Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов Yersinia enterocolitica и разработка на их основе технологии индикации и идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов Yersinia enterocolitica и разработка на их основе технологии индикации и идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза"

На правах рукописи

Коритняк Богдан Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ YERSINIA ENTEROCOUT1CA И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ ТЕХНОЛОГИИ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КИШЕЧНОГО ИЕРСИНИОЗА.

03.00.07 микробиология 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени г кандидата биологических наук

Саратов-2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат ветеринарных наук, профессор Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович доктор медицинских наук Плотников Олег Петрович Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение центр охраны здоровья животных» (ФГУВНИИЗЗ) г

«Федеральный . Москва.

Защита диссертации состоится «17» ноября 2005 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220 061 04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан «13» октября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Л.В.Карпунина

200G-4 ¡1018

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Заболевания, которые в настоящее время называют кишечными иерсиниозами, лет 30 - 40 назад считались редкими и не привлекали к себе внимания специалистов.

По данным Российских исследователей, в нашей стране заболевания вызываемые бактериями вида Yersinia enterocolitica занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллбза (Черкасский, Подунова, Акулова, 1995).

Несмотря на большой интерес, проявляемый к данному возбудителю, в России до сих пор не ясна картина заболеваемости, структура и динамика (Смирнов, Ценева, 1992). Отдельные серо и биовары У. enterocolitica, являющимися документированными этиологическими агентами, по прежнему находятся в 4-й группе «условно» патогенных бактерий. Это является основной из причин унифицированного подхода к их индикации и идентификации в условиях клиники и эпидемиологической практики (Волкова, Степанова, Ценева и соавт., 2000).

Широкое распространение иерсиниоза, многообразие клиники и трудоёмкость в постановке диагноза сделали актуальной проблему кишечного иерсиниоза в мировом масштабе. Различные методы индикации и дифференциации У. enterocolitica не идеальны и обладают некоторыми особенностями, поэтому разработка новых методов позволит исследователям более эффективно изучать данную проблему. Фаготипирование, как один из методов дифференциации и идентификации, позволяет быстро и точно определить принадлежность исследуемой бактерии не только к определённому виду, но и к разным фаготипам в пределах вида.

Цель исследования - разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации бактерий вида У. enterocolitica с помощью специфических бактериофагов. Для достижения поставленной цели предусматривается решение следующих задач: 1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий вида У. enterocolitica. 2. Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов. 3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикам. 4. Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида У. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата. 5. Разработать схему идентификации У enterocolitica с помощью бактериофагов. 6. Разработать технологические

параметры изготовления биопрепарата для фагоди

Научная новизна: Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида У еп1егосо1Шса, выделенных от сельскохозяйственных животных. Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата и схемы фагодиагностики.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении бактерий вида У етегосоШса. Выделенный и изученный штамм бактериофага депонирован в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признан перспективным и рекомендован для изготовления диагностических препаратов. Разработана "Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторного бактериофага У. еп1егосо1Шса У/9 УГСХА". Для врачей бактериологов предложены "Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий вида У еМегосоИНса в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды" и "Методические рекомендации по выделению и фагоидентификааии бактерий вида У етегосоШса из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностического бактериофага У/9 УГСХА, которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии.

Положения выносимые на защиту: Схема выделения бактериофагов бактерий вида У. емегосо1Шса Биологические свойства выделенных фагов бактерий вида У етегосоНпса Конструирование из отобранного фага нового биопрепарата - диагностикума. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий вида У еыегосоШка в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата. Разработка схемы идентификации У ешгосо1Шса с помощью специфического бактериофага. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий вида У еп!егосо1Шса.

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Апробация работы. Результаты основных исследований подтверждны в ВГНКИ (от 23.04.04г.), УГСХА (от 21.09.04г.); актом производственных испытаний в Сергиевской районной лаборатории Самарской области (от 4.0б.05г.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в городе Ульяновске (2000, 2003, 2004,

2005), Самаре (2005).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (292 источника, в том числе 161 отечественных) Работа иллюстрирована 32 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой и приложениями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы

Питательные среды. Для бактериологического исследования использовали питательные среды: мясолептонный бульон (НПО "Питательные среды", г. Махачкала); мясо-пептонный агар (НПО "Питательные среды", г. Махачкала), 0,3 %-ный, 0,7 %-ный, 1,5 % -ный; среда с бром-тимоловым синим (ГНЦ прикладной микробиологии, г Оболенск); среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г Оболенск); висмут-сульфит агар ("Биотехновация" . г Москва); среда Серова ГД (пропись по методическим рекомендациям УлГУ, 1996); среда Симонса (НИИ питательных сред, г. Махачкала); среда Кпиглера (НИИ питательных сред, г Махачкала); среды Гисса с индикатором BP (НПО "Питательные среды'" г Махачкала); натрий хлористый (ГОСТ 4233-77); мочевина (ГОСТ 6691-75); мертиолат натрия (Sern); физиологический раствор, pH 7,2-7,6. Штаммы бактерий. В работе были использованы как гомологичные, так и гетерологичные штаммы бактерий. В качестве гомологичных бактерий использовали: 38 штаммов бактерии вида Y. enterocolitica полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА и выделеные нами из объектов окружающей среды и патологического материала. Культуры бактерий обладали типичными для данного вида культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, выделены из разных источников. Использовали 101 штамм бактерий гетерологичных родов и семейств: Proteus, Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas aureginoia, Bacillus cereus, E.coli, Enterobacter, Citrobacter, Y pseudotuberculosis получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА; 9 бактериофагов бактерий вида У enterocolitica, выделенные нами из сточных вод животноводческих хозяйств Объекты внешней среды. В качестве объектов внешней среды использовали: водопроводную воду, фекалии животных и комбикорм, материал от больных и погибших животных, мясо. Оборудование: холодильники бытовые; ультратермостаты УТ-15У4,2; термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, лупа бинокулярная МБС-9; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия);

бактериальные фильтры L-3 свечи Шамберлана; центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови "Изольда"; с ртутной лампой ДРБ8-1; колбы мерные; пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3; флаконы ёмкостью 50, 100 см3; стёкла покровные, стёкла предметные; чашки Петри; пробирки; стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток; термометры ртутные

Методы

Методы. В работе использовались методы для выделения бактерий вида У enterocolitica, приведённые в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утверждёнными Департаментом ветеринарии МСХиП II октября 1999 года. Из культур выделяли бактериофаги методами, предложенными С. Лурия, Д Дарнел (1970), И.П. Ревенко (1978), В.Я. Ганюшкиным (1988). Фаги выделяли из объектов окружающей среды методом, предложенным Адельсоном (1962), В Я Ганюшкиным (1988). Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным М Adams (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), A.C. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвшш (1968), И.М. Габриловичем (1973), В.Я. Ганюшкиным (1988). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий вида У enterocolitica в объектах окружающей среды, кормах и пищевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988). Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили осаждением вирусных частиц в режиме низкоскоросгного центрифугирования (Пономорёв, Андреева, Артамонова, 2002)

Для статистической обработки результатов исследования использовали общепринятые статистические методы (Ашмарин, Воробьев, 1962; Бейли, 1962)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Поиск бактериофагов бактерий вида К enterocolitica и селекция клонов фагов. Для выполнения цели диссертационных исследований необходимо было первоначально выделить и изучить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги бактерий вида У enterocolitica из имеющихся у нас штаммов бактерий вида У enterocolitica. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).

Из имеющихся у нас культур Y enterocolitica мы пробовали выделить бактериофаги различными методами. Все штаммы, изученные нами, исследовались как индикаторные и как "лизогенные".

В первой серии опытов использовали методику, предложенную С Лурия, Д. Дарнелл (1970), для выделения бактериофагов энтеробактерий из бактерий вида У enterocolitica без воздействия на них индуцирующего фактора. Результаты опыта свидетельствуют, что из культур бактерий вида Y enterocolitica в опытах по выделению бактериофагов без воздействия на них индуцирующего фактора не приводило к появлению свободного фага

Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как "лизогенные", воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Y enterocolitica методом агаровых слоев предложенного А. Грациа (Гольдфарб, 1961) Установлено, что при действии индуцирующего фактора на бактерии вида У. enterocolitica в наших опытах не приводами к появлению зон лизиса. Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления перехода профага в свободный фаг у имеющихся штаммов бактерий по данным схемам. Дальнейшие исследования были посвящены выделению бактериофагов Y enterocolitica из объектов внешней среды (Андельсон, 1958; Ганюшкин, 1988) Для проведения исследований, брали сточные воды из общественных туалетов, свиноводческих хозяйств и молочно-товарных ферм в различных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей, а также на Ульяновском мясокомбинате. Селекцию выделенных бактериофагов и повышение их литической активности проводили с помощью пассирования фага на индикаторной культуре с периодической отвивкой типичных негативных колоний по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). В результате проведённых опытов, нами были выделены и изолированы 9 штаммов фагов бактерий вида У enterocolitica. Из выделенных фагов, мы отобрали 3 штамма фагов, обладавших стабильными биологическими. Анализируя свойства данных бактерифагов, мы отобрали бактериофаг Y/9 УГСХА, который лизировал 78,6% бактерий вида Y enterocolitica и был специфичен только в отношении данного вида бактерий.

Характеристика выделенных фагов бактерий вида Y. enterocolitica Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным М. Адамсом (1961), A.C. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвили (1968), И.М. Габриловичем (1973).

а) Морфология негативных колоний. Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые изучаемыми

бактериофагами, разделены нами на два типа. К первому типу относятся фаги- Y/9 УГСХА, который образует округлые колонии с ровными краями, в диаметре 2-3 мм, прозрачные, без вторичного роста, и фаг Y/4 УГСХА, который образует колонии с ровными краями, прозрачные, без вторичного роста и без зоны неполного лизиса, в диаметре от 1 до 2 мм Ко второму типу относится фаг Y/3 УГСХА, который образует колонии округлые, с ровными краями, в диаметре 20-30 мм, с зоной неполного лизиса, ширина зоны 0,5-1мм.

б) Литическая активность выделенных бактериофагов бактерий рода, Литическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методу Аппельмана и Грация (Гольдфарб, 1961). Литическая активности селекционированных бактериофагов Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/3 УГСХА по методу Аппельмана составила' Ю"10,10'8, 10'8; по Грация составил' lxlO10,4х109,2x109 фаговых корпускул в 1 мл.

в) Спектр литической активности изученных бактериофагов К enterocolitica. Спектр литической активности является характерной особенностью штаммов фага, и его используют для их идентификации. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Адаме, 1961; Гатошкин, 1988)

Для изучения спектра литической активности трёх селекционированных фагов (Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА, Y/3 УГСХА) мы использовали 12 референс и 2 полевых пггаммев 7 иерсиний Опыты показали, что изученные фаги характеризуются различным спектром литической активности Наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладает штамм фага Y/9 УГСХА, который лизировал 11 из имеющихся у нас 14 штаммов бактерий рода Y enterocolitica (78,6%). Фаг Y/4 УГСХА лизировал 8 (57,1%) и Y/3 УГСХА лизировал 2 (14,3%) из имеющихся у нас 14 штаммов бактерий рода У enterocolitica Поэтому фаг Y/9 УГСХА был выбран для конструирования диагностического препарата.

г) Специфичность действия исследуемых бактериофагов бактерий рода К enterocolitica. Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируемых бактерий. Определение видовой специфичности 3-х изучаемых бактериофагов бактерий вида У enterocolitica (Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА,Y/3 УГСХА) проводили на агаровых средах путём нанесения фага на газон культуры. В результате изучения специфичности трех бактериофагов У enterocolitica (Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА,Y/3 УГСХА) по отношению к представителям других семейств и родов использовали: Proteus 6 штаммов, Morganella 6 штаммов, Klebssiella 4 штамма, Salmonella 6 штаммов, Staphylococcus 4 штамма, Streptococcus 2

штамма, Pseudomonas aureginosa 4 штамма, Bacillus cereus 3 штамма, Ecoli 46 штаммов, Enterobacter 4 штамма, Citrobacter 13 штаммов, Y pseudotuberculosis 6. Установлено, что данные фаги не лизировали ни одну из испытуемых культур других видов бактерий На основании полученных результатов можно сделать вывод, о том, что селекционированные фаги являются специфичными по отношению к бактериям рода и не активны к представителям других видов бактерий.

д) Температурная устойчивость выделенных фагов бактерий вида К enterocolitica

Степень устойчивости бактериофагов и клеточных хозяев к инактивирующим факторам

физического воздействия имеет теоретическое и практическое значение, поэтому при изучении биоло1ических свойств фагов определение их чувствительности к таким агентам является обязательным Были проведены исследования по изучению термочувствительности вышеперечисленных объектов по методикам, предложенным Д.М Гольдфарбом (1961); М. Адамсом (1961); ИМ Габриловичем (1992). В результате исследований было установлено, что селекционированные нами фаги обладали разной температурной устойчивостью Полученные данные свидетельствуют о выраженной устойчивости фага Y/4 УГСХА к воздействию высокой температуры до 70° С. При температуре выше 73° С фаг Y/4 УГСХА терял свою физиологическую активность и погибал при температуре выше 89° С. Бактериофаги Y/9 УГСХА, Y/3 УГСХА умеренно устойчивы к воздействию температурного фактора и показали стабильные результаты только при 50° С.

е) Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа

Бактериофаги обычно устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому

данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий Определение чувствительности бактериофагов и бактерий проводили путем обработки фаговой суспензии и бульонных культур иерсиний хлороформом в соотношении 110 при постоянном встряхивании.

Обработка бактерий индикаторных штаммов Y enterocolitica 09, Y enterocolitica 08 в течение 15 минут хлороформом приводила к их полной инактивации. Результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что селекционированные бактериофаги Y/9 УГСХА, Y/ЗУГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа В то время как бактериофаг Y/4 УГСХА терял свою активность при воздействии хлороформа на фаголизаты в течение 60 минут, и является умеренно устойчивым к действию хлороформа.

Определение температурных параметров культивирования выделенных бактериофагов

а) Температурные показатели культивирования выделенных бактериофагов

Определение температурных условий культивирования фагов бактерий вида У еШегоЫШса: У/3 УГСХА, У/4 УГСХА, У/9 УГСХА проводили по методикам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (1961); М. Адамсом (19561); И.М. Габриловичем (1992). Результаты исследований свидетельствуют о том, что оптимальная температура культивирования фагов бактерий вида У еМегосоШка: У/3 УГСХА, У/4 УГСХА, У/9 УГСХА - 37° С.

б) Количественное соотношение фага и культуры при культивировании фагов бактерий вида К еМетосоИйса. При исследовании условий культивирования выделенных фагов бактерий вида У еШегосоИНса: У/3 УГСХА, У/4 УГСХА, У/9 УГСХА необходимо было выяснить оптимальное количественное соотношение фага и индикаторных бактерий вида У епгегосо1Шса, для производства диагностического препарата. В результате проведенных исследований было установлено, что для фагов У. еЫетосоИИса У/9 УГСХА (титр 1x1010 фаговых корпускул в 1 мл), У/3 УГСХА (титр 2x109 фаговых корпускул в 1 мл) оптимальным соотношением бактериофага 0,2 мл фага х 1,0 мл (800000 м.кл /мл) индикаторной культуры, а для фага У. еШегосоИНса У/4 УГСХА (ттр 4* 109 фаговых корпускул в 1 мл) 0,2 мл фага х 5,0 мл (800000 м.кл./мл) индикаторной культуры.

2.4. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий вида У. еШегосоИНса

Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к бактериям вида У еШегосоНПса мы разработали схему ускоренной идентификации этих микроорганизмов. Результаты исследований представлены на схеме (рис 1).

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фага на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также образование негативных колоний фага. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствии лизиса в контроле В результате проведенных исследований из проб сточных вод были выделены штаммы кишечных иерсиний, о чем свидетельствовали результаты изучения их биологических свойств Предлагаемая нами схема позволяет идентифицировать У еШегосоНПса за 48 часов (2 суток). Срок бактериологического исследования по схеме изложенной в «Методических указаниях по бактериологической

диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями» составил 92 часа (4 суток) при большей затрате посуды и реактивов I И

Итого: 48 часов (2 суток) Итого: 92 часа (4 суток)

Рис 1. Схема ускоренной идентификации бактерий вида У еп1егосо1Шса с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой бактериологического исследования, изложенной в "Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями (II)

Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое

значение

Определение параметров постановки РНФ и разработку количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методике, предложенной В.Д Тимаковым и Д.М.Голтдфарбом (1962), Проведены эксперименты с использованием МГТБ. контаминированного 18 часовыми индикаторными культурами Y enterocolitica 09 от 10' до 105 м к /мл, и с бактериофагом Y/9 УГСХА в рабочем разведении, содержащем не более 104 фаговых корпускул в миллилитре. В качестве контроля использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, образовавшихся на плотной питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили согласно таблицы 1. В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РНФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения. По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах, при контаминации МПБ бактериями вида Y enterocolitica в концентрации 103 м.к/мл для фага Y/9 УГСХА.

Таблица 1

Оценка реакции нарастания титра фага (РНФ)

Увеличение количества корпускул индикаторного фага в опытной пробе (пробирка №1) в отношении к количеству корпускул в контроле (пробирка №3) Оценка

Увеличение в 2,5 раза Увеличение от 3 до 5 раз Увеличение свыше 5 раз Увеличение более 10 раз Сомнительная Слабо положительная Положительная Резко положительная

Установление оптимального времени, обеспечивающее наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями при постановке РНФ с объектами исследования (сточные воды, комбикорм, мясо, фекалии)

Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим,

концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест объектов использовали сточную воду, комбикорм, мясо, фекалии, контаминированные бактериями вида У. enterocolitica, оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров. Оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5,16, 24 часов при температуре 37° С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37° С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37° С.

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 10, 16, 24 часов

при температуре 37° С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 7 часов при температуре 37° С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37° С.

помещали в термостат на 12-16 часов. Изучение чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала нами проводилось при инкубации контаминированных бактериями вида У. enterocolitica МПБ при температуре 37°С в течение 5, 10, 16 и 24 часов. Бактериологическим методом обнаруживались бактерии вида У enterocolitica в концентрации 104 м.к/мл, при этом затрачивалось 96 часов. Результаты этих исследований приведены в таблицах 2,3.

Установлено, что результаты исследования при подращивании зависят от вида исследуемого материала:

- при исследовании проб сточных вод и комбикорма: в течение 5-и часов фаг Y/9 УГСХА позволяет обнаружить У enterocolitica с помощью РНФ в концентрации 10J м.к./мл в исследуемых образцах (на опыт затрачено 24 часа);

- при исследовании проб фекалий и мяса в течение 16 часов фаг Y/9 УГСХА с помощью РНФ позволяет обнаружить бактерии вида У enterocolitica, при содержании 103 м.к/мл (на опыт затрачено 35 часов).

- бактериологическим методом это же количество кишечных иерсиний обнаружить не удавалось.

Таблица 2

Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала (вода, комбикорм), контаминированного У еШегосо1Шса (У/9 УГСХА)

№ п.п. Варианты исследований Минимальное количество бактерий, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований (в часах)

Длительность подращивания исследуемого материала РНФ бактериологи ческий метод РНФ бактериолог ический метод

Часы

1. 5 103 10* 24 96

2. 10 10' н.о. 27 н.о.

3. 16 но. 35 н.о.

4. 24 10' н.о. 42 н.о.

Примечание: н.о - не обнаружено.

Таблица 3

Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала (фекалии, мясо), контаминированного У еглегосоШса (У/9 УГСХА)

№ п.п. Варианты исследований Минимальное количество бактерий, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований (в часах)

Длительность подращивания исследуемого материала РНФ бактериологиче ский метод РНФ бактериологи чсский метод

Часы

1. 5 105 104 24 96

2. 10 10* н.о. 29 н.о.

3. 16 10^ н.о. 35 н.о.

4. 24 ю2 н.о. 44 н.о.

Примечание: н.о. - не обнаружено.

Во втором варианте опыта объекты исследования (сточные воды, комбикорм, мясо, фекалии), контаминированные бактериями рода У еп1егосо1Шса от 101 до 1х105 м.к./мл не подращивали, а сразу же вносили в пробирки Результаты исследования приведены в таблицах 4,5.

Установлено, что результаты исследования при инкубировании исследуемого материала с бактериофагом без подращивания варьируют в зависимости от вида исследуемого материала- при исследовании проб сточных вод и комбикорма- в течение 7-и часов фаг У/9 УГСХА позволяет обнаружить У еМегосоШса с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл в исследуемых образцах (на опыт затрачено 19 часов);

- при исследовании проб фекалий и мяса в течение 16 часов фаг У/9 УГСХА с помощью РНФ позволяет обнаружить бактерии вида У еШегосоИНса, при содержании 103 м.к/мл (на опыт затрачено 35 часов)

- бактериологическим методом это же количество кишечных иерсиний обнаружить не удавалось.

Таблица 4

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубированияисследуемого

материала (сточная вода, комбикорм), контаминированного У еыегосо1шса (У/9 УГСХА)

№ п.п. Варианты исследований Минимальное количество бактерий, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований (в часах)

Длительность подращивания исследуемого материала РНФ бактериологи ческии метод РНФ бактериологи ческий метод

Часы

1. 7 10' 104 19 96

2. 10 10' н.о. 22 н.о.

2. 16 10* н.о. 28 н.о.

3. 24 10* н.о. 36 н.о.

Примечание: н.о. - не обнаружено.

Таблица 5

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала (фекалии, мясо) У. етегосоИЧса (У/9 УГСХА)

Минимальное количество Время, затраченное на

Варианты исследований бактерий, обнаруживаемое проведение

№ с помощью исследований (в часах)

п.п. Длительность инкубирования бактериологи бактериолог

исследуемого материала РНФ ческий РНФ ическии

Часы метод метод

1. 7 101 104 19 96

2. 10 104 н.о. 22 н.о.

2 16 10* н.о 28 н.о.

3 24 ю2 н.о. 36 н.о.

Примечание: н.о. - не обнаружено.

На основании полученных данных, считаем, что наиболее эффективными являются режимы РНФ для проб воды и комбикорма 7 часовой, а для проб фекалий и мяса в течение 16 часов, экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается - 19 и 35 часов соответственно, поэтому данные режимы используем в

дальнейших исследованиях По результатам исследования метод подращивания по чувствительности не уступает методу экспозиции исследуемого материала с фагом в течение 10, 16, 24 часов, но недостаток в том, что при этом затрачивается больше времени.

Использование РНФ для обнаружения бактерий вида К еШегосоШса в объектах

внешней среды

В последние годы исследователи уделяют большое внимание проблеме обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды: в воде, кормах и фекалиях. Эти субстраты, подвергающиеся постоянному загрязнению выделениями больных животных и людей, в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношениях заслуживают особого внимания Поэтому разработка и внедрение в практику более простых и надежных методов обнаружения данного возбудителя в объектах внешней среды не теряют своей актуальности.

Дчя определения возможности использования РНФ для обнаружения бактерий вида У еыегосоНвса в объектах внешней среды исследовали образцы воды, комбикорма и фекалий

Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами объектов ветеринарного надзора (сточные воды, комбикорм, фекалии, мясо)

Для определения возможности использования РНФ для обнаружения бактерий вида У еЫегосоШка в объектах внешней среды исследовали образцы сточных вод, комбикорма и фекалий.

Пробы сточных вод в объеме 10 мл вносили в колбы и контаминировали У еЫегосоННса серовариантом 09 168-033 в концентрации 105, 104; I О3; 102, 101 мк/мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл сточной воды. Брали колбу с пробой воды, не контаминированной бактериями вида У егйегосоШса. Реакцию нарастания титра фага проводили по методике В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), В.Я. Ганюшкина (1988). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 1. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фага более чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток У еп!егосоШка в 1 мл водопроводной воды для фагов У/9 УГСХА (на опыт затрачено 24 часа).

Пробы комбикорма, весом 5-10 г вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторную культуру У еШегосоНИса серовариант 09 168-033 в концентрации 105; 104, 103; 102, 10' м.к. в 1 мл и брали колбы с пробой комбикорма не контаминированных бактериями

вида У еп1егосоШса Реакцию нарастания титра фага проводили по методике предложенной В.Д. Тимаковым и ДМ Гольдфарбом (1962), В.Я Ганюшкиным (1988) Учет результатов проводили согласно таблицы 1 Из результатов проведенных опытов видно, что увеличение титра фагов У/9 УГСХА более чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток У еп1егосо1Шса в 1 г комбикорма Таким образом, в комбикорме, коитаминированном бактериями вида У. еШегосоШка, с помощью РНФ данные бактерии обнаруживаются в количестве Ю'м.к/г без выделения чистой культуры, при наличии посторонней микрофлоры На обнаружение возбудителя - бактерий вида У еп1егосо1Шса, в комбикорме с помощью РНФ затрачивается не более 24 часов.

Пробы фекалий весом 5-10 г вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторную культуру У еМегосоНИса серовариант 09 168-033 в концентрации 105; 10"; 103; 102; 10' м к 'мл и колбы с пробой фекалий, не контаминированных бактериями вида У еМегосоШка Реакцию нарастания титра фага проводили по методике предложенной ВД Тимаковым и ДМ Гольдфарбом (1962), В Я. Ганюшкиным (1988). Учет результатов проводили согласно вышеизложенной схемы в таблице 1. Из результатов проведенных опытов видно, что увеличение титра фагов У/9 УГСХА более чем в 5 раза произошло при концентрации Ю4 микробных клеток У. еМегосоШса в 1 г фекалий (на опыт затрачено 35 часов)

Кусочки свинины массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке и вносили в колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. В опытные колбы вносили индикаторную У еЫегосо1Шса серовариант 09 168-033 в концентрации 105; 104, 103; 102, 101 м.к./мл и брали колбы с пробой мяса, не контаминированного бактериями вида У ешегосоНИса. Реакцию нарастания титра фага проводили по методике предложенной ВД Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962), В Я. Ганюшкиным (1988). Учет результатов проводили согласно таблицы 1. Из результатов проведенных опытов видно, что увеличение титра фага У/9 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток бактерий в 1 г мяса (на опыт затрачено 35 часов).

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства, нами были проведены исследования сточных вод хозяйств Самарской области, по выделению бактерий вида У еп!егосо1тса, бактериологическим методом и с помощью реакции нарастания титра фага. Результаты исследований отражены в таблице 6, видно, что в результате проведенных исследований сорока проб сточных вод из четырех хозяйств удалось выделить бактерии вида У ешегосоИНса: без холодового обогащения из 3 проб (17,5 %), на исследование

бактерии вида У егйегосоШса• без холодового обогащения из 3 проб (17,5 %), на исследование затрачивалось 96 часов; методом холодового обогащения из 12 проб (30%), на исследование затрачено 16 суток. При исследовании материала в РНФ с использованием иерсиниозного фага У/9 УГСХА положительная реакция была в 24 (60 %) пробах сточных вод Время индикации при этом составило 24-35 часов.

Таблица 6

Результаты исследования проб сточных вод хозяйств Самарской области

Исследовано проб Количество проб, в которых обнаружены У enterocolitica

Бактериологический метод РНФ

Без холодового обогащения Методом холодового обогащения

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

40 3 17,5 12 30 24 60

ВЫВОДЫ

1. Ил объектов внешней среды было выделено 9 изолятов фагов, активных по отношению к бактериям вида У. enterocolitica.

2 Три селекционированных штамма фагов Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА Y/3 УГСХА имели титр 10"8 - Ю"10 по Аппельману и 3,0х109 - 1хЮ10 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий вида У enterocolitica и не проявляли активности в отношении представителей родов Escherichia, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли логическую активность в течение 12 месяцев, Y/9 УГСХА, Y/3 УГСХА были устойчивы к нагреванию до 50°С, a Y/4 УГСХА до 70°С в течение 30 минут Фаги Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА Y/3 УГСХА были устойчивы к действию 10% раствора хлороформа в течение 45 минут.

3. Для индикации и идентификации бактериям вида У enterocolitica был предложен фаг Y/9 УГСХА, который имел широкий спектр литической активности по отношению к штаммам данных бактерий, равный 78,6%.

4 Разработана схема идентификации У enterocolitica с помощью фага Y/9 УГСХА, которая позволяет идентифицировать бактерии вида У. enterocolitica за 48 часов

5. Разработана схема ускоренной индикации бактерий бактерий вида У enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить У. enterocolitica за 19 - 35 часов.

6. Разработана НТД по изготовлению и контролю бактериофага для индикации и идентификация бактерий вида У еп!егосо1Шса

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен штамм бактериофага Y/9 УГСХА, активный в отношении бактерий вида У enterocolitica, обладающий строгой специфичностью, широким спектром логической активности. Фаг депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага Y/9 УГСХА - Phagum Yersinia enterocolitica Y/9 УГСХА ДЕП от 23.04.04г.)

2. Идентификацию бактерий вида У. enterocolitica предлагаем проводить с помощью диагностического фага, согласно «Методическим рекомендациям по выделению идентификации бактерий вида У enterocolitica из патологического материала, пишевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностического бактериофага Y/9 УГСХА».

3 Индикацию бактерий вида У enterocolitica в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением индикаторного бактериофага Y/9 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ бактерий вида У enterocolitica в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды".

4 Изготовление и контроль диагностического набора бактериофага необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю бактериофага вида Y enterocolitica, Y/9 УГСХА».

Спирсок работ опубликованных по теме диссертации

1 Коритняк Б.М, Кожаева Д.К., Померанцев Д.А. Определение пороговых показателей термической инактивации бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: Сборник научных трудов. - Ульяновск. 2000. - С. 32.

2. Коритняк Б.М., Васильев Д А., Золотухин С.Н. Сравнительное изучение различных методов выделения фагов возбудителя кишечного иерсиниоза // Инновационные технологии в аграрном образовании, науки и АПК России часть И: Материалы

Всероссийской научно-производственной конференции. - Ульяновск, 2003. - С. 231233.

3. Коритняк БМ., Занозина КВ. Патогенез кишечного иерсиниоза // Региональные проблемы народного хозяйства часть I- Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Ульяновск, 2004 - С 281-283.

4 Коритняк Б.М Экологические аспекты циркуляции возбудителя кишечного иерсиниоза (бактерии Yersinia enterocolitica) // Региональные проблемы народного хозяйства часть I: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Ульяновск, 2004. - С. 277-280.

5 Коритняк Б.М, Васильев Д А , Золотухин С Н Эпидемиология кишечного иерсиниоза // Вестник УГСХА №12 Ветеринария- Сборник научных трудов. - Ульяновск, 2004 -С 60-63

6 Коритняк Б М,, Васильев Д.А., Золотухин С Н Изучение устойчивости выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы часть IV: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Ульяновск, 2005. - С. 162-163

7 Коритняк Б.М, Васильев ДА., Золотухин С.Н. Выделение бактериофагов вида Yersinia enterocolitis из объектов внешней среды И Молодые ученые в решении региональных проблем АПК- Сборник научных трудов Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых приволжского федерального округа -Самара, 2005.-С. 192-194.

Подписано в печать 22.09.05 Формат 60x841 1/16 Бумага типогр..№ 1 Гарнитура Тип-Тайме 1 Усл.печ.л 1.0 Заказ 435 Тираж 100

Ризограф УГСХА

432601, Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1

» I

»19518

РНБ Русский фонд

2006-4 17018

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коритняк, Богдан Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ •

1.1. Характеристика бактерий вида Y. enterocolitica

1.2. Распространение и резервуар кишечного иерсиниоза

1.3. Лабораторная идентификация видаТ. enterocolitica

1.4. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 35 1.4.1 .Фагоидентификация бактерий и фаготипирование

1.4.2. Выделение бактериофагов

1.4.3. Чувствительность бактерий вида У. enterocolitica

1.4.4. Реакция нарастания титра фага (РНФ) 46 II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ •

2.1. Материалы и методы 54 2.1.1. Материалы 5 4^ 2.1^7) Методы

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Поиск бактериофагов Y. enterocolitica и селекция клонов фагов

2.2.2. Характеристика выделенных фагов бактерий вида

Y. enterocolitica

2.2.3. Определение температурных параметров культивирования выделенных бактериофагов

2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий вида Y. enterocolitica спользованием фагов

2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ бактерий вида У. enterocolitica с использованием фагов

2.4.1. Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение

2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями

2.4.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий вида Y. enterocolitica в объектах внешней среды

2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ

2.4.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями вида Г. enterocolitica с помощью РНФ

2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ

2.4.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями вида Y. enterocolitica с помощью РНФ

2.4.3.5. Результаты выделения бактерий вида Т. enterocolitica из сточных вод хозяйств Самарской области

2.5. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биологических свойств выделенных бактериофагов Yersinia enterocolitica и разработка на их основе технологии индикации и идентификации возбудителя кишечного иерсиниоза"

Актуальность работы. Заболевания, которые в настоящее время называют кишечными иерсиниозами, лет 30 - 40 назад считались редкими и не привлекали к себе внимания специалистов.

Исследователи стали уделять гораздо больше внимания возбудителю Yersinia enterocolitica после сообщений о том, что данный возбудитель стал причиной возникновения заболевания людей и животных США, Бразилии, Канаде, странах Европы, южной Африке, Японии, Иране и других странах (Mollaret, 1995).

В Нидерландах, Бельгии, Германии, Канаде, Австралии иерсиниоз занимает третье место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза и кампилобактериоза (Bockemuhl, 1995).

По данным Российских исследователей, в нашей стране заболевания вызываемые бактериями вида Y. enterocolitica занимает второе место среди пищевых зоонозов, после сальмонеллёза (Черкасский, Подунова, Акулова, 1995).

Несмотря на большой интерес, проявляемый к данному возбудителю, в России до сих пор не ясна картина заболеваемости, структура и динамика (Смирнов, Ценева, 1992). Отдельные серо- и биовары Y. enterocolitica, являющимися документированными этиологическими агентами, по прежнему находятся в 4-й группе «условно» патогенных бактерий. Это является основной из причин унифицированного подхода к их индикации и идентификации в условиях клиники и эпидемиологической практики (Волкова и др., 2000).

Опасность иерсиниоза усугубляется чрезвычайной распространённостью возбудителя Y. enterocolitica в природе. Бактерии Y. enterocolitica выделены практически от всех видов млекопитающих, птиц, рыб, земноводных, моллюсков и насекомых. Кроме того, Y. enterocolitica обнаружены в воде, почве, сточных водах, продуктах животного происхождения (Ленченко,

Куликовский, Павлова, 1998; Собакин и др., 1998; Ющенко, 1984).

Широкое распространение иерсиниоза, многообразие клиники и трудоёмкость в постановке диагноза сделали актуальной проблему кишечного иерсиниоза в мировом масштабе. Различные методы индикации и идентификации Y. enterocolitica не идеальны и обладают некоторыми особенностями, поэтому разработка новых методов позволит исследователям более эффективно изучать данную проблему. Фагодиагностика, как один из методов индикации и идентификации, позволяет быстро и точно определить принадлежность исследуемой бактерии не только к определённому роду, но и к виду и даже фаговару.

Цель исследования - разработка параметров и технологических приёмов^ по индикации и идентификации бактерий вида Y. enterocolitica■ с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования

1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий вида X enterocolitica.

2. Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.

3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.

4. Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида Y. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

5. Разработать схему идентификации У. enterocolitica с помощью бактериофагов.

6. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики.

Научная новизна

- Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий вида Y. enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных.

- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.

- Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.

- Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата и схемы фагодиагностики.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y. enterocolitica. Выделенный и изученный штамм бактериофага депонирован в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признан перспективным и рекомендован для изготовления диагностических препаратов. Разработана Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторного бактериофага Y. enterocolitica Y/9 УГСХА.

Для врачей-: бактериологов предложены "Методические рекомендации пот ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий вида Y. enterocolitica в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды" и "Методические рекомендации по выделению и фагоидентификации бактерий вида Y. enterocolitica из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностического бактериофага Y/9 УГСХА, которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии. Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Схема выделения бактериофагов бактерий вида Y. enterocolitica.

2. Биологические свойства выделенных фагов бактерий вида Y. enterocolitica.

3. Конструирование из отобранного фага нового биопрепарата диагностикума.

4. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий вида Y enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.

5. Разработка схемы идентификации Y. enterocolitica с помощью специфического бактериофага.

6. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий вида Г. enterocolitica.

Апробация работы

Результаты основных исследований подтверждны в ВГНКИ (от 23.04.04г.), УГСХА (от 21.09.04г.); актом производственных испытаний в Сергиевской районной лаборатории Самарской области (от 4.06.05г.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в городе Ульяновске (2000, 2003, 2004, 2005), Самаре (2005).

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры; микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (292 источника, в том числе 161 отечественных). Работа иллюстрирована 32 таблицами, 10 рисунками, 1 схемой и приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Коритняк, Богдан Михайлович

126 ВЫВОДЫ

1. Из объектов внешней среды было выделено 9 изолятов фагов, активных по отношению к бактериям вида К enterocolitica.

2. Три селекционированных штамма фагов Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА Y/3 УГСХА имели титр 10" - Ю*10 по Аппельману и 3, ОхЮ9 - 1хЮ10 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий вида Y. enterocolitica и не проявляли активности в отношении представителей родов Escherichia, Enterobacter, Proteus, Citrobacter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, Y/9 УГСХА, Y/3 УГСХА были устойчивы к нагреванию до 50°С, a Y/4 УГСХА до 70°С в течение 30 минут. Фаги Y/9 УГСХА, Y/4 УГСХА Y/3 УГСХА были устойчивы к действию 10% раствора хлороформа в течение 45 минут.

3. Для индикации и идентификации бактериям вида Y. enterocolitica был предложен фаг Y/9 УГСХА, который имел широкий спектр литической активности по отношению к штаммам данных бактерий, равный 78,6%.

4. Разработана схема идентификации Y. enterocolitica с помощью фага Y/9 УГСХА, которая позволяет идентифицировать бактерии вида Y. enterocolitica за 48 часов.

5. Разработана схема ускоренной индикации бактерий бактерий вида Y. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить К enterocolitica за 19-35 часов.

6. Разработана НТД по изготовлению и контролю бактериофага для индикации и идентификации бактерий вида Y. enterocolitica.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен штамм бактериофага Y/9 УГСХА, активный в отношении бактерий вида Y. enterocolitica, обладающий строгой специфичностью, широким спектром литической активности.

2. Идентификацию бактерий вида Y. enterocolitica предлагаем проводить с помощью диагностического фага, согласно «Методическим рекомендациям по выделению идентификации бактерий вида Y. enterocolitica из патологического материала, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностического бактериофага Y/9 УГСХА».

3. Индикацию бактерий вида Y. enterocolitica в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторного бактериофага Y/9 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ бактерий вида Г. enterocolitica в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды".

4. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофага необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю бактериофага вида Y. enterocolitica, Y/9 УГСХА».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коритняк, Богдан Михайлович, Ульяновск

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалеоиентов // ЖМЭИ. 1960. - № I. - С. 23-27.

2. Аврех В.В. О понятии "Серологический тип бактериофагов" // В кн.: XIII Всесоюзный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Л., 1954. - Т.2. - С. 537-540.

3. Адаме М. Бактериофаги // Москва, 1961. С. 521.

4. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустова Н.М., и др. // Журн. микробиол. -1995.-№2.-С. 80-84.

5. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М.Кирова. 1964. - T.XYIII. - С. 1012.

6. Андельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. -Л., 1958.

7. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. 1961. -№ 2. - С. 5-11.

8. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. - №3. -С. 27.

9. Ахмедов Р.А. Кишечный иерсиниоз как природноочаговое заболевание// Тезисы докладов научной конференции «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций». Ставрополь, 1991. С. 156-158.

10. Ю.Ашмарин И.П., воробьев А.А. Статистические методвы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180с.

11. Багрянцев В.Н., Шубин Ф.Н., Каверзин С.В. и соавт. Экологические аспекты циркуляции бактерий Y. enterocolitica на Чукотке // Иерсиниозы. -Новосибирск, 1983. G.90-96.

12. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров: Автореферат канд.дис. -М, 1970. 21 с.

13. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-мед. журн. 1961. - № 4. - С. 3942.

14. Бейли Н.Статистические методы в биологии. М.: Изд-во иностран. лит., -1962.-С. 124-135.

15. Беспалов В.П., Маркина В.В, Нафеев А.А., Никишина Н.М. Этиология, эпидемиология, клиника и лабораторная диагностика иерсиниоза человека. -Ульяновск: УлГУ. 1996. -45с.

16. Божкова К. Сравнительная оценка качества различных агаровых сред для выращивания Yersinia enterocolitica II Инфектология. —1997. С. 14-15

17. Быкова ЗА. Некоторые свойства чумных фагов // Тр. Армянской противочумной станции. 1964. - №3. - С. 171-175.

18. Ващенок Г.И., Андрейчик Э.П. Иерсиниозы в Ленинграде // Болезни с природной очаговостью. Тр. Ин-та Пастера. J1., 1983. Т.60. - С. 82-87.

19. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии // ЖМЭИ. 1971. - № 1. - С. 136-138.

20. Воронцова А.В. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании // Тез. Докл. Намежинстит.конф. по проблеме «Кишечные инфекции». М., 1961. - С. 127128.

21. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы бактериофагии. Минск, 1973.- С.5-24.

22. Ганюшкиг В:Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: Автореферат дис. докт. вет. наук. Ульяновск, 1984. - 84 с.

23. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии // Учебное пособие. Ульяновск, 1988. - 45 с.

24. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990. - С.20-28.

25. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят // Ветеринария. 1967. -№ 3. - С.69-71.

26. Гинцбург A.JI., Романова Ю.М. // Природа. 1997. №5 - С.3-7.

27. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М: Медгиз, 1961. - 297 с.

28. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8. - С.90-94.

29. Гольдфарб Д.М., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага // ЖМЭИ. 1957. - №5. -С.17.

30. Гордейко В.А., Воронцова Т.А., Литвин В.Ю. Серо-эпидемиологическое изучение шишечного иерсиниоза у работников свинокомплекса // Журнал микробиология. 1990. - №3.- С.117.

31. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов: Автореферат докт. дисс., М., 1954. - 20с.

32. Гурлева Г.Г., Григорян Э.Г., Шошиев JI.H. О бактериофагии и бактериоциногении // ЖМЭИ. 1979. - №4 - С.9-10.

33. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - С.53-55.

34. Давиденко Т. А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 гг // В кн.: Кишечные инфекции. Киев,. 1972. - в.5. - С. 41.

35. Дегтярев Ю.А. Реакция нарастания титра фага и 'ее применение для диагностики брюшного тифа и выявление бактерионосителей // Тез.докл.ин-та эпидемиол. и гигиены. Душанбе, 1960. - С. 12.

36. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко Л.К. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага // Иркутск, 1957.

37. Дулатова М.В. Кишечный иерсиниоз // Л., 1989

38. Еременко В.А., Воробьев И.Г., Васильев И.Д. и соавт. Эпидемиология иерсиниозов в Санкт-Петербурге // Санкт-Петербург, 1993

39. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ // В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М., 1959. - С. 188.

40. Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Бактерии рода Citrobacter и их бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов. Ульяновск, 2000. - С.53-58.

41. Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю. Усовершенствование лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза // Ветеринария. 2001. - №5. -С.22.

42. Зыкин Л.Ф., Щербаков А.А., Хапцев З.Ю. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных // Саратов, 2002

43. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации: Автореферат канд. дисс. — М., 1967. 20с.

44. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. - № 6. - С.78.

45. Калошина Л.А., Ющенко Г.В., Шестопалов и соавт. Эпизоотологический процесс псевдотуберкулеза и иерсиниоза в популяции грызунов крупного города // Тезисы докладов XII Всесоюзной конкуренции по природной очаговости болезней. Новосибирск, 1989 - С.83-84.

46. Камбаратов П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза // ЖМЭИ. 1963. - № 6. - С.35.

47. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага // Симпозиум "Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". Новочеркасск, 1972. - С.76-78.

48. Кацитадзе Т.К. Применение брюшнотифозного фага Vi-Гв РНФ // ЖМЭИ. -1963. № 3. - С.126-127.

49. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. -1947. № 8. -С.312-315.

50. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллёзных культур с помощью О-бактериофага // Тез. докл.конф. Таллин, научн.-иссл.ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин, 1960. - С.5.

51. Кирьянов Е.А. и Савчук И.Н. Роль У. enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных // Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции "Иерсиниозы". Владивосток, 1989. — ч.1 -С.89-91.

52. Климанова Е.М., Белая О.Ф., Лаврова К.В., Белая Ю.А. Использование реакции коаглютинации в диагностике иерсиниозов у детей // Педиатрия. -1993. №4. - С.48-49.

53. Козелько О.А. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций // ЖМЭИ.- 1961. № 2. - С.36-40.

54. Колос Е.Н., Гнутов И.Н., Ющенко Г.В. и соавт. Сельскохозяйственные животные как источник иерсиниоза // ЖМЭИ. 1985. - №4. - С.77-79.

55. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом // Материалы 16 межобластн. научн.-практ.конф.лабор.работников в Зап. Сибири в т. Томске. 1960. -С.20-21.

56. Королюк A.M. Применение реакции коаглютинации для обнаружения и быстрой идентификации возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза // Лабораторное дело. 1984. - №4 - С.250-252.

57. Королюк A.M., Головачева С.Н., Дулатова М.В. Серологическая диагностика кишечного иерсиниоза. Конструирование стабильного эритрощггарного препарата для РНГА // ЖМЭИ. 1989. - №3 - С.30-34.

58. Корольков В. Ф., Колков В. Ф., Герепелкин В. С., Мандрик В. А. Анализ причин заболеваемости кишечными инфекциями личного состава // Воен.-мед. ж.-1992.-№6. С.54-57, 79.

59. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакциинарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1961. - № 7. -С.124.

60. Кривиский А.С. Вирусы против микробов // М., 1962.

61. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси, 1974. - С.276-280.

62. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий // В кн.: Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М., 1961. - С.220.

63. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis II ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С.16-22.

64. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий // М., 1963.

65. Кузнецов А.Ю.: Автореферат дис. канд. биол. наук. Ульяновск, 2000.

66. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

67. Кузнецов В.Г., Багрянцевым В.Н. Пастеризованное молоко, как фактор передачи возбудителей иерсиниозов // Журнал Микробиология. 1992. -№4. — С.22-23.

68. Куликовский А.В., Джентемирова К.М. Иерсиниоз — актуальная проблема ветеринарной медицины // Ветеринария. 1993. - №11-12. - С.28-35.

69. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

70. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр.науч.конф.аспирантов и ординаторов 1-го Моск.мед.ин-та. М.-1964.-С. 105-107.

71. Ленченко Е. М. Иерсиниоз. Этиология, диагностика, меры борьбы и профилактика (проблемная лекция) // М., 2002. С.42

72. Ленченко Е.М., Куликовский А.П., Павлова И.Б. Иерсиниоз. Этиология, эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики. М.: МГУПБ, 1998.- 127 е., ил.

73. Литвин В.Ю. Сапрофитическая фаза в экологи возбудителей инфекционных заболеваний // ЖМЭИ. 1985. - №6 - С.98-101.

74. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

75. Лурия С., Дарнел Д. Общая вирусология // М., 1961. С.146-147.

76. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 1. - С.113-115.

77. Марков И.С., Ткаченко В.И., Симен Д.Д. Вспышки псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза среди советских специалистов и членов их семей в Монгольской Народной Республике //.ЖМЭИ. 1989. - №8 - С.43-49.

78. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа // Тез.докл.на межинстит. конф. по проблеме "Кишечные инфекции". М., 1961. - С.146-147.

79. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии. М.: Медицина. - 1965.

80. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага // ЖМЭИ. - 1958. - № 12. - С.34.

81. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styphimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - С.53.

82. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 научн. Сесс. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата, 1978. - С.55-57.

83. Оливери С.А., Коростелева М.А., Кострицкий Н.Г. Опыт применения РНФ в лабораторной диагностике кишечных инфекций // В кн.:Материалы итоговой научно-практической конф.по проблеме "Кишечные инфекции, главным образом, дизентерия". Киев, 1962. - С.20-21.

84. Островская З.С. Диагностика брюшного тифа у больных с помощью РНФ // Аннотация научной работы АМН СССР. 1956. - С.57-59.

85. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага // ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С.37-40.

86. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. 1961. - № 5; -С.145.

87. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus // ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

88. Петру шина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров // ЖМЭИ. 1967. - № 5. - С. 128.

89. Писаренко Н.И., Куцевалов С.И., Проценко C.JI. Характеристика иесиний, выделенных от овец // Ветеринария. 1990. №2 - С.43-46.

90. Подболотов К.В., Сурков B.C. К эпизоотологической оценке кишечного иерсиниоза в Сахалинской области // Журн. Микробиол. 1984. - №2. - С.70-73.

91. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде // ЖМЭИ. 1962. - №1. - С.29-31.

92. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. -№ 6. - С. 135.

93. Попов А. В., Никифоров Ю.В. О первых случаях выделения Y. enterocolitica в Тувинской АССР (Кызыл) // Матариал регионального совещания противочумных учереждений по эпизоотологии, эпидемиологии и профилактики ООИ. Куйбышев, 1990. - С.168-170. •

94. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для дифференциации бруцелл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119-124.

95. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. -Киев: Урожай, 1978. С.88.

96. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. - № 6.

97. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1959. - №6. - С.110-112.

98. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней // Под ред. В.И. Покровского. М., 1993. - С.61-78.

99. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д1агностики за допомогою бактерюфага. // Мжробюл. журн . АН УССР. 1936. - №1. - С.85-112.

100. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близких к нему микроорганизмов // Клиническая микробиология и антимикробная химеотерапия. 2002. - №1.

101. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Культуралоьные свойства и вирулентность иерсиний /У Журнал микробиологии. 1991. - № 9. - С. 13-16

102. Смирнов И.В., 1989 Определение феномена аутоаглютинации вирулентных иерсиний // Лаб. дело. 1989. - №6. - С.59-60.

103. Смирнов И.В., Горохов В.И. 1990 Диагностическая сыворотка с атителами вирулентным иерсиниям // Лаб. дело. — 1990. №10. — С.66-65.

104. Смирнов И.В., Ценева Г.Я. Фенотип возбудителя иерсиниоза и его значение для диагностики // Журн. микробиол. 1992. - №1. - С.13-16.

105. Смирнова Е.Ю, Рыбакова И.А., Евсюкова Н.А. Эпидемиологическое распространение Y. enterocolitica в окружающей среде // Метериаля 8-го съезда ВНОЭМП. М., 2002. - Т. 1 - С.389-399.

106. Собакин А.С., Зыкин Л.Ф., Хапцев З.Ю., Юркин В.Ф. Выявление кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у животных // Ветеринария. -1998. №8. - С.15-16.

107. Солохина Л.В., Константинова И. Д., Пушкарева В.И; и др. Ультраструктурный анализ взаимодействия Y. pseudotuberculesis с синезелеыми водорослями (цианобактериями) // Материалы 8-го съезда ВНОЭМП. М., 2002. - T.I - G.401.

108. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носительства дизентерийных бактерий // Автореферат дис. канд. мед. наук. -Симферополь, 1964.

109. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ) // М., 1962.

110. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотйфозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С.3-7.

111. Тимофеева, Миронова, Головочева, Бусоедова Характеристика штаммов Yersinia enterocolitica, выделенных от людей и животных в Сибири и на Дальнем Востоке // Журн. микробиол. 1977. - №11. - С. 144-145.

112. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968. -С.89.

113. Томэску В., Гавриле И., Гавриле Д Зоонозы. М.: Колос, 1982. - С.319

114. Уткин Д.В.; Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики кишечного иерсиниоза и перспективы ее совершенствования // Рос. н.-и. противочум. ин-т "Микроб". 1999, - 16 с.

115. Хапцев З.Ю., Зыкин Л.Ф. Лабораторная диагностика сельскохозяйственных животных // Материалы международной конференции «Инфекции обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции». Санкт-Петербург, 2000. — С.62-63.

116. Хоулт Дж. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980. - с.459.

117. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., стейли Дж., Уилльямс С. Определитель бактерий Берджи. В 2-х Т. Т1. Пер. с англ. М.: Мир, 1997. — С. 195-196.

118. Цветков К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6. - С.4-6.

119. Ценева Г.Я. Иерсиниоз и псевдотуберкулез // Пособие для врачей. С.Петербург,- 1992.

120. Ценева Г.Я. // Лабораторная диагностика псевдотуберкулеза и иерсиниоза. С.-Петербург, 1997. -62 с.

121. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Полоцкий Ю.Е. и др. Инвазивность и цитотоксичность как критерий оценки аттенуации иерсиний // ЖМЭИ. -1988.-№9.-С.10-15.

122. Черкасский Б.Л, Подунова Л.Г., Акулова Н.К. Пищевые зоонозы у людей в России // Пищевые зоонозы сальмонелл ёзы, кампилобактериоз, иерсиниозы, листериоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. М., 1995. - С. 18-19.

123. Чиракадзе Л.Г., Чанишвили Т.Г. Типирование S.typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С.72-78.

124. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. М., 1968. С.225.

125. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез.докл. и выступл.на 5 Всес. научн. конф. по санитарн. микробиол. М., 1962. - С.89-93.

126. Шпилюк Г.Ф., Головешкина Т.Н., Володина И.К. и соавт. Иммуноглобулиновые и латексные препараты для экспресс диагностики иерсиниозов // ЖМЭИ. 1993. - №6. - С.92-93.

127. Шумилов К.В., Мельниченко Л.П., Селиверстов В.В. Современные данные об иерсиниозе животных.// Ветеринария. 1998. - №4. - С.7-13.

128. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага // ЖМЭИ. 1962. - № 1. -С.99-102.

129. Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемиологических мероприятий // Инструкция МЗ СССР от 30.10.1990.

130. Ющенко Г.В. Актуальные вопросы эпидемиологии и клиники иерсиниоза // ВНИИМиМТИ Обзорная информация. Вып №4. М., 1984.

131. Ющенко Г.В. Иерсиниозы // Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. М., 1993. - С. 133-148.

132. Ющенко Г.В. Псевдотуберкулез и иерсиниоз: эпидемиологические и экологические аспекты // Материалы международной конференции «Инфекции обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез), и другие актуальные инфекции». Санкт-Петербург, 2000. - С. 2

133. Ющенко Г.В. Распространенность иерсиниоза в условиях жаркого климата // «Иерсиниозы» Тезисы Всесоюзной научно-практической конференции. -Владивосток, 1989. ч.1 - С. 128-129.

134. Ющенко Г.В. род Yersinia II Энтеробактерии (Рук. Для врачей под ред. В.П. Покровского). М.: Медицина, 1985. - гл.З - С.220-239.

135. Ющенко Г.В., Дунаев В.М. Методика выделения и идентификации Yersinia pseudotuberculosis и Yersinia enterocolitica II Лаб.дело 1980. №6. - С.367-369.

136. Ahvonen P. Human yersiniosis in Finland: I. Bacteriology and serology // Ann. Clin. Res. 1972a. - №4. - P. 30-38.

137. Ahvonen P., Thai E. and Vasenius H. Occurrence of Yersinia enterocolitica in animals in Finland and Sweden // Contr. Microbiol. Immunol. 1973. - №2. -P.135-36.

138. Andersen J.K., Sorensen R. and Glensbjerg M. Aspects of the epidemiology of Yersinia enterocolitica: a review // Int. J. food Microbiol. 1991. - №13. - P.231-238.

139. Anonimous Infectious disease in Finland 1995-1999 // National Public Health Institute, Helsinci, Finland. KTL. 2000. -№B4.

140. Antonarakis S.E. // New England. J. Med. 1989. - V. 320, №3. - P. 153-163.

141. Asplund K., Johansson Т., and Siitonen A. Evaluation of pulsed-field gel elektrophoresis of genomic restriction fragments in the discrimination of Yersinia enterocolitica 0:3 // Epidemiol. Infect. 1990. - 121. - P. 579-586.

142. Aulisio C.C.G., Mehlman I.J., and Sanders A.C. Alkai method for rapid recovery of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculesis from foods // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - №39. - P.135-140

143. Baker P.M., Farmer J.J. New bacteriophage typyng system for Y.enterocolitica, Y.kristensenii, Y.frederibenii and Y.intermedia: correlation with serotyping, biotyping and antibiotic susceptibiolity // J. Clin. Microbiol. 1982. - №.15. -P.491-502.

144. Bercovier H., Mollaret H.H. Genus XIV. Yersinia. In: Krieg, N. R. (Ed.). Bergey's manual of systematic bacteriology, V. 1 9th ed., // The Williams and Wilkins Co., Baltimore. 1984.- P. 498-506.

145. Bercovier, H., Brenner, D.J., Ursing, J., Steigewalt, A.G., Fanning, G.R., Alonso, J.M., Carter, G.P. and Mollaret, H.H. Characterisation of Yersinia enterocolitica sensu strictom // Curr. Microbiol; 1980. - №4; - P.201-206.

146. Bissett, M. L., Powers, C., Abbott, S. L. and Janda, J. M. Epidemiological investigations of Yersinia enterocolitica and related species: sources, frequency, and serological distribution II J. Clin. Microbiol. 1990. - №28. - P.910-912.

147. Blais B.W. and Philippe L.M. Comparative analisis of yadA and ail polymerase chain reaction methods for virulent Yersinia enterocolitica II Food Control. -1995.-№6.-P.211-214.

148. Bockemuhl I. Epidemiology and visk factors of Yersinia infections in humans Working paper for WHO concultatin emerginj foodborne diseases agents // Berlin, March. 1995.-P.20-24.

149. Bodnaruk, P. W. and Draughon, F. A. Effect of packaging atmosphere and pH on the virulence and growth of Yersinia enterocolitica on pork stored at 4°C // Food Microbiol. 1998. - №15. - P. 129-136.

150. Bottone, E. J. Yersinia enterocolitica-. The charisma continues // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - №10. - P.257-276.

151. Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates // Microb. Infect. -- 1999. №1. - P.323-333.

152. Brennhovd S., Kapperud G. and Langeland G. Survey of thermotolerant Campilobacter spp. And Yersinia spp. In Three suface water sources in Norway // Int. J. Food. Microbiol. 1992. - №15. - P.327-338.

153. Brocklehurst, T. F. and Lund, В. M. The influence of pH, temperature and organic acids on the initiation of growth of Yersinia enterocolitica II J. Appl. Microbiol. 1990. - №69.- P.390-307.

154. Calvo С., Brault J. Lysogenie chez Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii et Yersinia intermedia II Ann. Microbiol. 1983. - A134 № 2. - P.183-188.

155. Gateau M. Methodes rapides d analyse en microbiologic alimentaire // Rev. fr. lab. 1993. V. 22. - №264. - P. 25-28.

156. Christensen S. Yersinia enterocolitica in Danish pigs // Journal of Applied Bacteriology. 1980. - №48. - P.377-382.

157. Christensen S.G. The Yersinia enterocolitica situation in Denmark // Contr. Microbiol. Immunol. 1987b. №9. - P.26-29.

158. Coll P., Rossell., Gaya A. et.al. Enzimoimmunoanalisis para la defection de anticuerpos sericos espesificos de Y. enterocolitica 0:3. Comparacion de varios methods para la expression de resultados // Immunologia. 1986. - V.5. - №4. -P. 139-142.

159. Cornelis G.R. The Yersinia deadly kiss // J. Bacteriol. 1998. №180. - P.5495-5504.

160. Cover, T. L and Aber, R. C. Yersinia enterocolitica. N. Engl // J. Med. 1989.-№321. -P.16-24.

161. Danks D.M.// Aust. N.Z.J. Med. 1988. - V. 18. - №3. - P. 339-348.

162. Daniels J.J end Goudzwaard С. // Tijdschr. Diergeneesk. 1963. - №88, 2. -P.96-102.

163. Dikinson A.B., Mocquot G.J // Appl. Bact.- 1961. №24, 3. - P.252-284.

164. Doyl M.P., Hugdahl M.B. Impruved procedure for recoveri of Yersinia enterocolitica from meats // Appl. environm. Microbiol. 1983. - V. 45. - №1. -P. 127-135.

165. Escudero M.E.; Velazquez L.; de Guzman A.M.S. Yersinia enterocolitica and related species isolated from animals slaughtered for human consumption // Food Microbiol. 1996. - P.201-204.

166. Esseveld H., Goudzwaard С. On the epidemiolgi of Yersinia enterocolitica ionfecctions: pigs as the source of infecthions in man in Contributions to

167. Microbiology. V. 2. Yersinia , Pasteurella and Franciella II Basel: Karger. 1973. - P.99-101.

168. Fantasia, M., Mingrone, M. G., Martini, A., Boscato, A. and Crotti, D. Characterisation of Yersinia species isolated from a kennel and from cattle and pig farms//Vet. Rec. 1993. - №132. - P.532-534.

169. Fenwick S.G.and Murray A. Detect of pathogenic Yersinia enterocolitica by polymerase chain reaction // Lancet. 1991. №337. - P.496-497.

170. Frederiksen W. A studi of som Yersinia pseudotuberculosis-like bakteria {Bacterium enterocoliticum and llPasteurrella X") II In: Proc. Of 14-th Scandinavka Congress on Pathologi and Microbiologi. Oslo. 1964. - P. 103-104.

171. Fredricsen W. // Proc. XIV Scand. Congress Path. Microbiol. Oslo. 1964. -P.103-104.

172. Fredrikson-Ahomaa M., Korte T. and Korkeala H. Transmission of Yersinia enterocolitica 4/03 to pets via contaminated pore // Lett. Appl. Microbiol. In press. 2001a.

173. Fredrikson-Ahomaa M., Korte T. et.al. Contamination carcass, offal's and environment with Yad-A positive Y. enterocolitica in pigs slaughterhouse // J. Food Prot. 2000. - V.63. - №1. - P.31-35.

174. Fukushima, H. New selective agar medium for isolation of virulent Yersinia enterocolitica // J. Clin. Microbiol. 1987. - №25. - P.1068-1073.

175. Genovez M.E., Giorgi W., Simon F. Novo isolamento de Yersinia enterocolitica de sagul (Callitthrix penicillata) // Biologico (Brasil). 1980. - V. 46. - №12. - P. 303-305.

176. Gill, J. Yersiniosis in farm animals in New Zealand // Survaillance. 1996. №23. -P.24-26.

177. Goverde, R. L., Kusters, J. G. and Huis in't Veld, J. H. J. Growth rate and physiology of Yersinia enterocolitica', influence of temperature and presence of the virulence plasmid // J. Appl. Bacterid. 1994. - №77. - P.96-104.

178. Graigie J., Felix A. Typing of tyfoid bacilli with Vi bacteriofage, suggestions for ist standartisation // Lancet. 1947. - V. 14. - P. 823.

179. Graigie J., Yan C. Demonstration of types of b tyfosus by mesns of preparations of typs // Canad. Publ. Hith. J. 1938. V. 29. - № 9. - P. 448.

180. Gueraud I. Vers une epizootic de Yersiniose chez li chlinichalla.// bull. Acad. Vet. Fr. 1988. - V. 61. - №1. - P.95-98.

181. Hacking M.A., Sileo L. Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculesis from wildlife in Ontario // J. wildlife Dis. 1974. - V.10. - №4. - P.452-457

182. Hamon Y., Nicolle P., Vieu J. -F., Mollaret H. Recherche de la bacteriocinogenie parmi les souches de Yersinia enterocolitica II Ann. Inst. Pasteur. 1966. - T.3. - P.368-372.

183. Harmon, M. C., Yu, C. L. and Swaminathan, B. An evaluation of selective differential plating media for the isolation of Yersinia enterocolitica from experimentally inoculated fresh ground pork homogenate // J. Food Sci. 1983 . -№48. - P. 6-9.

184. Harris LJ. and Griffiths M.W. The detection of foodborne pathogens by the polimerase chain reaction (PCR) // Food Res. Int. 1992. - №25. - P.457- 469.

185. Harrison W.A., Petters A.G. and Fielding L.M. Growth of Listeria monocitogcms and Yersinia enterocolitica colonies under modified atmospheres at 4 and 8°C using a model system // J Appl. Microbiol. 2000. - №88; - P.38-43.

186. Hausner O., Hausnerova S. The isolation of urease negative strains of Yersinia enterocolitica II Contribs-Microbiol. Immunol. 1979.- № 5. - P. 80-82.

187. He Xiaoqing, Pan Ruonan. Bacteriophage lytic patterns for identification of Salmonellae, Shigellae, Escherichia coli, Citrobacter freundii, and Enterobacter cloacae II J. Clin. Microbiol. 1992. - 30. - № 3. - P.590-594.

188. Heesemann J., Keller G., Morawa R., Schmidt п., siemens H.J. and Laufs R. Plasmids of human strains of Yersinia enterocolitica: Mollecular relatedness and possible importance for Pathogenesis // J. Infect. Dis. 1983. - №147. - P.107-115.

189. Hurvell, B. Zoonotic Yersinia enterocolitica infection: host range, clinical manifestations, and transmission between animals and man. In: Bottone, E. J. (Ed.). Yersinia enterocolitica. CRS press, Boca Raton, FL. 1981. - P. 145-159.

190. Ichinohe H., Yoshioka M., Fukushima H., Kaneko S., Maruyama T. First Isolation of Yersinia enterocolitica Serotype 0:8 in Japan // Journal of Clinical Microbiology. Apr. 1991. - P. 846-847.

191. Iteman I. Guiyoule A. Carniel E. Comparison of three molecular methods for typing and subtyping pathogenic Yersinia enterocolitica strains // J. Med. Microbiol. 1996.-P.48-56.

192. Jacubczak A., Simionek J., Anusz J. Ocena testow na patogennose szezepow Y. enterocolitica iozolowanych od ludi i zwieri // Med. Vet. 1992. - P.478.

193. Joshi Neelam; Singh Ajit, Punjab Agr. Univ. Detection of Yersinia enterocolitica by I solation and fluorescent antibody test from meat and infected tissues // J. Res. 1999. P.257-262.

194. Kaneuchi, C., Shibata, M., Kawasaki, Т., Kariu, Т., Kanzaki, M. and Maruyama, T. Occurrence of Yersinia spp. in migratory birds, ducks, seagulls, and swallows in Japan // Jpn. J. Vet. Sci. 1989. - №51. - P.805-808.

195. Kapperud G. Yersinia enterocolitica and Y. enterocolitica-like bakteria isilated from healthy humans in Norway // Acta panth. Microbiol. Scand. Sect. B. 1980. - V. B88. - №6. - P. 303-306.

196. Kapperud G., Olsvik 0. Isolation of enterotoxigenic Yersinia enterocolitica from birds in Norway // J. Wildlife. Dis. 1982. - V. 18. - №2. - P.247-248.

197. Katznelson H;, Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of internalug borne bacterial infections of seed // J. Bact. 1951. - V. 61. - № 1. - P. 689.

198. Kawaoka J., Otsuki K., Tsubokura M. Temperature-dependent variation in the synthesis of the receptor Yersinia enterocolitica bacteriophages XI // Zbl. Bacteriol. 1983. - Abt.IA, Bd. 253. - P.364-369.

199. Kleinlein, N. and Untermann, F. Growth of pathogenic Yersinia enterocolitica strains in minced meat with and without protective gas with consideration of competitive background flora // Int. J. Food Microbiol. 1990. - №10. - P.65-72.

200. Knapp W., Thai E., Zbl. Bakt. //1. Abt. Orig. 1963. - P.190, 4, 172-484.

201. Kontainen S., Sivonenn A. and Renkonen O.V. Increased yelds of patogenic Yersinia enterocolitica strains by cold enrichmentm Scand. J. Infect. Dis. - 1994. - №26. - P.685-691.

202. Lachica R.V. and Zink D.L. Determination of plasmid-associated hydrophobicity of Yersinia enterocolitica by a latex particle agglutination test // J. Clin. Microbiol. 1984. - №19. - P.660-663.

203. Lantz P.G., Hahn-HuagerdalB. and Redstrom P. Sample preparation metods in PCR-based detection of food pathogens Trends Food Sci. Tehnol. - 1994. - №5. -P.384-389.

204. Letellier A., Messier S. and Quessy S. Prevalence of Salmonella spp. And Yersinia enterocolitica in finishing swine at Canadian abattoir // J. Food Prot. -1999. -№62.-P.22-25.

205. Lindblom В., Holmlund G. // Gene anal. Techn. 1988. - №5. - P. 97-101.

206. Mehlman, I. J., Auliso, С. C. G. and Sanders, A. C. Problems in the recovery and identification of Yersinia from food // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1978. -№61. -P 761-771.

207. Mollaret H.H. Fifteen Centuries of Yersiniosis. II Yersiniosis: Present and Future. Gontrib. Microbiol Immunol // Basel,. Karger. 1995.- №13. - P.l-4.

208. Mollaret H.H. L'infektion humaine a Yersinia enterocolitica en 1970, a la Lumiere de 642 cas recents // Path. Biol. (Paris). 1971. - V.19. - P.189-205.

209. Mollaret H.H., Chevalier A., Deplanche M.C. // Ann. Inst. Pasteur. 1964. -P. 107, 1, 121-127.

210. Mollaret H.H., Nicolle P. Sur la frequence de la lysogenie dans l'espece nouvelle Yersinia enterocolitica II C.R. Acad. Sci. 1965. - T. 260. - P. 1027-1029.

211. Neubauer H.; Sprague L.D.; Hensel A.; Aleksic S.; Meyer H. Specific detection of plasmid bearing Yersinia isolates by PCR // Clin. Lab. 2000. - P.583-587.

212. Nicolle P. Lysotypie Yersinia enterocolitica II In: Infektionskrankheiten und ihre Erreger.-Jena. 1973. - Bd.14. - P.377-387.

213. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Nouveaux resultats sur la lysotypie de Yersinia enterocolitica portant sur plus de 4000 souches d'origins diverses // Revue d'epidemiologie et de sante publique. Paris. 1976. - № 24. - P.479-496.

214. Nicolle P., Mollaret H.H., Brault J. Recherches sur la lysogenie, la lysosensibilite, la lysotypie et la serologic de Yersinia enterocolitica II In: Contribs. Microbiol, and Immunol. 1973. - № 2. - P.54-58.

215. Nicolle P., Mollaret H.H., Hamon., Vieu J.-F. Etude lysogenique, bacteriocinogenique et lysotypique de l'espece Yersinia enterocolitica II Ann. Inst. Pasteur. 1967. - T.l 12. - P. 86-92.

216. Nielsen B. and Wegener H.C. Public health and pork and pork products: regional perspectives of Denmark // Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1997. - №16. -P.513-524.

217. Nilehn B. Electron microscopic studies on flagellation in different strains of Yersinia enterocolitica II Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - № 77. - P.527-541.

218. Nilehn B. Studies on Yersinia enterocolitica. Characterisation of 26 strains from human and animal sources // Acta Path. Microbiol. Scand. 1967. - № 69. -P.83-91.

219. Nilehn В. Studies on Yersinia enterocolitica. Growth on various solid media of 37° and 25°C // Acta Path. Microbiol. Scand. 1969. - №77. - P.685-697.

220. Nilehn В., Ericson C. Studies on Yersinia enterocolitica. Bacteriophages liberated from chloroform treated cultures // Acta Path. Microbiol. Scand. — 1969. -№75.-P.177-187.

221. Nilehn, B. Studies on Yersinia enterocolitica with special reference to bacterial diagnosis and occurrence in human acute enteric disease // Acta Path. Microbiol. Scand. Suppl. 1969b. - №206. - P. 1-48.

222. Nilehn B. Host range, temperature characteristics and serologic relationship among Yersinia phages // In: Contribs. Microbiol, and Immunol. 1973. - №2. -P.59-67.

223. Oosteron J. Isolation and epidemiological significance of Yersinia enterocolitica II Antonie van Leeuwenhoek. 1979. - №45. - P.630-633.

224. Ostroff S.M., Kapperud G., Huteagner L.C., Nesbakken Т., Bean N.H., Lassen J. and Tauxe R.V. Sources of sporadic Yersinia enterocolitica infections in Norway: a prospective case-contorol study // Epidemiol. Infect. 1994. - P. 112; 133-141.

225. Papavassiliou J., Leonardopoulos I: Bacteriocinogenie, lysogenie et colicinotypie de Yersinia enterocolitica isolees au Canada // Arch. Inst. Past. Hellen. 1974. - T. 20. - P.55-62.

226. Robbins-Brown R., Milliotis M., Ciancionisis et. al. Evaluation of DNA colony hybridization and other fechnigues for detection of virulents in Yersinia species // J. Clin. Microbiol. 1989. - V.27. - №4. - P.644-650.

227. Robins Brown R.M. Yersinia enterocolitica. In: Doyle, M.P., Beuchat L.R and Montville T.J. (Ed.) // Food Microbiolgy, Fundamentals and frontiers. ASM Press, Washingtot D.C. - 1997. - P. 192-215.

228. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K. and Rasmussen O.F. Inhibition of PCr by components of food samples, microbial diagnostics assays and DNA-extraction solutions // Int. J. Food Microbiol. 1992. - №17. - P.37-45.

229. Rukdeschel K., Roggenkamp A., Schubert S. and Heesemann J. Differencial : contribution of Yersinia enterocolitica virulence factors to evasion of microbial action of neutrophils // Infect. Immun. 1996. - №64. -P.724-733.

230. Saebo A., Kapperud G., Lassen J. and Waage J. Prevalence of antibodies to Yersinia enterocolitica 0:3 among Norwegian military recruits: Association with risk Factors and clinical manifestecion // Eur. J. epidemiol. 1994. - №10. -P.749-755.

231. Samonis G. Maraki S. Christidou A. Georgiladakis A. Tselentis Y. Bacterial pathogens associated with diarrhoea on the island of Crete // Eur. J. Epidemiol. -1997. — P.831-836.

232. Scheleifstsin J.I и Coleman M.B. // N. Y. St. Depart.Hlth Ann. Rep. Lab. Res. -1943.-P.56.

233. Scheleifstein J.I, Coleman M.B. // N. Y. St. J. Med. 1939. - Sept. - №15. -P.1749-1753.

234. Schiemann D.A. Yersinia enterocolitica: observation on some growth characteristics and response to selective agents // Canad. J. Microbiol. 1980. -№26. - P. 1232-1240.

235. Sechter I.O. Metodika de cercetare a prezentei bacilului tifis in materufacale ajutorole bacterofagului // V. Academie RPSH Filialr Vasi Studii si cercetari Stintifie. Ann. -VI. 1955. - №3-4. - P. 99.

236. Skjerve E., Lium В., Nielsen B. and Nesbakken T. Control of Yersinia enterocolitica in pigs at herd level // Int. J. Food Microbiol. 1998. -№ 45. -P. 195-203.

237. Skurnic M. and Zhang L. Molecular genetics and biochemistry of Yersinia Lipopolysaccharide // APMIS. 1996. - №104. - P.849-872.

238. Skurnik M. Expression of antigenes enkoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different conditions // Infect. Immun. 1985. - №47. -P.183-190.

239. Skurnik M., Bali I., Heikkinen H., Piha S. And wolf-Watz Virulence plasmid-associated.autuagglutination in Yersinia spp // J. Bacteriol. 1984. - №158. — P.1033-1036.

240. Slee K., SkilbekN. Epidemiology of Y. enterocolitica and Z pseudotuberculosis infection in sheep in Australia // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - №3. - P712-715.

241. Slee, K. J. and Skilbeck, N. W. Epidemiology of Yersinia pseudotuberculosis and К enterocolitica infections in sheep in Australia // J. Clin Microbiol. 1992. -№30. - P.712-715.

242. Spadaro M., Infortuna M. Isolamento di Yersinia enterocolitica in Mytilus galloprovincialis lamk // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1968. - V. 44. - №22. -P.1896-1897.

243. Theakston E.P. Morris A.J. Streat S.J. Baker B.W. Woodfield D.G. Transfusion transmitted Yersinia enterocolitica infection in New Zealand Austral, and N. Z // J. Med. -1997.-P.62-67.

244. Thompson, J. S. and Gravel, M. J. Family outbreak of gastro-enteritis due to Yersinia enterocolitica serotype 0:3 from well water // Can. J. Microbiol. 1986. -№32. -P.700-701.

245. Toma S., Diedrick V. Isolation of Yersinia enterocolitica from swine // Jornal of Clinical Microbiologi. 1975. - №2. - P. 103-110.

246. Tsubokura M., Otsuki K., Kawaoka J. Lysogenicity and phage of Yersinia enterocolitica isolated in Japan // Jap. J.Vet. Sci. —1982. №44. - P.433-437.

247. Urbanova E., Pacova Z. Identifikace druhu rodu Citrobactera jejich a jejich vyskyt у surovinach a potravinach // Vet.med. 1997. - 42. - № 3. - P. 87-91.

248. Wauters G. Aspects pahogeniques et epidemiologiques des infections a Yersinia enterocolitica II Bull, et mem. Acad. roy. med. Belgium. 1981. - T. 136. - N10. -P. 510-520.

249. Wauters G. Contribution a l'etude de Yersinia enterocolitica II Louvain. 1970. -P.165.

250. Wauters G., Aleksic S., Charlier J. and Schulse G. Somatic and flagella antigens of Yersinia enterocolitica and related species // Contr. Microbiol. Immunol. -1991. №12. -P.239-243.

251. Wauters G., Goossens V., Janssens M. and Vandepitte J. New enrichment method for isolation of patogenic Yersinia enterocolitica serogroup 0:3 from pork //Appl. Environ. Microbiol. 1988a.-№54. -P .851-854.

252. Wauters G., Mollaret H.H. // Rev. belg. Path. 1965. -№31.- P.328-333.

253. Wauters, G., Janssens, M., Steigerwalt, A. G. and Brenner, D. J. 1988b. Yersinia mollaretii sp. nov. and Yersinia bercovier sp. nov., formerly called Yersinia enterocolitica biogroups ЗА and 3B. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 424-429.

254. Wauters, G. Improved methods for the isolation and the recognition of Yersinia enterocolitica II Contr. Microbiol. Immunol. 1973. - №2. - P.68-70.

255. Wauters, G. Carriage of Yersinia enterocolitica serotype 3 by pigs as a source of human infection//Contr. Microbiol. Immunol. 1979. - №5. -P.249-252.

256. Weagant S.D., Jacow J.A., Jinneman K.S., Omiecinski C.J., Kajsner C.A. and

257. Hill W.E. Development of Dioxigenin-labelled PCR amplicon probes for use in thedetection and identification of enteropathogenic Yersinia and.shiga toxin producing

258. Escherichia coli from foods // J. Food Prot. 1999. - №62. - P.438-433.

259. Winblad S. Studies on serological typing of Yersinia enterocolitica II Acta Path. Microbiol. Scand. 1967. - Suppl. 187. - P. 115-116.

260. Yanagawa Y., Maruyama Т., Sakai S. Isolation of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from apparently healthy dogs and cats // Microbiology and Immunology. 1978. - №22 - P. 643-646.

261. Zen-Yoji H., Sacai S., Maruyama Т., Janagawa Y. Isolation of Y.enterocolitica and Y. pseudotuberculesis from swine, cattle and rats at an abattoir // Japanase Journal of Microbiology. 1974. - №18. - P.103 - 105