реакций у больных с артритами подтверждает данные о роли исрсиний в возникновении этих заболеваний ( Парков , 1989 ). •

Резулг,тяты проведенных исследований поаволгди разрабстсть нетс-дику рффг кишке го выявления «нтитёльногс ответа при tiej cas с j!Cno.Tb30FEíHuaa изогекнкх пар Еогй'удителл, стл:™ает;ихся по содср-глк:я ПЗ (. Таблица" ).

Нредлоуе№?ый подход позволяет нр только уточнил» середин.'нрстй-ку перонпиоза у людей и апвстнм*, но п проводпгь дл^феронцкаи,»

Результаты исследования натишой и адсорбированной сыворотки, подтверждающие серологический диагноз иерсиниоза.

Обозначение реакций и антигенов (диаг -

Йерсивиоз 03

Иереи ни о з

О 9

ностикумов )

I

РИГА

РА

коммерческий 133 коммерческий 05

ОЗПВ" ОШБ" 03ПВ+ • ■ 0ШБ+

Натив- Сыворотка,адсорбированная. Натив-ная сы- микробной массой иереиний ная сыворотка 7 ' 7 воротка ОШВ" ОШВ ОШВ" 0ШВ+

+ + +

-(-О +(-) ' •+<-}

-{+)' + +

- +.

+ +

Сыворотка, адсорбированная микробной массой иереиний

ОШВ" 03ПВ+ 09ЯВ" . 09ПВ+

+ + +

+ +

Примечания : I - диагностикумы для РА и микробные массы для адсорбции получают из референеных культур, выращенных при 37°С;

2 - в скобках указан возможный вариант реакции;

3 - для РА на стекле рекомендуется .разведение исследуемой сыворотки 1:10 - 1:20

антительного ответа при иерсияиозе 09 и бруцеллезе. Учитывая тот факт, что перекрестные серологические реакции сывороток с коммерческими диагносткяумамй при этих двух инфекциях обусловлены антигенным родством ЛПС возбудителей, мы изучали возможность использования антительного ответа на ПВ-ассоциированные антигены кая-дифференциального признака иерсиниозной инфекции. Показано, что сыворотки больных- бруцеллёзом людей или привитых животных,как правило, не реагируют, с диагностикумом 03ПВ+,. что свидетельствует об отсутствии характерных для иерсиниоза антител. Предложенный нами "Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза 09 и бруцеллеза" защищен авторским свидетельством ( A.C. СССР ff I7031I9 )»

ВЫВОДЫ

1. Для изученных штаммов возбудителя иерсиниоза сероваров 03 и 09 характерно наличие плазмиди с мол .массой 45-47 Щ. Эта особенность плазмвдного профиля в значительной мере определяет выраяенность патогенных свойств Y.enterocolitioa , тестируедах на моделях конъюнктивального заражения морских свинок, энтераль-ного заражения мышей, инфицирования культуры ткани НЕр-2, но не связана с энтеротоксигенностыо шгакмов, которая контролируется хромосомными генами.

2. По характергой молекулярной массе, принадлежности к группе несовместимости inc Р1, ряду фенотипичесянх признаков выявленные плазмвдн вирулентности отнесены к группе рУТ .

3. Плаз^ида вирулентности возбудителя иерсиниоза ( ПВ ) стабильно наследуется в условиях in vivo, но мсжет быть утрачена значительной частью популяции при культивировании на питательных средах, особенно при 37°С и в условиях дефицита кальция.

4. Усовершенствованы методы тестирования маркеров вирулентности возбудителя иерсиниоза с использованием отечественных сред и доступных ингредиентов. Для дифференциации ia- vitro вирулентных и авирулентных штаячов ( клонов ) можно использовать тесты ферментации салицина и лактозы, аутоаггдвтпнацни, кальцг.йз&яксичости роста, определения ПВ-ассоциированньсс антигенов.

5. Дополнительными маркерами вирулентности можно считать

признак температурозависимой морфологии колоний и отсутствие атипичных серологических и биохимических свойств ( инагглвтинабель-иость типовыми сыворотками, неспособность к ферментации сорбита ).

6. Разработан и апробирован новый препарат - сыворотка диагностическая к вирулентным иерсиниям адеорбированная для РА ССВИ)

и технология его производства. Показана высокая специфическая активность и специфичность препарата при серологической идентификации ПВ+ штаммов (клонов) возбудителя иерсиниоза.

7. Создана коллекция региональных генетически охарактеризованных штаммов возбудителя иерсиниоза основных сероваров. В коллекции ГШК им.Л.АДарасевича депонированы штаюш 188, 189 и 207, в коллекции ЕНШЧИ "Микроб"' - KM-33C20I) и Ш-34(241), предназначенные для использования.в качестве референсных при определении вирулентности возбудителя в условиях in vitro и на экспериментальных: .моделях , а такие при получении и контроле препарата СВИ.

8. Научно обоснован новый подход к микробиологической диагностике иерсиниозной инфекции, более полно учитывающий специфичность возбудителя. В соответствии с ним идентификация возбудителя должна быть ориентирована на выявление детерминантов патогенности и комплекса связанных с ним фототипических признаков. При этом необходимо учитывать хромосомные и плазмидные ( ПВ ) маркеры вирулентности.

9. Штаммы I.euterocoHtica сероваров 03 и 09, независимо от Происхождения, обладают ПВ-ассоцкированными маркерами вирулентности и являются основными возбудителями иерсиниоза. Штаммы Y.ente-rocolitica других сероваров, относилме к биовару I или нетипируе-мым, а таете представители "навых" видов иерсиний не имеют ПВ или соответствующих маркеров-вирулентности и неспособны к инициации иерсиниозной инфекции. Определение маркеров вирулентности целесообразно при оценке значения взделяемых штаммов иерсиний.

10. Для выявления специфических персиниозних-агглютининов и. перекрестной адсорбции можно использовать микробные массы ПВ+ и ПВ" нзогенных вариантов юзбудителя, выраценнш при 37°С. Установлена высокая чувствительность, специфичность и стабильность кор' пускулярнего антигена для реакции агглютинации иэ штамма 9556 С серсеар СЗ, П@" j.'

СШПОл РАБОТ , СШЕЛ1№ЗА15Ш

ПО ТЕ'.'Е ДДГЕРГЛП!:!

I. Ценева Г.Я., Смирнов И.В., Реброва Р.И., /шгршгва Г.М. Характеристика патогенных свойств иерсиний, детерминируемых плагмидами / / Острые кишечные инфекции: Респ.сб.- Л., 1988.- Вш. 10.-С.121-126.

?.. Смирнов И.В. К вопросу о распространении Л-плазшзд у кишечных иерсиний// Тезисы докладов Всесовзн. науч.-лракт.конф. "Иереи-ниозы: микробиология, эпидемиология, клиника, патогенез, и\'муноло-' гия".- Владивосток, 1986,- С.68-70.

3. Смирнов И.В. Наследование и экспрессия генов плаэмиды вирулен-иости иерсиний при воздействии антибиотиков ин витро // Тезисы докладов Всесовзн. семинара "Колонизационная резистентность и химиоте-ряпевтические антибактериальные препараты". - М.,1988.- С.203-210.

4. Смирнов И.В. Количественные показатели роста иерсиний в ходкой среде // Деп.ВИШ!, £6.04.88.- » 3227-В63.-.1988. - 10 с.

5. Ннвазивность и щгготоксичность как критерии оценки аттенуации иерсиний // Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.Е., Смирнов И. В., Попов В. Л.,. Смирнова Н.С. - Курн.микробиол.- 1988.- » 9.- С .10- 16.

6. Ценева Г.Я., Смирнов И.В., Реброва Р.Н. Итак,! бактерий Тегг1п1а ег^егосоИНса 09 серовара, используемый в качестве тест-штамма

для определения вирулентности иерсиний. А.С. 1427837 СССР // Б.И.-- 1988.- Р 36.

7. Смирнов И.В. Определение феномена аутоагглютинации вирулентных иерсиний // Лаб.делс.- 1989.- № б,- С.59-60.

8. Смирнов И.В. К вопросу о психри^ильных сьойствах возбудителя иерсиниоза'// Тезисыдокладов Ито1'овой объединенной науч.-лракт.коц|>. мол.уч., спец. и студ. Дагестана по медицине.- '"ахачкала, 1989.--С. 69-70.'

■ '3. Смирнов Й.В. Оценка популяций иерсиний по признаку содержания плазмиды кальцийзавнсимоСти // Тезисы докладов Псееоюон. науч.-практ кои{1. "Иерсиниазн (микробиология, опидемиологид, клиника, патогенез, лабораторная диагностики".- Влпдпь'илиж, 198Э,- ч.1.- С.05-56.

Ю. Смирнов И,В., Федотова Г Л1., ОнроуптнккСЕа В.А., Митриковд

Л.Д. 'Вкяелеша плазыздшх маукеро» у иерснцша // Там so.- C,56-tÖ.

11. Смирнов И,В., Силин К.Д. Использование отечественных питательных сред для Еьщелеш« и дифференциации вирулентных передний /,/ Тезисы докладов Всессюзн. конф. "Разработка и производство препаратов ь'.сдицинокой биотехнологии",- Махачкала, 1920.-чЛ.-С.65-86,

12. Смирнов Н.В., Горохов В,И. Диагностическая сыворотка с антителами к вирулентным иеремниям // Лаб.дело,- 1990.- л5 10,- С.66-63.

13. Смирное И.В. Цетодическиа рекомендации по определенна см-занных с вирулентностью признаков иерешшй,- Рязань, 1989.- 4 е.

14. Смирнов И.В., Ценева Г,Я,, Митрикова Л.А, Выявление маркеров вирулентности у клинических штаммов иерскний // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология,- 1991.- J? 3,— С,19-24.

15. Smirnov I.V. Production and чае of diagnostic oexua for ctudy tho circulation of enteropath'ogenic Yersinia // Medical biotechnology, immunization and AIDS.- USSR, Leningrad, 1991P.2-20.

16. Smirnov I.V., laeneva G.Ya. Uae of genetically charaoteriEed straiae for diagnosis of. yersiniosia // rbid,~ P.2-21.

17. Смирнов Й.В,, Ценева Г.Я. Культуралыше свойства и вирулентность иерсиний // Журн.микробиол.- 2991.- Р 9.- С.13-16.

18. Смирнов И.В. Способ диагностики иерсиниозов. A.C.ДО 1683690 СССР // Б.И.- 1991.- )<" 38.

19. Смирнов И.В., Ценева Р.Я. .Актуальные вопросы диагностики иерсиниозов П Тезисы докладов 6-го Всероос, съезда микробиол., спиде-миол и паразитол. ( Ншший Новгород, -I99I ) .-41. ,1991.- T.I.- С.132--. 133. .

20. йестиперова Т.Н., Смирнов И.В., Какижанова М.А. К вопросу о бактериологическом подтверждении иарсиниоза у ладей ■// Там ке.-

С.149-150.

21. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсиниоза и его значение для диагностики П Курн. микробиол. - 1992,- С.

68-94,

22. Смирнов И.В. Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза 09 и бруцеллеза. A.C. № I703II9 СССР // Б.И.- 1992.- № I.