Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis

Катмакова, Надежда Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis"

0O461314S

Т^ятхжяъ-пп я Нчпйм^па Паттлоочо

ivu i nmnUuu 1 t<v i |juuiiu

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА «YP - 09 УГСХА» НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионаногехнологии) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

Ульяновск-2010

004613148

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Васильев Д митрий Аркадьевич

доктор биологических наук, профессор Золотухин Сергей Николаевич

доктор биологических наук, профессор Ежкова Галина Олеговна

доктор биологических наук, профессор Красноперова Юлия Юрьевна

ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

Защита диссертации состоится «3» декабря 2010 года в Л часов на заседании диссертационного совета Д 220.065.01 при ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел. 44-30-58, e-mail: kormlen@vandex.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Автореферат диссертации разослан » октября 2010 года и размещен на сайте: http://ugsha.ru/

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, ученому секретарю диссертационного совета

Ученый секретарь диссертационного совета JI.A. Пыхтина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекция, вызываемая Yersinia pseudotuberculosis, привлекает к себе внимание исследователей в связи с ростом заболеваемости и все более широким ее распространением (Г. П. Сомов, 1990; Г.В. Ющенко, 2000; Н. Fukushima, 2001; В.Ф. Учайкин, 2008).

Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов иерсиниозов, актуальность этой проблемы сохраняется. Стабильные показатели заболеваемости по РФ псевдотуберкулезом (данные официальной статистики) - 7,1 на 100 тыс. населения - в последние 5 лет не отражают истинного распространения инфекций {Г.Я. Ценева, 2006). Анализ изученных факторов патогенности подтверждает абсолютную патогенность бактерий вида Y. pseudotuberculosis для людей и животных {Г.Я. Ценева, 1984; Ю.Е. Полоцкий, 1987; Н.Ф. Тимченко, 1997\Н.Д. Ющук, 2003).

О выделении штаммов Y. pseudotuberculosis из отдельных регионов при эпидемических вспышках, групповых заболеваниях или спорадических случаях людей и животных сообщается в работах М. Tsubokura et al. (1989); Г.Г. Головиной (2000); С.Н. Бениовой (2000); М.В. Чесноковой (2003); К. Jalava et al (2004); S. Kangas et al. (2008) и dp.

В последние годы выражена тенденция к активному изучению и применению в лабораторно-диагностической практике фагов бактерий различных родов и видов (В.Я. Ганюшкин, 1988; С.Н. Золотухин, 1994; Н.Е. Гаевская, 2004; Л.Д. Македонова, 2006; Т.А. Кудрякова, 2010). Бактериофаги применяются для идентификации и фаготипирования бактерий, а также ускоренной индикации возбудителей бактериальных инфекций в различных субстратах. Все большую актуальность приобретают фаготерапия и фагопрофилактика инфекционных болезней как альтернатива использованию антибиотиков.

рядовых лабораториях, в связи с чем поиск и разработка методов своевременной индикации возбудителя, вызывающего заболевание, являются актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель - разработка технологических параметров изготовления и применения биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе выделенных специфических фагов для индикации и идентификации бактерий вида У. pseudotuberculosis. Поставленная цель решалась следующими задачами:

1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида У.pseudotuberculosis.

2. Изучить основные биологические свойства выделенных бактериофагов: морфологию негативных колоний, литическую активность, спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость, чувствительность к воздействию хлороформа.

3. Подобрать штаммы бактериофагов с заданными биологическими свойствами - высокой литической активностью, широким спектром литического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий, порогом инактивации - для конструирования диагностического биопрепарата.

4. Разработать схему идентификации бактерий вида У. pseudotuberculosis с помощью специфических псевдотуберкулезных бактериофагов.

5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида У. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью диагностического биопрепарата на основе фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА методом РНФ.

6. Разработать биотехнологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных бактериофагов У. pseudotuberculosis.

Научная новизна. Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий вида Y. pseudotuberculosis, изучены их основные

биологические свойства. Разработаны параметры схемы индикации и идентификации бактерий вида К pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью выделенных и изученных бактериофагов. Впервые разработана технология изготовления диагностического биопрепарата на основе специфических псевдотуберкулезных фагов.

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные псевдотуберкулезные бактериофаги, пригодные для изготовления диагностического биопрепарата с целью индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды. Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных псевдотуберкулезных бактериофагов YP - 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с использованием диагностических бактериофагов YP - 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Y. pseudotuberculosis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», утвержденные ректором Ульяновской ГСХА (3 сентября, 2010).

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также при выполнении тем научно-исследовательских работ на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработанная схема выделения бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать вирулентные фаги Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды.

2., Выделенные и изученные штаммы бактериофагов Y. pseudotuberculosis пригодны для изготовления диагностического биопрепарата.

3. Разработанная схема ускоренной идентификации бактерий вида Y.pseudotuberculosis позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного вида за 48 часов.

4. Разработанная схема ускоренной индикации бактерий вида Y.pseudotuberculosis методом РНФ позволяет обнаружить бактерии вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды в концентрации 103 - 101 м.к. в 1 мл за 19 - 28 часов, соответственно.

5. Разработаны технологические параметры изготовления активного и специфического биопрепарата на основе псевдотуберкулезных фагов для индикации и идентификации бактерий вида К pseudotuberculosis.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (Покров, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов YP - 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА и индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в

объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (11-12 февраля 2010 года).

Работа выполнена в соответствии с тематическим планом исследований кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГУ ВПО «Ульяновская ГСХА» «Диагностика и профилактика болезней молодняка сельскохозяйственных животных. Пищевые инфекции» (номер Государственной регистрации 01200203524).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (230 всего, в том числе 60 зарубежных авторов). Работа изложена на 151 страницах текста, иллюстрирована 32 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы

Питательные среды и реактивы: мясопептонный бульон, мясопептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), агар Эндо, среда для выделения возбудителей кишечного иереи ниоза и псевдотуберкулеза (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Серова (пропись по методическим рекомендациям УлГУ, 1996), среды Гисса с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург), натрий хлорид, мочевина, желчь дегидратированная, трихлорметан.

Лабораторная посуда и оборудование: термостат ТС-80М-2, автоклав ГК-100-3, шкаф сушильно-стерилизационный ШСС-80п УХЛ 42,

холодильник бытовой, дистиллятор, лабораторные центрифуги ОПн-8УХЛ 4,2 и ЦЛС - 3, водяная баня, термометр ртутный, мультимедийный микроскоп «Биомед-6» с вцдеофотонасадкой, штативы, спиртовки, цилиндры мерные, флаконы, чашки Петри, пробирки, пипетки градуированные, колбы, стекла предметные и покровные.

Штаммы бактерий: в работе использовали 96 штаммов бактерий: 5 референс-штаммов бактерий вида У. pseudotuberculosis, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА, а также 19 штаммов, выделенных нами из патологического материала, фекалий больных животных, объектов внешней среды; 72 штамма бактерий других родов и видов, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы (У. enterocolitica - 17, Staphylococcus - 3, Escherichia - 5, Proteus - 5, Citrobacter - 5, Klebsiella - 5, Enterococcus - 5, Providencia - 5, Aeromonas - 5, Pseudomonas - 5, Salmonella - 3, Serratia - 2, Bacillus - 5, Shigella - 2).

Объекты внешней среды: водопроводная вода, сточные воды, фекалии животных, пищевое сырье, патологический материал от больных и павших животных.

Объектами исследования являлись 7 штаммов фагов бактерий вида У. pseudotuberculosis, выделенные нами из объектов внешней среды.

Методы

Выделение и идентификацию бактерий вида У. pseudotuberculosis проводили в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ (1999), «Методическими указаниями по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах»г утвержденными МСХ РФ (2005), «Методическими рекомендациями

по эпидемиологии, клинике, диагностике и терапии псевдотуберкулеза и иерсиниоза» (Ценева, 2005). При необходимости использовали дополнительные тесты, изложенные в определителе бактерий Берджи (1997).

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов проводили с помощью методов, предложенных предложенным М. Адамсом (1961), Д.М. Голъдфарбом (1961), С. Лурия, Д. Дарнелл (1970), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (2006). Постановку РНФ для индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным В.Д. Тимаковым, Д.М. Голъдфарбом (1961), В.Я. Ганюшкинъш (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами (Аишарин, 1962; Бейли, 1970) с использованием программ Statistica - 6.0, Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение бактериофагов Y. pseudotuberculosis

Необходимым этапом наших исследований являлось выделение бактериофагов Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды. В качестве материалов исследования использовали сточные воды и фекалии животных свиноводческих и молочно-товарных ферм, частных хозяйств Ульяновской и Самарской областей, всего исследовано 52 пробы.

Исследуемый материал фильтровали через бумажный фильтр для освобождения от механических примесей. В колбу с 200 мл мясопептонного бульона вносили 50 мл исследуемого фильтрата сточных вод и по 1,0 мл 18-часовых культур бактерий Y pseudotuberculosis. Содержимое колбы инкубировали в термостате при температуре 37 °С. Через 24 - 48 часов исследуемый материал из колбы переносили в стерильную пробирку, обрабатывали хлороформом (1:10), а также центрифугировали при 700 g в течение 30 минут с целью инактивации и удаления бактериальной массы. В качестве контроля на чашки засевали индикаторные штаммы бактерий вида

Y. pseudotuberculosis методом агаровых слоев с 1 мл стерильного мясопептонного бульона.

Обработанный фильтрат исследовали методом агаровых слоев на присутствие псевдотуберкулезных бактериофагов. Наличие прозрачных негативных колоний или зон лизиса ка газоне роста культуры указывало на присутствие бактериофага в исследуемом фильтрате.

Выделение чистых линий фага проводили путем последовательных пассажей морфологически однотипных негативных колоний. Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили методом пассирования фага на индикаторной культуре Y. pseudotuberculosis.

В результате исследований выделено 7 изолятов бактериофагов Y. pseudotuberculosis (табл. 1).

Таблица 1 - Источники выделения фагов Y. pseudotuberculosis

Фаги Индикаторный штамм Y.ps. Источник Место и год выделения

YP - 1 УГСХА 19ВИЭВ Сточные воды Учебно-опытное хозяйство УГСХА, 2005

YP-2 УГСХА ВИЭВ III Сточные воды п. Тимирязевский, Ульяновский р-н, 2005

YP-3 УГСХА №19 ВИЭВ Сточные воды п. Октябрьский, Чердаклинский р-н, 2006

YP-4 УГСХА №19 ВИЭВ Фекалии поросят Самарская область, 2006

YP-5 УГСХА 01 №7 Сточные воды Птицефабрика «Ульяновская», Чердаклинский р-н, 2007

YP-6 УГСХА РЯЗ Фекалии поросят Ставропольский район, Самарская область, 2006

YP-7 УГСХА 0630 Сточные воды п. Тимирязевский, Ульяновский р-н, 2007

Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов

Морфология негативных колоний

Морфологию негативных колоний бактериофагов определяли на плотной питательной среде при посеве фагов методом Грациа (1936).

Выделенные штаммы бактериофагов формировали негативные колонии двух типов: четкие прозрачные колонии округлой формы, с ровными краями, диаметром от 1,5 до 2,5 мм; прозрачные колонии округлой формы, с ровными краями, диаметром от 3,0 до 8,5 мм, с зоной неполного лизиса, без вторичного роста культуры.

Литическая активность

Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методами Аппельмана (метод серийных разведений в жидкой питательной среде) и Грациа (метод агаровых слоев на плотной питательной среде).

Литическая активность исследуемых фагов составила от 10"8 до 10"'° по методу Аппельмана и от 5 х 107 до 1 х 109 по методу Грациа. Все изоляты фагов обладали литической активностью, достаточной для использования их в качестве диагностических препаратов (табл. 2).

Таблица 2 - Литическая активность бактериофагов К pseudotuberculosis

Бактериофаги Литическая активность

по методу Аппельмана (степень разведения) по методу Грациа (количество корпускул в 1 мл)

YP-1 УГСХА 10* 1 х Ю8

YP - 2 УГСХА 10'* 4 х 108

YP-3 УГСХА 10"* 1 х Ю8

YP - 4 УГСХА 10"8 5 х Ю7

YP - 5 УГСХА 10'* 3 х ю8

YP - 6 УГСХА 10* 2 х Ю8

YP - 7 УГСХА ю-10 1хЮ*

Спектр литической активности

Определение спектра литической активности проводили методом нанесения бактериофага на газон роста культуры бактерий вида К pseudotuberculosis. Установлено, что спектр литической активности фагов находился в пределах от 47,5 до 93,2 % из числа изучаемых штаммов. Максимальный совместный спектр литического действия (94 %) был

обнаружен у двух штаммов бактериофагов - YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА (табл. 3).

Специфичность

Определение специфичности проводили методом нанесения бактериофага на газон роста бактериальных культур штаммов гетерологичных родов, видов. Установлено, что бактериофаги обладают выраженной специфичностью к бактериям вида У. pseudotuberculosis и проявляют себя неактивными по отношению к бактериям других родов, видов (табл. 3).

Таблица 3 - Спектр литической активности и специфичность бактериофагов У. pseudotuberculosis *

Род (вид) бактерий Количество штаммов Бактериофаги серии УГСХА

YP-1 YP-2 YP-3 YP-4 YP-5 YP-6 YP-7

Процент лизируемых культур

Y.pseudotuberculosis 24 47,5 83,3 54,2 58,6 63,4 68,2 93,2

Y.enterocolitica 17 - - - - - - -

Staphylococcus 3 - - - - - - -

Serratia 2 - - - - - - -

Escherichia 5 - - - - - - -

Proteus 5 - - - - - - -

Salmonella 3 - - - - - - -

Citrobacter 5 - - - - - - -

Shigella 2 - - - - - - -

Klebsiella 5 - - - - - - -

Enterococcus 5 - - - - - - -

Providencia 5 - - - - - - -

Aeromonas 5 - - - - - - -

Pseudomonas 5 - - - - - - -

Bacillus 5 - - - - - - -

'Примечание: «-»- отсутствие лизиса

Температурная устойчивость

В результате изучения воздействия температурного фактора на бактериофаги У. pseudotuberculosis установлено, что все изоляты выделенных

фагов проявляют чувствительность к воздействию высокой температуры, т.е. являются термолабильными: температура в пределах 58 - 64 °С снижает литическую активность испытуемых фагов с 10s до 101 активных корпускул фага в 1мл фаголизата, температура выше 66 °С полностью их инактивирует (табл. 4). Обработка полученных данных методом дисперсионного анализа показала, что степень влияния температурного фактора на литическую активность фагов составляет от 41, 04 % до 95, 66 % при коэффициенте достоверности Фишера 2, 78 - 58, 78. Опыты с прогреванием индикаторных бактериальных культур Y. pseudotuberculosis при температуре 58 - 66 °С показали аналогичные результаты.

Чувствительность бактериофагов к воздействию хлороформа

При изучении устойчивости фагов У. pseudotuberculosis к воздействию хлороформа установлено, что обработка хлороформом в течение 60 минут не оказывает существенного влияния на активность фагов (табл. 5). Дисперсионный анализ полученных данных показал, что степень влияния хлороформа составляет от 14, 29 до 26, 91 % при недостоверном влиянии факториапьной дисперсии на активность фагов. Воздействие хлороформом на индикаторные бактериальные культуры Y. pseudotuberculosis в течение 15 минут вызывает полную инактивацию исследуемых штаммов. Полученные данные позволяют использовать хлороформ в качестве средства для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий.

Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных псевдотуберкулезных бактериофагов

На основании изученных биологических свойств выделенных бактериофагов были отобраны два изолята псевдотуберкулезных фагов YP -2 УГСХА и YP - 7 УГСХА с целью конструирования диагностического биопрепарата. Фаги обладали литической активностью не ниже 108 и строгой специфичностью, совместный спектр литического действия данных фагов составил 94 %.

Таблица 4 — Температурная устойчивость бактериофагов У. pseudotuberculosis*

Фаги Титр фагов после обработки температурой, количество активных корпускул в 1 мл Контроль активности фагов

58 °С 60 °С 62 °С 64 °С 66 °С

YP-1 1,5Х105± 0,ЗХ105* З,0х103± 1,0хЮ3* 1,3x10^0,3x10'* - - 1,ЗхЮ8±0,ЗхЮ8

YP-2 3,0х104±1,1х104* 2,7х104± 1,6X1 О4* 6,3х 102± 1,3х102* 4,7x10^0,8x10'* 3,0х10'±1,1х10'* 4,6хЮ8± 1,2хЮ8

YP-3 3,3х104± 1,8х104 2,Зх103±0,8х103 - - - 1,6хЮ8х0,6х105

YP-4 6,0х103±2,0*103" 3,0х104±0,5х104" 3,1x10^ l.OxlO2** - - 8,0x10'± 1,1x10'

YP-5 8,7Х104±0,8Х104* 11,7хЮ4±0,8Х104* 2,3х104± 0,6X1 О4* 5,0хЮ'± 1,1x10'* - 1,3х108±0,3х108

YP-6 3,7х106± 1,2x10s* 4,7x105 ±0,8X1 О5" 9,0X1 О5 ±2,6x105* 7,0х102±1,5х102** - 5,0хЮ7± 0,5x10'

YP-7 7,0ХЮ4± 1,0Х104 1,Зх103±0,Зх103 1,4ХЮ2±0^ХЮ2 2,7x10'±0,8x10' 2,6хЮ8± 1,2x10"

Таблица 5 — Устойчивость бактериофагов У. pseudotubercidosis к воздействию хлороформа*

Фаги Титр бактериофагов после обработки хлороформом, количество активных корпускул в 1 мл Контроль активности фагов

15 мин 30 мин 45 мин 60 мин

YP-1 2,0хЮ8± 1,0х108 2,ЗхЮ8± 1,ЗХЮ8 1,Зх108±0,ЗхЮ8 9,0х107± 1,0хЮ7 1,3х108±0,3х108

YP-2 1,2хЮ8±0,Зх108* 2,ЗхЮ8± 1,ЗхЮ8' 1,6хЮ8± 0,7х 108* 7,7х 108± 2,3x108 1,ЗхЮ9±0,ЗхЮ9

YP-3 1,6х108±0,6хЮ8 2,0х108±0,5ХЮ8 2,ЗхЮ8±0,8х108 1,Зх108±0,ЗхЮ8 4,0x108 ±3,0x108

YP-4 4,3х108± 1,2x1 О8 6,0x1 О8± 2,6хЮ8 2,9х108± 1,2хЮ8* 4,0x108 ±0,5x108* 1,Зх109±0,ЗхЮ9

YP-5 5,0хЮ8± 1,5Х108 2,ЗхЮ8±0,ЗХЮ8 3,3х108± 1,2хЮ8 3,2х108± 1,0хЮ8 6,0х108± 1,5хЮ8

YP-6 1,3х108±0,3х108 6,3X1 О7 ±2,0x107 4,0x107 ± 1,0x107 2,7хЮ7± 1,2хЮ7 5,7хЮ7±0,8х107

YP-7 4,0x108 ±3,0x108 5,0хЮ8±0,5Х108* 4,0хЮ8±3,0ХЮ8 1,5х108±0,7хЮ8 2,7хЮ8±0,ЗХЮ8

* Примечание: *Р < 0,05; **Р <0,01

Определены оптимальные технологические параметры для изготовления диагностического препарата с высокой литической активностью: соотношение концентрации фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторного штамма бактерий вида У. pseudotuberculosis составляет 1:2, время инкубации при температуре 37 °С - 6 часов.

Разработка параметров ускоренной идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью бактериофагов

С учетом строгой родовой специфичности селекционированных бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА в отношении бактерий вида У. pseudotuberculosis, была разработана схема выделения и ускоренной идентификации вышеуказанных микроорганизмов (рис. 1). В исследованиях использовали воду, комбикорм, пищевое сырье, контаминированные бактериями вида Y. pseudotuberculosis в концентрации 105 - 101 м.к. в 1 мл.

Посев исследуемого материала производили на среды Эндо, Серова и СБТС. Посевы инкубировали в термостате 18-20 часов при температуре 37 °С. Бульонные культуры, полученные после пересева колоний, подвергали микроскопии (окраска по Граму). При наличии в мазках мелких грамотрицательных палочек проводили идентификацию выделенных культур бактериологическим методом и фагоидентификацию методом нанесения бактериофага на газон роста изучаемой культуры. Наличие зоны лизиса на сплошном газоне роста культуры в месте нанесения фагов указывало на принадлежность исследуемого штамма к виду Y. pseudotuberculosis. Результаты фагоидентификации выделенных штаммов как бактерий вида У. pseudotuberculosis подтверждены данными исследований биохимических свойств. Экспериментальные данные подтверждают возможность идентификации бактерий вида У. pseudotuberculosis с помощью фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА, срок исследования по сравнению с бактериологическим методом при этом сокращается с 4 до 2 суток при меньшем расходе питательных сред, реактивов, лабораторной посуды.

Итого: 48 часов (2 суток) Итого: 96 часов (4 суток)

Рис. 1. Выделение бактерий вида Y. pseudotuberculosis и ускоренная идентификация с помощью бактериофагов (1) в сравнении с традиционной схемой бактериологического исследования (2)

Разработка оптимальных условий постановки РНФ

Определение количественного показателя РНФ

Для определения уровня нарастания титра, при котором РНФ можно считать положительной, были проведены эксперименты по обнаружению культур Y. pseudotuberculosis в разных заражающих концентрациях (от 105 до

101 м.к./мл) в мясопептонном бульоне. Установлено, что результат реакции является положительным (увеличение количества корпускул фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА более чем в 5 раз) в пробах при контаминации мясопептонного бульона бактериями Y. pseudotuberculosis в концентрации 103 м.к./мл.

Определение оптимального времени постановки РНФ Разработка оптимальных условий постановки РНФ включает определение времени наиболее полноценного взаимодействия фага с бактериями. Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:

- предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16 и 24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10, 16,24 часов при температуре 37 °С.

В результате исследований установлено, что метод РНФ с предварительным подращиванием исследуемого материала в течение 5 часов позволяет обнаружить бактерии Y. pseudotuberculosis в количестве 103 м.к./мл, время проведения исследований составляет 22 часа (табл. 6).

Таблица 6 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания

исследуемого материала с фагами YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА

Время контакта, часов Концентрация бактерий У. ps., обнаруживаемая методом РНФ Время исследований, часов

5+5 10* 22

16+5 10' 33

24+5 10' 41

Увеличение времени подращивания исследуемого материала до 16 часов повышает чувствительность реакции до 101 м.к./мл с увеличением сроков исследования до 33 часов. Подращивание материала в течение 24 часов существенно не повлияло на результаты РНФ.

Опыты по изучению чувствительности реакции в зависимости от времени контакта исследуемого материала с фагом показали, что РНФ с 7-часовой экспозицией материала с фагами YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА позволяет провести индикацию бактерий вида У. pseudotuberculosis в концентрации 103 м.к./мл за 19 часов (табл. 7, 8).

Таблица 7 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени контакта

исследуемого материала с фагом YP - 2 УГСХА

Время контакта, Концентрация бактерий Y. ps., Время исследований,

часов обнаруживаемая методом РНФ часов

7 10J 19

10 103 22

16 10' 28

24 10' 36

Инкубация исследуемого материала с фагом в течение 16 часов повышает чувствительность РНФ доЮ2 - 101 м.к./мл, время исследований составляет 28 часов. 24-часовая экспозиция материала с фагами характеризуется одинаково высокой чувствительностью реакции (101 м.к./мл) с увеличением сроков исследования до 36 часов.

Таблица 8 - Чувствительность РНФ в зависимости от времени контакта

исследуемого материала с фагом YP - 7 УГСХА

Время контакта, Концентрация бактерий У. ps., Время исследований,

часов обнаруживаемая методом РНФ часов

7 10J 19

10 10J 22

16 \0г 28

24 10' 36

В результате проведенных исследований установлено, что РНФ с предварительным подращиванием материала является одинаково чувствительной по сравнению с РНФ без подращивания, но более продолжительной по времени. Таким образом, наиболее оптимальным

является режим РНФ при инкубации исследуемого материала с фагом в течение 7 часов, поскольку позволяет обнаружить бактерии У. pseudotuberculosis в количестве 103 - 102 м.к./мл за 19-28 часов. Данный режим рекомендован для дальнейших исследований.

В настоящее время исследователи уделяют большое внимание разработке простых и надежных методов обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды. Для определения возможности использования РНФ для индикации бактерий вида У. pseudotuberculosis в объектах внешней среды были проведены исследования различных проб воды, контаминированных У. pseudotuberculosis.

Результаты исследований показали, что увеличение титра фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации бактерий вида У. pseudotuberculosis в материале 103 м.к./мл при наличии посторонней микрофлоры.

По результатам исследования установлено преимущество РНФ перед бактериологическим методом исследования. С помощью РНФ можно обнаружить бактерии У. pseudotuberculosis в концентрации 103 за 19 - 22 часа. Бактериологическим методом удавалось обнаружить искомые бактерии в минимальной концентрации 104 м.к./мл, при этом затрачивается не менее 96 часов.

Изученне эффективности биопрепарата «YP - 09 УГСХА»

Для возможности использования биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе псевдотуберкулезных фагов необходимым условием было изучение эффекта их совместного действия. Установлено, что биопрепарат на основе фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА по некоторым показателям (высокая литичеекая активность, широкий спектр литической активности, выраженная видовая специфичность, более высокий по сравнению с бактериями порог инактивации) соответствует отдельным монофагам. Антагонистический эффект при взаимодействии данных фагов отсутствует.

выводы

1. Из объектов внешней среды (сточные воды, фекалии животных) выделено 7 штаммов бактериофагов, активных по отношению к бактериям вида У. pseudotuberculosis.

2. Изучены биологические свойства выделенных фагов Y. pseudotuberculosis, в результате исследований установлено, что:

изоляты фагов формируют однородные негативные колонии с ровными, четко выраженными краями, диаметром от 3,5 до 6,5 мм; литическая активность фагов составляет от 10"8 до Ю"10 по методу Аппепьмана и от 107 до 109 по методу Грациа\

фаги обладают выраженной специфичностью к бактериям вида Y. pseudotuberculosis, активны и не лизируют бактерии гетерологичных видов и родов;

фаги проявляют термолабильность (порог инактивации - 66 °С) и устойчивы к воздействию хлороформа.

3. Бактериофаги YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА обладают выраженными биологическими свойствами, совместным спектром литической активности 94 % по отношению к изученным штаммам бактерий вида Y. pseudotuberculosis и пригодны для изготовления биопрепарата.

4. Разработанная схема фагоидентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью индикаторных бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА позволяет идентифицировать гомологичные бактерии за 48 часов, традиционный бактериологический метод выделения бактерий составляет 96 часов.

5. Разработаны технологические параметры постановки реакции нарастания титра фага для ускоренной индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды. Метод РНФ с использованием биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА позволяет обнаружить указанные бактерии в концентрации от 103 -10' м.к. в 1 мл исследуемого материала за 19 - 28 часов, соответственно.

6. Разработанные технологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА позволяют получить специфичный биопрепарат с высокой литической активностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА активных по отношению к бактериям вида У. pseudotuberculosis, обладающие строгой видовой специфичностью, широким спектром литической активности для изготовления диагностического биопрепарата «YP - 09 УГСХА».

2. Разработаны «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида У. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА».

3. Индикацию бактерий вида У. pseudotuberculosis в объектах внешней среды предлагаем проводить с помощью набора диагностических бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА, согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации методом РНФ бактерий вида У. pseudotuberculosis в патологическом материале, кормах, пищевых продуктах и объектах внешней среды».

4. Изготовление и контроль набора бактериофагов рекомендуем проводить согласно «Инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов У. pseudotuberculosis YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Катмакова, Н.П. Обзор бактериологических методов выделения бактерий Yersinia pseudotuberculosis / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции

«Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы», 26 - 28 апреля, 2005. - Ульяновск, 2005. -Ч. 5. - С.216 - 221.

2. Катмакова, Н.П. Основные факторы передачи возбудителя псевдотуберкулеза / Н.П. Катмакова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.И. Козин, С.В. Мерчина // Материалы международной научно-практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 21 - 23 июня, 2006. - Ульяновск, 2006.-С. 363-367.

3. Катмакова, Н.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных энтеробактерий / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев, JI.C. Каврук, Н.И. Молофеева, Л.П. Пульчеровская, Б.М. Коритняк, Е.Н. Бульканова, Н.А. Феоктистова, Е.Н. Пожарникова, А.С. Мелехин, Н.Г. Барт // Материалы международной научно-практической конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», 21-23 июня, 2006. - Ульяновск, 2006. - С. 227 - 231.

4. Катмакова, Н.П. Выделение фагов бактерий вида У pseudotuberculosis из объектов и материалов внешней среды / Н.П. Катмакова, Д.А.Васильев, С.Н. Золотухин, Э.А. Афонин // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», 12-13 октября, 2006. - Санкт-Петербург, НИИЭМ им. Пастера, 2006. С.151 - 153.

5. Катмакова, Н.П. Выделение, селекция и изучение некоторых биологических свойств бактериофагов У. pseudotuberculosis / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК», 22 - 24 ноября, 2006. - Ульяновск, 2006.-Ч. 1,-С. 319-322.

6. Катмакова, Н.П. Изучение температурной устойчивости бактериофагов Yersinia pseudotuberculosis / Н.П. Катмакова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Материалы международной научно-практической

конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА, 20 - 22 мая 2008. - Ульяновск,

2008.-Т. 4.-С. 106- 107.

7. Катмакова, Н.П. Селекция псевдотуберкулезных бактериофагов для создания диагностического препарата // Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Материалы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел», 9-10 октября, 2008. - Москва, 2008.-С. 129- 131.

8. Катмакова, Н.П. Изучение основных биологических свойств фагов бактерий вида Yersinia pseudotuberculosis / Н.П. Катмакова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных», 13-14 ноября, 2008. - Покров, 2008. - Т. I. - С. 212 - 214.

9. Катмакова, Н.П. Разработка схемы постановки РНФ для индикации бактерий вида Yersinia pseudotuberculosis в объектах внешней среды / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин // Материалы конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины», 3 —4 декабря, 2009. - Покров, 2009. - С. 140 - 143.

10. Катмакова, Н.П. Разработка оптимальных технологических параметров постановки РНФ с биопрепаратом YP - 09 УГСХА / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев // Естественные и технические науки. - Москва,

2009,-№6.-С. 202-204.

11. Катмакова, Н.П. Поиск и селекция псевдотуберкулезных фагов / Н.П. Катмакова, С.Н. Золотухин, Д.А. Васильев. // Ветеринарная медицина. -Москва, 2009. - № 4. - С. 19 - 20.

Ч {и

Огпечатано в ООО «Вега-МЦ» г. Ульяновск, 9-й пр-д Инженерный, д. 10 Тел: (8422)25-04-39

Заказ №4007. Тираж 100 экз. Бумага офсетная

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Катмакова, Надежда Петровна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 1.1 Характеристика бактерий вида Yersinia pseudotuberculosis.

1.2 Распространение, источники заражения, факторы передачи

Y. pseudotuberculosis.

1.3 Патогенез и клинические проявления болезни.

1.4 Лабораторная идентификация бактерий вида

Y. pseudotuberculosis.

1.5 Применение бактериофагов в диагностической практике.

П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Материалы.

2.1.2 Методы.

2.2 Результаты собственных исследований и их обсуждение

2.2.1 Выделение и идентификация бактерий вида

Y. pseudotuberculosis.

2.2.2 Выделение бактериофагов Y. pseudotuberculosis.

2.2.3 Характеристика биологических свойств выделенных бактериофагов.

2.2.4 Разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторных псевдотуберкулезных фагов.

2.2.5 Разработка параметров ускоренной идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью бактериофагов.

2.2.6 Разработка оптимальных условий постановки РНФ.

2.2.7 Использование РНФ для индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды

2.2.7.1 Исследование с помощью РНФ проб воды, контаминированных бактериями вида Y. pseudotuberculosis.

2.2.7.2 Исследование с помощью РНФ комбикорма, контаминированного бактериями вида Y. pseudotuberculosis.

2.2.7.3 Исследование с помощью РНФ фекалий, контаминированных бактериями вида Y. pseudotuberculosis.

2.2.7.4 Исследование с помощью РНФ мяса, контаминированного бактериями вида Y. pseudotuberculosis.

2.2.8 Изучение эффективности сконструированного биопрепарата псевдотуберкулезных фагов «УР — 09 УГСХА».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis"

Актуальность темы

Инфекция, вызываемая Yersinia pseudotuberculosis, привлекает к себе i внимание исследователей в связи с ростом заболеваемости и все более широким ее распространением [140,169,192, 149].

Несмотря на достигнутые успехи в изучении многих аспектов иерсиниозов, актуальность этой проблемы сохраняется. Стабильные показатели заболеваемости по РФ псевдотуберкулезом (данные официальной статистики) — 7Д на 100 тыс. населения — в последние 5 лет не отражают истинного распространения инфекций [58]. Анализ изученных факторов патогенности подтверждает абсолютную патогенность бактерий вида Y pseudotuberculosis для людей и животных [152,122,146,170].

О выделении штаммов Y. pseudotuberculosis из отдельных регионов при эпидемических вспышках, групповых заболеваниях или спорадических случаях людей и животных сообщается в работах М. Tsubokura et al. [217], Г.Г. Головиной [37], С.Н. Бениовой [15], М.В. Чесноковой [115], К. Jalava et al. [203], S. Kangas et al. [230] и др.

В последние годы выражена тенденция к активному изучению и применению в лабораторно-диагностической практике фагов бактерий различных родов и видов [34, 52, 155, 121, 11]. Бактериофаги применяются для идентификации и фаготипирования бактерий, а также ускоренной индикации возбудителей бактериальных инфекций в различных субстратах. Все большую актуальность приобретают фаготерапия и фагопрофилактика инфекционных болезней как альтернатива использованию антибиотиков.

Многообразие клинических форм псевдотуберкулезной инфекции, высокая стоимость современных лабораторных методов, отсутствие квалифицированных кадров зачастую затрудняют постановку диагноза в рядовых лабораториях, в связи с чем поиск и разработка методов своевременной индикации возбудителя, вызывающего заболевание, являются актуальной задачей.

Цель исследования

Разработка технологических параметров изготовления и применения биопрепарата «YP - 09 УГСХА» на основе выделенных специфических фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Задачи исследования

1. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий вида Y.pseudotuberculosis.

3. Подобрать штаммы бактериофагов с заданными биологическими свойствами - высокой литической активностью, широким спектром логического действия, выраженной видовой специфичностью, более высоким, чем у бактерий, порогом инактивации - для конструирования диагностического биопрепарата.

4. Разработать схему идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью специфических псевдотуберкулезных бактериофагов.

5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью диагностического биопрепарата на основе фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА методом РНФ.

6. Разработать биотехнологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «УР — 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных бактериофагов Y. pseudotuberculosis.

Научная новизна

Выделены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.

Разработаны параметры схемы индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды с помощью выделенных и изученных бактериофагов.

Впервые разработана технология изготовления диагностического биопрепарата на основе специфических псевдотуберкулезных фагов.

Практическая значимость

Выделены и селекционированы специфичные псевдотуберкулезные бактериофаги, пригодные для изготовления диагностического биопрепарата с целью индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды.

Разработана «Инструкция по изготовлению и контролю серии индикаторных псевдотуберкулезных бактериофагов YP - 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА», предложены «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с использованием диагностических бактериофагов YP - 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага бактерий вида Y pseudotuberculosis в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды», утвержденные ректором Ульяновской ГСХА (3 сентября, 2010).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная схема выделения бактериофагов позволяет обнаружить и изолировать вирулентные фаги Y. pseudotuberculosis из объектов внешней среды.

2. Выделенные и изученные штаммы бактериофагов Y pseudotuberculosis пригодны для изготовления диагностического биопрепарата.

3. Разработанная схема ускоренной идентификации бактерий вида Y.pseudotuberculosis позволяет выделить и идентифицировать бактерии данного.вида за 48 часов.

5. Разработаны технологические* параметры изготовления' активного' и специфического биопрепарата, на основе псевдотуберкулезных фагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), «Аграрная- наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК» (Ульяновск, 2006); П Всероссийской научно-практической , конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); Международных научно-практических конференциях: «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы, с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); конференции молодых ученых, посвященной памяти члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. 70-летию со дня рождения «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (Покров, 2009).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов YP — 2 УГСХА, YP - 7 УГСХА и индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды методом РНФ подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА (11 - 12 февраля 2010 года).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и список использованных литературных источников (230 всего, в том числе 60 зарубежных авторов). Работа изложена на 151 страницах текста, иллюстрирована 32 таблицами, 15 рисунками и дополнена приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Катмакова, Надежда Петровна

ВЫВОДЫ

1. Из объектов внешней среды (сточные воды, фекалии животных) выделено 7 штаммов бактериофагов, активных по отношению к бактериям вида Y. pseudotuberculosis.

2. Изучены биологические свойства выделенных фагов Y. pseudotuberculosis, в результате исследований установлено, что: изоляты фагов формируют однородные негативные колонии с ровными, четко выраженными краями, диаметром от 3,5 до 6,5 мм;

О |Л литическая активность фагов составляет от 10" до 10" по методу Аппельмана и от 107 до 109 по методу Грациа\

- фаги обладают выраженной специфичностью к бактериям вида Y. pseudotuberculosis, активны и не лизируют бактерии гетерологичных видов и родов;

- фаги проявляют термолабильность (порог инактивации - 66 °С) и устойчивы к воздействию хлороформа.

3. Бактериофаги YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА обладают выраженными биологическими свойствами, совместным спектром литической активности 94 % по отношению к изученным штаммам бактерий вида Y pseudotuberculosis и пригодны для изготовления биопрепарата.

УГСХА позволяет обнаружить указанные бактерии в концентрации от 10 -101 м.к. в 1 мл исследуемого материала за 19 — 28 часов, соответственно.

6. Разработанные технологические параметры изготовления и контроля диагностического биопрепарата «YP — 09 УГСХА» на основе выделенных и изученных фагов УР — 2 УГСХА и УР — 7 УГСХА позволяют получить специфичный биопрепарат с высокой литической активностью.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 2 штамма бактериофагов YP - 2 УГСХА и УР - 7 УГСХА активных по отношению к бактериям вида Y. pseudotuberculosis, обладающие строгой видовой специфичностью, широким спектром литической активности для изготовления диагностического биопрепарата «УР — 09 УГСХА».

2. Разработаны «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis из патологического материала, пищевых продуктов, кормов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов УР - 2 УГСХА и УР - 7 УГСХА».

3. Индикацию бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды предлагаем проводить с помощью набора диагностических бактериофагов УР - 2 УГСХА и УР - 7 УГСХА, согласно «Методическим рекомендациям по ускоренной индикации методом РНФ бактерий вида Y.pseudotuberculosis в патологическом материале, кормах, пищевых продуктах и объектах внешней среды».

4. Изготовление и контроль биопрепарата бактериофагов Y.pseudotuberculosis рекомендуем проводить согласно «Инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Y.pseudotuberculosis УР - 2 УГСХА и УР - 7 УГСХА».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфекции, вызываемые иерсиниями, широко распространены на территории России и других развитых стран. В настоящее время накоплен обширный материал по изучению псевдотуберкулезной инфекции у человека [170, 127, 149] и животных [187, 191, 196, 201].

Сходство морфологических, культуральных, биохимических свойств бактерий Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, а также близкое антигенное родство возбудителя псевдотуберкулеза с некоторыми видами бактерий семейства Enterobacteriaceae затрудняют дифференциальную диагностику этих микроорганизмов.

Для разработки мер борьбы и профилактики инфекции животных, вызываемой бактериями вида Y. pseudotuberculosis, остаются актуальными вопросы диагностики и индикации названных микроорганизмов в разных субстратах.

Специалисты, работающие в области лабораторной диагностики ' энтеробактерий, подчеркивают сложность выделения бактерий Y pseudotuberculosis. Это связано с тем, что данные микроорганизмы хорошо растут на всех питательных средах, предназначенных для культивирования энтеробактерий, и почти всегда вырастают в смешанных культурах.

Использование существующих в настоящее время лабораторных методов диагностики псевдотуберкулезной инфекции не умаляет • актуальности разработки новых средств индикации возбудителя.

Целью наших исследований являлась разработка технологии изготовления и применения биопрепарата на основе специфических псевдотуберкулезных бактериофагов для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды.

Основные задачи наших исследований включали выделение псевдотуберкулезных бактериофагов из объектов внешней среды, изучение биологических свойств и селекцию выделенных фагов.

В качестве источников выделения изолятов бактериофагов использовали сточные воды и фекалии животноводческих хозяйств Ульяновской и Самарской областей. В результате проведенных исследований было выделено 7 изолятов бактериофагов Y. pseudotuberculosis. На основании изученных биологических свойств выделенных фагов (морфология негативных колоний, литическая активность, спектр литической активности, специфичность действия, температурная устойчивость, устойчивость к воздействию хлороформом) были отобраны два штамма бактериофагов для конструирования диагностического биопрепарата с целью использования его для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Выделенные изоляты фагов формировали прозрачные негативные колонии двух типов: округлой формы с ровными четкими краями, диаметром от 1,5 до 2,5 мм, без вторичного роста и зоны лизиса, а также округлые колонии, диаметром от 3,0 до 8,5 мм с зоной лизиса.

Литическая активность бактериофагов, которую определяли по методам Аппельмана и Грациа, составила

10-8 10-ю 5х107 1х109 соответственно.

Для изучения диапазона литической активности использовали штаммы Y. pseudotuberculosis. Спектр литической активности выделенных фагов составил от 47,5 до 93,2 % лизируемых культур.

Для определения видовой специфичности бактериофагов были использованы гетерологичные штаммы бактерий родов Yersinia, Staphylococcus, Escherichia, Proteus, Citrobacter, Klebsiella, Enterococcus, Providencia, Aeromonas, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, Bacillus, Shigella.

Установлено, что исследуемые фаги являются специфичными для бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Исследования по изучению термоустойчивости выделенных изолятов бактериофагов показали, что изучаемые нами фаги проявляли чувствительность к воздействию температурного фактора: температура в пределах 64 - 66 °С являлась критической для развития данных фагов.

Опыты с использованием хлороформа как фактора внешней среды показали устойчивость изучаемых фагов к обработке хлороформом в течение 60 минут. Полученные данные позволяют использовать хлороформ в качестве химического агента для обработки фаголизата от посторонней микрофлоры.

На основании изученных биологических свойств выделенных фагов Y. pseudotuberculosis были отобраны 2 изолята бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА для изготовления диагностического биопрепарата. Указанные бактериофаги формируют однородные негативные колонии (от 3,0 до 8,5 мм), обладают высокой литической активностью не ниже 10"9 по о Q

Аппельману и 10 - 10 фаговых корпускул в 1,0 мл по Грациа. Совместный спектр литической активности данных фагов составляет 94 %. Бактериофаги проявляют выраженную специфичность по отношению к бактериям гетерологичных родов и видов, являются термолабильными и проявляют устойчивость к воздействию хлороформа в течение 60 минут.

Разработаны оптимальные технологические параметры для изготовления биопрепарата с высокой литической активностью: соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов бактерий вида Y. pseudotuberculosis составляет 1:2, время инкубации при температуре 37 °С составляет 6 часов. Для инактивации жизнеспособных бактерий в фаголизате проводится обработка хлороформом в соотношении 1:10 в течение 30 минут.

Нами была изучена возможность использования индикаторных бактериофагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА для идентификации и индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis.

Современные лабораторные методы индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis позволяют успешно провести диагностику заболевания [58, 161, 139, 170]. Однако, применение генетических и иммунологических методов сдерживается высокой стоимостью технического оборудования и требованием к наличию квалифицированных специалистов.

Бактериологический метод выделения и идентификации бактерий Y. pseudotuberculosis основан на определении биохимических свойств выделенной культуры [127].

Нами разработана и предложена схема ускоренной идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis с помощью индикаторных фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА. Чувствительность культуры к указанным индикаторным фагам (феномен лизиса) служит основанием для дифференциации исследуемой культуры как вида Y. pseudotuberculosis. Срок исследования при этом сокращается с 4 до 2 суток при меньшем расходе сред и лабораторной посуды.

Эффективность применения реакции нарастания титра фага для индикации возбудителей во внешней среде подтверждают многие исследователи [50, 116, 48, 54].

Необходимым условием для ускоренной индикации бактерий вида Y.pseudotuberculosis в различных субстратах методом РНФ является разработка оптимальных условий постановки реакции.

Первый этап разработки оптимальных параметров постановки реакции включал определение количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение. Исследования проводили путем постановки РНФ на МПБ, контаминированном индикаторными культурами Y. pseudotuberculosis в концентрации 101 - 105 м.к./мл. По данным разных исследователей РНФ считается положительной при уровне нарастания титра от 2 до 10 раз [87, 95]. Оценку результатов РНФ проводили в соответствии с показателями, разработанными В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом [143]. Положительным считали результат реакции, при котором произошло увеличение титра фага по сравнению с контролем более чем в 5 раз. Выбранный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага. Результаты индикации псевдотуберкулезных бактерий с помощью РНФ подтверждали бактериологическим методом и специфичностью РНФ с контрольными пробами.

Второй этап разработки параметров проведения реакции включал определение оптимального времени постановки РНФ. Для этих целей были проведены эксперименты для определения наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры.

Оптимальное время экспозиции выбирали из следующих параметров:. предварительное подращивание исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом до 7, 10,16,24 часов при температуре 37 °С.

Оптимальным, по нашим данным, является режим РНФ при 7-часовой экспозиции исследуемого материала с фагами, когда удается провести индикацию бактерий вида Y. pseudotuberculosis в количестве 10 микробных клеток в 1 мл исследуемого субстрата. Время исследования при этом составляет 19 часов. Увеличение времени контакта исследуемого материала с фагом (без предварительного подращивания) в пределах 10 - 16 часов повышает чувствительность реакции: бактерии вида Y. pseudotuberculosis

О 1 обнаруживаются в количестве

10" - 101 м.к./мл, при этом на проведение исследований затрачивается 22 - 28 часов.

Чтобы установить возможность использования метода РНФ для индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды, нами были проведены исследования проб водопроводной воды, комбикорма, мяса, фекалий.

При использовании разработанного режима РНФ для исследования проб мяса, комбикорма, фекалий, контаминированных бактериями вида Y. pseudotuberculosis получены отрицательные результаты: нарастания титра фагов в исследуемых пробах не произошло.

Положительные результаты получены при исследовании водопроводной воды, содержащей постороннюю микрофлору и бактерии Y.pseudotuberculosis в количестве от 101 до 105 м.к./мл, при этом отмечена эффективность использования специфических бактериофагов по сравнению с бактериологическим методом исследования. С помощью РНФ удается обнаружить бактерии Y. pseudotuberculosis в исследуемом субстрате в количестве 10 м.к./мл за 19 часов. Бактериологическим методом удавалось обнаружить бактерии Y. pseudotuberculosis в минимальной концентрации 104 м.к./мл, время проведения исследований при этом составляет более 96 часов.

Таким образом, экспериментальные данные позволяют рекомендовать метод РНФ для индикации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в различных пробах воды.

Нами изучалась возможность использования биопрепарата, изготовленного на основе псевдотуберкулезных фагов. Для этого мы определяли литическую активность отдельно взятых фагов YP - 2 УГСХА и YP - 7 УГСХА и фагов в совокупности, при этом были получены аналогичные результаты. Антагонистический эффект взаимодействия фагов отсутствует. По данным исследований установлена возможность конструирования биопрепарата, состоящего из двух штаммов псевдотуберкулезных фагов.

В результате проведенных исследований предложен диагностический биопрепарат «УР - 09 УГСХА», изготовленный на основе псевдотуберкулезных фагов УР - 2 УГСХА и УР - 7 УГСХА для индикации и идентификации бактерий вида Y. pseudotuberculosis в объектах внешней среды.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Катмакова, Надежда Петровна, Ульяновск

1. Аврех, В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов / В.В. Аврех // ЖМЭИ. 1954. - № 7. С. 93-96.

2. Адаме, М. Бактериофаги / М. Адаме. М. : Медгиз, 1961. - 521 с.

3. Алексеева, А.П. Получение и характеристика моноклональных антител к Y. enterocolitica 0:9 / А.П. Алексеева // Биотехнология. 2000. - № 2. - С. 79-83.

4. Арский, В.Г. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии / В.Г. Арский, 3.3. Ахметов, А.В. Ясенский // Здравоохранение Таджикистана. 1961. - № 2. - С. 5-11.

5. Архангельский, И.И. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров / И.И. Архангельский, Б.А. Степанов // Ветеринария. 1966. - №3. - С. 27.

6. Афанасьев, Н.Н. Псевдотуберкулез у детей / Н.Н. Афанасьев // Журн. Мать и дитя в Кузбассе. 2008. - № 1 (32). - С. 3-5.

7. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев. Л., 1962.

8. Бактериофаги Yersinia enterocolitica : обнаружение и идентификация / Т.А. Кудрякова и др. // Клин. лаб. диаг. 2010. - № 4. - С. 43-45.

9. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии / С.Н. Золотухин и др. // Ветеринарная патология. 2006. - № 3. - С. 80-85.

10. Бейли, Н. Математика в биологии и медицине / Н. Бейли. М.: Мир, 1970.-326 с.

11. Биологические и биохимические характеристики Y. pseudotuberculosis, культивируемых при разных температурах / Н.Ф. Тимченко и др. // Природноочаговые болезни Сибири и дальнего Востока. Новосибирск. -1984.-С. 65-74.

12. Биосинтез ДНК, РНК и белка в клетках Yersinia pseudotuberculosis при разных температурах культивирования / В.Г. Кузнецов и др. // Журн. микробиол. 2000. - № 6. - С. 18-22.

13. Бузолева, JI.C. Влияние температуры культивирования на содержание нуклеиновых кислот у бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia pseudotuberculosis / JI.C. Бузолева, Т.И. Бурцева, Г.П. Сомов // Журн. микробиол. 2000. - № 6. - С. 22-25.

14. Влияние Yersinia pseudotuberculosis на продукцию цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro / А.В. Воропаев и др. // Журн. микробиол. -2002.-№4. -С. 48-51.

15. Влияние термостабильного токсина Yersinia pseudotuberculosis на окислительную и антиокислительную активность лейкоцитов крови человека // Н.Ф. Тимченко и др. // ЖМЭИ. 1998. - № 6. - С. 16-20.

16. Возможности метода флюоресцирующих антител (МФА), применительно к изучению распространенности кишечного иерсиниоза среди людей / Н.А. Лысенко и др. // Иерсиниозы : тез. всесоюз. науч.-практической конф. Владивосток, 1989. — Ч. 2. — С. 110-111.

17. Воронцова, А.В. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании / А.В. Воронцова // Тез. докл. на межинстит. конф. по проблеме «Кишечные инфекции». М., 1961.-С. 127-128.

18. Выявление и изучение динамики численности некультивируемых форм Yersinia pseudotuberculosis во внешней среде при использовании полимеразной цепной реакции / М.Ю. Аксенов и др. // ЖМЭИ. 1995. - № 2.-С. 80-83.

19. Выявление кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза у животных / А.С. Собакин и др. // Ветеринария. 1998. - № 8. - С. 15-16.

20. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. Минск. - 1973. - С.5-24.

21. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences / И.М. Габрилович // ЖМЭИ. 1992. - № 6. - С. 10-12.

22. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин. Ульяновск, 1988. - 45 с.

23. Ганюшкин, В.Я. Опыт фагопрофилактики сальмонеллеза поросят. / В.Я. Ганюшкин // Новое в краевой патологии сельскохозяйственных животных : сб. научн. тр. Ульяновского с/х ин-та. — Ульяновск. — 1987. С. 3.

24. Ганюшкин, В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят / В.Я. Ганюшкин // Ветеринария. 1967. - № 3. - С. 69-71.

25. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб ; под ред. и с предисл. проф. В.Д. Тимакова. М. : Медгиз, 1961. - 299 с.

26. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов: автореферат дис. . д-ра биол. наук / Р.В. Гордина. -М., 1954.-20 с.

27. Гуторова, Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки / Л.Д. Гуторова // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - С.53-55.

28. Давиденко, Т.А. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966 1970 гг / Т.А. Давиденко, A.M. Зарицкий // В кн.: Кишечные инфекции. - Киев, 1972. - В. 5. - С. 41.

29. Дегтярев, Ю.А. Реакция нарастания титра фага и ее применение для диагностики брюшного тифа и выявление бактерионосителей / Ю.А. Дегтярев // Тез. докл. ин-та эпидемиол. и гигиены. Душанбе. - 1960. - С.12.

30. Действие термостабильного летального токсина Yersinia pseudotuberculosis на биосинтез белка in vitro / Н.Ф. Тимченко и др. // Журн. микробиол. 2004. - № 3. - С. 15-18.

31. Диагностическая ценность новой питательной среды для выделения и культивирования возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза / Л.В. Саяпина и др. // Журн. микробиол. 2000. - № 6. - С. 15-18.

32. Знаменский, В.А. Этиология дальневосточной скарлатиноподобной лихорадки / В.А. Знаменский, А.К. Вишняков // Журн. микробиол. 1967. -№2.-С. 125-130.

33. Золотухин, С.Н. Бактериофаги М. morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят : автореферат дис. . канд. вет. наук / С.Н Золотухин. Ульяновск, 1994. - 23с.

34. Золотухин, С.Н. Изучение чувствительности Е. coli к колифагам / С.Н. Золотухин, Н.И. Молофеева, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. 2001. - № 11.-С. 59-63.

35. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий : автореф. дис. . д-ра биол. наук / С.Н. Золотухин. Ульяновск, 2007. - 39 с.

36. Зыкин, Л.Ф. Иерсиниоз и псевдотуберкулез сельскохозяйственных животных : моногр. / Л.Ф. Зыкин, А.А. Щербаков, З.Ю. Хапцев. Саратов, 2002.-С. 70.

37. Иерсинии и иерсиниозы / Бургасова О.А. и др. ; под ред. Г.Я. Ценевой. Спб., 2006. - С. 168.

38. Иерсиниозы: итоги изучения и задачи научных исследований / Н.Д. Ющук и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - СЛ.

39. Изменчивость клональной структуры популяции Yersinia pseudotuberculosis в разных условиях существования / В.И. Пушкарева и др. // Журн. микробиол. 2004. - № 4. - С. 31-35.

40. Камбаратов, П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза / П.И. Камбаратов // ЖМЭИ. 1963. - № 6. - С.35.

41. Капырина, Н.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага / Н.А. Капырина, И.А. Бакулов // Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных : симп. Новочеркасск, 1972. -С.76-78.

42. Кац-Чернохвостова, JI .Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение / Л.Я. Кац-Чернохвостова // ЖМЭИ. 1947. - № 8. - С. 312-315.

43. Квеситадзе, И.Ф. Фаготерапия и фагопрофилактика при колипаратифозных заболеваниях телят / И.Ф. Квеситадзе // Бактериофагия в ветеринарной практике. М., 1947. - С. 28.

44. Клиника и диагностика псевдотуберкулеза у детей / Н.П. Куприна и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 28-29.

45. Клинические аспекты иерсиниозов в Алматы / A.M. Дмитровский и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 17.

46. Ковалева, E.H. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis : автореф. дис. . канд. биол. наук. / E.H. Ковалева. Саратов, 2009. - 20 с.

47. Колесникова, В.В. Новые факты в эпидемиологии псевдотуберкулеза / В.В. Колесникова // Иерсиниозы: сб. науч. тр. ; под общ. ред. Г.П. Сомова ; Сибирское отд-е акад. мед. наук СССР. Новосибирск ?, 1983. - С. 50-57.

48. Количественный ПЦР-анализ: разработка системы определения содержания амплифицированного фрагмента ДНК / Ю.С. Аляпкина и др. // Мол. генетика. 1994. -№ 5. - С. 22-26.

49. Кольпикова, Т.И. Фаготипирование листерий / Т.Н. Кольпикова, И.А. Бакулов, В.М. Котляров // Ветеринария. 1990. - № 6. - С. 31-32.

50. Коритняк, Б.М. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yersinia enterocolitica, разработка технологических параметров по их применению : автореф. дис. . канд. биол. наук / Б.М. Коритняк. Саратов, 2005. — 20 с.

51. Корнилова, Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом / Г.В. Корнилова // Материалы 16 межобластн. научн.-практической конф. лабор. работников в Зап. Сибири. -Томск, 1960.-С. 20-21.

52. Кременчук, Г.А. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды / Г.А. Кременчук, М.А. Гицевич, К.П. Бояршинова // ЖМЭИ. 1961. - № 7. - С.124.

53. Крылова, М.Д. Перспективы и возможности метода фаготипирования бактерий / М.Д. Крылова // Материалы симп., посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси, 1974. - С. 276-280.

54. Крылова, М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий / М.Д. Крылова // В кн. : Бактериофагия. М.: Медгиз, 1961. - С. 220-257.

55. Крылова, М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis / М.Д. Крылова // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16-22.

56. Кузнецов, В.Г. Бактерии рода Yersinia в источниках питьевой воды Владивостока / В.Г. Кузнецов, В.Н. Багрянцев, A.B. Гудков // Журн. микробиол. 1994. -№ 6. - С. 50-51.

57. Кузнецова, В.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды / В.Н. Кузнецова, М.И. Хазанов, Т.Н. Ремова // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

58. Лебедев, В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях / В.И. Лебедев // Тр. науч. конф. аспирантов и ординаторов 1-го Моск. мед. ин-та. -М. -1964. С. 105-107.

59. Лихачев, Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага / Н.В. Лихачев // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

60. Лурия, С. Общая вирусология / С. Лурия, Д. Дарнелл. М.: Мир, 1970. -397 с.

61. Мазурин, Н.Д. РНФ при диагностике дизентерии / Н.Д. Мазурин, Ц.С. Розина-Япкина // ЖМЭИ. 1963. -№ 1.-С.113-115.

62. Мейпариани, А.Н. Современные принципы производства и применения сухих лечебно-профилактических дизентерийных и брюшнотифозных бактериофагов : автореф. дис. . докт. мед. наук / А.Н. Мейпариани. -Тбилиси, 1971.-45 с.

63. Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах / Л.С. Каврук и др. ; под редакцией Л.С. Каврука. -Москва, 2005. 53 с.

64. Методические указания по микробиологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных, вызываемой патогенными энтеробактериями. М., 1999. - 34 с.

65. Мефодьев, В.В. Иерсиниозы на территории юга Тюменской области /

66. B.В. Мефодьев, В.В. Черемных, Н.С. Панова // Инфекции, обусловленные иерсиниями : материалы II Всероссийской науч.-практической конф. с международным участием. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2006.1. C. 98-100.

67. Молофеева, Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Е. соИ О 157 и их применение в диагностике : автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.И. Молофеева. Саратов, 2004. - 20 с.

68. Некультивируемые формы Yersinia pseudotuberculosis в почвах природного очага псевдотуберкулеза / В.В. Троицкая и др. // Журн. микробиол. 1996. - № 5. - С. 13-15.

69. Новосельцев, Н.Н. Фаги IV серовара Yersinia pestis / Н.Н. Новосельцев, В.И. Марченков, Ю.И. Арутюнов // ЖМЭИ. 1994. - № 6. -С. 9-10.

70. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10-го научн. сем. Алма-Атинского гос. мед. ин-та. Алма-Ата, 1978. - С. 55-57.

71. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / под редакцией А.С. Лабинской, Л.П. Блинковой, А.С. Ещиной. Медицина, 2004. - 576 с.

72. Определитель бактерий Берджи ; под редакцией Дж. Хоулта и др. ; 9-е издание. Т. 2. Перевод с англ. под редакцией Г.А. Заварзина. - М.: Мир, 1997.-432 с.

73. Особенности иерсиниозной инфекции у детей / Л.А. Гульман и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы международной конференции. -С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. Спб., 2000. - С. 14.

74. Островская, З.С. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага / З.С. Островская, Б.Н. Папкова // ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37-40.

75. Островская, H.H. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде / H.H. Островская, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1961. - № 5. - С.145.

76. Оценка эффективности полимеразной цепной реакции при расследовании вспышек псевдотуберкулеза / М.В. Чеснокова и др. // Журн. микробиол. 2003. - № 3. - С. 7-11.

77. Павлова, И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас. anthracis и Вас. cereus / И.П. Павлова // ЖМЭИ. 1971. - № 7. -С.147.

78. Поддубный, Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде / Ф.Н. Поддубный // ЖМЭИ. 1962. - №1. - С. 29-31.

79. Полоцкий, Ю.Е. Применение кератоконъюнктивальной пробы для определения вирулентности возбудителя псевдотуберкулеза / Ю.Е. Полоцкий, Г.Я. Ценева, В.Е. Ефремов // Журн. микробиол. 1983. - № 4. -С. 72-76.

80. Попхадзе, М.З. Использование бруцеллезного фага для диагностики бруцелл / М.З. Попхадзе // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119-124.

81. Практическое применение листериозных фагов : уч. пособие / И.А. Бакулов и др. ; Ульяновск, 1998. 66 с.

82. Применение поливалентного сальмонеллезного бактериофага групп АВСДЕ для профилактики сальмонеллеза в лечебных учреждениях / Т.Н. Белова и др. // Острые кишечные инфекции : республиканский сборник. -Л. 1981. - С. 106-110.

83. Псевдотуберкулез в Украине / Л.В. Третьякова и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 58-59.

84. Псевдотуберкулез и иерсиниоз (эпидемиология, клиника, диагностика, терапия): методические рекомендации / Г.Я. Ценева и др. ; под. общ. ред. Г.Я. Ценевой. Спб., 2005. - 50 с.

85. Псевдотуберкулез и иерсиниоз в Санкт-Петербурге / Г.В. Волкова и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 8-9.

86. Пульчеровская, Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике :автореф. дис. . канд. биол. наук / Л.П. Пульчеровская. Саратов, 2004. -21 с.

87. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. Киев: Урожай, 1978. — С. 88.

88. Рубашкина, Б.К. Применение метода нарастания титра фага дляисследования объектов внешней среды / Б.К. Рубашкина, С.Ф. Казакова // ЖМЭИ. 1959. - №6. - С. 110-112.

89. Сергиенко, Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д!агностики за допомогою бактерюфага / Ф.Е. Сергиенко // Мшробюл. журн. АН УССР. -1936. -№1.- С. 85-112.

90. Смирнов, И.В. Верификационные методы микробиологической диагностики иерсиниоза и псевдотуберкулеза : методические рекомендации для врачей / И.В. Смирнов. Рязань, 1996. - 21 с.

91. Сомов, Г.П. Псевдотуберкулез / Г.П. Сомов, В.И. Покровский, H.H. Беседнова. М.: Медицина, 1990. - 240 с. - ISBN 5-225-00762-7.

92. Сравнительная оценка различных иммунологических реакций в диагностике псевдотуберкулеза / O.A. Бургасова и др. // Журн. микробиол. 1996. -№ 2. - С. 48-51.

93. Тимаков, В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб. М., 1962. - С. 32.

94. Тимаков, В.Д. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

95. Тимченко, Н.Ф. Факторы патогенности Yersinia pseudotuberculosis и некоторые аспекты патогенеза псевдотуберкулеза / Н.Ф. Тимченко // ЖМЭИ. 1997. - № 5. - С. 25-29.

96. Туманский, В.М. Псевдотуберкулез / В.М. Туманский. М.: Медгиз, 1958.-С. 82.

97. Учайкин, В.Ф. Иерсиниозы у детей / В.Ф. Учайкин, А.В. Гордеец, С.Н. Бениова. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - С. 144. - ISBN 978-5-97040765-3.

98. Характеристика инвазивности возбудителя псевдотуберкулеза / Г.Я. Ценева и др. // Журн. микробиол. 1984. - № 5. - С. 26-30.

99. Характеристика холерных бактериофагов in vivo / Гаевская Н.Е. и др. // Фундаментальные исследования. 2004. - № 1 - С. 44-45.

100. Характеристика чумных и псевдотуберкулезных фагов, принадлежащих к III и V морфогруппам / Т.А. Кудрякова и др. // Современные наукоемкие технологии. 2004. - № 3. - С. 111.

101. Хэйс, У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хэйс ; пер. с англ. К.Н. Гринберга и др. ; под ред. и с предисл. С.Н. Алиханяна. М.: Мир, 1965.-368 с.

102. Цветков, К.И. Применение специфического бактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл / К.И. Цветков // Ветеринария. -1941.-№ 6.-С. 4-6.

103. Шантаренко, И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде / И.В. Шантаренко // Тез. докл. и выступл. на 5-й Всесоюз. научн. конф. по санитарной микробиол. М., 1962. - С. 8993.

104. Эпидемиологическая экология иерсиниозов в Алматы / В.А. Меркер и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 39.

105. Эпидемиологические аспекты иерсиниозов в Армении / Г.Б. Гукасян и др. // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 13.

106. Эпидемиологические закономерности иерсиниозов в республике Саха (Якутия) / И.Я. Егоров и др. // Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 40-43.

107. Эпизоотический процесс псевдотуберкулеза и иерсиниоза в популяции грызунов крупного города / JI.A. Калошина и др. // тез. докл. XII Всесоюз. конф. по природной очаговости болезней. — Новосибирск, 1989.-С. 83-84.

108. Ющенко, Г.В. Актуальные вопросы эпидемиологии и клиники иерсиниоза / Г.В. Ющенко // Медицина и здравоохранение. Серия «Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания» : обзорная информация. Вып. 4. - М., 1984. - С. 53.

109. Ющук, Н.Д. Иерсиниозы / Н.Д. Ющук, Г.Я. Ценева, Г.Н. Кареткина.- М. : Медицина, 2003. 208 с. : ил. - ISBN 5-225-04652-5.

110. A widespread outbreak of Yersinia pseudotuberculosis 0:3 infection from iceberg lettuce / J.P. Nuorti et al. // J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 189, № 5. -P. 766-774.

111. Acute renal failure associated with Yersinia pseudotuberculosis presenting as an abdominal mass / J.W. Koo et al. // Pediatr. Nephrol. 1996.- Vol. 10, № 5. C. 582-586.

112. Aleksic, S. Microbiology and epidemiology of Yersinia infections / S. Aleksic, J. Bockemühl // Immun. Infekt. 1990. - Vol. 18, №6. - P. 178-185.

113. An outbreak of Yersinia pseudotuberculosis infection / R. Tertti et al. // J. Infect. Dis. 1984. - Vol. 149. - P. 245-250

114. Antibody response in Yersinia pseudotuberculosis III infection: analysis of an outbreak / Т.Н. Stahlberg et al. // J. Infect. Dis. 1987. - Vol. 156, №> 2. -P. 388-391.

115. Calvo, С. Lysogenie chez Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii et Yersinia intermedia / C. Calvo, J. Brault // Ann. Microbiol. 1983. - Vol. 134, № 2. — P.183-188.

116. Carniel, E. The Yersinia high-pathogenicity island / E. Carniel // Инфекции, обусловленные иерсиниями (иерсиниоз, псевдотуберкулез) и другие актуальные инфекции : материалы междунар. конф. С.-Петерб. НИИЭМ им. Пастера. - Спб., 2000. - С. 76.

117. Cat-contaminated environmental substances lead to Yersinia pseudotuberculosis infection in chidren / H. Fukushima et al. // J. of Clinical. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 12. - P. 2706-2709.

118. Characterization and pathogenicity of Yersinia pseudotuberculosis isolated from swine and other animals / M. Tsubokura et al. // J. Clinical. Microbiol. 1984. - Vol. 19, № 6. - P. 754-756.

119. Cornelis, G.R. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells / G.R. Cornelis, H. Wolf-Watz // Mol. Microbiol. -1997. Vol. 23, № 5. - C. 861-867.

120. Czernomysy-Furowicz, D. First isolation of Yersinia pseudotuberculosis from foals in Poland / D. Czernomysy-Furowicz // Adv. Agr. Sei. 1996. - Vol. 5, № 1. - P. 25-29.

121. Detection and identification of Yersinia pseudotuberculosis and pathogenic Yersinia enterocolitica by an improved polymerase chain reaction method / H. Nakajima et al. // J. Clinical Microbiol. 1992. - Vol. 30, № 9. -P. 2484-2486.

122. Diagnosis of Yersinia pseudotuberculosis infection by polymerase chain reaction // H.I. Cheong et al. // Pediatr. Infect. Dis. 1996. - Vol. 15, № 7. -P. 595-599.

123. Distribution of virF/lcrF-positive Yersinia pseudotuberculosis serotype O: 3 at farm level / T. Niskanen et al. // Zoonoses Public Health. 2008. - Vol. 55, №4.-P. 214-221.

124. Erlich, H.A. Recent Advances in Polymerase Chain Reaction / H.A. Erlich, D. Gelfand, J.J. Sninsky // Science. 1991. - Vol. 252. - C. 1643-1651.

125. Evaluation of pathogenicity determinants of Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from chinchillas from the Western Pomerania area // W. Emirsajlow-Zalewska et al. // Adv. Agr. Sei. 1996. - Vol. 5, № 1. - p. 1924.

126. Experimental Yersinia pseudotuberculosis enteritis in laboratory animals / A. Okwori et. al. // African J. Biotechnol. 2007. - Vol. 6, № 20. - P. 24112414.

127. Fukushima H. Intestinal Carriage of Yersinia pseudotuberculosis by wild birds and mammals in Japan / H. Fukushima, M. Gomyoda // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57, № 4. - P. 1152-1155.

128. Fukushima, H. Direct isolation of Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis from meat / H. Fukushima // Appl. Environ. Microbiol. -1985. Vol. 50, № 3. - P. 710-712.

129. Fukushima, H. Susceptibility of wild mice to Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica / H. Fukushima // Zentralbl. Bakteriol. — 1991. — Vol. 275, №4.-P. 530-540.

130. Furowicz Antoni J. Yersinia pseudotuberculosis infections in animals / A. J. Furowicz, D. Czernomysy-Furowicz // Adv. Agr. Sei. 1996. - Vol. 5, № 1. -P. 5-10.

131. Heeseman, J. Chromosomal-encoded siderophores are required for mouse virulence of enteropathogenic Yersinia species / J. Heeseman // FEMS Microbiol. 1987. - Lett. 48. - P. 229-233.

132. High frequency of Yersinia antibodies in healthy populations in Finland and Germany / O. Maki-Ikola et al. // Rheumatol. Int. 1997. - Vol. 16, № 6. - P. 227-229.

133. Hum, S. Enteritis associated with Yersinia pseudotuberculosis infection in a buffalo / S. Hum, S. Slattery, S. Love // Australian Veterinary Journal. 1997. -Vol. 75, №2.-P. 95-97.

134. Isberg, R.R. Cultured mammalian cells attach to the invasin protein of Yersinia pseudotuberculosis / R.R. Isberg, J.M. Leong // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P. 6682-6686.

135. Kapperud, G. Isolation of enterotoxigenic Yersinia enterocolitica from birds in Norway / G. Kapperud, 0. Olsvik // J. Wildlife. Dis. 1982. - Vol. 18, №2. - P. 247-248.

136. Katznelson, H. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of internalug borne bacterial infections of seed/Н. Katznelson, M. Sutton/J. Bact. 1951. - Vol. 61, № l.-P. 689.

137. Martins, C.H.G. Experimental kinetics of infection induced by Yersinia pseudotuberculosis isolated from stock animals / C.H. Gomes Martins, D.P. Falcao // Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 2004. - Vol. 99, № 6. - P. 621-626.

138. Mesenteric adenitis caused by Yersinia pseudotuberculosis presenting as an abdominal mass / L. Jelloul et al. // Eur. J. Pediat. Surg. 1997. - Vol. 7, №3.-P. 180-183.

139. Multiple outbreaks of Yersinia pseudotuberculosis infections in Finland / K. Jalava et al. // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42, № 6. - P. 2789-2791.

140. Neef, N.A. Pathogeniciti of a strain Yersinia pseudotuberculosis isolated from a pig with porcine colitis syndrome / N.A. Neef, R.J. Lysons // Vet. Ree. -1994.-Vol. 135, №3.-P. 58-63.

141. Nilehn, B.Studies on Yersinia enterocolitica. Bacteriophages liberated from chloroform treated cultures / B. Nilehn, C. Ericson // Acta Path. Microbiol. Scand.-1969.-Vol. 75.-P. 177-187.

142. Niskanen, T. Yersinia pseudotuberculosis with limited genetic diversity is a common finding in tonsils of fattening pigs / T. Niskanen, M. Fredriksson-Ahomaa, H. Korkeala // J. Food Protect. 2002. - Vol. 65, № 3. - P. 540-545.

143. Outbreak of pseudotuberculosis in commercial guinea fowls (Numida meleagris) / M. Bonci et al. // Ital. J. Anim. Sei. 2009. - Vol. 8. - P. 793796.

144. Outbreak of Yersinia pseudotuberculosis infection in central Finland / R.G. Pebody et al. // Euro. Surveill. 1997. - Vol. 1, № 21. - P. 1051.

145. Paik, I.K. Epidemiological investigation of Yersinia pseudotuberculosis infection in Korean / I.K. Paik , C.R. Cho, M.A. Kim // Korean. J. Clin. Pathol. -1997.-Vol. 17, №6.-P. 1068-1075.

146. Pathogenic Yersinia enter ocolitica 2/0:9 and Yersinia pseudotuberculosis 1/0:1 strains isolated from human and non-human sources in the Plateau State of Nigeria / A.E. Okwori et al. // Food Microbiol. 2009. - Vol. 26, № 8. - P. 872-875.

147. Prevalence of enteropathogenic Yersinia in Estonian, Latvian, and Russian (Leningrad region) pigs / P.O. Martinez et al. / Foodborae. Pathog. Dis. 2009. - Vol. 6, № 6. - P. 719-24.

148. Purification, characterization and cloning of a novel variant of the superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen / T. Ramamurthy et al.//FEBS Lett.-1997.-Vol. 413, № l.-P. 174-176.

149. Reactive arthritis after an outbreak of Yersinia pseudotuberculosis serotype 0:3 infection / T. Hannu et al. // Ann. Rheum. Dis. 2003. - Vol. 62, №9.-P. 866-869.

150. Report of four cases of Yersinia pseudotuberculosis septicemia and a literature review / P. Ljungberg et al. II Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. -1995.-Vol. 14, №9.-P. 804-810.

151. Ribotyping and virulence markers of Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from animals in Brazil / C.H.G. Martins et al. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 2007. - Vol. 102, № 5. - P. 587 - 592.

152. Sechter, I.O. Metodika de cercetare a prezentei bacilului tifis in materufacale ajutorole bacterofagului / I.O. Sechter // V. Academie RPSH Filialr Vasi Studii si cercetari Stintifie. Ann. 1955. - Vol. VI, №3/4. - P. 99.

153. Special Featurs of Distribution of Yersinia pseudotuberculosis in Japan / M. Tsubokura et al. II J. Clinical. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 4. - P. 790791.

154. Superantigen YPMa exacerbates the virulence of Yersinia pseudotuberculosis in mice / C. Carnoy et al. II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68, №5.-P. 2553-2559.

155. The high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis can be inserted into any of the three chromosomal asn tRNA genes / C. Buchrieser et al. // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 30, № 5. - C. 965-978.

156. Thisted Lambertz, S. TaqMan-based real-time PCR method for detection of Yersinia pseudotuberculosis in food / S. Thisted Lambertz, C. Nilsson, S. Hallanvuo // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol. 74, № 20. - P. 64656469.

157. Torna, S. Human and Nonhuman Infections Caused by Yersinia pseudotuberculosis in Canada from 1962 to 1985 / S. Torna // J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol. 24, № 3. - P. 465-466.

158. Transmission of Yersinia pseudotuberculosis in the Pork Production Chain from Farm to Slaughterhouse / R. Laukkanen et al. // Applied and Environmental Microbiol. 2008. - Vol. 74, № 17. - P. 5444-5450.

159. Yang, Y. Transcriptional regulation of the Yersinia pseudotuberculosis pH6 antigen adhesion by two envelope-associated components // Y. Yang, R.R. Isberg // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24, № 3. - C. 499-510.

160. Yersinia pseudotuberculosis and Y. enterocolitica infections, FoodNet, 1996-2007 / C. Long et al. // Emerg. Infect. Dis. 2010. - Vol. 16, № 3. - P. 566-567.

161. Yersinia pseudotuberculosis causing a large outbreak associated with carrots in Finland, 2006 / R. Rimhanen-Finne et al. // Epidemiol. Infect. -2009. Vol. 137, № 3. - P. 342-347.

162. Yersinia pseudotuberculosis infection of buffaloes (Bubalus bubalis) / F. Riet-Correa et al. // J. Vet. Diagn. Invest. 1990. - Vol. 2. - P. 78-79.

163. Yersinia pseudotuberculosis infection: study of an epizootic in squirell monkeys / W.C. Bühles et al. // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol. 13, № 3. -P. 519- 525.

164. Yersinia pseudotuberculosis 0:1 traced to raw carrots, Finland / S. Kangas et al. // Emerg. Infect. Dis. 2008. - Vol. 14, № 12. - P. 1959-1961.

Информация о работе

Катмакова, Надежда Петровна
кандидата биологических наук
Ульяновск, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка и применение диагностического биопрепарата "YP-09 УГСХА" на основе бактериофагов Yersinia Pseudotuberculosis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы