Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике"

На правах рукописи

Пульчеровская Лидия Петровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ CITROBACTER И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ

03.00.07 микробиология 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии

Научные руководители доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич,

кандидат ветеринарных наук, доцент Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты. доктор ветеринарных наук, профессор

Русалеев Владимир Сергеевич;

доктор биологических наук, профессор Игнат ов Олег Владимирович

Ведущая организация: Московский государственный университет

прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится «g^ »^¿JCÚ^Í.Л. 2004 года в ^¿^часов на заседании диссертационного совета Д 220 061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им Н.И Вавилова» по адресу. 410005, i. Саратов, ул. Соколовая, 335

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им, Н.И.Вавилова» по адресу 410005, г Саратов ул Соколовая, 335

{»Мшфл

Автореферат разостан «_ _7» /¿¿1¿¿/U¿2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук ^ Л.В Карпунина

Аз

iQfff

ZI3Ï66I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исстедователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Citrobcter в патологии животных и человека.

Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Adeniiyi, Ocholi, Enurah, Chima, Ekhonu, 1991, Mullner, Keller, 1992, Семёнова с соавт, 1993). Но в то же время представители этого рода способны вызывать вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции, менингиты, абсцессы мозга, урологические заболевания, гнойные инфекции и даже сепсис у детей и взрослых людей (Алешукина с соавт , 1991; Корольков, 1992; Torres Alvarez de Агсауа et al, 1993; Pettis et al., 1994, Ventura et al, 1995; Ishii Yukiko, et al, 1996; Кебу, 1998 Gordon David., Fitz Gibbon Frances, 1999), a также самостоятельно или в ассоциации с другими микроорганизмами вызывать заболевания у домашних и диких животных (Мнацаканов, 1986, Воронин с соавт , 1989. Adeniiyi, 1991; Karunasagar et al, 1992; Ставцева, Дервишев, 1993, Каврук, 1994; Золотухин с соавт , 1999).

В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых цитробакте-рами. основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам Этот метод трудоемок, недостаточно чувствителен и гребует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов

В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961. Капыри-на. Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Русалиев, 1990; Хайруллин, 1990; Кольпикова, Баку-лов, Котпяров, 1990, 1992) Метод индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичен, не требует больших затрат времени, материалов и общедоступен.

Цель исследований. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации бактерий рода Citrobacter с помощью специфических бактериофагов

Задачи исследования:

1 Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Citrobacter

2. Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, ли-тическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.

юс

* Ji ьНАЯ

>.А

L

MUß

3 Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат диагностикум

4 Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата

5 Разработать схему идентификации нитробактерий с помощью бактериофагов

6 Разработать технологические параметры изготовления биопрепарат для фагодиагно-

сгики.

Научная новизна:

- Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Citrobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных

- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью

- Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схемы фагодиагностики

Практическая значимость. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги. активные в отношении бактерий рода Citrobacter Три выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА»

Для врачей бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий рода Citrobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фагогипированию бактерий рода Citrobacter из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии 16 02 04 г

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1 Схема выделения бактериофа! ов бактерий рода Citrobacter

2 Биологические свойства выделенных фагов бактерий рода Citrobacter.

3 Конструирование из отобранных фагов нового биопрепарата диагностикума

4. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата

5 Разработка схемы идентификации нитробактерий с помощью специфических бактериофагов

6 Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Citrobacter.

Апробация работы. Результаты основных исследований подтверждены акшми комиссионных испытании в ВГНКИ (от 23 04 04i ), УГСХА (от 5.06 ОЗг), актами производственных испытаний проведённых в Чердаклшгской районной лаборатории Ульяновской области (от 24 08 04г) и в Сергиевской районной лабораюрии Самарской обчас^и (от 30 08 04г ) Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях R ! ородах Москва, Ульяновск (1997, 2000, 2001, 2002, 2004)

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 15? страницах машино писного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (174 источника, в том числе 123 отечественных) Работа иллюстрирована 33 таблицей 13 рисунками, 1 схемой и приложениями

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы: В работе были использованы 13 штаммов бактерий рода Citrobacte, полученные из НИИВС (Москва), из музея кафедры микробиологии вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА и выделены нами из объектов окружающей среды и патологического материала 97 штаммов бактерий гетерологичных родов и семейств: Escherichia, Proteus, Fnlero-bacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus Pseudomonas получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ УГСХА, 23 бактериофага бактерий рода Citrobacter, выделенные нами из сточных вод животноводческих хозяйств

Питательные среды. Для бактериологического исследования использовали питательные среды, мясопептонный бульон (НПО «Питательные среды», г Махачкала), мясо-нептонный агар (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), 0,3%-ный, 0,7%-ный, 1,5%-ный. среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г Оболенск); висмут-сульфит агар («Биотех-новация», г Москва), среда Симонса (НИИ питательных сред, г Махачкала), среда Клиглера (НИИ питательных сред, i Махачкала); среды Гисса с индикатором BP (НПО «Питательные срсды» г Махачкала), физиологический раствор, pH 7,2-7,6

Приборы и оборудование. Холодильники бытовые; ультратермостаты УТ-15У4,2, термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, электронный микроскоп JEM-100B (Япония), микроскоп МИР-12т, лупа бинокулярная МБС-9; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), бактериальные фильтры 1 3, свечи Шамберлана, центрифуг лабораторные ОПн-

8УХЛ4.2 и ЦЛС-З, аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной пампой ДРБ8-1, ко!бы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0, 2,0; 5,0, 10 cmj фтаконы ёмкостью 50, 100 cmj; стёкла покровные, стёкла предметные; чашки Петри, пробирки, стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток; термометры ртутные

Методы. В pa6oie использовались методы д гя выделения бактерий рода Citrobacter приведенные в «Меюдических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденными Департаменюм ветеринарии МСХиП 1! октября 1999 года Из кулыур выделяли бактериофаги методами, предложенными С.Лурия, Д.Дарнел (1970), ИПРевенко (1978), Ганюшкин В Я. (1988). Фаги выделяли из объектов окружающей среды методом, предложенным Адельсон (1962), Ганюшкин В Я (1988) Изучение биологических свойств фаюв проводили по методам, предложенным M.Adams (1961), Д.М.Гольдфарбом (1961). А С Тихоненко (1968), ТГЧинашвичи (1968), И М.Габрилович (1973), В.Я Ганюшкин (1988) Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной и использованной И.М.Габриловичем (1992), С.Н Золотухиным (1994) Обнаружение бактерий рода Citrobacter в объектах окружающей среды, кормах и пищевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методике ВДТимакова и Д М.Гольдфарба (1962), В.Я Ганюшкина (1988) Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили осаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования (Пономорев, Андреева, Артамонова, 2002).

Для статистической обработки результатов исследования использовали методы Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение

Поиск и селекция бактериофагов Первым этапом работы была попытка выдечить бактериофаги Citrobacter из имеющихся у нас штаммов бактерий рода Citrobacter, надеясь обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).

В первой серии опытов использовали методику, предложенную С Лурия, Д Дарнелл (1970), для выделения бактериофагов энтеробактерий без воздействия на них индуцирующего фактора Проведя эти исследования, нам не удалось выделить бактериофаги Citrobacter из имеющихся у нас штаммов бактерий рода Citrobacter

Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревснко, 1978) В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 30 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8. 18.0%, мощность которой приходится на область 254 нм Полученный фитьт-

рат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Citrobacter методом агаровых слоев В наших исследованиях индукция не приводила к появлению свободного фа! а

Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления перехода профага в свободный фаг у имеющихся штаммов бактерий

Следующий этап работы был посвящен выделению бактериофагов Citrobacter из обьектов внешней среды САдельсон, 1962) Для этого мы использовали сточные воды свиноводческих хозяйств и молочно-товарных ферм из разных хозяйств Ульяновской и Самарской областей При исследовании 8 проб сточных вод, удалось выявить присутствие искомого фага по наличию на газоне индикаторной культуры Citrobacter негативных колоний или зон лизиса.

Для получения чистой линии фага проводили до пяти пассажей из изолированных негативных колоний по методике, описанной Dulbeio, Vogt (1954), И М Габриловичем (1992). С.Н.Золотухиным (1994)

В результате проведённых опытов нами были выделены и изолированы 23 изолята фагов Citrobacter Из выделенных штаммов фагов было отобрано 3 изолята фагов, которые лизировали в сумме все имеющиеся у нас бактерии рода Citrobacter

Характеристика фагов Citrobacter

а) Морфология негативных колоний

Морфологию негативных колоний изучали при посевах фагов ме годом агаровых слоев по Грация на МПА Учёт производили через 18-20 часов инкубации при температуре 37°С Негативные колонии, образуемые изучаемыми бактериофатами, разделены нами на два типа К первому типу относятся фаги: С-52 УГСХА, который образует округлые колонии с ровными краями, в диаметре 2-3 мм, прозрачные, без вторичного роста, с зоной цепочного лизиса по периферии, ширина зоны 0,5 мм; и фаг С-66 УГСХА, который образует колонии округлые, с ровными краями, в диаметре 3-8 мм, с зоной неполного лизиса, ширина зоны 1мм Ко второму типу относится фаг С-61 УГСХА, который образует колонии с ровными краями, прозрачные, без вторичного роста и без зоны неполного лизиса, в диаметре от 1,5 до 2,5 мм.

б) Литическая активность бактериофагов Citrobacter

Литическую активность селекционированных бактериофагов проводили по метод} Аппельмана и Грания (Д М Гольдфарб, 1961). Активность фагов: С-52 УГСХА, С-61 УГСХА, С-66 УГСХА по Аппельману составила 10 7, по Грация - 3,0х109 до 4,Ох 109 фаговых корпускул в 1 мл (табл 1).

Литическая активность бактериофагов Citrobacter по Грация

Ks Фаги j Литическая активность

п.п j по Аппельману по Грация

1 С-52 УГСХА 1 107 3,0x10"

2 С-61 УГСХА 1 ю-7 4,0x109

3 С-66 УГСХА 1 Ю-7 3,0x109

в) Спектр литической активности бактериофагов Citrobacter

Спектр литической активности является характерной особенностью фага, и им пользуются для его идентификации (Адаме, 1961, Ганюшкин, 1988) Для изучения спектра литической активности трех селекционированных фасов (С-52 УГСХА, С—61 УГСХА, С-66 УГСХА) использовали 3 штамма бактерий рода Citrobacter (С amalonaticus Nsl 1, С freundu №16; С freundu X°9) и проводили его методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Ганюшкин, 1988) Результаты исследований представлены в таблице 2, из которой видно, чю наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов С 52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА. которые ли-зировали все имеющиеся у нас штаммы Citrobacter, независимо от вида, что составляет 100%

г) Специфичность дейс1вия бактериофагов Citrobacter

Dia способность фагов определяется, прежде всего, родством их к фшовым рецепторам лизируемых бактерий и используется в практике для дифференциации бактерий. Изучение специфичности трех бактериофагов Citrobacter (С-52 УГСХА, С-61 УГСХА, С-66 УГСХА) проводили по отношению к представителям других семейств и родов с использованием штаммов Е coli-46 цпаммов, Proteus spp -6 штаммов, Morganella spp -6 штаммов, Klebsiella spp -4 штамма, Salmonella spp-6 штаммов, Enterobacter spp.-4 штамма, Y enterocohtica-12 штаммов, Staphylococcus spp -3 штамма, Streptococcus spp -2 штамма, Pseudomonas auregimsa-4 штамма, Bacillus cereus-3 штамма Установлено, что фаги неактивны к представителям бактерий гетерологичных родов и семейств. Таким образом, селекционированные нами фаги являются специфичными для рода Citrobacter.

д) Температурная устойчивость бактериофагов Citrobacter

Степень устойчивости бактериофагов и их хозяев к инактивирующим температурным факторам имеет теоретическое и практическое значение Результаты исследования представлены в таблице 4

Полученные данные свидетельствуют об одинаковой устойчивости фагов к воздействию температуры в 71-73°С Фаги начинают терять физиологическую активность при температуре выше 73°С и инактивируюгея при температуре вьппе 88°С в течение 30 минут В то время как бактериальные клетки цитробактерий погибают при 60° С за 7 минут

Спектр титической активности цитробактерных фагов по отношению к штаммам бактерий рода Citrobacter

№ Фаги Кол-во испытанных штаммов Из них чувствительных к фагу № лизируемых штаммов % лизируемых штаммов

1. С-1 УГСХА 13 3 2,11,10 23,1%

2 Т" 4. С-2 УГСХА 13 2 2,11 15,4%

С-3 УГСХА 13 1 9 7.7%

С-4 УГСХА 13 2 11,16 15,4%

5 С-5 УГСХА 13 3 16, 11,10 23,1%

6. 7 С-6 УГСХА 13 5 1,9,4, 16,6 41,5%

С-1 УГСХА 13 5 1,4, 16,6,10 41,5%

8 С-8 УГСХА 13 5 1,4,16, 6,12 41,5%

9 С-61 УГСХА 13 7 1,4,16,6,101/57,11,12 53,8%

10 С-52 УГСХА 13 6 2,9,16,7,12,13 1 46,1%

11 С-10 УГСХА 13 1 j 1,7,11 23,1%

12 С-11 УГСХА 13 4 1,4,16,11 30.8%

13. С-12 УГСХА 13 4 1,4,16 6 30,8%

14 С-13 УГСХА 13 5 1,9,4. 16,6 41,5%

15 J С-14 УГСХ А | 13 4 3,4,16,6 30,8%

16 ' С-15 УГСХА ! 13 2 11,10 15,7%

17. С-16 УГСХА i 13 5 1,4,16,11,10 41,5%

18 С-17 УГСХА 13 5 1,4,16,7,10 41,5%

19. С-18 УГСХА 13 3 2,9,16 23,1%

20. С-66 УГСХА 13 7 1, 16,11.8, 101/57,12,7 53,8%

21. С-19 УГСХА 13 5 1,4,16,6,7 41,5%

22. С-20 УГСХА 13 1 11 7,7

23. С-21 УГСХА 13 5 1,4,16,6,13 41,5%

Таблица 3 Спектр литической активности производственных штаммов фагов

№ ! Количество Фаги 1 испытанных | штаммов Из них чувствительных к фагу тт ! % Лизируемые , лизируемых штаммы штаммов

1 2 „ j С-52У1СХА J 13 С-61 УГСХА 1 13 I С-66 УГСХА | 13 1 6 7 ! 7 1 16,11,8, ! 101/57,12,7 ! 1,4,16,6, 101/57,11,12 1,2,9,16,7, 12,13 46,1% 53,8% 53,8%

Температурная >сгойчиво<ль бактериофагов Citrobacter

Температура, 0 С Титр фагов

С-52 УГСХА С 61 УГСХА С-66УГСХА

60-63 1,8x109 3,1x109 2,3x109

64-66 1,3x10" ^ 2,1х109 1,8x109

67-70 2x109 2,3x109 2,7x109

71-73 2,4x109 2,1х109 1,9x109

74-76 5x108 1,9x108 1,2x10'

77-80 2x106 5x10' ЗхЮ7

81-83 1х105 1,2х 10б 1.4x10б

84-85 1x10' 3x102 1х102

86-88 1+0,2 - 3±1,1

88-90 -

Контроль фага 2x109 3x109 2,1x109

е) Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа

Бактериофаги обычно устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий Определение чувствительности бактериофагов и бактерий проводили путем обработки фаговой суспензии и бульонных культур цитробактеров хлороформом в соотношении 1 "10 при постоянном встряхивании

Бактериофаги С-66 УГСХА и С-61 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 40 минут В то время как фаг С-52 УГСХА значительно терят свою активность в течение 15 минут, и существенно уменьшалось количество фаговых корп)скул (до 40%) Форма негативных колоний менялась Бактериофаги, клонированные из них, отмечались низкой логической активностью, которая восстанавливалась только на 3-й пассаж фага При действии хлороформа на фаг С-52 УГСХА в течение 40 минут происходила полная его инактивация Результаты исследований представлены в таблице 5

Таблица 5

Устойчивость фагов бактерий рода Citrobacter к воздействию хлороформом

№ Фаги Обработка 15 мин. Обработка 30 мин. Обработка 40 мин

% выживаемости фага % выживаемости фага % выживаемости фага

1 С-52 УГСХА 40 15 -

2 С-61 УГСХА 100 100 100

3 С-66 У1 СХА 100 100 100

Обработка бактерий индикаторных штаммов Cfrewnd.ii №9, С {геипс!и №16 и С ата1опаиаа №11 в течение 15 минут хлороформом приводила к их полной 1 ибечи

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что селекционированные бактериофаги 0-66 УГСХА и 0-61 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа При воздействии хлороформа на фагодизаты в течение 40 минут существенного уменьшения фаговых корпускул в 1 мл не наблюдалось В то время как бактериофаг 0-52 УГСХА терял свою активность.

з) Изучение морфологии фаговых корпускул Для этих целей проводили электронно-микроскопические исследования лизатов бупь-онных культур' СреипЛг №9, Cfreund.ii №16, С атЫопаПсиз №11 с бактериофагами 0-52 УГСХА, С-61 УГСХА, С-66 УГСХА в гитре от 3,0x10® до 4,0x10® фаговых корпускул в 1 мл (по Грация)

Эпектронно-микроскопические исследования проводили по методике, предложенной А П Пономаревым О Г Андреевой, ТН Артамоновой (2002) В результате проведенных исследований было установтено, что вирионы фага имеют структуры, состоящие из головки в форме растянутого многогранника с отростком У основной массы вирионов чехол находит -ся в растянутом состоянии, что характерно для интактных частиц Чехол отростка па всем протяжении прямой и имеет цилиндрическую форму. Концевая структура отростка ограничивается базальной мембраной, от которой отходят короткие нити Рдиничные вирионы имеют отростог в сокращенном состоянии, то есть чехол отростка укорачивается и расширяется При этом просматривается внутренний стержень отростка Вирусные частицы фагов С-61 УГСХА и С-66 УГСХА имеют следующие размеры диаметр головки 100 нм и длина отростка - 135 нм. Отношение высоты головки к её диаметру у фагов равно 1,28, что позволяет йкдючить о растянутости многогранника частиц данного фага (рис 1, 2, 3)

Корпускуты фага С-52 УГСХА имеют более симметричную головку Гё длина равна 74 нм, диаметр 68 нм Отношекие высоты головки к её диаметру равна 1,08. Длина отростка 115 нм и длина сокращенного чехла отростка 60 нм.

Рис 1 Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-52 УГСХА (увл 167 ООО).

Рис. 2 Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-61 УГСХА х 167 ООО

Рис. 3. Электронная микрофотография.

Морфология бактериофага С-66 УГСХА х 167 ООО

Таким образом, в соответствии с морфологическими параметрами изучаемый нами фаги согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride (F.A. Murphy и др., 1995), а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе' «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (Тихоненко,1968).

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий Citrobacter

Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к бактериям рода Citrobacter мы разработали схему ускоренной идентификации этих микроорганизмов Результаты исследований представлены на схеме 1

Схема 1. Ускоренная идентификация бактерий рода Citrobacter с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой бактериологического исследования, изложенной в "Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка живогных, вызываемой патогенными энтеробактериями (И)

Итого: 48 часов (2 суток) Итого: 92 часа (4 сугок)

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения хотя бы одного из трех штаммов фагов на газоне сплошною роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса со вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также образование негативных колоний фага Отрицательным считали результат при от-су гсгвии лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствии лизи са в контроле При положительном результате культуру относили к роду Citrobacter В ре-

-утьтате проведенных исследований из проб фекалий были выделены шгаммы цитробакте-ров о чем свидетельствовали результаты и ¡учения их биологических свойств

Пред тгаемая нами схема позволяет идеи гифицировать цитробактерии за 48 часов (2 с>ток) Срок бактериологического исследования по схеме изложенной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекпии молодняка животных, вызываемой патогенными онтеробактсриями» составит 92 часа (4 суток) при большей затрате посуды и реактивов

Определение количественного показателя РНФ, имеющее диагностическое значение

Определение параметров постановки РНФ и разработку количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методике, предложенной ВДТимаковым и Д М Гочыфарбом (1962) Проведены .зкелерименты с использованием МПЬ, контаминированного 18 часовыми индикаторными культурами С ¡г еипс1п №16 (для фага С 61 УГСХА), С /геипёи Х°9 (для фага С-66 УГСХА) и С атаЬпапсш №11 (для фага С 52 УГСХА) о г 101 до 105 м к /мл В качестве контроля использован интактный МПБ

Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования С этой целью подсчитывали число негативных ко юний фага, образовавшихся на плотной пшагельной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили ссмласно таблицы 6 В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках Разницу сравнивали с контролем При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной ку тьгуры) реакция не учитывалась РНФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения.

Таблица 6

Показатели увеличения титра фага в РНФ

Увеличение количества частиц бактериофага в опытной пробе по отношению к контролю Оценка результатов

Увеличение до 2,5 раз Отрицательная

Увеличение от 3 до 5 раз Слабо положительная

Увеличение свыше 5 раз Положительная

Увеличение более 10 раз Резко положительная

По реяулыатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации нитробактериями МПБ в концентрации 103 м.к/мл

Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями

Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выяв тению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикагорной культуры при сохранении остальных параметров (темпера[урный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Citrobacter. оптимальное время экспозиции выбирали из шеста следующих параметров

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37°С. после добавления фатов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37°С,

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фш ом до 10,16 и 24 часов при температуре 37°С.

Для изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени подрашивания. МПБ контаминировали бактериями рода Citrobacter в концентрации от 101 до 1х105 м к/мл и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 5, 16, 24 часов. Результаты исследования представлены в таблице 7.

Таблица 7

Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминированного бактериями рода Citrobacter

Минимальное количество 1 Время, заграченное на

Варианты исследований нитробактерий, обнару- проведение исследо-

Фаги М^п живаемое с помощью ваний (в часах)

Длительность подращивания бактериологи- бактериото-

исследуемого материала РНФ ческии РНФ iический

часы метод метод

С-52 1 5 103 104 22 96

У ГС- 2 16 ю2 н.о 32 н 0

ХА 3 24 102 н.о 40 Н 0

С-61 1 5 104 104 22 96

УГС- 2 16 103 н.о. 32 н.о

ХА з 24 103 н.о. 40 н.о

С-66 1 5 103 104 22 96

УГС- 2 16 ю2 н.о 32 н.о

ХА 3 24 102 Н 0 40 L . - Н О

Примечание' но не обнаружено.

Установлено, что при подращивании материала в течение 5-ти часов позвотяет обнаружить цитробактеры с помощью РНФ в концентрации 103 м кУмт для фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА, а для фага С-61 УГСХА 104 м.к/мл При подращиваяии исследуемого мате-

риала в течение 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102и 103 мк/мл соответственно На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество цитробактеров обнаружить не удавалось При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 10J м к/мл На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированяый бактериями рода Citrobacter от 10' до 1х105 м.к /мл, не подращивали, а увеличивали время контакта с фагом до 5, 10, 16, 24 часов Результаты представлены в таблице 8

Таблица 8

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагами

Минимальное количест- Время, затраченное на

Варианты исследований во цитробактерий, обна- проведение исследова-

Фаги №п руживаемое с помощью ний (в часах)

Время контакта исследуемо- бактериоло- бактериоло-

го материала с фагом РНФ гический РНФ гический

часы метод метод

С'52 УГСХА 1 5 103 104 22 96

2 10 103 ю4 22 96

3 16 ю2 н о 32 н.о

4 24 102 н.о 40 н.о

С-61 УГСХА 1 5 ю4 104 22 96

2 10 L Ю4 ю4 22 96

3 ¡6 к 103 н о 32 н.о

4 24 10J н.о 40 н.о.

С-66 УГСХА 1 10 103 104 22 96

2 10 ^ 103 -J ю4 22 96

3 16 ^ ю2 1 н.о 32~~ н.о

4 24 102 н.о 40 но

Примечание: н о - не обнаружено

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 10-ти часов позволяет обнаружить цитробактеры с помощью РНФ в концентрации 103 м к./мл для фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА, для фага С-61 УГСХА - 104 м к./мл. При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102и 103 м.к/мл соответственно На проведение исследования затрачивается 32 часа Бактериологическим методом это же количество цитробактеров обнаружить не удавалось При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 107 и 103 м.к/мл соответственно На проведение этого варианта

реакции необходимо 40 часов Бактериологическим методом нитробактерии удавалось обнаружить в концентрации 104 м к /мт на проведение данного метода затрачивается 96 часов

На основании наших данных, считаем, что наиболее оптимальным являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 и 104 м к в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-18 часов. Поэтому данный режим используем в дальнейших исследованиях, хотя наиболее эффективным по чувствительности является инкубирование исследуемого материала с фагом в течение 16 часов, на которое затрачивается до 32 часов

Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами объектов ветеринарного надзора (водопроводная вода, комбикорм, фекалии, мясо)

Д гя определения возможности испотьзования РНФ для обнаружения бак£ерий рода СкгоЬасГег в объектах внешней среды исследовали образцы воды, комбикорма и фекалий

Пробы водопроводной воды в объеме 10 мл вносили в колбы и контаминировали С/геипсИг №9 С/геипс^й №16, С ата1опаПси<, №\ \ в концентрации 105, 104, 103, 102, 101 м к /мл, заливали МПБ из расчета 10 мт бульона на 1 мл воды. Для контроля использовали котбу с пробой воды, не контаминированной названными бактериями По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА бо-тее чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток питробактеров в 1 мл водопроводной воды, фага С-61 УГСХА 104м к в 1 мл водопроводной воды

Комбикорм массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали С]геипс1п №9 С/геипс111№\(>,Сата1опМкю№1\ в концентрации 105; 104; 103 10', 101 м к /мл и вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчет 10 м ' бу 1ьона на 1 г. Брали колбу с пробой комбикорма не контаминированного цитробактерами Дальнейшие исследования проводили по вышеизложенной методике По результатам провеянных опытов установлено, что увеличение титра фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток цитробактеров в 1 г комбикорма, а фага С-61 УГСХА 104м.к.в 1 г комбикорма.

Фекалии массой 5-10 г вносили в МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г и контаминировали их С¡геипйи №9, С/геипс!и №16, Сатсйопапсия№\ \ в концентрации от 105, 104 10', 102. 10' м к Брали колбу с пробой фекалии не контаминированной бактериями вышеназванными бактериями Исследования проводили но вышеизложенной методике По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 104 микробных клеток цитробактеров в 1 1 фекалий, а фага С-61 УГСХА при концентрации 105 м к в 1 г фекалий

Нами установлено, что увеличение титра фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток, а фага С 61 УГ СХЛ при концентрации 104 м к цитробактеров в 1 мл взвеси водопроводной воды и комбикорма

При исследовании фекалий увеличение тигра фагов С-52 УГСХА и С-66 УГСХА более чем в 5 раз произошло при концентрации 104м к , а фага С-61 УГСХА 105 м.к. в 1г фекалий.

Кусочки свинины массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, конта-минировали С freundix №9, С freundii №16, Сamalonaticus№\\ в концентрации 105; 104; 103; 10 , 10' м к /г и вносили в колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г Для контроля использовали пробу мяса, не контаминированного вышеназванными бактериями.

По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов С-52 У1 СХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток цитробактеров в 1 г мяса.

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства, нами были проведены исследования по фагодиагностики кишечной инфекции поросят и телят, протекающей с участием бактерий рода Citrobacter Обнаружение нитробактерий проводили бактериологическим методом и с помощью реакции нарастания титра фага

Результаты исследований отражены в таблице 9, из которой видно, что при исследовании 10 проб фекалий от больных диареей поросят, бактериологическим методом выделено бактерий рода Citrobacter из 20% проб, а в РНФ - 60%; из 8 проб от телят - бактериологическим методом удалось выделить цитробактерий в 37,5% случаев, а в РНФ - 62,5%

Таблица 9

Результаты исследования проб фекалий от больных диареей телят и поросят

Всего проб Результаты исследований

Бак.метод РНФ

От поросят количество проб % количество проб %

10 2 20 6 60

От телят I

8 1 3 37,5 5 62,5

ВЫВОДЫ

1 Из объектов внешней среды было выделено 23 изолята фагов, активных по отношению к бактериям рода Citrobacter

2 Три селекционированных штамма фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА имели титр 10 7 по Аппельману и 3,0х109-4х109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий рода Citrobacter не лизировали представителей родов Escherichia, Enterobacter, Proteus, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, были устойчивы к нагреванию до 73°С в течение 30 минут Фаги С-61 УГСХА и С-66 УГСХА были устойчивы к действию 10% раствора хлороформа в течение 40 минут, а фаг С-52 УГСХА был чувствителен к данному реагенту.

3 Фаги C-6I УГСХА, С-52 У1 СХЛ, С-66 УГСХА в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myovtride, а по классификации АСТихоненко - к V морфологической i руппе- «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению))

4 Три фага С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА имели совместный спектр литической активности по отношению к бактериям рода Citrobacter, равный 100%, и были предложены для диагностического набора.

5 Разработана схема идентификации нитробактерий с помощью фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, которая позволяет идентифицировать бактерии рода Citrobacter за 48 часов

6 Разработана схема ускоренной индикации бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить нитробактерии за 20 часов

7 Разработана НТД по изготовлению и контролю набора бактериофагов для индикации и идентификации бактерий рода Citrobacter

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Предложены 3 штамма фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, активных по о (ношению к представителям бактерий рода Citrobacter, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности Фаги депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага С-52 УГСХА - Phagum Citrobacter 52-УГСХА- ДЕП от 23.04.04 . С-61 УГСХА - Phagum Citrobacter 61-УГСХА-ДЕП от 23 04 04г и С-66 УГСХА- Phagum Citrobacter 66-УГСХА - ДЕП от 23 04 04г) и признаны перспективными для конструирования диагностических и лечебно-профилактических препаратов

2 Идентификацию бактерий рода Citrobacter предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению из патологического материала пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

3. Индикацию бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарното надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ бактерий рода Citrobacter в патоло1 ическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды", утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16 02 2004г

4 Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Citrobacter, С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16 02 2004г

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Васильев Д А Пульчеровская Л П , Волгушова Н Г Молофеева Н И Изучение микрофлоры кишечника сельскохозяйственных животных при желудочно-кишечных заболеваниях //Сборник тезисов докладов 2-й Международной научно-практической конференции» Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции 25-27 июня 1997i » Часть 2 «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», - Москва - 1997 - С 166

2 Золотухин С Н , Пульчеровская Л П, Васильев Д А Бактерии рода Citrobacter и их бак-¿ериофаги Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2000 - С 53-58

3 Золотухин С Н , Пульчеровская Л П , Васильев Д А Выделение и селекция бактериофагов рода Citrobacter //Вестник ветеринарии , Выпуск V , Оренбург, - 2002 - С 85-88

4 Золотухин С Н , Пульчеровская Л П , Кирьянова Н А , Васильев Д А. Выделение фагов бактерий рода Citrobacter из объектов внешней среды и патологического материала //«Вестник УГСХА», Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2002. - С. 29-32

5 Золотухин CII, Пульчеровская Л П , Васильев Д А Изменение литической активности бактериофагов рода Citrobacter при хранении //«Вестник УГ'СХА» Сборник научных трудов, Ульяновск, 2003. - С. 222-223

Подписано в печать 2? № оь

Формат 60x84'/«

Бумага типогр. Ма 4

Гарнитура Тгат-Таймс

Усп. печ. л. у. о

Заказ гге Тираж {С с

Ризограф УГСХА

432601, г Ульяновск, бутьвар Новый Венец,

»

í

РНБ Русский фонд

2006-4 19511

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пульчеровская, Лидия Петровна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика бактерий рода Citrobacter.

1.2. Резервуар и распространение инфекции.

1.3. Патогенез

1.4. Лабораторная идентификация Citrobacter.

1.5. Устойчивость.

1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике.

1.6.1.Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.

1.6.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина.

1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Материалы.

2.1.2. Методы.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Выделение бактерий рода Citrobacter из объектов окружающей среды.

2.2.2. Поиск бактериофагов Citrobacter и селекция клонов фагов.

2.2.3. Характеристика выделенных фагов бактерий рода Citrobacter.

2.3. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Citrobacter с использованием фагов.

2.4. Разработка оптимальных условий постановки РНФ

2.4.1.Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение.

2.4.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

2.4.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Citrobacter в объектах внешней среды.

2.4.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ.

2.4.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ.

2.4.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ

2.4.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Citrobacter с помощью РНФ

2.4.3.5. Результаты исследований фекалий от больных диареей телят и поросят с помощью РНФ.

2.5. Обсуждение.

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике"

Актуальность работы.

В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Citrobcter в патологии животных и человека.

Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Семёнова с соавт., 1993; Mullner, Keller, 1992; Adeniiyi, et al., 1991), но в то же время представители этого рода способны вызывать вспышки гастроэнтеритов и токсикоинфекций, внутрибольничные инфекции, менингиты, абсцессы мозга, урологические заболевания, гнойные инфекции и даже сепсис у детей и взрослых людей (Але-шукина с соавт., 1991; Корольков с соавт., 1992; Torres Alvarez de Агсауа et al., 1993; Pettis et al., 1994; Ventura et al., 1995; Yukiko, et.al. 1996; Кебу с соавт., 1998; Gordon David M., Fitz Gibbon Frances 1999).

Цитробактеры способны также самостоятельно или в ассоциации с другими микроорганизмами вызывать заболевания у домашних и диких животных (Adeniiyi et al., 1991; Karunasagar et al., 1992). Особый интерес представляют исследования по изучению этиологической роли цитробактера в возникновении диареи новорожденных животных (Мнацаканов, 1986; Воронин с соавт., 1989; Ставцева, Дервишев, 1993; Каврук, 1994; Золотухин с соавт., 1999).

В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых цитробактерами, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок, недостаточно чувствителен и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Ру-салиев, Хайруллин, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990, 1992). Метод индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичен, не требует больших затрат времени, материалов и общедоступен.

Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации бактерий рода Citrobacter с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования.

1. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Citrobacter.

2. Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.

3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат - диагностикум.

4. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

5. Разработать схему идентификации цитробактерий с помощью бактериофагов.

6. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики.

Научная новизна.

- Впервые в ветеринарной практике были выделены бактериофаги, активные в отношении штаммов бактерий рода Citrobacter, выделенных от сельскохозяйственных животных.

- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью. - Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схемы фагодиагностики.

Практическая значимость. v

Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Citrobacter. Три выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов Citrobacter С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА".

Для врачей бактериологов предложены "Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) бактерий рода Citrobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды" и "Методические рекомендации по выделению и фаготипированию бактерий рода Citrobacter из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА", которые были одобрены Ученым советом УГСХА и утверждены ректором академии 16.02.04 г.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Схема выделения бактериофагов бактерий рода Citrobacter.

2. Биологические свойства выделенных фагов бактерий рода Citrobacter.

3. Конструирование из отобранных фагов нового биопрепарата — диагно-стикума.

4. Разработка схемы ускоренной индикации бактерий Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.

5. Разработка схемы идентификации цитробактерий с помощью специфических бактериофагов.

6. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Citrobacter.

Апробация работы.

Результаты основных исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в ВГНКИ (от 23.04.04г.), УГСХА (от 5.06.03г.); актами производственных испытаний, проведённых в Чердаклинской районной лаборатории Ульяновской области (от 24.08.04г.) и в Сергиевской районной лаборатории Самарской области (от 30.08.04г.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в городах: Москва, Ульяновск (1997, 2000, 2001, 2002, 2004).

Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (174 источников, в том числе 123 отечественных). Работа иллюстрирована 33 таблицами, 13 рисунками, 1 схемой и приложениями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Пульчеровская, Лидия Петровна

выводы

1. Из объектов внешней среды было выделено 23 изолята фагов, активных по отношению к бактериям рода Citrobacter.

2. Три селекционированных штамма фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА имели титр 10' по Аппельману и 3,0x109 - 4x109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий рода Citrobacter не лизировали представителей родов Escherichia, Enterobacter, Proteus, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, были устойчивы к нагреванию до 73°С в течение 30 минут. Фаги С-61 УГСХА и С-66 УГСХА были устойчивы к действию 10% раствора хлороформа в течение 40 минут, а фаг С-52 УГСХА был чувствителен к данному реагенту.

3. Фаги С-61 УГСХА, С-52 УГСХА, С-66 УГСХА в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride, а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

4. Три фага С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА имели совместный спектр литической активности по отношению к бактериям рода Citrobacter, равный 100%, и были предложены для диагностического набора.

5. Разработана схема идентификации цитробактерий с помощью фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, которая позволяет идентифицировать бактерии рода Citrobacter за 48 часов.

6. Разработана схема ускоренной индикации бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить цитробактерии за 20 часов.

7. Разработана НТД по изготовлению и контролю набора бактериофагов для индикации и идентификации бактерий рода Citrobacter.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены 3 штамма фагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА, активных по отношению к представителям бактерий рода Citrobacter, обладающие, строгой специфичностью, широким спектром литической активности. Фаги депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага С-52 УГСХА - Phagum Citrobacter 52-УГСХА- ДЕП от 23.04.04 , С-61 УГСХА - Phagum Citrobacter 61-УГСХА-ДЕП от 23.04.04г. и С-66 УГСХА- Phagum Citrobacter 66-УГСХА - ДЕП от 23.04.04г.) и признаны перспективными для конструирования диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

2. Идентификацию бактерий рода Citrobacter предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению из патологического материала, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

3. Индикацию бактерий рода Citrobacter в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных бактериофагов С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА согласно "Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ бактерий рода Citrobacter в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды", утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

4. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Citrobacter, С-52 УГСХА, С-61 УГСХА и С-66 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004г.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пульчеровская, Лидия Петровна, Ульяновск

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фагаи бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалесцентов // ЖМЭИ. 1960. - № I. - С. 23-27.

2. Аврех В.В. О понятии "Серологический тип бактериофагов" // В кн.: XIII Всесоюзный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Л.: 1959. - Т.2. - С. 537-540.

3. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонеллезов // ЖЭМИ. 1954. - №7. - С. 93-96.

4. Адаме М. Бактериофаги // Москва. -1961. - С. 521.

5. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам // Вопросы микробиологической диагностики и бак-териофагии.-1962.-С. 184-194.

6. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.-гиг. мед. ун-та. Л., 1958.

7. Азизбекян P.P. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии // В кн. Микробиология. Т.З. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1974. - С. 191-233.

8. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М.Кирова, - 1964. - T.XYIII. - С. 10-12.

9. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. 1961. -№ 2. - С. 5-11.

10. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. №3. -С. 27.

11. Ахунов Э.Д., Бондаренко В.М. Тайгунов М.М. и др. Использование случайностей амплификации полиморфной бактериальной ДНК для типиро-вания бактерий рода Citrobacter / / ЖМЭИ. 1998. - № 4 . - С. 61 - 63.

12. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров // Автореферат канд.дис. М. - 1970.

13. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-мед. журн. 1961. - № 4. -С. 39-42.

14. Белоусов Ю.Б., Комарова В.П., Ефременкова О.В. Выбор антибактериальной терапии при лечении инфекций у лиц пожилого возраста // Антибиотики и химиотерапия. 1998. -43, -№10. -С. 19-23.

15. Брильман Я.Е. Дополнительный дегидрогенезный или окислительно-восстановительный тест, в классификации энтеробактерий //ЖМЭИ. -1998.-№ 4.-С. 17-19.

16. Быкова З.А. Некоторые свойства чумных фагов // Тр.Армянской противочумной станции. - 1964. - №3. - С. 171-175.

17. Васильев Д.А., Померанцев Д.А.// Ульяновск -2001.

18. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии // ЖМЭИ. 1971. - № 1. - С. 136-138.

19. Висконти Р. Генетика бактериофага // В кн.: Онтогенез вирусов. М., -1956.-С. 141.

20. Воронцова А.А. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании // Тез.докл. на межин-стит.конф. по проблеме "Кишечные инфекции". М., 1961. - С. 127-128.

21. Воронин Е.С., Дервишов Д.А. и др. Этиология и профилактика желудочно-кишечных заболеваний телят // Вестник сельскохозяйственной науки. — 1989.-№9.-С.105-110.

22. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1992. -С. 10-12.

23. Габрилович И.М. Лизогения // Минск, 1970.

24. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы бактериофагии. -Минск.-1973. -С.5-24.

25. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение // Автореферат дис. докт. вет. наук. Ульяновск. - 1984. - С.84.

26. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии // Учебное пособие. Ульяновск. - 1988. - С.45.

27. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск. - 1990. - С.20-28.

28. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят // Ветеринария. — 1967. -№ 3. С. 69-71.

29. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия // М.: Медгиз. 1961. - С. 297.

30. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8. - 90-94.

31. Гольдфарб Д.М., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага //ЖМЭИ. 1957. - №5. С.17.

32. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов // Автореферат докт. дисс., М., 1954.

33. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки // ЖМЭИ. 1958. -№12.-С. 53-55.

34. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. Киев, - 1972. -в.5, - С. 41.

35. Дегтярев Ю.А. Реакция нарастания титра фага и ее применение для диагностики брюшного тифа и выявление бактерионосителей // Тез.докл.ин-та эпидемиол. и гигиены. Душанбе. - 1960, - С. 12.

36. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко JI.K. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага // Иркутск, 1957.

37. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ //В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М. - 1959. - С. 188.

38. Жугова Т.Ч. Бактериофаги Yersinia enterocolitica // Автореф. дис. канд. мед. наук. Минск, 1985.

39. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореферат дис. канд. вет. наук. -Ульяновск, 1994.

40. Ивашура А.И. Патогенные бактерии в молоке здоровых и больных маститом коров и методы их индикации // Автореферат канд. дисс. М., 1967.

41. Игути Н. и др. Частота выделения бактерий из мочи и мокроты в госпитале Керицу и чувствительность выделенных штаммов к антибиотикам //Икагаку кэнса = Jap. J. Med. Technol. 1991. - 40, - № 9. - С. 81 -84.

42. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Применение РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. - № 6. - С. 78.

43. Каврук JI.C. Тесты, критерии и методы ускоренной санитарно-бактериологической оценки репродуктивных помещениий животноводческих ферм и пути оптимизации в них микробиоциноза // Дисс. в форме науч. докл. на соиск. уч. степ. докт. вет. наук. М., - 1994.

44. Камбаратов П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза // ЖМЭИ.- 1963.-№6.-С. 35.

45. Камбаратов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 4. - С. 29.

46. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага. // Симпозиум "Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". Новочеркасск. — 1972. С. 76-78.

47. Кацитадзе Г.К. Применение брюшнотифозного фага Vi-I в РНФ // ЖМЭИ. 1963. - № 3. - С. 126-127.

48. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. — 1947.-№ 8.-С. 312-315.

49. Кебу Т.И., Стасюлевич З.К., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. Условно-патогенные энтеробактерии у здоровых и больных острыми кишечными инфекциями обезьян // Bait. J. Lab. Anim. Sci. 1998. - 8, - № 3. - С. 177 -182.

50. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллёзных культур с помощью О-бактериофага // Тез. докл.конф. Таллин, научн.-иссл.ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин. 1960. - С.5.

51. Козелько О.А. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций // ЖМЭИ. 1961. - № 2. — С. 36-40.

52. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листерий // Ветеринария. 1990. - №6. - С.31-32.

53. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом. // Материалы 16 межоб-ластн.научн.-практ.конф.лабор.работников в Зап. Сибири в г. Томске. — 1960.-С. 20-21.

54. Корольков В. Ф., Колков В. Ф., Герепелкин В. С., Мандрик В. А. Анализ причин заболеваемости кишечными инфекциями личного состава // Во-ен.-мед. ж . -1992 . -№ 6. -С. 54 -57, 79.

55. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1961.-№7. -С. 124.

56. Кривиский А.С. Вирусы против микробов // М., - 1962.

57. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготапирования бактерий // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси. - 1974. - С. 276-280.

58. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий // В кн.: Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М. - 1961. - С. 220.

59. Крылова М.Д. Схема фаготапирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis // ЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16-22.

60. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий II М., - 1963.

61. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

62. Кузнецов А.Ю. // Автореферат дис. канд. биол. наук. Ульяновск, - 2000.

63. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике //

64. ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

65. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр.науч.конф.аспирантов и ординаторов 1-го Моск.мед.ин-та. М.-1964.-С. 105-107.

66. Ленев С.В. Бактериофаги энтеропатогенных эшерихий, их биологическиесвойства и практическое применение // Автореферат дис. канд. биол. наук. -М., 1988.

67. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710 и их мутантов // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций. 1974. - в.2.-С. 38-41.

68. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7. - С. 32.

69. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология //- М., "Мир", 1970.

70. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 1.-С. 113-115.

71. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа // Тез.докл.на межин-стит. конф. по проблеме "Кишечные инфекции". М. - 1961. - С. 146-147.

72. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии //М.: Медицина, 1965.

73. Методические указания по бактериологической диагностике колибакте-риоза (эшерихиоза) животных", утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ, 2000.

74. Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции животных, утверждённые Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ, 2000.

75. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага // ЖМЭИ. - 1958. - № 12. - С. 34.

76. Мищенко В.А. и др. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят // Ветеринария. 1999. - №9. - С. 20-23.

77. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli 0157 и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. биол. наук. Саратов, 2004.

78. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styphimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. - № 1. - С. 53.

79. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 научн. Сесс. Алма-Атин. гос. мед. ин-та. Алма-Ата. 1978. - С. 55-57.

80. Островская З.С. Диагностика брюшного тифа у больных с помощью РНФ // Аннотация научной работы АМН СССР. 1956. - С. 57-59.

81. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага //ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37-40.

82. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра.фага для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. 1961. - № 5.-С. 145.

83. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов Вас.anthracis и Вас. cereus // ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

84. Петрушина Л.И. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных маститом коров // ЖМЭИ. 1967. - № 5.— С. 128.

85. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде //ЖМЭИ. 1962. №1. - С.29-31.

86. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология //М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА. 1999.

87. Пономарев А.П., Андреева О.Г., Артамонова Т.Н. Электронно-микроскопическое выявление вирусов животных в некогцентрированных вируссо-держащих суспензиях // Вестник РАСХН. 2002. - №2. - С. 74-77.

88. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. -№ 6. - С. 135.

89. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для дифференциации бруцелл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119-124.

90. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике // Киев: Урожай, - 1978. - С. 88.

91. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. - № 6.

92. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды //ЖМЭИ. 1959. - №6. - С. 110-112.

93. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней // Под ред. В.И. Покровского. М., - 1993. - С. 61-78.

94. Русалиев В.М. Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis // Ветеринария. 1990. - №9. - С.39.

95. Русалиев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария. 1990. - №8. - С.29-30.

96. Сарбасова Ш.И. Серологическая индикация условно патогенных энтеро-бактерий при диареях // Матер. 5 Объед. Съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. Т.6. - 1991.-С 59-60.

97. Семенова Е.А, Белькова Е.И., Пищик В.Н., Вассер Н.Р. Изучение факторов патогенности у различных представителей рода Citrobacter // Микробиол. Ж. 1993 .-55, -№ 4.-С. 75-81.

98. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д1агностики за допомогою бактерюфага. // Мшробюл. журн . АН УССР. 1936. - №1. - С. 85-112.

99. Ставцева Л.Я., Фёдорова М.К., Павлова Г.В. Бактериальная микрофлора кишечника больных диареей телят и поросят // Вестник сельскохозяйственной науки. №5-6. - 1992. - С. 149-152.

100. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носитель-ства дизентерийных бактерий // Автореферат дис. канд. мед. наук. Симферополь. - 1964.

101. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки //Вестник АМН СССР. 1958. - № 2. - С. 37.

102. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ) // М., 1962.

103. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

104. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

105. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий //М.: Наука, 1968. С. 89.

106. Тушунов М.М., Габидулдин З.Г., Ишкильдин И.Б., Мавзютов А.Р., Гаши-мова Д.Т., Булгаков А.К., Савченко Т.А. Морфологические свойства и адгезивная активность клинических штаммов Citrobacter // Здравоохр. Башкортостана. 1996. - № 6. - С. 25-27.

107. Хакешева Т.А. Фаги цитробактера // Автореферат канд. дис. М. — 1985.

108. Цветков К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6. — С. 4-6.

109. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. М.- 1968.-С.225.

110. Чиракадзе Л.Г., Чанишвили Т.Г. Типирование S.typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 72-78.

111. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез.докл. и выступл.на 5 Всес. научн. конф. по са-нитарн. микробиол. М. - 1962. - С. 89-93.

112. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага // ЖМЭИ. 1962.-№ 1.-С. 99-102.

113. Энтеробактерии // Под ред. Голубевой И.В., Килессо В.А., Киселевой Б.С. и др. М., - 1985. - С. 57-87.

114. Adeniyi К.О., Ocholi R.A., Enurah L.U., Chima J.C., Ekhonu M.C. Notes on causes of nortality at the tos Zoo, Nigeria from 1977-1987 //Himalayan J. Environ and Zool. -1991. 5, - № 1. - P. 1- 4.

115. Alonso J.L., Soriano A., Amoros I., Ferrus M.A. Quantitative determination of E.coli and fecal coliforms in water using a chromogenis medium // J.Ewiron. Sci. And Health. A. 1998. - 33. - № 6. - P. 1229-1248.

116. Avril I.L., Mesnard R., Roche G., Pouedras P. Place et sensibilite aux antibi-otiques des Enterobacteriaceae Responsables d'infections urinaires // Sem. hop. Paris. 1993. - 69. - № 4. - P. 81-86 .

117. Cartwright RY. Travellers diarhoea // Brit. Med. Bull. 1993. - 49. - № 2. - P. 348-362.

118. Donaldson Scott G., Azizi S.Q., R. dal Nogare Anthony. Characteristics of aerobic gram-negative bacteria colonizing critically ill patients //Amer. Rev. Respir. Disease. 1991. - 144. - № 1. - P. 202-207.

119. Doran Tarence I. The role of Citrobacter in clinical disease of children Review // Clin. Infec. Diseases. 1999. - 28. - № 2. - P. 384-394.

120. Eppes Stephen C., Woods Charles R., Mayer Annyce S., Klein Joel O. Recurring ventriculitis due to Citrobacter diversus: clinical and bacteriologic analysis //Clin. Infect. Diseases. 1993. - 17. - № 3. - P. 437-440.

121. Farr R. Wesley, Khakoo Rashida A., Maxwell L.P., Hill Ronald C. Citrobacter pericarditis secondary to a subphrenic abscess // Clin. Infec. Diseases. 1994. -18.-№5. - P. 838-839.

122. Goldstein В., Magdassi S., Rokem J.S.Surface angle of bacterial colony is directly correlated to hydrophobicity of bacterium // Microbios. 1993. - 75. - № 304.-P. 181-184.

123. Gordon David M., FitzGibbon Frances. The distribution of enteric bacteria from Australian mammals: Host and geographical effects // Microbiology. -1999.- 145.-№ 10.-P. 663-671.

124. Graigie J., Felix A. Typing of tyfoid bacilli with Vi bacteriofage, suggestions for ist standartisation // Lancet. 1947. - V. 14, - P. 823.

125. Graigie J., Yan C. Demonstration of types of b tyfosus by mesns of preparations of typs // Canad. Publ. Hith. J., 1938. V. 29, № 9. - P. 448.

126. Guggenbichler J.P., Allerberger F., Ausserer В., Fink F.M. Selektionierung der physiologischen Keimflora durch Chemotherapeutika // FAC: Fortschz. an-timikrob. und antineoplast. Chemother. 1990. - 9. - № 3. - P. 315-322.

127. He Xiaoqing, Pan Ruonan. Bacteriophage lytic patterns for identification of salmonellae, shigellae, Escherichia coli, Citrobacter freundii, and Enterobacter cloacae // J. Clin. Microbiol. 1992. - 30. - № 3. - P590-594.

128. Hugo Johansson P. J., Sternby Erland, Ursing Bo. Septicemia in granulocytopenic patients: A shift in bacterial etiology // Scend. J. Infec. Diseases. 1992. — 24.-№3.-P. 357-360.

129. Ishii Yukiko, Suzuki Yumiko, Ishihara Rika, Nakazawa Arisa, Deguchi Koichi. // Jap. J. Antibiot. 1996. - 49. - №12. - P. 25-36.

130. Jertborn Marianne, Svennerholm Ann-Mari. Enterotoxin-producing bacteria isolated from swedish travellers with diarrhoea // Scend. J. Infec. Diseases. -1991. 23, - № 4. - P. 473-479.

131. Jolivet-Gougeon A., Tamanai-Shacoori Z., Sauvager F., Cormier M. Production of Escherichia cob group I-like enterotoxin by Enterobacteriaceae isolated from environmental water // Microbios. 1997. - 90. - № 364-365. - P. 209-218.

132. Karunasagar I., Karunasagar I., Pai R. Systemis Citrobacter freundii infection in common carp, Cyprinus carprio L., fingerlings // J. Fish Diseases. 1992. - 15. -№1.-P. 95-98.

133. Katznelson H., Sutton M. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonstration of internalug borne bacterial infections of seed//J. Bact. 1951. - V. 61, № l.-P. 689.

134. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during // Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. - V.28. - P. 393-398.

135. Levinthal C., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus // Biochim. Biophys. Acta, 1952. -V. 9, № 4. - P. 419.

136. Linderberg R.B., Latta R.L. Phage typing of Ps.aeruginosa chinical and epide-miologi considerations // J. Infect. Diseases. 1974. - V. 130, № 5, - P. 32-34.

137. Martinez-Martinez Luis, Suarez Ana Isabel, Carranza Rafael, Perea Evelio J. Resistencia a ciprofloxacino en bacilos gramnegativos. Aspectos epidemiologi-cos // Enferm. infecc. у microbiol. clin. 1993. - 11. - № 9. - P. 474-478.

138. Morgan M.G., Stuart C., Leanord A.T., Enright M., Cole G.F. Citrobacter diversus brain abscess: case reports and molecular epidemiology // J.Mad. Microbiol. 1992.- 36.-№4.-P. 27-278.

139. Mullner G.F., Keller H. Spondylitis durch Citrobacter diversus. Fallbeschrei-bung und Ubersicht uber Citrobacter-diversus-Infetrtionen // Schweiz. med. Wochenschr. 1992. - 122. - № 31-32. - P. 1173-1177.

140. Munuera Echave I., Garcia Bermejo D., Ibanez Guilen J.J. Analisis microbi-ologico de aguas de bebida envasadas comercializadas en la ciudad de Sevilla // Alimentaria. 1994. - 31. - № 257.

141. Murphy F.A. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses // Spingerverlad Wien New York. 1995. - P. 586.

142. Nishioka Sergio De Andrade, Silveira Paulo Vitor Portella. Bacteriology of abscesses complicating bites of lance-headed vipers // Ann. Trop. Med and. Para-sitol. 1992. - 86. - № 1. - P. 89- 91.

143. О1 Нага Koji, Nakamura Akio, Sawai Tetsuo, Hosino Kazuo, Iwai Yuki, Naka-mura Sadahiro, Seto Isamu // Jap. J. Antibiot. 2000. - 53. - № 1. - P. 46- 59.

144. Ozyer Mestan. Tavuk yumurtalarindan salmonella izolasyon calismalari //Etlik vet. mikrobioyol. decgi. 1992. - 7. - №2. - P. 63-115.

145. Papapetropoulou M., Pagonopoulou O., Kouskouni E. Prevalence and sensitivity to antibiotics of Enterobacteriaceae isolated from urinary cultures in some microbiology laboratories of a city in West Greece // Pathol. Biol. 1997. - 45. -№ 9. -C. 716-720.

146. Peterz Mats E.G. Temperature in agar plates and its influence on the results of quantitative microbiological // Int.J. Food Microbiol. 1991. - 14. - № 1. - P. 59-66.

147. Pettis A.M., Chodoff A., Schoonmaker O., Shelly M. Polymicrobial gram negative bacteremia associated with saline flush used with a needle-free intravenous system // Amer. J. Infec. Contr. 1994. - 22. - № 2. - P. 103.

148. Ramteke P.W., Pathak S.P., Bhattacherjee J.W. Isolation of antibiotic resistant coliform sp. from rural drinking wafer // J. Environ. Biol. 1991. - 12. - № 2. -C. 1012- 1053.

149. Schindler P.R.G., Metz H. Coliform bacteria in drinking water from South Bavaria: identificiation by the API 20 E system and resistance patterns //Lentralbl. Hyg. und Umweftmed. 1990. - 190. - № 5 - 6. - P. 436.

150. Sechter I.O. Metodika de cercetare a prezentei bacilului tifis in materufacale ajutorole bacterofagului // V. Academie RPSH Filialr Vasi Studii si cercetari Stintifie. Ann. VI. - 1955. - №3-4. P. 99.

151. Snydman David R. Clinical implications of multi-drug resistance in the intensive care unit // Scand. J. Infec. Diseases. Suppl. 1991. - №78. - P. 54- 63.

152. Stathopoulos G., Vagiona-Arvanitidou Tania, Katsouylannopoulos V. Identification and drug resistance of bacteria isolated from ground water // 5th Eur. Congr. Clin. Microbiol, and Infect. Diseases, Oslo, Sept. 9-11, 1991: Abstr. -Oslo. 1991.-P. 124.

153. Torres Alvarez de Arcaya M.Y., Rodriguez Luis J.C., Hernandez A.A., Rodri-quez Fernander Oliva C. R., Garcia - Marrero A. Sepsis por Citrobacter freundii postsplenectomia: a proposito de, un caso // An. esp. pediat. - 1993. -39.-№4.-P. 376.

154. Doran Tarance I. //Clin.Infec.Diseases. 1999. - 28. - № 2. - C. 384-394.

155. Urbanova E., Pacova Z. Identiflkace druhu rodu Citrobactera jejich a jejich vyskyt у surovinach a potravinach // Vet.med. 1997. - 42. - № 3. — P. 87-91.

156. Ventura G., Tumbarello M., Tacconelli E., Cauda R., Lucia M.B. Gram-negative bacillary meningitis in adults: (Pap.) 9th Mediterr. Congr. Chemother. Я. Adv. Antimicrob. Chemother.", Milan, 1994 // J. Chemother. 1995. - 7. -№4. Suppl.-P. 177- 179.

157. Watanabe T. The orig of R factors. "Ann. N. Y. Acad. Sci.", - 1971. - V. 176. -P.126.