Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения

Спиряхина, Татьяна Владиславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения"

На правах рукописи

СПИРЯХИНА ТАТЬЯНА ВЛАДИСЛАВОВНА

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШТАММОВ YERSINIA ENTEROCOLITICA РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэксперти-зы Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Зыкин Леонид Федорович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Швиденко Инна Григорьевна кандидат биологических наук Ливанова Людмила Федоровна Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет»

Защита состоится «» 2006 г. в У*У часов на

заседании диссертационного^ совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс (8452) 69-25-32.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Кишечный иерсиниоз широко распространен во многих странах мира. Источником инфекции являются больные сельскохозяйственные, домашние, дикие животные и грызуны, а фактором передачи - продукты животноводства и корма. Поэтому роль У. еШегосоШка в патологии сельскохозяйственных животных и свойства возбудителя требуют всестороннего изучения. Однако кишечный иерсиниоз по-прежнему остается инфекцией, мало известной работникам животноводства, данные о заболеваемости среди сельскохозяйственных животных неполны и отрывочны Регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных введена с 1996 г. (Иерсинио-зы, СП, ВП, 1996). Эпизоотологические исследования свидетельствуют о возрастающей роли У.еШегосоНИса в желудочно-кишечной патологии сельскохозяйственных животных (Померанцев, Васильев, 1998; Шумилов, Мельниченко, Селиверстов, 1998; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002). К сожалению, количество отечественных работ по изучению спектра биоваров «ветеринарных» штаммов У. еШегосо1Шса, а также по исследованию культур возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами, невелико. Отсутствуют диагностические препараты, утвержденные Министерством сельского хозяйства РФ. Единственные «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», выпущенные Министерством сельского хозяйства, официально утверждены лишь в октябре 2005 года, и только начинают действовать. Все перечисленные обстоятельства делают необходимым глубокое и всестороннее изучение ветеринарного аспекта проблемы кишечного иерсиниоза в нашей стране, особенно генетических особенностей У.вШегосо1Шса в связи с вопросами эпидемиологии и эпизоотологии.

У. еМегосоШса представляют собой разнородную группу бактерий как внутри вида, так и в пределах отдельных серог-рупп и биоваров. Поэтому остается актуальным вопрос о под-

1 рос нлкйоядеммя

БИБЛИОТЕКА

тверждении патогенности выделенной культуры. Помимо определения серогруппы и биоварианта рекомендуется исследовать факторы патогенности. Литературные данные свидетельствуют о полидетерминантной природе различных структур микроорганизма, обеспечивающих реализацию инфекционного процесса. Факторы патогенности контролируются хромосомными и плазмидными генами. По современным воззрениям проявление патогенных свойств связано с присутствием в клетках Y.enterocolitica плазмиды pYV молекулярной массой 45-47 мДа и экспрессией кодируемых ею белков (Gemsky, Laz-ere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981; Heesemann et al., 1983; Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Смирнов, 2004).

После выявления кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выделения культур Y.enterocolitica, выяснения роли молока и мяса в передаче возбудителя (Зыкин и др., 1997; Хапцев, 2000; Осипчук, 2003; Киселева, 2005), возникла необходимость подробно изучить свойства штаммов Y.enterocolitica, изолированных из разных источников, и определить их генетические особенности.

Цель работы - выяснение генетических особенностей (наличия плазмиды pYV и хромосомного гена inv) штаммов Y. enterocolitica, выделенных от больных и павших поросят и из молока КРС, а также биотипирование этих штаммов.

Задачи исследования:

1. Определить биоварианты штаммов Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

2. Провести плазмидный скрининг культур различного происхождения.

3. Исследовать культуры Y.enterocolitica методом ПЦР, применяя две коммерческие тест-системы: для выявления хромосомного гена inv и ДНК плазмиды pYV.

Научная новизна

1. Впервые определен спектр биовариантов У. еШегосо-1Шса, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. От свиней и крупного рогатого скота выделяются У.еШегосоИИса первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов У. еШегосоИНса, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Установлено, что хромосомный ген ту одинаково распространен среди У.еШегосоННса, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

3. Доказано, что плазмида вирулентности рУУ присутствует лишь в клетках У.еЫегосо1Шса, изолированных от больных и павших поросят. Культуры, выделенные из молока КРС, являются бесплазмидными.

4. Показано,что для определения плазмидного профиля можно использовать плазмидный скрининг, а для выявления ДНК плазмиды вирулентности рУУ ПЦР-анализ с тест-системой «ДиаГен- Уекчта».

Практическая значимость

По результатам исследований подготовлены методические рекомендации «Идентификация патогенных штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами для оценки их эпидемиологической и эпизоотологической значимости», утвержденные МК ФВМ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 5 от 16 ноября 2005 г).

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу «Ветеринарная микробиология и иммунология».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области циркулируют У. еШегосоШка первого (А и В), второго,

третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1 А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов УеШегосоПНса, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Хромосомный ген /«V, кодирующий синтез белка инва-зина, встречается как у УеШегосо1Шса, изолированных от больных и павших поросят, так и у культур кишечно-иерсиниозного микроба, выделенных из молока коров.

3. Культуры У.еШегосо1Шса , изолированные от больных и павших поросят, являются носителями плазмиды вирулентности рУУ, которая была обнаружена у семи из шестнадцати культур. Ни у одного из двадцати девяти «молочных» штаммов эта плазмида не выявлена. Для подтверждения патогенно-сти с целью решения вопроса об эпизоотической и эпидемической значимости выделенной культуры У. еШегосоИйса в комплексе с определением принадлежности к био- и серогруппе и наличия маркеров вирулентности рекомендуется выявлять присутствие в клетке плазмиды вирулентности рУУ.

4. Плазмидный анализ и ПЦР с тест-системой «ДиаГен-УегяМа» для выявления ДНК плазмиды рУУ в равной степени могут использоваться для выявления присутствия в клетках плазмиды вирулентности рУУ, так как их результаты одинаковы.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского Федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, 2003), на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и инфекционной патологии животных» (Омск,

2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 г. (СГАУ им. Н.И. Вавилова, Саратов, 2005).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР кафедры микробиологии и ветсанэкспертизы ИВМиБ за 20032005 гг.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы, включающего 137 наименований, в том числе 86 иностранных, и приложения. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.

Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И.Вавилова» в рамках основной темы направления работы кафедры: НИР № 21/ОЗВ «Разработка и внедрение эффективных методов дифференциальной диагностики туберкулеза, кишечного иерси-ниоза, псевдотуберкулеза, листериоза и лейкоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области».

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материал и методы

В работе были использованы штаммы Yersinia enterocoli-tica, выделенные в 2000 г. к.б.н. Хапцевым З.Ю. в разных районах Саратовской области от павших поросят и поросят с признаками диареи, а также штаммы, выделенные в 2003 г. к.б.н. Осипчук Е.С. из молока коров пяти хозяйств Петровского района Саратовской области. Выращивали культуры на питатель-

ном агаре (Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар) ННПЦ ГИП г. Оболенск, Моск. обл.).

Для определения серогрупповой принадлежности использовали диагностические сыворотки к Yersinia enterocolitica адсорбированные кроличьи сухие для РА на стекле, выпускаемые НИИЭМ им. Пастера, С.Петербург.

Биохимические свойства культур определяли стандартными микробиологическими методиками, в том числе с помощью диагностических систем ЭНТЕРОтест 16 (PLIVA - La-chema a.s.,Чешская республика).

Для определения маркеров вирулентности - кальцийзави-симости роста на среде Хигучи-Смита, пигментсорбции на агаре Хоттингера с конго-рот, агглютинации культуры сывороткой к вирулентным иерсиниям, температурозависимости роста и аутоагглютинации на среде Кларка - пользовались общепринятыми методиками (Ценева, 1992; Зыкин и др., 2002).

Для проведения плазмидного скрининга 1 использовали метод, предложенный C.I. Kado, S.T.-Liu (1981) с модификациями, включающий три основных этапа: 1. Выращивание бактерий на мясо-пептонном агаре при 37 °С 24 часа. 2.Сбор бактерий и лизис клеток для выделения ДНК. Суточную культуру центрифугировали, осажденные клетки суспендировали в ТАЕ-буфере следующего состава: 40 мМ трис-ОН, 0,8 мМ ЭДТА, 0,116 % уксусной кислоты, добавляли 250 мкл лизи-рующей смеси, состоящей из 2,5 М NaOH и смеси Kado-Liu (3 % SDS, 0,04 М трис-ОН). Инкубировали на водяной бане при 58 °С 50 минут. 3. Очистка плазмидной ДНК. К полученной смеси добавляли 5 М NaCl, затем равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1), перемешивали и центрифугировали 5 минут при 8500 g. После этого отбирали водную фазу, ДНК переосаждали добавлением равного объема изопропанола. Суспенди-

1 Автор приносит благодарность за консультативную и методическую помощь д.б.н. профессору Ю.А.Попову и м.н.с. О.М.Кудрявцевой.

ровали ДНК в бидистиллированной воде. Плазмидные репли-коны разделяли методом электрофореза (Маниатис и др., 1984) в 0,7 % агарозном геле фирмы "Sigma", США, в трис-ацетатной буферной системе (рН 8,0-8,2) на камере "Mini-phor" ("Hoefer", США). Для оценки результатов гель окрашивали раствором бромида этидия (0,5 мкг/мл) и просматривали его в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе LKB, Швеция. Результаты экспериментов регистрировали при помощи специализированной системы обработки изображений (гель-документирующей системы) Vitran (Россия).

Для постановки ПЦР 1 использовали две коммерческие иерсиниозные тест-системы. Первая - «ДиаГен- Yersinia» для выявления фрагмента ДНК патогенных иерсиний («Диа-генис», г. Москва). Праймеры этой тест-системы выбраны на основе нуклеотидной последовательности длиной 181 п.н., входящей в состав плазмиды вирулентности pYV. Вторая - «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21Qy> (ЦНИИЭ, г. Москва), предназначена для выявления участка ДНК гена инвазина вирулентных штаммов Y.enterocolitica длиной 270 п.н.

Использовали суточные агаровые культуры исследуемых штаммов, выращенные при температуре 24-26 °С. Из них готовили взвесь в 0,85 % растворе NaCl по стандарту мутности, а затем необходимые разведения.

ПЦР проводили согласно прилагаемым к тест-системам инструкциям. Для выделения ДНК использовали метод нук-леосорбции. В пробирки с лизирующим раствором вносили по 100 мкл пробы, используя наконечники с аэрозольным барьером. Пробы перемешивали в вортексе и прогревали 5 минут при 65 °С, осаждали центрифугированием. Затем в каждую пробирку добавляли по 25 мкл сорбента, перемешивали и оставляли в штативе. Осаждали центрифугирова-

1 Автор приносит благодарность за консультативную и методическую помощь д.м.н.Э.А.Федотову.

нием, удаляли супернатант вакуумным отсасывателем. К осадку добавляли раствор для отмывки, ресуспендировали, центрифугировали, удаляли супернатант, повторяли процедуру отмывки несколько раз. Сорбент подсушивали, поместив пробирки с открытыми крышками в термостат. В пробирки добавляли 50 мкл элюирующего буфера, перемешивали и выдерживали 5 минут при 65 °С, периодически встряхивая. Центрифугировали на максимальных оборотах 1мин. После такой обработки супернатант в пробирках содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Амплификация проводилась с применением «горячего старта», предусматривающего приготовление реакционной смеси из двух слоев, разделенных слоем парафина или воска. Нижний слой содержал ПЦР-буфер, праймеры с дНТФ. Верхний слой - ПЦР-буфер, раствор MgCh и Taq-полимеразу. Сверху наслаивали минеральное масло. Затем на масло или под масло, вносили 10 мкл исследуемой ДНК, и помещали пробирки в амплификатор. Амплификацию проводили на приборе «GeneAmp PCR 2700» производства Applied Biosystems, США.

Детекцию продуктов амплификации осуществляли методом гель-электрофореза. Электрофорез продуктов амплификации проводили в горизонтальном геле 2 % агарозы, камера и источник тока фирмы «Biometra», Германия. В каждом ряду дорожек геля был представлен положительный контроль и маркер молекулярных масс. Регистрацию фрагментов ДНК проводили по свечению в ультрафиолетовом свете в присутствии красителя бромистого этидия, используя трансиллюминатор ТН-1, («Biometra», Германия) и регистрирующую компьютерную систему «Vitran Photo», Россия. При использовании тест-системы «ДиаГен-Уелуш/а» положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 181 п.н., при условии наличия такой полосы в дорожке, соответствующей положительному контролю, и отсутствия ее в дорожке отрицательного контроля. В случае применения набора «Ам-

плиСенс Yersinia enterocolitica-270» положительные результаты регистрируются у проб, содержащих светящуюся полосу на уровне 270 п.н., при наличии такой полосы в дорожке положительного контроля и отсутствии ее в дорожке отрицательного.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение биохимических свойств и определение бноваров Y. enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных

Исследования показали, что все изученные штаммы обладают уреазой, орнитиндекарбоксилазой, нитратредукта-зой, Р-галактозидазой, утилизируют маннит, трегалозу, сорбит, сахарозу и целлобиозу; не продуцируют сероводород, не дезаминируют фенилаланин, не ферментируют малонат и адонит; реакция Фогес- Проскауэра положительна при 22 °С и отрицательна при 37 °С. Вариабельными оказались следующие признаки: ферментация эскулина, салицина, ксилозы, инозита, продукция индола, утилизация цитрата, лизин-декарбоксилазная и лецитиназная активности. Биохимические признаки штаммов возбудителей кишечного иерсинио-за, изолированных от сельскохозяйственных животных Саратовской области, в целом соответствуют описанным в литературе (Ценева, 1997). Исключение составляют ферментация инозита, утилизация цитрата и лизиндекарбоксилазная активность, ранее описанные как отрицательные признаки у Y. enterocolitica. В нашей работе эти свойства не обнаруживались у культур эпидемиологически и эпизоотологически значимых серогрупп 0:3 и 0:9, но проявлялись у большинства штаммов других серогрупп.

По биохимическим свойствам были определены биовары изучаемых культур. Результаты представлены в таблицах 1, 2 и 3 и на рисунках 1 и 2.

Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области циркулируют Y.enterocolitica следующих биоваров: 4 (22 штамма из 45 изученных), 1А (17 культур), 1В (1 штамм), 2 (3штамма) и 3 (2 штамма).

Большинство культур, изолированных от павших и больных поросят (11) относились к биовару 4, одна - к биовару 3, и лишь четыре штамма - к непатогенному биовару 1А. Y.enterocolitica биоваров 3 и 4 принадлежали к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе 0:3, тогда как четыре «непатогенных» штамма - к иным серов-группам, т.е. прослеживается корреляция между серогруп-пами и биоварами Y.enterocolitica (табл.1, рис.1).

Двадцать девять «молочных» штаммов распределились по биоварам по-иному: 13 культур относились к биоварианту 1 А, 11 - к четвертому биовару, три - ко второму и по одному штамму к биоварам 1В и 3. Однако корреляция между серогруппами и биовариантами прослеживается также четко: среди 15 культур Y.enterocolitica сероваров ОЗ и 09 обнаружилось лишь две непатогенного биовара 1А (табл. 2), а из 14 штаммов иных серогрупп к непатогенному биовару принадлежали 11 культур (табл. 3).

Результаты наших исследований совпадают с литературными данными о биовариантах иерсиний, циркулирующих среди животных. Указывается на важное значение 2-5 биоваров (Чеснокова, Марамович, Климов, 1997), на выделение от свиней в большинстве случаев штаммов четвертого биовара, и реже - третьего и второго (Климов, Чеснокова, Марамович, 1997; Маркик, 1993; Стефанов, 1989). Из молока коров изолировали Y.enterocolitica первого и третьего биоваров (Павлов и др., 1988). В последние годы появляются сообщения о выделении иерсиний биовара 1А от больных людей (Grant, Bennet-Wood, Robins-Brown, 1998). Наши исследования показывают возможность выделения иерсиний биовара 1А и от больных животных.

Биохимические свойства и биовары У.еМегосоШса, выделенных от поросят

№ п/п Штамм/ серогруппа Лещггиназа Салицин Эскулин Индол Ксилоза Грегалоза Ьорбиг Сахароза ■ Орнигин- де-карбоксилаза (5-галакто-зидаза Реакция Фо-гес- Проскауэра, 22°С |

1 60 (03) - - - - - + + + + + + + 4

2 160(03) - - - - - + + + + + + + 4

3 12(03) - - - + + + + + + + 4

4 112(03) - - - - - + + + + + + + 4

5 58(03) - - - - - + + + + + + + 4

6 158(03) - - - - - + + + + + + + 4

7 24(03) - - - - - + + + + + + + 4

8 124(03) - - - - - + + + + + + + 4

9 22(03) - - - - - + + + + + + + 4

10 138(03) - - - - - + + + + + + + 4

11 27(03) - - - - - + + + + + + + 4

12 127(03) - - - - + + + + + + + + 3

13 96(пол.) + + + + + + + + + + + + 1А

14 49(пол.) + + + + ± + + + + + + + 1А

15 43(06.30) + + + + ± + + + + + + + 1А

16 53(пол.) + + + + - + + + + + + + 1А

Примечание: (+) - положительная реакция, (-) - отрицательная реакция, (±) - сомнительный результат, (пол) - РА с поливалентной сывороткой.

£10

0 а

1 5 I о

1А 1В 2 3

биовары"

Рис. 1. Результаты биотипирования Y.enterocolitica от поросят

1А 1В 2 3 4 5

биовары

Рис. 2. Результаты биотипирования Y.enterocolitica из молока КРС

Биохимические свойства и биовары КеШегосоШка серогрупп ОЗ и 09, выделенных из молока коров

№ п/п Штамм/ серо-группа Лецитиназа Салицин Эскулин Индол Ксилоза Грегалоза Сорбит <3 со и Ннтратредуктаза Орнитин- декарбо-ксилаза я § ■ СО. Реакция Фогес-Про-скауэра, 22 °С Биовар

1 Н21(03) + + + + ± + + + + + + + 1А

2 Н26(03) - - - - + + + + + + + 4

3 Н32(03) - - - - + + + + + + + + 3

4 НЗЗ(ОЗ) - - - ± + + + + + + + 4

5 Н35(09) - - - + ± + + + + + + + 2

6 РЗ(ОЗ) - - - - - + + + + + + + 4

7 Р5(09) - - - - - + + + + + + + 4

8 Р20(09) - - - - ± + + + + + + + 4

9 М 14(03) - - - - + + + + + + + 4

10 НЗ(ОЗ) + + + + ± + + + + + + + 1А

11 НКОЗ) - - - ± + + + + + + + 4

12 НН(ОЗ) - - - ± + + + + + + + 4

13 НШ(ОЗ) - - - ± + + + + + + + 4

14 НШОЗ) - - - + + + + + + + 4

15 Н9Ю9) - - - - - + + + + + + + 4

Примечание: (+) - положительная реакция, (-) - отрицательная реакция, (±) - сомнительный результат.

Биохимические свойства и биовары выделенных из молока коров У.еШегосоИйса, не отнесенных к серогруппам ОЗ и 09 или нетипированных

№ п/п Штамм/ серогруппа Лецитиназа Салицин Эскулин в Ксилоза Грегалоза Сорбит Сахароза Нитратредуктаза я 5 У si р-галактозидаза Реакция Фогес-Прос-кауэра, 22 °С Биовар

1 Н40 (06,30) - + + + + + + + + + + + 1А

2 Н18 (018) + - + + - + + + + + + + 1А

3 Н5 (нетип.) - + + + + + + + + 2

4 Р2 (нетип.) - - - + ± + + + + + + + 2

5 Р9 (нетип.) - + + + + + + + + + + + 1А

6 М4 (07,8) - + + + + + + + + + + + 1А

7 М8 (04,32) + + + + ± + + + i + + + + 1А

8 М10 (04,32) + + + + + + + + + + + + 1А

9 М20 (012,25) - - + + + + + + + + + + 1А

10 Ч (04,32) + + + + - + + + + + + + 1А

11 Т (пол.) - + + + ± + + + + + + + 1А

12 М (04,32) - + + + - + + + + + + + 1А

13 Р (пол.) + - - + - + + + + + + + 1В

14 Н6(06) + + + + - + + + + + + + 1А

Примечание. (+) - положительная реакция, (-) - отрицательная реакция, (±) - сомнительный результат, (пол.) - РА с поливалентной сывороткой, (нетип.) - нетипируемый.

Исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных генетическими методами

В результате плазмидного скрининга было установлено, что в клетках семи из сорока пяти проверенных штаммов У.еп1егосо-1Шса, имеется внехромосомный репликон. Молекулярная масса плазмидной ДНК, обнаруженной в исследованных штаммах У.ШегосоШгса, оказалась равной 45-47 мДа, то есть соответствовала величине, характерной для плазмиды рУУ. Дня подтверждения того, что обнаруженный внехромосомный репликон действительно является плазмидой вирулентности, все штаммы в дальнейшем были проверены с помощью ПЦР с Использованием тест-системы «ДиаГен-Геши/йг» для выявления ДНК плазмиды рУУ.

Плазмида, предполагаемая как плазмида вирулентности, была обнаружена только у культур, выделенных от павших и больных поросят (рис. 3, табл. 4). Штаммы разделены на подгруппы по месту выделения.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Рис. 3. Электрофореграмма с результатами плазмидного анализа

Примечание' 1-5 - маркеры молекулярных масс (160 мДа, 78мДа, 26 мДа, 36 мДа, 4мДа); 6, 8, 9, 10, 11, 15 - Y.enterocohtica 60, Y.enterocohtica 12, Y enterocolitica 112, Y enterocolitica 58, Y enterocolitica 158, Y.enterocohtica 53 В клетках этих штаммов обнаружена плазмида массой 45-47 мДа, полосы плазмидной ДНК показаны стрелками; 7, 12, 13, 14 - Y.enterocohtica 160, Y enterocolitica 96, Y.enterocohtica 49, Y.enterocohtica 43 В клетках этих штаммов плазмидная ДНК не обнаружена Нет полос на уровне 45-47 мДа.

Результаты плазмидного скрининга штаммов К еШегосоШса, изолированных от поросят

1 1 Подгруппа а о Название хозяйства Серогруппа Марке ры вирулентности Наличие плазмиды 45-47мДа

Кальций-зависимость Пигмент-сорбция РА со СВИ Аутоагглю-тинация Температуро- зависимосгь колоний

1 А 60 СПОГА2 ОЗ + + + + + +

2 А 160 ОЗ + + + + + -

3 А 12 03 + + + + + +

4 А 112 ОЗ + + + + + +

5 А 58 ОЗ + + + + + +

6 А 158 03 + + + + + +

7 В 24 Трудовое 03 + + + + + +

8 В 124 03 + + + + + -

9 В 22 ОЗ + + + + + -

10 в 138 ОЗ + + + + +

11 в 27 03 + + + + + -

12 в 127 ОЗ + + + + +

13 с 96 Кристалл нетип - - _ +

14 с 49 нетип - - - - +

15 с 43 0:6,30 - _ - + _

16 с 53 нетип - ■ - - + +

Примечание: (+) - положительный результат, (-) - отрицательный результат, нетип. - нетипируемый штамм.

Результаты плазмидного скрининга штаммов подгруппы А, полученных от больных и павших поросят хозяйства СПОГА-2 Саратовского района, вполне ожидаемы-наличие плазмиды вирулентности у них совпадает с маркерами, и все они относятся к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе ОЗ.

Результаты плазмидного скрининга штаммов подгруппы В, полученных из хозяйства «Трудовое» Марксовского района (имея набор маркеров вирулентности, они не обнаруживали в своем составе плазмиду pYV, за исключением культуры №24), можно объяснить тем, что у них или произошла утрата плазмиды в процессе пересевов и хранения культур, или плазмидный репликон встроился в хромосому бактериальной клетки, аналогично тому, как это было показано АЛ.Гинцбургом с соавторами (1989). При этом может сохраняться экспрессия детерминант патогенности.

Культуры подгруппы С, выделенные из ОПХ «Кристалл» Саратовского района, не принадлежали к серотипу ОЗ, не имели маркеров вирулентности и не содержали плазмиду 45-47 мДа. Исключение составлял штамм № 53, обладающий плазмидой вирулентности. Наиболее вероятное объяснение этого феномена состоит в наличии мутационного дефекта общего гена-регулятора, контролирующего экспрессию ряда генов, задействованных в детерминантах вирулентности.

Что касается свойств 29 культур, выделенных из молока КРС, то оказалось, что ни одна из них не содержала плазмиду 45-47 мДа, хотя 15 из них относились к эпидемиологически значимым серогруппам 03 и 09 и имели маркеры вирулентности. С 13 штаммами зарегистрированы сомнительные результаты, а у одного маркеры вирулентности не обнаруживались совсем. Интересно, что последние относились не к серогруппам ОЗ и 09, а к редко встречающимся серогруппам 04,32, 06; 06,30; 07,8; 012,25; 018. Роль их в патологии сельскохозяйственных животных и человека некоторыми исследователями оспаривается. Следует отметить, что некоторые патогенные штаммы Y. enterocolitica не содержат плазмиду pYV. Эта закономерность обнаруживалась, например, у Y. enterocolitica

непатогенного биотипа 1А, выделенных от больных людей (Grant, Bennet-Wood, Robins-Brown, 1998).

Следующим этапом работы была постановка ПЦР с двумя тест-системами: для выявления ДНК плазмиды pYV и хромосомного гена inv у исследуемых штаммов Y.enterocolitica. Перед проведением исследований проверяли чувствительность и специфичность ПЦР для обеих тест-систем. Использованные коммерческие тест-системы не отличаются по чувствительности: она составляет <1x103 КОЕ/мл. Обе тест-системы достаточно специфичны. Положительные результаты наблюдались только с Y.enterocolitica, но не с культурами испытанных гете-рологичных микроорганизмов. Положительные результаты были получены при использовании обеих тест-систем для исследования фекалий свиней, искусственно контаминирован-ных Y. enterocolitica в дозе 1хЮ5мт/мл.

При исследовании тест-системой «АмплиСенс Yersinia еп-terocolitica-270» для выявления ДНК гена inv положительные результаты были получены у 8 штаммов из 16, изолированных от поросят, и у 12 из 29 культур, выделенных из молока (рис. 4, табл. 5).

> а -

<ч

S2 а а а а ы 3

ЖнннннчКнЦнн нч

X ЕП

е £ £

Рис. 4. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации, полученных в ПЦР с помощью тест-системы «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-210»

Примечание: М - маркеры молекулярных масс; 43-Н26,Н6-Н32,Н18-М4 - штаммы Y.enterocolitica; К+, К- - положительный и отрицательный контроля; Фек. - фекалии, контаминированные Y enterocolitica 12

Результаты ПЦР-анализа тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-ПО» штаммов возбудителей кишечного иерсиииоза, изолированных от сельскохозяйственных животных

Y. enterocolitica,

выделенные от павших и больных поросят Y. enterocolitica, выделенные из молока КРС

№№ №№ Наличие ДНК гена inv № №№ штам- Наличие ДНК №№ №№ штам- Наличие ДНК

п/п штаммов № п/п мов гена inv п/п мов гена inv

1 60 - 1 Н21 + 15 Н9 -

2 160 + 2 Н26 + 16 Н40 +

3 12 + 3 Н32 - 17 Н18 _

4 112 + 4 НЗЗ - 18 Н5 +

5 58 - 5 Н35 19 Р2 +

6 158 + 6 РЗ - 20 Р9 _

7 96 - 7 Р5 + 21 М4 -

8 49 + 8 Р20 + 22 М8 _

9 43 - 9 М14 + 23 М10

10 53 - 10 НЗ - 24 М20 +

11 24 + 11 HI + 25 Ч _

12 124 - 12 НИ + 26 Т -

13 22 - 13 Hill - 27 М _

14 138 - 14 HIV - 28 Р +

15 27 + 29 Н6 -

16 127 +

Примечание: (+) - положительный результат, (-) - отрицательный результат.

ПЦР-тест-система «ДиаГен- Yersinia» для выявления ДНК плазмиды pYV положительные результаты показала лишь при исследовании Y. enterocolitica от поросят, в 6 случаях из 16 (рис. 5, табл. 6).

Рис. 5. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации, полученных в ПЦР с помощью тест-системы «ДиаГен- Уегяи/а»

Примечание' М - маркеры молекулярных масс; 22-160 - штаммы Y.enterocolitica; К+, К- - положительный и отриидтельный контроля; Фек - фекалии, контаминирован-ные Y enterocolitica 112.

Результаты ПЦР-анализа почти полностью совпадают с результатами плазмидного скрининга (табл. 6). Исключение составила культура №53, у которой обнаружен автономный репликон массой 45-47 мДа, но ДНК плазмиды методом ПЦР не найдена.

Результаты ПЦР-исследования свидетельствуют об одинаковой распространенности хромосомного гена инвазина у штаммов Y. enterocolitica, циркулирующих как среди поросят, так и среди КРС. Ген inv встречается примерно у половины штаммов.

Другая картина наблюдается с плазмидными генами. ДНК плазмиды вирулентности обнаружена только у культур, изолированных от больных и павших поросят. Результаты плазмидного скрининга и ПЦР в этом случае совпадают. Плазмида вирулентности не встречается у возбудителей кишечного иерсиниоза, выделенных из молока коров. Это еще раз доказывает, что свиньи являются резервуаром инфекции, и подтверждает предположения, высказанные другими исследователями, о том, что от КРС патогенные иерсинии выделяются редко, и КРС не представляет собой существенный резервуар инфекции (Bucher, Fredriksson-Ahomaa, Stolle, 2002).

Таблица 6

Сравнение результатов плазмидного скрининга и ПЦР-исследования тест-системой «ДиаГен- Уешма»

1 * № штамма Маркеры вирулентности Наличие плазмиды 45-47 мДа (плазмидный скрининг) Наличие ДНК рТУ (ПЦР-анализ) № п/п I 1 Маркеры вирулентности Наличие плазмиды 45-47 мДа (плазмидный скрининг) Наличие ДНК рУУ (ПЦР-анализ)

1 60 + + + 9 43 - - -

2 160 + - - 10 53 - + -

3 12 + + + 11 24 + + +

4 112 + + + 12 124 + - -

5 58 + + + 13 22 + - -

6 158 + + + 14 138 + - -

7 96 - - - 15 27 + - -

8 49 - - - 16 127 + - -

Примечание: (+) - положительный результат, (-) - отрицательный результат

Генетические методы высоко информативны и дают возможность получить более полную характеристику штаммов У. еШего-соШса Наши исследования четко показали - хромосомный ген /от распространен равномерно у штаммов, циркулирующих среди разных групп животных, а плазмида вирулентности встречается исключительно у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших поросят и от поросят с явлениями диареи, т.е. в случаях, когда клинически проявляются патогенные свойств микроба. Нельзя забывать о наличии у половины культур, выделенных из молока, полного набора маркеров вирулентности. Данные литературы свидетельствуют о расширении спектра возможных возбудителей иерсиниоза. Поэтому для решения вопроса о патогенно-сти выделенной культуры необходимо определение комплекса признаков: серогруппы, биоварианта, наличия маркеров вирулентности и присутствия в клетках плазмиды вирулентности рУУ. Поскольку результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен-Уешта» практически идентичны результатам плазмидного скрининга, для выявления плазмиды можно выбирать любой метод. Плазмидный скрининг даже предпочтительнее, т.к. требует мень-

ше специального оборудования и материальных затрат. Аналогичные рекомендации даны для возбудителей кишечного иерси-ниоза человека (Климов и др., 1997)

ВЫВОДЫ

1. Изучено 45 штаммов Y.enterocolitica, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи (16 культур) и из молока коров (29 штаммов) в 2000-2003гг в Саратовской области. Все культуры обладали типичными для этого вида свойствами. Большинство из них (27 культур) относились к серогруппам ОЗ и 09.

2. Биотипирование позволило отнести Y.enterocolitica к первому (А и В), второму, третьему и четвертому биоварам; преобладают биоварианты 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

3. С помощью плазмидного скрининга автономный репликон молекулярной массой 45-47мДа (плазмида вирулентности pYV) был обнаружен только у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших и больных поросят - в 7 случаях из 16. Ни у одного из 29 штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, плазмида вирулентности pYV не найдена. Наличие маркеров вирулентности (кальцийзависимости, пигментсорбции, способности агглютинироваться сывороткой СВИ, температурозави-симости колоний и аутоагглютинации) не всегда совпадает с присутствием в клетках плазмиды pYV.

4. Результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды вирулентности иерсиний совпадают с результатами плазмидного скрининга. Они положительны только у культур, выделенных от поросят (6 случаев из 16), и отрицательны у «молочных» штаммов.

5. ПЦР-анализ с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocoli-tica-270», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv, показал, что этот ген равномерно распространен среди Y.enterocolitica, выделенных от разных групп

животных, и, скорее всего, не связан с проявлением патогенных свойств микроба.

6. Плазмидный скрининг и ПЦР-анализ с тест-системой для выявления ДНК плазмиды рУУ можно рекомендовать в качестве дополнительного теста при идентификации патогенных иерсиний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. л

1. Спиряхина Т.В. Сравнительное изучение штаммов Yersinia еп-terocolitica различного происхождения // Вавиловские чтения - 2003: Тезисы межре-гиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа. -Саратов, 2003. - С. 51-52.

2. Спиряхина Т.В. Биотипирование Yersinia enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных в Саратовской области // Ветеринарная практика. - 2004. - № 3. - С. 10-13.

3. Спиряхина Т.В. Сравнительное изучение штаммов Yersinia enterocolitica различного происхождения // Актуальные проблемы микробиологии и инфек-ционной патологии животных: Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Н.Г. Кондюрина. - Омск, 2004. - С. 146-150.

4. Спиряхина Т.В., Хапцев З.Ю., Осипчук Е.С., Зыкин Л.Ф. Характеристика свойств Yersinia enterocolitica, выделенных от животных из хозяйств Саратовской области // Практик. - 2004. - № 9-10. -С. 50-53.

5. Спиряхина Т.В. Генетический анализ штаммов Yersinia enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных // Вавиловские чтения - 2005: Материалы конференции, посвященной 118-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова. - Саратов, 2005.-С. 101-104.

Авторская редакция Компьютерная верстка И.В. Трофимова

Подписано в печать 11.01.06. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печ. л. 1. Тираж 100. Заказ 1111/1045.

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им Н И Вавилова»

410600, Саратов, Театральная пл., 1 п

/¿2¿>¿ÍA /¿ГЗ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спиряхина, Татьяна Владиславовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Биология возбудителя.

1.2 .Распространенность возбудителя.

1.3. Факторы патогенности Y enterocolitica и их генетические детерминанты.

1.3.1. Факторы патогенности, кодируемые плазмидой вирулентности.

1.3.2. Факторы патогенности, кодируемые хромосомными генами.

1.3.3. Факторы токсигенности Y. enterocolitica.

1.3.4. Экзоферменты Y. enterocolitica как факторы патогенности.

1.4. Дифференциация патогенных и непатогенных иерсиний.:.

• 1.4.1. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации патогенных Y. enterocolitica.

1.4.2. Возможности плазмидного скрининга.

1.4.3. Применение метода ДНК-зондирования.

Экспериментальная часть.

Глава 2. Материал и методы.

2.1. Штаммы.

2.2. Питательные среды и сыворотки.

2.3. Определение биохимических свойств.,.

2.4. Определение маркеров вирулентности.

2.5.Плазмидный скрининг.

2.6. Полимеразная цепная реакция.

Глава 3. Изучение биохимических свойств и определение биоваров Yersinia enterocolitica, изолированных от сельскохозяйственных животных.

Глава 4. Исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных генетическими методами.

4.1. Плазмидный скрининг.

4.2. Полимеразная цепная реакция.

4.3. Результаты ПЦР - анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения"

Актуальность темы

Работа посвящена изучению возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйствненных животных. Иерсиниоз — инфекционная болезнь человека и животных, вызываемая Y.enterocolitica, передающаяся алиментарным путем и характеризующаяся интоксикацией, преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта; при генерализованных формах — полиорганным поражением и склонностью к обострениям, рецидивам и хронизации процесса.

Иерсиниоз в соответствии с Международной статистической классификацией болезней (1995) регистрируется под символами: А046 — энтерит, вызванный Y.enterocolitica, или А28.2 — экстраинтестинальный иерсиниоз.

Заболевание широко распространено во многих странах мира. Наиболее часто эта инфекция встречается в странах Западной и Северной Европы, а также Америки: Великобритании, США, Канаде, Японии, России. В настоящее время наблюдается изменение структуры возбудителей ОКИ бактериальной природы, на первый план в некоторых странах (ФРГ, Дания, Финляндия) выдвигаются Campylobacter и Yersinia (Померанцев, Васильев, 1998; Куликовский, 1984).

В России первый случай кишечного иерсиниоза человека был зарегистрирован в 1968 году (Белова, Ющенко, 1968), официальный учет этой инфекции введен Минздравом в 1987 году. В настоящее время заболеваемость в некоторых регионах (Сибирь, Дальний Восток, Северо-Запад) составляет 3-5 случаев на 100 тыс. населения. Тридцатилетний период интенсивного изучения иерсиний позволил детально охарактеризовать свойства возбудителей кишечного иерсиниоза человека.

Y.enterocolitica - вид, представляющий собой разнородную группу микроорганизмов. По биохимическим свойствам различают 5 биовариантов первый биовар разделен на 1А и 1В), по антигенной структуре выделяют более 70 серовариантов. Далеко не все представители вида являются патогенными (Wauters et al., 1991). Эти микроорганизмы широко распространены в природе и часто выделяются из объектов внешней среды. Поэтому остается актуальным вопрос о подтверждении патогенности выделенной культуры." Помимо определения серогруппы и биоварианта рекомендуется исследовать факторы патогенности. Литературные данные свидетельствуют о полидетерминантной природе различных структур микроорганизма, обеспечивающих реализацию инфекционного процесса. Факторы патогенности Y.enterocolitica достаточно хорошо изучены, определены их генетические детерминанты. Описаны хромосомные гены и их продукты, участвующие в развитии инфекционного процесса. По современным данным литературы проявление патогенных свойств связано с присутствием в клетках Y.enterocolitica плазмиды pYV молекулярной массой 45-47 мДа и экспрессией кодируемых ею белков (Gemsky, Lazere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981; Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Смирнов, 2004). В Методических рекомендациях Министерства Здравоохранения РФ по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) для идентификации вирулентных иерсиний предлагается использовать фенотипические методы -определять маркеры вирулентности, агглютинационные тесты - постановку реакции агглютинации с сывороткой к вирулентным иерсиниям, а также молекулярно-генетические методы - полимеразную цепную реакцию. Имеются сообщения о возможности применения метода генетического зондирования (Кутырев и др., 1989, Попов и др., 1991).

По современным воззрениям, источником инфекции при кишечном иерсиниозе являются больные сельскохозяйственные, домашние, дикие животные и грызуны, а факторами передачи - продукты животноводства и корма. Поэтому роль Y.enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных и свойства возбудителя требуют всестороннего изучения.

Регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в РФ введена с 1996 году (Иерсиниозы, СП, ВП, 1996). Эпизоотологические исследования свидетельствуют о возрастающей роли Y enterocolitica в желудочно-кишечной патологии сельскохозяйственных животных. Иерсиниоз основных видов животных описан в различных регионах РФ: Дальневосточном регионе, Нижегородской, Ульяновской, Вологодской, Ленинградской и других областях (Кирьянов, Савчук, 1987; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002; Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003). Из сельскохозяйственных животных наиболее важную роль играют свиньи и КРС, меньшую - МРС, лошади. Описаны случаи кишечного иерсиниоза среди собак, кошек и других домашних животных (Platt-Samoraj, Szweda, Siwicki, 2000; Vokoun, 1985; Hayashidani et al., 1995; Корчагин, Васильев, 2002). Имеются наблюдения о заражении от диких животных (кабанов) (Shayegani, Stone, DeForge, 1986; Nattermann, Dedek, Loepelmann, 1986), a также от грызунов, которые часто инфицируют своими экскрементами корма и пищевые продукты (Калошина, Ющенко, Шестопалов, 1989; Singh, Sharma, Singh, 1994; Hayashidani, Kitahara, Ogawa, 1994). Значительное количество работ посвящено изучению кишечного иерсиниоза у свиней (Кирьянов, Савчук, 1989; Родионова, Муравьев, Малофеева, 1999; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002, Прунтова и др., 2000; Nattermann, Horsch, Seeger, 1985; Markic, 1986; Mickova, Konecny, 1987; Hugenberg J., 1999, Okoroafor, Adesiyun, Agbonlahor, 1988). Почти на всех территориях от свиней изолируют Y.enterocolitica серогрупп ОЗ, 09, 05,27, 08, 06,30, 05, 07, ОН, 012, 017, 019, 04,32. Доказано, что свиньи являются основным источником иерсиниоза. От крупного рогатого скота выделяют иерсинии серогрупп 012, 013, 018, 07,8, 04, 05,27, ОЗ, 08.

К сожалению, количество отечественных работ по изучению спектра биоваров «ветеринарных» штаммов Y.enterocolitica, а также по исследованию их генетическими методами, невелико. Отсутствует нормативно-техническая документация по кишечному иерсиниозу сельскохозяйственных животных, нет диагностических препаратов, утвержденных Министерством сельского хозяйства РФ. Единственные «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», выпущенные Министерством сельского хозяйства, официально утверждены лишь в октябре этого года, и только начинают действовать. Все перечисленные обстоятельства делают необходимым глубокое и всестороннее изучение ветеринарного аспекта проблемы кишечного иерсиниоза в нашей стране, особенно генетических особенностей Y. enterocolitica в связи с вопросами эпизоотологии и эпидемиологии. Кишечный иерсиниоз по-прежнему остается инфекцией, мало известной работникам животноводства, данные о заболеваемости среди сельскохозяйственных животных неполны и отрывочны.

В Саратовской области существование кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных было доказано Зыкиным Л.Ф. и сотр. в 1997 году (Зыкин Л.Ф. и др., 1997). С этого времени на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Саратовского ГАУ им Н.И.Вавилова ведется планомерная работа по изучению кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. С 1997 по 2005 год были обследованы животные нескольких районов Саратовской области: Саратовского, Советского, Базарно-Карабулакского, Энгельского, Марксовского, Ново-Бурасского, Красноармейского, Калининского и Петровского. При иммунологическом обследовании свиней и КРС в высоком проценте случаев выявлены антитела, а затем бактериологическим методом были выделены культуры Y. enterocolitica от поросят, КРС, из молока коров, а также из мяса и мясопродуктов (Хапцев, 2000; Гвинджилия, Зыкин, 2002; Гвинджилия, 2002; Осипчук, 2003; Киселева, Зыкин, 2004; Киселева, 2005). Большая часть культур выделена в Петровском районе Саратовской области, что согласуется с данными Областного Центра санэпиднадзора за 2001 год, по которым в этом же районе были выявлены лица (6 человек) с диагностическими титрами антител к Y.enterocolitica 03 серогруппы. Это еще раз подтверждает, что при заболевании людей основным источником инфекции являются сельскохозяйственные животные, а фактором передачи -продукты животноводства.

Цель работы - выяснение генетических особенностей (наличия плазмиды pYV и хромосомного гена inv) штаммов Y. enterocolitica, выделенных от больных и павших поросят, а также из молока КРС, и биотипирование этих штаммов.

Задачи исследования:

1. Определить биоварианты штаммов Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

2. Провести плазмидный скрининг культур различного происхождения.

Научная новизна

1. Впервые определен спектр биовариантов Y.enterocolitica, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. От свиней и крупного рогатого скота выделяются Y.enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Установлено, что хромосомный ген inv одинаково распространен среди Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

3. Доказано, что плазмида вирулентности pYV присутствует лишь в клетках Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят. Культуры, выделенные из молока КРС, являются бесплазмидными.

4. Показано, что для определения плазмидного профиля можно использовать плазмидный скрининг, а для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV ПЦР-анализ с тест-системой «ДиаГен- Yersinia».

Практическая значимость

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсам «Ветеринарная микробиология и иммунология» и «Клиническая микробиология».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области . циркулируют Y.enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантов; преобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые - к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Хромосомный ген inv, кодирующий синтез белка инвазина, встречается как у Y.enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят, так и у культур кишечно-иерсиниозного микроба, выделенных из молока коров.

3. Культуры Y.enterocolitica , изолированные от больных и павших поросят, являются носителями плазмиды вирулентности pYV, которая была обнаружена у семи из шестнадцати культур. Ни у одного из двадцати девяти «молочных» штаммов эта плазмида не выявлена. Для подтверждения патогенности с целью решения вопроса об эпизоотической и эпидемической значимости выделенной культуры Y.enterocolitica в комплексе с определением принадлежности к био- и серогруппе и наличия маркеров вирулентности рекомендуется выявлять присутствие в клетке плазмиды вирулентности pYV.

4. Плазмидный анализ и ПЦР с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды pYV в равной степени могут использоваться для выявления присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV, так как их результаты одинаковы.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР кафедры микробиологии и ветсанэкспертизы ИВМиБ за 2003-2005 годы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Спиряхина, Татьяна Владиславовна

Выводы

1. Изучено 45 штаммов Y.enterocolitica, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи (шестнадцать культур) и из молока коров (двадцать девять штаммов) в 2000-2003 годах в Саратовской области. Все культуры обладали типичными для вида свойствами. Большинство из них (двадцать семь культур) относились к серогруппам ОЗ и 09.

3. С помощью плазмидного скрининга автономный репликон молекулярной массой 45-47 мДа (плазмида вирулентности pYV) был обнаружен только у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших и больных поросят - в семи случаях из шестнадцати. Ни у одного из двадцати девяти штаммов Y.enterocolitica, выделенных из молока коров, плазмида вирулентности pYV не найдена. Наличие маркеров вирулентности (кальцийзависимости, пигментсорбции, способности агглютинироваться сывороткой СВИ, температурозависимости колоний и аутоагглютйнации) не всегда совпадает с присутствием в клетках плазмиды pYV.

4. Результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды вирулентности иерсиний совпадают с результатами плазмидного скрининга. Они положительны только у культур, выделенных от поросят (шесть случаев из шестнадцати), и отрицательны у «молочных» штаммов.

5. ПЦР-анализ с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-270», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv, показал, что этот ген равномерно распространен среди Y.enterocolitica, выделенных от разных групп животных, и, скорее всего, не связан с проявлением патогенных свойств микроба.

6. Плазмидный скрининг и ПЦР-анализ с тест-системой для выявления ДНК плазмиды pYV можно рекомендовать в качестве дополнительного теста при идентификации патогенных иерсиний

Заключение

Yersinia enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза, заболевания, которое широко распространено в мире, в том числе и в России. По данным ВОЗ эта болезнь регистрируется более чем в 30 странах мира, чаще в странах с более прохладным климатом. Так, в Финляндии абсолютное число заболевших в 2001 году составило720 человек, в Швеции - 579, в Дании - 285 человек. В РФ (по данным ЦЬЖИЭ Минздрава России) ежегодно регистрируется 4-5 тысяч случаев иерсиниоза, т.е. 6-7 случаев на 100 тысяч населения. В некоторых регионах этот показатель намного выше: во Владивостоке он достигает 40-50 случаев на 100 тысяч В Саратовской области по данным Областного ЦСЭН наблюдается рост заболеваемости: в 1999 году зарегистрировано 10 случаев, в 2000 году - 26, в 2001 году - 18. Фактическая заболеваемость кишечным иерсиниозом превышает официально регистрируемую, так как не во всех регионах РФ на эту инфекцию обязательно исследуют в случае острых кишечных инфекций.

Болеют кишечным иерсиниозом и сельскохозяйствененые животные. Особенно восприимчив к Y.enterocolitica молодняк свиней. Иерсинии выделены от свиней, коров, мелкого рогатого скота, кроликов, птицы, а также от грызунов и диких животных (Зыкин, Щербаков, Хапцев, 2002). При иммунологическом обследовании животных Саратовской области в РА в высоком проценте случаев выявлены антитела к Y.enterocolitica (Хапцев, 2000)

Источниками инфекции являются сельскохозяйственные животные и грызуны, а факторами передачи - продукты животноводства и корма. С 1996 года введена официальная регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных, но это заболевание по-прежнему остается инфекцией, мало известной ветеринарным работникам, главным образом, в силу отсутсвия нормативно-технической документации, необходимых сред и диагностических препаратов.

В 1997 году профессором Зыкиным Л.Ф. и сотрудниками кафедры микробиологии Саратовского Аграрного Университета эта инфекция была выявлена среди сельскохозяйственных животных области, главным образом, среди свиней и КРС. В 2000-2003 годах к.б.н. 3. Ю. Хапцевым и к.б.н. Е. С. Осипчук от сельскохозяйственных животных были изолированы 45 штаммов Yersinia enterocolitica. Все выделенные культуры обладали характерными для вида фенотипическими свойствами. Доказана роль молока и мяса в передаче возбудителя, кишечного иерсиниоза.

Следующим этапом работы должно было стать всестороннее изучение штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных, в том числе генетическими методами.

Для Yersinia enterocolitica характерен внутривидовой полиморфизм: этот вид включает более 70 серовариантов, 6 биовариантов, встречаются патогенные и непатогенные представители. Для выявления патогенных иерсиний, согласно рекомендациям, определяют маркеры вирулентности: зависимость от ионов Са2+ при выращивании при 37 °С, сорбцию пигмента конго-красного или гемина из среды роста, способность агглютинироваться сывороткой СВИ (сыворотка к вирулентным иерсиниям), аутоагглютинацию на среде Кларка и температурозависимость колоний.

Для максимального проявления патогенных свойств по современным воззрениям, необходимо присутствие в клетках иерсиний плазмиды pYV и экспрессия кодируемых ею белков. Размеры плазмиды составляют около 70 тыс. пар оснований, что соответствует молекулярной массе 45-47 мДа. Штаммы, содержащие эту плазмиду, как правило, являются вирулентными, тогда как штаммы, лишенные ее, авирулентны. Поэтому обнаружение плазмиды pYV является важным признаком, указывающим на возможную эпидемическую и эпизоотологическую опасность исследуемого штамма.

Имеют значение для патогенности и многие факторы, кодируемые хромосомными генами. Например, ген inv кодирует белок инвазин, играющий важную роль в проникновении бактерий внутрь эпителиальных клеток. На основе специфических участков гена inv и плазмиды pYV созданы коммерческие ПЦР-тест-системы, рекомендуемые производителями для идентификации патогенных иерсиний.

Нашей задачей было изучить биохимические свойства Y.enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных, для того, чтобы определить биоварианты этого микроба различного происхождения, с помощью генетических методов обнаружить плазмиду вирулентности в клетках и присутствие гена инвазина в хромосоме, а также выяснить, возможно ли применять указанные ПЦР-тест-системы для индикации патогенных иерсиний.

Всего подробно были изучены сорок девять штаммов Y.enterocolitica: шестнадцать из них были выделены в 2000 году З.Ю. Хапцевым от больных поросят и поросят с признаками диареи в хозяйствах Саратовского и Марксовского районов Саратовской области, двадцать девять культур изолированы в 2003 году Е.С. Осипчук из молока коров в хозяйствах Петровского района и четыре штамма - музейные культуры из коллекции кафедры микробиологии СГАУ. Биохимические признаки штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных Саратовской области были типичными и в целом соответствовали описанным в литературе.

Были определены биовары изучаемых культур Большинство культур -одиннадцать, изолированных от павших и больных поросят, относились к биовару 4, одна - к биовару 3, и лишь четыре штамма - к непатогенному биовару 1А. Важно отметить, что Y.enterocolitica биоваров 3 и 4 принадлежали к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе ОЗ, тогда как четыре «непатогенных» штамма - к иным сероварам, т.е. установлена корреляция между серогруппами и биоварами Y. enterocolitica.

Результаты наших исследований совпадают с литературными данными о биовариантах иерсиний, циркулирующих среди животных. Различные исследователи указывают на важное значение 2-5 биоваров (Чеснокова, Марамович, Климов, 1997), на выделение от свиней в большинстве случаев четвертого биовара, и реже - третьего и второго (Климов, Чеснокова, Марамович, 1997; Маркик, 1993; Стефанов, 1989). Из молока коров изолируются Y.enterocolitica первого и третьего биоваров (Павлов и др., 1988). В последние годы появились сообщения о выделении иерсиний биовара 1А от больных людей (Grant, Bennet-Wood, Robins-Brown, 1998). Наши исследования показывают возможность выделения биовара 1А и от больных животных.

Биотипирование Y.enterocolitica различного происхождения показало, что определение биоварианта выделенной культуры возбудителя кишечного иерсиниоза - необходимая процедура при исследовании Y.enterocolitica ветеринарного происхождения.

Следующий раздел нашей работы предполагал исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами. Работ, посвященных генетическим исследованиям Y.enterocolitica , выделенных от сельскохозяйственных животных, в отечественной литературе мало, поэтому этот раздел важен не только с теоретических, но и с практических позиций.

Плазмидный скрининг культур позволил дифференцировать штаммы, содержащие плазмиду от бесплазмидных. Оказалось, что плазмиду вирулентности pYV удалось обнаружить лишь в клетках культур, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи. Внехромосомный репликон молекулярной массой 45-47мДа был обнаружен у семи штаммов из шестнадцати. Важно, что наличие плазмиды не всегда совпадало с маркерами вирулентности, кодируемыми плазмидой, например, с кальцийзависимостью. Культуры, изолированные от поросят хозяйства «Трудовое» Марксовского района, имели полный набор маркеров вирулентности, но не имели плазмиду pYV. Штаммы Y.enterocolitica, изолированные из молока коров, не содержали плазмиду вирулентности pYV. Однако пятнадцать из двадцати девяти «молочных» штаммов имели полный набор маркеров вирулентности. Объяснить это можно было бы, предположив, что плазмида интегрирована в хромосому. Такая возможность была показана А.Л. Гинцбургом с соавторами (1989). При этом может сохраняться экспрессия детерминант патогенности. Реальность этой гипотезы может быть проверена экспериментально методом генетического зондирования или полимеразной цепной реакции.

Для этого мы провели ПЦР-анализ штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от больных и павших поросят и из молока КРС. Были использованы две тест-системы: «ДиаГен-Yersinia'» для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV Y.enterocolitica и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-210», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv вирулентных штаммов Y.enterocolitica.

Результаты ПЦР-исследования культур тест-системой «ДиаГен-Yersinia» почти полностью совпали с результатами плазмидного скрининга. ДНК плазмиды pYV обнаружена только у Y.enterocolitica, выделенных от павших и больных поросят, в шести случаях из шестнадцати. Плазмидный скрининг определяет присутствие автономного репликона в клетках. ПЦР обнаруживает нуклеотидную последовательность, независимо от того, автономна плазмида или встроена. Положительные результаты ПЦР и плазмидного анализа были получены у одних и тех же штаммов. Совпадение результатов плазмидного скрининга и ПЦР свидетельствует о том, что интеграция плазмиды в хромосому у изученных штаммов маловероятна (хотя и не исключается).

Определив плазмидный профиль культур, мы получили еще один аргумент в пользу того, что основным резервуаром и источником иерсиниозной инфекции являются свиньи. Именно от них выделяются высоковирулентные штаммы Y.enterocolitica. Тот факт, что ни у одной из двадцати девяти культур, изолированных из молока, не обнаружена плазмида вирулентности pYV, свидетельствует, по нашему мнению, о том, что КРС не "имеет большого значения как источник инфекции. К такому же выводу пришли в своей работе немецкие ученые М. Bucher, М. Fredriksson-Ahomaa и A. Stolle (2002).

Проведен ПЦР-анализ другой тест-системой, «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§y>. Она направлена на распознавание хромосомного гена inv в клетках Y.enterocolitica. Ген inv обнаружен у двадцати культур из сорока пяти изученных. Оказалось, что этот ген одинаково распространен как среди культур, изолированных от больных и павших поросят (у восьми культур из шестнадцати), так и .среди штаммов, выделенных из молока КРС (у двенадцати из двадцати девяти). Корреляции с патогенными свойствами, принадлежностью к определенным биовариантам и серогруппам не было обнаружено. По литературным данным, ген инвазина обнаруживается как у патогенных, так и у непатогенных штаммов иерсиний (Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002). Наши исследования этот факт подтверждают.

Мы имели возможность сравнить две иерсиниозные ПЦР-тест-системы. Они не отличались по чувствительности и специфичности. Чувствительность обеих тест-систем составляет <1x103 КОЕ/мл. Обе они оказались достаточно специфичны. Положительные результаты наблюдались только с Y.enterocolitica, но не с культурами испытанных гетерологичных микроорганизмов (E.coli, S.enteritidis, S.faecalis и Y.pseudotuberculosis). Хорошо зарекомендовали себя тест-системы и при исследовании биологических объектов - фекалий свиней, искусственно контаминированных Y. enterocolitica в дозе 1x105 мт/мл. Положительные результаты были получены при использовании и «ДиаГен- Yersinia» и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§y>.

Все три генетических метода, которые мы применили, могут быть рекомендованы для исследования штаммов Y. enterocolitica. ПЦР с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21 ()» для выявления гена инвазина может использоваться для обнаружения возбудителя кишечного иерсиниоза, а также для дополнительной характеристики штамма. Аналогичные рекомендации даны Корчагиным Г.А. (2002) в связи с высокой распространенностью и сохранностью при пересевах гена inv. Однако для индикации патогенных иерсиний необходимо определить плазмидный профиль выделенной культуры, так как важнейшее значение для реализации патогенных свойств микроба имеет присутствие в клетках плазмиды pYV.

Наши исследования четко показали - хромосомный ген inv распространен равномерно у штаммов, циркулирующих среди разных групп животных, а плазмида вирулентности встречается исключительно у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших поросят и от поросят с явлениями диареи, т.е. в случаях, когда клинически проявляются патогенные свойств микроба. Нельзя забывать о наличии у половины культур, выделенных из молока, полного набора маркеров вирулентности. Данные литературы свидетельствуют о расширении спектра возможных возбудителей иерсиниоза. Поэтому для решения вопроса о патогенности выделенной культуры необходимо определение комплекса признаков: серогрупповой принадлежности, биоварианта, наличия маркеров вирулентности и присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV. Поскольку результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен- Yersinia» практически идентичны результатам плазмидного скрининга, для выявления плазмиды можно выбирать любой метод в зависимости от возможностей исследователя. Плазмидный скрининг даже предпочтительнее, т.к. требует меньше специального оборудования и материальных затрат. Аналогичные рекомендации даны для возбудителей кишечного иерсиниоза человека (Климов и др., 1997) В последних методических рекомендациях по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003; Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) предусматривается возможность использования ПЦР для выявления генетических детерминант, локализованных в плазмиде вирулентности. Мы подтвердили возможность применения на практике ПЦР-тест-системы «ДиаГен- Yersiniav> и плазмидного скрининга и можем рекомендовать эти методы для диагностики кишечного иерсиниоза.

Генетические исследования штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных показали необходимость определять наличие плазмиды pYV у «ветеринарных» штаммов Y. enterocolitica с целью выяснения их эпидемиологической и эпизоотологической значимости. Особенно это касается культур, изолированных от свиней.

Наши исследования показывают необходимость комплексного подхода к вопросу о патогенности Y. enterocolitica и дальнейшего изучения особенностей этого микроорганизма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спиряхина, Татьяна Владиславовна, Саратов

1. АляпкинаЮ.С., Аксенов М.Ю., Чернов Б.К., Гинцбург A.J1. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержания амплифицированного фрагмента ДНК. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1994. - № 5. - С. 22-26.

2. Балахонов С.В., Лапа С.Э., Пинтусов В.И. Использование ПНР и плазмидного скрининга в эпидемиологическом надзоре за внутрибольничным сальмонеллезом. // Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиология XXI век». -2005. - С. 29-30.

3. Бантинг Г., Кантор Ч., Коллинз Ф., Колсон А., Кокс Д., Эрлих Г., Гудфеллоу П., Гиленстен У. Анализ генома. Методы. Под ред. К. Дейвиса.-М.: Мир, 1990. 264с.

4. Белова М. А., Ющенко Г.В. Случай выделения Yersinia enterocolitica от человека.//ЖМЭИ. 1968. - № 9. - С. 148-150.

5. Водопьянов С.О.; Олейников И.П.; Гурлева Г.Г.; Мишанькин Б.Н. Генотипическое изучение штаммов Yersinia enterocolitica в полимеразной цепной реакции с использованием универсальных праймеров // Биотехнология. 1995.- № 3-4.- С. 35-37.

6. Гвинджилия Е. С., Зыкин Л.Ф. Выделение возбудителя кишечного иерсиниоза из молока КРС // Практик. 2002.- № 3-4.- С. 18-29.

7. Гвинджилия Е.С. Иерсиниоз КРС в Петровском районе Саратовской области // Тезисы научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 115- летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова. Саратов, 2002.- Ч. 2.- С. 19-20.

8. Гвинджилия Е. С., Зыкин Л.Ф., Матвиевский В.Я. Дальнейшее исследование молока КРС на наличие возбудителя кишечного иерсиниоза и влияние различных режимов пастеризации навыживаемость Y. enterocolitica в молоке // Практик. 2002. - №11 - 12. -С. 18-22.

9. Зыкин Л.Ф., Щербаков А.А., Хапцев З.Ю. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных.//Саратов, 2002. -70с.

10. Иерсиниозы// Санитарные правила СП 3.1.094-96, Ветеринарные правила ВП 13.3.13.18-96. -М., 1996.

11. Калошина Л.А., Ющенко Г.В., Шестопалов Н.В. и др. Эпизоотический процесс псевдотуберкулеза и иерсиниоза в популяции грызунов крупного города.// Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней. Новосибирск, 1989. -С.83-84.

12. Кирьянов Е. А., Савчук И.И. Иерсиниоз сельскохозяйственных животных // Болезни сельскохозяйственных животных в Забайкалье и на Дальнем Востоке.- 1987. С. 22-26.

13. Кирьянов Е. А., Савчук И.И. Роль Y. enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных// Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции «Иерсиниозы». Владивосток, 1989. чЛ. -С.89-91.

14. Киселева И.С. Мясо как фактор передачи инфекции при иерсиниозе // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.- Саратов , 2005.

15. Киселева И.С., Зыкин Л.Ф. Выделение Y.enterocolitica из мяса и мясопродуктов // Практик.- 2004.- №5-6. -С. 10-13.

16. Киселева И. С., Зыкин Л.Ф. Первый случай выделения 7. enterocolitica из мяса в Саратовской области // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Тезисы 2-ой региональной конференции молодых ученых. -Саратов, 2004. -С. 30-31.

17. Королюк A.M., Михайлов Н.В., Мирошниченко И.В. Диагностическая ценность ПЦР при иерсиниозах. // Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов. М. 1997.- С. 180-181.

18. Корчагин Г.А. Диагностика кишечного иерсиниоза у свиней и КРС.// Вестник УГСХА.-Ульяновск, 2002.- С. 15-17.

19. Корчагин Г.А. Сравнительная характеристика лабораторных методов диагностики кишечного иерсиниоза. // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-Саратов, 2002.

20. Корчагин Г.А.; Васильев Д.А. К вопросу о диагностике заболевания, вызываемого энтеропатогенными иерсиниями, у мелких домашних животных // Вестник Ульяновской ГСХА, серия "Ветеринария".- 2002.- № 8. С. 15-17.

21. Кузнецов В.Г. Сигнальная идентификация потенциально патогенных иерсиний//Клиническая лабораторная диагностика. 2000.-№1,-С. 46-48.

22. Кузнецов В.Г., Багрянцев В.Н. Пиразинамидазная активность бактерий рода Yersinia. II Лабораторное дело. -1990 .- № 9. С. 72-73.

23. Куклева JI.M., Кутырев В.В., Проценко О.А. Молекулярно-генетические аспекты инвазивных и антифагоцитарных свойств патогенных иерсиний. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 1996.-№ 1.- С. 11-16.

24. Куликовский А.В. Yersinia enterocolitica и Campilobacter jejuni возбудители пищевых отравлений человека // Труды ВИЭВ. 1984.- Т. 61.-С. 125-131.

25. Маниатис Т.,Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М., «Мир», 1984.

26. Международная классификация болезней. 10-й пересмотр. М.: Медицина.- 1995. -Т 1.- С. 105- 118.

27. Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах. Министерство сельского хозяйства РФ. Москва, 2005.

28. Осипчук Е.С. Молоко как фактор передачи возбудителя кишечного иерсиниоза.// Дисс. канд. биол. наук. -Саратов, 2003.-130с.

29. Померанцев Д.А. Васильев Д.А. Yersinia enterocolitica как возможный этиологический агент при желудочно-кишечных заболеваниях сельскохозяйственных животных. //Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы. -Ульяновск, 1998. -С. 103-116.

30. Попов Ю.А., Булгакова Е.Г., Куличенко А.Н., Шишкина О.Г., Лежнев А.И., Федотов Э.А., Кириллина О.А. Конструирование тест-системы на основе генетических зондов для идентификации чумного микроба //Генетика.- 1991.- Т 27,- С. 2063-2071.

31. Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз. (Экология, эпизоотология, лабораторная диагностика у сельскохозяйственных животных) Методические рекомендации // Вологда, 2003.

32. Псевдотуберкулез, иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия). Методические рекомендации // Санкт-Петербург, 2005.

33. Родионова В. Б., Муравьев В.Н., Малофеева Н.А. Роль иерсиний в патологии репродукции свиней.// Тезисы докладов Международной конференции, посвященной 80-летию Московской ветеринарной академии. М.- 1999. С. 191-192.

34. Светличкин О.В. ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Разработка тест-систем обнаружения Yersinia enterocolitica с использованием- полимеразной цепной реакции и ДНК-зондов //

35. Научные основы производства ветеринарных биопрепаратов. -Щелково, 2000. С. 388.

36. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуральные свойства и вирулентность иерсиний.// ЖМЭИ. 1991. - № 9. - С. 13-15.

37. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близких к нему микроорганизмов.//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.-2004.-Т 6, №1. -С. 10-21.

38. Тихонов В.К. Иерсиниозы животных в центральном и правобережном агрорайоне Нижегородской области. //Автореферат диссертации кандидата ветеринарных наук- С -Петербург, 1999.

39. Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных.// Диссертация кандидата биологических наук. Саратов, 2000.-124с.

40. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. - Т. 4. - № 3. -С. 248-266.

41. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез СПб, 1992. - 60 с.

42. Ценева Г.Я. Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза.//СПб, 1997.-62с.

43. Чеснокова М.В., Марамович А.С., Климов В.Т. Основные направления эпидемиологического надзора за иерсиниозами. //Материалы 7-го съезда ВНОЭМП. М.Д997.-Ч. 1.-С. 167-168.

44. Шумилов К.В.; Мельниченко Л.П.; Селиверстов В.В. Современные данные об иерсиниозе животных // Ветеринария. -1998.-№4.-С. 7-13.

45. Ющук Н.Д., Ценева Г.Я., Кареткина Г.Н., Бродов Л.Е. Иерсиниозы. -М.: Медицина, 2003. 208 с.

46. Asplund К.; Tuovinen V.; Veijalainen P.; Hirn J. The prevalence of Yersinia enterocolitica 0:3 in Finnish pigs and pork // Acta Veter. scand, 1990.- T. 31, N 1, P. 39-43.

47. Bezanson G., Fernander R., Haldane D., Burbridge S., Marrie T. Virulence of patient and water isolated of Legionella pneumophila varies with bacterial genotype.//Can. J. Microbiol. 1994. - V 40, № 6 .- P. 426431.

48. Bhaduri S., Conway L.K., Lachica R.V. Assay of Crystal Violet Binding for Rapid Identification of Virulent Plasmid-Bearing Clones of // J. clin. Microbiol. 1987.-V.6. -P. 1039-1042.

49. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucleic Acids Res. 1979.- V7. -P. 1513-1523.

50. Borie C.E.; Jara M.A.; Sanchez M.L.; San Martin В.; Arellano C.; Martinez J.; Prado V. Aislamiento у caracterizacion de Yersinia enterocolitica de cerdos у bovinos en Chile // J. Veter.Med.Ser.В.- 1997.- V. 44, N 6. P. 347-354.

51. Bucher M., Fredriksson-Ahomaa M. und. Stolle A Vorkommen von Yersinien-Arten in Kalbern und Jungrindern // Fleischwirtschaft -2002.- № 9. -C. 125-127.

52. Bullians J.A. Yersinia species infection of lambs and cull cows at an abattoir //N. Z. veter. J.- 1987.- T. 35, N 5.- P. 65-67.

53. Catteau M.; Krembel C.; Wauters C. Isolement de yersinia enterocolitica de langues // Res. Med. veter, 1983.- T. 159, N 2. P. 89-94.

54. Corbel M.J.; Brewer R.A.; Hunter D. Characterisation of Yersinia enterocolitica strains associated with ovine // Veter. Rec.- 1990.- T. 127, N 21.-P. 526-527.

55. Christensen S.G. Yersinia enterocolitica i levnedsmidler // Dansc. Veter.-Tidsskr.- 1984.- T. 76, N 11. P. 531-533.

56. Czernomysy-Furowicz D.; Furowicz A.J.; Karakulska J.; Nawrotek P.; Peruzynska A.; Kalisinska E. A case of isolation Yersinia enterocolitica from duck muscles // Adv.in agr.Sc. -Szczecin.- 1999.- V. 6, f.l.- P. 19-23.

57. Daris F.; Crevatin E.; Cocevari M. Isolation of Yersinia enterocolitica in pigs reared in the Friuli-Venezia Giulia region // Clin. Veter.- 1986.- T. 109, N4.-P. 303-307.

58. Datta N., Hedges R.W.// J. Gen. Microbiol. 1972. -V.70.

59. Dee W. Bakteriologische Untersuchungen zum Vorkommen und zur Epizootiologie von Yersinia enterocolitica beim Tier // Mh. Veter.-Med, 1986.-T. 41, N3.-S. 99-100.

60. Fukushima H.; Ito Y.; Saito K. Ecological studies of Yersinia enterocolitica. 3. Cross-protection against fecal excretion between Y. enterocolitica serovars 3 and. 5.27 in pigs // Veter. Microbiol.- 1984.- T. 9, N4.-p. 383-389.

61. Fukushima H.; Nakamura R.; Ito Y. Ecological studies of Yersinia enterocolitica. 2. Experimental infection with Y. enterocolitica in pigs // Veter. Microbiol.- 1984.- T. 9, N 4. P. 275-281.

62. Gemsky P., Lazere j., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependence of Yersinia enterocolitica // Infect. Immun. 1980.-V.27. -P. 682-685.

63. Gierczynski R. Evaluation of the usefulness of selected virulence markers for identification of virulent Yersinia enterocolitica strains. II. Genotypic markers assousiated with the pYV plasmid. // Med. Dosw. Mikrobiol. -2000.- V 52,N 1.- P.-35-49.

64. Glunder G.; Hinz K.-H.; Weber A. Zum Vorkommen von Yersinien in Vogeln // Dt. tierarztl. Wschr.- 1986.- T. 93, N 1. S. 27-29.

65. Grant Т., Bennet-Wood V. and Robins-Brown R.M. Identification of Virulense-Assousiated Characteristics in clinical isolates of Y.enterocolitica lacking classical virulence markers .//Infect. And Immun. Mar. -1998.-P. 1113-1120.

66. Hamdy M.; Makeen S.; Fadl H.; Nouman T. Yersinia enterocolitica among sheep carcases // Assiut veter. med. J, -1990.- T. 23, N 45. P. 116119.

67. Harmon M.C.; Swaminathan В.; Forrest J.C. Isolation of Yersinia enterocolitica and related species from porcine samples obtained from abbatoir // J. appl. Bacteriol, -1984.- T. 56, N 3,- P. 421-427.

68. Hathaway S.C.; McKenzie A.I. Meat inspection in New Zealand: Prospects for change // N. Z. veter. J, -1991.- T. 39, N 1. P. 1-7.

69. Hayashidani H.; Kaneko K.; Sakurai K.; Ogawa M. Experimental infection with Yersinia enterocolitica serovar 0:8 in Beagle dogs // Veter.Microbiol.,- 1995.- Vol.47,N 1-2. P. 71-77.

70. Hayashidani H.; Kitahara E.; Ogawa M. Infectivity and pathogenicity of Yersinia enterocolitica serovar 0:8 to wild rodents in Japan // J. Veter.Med.Ser.B.- 1994.- V. 41, N 7/8. P. 504-511.

71. Hefnawy Y.; Moustafa S.; Refai R.S. Occurrence of Yersinia enterocolitica and Listeria monocytogenes in fresh water fish // Assiut veter. med. J, 1989.- T. 21, N 41. P. 135-137.

72. Heim D.; Fehllhaben K.; Scheibner G. Untersuchungen uber das Verhalten von Yersinia enterocolitica in Lebensmitteln tierischer Herkunft // Mh. Veter.-Med.- 1985.- T. 40, N 3. S. 95-98.

73. Hugenberg J. Zur Vorkommen und Nachweis von Yersinia enterocolitica bei Schlachtschweinen in Niedersachsen //Inaug.-Diss., Hannover.- 1999. 106 c.

74. Ikheloa J.O.; Aruna M.B.; Ayoade G.O. Biotypes and sensitivity screening Yersinia enterocolitica as an infective agent in man and swine in Nigeria // Rev.Elevage Med.veter.- 1992.- T. 45, N 2. P. 135-137.

75. Jackova S.; Urgeova E. Nalezy Yersina enterocolitica 03 v ustnej dutine jatocnych osipanych, v mase i v masovych // Biologia. Bratislava.-1992.- R.47,№.9. P. 737-743.

76. Jakubczak A.; Maleszewski J. Przezywalnosc Yersinia enterocolitica w miesie wieprzowym w zaleznosci od wielkosci inoculum i temperatury zamrazania // Med.weter. -1992,- R.48, N 10. S. 466-467.

77. Jakubczak A.; Maleszawski J. Paleczki Yersinia enterocolitica w produktach zwierzecych // Med. Weter.- 1986.- T. 42, N 9.-P. 537-540.

78. Kado C.I., Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids//J.Bacter.- 1981.-V. 145.-P. 1365-1373.

79. Kahalil N.G.; Elyas A.H.; Nashed S.M. Studies on Yersinia enterocolitica in raw milk and ice-cream // Assiut veter.med.J. -1993.- Vol. 29, N57. P. 103-109.

80. Kandolo K., Wauters G. Pyrazinamidase activity in Y.enterocolitica and related organisms // J. clin. Microbiol. 1986. - Vol 21. N6. - P. 980 -982.

81. Kaneuchi C.; Shibata M.; Kawasaki T. Occurrence of Yersinia spp. in migratory birds, ducks, seagulls, and swallows in Japan // Japan. J. veter. Sc.- 1989.- T. 51, N 4. P. 805-808.

82. Kot В.; Jakubczak A. Genotypic markers of Yersinia enterocolitica virulence // Adv.in agr.Sc. -Szczecin, -2002.- N 8/1.- P. 53-58.

83. Kot В.; Wozniak-Kosek A.; Kawiak J.; Bukowski K. Zastosowanie metody PCR do wykrywania plazmidowych markerow chorobotworczosciszczepow Yersinia enterocolitica izolowanych od ludzi i swin // Med.weter. -2001.- R. 57, N 10.- S. 727-730.

84. Kwaga J.; Iversen J.O. Plasmids and outer membrane proteins of Yersinia enterocolitica and related species of swine origin // Veter.Microbiol.- 1993.- Vol.36, N 3/4. P. 205-214.

85. Lotsch G. Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica bei Speisefischen und ausgewahlten Fischprodukten // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41, N 14. S. 496-498.

86. Ludes A.; Weiss R. Zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica bei Schafen // Berl. u. munch, tierarztl. Wschr. -1984.- T. 97, N 6. S. 198-202.

87. Lyxell G.; Bernervall Y.; Danielsson-Tham M.-L. Yersinia enterocolitica: En livsmedelsburen patogen. Svensk // Veter.-Tidn. -1990.-T. 42, N 14. P. 599-602.

88. Maleszewski J.; Jakubczak A. Izolacja Yersinia enterocolitica z tusz trzody chlewnej przy uzyciu dwoch metod // Med. Weter.- 1988.- T. 44, N 12. P. 734-737.

89. Markic Z. Изолацкуа на б актерку ата Yersinia enterocolitica серовар 0:3 од свиньи // Макед.ветер.Прегл. -1993,- Г.22,бр.1/2. С. 13-16.

90. Markic Z. Nalazi bakterije yersinia enterocolitica serotipa 0:9 u svinja // Veter. Glasnik.- 1986.- T. 40, N 12. P. 893-896.

91. Myers L.L.; Firehammer B.D.; Border M.M.; Shoop D.S. Prevalence of enteric pathogens in the feces of healthy beef calves // Am. J. veter. Res, 1984,- T. 45. N 8. P. 1544-1548.

92. Mickova V.; Konecny S. Frekvence nalezu Yersinia enterocolitica u jatecne porazenych // Veterinarstvi.- 1987.- T. 37. N 7. P. 308-309.

93. Mickova V. Vyskyt a detekce Yersinia enterocolitica a ostatnich yersinii z potravin // Veterinarstvi.- 1990.- T. 40. N 6, P. 276-277.

94. Nakajama H., Inone M., Mori T. et al. Detection and identification of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica by ane imoroved PCR method. //J. Clin. Microbiol. 1992. - v. 30, - №9. - P. 2484-86.

95. Nattermann H.; Dedek J.; Loepelmann H. Serologische Untersuchungen zum Vorkommen von Yersinia enterocolitica beim Schwarzwild // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41. N 16.- S. 565-567.

96. Nattermann H.; Horsch F.; Dee W.; Ortmann J. Die Yersinia-enterocolitica-Infektion bei landwirtschaftlichen Nutztieren // Mh. Veter.-Med.- 1986.- T. 41. N 1. P. 23-26.

97. Nattermann H.; Horsch F.; Seeger M. Epizootiologie der Yersinia-enterocolitica-Infektion in einem Schweinebestand // Mh. Veter.-Med.-1985.-T. 40. N 11.-S. 366-370.

98. Neubauer H.; Sprague L.D.; Hensel A. et al. Specific detection of plasmid bearing Yersinia isolated by PCR.// Clin. Lab. 2000. - V. 46. - P. 583-587.

99. Nielsen G.H.; Aalbaek В.; Jogensen M.M.; Hoorfar J. Identifikation af Yersinia enterocolitica ved hjaelp af automatiseret PCR // Dansk Veter.-Tidsskr.- 2001.- Arg.84,N 6. S. 6-11.

100. Nissen H.; Maugesten Т.; Lea P. Survival and growth of Escherichia coli 0157:H7, Yersinia enterocolitica and Salmonella enteritidis on decontaminated and untreated meat // Meat Sc.- 2001.- Vol.57, N 3. P. 291-298.

101. Novak S.; Polaharova A. Depistaz Yersinia enterocolitica u osipanych v juznej casti Stredoslovenskeho regionu //Veterinarstvi.- 1993,-R.43,c.5. S. 165-166.

102. Nwosuh E.N.; Adensiyun A.A. Prevalence of Yersinia enterocolitica infection in Nigerian chickens: cultural and serologic studies // Rev. Elevage Med. Veter.- 1987.- T. 40. N 3. P. 239-241.

103. Odinot P.,Meis F.,Gurgs J. et al. Two-step polymerase chain reaction assay for detection of Yersinia species in general and of pathogenic Y. enterocolitica strains specifically.// Int. I. Infec. Dis.-1997. -v.l, №4. P. 206-211.

104. Okoroafor E.; Adesiyun A.A.; Agbonlahor D.E. Prevalence and characteristics of Yersinia enterocolitica strains isolated from pigs in Jos, Nigeria//Brit, veter. J.- 1988.-T. 144, N2.-P. 131-138.

105. Platt-Samoraj A.; Szweda W.; Siwicki A.K. Wplyw zakazen Yersinia enterocolitica psow i kotow na wystepowanie jersiniozy u czlowieka // Med.weter. 2000.- R.56,N 6. - S. 379-381.

106. Portnoy D., Moseley S., Falkow S. Characterization of plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis //Infect. Immun. -1981. -V. 31. -P. 775-782.

107. Павлов А., Филиппов В., Хвърчилков В., Данев Й. Содержание Y.enterocolitica в молоке и пробах из прямой кишки коров. (НРБ)//Ветер. С6.-1988-Т.6, №2.-С. 47-49.

108. Saad N.M.; Moustafa S. Prevalence of yersinia enterocolitica in raw milk in Assiut city // Assiut veter. med. J.- 1989.- T. 22, N 43. P. 95-99.

109. Schiemann D.A. The pathogenicity of Yersinia enterocolitica for piglets // Canad. J. veter. Res.- 1988.- T. 52, N 3. P. 325-330.

110. Schiemann D.A. Yersinia enterocolitica in milk and dairy products // J. Dairy Sc.- 1987.- T. 70, N 2. P. 383-391.

111. Shayegani M.; Stone W.B.; DeForge I. Yersinia enterocolitica and related species isolated from wildlife in New York state // Appl. environm. Microbiol.- 1986.- T. 52, N 3. P. 420-424.

112. Singh S.; Sharma S.N.; Singh N.P. Effect of Yersinia enterocolitica infection on fertility of mice // Indian J.anim.- 1994.- Vol.64, N 4. P. 346347.

113. Sinha R.P.; Chauhan H.V.S.; Zahinuddin M. Comparative studies on dinitrochlorobenzene, johnin and tuberculin tests for diagnosis ofparatuberculosis in goats // Indian J. anim. Sc.- 1985.- T. 55, N 9. P. 759761.

114. Sinha A.K.; Narayan K.G.; Singh D.K. Evidence of autotrophic growth of Yersinia enterocolitica //Indian J. anim. Sc.- 1988.- T. 58, N 10. -P. 1138-1140.

115. Славчев Г. Проучвания на термостабилен ентеротоксин от щамове на Y. enterocolitica серотип 0:3 // Ветер. Сб.- 1990.- Т. 88, N 1. -С. 43-47.

116. Slee K.J.; Button С. Enteritis in sheep and goats due to Yersinia enterocolitica infection // Austral, veter. J.- 1990.- T. 67, N 11. P. 396-398.

117. Smego R.A., Frean J., Koornhof H. J. Yersiniosis: microbiological and clinicoepidemiological aspects of plaque and non- plaque Yersinia infections. //Eur J Clin Microbiol Infect Dis.- 1999.-№ 18.- P. 1-15.

118. Стефанов И.; Кунев Ж. Изолиране на Yersinia enterocolitica и подобните видове от редовно заклани свине // Ветер. Сб.- 1990.- Т. 88, N 5/6. С. 43-46.

119. Стефанов И. Выделение Yersinia spp из миндалин и языков убойных свиней. //Ветер. Сб. -1989.-С. 41-43.

120. Upmann М., Paulsen P., Jams С., Smulders F. Die Mikrobiologie von Kalte behandeltem Fleisch // Fleischwirtschaft.- 2000. -№ 8. -C. 90-96.

121. Verma N.K.; Misra D.S. Isolation of enterotoxigenic Yersinia enterocolitica from pigs in Uttar Pradesh // Indian J. anim. Sc.- 1984.- T. 54, N 7.- P. 659-662.

122. Vokoun P. Depistaz Yersinia enterocolitica 0:3 u psu a kocek // Veterinarstvi.- 1985.- T. 35, N 12. P. 550-551.

123. Василев П. Иерсиниа ентероколитика в гърлени секрети на свине //Ветер. Сб.- 1986.- Т. 84, N 2. Р. 30-31.

124. Wozniak-Kosek A.; Kot В.; Jakubczak A.; Grzybowski J. Zastosowanie metody PCR do identyfikacji markerow chorobotworczosciszczepow Yersinia enterocolitica izolowanych od ludzi i swin // Med.weter.-2001.- R.57,N 3. S. 183-186.

125. Weagant S., Jagow J., Jinneman K. Development of digoxigenin-labelled PCR-amplicon probes for use in the use in the detection and identification of enteropathogenic from food.// J. Food Prot. -1999.-v.62,N5.- P.438-443.

126. Yanguela Martinez J.; Herrera Marteache A.; Rivas Pala Т.; Brault J. Isolement de Yersinia enterocolitica de langues de pore et de carcasses de poulet // Microbiol. Aliments Nutrit.- 1987.- T. 5, N 4. P. 339-343.

127. Zheng X.B. Isolation of Yersinia enterocolitica from the faeces of diarrhoeic swine // J. appl. Bacteriol.- 1987.- T. 62, N 6. P. 521-525.

128. Zowghi E.; Ebadi A. Isolation and identification of Yersinia enterocolitica serotype 0:9 in cattle in Iran // Arch. Inst. Razi.- 1986.- T. 36/37. P. 79-83.

Информация о работе

Спиряхина, Татьяна Владиславовна
кандидата биологических наук
Саратов, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы