Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика биологических свойств бактерий рода Citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика биологических свойств бактерий рода Citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе"

На правах рукописи

Туйгунова Вера Георгиевна

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.02.03 - «Микробиология»

7 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

Оренбург-2013

005537639

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Доктор медицинских наук, профессор, Заместитель главного врача МБУЗ Роддом №4 г.Уфы:

Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

Карташова Ольга Львовна

Амирова Виктория Радековна

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Заведующий лабораторией Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уро РАН:

Ведущая организация ГБОУ ВПО «Южно-уральский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита состоится «14» ноября 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, в конференц-запе (аудитория №205), телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-2459, E-mail: ogma_dsl@esoo.ru, официальный сайт: http://orgma.ru/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА

Автореферат разослан « /2 » /о_20J3 г-> автореферат и текст

объявления размещен на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Бактерии рода Citrobacter высокоадаптивные микроорганизмы, о чем свидетельствует их широкое распространение в окружающей среде и обнаружение в составе различных микросимбиоценозов организма человека, где данный род бактерий является представителем ассоциативной микробиоты. Наряду с другими условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae, Citrobacter spp. способны вызывать оппортунистические инфекции, удельный вес которых в структуре инфекционной патологии человека, в настоящее время имеет тенденцию к неуклонному росту. Представители этого рода часто являются этиологической причиной гнойно-воспалительных и токсико-септических процессов, инфекций мочеполового тракта, острых кишечных, респираторных и внутрибольничных инфекций. При этом выделенные штаммы, как правило, проявляют в определенной степени факторы патогенности и мультирезистентносги к широко применяемым антибактериальным препаратам (Страчунский JI.C., Козлов С.Н., 2002, 2004).

С позиции инфекционной симбиологии, популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения - конкурентные или кооперативные, при заселении различных биотопов макроорганизма формируют специфический микросимбиоценоз, являющийся одним из векторов ассоциативного симбиоза человека (Бухарин О.В. и др., 2006, 2012). Исходя из данной концепции, патогенный потенциал бактерий рода Citrobacter, при формировании симбиотиче-ских взаимосвязей с микробиотой, также подвержен изменениям, что может отражаться на гомеостазе организма человека. В ряде работ отмечены различия экспрессии вирулентных и некоторых персистентных (АЛА и АИА) свойств Citrobacter spp., изолированных при моно- и ассоциированой инфекции (Габи-дуллин З.Г. и др. 2006 г., Суфияров P.C. 2012 г.). Однако отсутствует комплексная характеристика патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter в ассоциации с другими видами бактерий, представителями доминантной и ассоциативной микробиоты, не изучены регуляторные взаимоотношения Citrobacter spp. с доминантной микрофлорой, не определены изменения генетического профиля цитробактера при этих взаимодействиях. Указанные моменты и предопределили тематическую направленность наших исследований.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение биологические свойств бактерий рода Citrobacter при взаимодействии с ассоциативной и доминантной микробиотой человека.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оценить качественный и количественный состав Citrobacter spp., изолированных от пациентов с различной патологией (дисбиоз кишечника, инфекции мочеполовой системы, а также гнойно-воспалительные заболевания кожи и мягких тканей).

2. Определить видовой состав микробиоты, образующей ассоциации с Citrobacter spp. и провести сравнительную характеристику вирулентных и персистентных свойств цитробактеров при моно- и ассоциированной инфекции.

3. Изучить особенности персистентных и вирулентных свойств Citrobacter spp. при воздействии на них метаболитов представителей доминантной и ассоциативной микрофлоры на модели микробиоты дистального отдела толстого кишечника человека.

4. Определить внехромосомную генетическую изменчивость Citrobacter spp. при сокультивировании с ассоциативной микробиотой (на модели взаимодействия со штаммом В. subtilis).

Новизна исследования

Представлена комплексная характеристика патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter, изолированных из различного клинического материала, при моно- и ассоциированной инфекции. Установлено, что клинические изоля-ты Citrobacter spp. обладают набором факторов персистенции (АЛА, АИА, БПО), вирулентности (гемолизины, липолитическая, ДНК-азная активности, токсинопродукция), антибиотикорезистентности, а также способностью образовывать ассоциации с условно-патогенной микробиотой человека, определяя формирование патологического микросимбиоценоза.

В экспериментах in vitro определено два типа направленности коммуни-кативой активности бактерий при формировании ассоциаций с Citrobacter spp. -синергидный и антагонистический. Представители ассоциативной микробиоты, стимулировали антилизоцимную активность и биопленкообразование С. freundii, и, напротив, бифидобактерии (доминанты) и лактозопозитивные негемолитические эшерихии (представители нормофлоры), изолированные при эу-биозе, ингибировали адаптационную функцию Citrobacter spp.

Установлено, что метаболиты С. freundii, предварительно соинкубиро-ванные с культурами бифидобактерий, индуцировали у доминантов усиление антагонистической активности, подавляя АЛА и БПО цитробактеров. Полученные данные свидетельствуют о том, что бактерии рода Citrobacter распознаются доминантами как «чужеродный» микроорганизм, что может рассматриваться в качестве механизма защитного действия нормофлоры при эубиозе.

Впервые установлены изменения биологических свойств клинических штаммов бактерий рода Citrobacter при их совместном сокультивировании с модельным штаммом Bacillus subtilis ЗН, которые проявлялись как на феноти-

пическом (повышение чувствительности к антибактериальным препаратам, снижение патогенного потенциала), так и на генотипическом уровнях (элиминации плазмид токсигенности).

Практическая ценность работы

Выявленные фенотипические изменения биологических свойств бактерий рода Citrobacter в условиях in vitro и in vivo, а также изменение плазмидного профиля токсигенных штаммов при совместном культивировании с В. subtitlis ЗН, расширяют теоретические представления о механизмах межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе при ассоциативном симбиозе человека.

Практическое значение исследований определяется подбором модельных штаммов, обладающих высоким патогенным потенциалом, депонированных в НИИ ГИСК им. JI.A. Тарасевича (патенты РФ № 2293764 и № 2293765). Данные культуры используются в работе практических лабораторий и научных учреждений в качестве модельных штаммов при изучении изменений патогенного потенциала бактерий под влиянием на них различных препаратов, а также в исследованиях механизмов формирования микросимбиоценозов человека.

Результаты исследований используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета, в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений г.Уфы (Акт внедрения ГБОУ ВПО БГМУ, Акт внедрения № 10 РКБ им. Куватова, Акт внедрения №11 ДРКБ.).

Представленные данные - составная часть темы открытого плана ПИР по теме «Молекулярная диагностика инфекций, вызываемых патогенами различных уровней организации» (№ гос. регистрации 01200906698).

Положения, выносимые на защиту

1. Ассоциативная микробиота усиливает вирулентный и персистентный потенциал бактерий рода Citrobacter, способствуя формированию патологического (дисбиотического) микросимбиоценоза.

2. Доминантные микросимбионты - бифидобактерии обладают антагонистической направленностью воздействия в отношении Citrobacter spp. и способны распознавать данный вид бактерий как чужеродный, снижая персистентный потенциал цитробактеров.

3. Регуляция токсигенности бактерий рода Citrobacter осуществляется на внехромосомном генетическом уровне посредством элиминации плазмиды LT-энтеротоксина под действием В. subtilis.

Апробация работы Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции стран СНГ (г. С.-Петербург, 2006, 2007 гг.), Всероссийской научно-практической конференции (г. Уфа, 2009 - 2012 гг.)

Публикации По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в журналах, рекомендованных ВАК и 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 87 отечественных и 197 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 4 таблицами и 14 рисунками.

_СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ:_

Материалы и методы исследования

Материалом для исследований явились 136 клинических штаммов бактерий рода Citrobacter, выделенных от пациентов с дисбиозом кишечника II - Ш степени, а также с инфекциями урогенитального тракта (уретрит) и гнойно-воспалительными заболеваниями кожи и мягких тканей (флегмона, нагноение послеоперационной раны). Из микросимбиоценозов в консорциуме с бактериями рода Citrobacter было изолировано 252 штамма микроорганизмов родов Escherichia, Proteus, Enterobacter, Klebsiella, Hafhia, Staphylococcus, Enterococcus и Candida, являющиеся представителями ассоциативной микробиоты человека.

Среди доминантной микрофлоры, 36 штаммов были представлены Bifidobacterium spp., выделенных из микросимбиоценоза кишечника.

Исследование микробиоценоза кишечника проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по применению бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (М., 1986). Бактериологическое исследование при гнойной раневой инфекции проводили путем посева гнойного отделяемого на селективные среды с определением уровня бактериальной обсеме-ненности методом секторальных посевов (Биргер О.М., 1982). Выделение микроорганизмов из мочи при инфекции мочевых путей осуществляли методом секторальных посевов по Gould.

Для выделения облигатно-анаэробных бактерий анаэробные условия создавали с помощью газогенераторных пакетов "GasPakAnaerobicSystem" (BBL, США) в анаэробной камере "GasPak 150" (BBL, США). Идентификация облигатно-анаэробных микроорганизмов проводились в соответствии с руководством «Wadsworth-KTL anaerobic bacteriology manual» (2002). Биохимический

профиль факультативно-анаэробных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем: "ENTEROtest 24", "STREPTOtest 16", "STAPHYtest 16", "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия) и "API20CAUX" (bioMerieux, Франция).

Определяли уровень бактериальной обсемененности (Шапиро A.B., Фельдман Ю.М., 1984), видовой состав возбудителей и их биологические свойства: плазмокоагулазную, гемолитическую активности по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982), липолитическую активность - чашечным методом (Slifkin М., 2000), ДНК-азную активность - по методу PowerD.A., McCuenPJ. (1988), антилизоцимную (АЛА) и «антиинтерфероновую» (АИА) активности -по методикам О.В. Бухарина с соавт. (1999). Образование биоплёнок оценивали по способности штаммов бактерий к адгезии на поверхности 96-луночных по-листероловых стерильных планшет (O'TooleG., 2000).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных микроразведений в соответствии с международным стандартом NCCLS (NationalCommitteeforCHnicalLaboratoryStandards, 1997). Определяли ан-тибиотикочувствительность штаммов к широко применяемым в практике антибактериальным препаратам класса ß-лакгамных антибиотиков: группа пенициллинов незащищенных (ампициллин, карбенициллин, амоксициллин) и ингибиторзащи-щенных (амоксициллин/клавуланат), группа цефалоспоринов I-IV поколений (це-фазолин, цефуроксим, цефотаксим, цефтриаксон, цефепим) группа карбепенемов (имипенем), а также препараты групп аминогликозидов (канамицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин), фторхинолонов (ципрофлоксацин, офлоксацин, моксиф-локсацин), тетрациклинов (тетрациклин, доксициклин), нитрофуранов (нитрофу-рантоин, фуразолвдон) и хлорамфеникол (левомицетин).

Адгезивную активность цитробакгеров выявляли при постановке реакции гемагглютинации с эритроцитами различных животных и птиц (Габидуллин З.Г., 1998) с количественной оценкой по Брилису В.И. с соавт. (1986). Токсигенность культур Citrobacter spp. определяли на моделях лигированной петли тонкого кишечника кролика (GianellaR., 1976), на мышах-сосунках и в плантарном тесте (Вартанян Ю.П., 1978).

Модельные эксперименты по изучению регуляции проводили на клинических изолятах микроорганизмов и эталонных штаммах бактерий и грибов коллекции ГИСК им. JI.A. Тарасевича и Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (АТСС). В качестве доминантной микрофлоры были использованы культуры Bifidobacterium spp., а в качестве ассоциантов - микроорганизмы родов Escherichia, Proteus, Staphylococcus. В качестве эталонных штаммов в работе были использованы культуры Citrobacter freund» № 255 и

Citrobacter diversus № 256 (коллекция штаммов кафедры микробиологии ГБОУ ВПО БГМУ), обладающие комплексом факторов патогенности.

Исследование биологических свойств микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных суперна-тантов (продуктов жизнедеятельности микроорганизмов) микроорганизмов-симбионтов в питательный бульон по алгоритму, описанному в ряде работ (Елагина H.H., 2001; Перунова Н.Б., 2003, Иванова Е.В., 2010). Распознавание «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» микросимбионтов определяли по разработанной методике (Бухарин О.В., Перунова Н.Б., 2011).

Выделение плазмидной ДНК проводилось с помощью стандартных наборов Plas/minilsolationKit XL («AppliChem», Германия). Получаемые плазмидные ДНК подвергались агарозному гель-электрофорезу (Маниатис Т. Фрич Э. Сэм-брук Дж„ 1984). Визуализация результатов разделения нуклеиновых кислот проводилась в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 312 нм на установке гель-документирования «VilberLourmat».

Для оценки размера и количества плазмид использовался линейный маркер «100 Ьр» (ООО «Лаборатория Медиген», Россия) в количестве 1,5 мкг.

Выявление случаев возможной полной утраты плазмид проведено путем рассева микробиологической петлей бульонной культуры микроорганизмов в поздней логарифмической фазе на 1,5% LB-arap с последующим анализом 100 получаемых клонов на наличие выделяемых плазмид.

Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методами вариационной статистики с определением средней арифметической вариационного ряда (М), среднего квадратичного отклонения (5), средней ошибки средней арифметической (ш). Показатель достоверности различий (р) определялась по таблице с использованием критерия Стьюдента (t).

Данные по определению регулирующего влияния экзометаболитов микроорганизмов-симбионтов на биологические свойства бактерий рода Citrobacter были статистически обработаны непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведенный анализ видового состава бактерий рода Citrobacter в различных биотопах организма человека показал, что среди изолированных штаммов Citrobacter spp., независимо от источника выделения, чаще обнаруживался вид С. freundii (в 75,0 ± 3,9 % случаев), в сравнении с другими видами - С. diversus и С. amolanaticus, которые выявлялись реже - в 16,9 ± 3,3 % и 8,1 ± 2,4 % случаев соответственно.

В зависимости от патологического материала, среди всех выделенных штаммов наибольшая частота встречаемости Citrobacter spp. приходилась на урогенитальных тракт человека (32,4 ± 4,2 % случаев) и дистальный отдел толстого кишечника (30,1 ± 4,1 %), тогда как при обследовании гнойного отделяемого при раневой инфекции, бактерии данного рода обнаруживались с меньшей частотой: у 22,1 ± 3,7 % и 15,4 ± 3,2 % пациентов соответственно.

Значения показателя микробной обсемененности изолированных штаммов цитробактеров также зависели от источника выделения. Средние значения показателя микробной обсемененности бактерий рода Citrobacter при дисбиозе дистального отдела толстого кишечника составляли 10б КОЕ/г, а при инфекции урогенитального тракта и раневой инфекции -104 КОЕ/мл.

Установлено, что подавляющее большинство штаммов С. freund» (в 91,2 ± 3,0 % случаев) были изолированы в ассоциации с другими видами бактерий, тогда как только в 8,8 ± 3,0 % бактерий данного вида выделялись в виде монокультуры, что было характерно для штаммов урогенитального тракта. Напротив, культуры С. diversus в 78,3 ± 8,6 % случаев обнаруживались в виде монокультур, С. amolanaticus одинаково выделялись как в ассоциации с микробио-той (54,5 ± 15,0 % штаммов), так и в монокультуре (в 45,5 ±15,0 % случаев).

При определении структуры ассоциативной микробиоты обнаружено, что несколько чаще (в 27 Д - 33,8 % случаев) с бактериями рода Citrobacter обнаруживались коагулазопозитивные стафилококки (S. aureus), протеи (Р. vulgaris, P. mirabilis) и энтерококки (Е. faecalis, Е. faecium) (р<0,05) (рис. 1). Реже в ассоциации с цитробактерами обнаруживались энтеробактеры (18,4 ± 3,5 %), клебсиеллы (14,7 ± 3,0 %), лактозонегативные (13,2 ± 2,9 %) и гемолитические эшерихии (11 ± 2,7 %). Другие виды бактерий и грибы рода Candida встречались менее чем в 10 % случаев. В кишечном микросимбиоценозе Citrobacter spp., как правило, обнаруживались при отсутствии или низкой численности (менее 107 КОЕ/г) доминантной микрофлоры - бифидобакгерий.

Полученные данные свидетельствуют о сохранении лидирующих позиций С. freundii среди других видов бактерий данного рода, что соотносится с данными литературы (Габидуллин ЗГ., 2002). Не исключено, что высокая частота обнаружения С. freundii связана с особенностью его биологических свойств (экспрессии факторов вирулентности и персистенции), которые имеют значение при инфекционном процессе в условиях ассоциативного симбиоза человека (Бухарин О.В., 2007). Кроме того, образование ассоциаций с условно-патогенной микробиотой позволяет более эффективно осуществлять стратегию выживания ассоциативных микроорганизмов в условиях микросимбиоценоза. В связи с этим, на следующем этапе работы, было произведено сравнение биопрофиля бактерий рода Citrobacter, изолированных из ассоциаций микроорганизмов и в монокультуре.

При определении показателей специфической адгезии, имеющей значение на начальной стадии инфекционного процесса, было установлено, что цитробактеры в ассоциации чаще, в сравнении в монокультурой, проявляли способность адгезиро-ваться к эритроцитам цыпленка (80 ±3,6 % против 68,6 ± 4,1 % штаммов). Из общего числа изолятов, большинство (62,9 ± 4,3 %) культур обладали маннозорези-стентной (МЯ) адгезией и лишь 37,1 ± 4,3 % культур - маннозочувствительной.

Hafnia spp. В 1 Proteus spp. Candida spp. Enterococcus spp.

КПС КОС

Enterobacter spp. Klebsiella spp. E. coli hly + E. coli лак -E. coli лак+

10 20 зо

% встречаемости

Рис 1. - Частота встречаемости бактерий и грибов в ассоциации с Citrobacter spp.

Условные обозначения: * - достоверность различий между группами ассоциантов (р<0,05).

Высокая степень MR адгезивной активности (более 5 мкг/мл) наблюдалась у штаммов Citrobacter spp., выделенных при ассоциированных инфекциях, в сравнении с монокультурой. При условном разделении исследуемых штаммов на группы по степени адгезивной активности, оказалось, что чаще (21,7 ± 3,7% случаев) высокие показатели адгезии (в среднем 5,8 ± 0,2 ед.) имели культуры, изолированные из урогенитального тракта, в сравнении с кишечными изолятами (10,5 ± 2,7 %) и штаммами, выявленными при раневой инфекции (в 17,4 ± 3,4 % случаев) (рис. 2).

Определение адгезии бактериальных клеток к формалинизованным эритроцитам человека 1(0) группы крови показало ее наличие у 63,2 ± 4,3 % штам-

мов Citrobacter spp. При этом, штаммы, изолированные из ассоциации с бактериями, в 47,4 ± 4,4 % случаев обладали высокой степенью адгезивной активности (более 5 ед.). Напротив, при моноинфекции, культуры бактерий рода Citrobacter, реже адгезировались к эритроцитам (в 13,5 ± 3,0 % случаев) и характеризовались низкой степенью адгезивной активности (менее 2 ед.).

100 90 80

дистальный отдел урогениталный тракт отделяемое ран тостого кишечника

□ 1 02 "3 И4

Рис. 2. - Частота выявления адгезивной активности бактерий рода Citrobacter в различных биотопах организма человека.

Условные обозначения: 1 - штаммы, проявляющие высокую степень адгезии (более 5 ед.), 2 - среднюю степень адгезии (от 2,1 до 4,9 ед.), 3 - низкую степень адгезии (2 ед. и менее), 4 - не обладающие адгезивной активностью.

Полученные данные об адгезивной активности исследуемых штаммов Citrobacter spp. были подтверждены с помощью электронно-микроскопического исследования: у высокоадгезивных штаммов цитробактеров по периметру были обнаружены реснички длиной 110 - 420 нм и шириной 5,0 - 5,4 нм.

Далее были изучены пенетрантность и экспрессия факторов персистенции, от которых зависит продолжительность течения и наличие осложнений ряда заболеваний (Бухарин О.В., 1999; Шагинян И.А., 2000).

Анализ распространенности персистентных свойств показал, что у бактерий рода Citrobacter, изолированных из микробных ассоциаций чаще, чем

в монокультуре, встречалась «антиинтерфероновая» активность (63,2 ± 4,3 % против 52,6 ± 4,4 %) (р<0,05) (рис. 3).

123456789 10

Рис. 3. - Распространенность патогенных свойств Citrobacter spp., изолированных в монокультуре и из ассоциации микроорганизмов.

Условные обозначения: 1 - адгезия к эритроцитам цыпленка, 2 - адгезия к эритроцитам человека, 3 - АИА, 4 - АЛА, 5 - БПО, 6 - а-гемолизин, 7 - тиолза-висимый гемолизин, 8 - энтерогемолитическая активность, 9 - липолитическая активность, 10 - ДНК-азная активность.

□ монокультура Citrobacter spp., ■ штаммы Citrobacter spp., изолированные из микробных консорциумов.

Антилизоцимная активность и биопленкообразование данного вида бактерий в равной степени часто встречалась, как у штаммов, изолированных при моноинфекции, так и из ассоциации микроорганизмов (в среднем 85,7 ± 3,1 % и 95,5 ±1,8 % соответственно).

Частота встречаемости «антиинтерфероновой» активности бактерий рода Citrobacter убывала в ряду: раневое отделяемое (75,2 ± 3,8 %) > дистальный отдел толстого кишечника (63,2 ± 4,3 %) > урогенитальный тракт (56,6 ± 4,4 %). Пенетрантность антилизоцимной активности и

биопленкообразованияцитробактеров, изолированных из различных источников, варьировала в переделах 85,7 - 95,5 %.

При исследовании экспрессии «антиинтерфероновой» активности оказалось, что штаммы, выделенные из микробной ассоциации имели более высокие

средние значения исследуемого свойства (0,4±0,03 ед.), в сравнении с монокультурой (0,3±0,03 ед.). Кроме того, выраженность АИА у штаммов Citrobacter spp. различалась в зависимости от источника выделения. Культуры цитробак-теров, полученные из раневого отделяемого при гнойной раневой инфекции имели более высокий уровень АИА (0,4±0,03 ед.) в сравнении со штаммами, выделенными из кишечника (0,2±0,01 ед.) и урогенитального тракта (0,3±0,03 ед.) (р<0,05).

Наиболее высокие средние значения АЛА были характерны для штаммов цитробактеров, изолированных при раневой инфекции (1,4 ± 0,01 мкг/мл*ОП) и из микросимбиоценоза кишечника (1,1 ± 0,01 мкг/мл*ОП), в сравнении с культурами Citrobacter spp., полученных при моноинфекции из урогенитального тракта (в среднем 0,7 ± 0,01 мкг/мл*ОП) (р<0,05).

Экспрессия биопленкообразования Citrobacter spp., так же как и другие персистентные свойства (АИА и АЛА), имела более высокие средние значения (4,2 ± 0,05 ед.) у штаммов, входящих в состав микробных ассоциаций, тогда как в монокультуре данный показатель имел низкие значения (2,8 ± 0,04 ед.) (р<0,05). В зависимости от биотопа выраженность БПО исследуемых штаммов бактерий ранжировалась в порядке убывания следующим образом: урогенитальный тракт (4,8 ± 0,05 ед.) > кишечник (4,1 ± 0,05 ед.) > раневое отделяемое (3,2 ± 0,03 ед.).

При изучении факторов, использующихся в качестве показателей потенциальной токсичности, были определены некоторые гемолизины бактерий рода Citrobacter. Фенотипическая характеристика исследуемых культур Citrobacter spp. показала, что 8,8 ± 2,5 % штаммов обладали а-гемолизином, 18,4 ± 3,5 % культур имели тиолзависимый гемолизин и 13,2± 3 % штаммов характеризовались энтерогемолитической активностью. Все штаммы, обладающие гемолитической активностью были изолированы из микросимбиоценоза кишечника человека и раневого отделяемого при гнойной раневой инфекции.

Среди других факторов патогенности у цитробактеров было выявлено наличие липолитической активности (в среднем у 42,6 ± 4,4 % штаммов) и ДНК-азной активности (в среднем у 25 ± 3,8 % культур). Как распространенность, так и выраженность исследуемых вирулентных свойств Citrobacter spp. варьировала и имела более высокие значения у штаммов, изолированных из микробных консорциумов в сравнении с монокультурой.

При исследование чувствительности бактерий рода Citrobacter к антимикробным препаратом, выявлена устойчивость исследуемых штаммов к ß-лакгамным антибиотикам. Так, к ампициллину устойчивость регистрировалась у 97,1 ± 1,5 % штаммов, к карбенициллину - у 91,2 ± 2,5 % культур, к цефазолину -у 86 ±3,1 % изолятов, к амоксициллину - у 77,9 ± 3,7 % штаммов и к канамицину

- у 76,5 ± 3,8 % культур бактерий. Частота встречаемости антибиотикорезистентности к другим группам антимикробных препаратов варьировала в пределах 50 -75 % случаев. Реже устойчивость Citrobacter spp. формировалась к карбапенемам и фторхинолонам: к имипенемам - у 5,1± 1,9 % штаммов, к моксифлоксацину - у 7,4 ± 2,3 % культур, к ципрофлоксацину - у 14 ± 3,1 % изолятов и к офлоксацину - у 16,2 ± 3,3 % штаммов бактерий.

Изучение вирулентности в экспериментах invivo различными штаммами бактерий рода Citrobacter показало, что в 17,7 ± 4,1 % случаев изоляты цитробактеров проявляли способность вызывать поражение органов дыхания у животных, а у 14,5 ± 3,8 % белых мышей - давали эффект «отечной лапки».

Таким образом, полученные данные показали, что бактерии рода Citrobacter обладают комплексом патогенных свойств, позволяющим им выступать не только в качестве «агрессора», проявляя вирулентные свойства, но и длительно сохраняться (персистировать) в организме человека, в том числе, включаясь в состав микросимбиоценозов. При формировании и функционировании микросимбиоценоза между микроорганизмами складываются различные взаимоотношения, которые определяются качественной и количественной характеристикой микробного пейзажа (Несвижский Ю.В. и др., 1997), приводя к изменению биологических свойств симбионтов (Бухарин О.В. и др., 2011). В связи с этим, на следующем этапе работы было оценено изменение биологических свойств бактерий рода Citrobacter при взаимодействии с ассоциативной и доминантной микробиотой человека.

Эксперименты invitro и invivo были осуществлены с использованием модельных штаммов С. freundii, а также ассоциативных (P. vulgaris, S. aureus, Е. coli) и доминантных микросимбионтов (В. longum) (коллекция кафедры микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный медицинский университет»).

Анализ полученных результатов позволил установить наличие синергид-ных связей в ассоциации С. freundii с Р. vulgaris, S. aureus и гемолитическими (hly +) Е. coli. Под действием супернатантов данных видов ассоциантов преимущественно отмечалась стимуляция антилизоцимной активность у 55 - 63,9 % исследуемых штаммов цитробактеров (рис. 4).

В контроле (без воздействия супернатантов ассоциантов) выраженность АЛА С. freundii составляла 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП, тогда как после соинкубирования с метаболитами Р. vulgaris, S. aureus и Е. coli hly + данный показатель увеличился до 1,6 ± 0,01 мкг/мл*ОП, до 1,9 ± 0,01 мкг/мл*ОП и до 1,4 ± 0,01 мкг/мл*ОП соответственно.

Значительно реже (у 8,3 - 22,2 % штаммов) было отмечено снижение ан-тилизоцимного признака С. freundii с 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 0,7 - 0,9

мкг/мл*ОП (р<0,05). В 29,6 ± 8,9 % случаев ассоцианты не изменяли АЛА цит-робактера.

Ц ^ fc h

s

1 60 Щл

¡III.

P. vulgaris S. aureus Е. coli hly + Е. соНлак+ B.longum

Рис. 4. - Распространенность изменений антилизоцимной активности среди штаммов С. freundii при соинкубировании с метаболитами бактерий.

Условные обозначения', белым цветом - снижение экспрессии свойства, черным цветом - увеличение экспрессии свойства, штриховка - отсутствие изменений экспрессии свойства

* - достоверность различий (р<0,05)

Напротив, представители нормофлоры (бифидобактерии и лактозопози-тивные негемолитические эшерихии), в большинстве случаев (50 - 63,9 %) проявляли антагонистический эффект, ингибируя АЛА С. freundii. При этом значения АЛА цитробактера снижались с 1,2 ± 0,01 м кг/мл *ОП до 0,6 ± 0,01 мкг/мл*ОП (р<0,05).

Доминантные бактерии (В. longum) и эшерихии увеличивали АЛА у 25 -33,3 % штаммов С. freundii (с 1,2 ± 0,01 мкг/мл*ОП до 1,5 ± 0,01 мкг/мл*ОП). Отсутствие изменения АЛА было выявлено в 11,1 - 16,7 % случаев

Аналогичная направленность биокоммуникативной активности микросимбионтов была выявлена при исследовании изменения биопленкообразова-ния С. freundii (рис. 5).

Стимуляция биопленкообразования С. freundii в 47,2 - 69,4 % случаев наблюдалась при взаимодействии с ассоциативной микробиотой, характерной для

1 к * ■ 1 . 1 ^ ♦ *

|| 1

дисбиотических изменений микросимбиоценоза. Так, под действием метаболитов S. aureus, значения БПО цитробактера увеличивались с 3,8 ± 0,3 ед. до 5,1 ± 0,5 ед., при воздействии Е. coli hly + - до 4,9 ± 0,4 ед. (р<0,05), а

Р. vulgaris S. aureus Е. coli hly + Е. coli лак + В. longum

Рис. 5. - Распространенность изменений биопленкообразования среди штаммов С. freundii при соинкубировании с метаболитами бактерий.

Условные обозначения: белый цвет - снижение экспрессии свойства, черный цвет - увеличение экспрессии свойства, штриховка - отсутствие изменений экспрессии свойства

* - достоверность различий (р<0,05).

под влиянием супернатантов P. vulgaris имели тенденцию к увеличению (до 4,3 ± 0,3 ед.).

Вместе с тем ингибирование БПО было характерно только для 11,1 - 27,8 % штаммов С. freundii. При этом значения биопленкообразования исследуемых штаммов цитробактеров снижалось с 3,8 ± 0,3 ед. до 2,9 ± 0,3 ед., до 3,1 ± 0,3 ед. и до 2,5 ± 0,2 ед. под действием супернатантов P. vulgaris, S. aureus и гемолитических Е. coli соответственно. Отсутствие изменений биопленкообразования (индифферентный эффект) наблюдался в 19,5 - 27,8 % случаев.

Противоположный - антагонистический эффект был характерен при влиянии метаболитов представителей нормофлоры на биопленкообразование С. freundii. Ингибирование БПО отмечалось у 69,4 ± 9 % штаммов Citrobacter spp. при действии супернатантов лактозопозитивных Е. coli и у 80,5 ± 7,7% куль-

тур - под влиянием В. Iongum. Экспрессия БПО снижалась с 3,8 ± 0,3 ед. до 2,6 ± 0,3 ед. и до 1,8 ± 0,2 ед. соответственно при действии супернатантов эшери-хий и бифидобактерий.

Стимуляцию биопленкообразования С. freundii под действием лактозо-позитивных Е. coli и В. Iongum выявляли не более, чем в 13,9 ± 6,8 % случаев (с 3,8 ± 0,3 ед. до 2,4 ± 0,2 ед.), а индифферентный эффект не превышал 16,7 ± 7,3 % случаев.

Таким образом, полученные данные позволили установить, что в ассоциации Citrobacter spp. с бактериями формируются по два основных типа взаимодействий, зависящие от вида микросимбионтов. Синергидные связи формировались с представителями ассоциативной микробиоты (Р. vulgaris, S. aureus и гемолитические Е. coli), как правило, присутствующие наряду с С. freundii при дисбиозе кишечника. Представители нормофлоры, напротив, подавляли AJIA и БПО цитробактеров, что можно рассматривать как защитную функцию бифидобактерий и эшерихий, осуществляющих контроль численности и физиологической активности условно-патогенных бактерий в условиях ассоциативного симбиоза человека.

Поскольку ранее было установлено, что предварительное соинкубирова-ние бифидобактерий с супернатантами ассоциантов, позволяет дифференцировать «свои» и «чужие» виды микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант» (Перунова Н.Б., 2011, Бухарин О.В.. 2012), дальнейшие эксперименты были проведены по алгоритму с использованием в качестве модели пары «С. freundii - В. longum». При оценке были использованы только базовые физиологические критерии адаптации микросимбионтов - антилизоцимная активность и био-пленкообразование, поскольку исследуемые штаммы бифидобактерий не оказывали влияния на ростовые свойства Citrobacter spp.

Предварительное соинкубирование В. longum с супернатантами С. freundii, приводило к исчезновению стимулирующего эффекта влияния бифидобактерий, как в случае антилизоцимной активности цитробактеров, так и в отношении их биопленкообразования (рис. 6). Наряду с этим отмечено увеличение распространенности ингибирующего и индифферентного воздействия бифидофлоры на персистентные свойства Citrobacter spp.

Что же касается выраженности исследуемых свойств, то предварительное соинкубирование В. longum с метаболитами С. freundii также приводило к снижению экспрессии АЛА и БПО цитробактеров на 18,9 - 36,4 % от значений контроля (без предварительного соинкубирования), на основании чего они были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов.

С целью оценки патогенного потенциала Citrobacter spp., изолированного из ассоциации с бактериями, были проведены эксперименты in vivo на модели

штамма С. freundii № 255, выделенного ранее из ассоциации с Е. coli и Р. vulgaris и обладающего в экспериментах in vitro высокими значениями вирулентных и персистентных свойств, в сравнении с культурами Citrobacter spp., изолированных в монокультуре.

Рис. 6. - Изменение БПО и АЛА штаммов С. freundii при соинкубирова-нии с метаболитами В. longum.

Условные обозначения:

1 - изменение БПО и AJIA С. freundii после соинкубирования с супернатантом бифидобактерий; 2 - изменение БПО и АЛА С. freundii после соинкубирования с метаболитами бифидобактерий, предсоинкубированных с супернататом цит-робактера.

Белый цвет - снижение экспрессии свойств, черный цвет - увеличение экспрессии свойств, штриховка - отсутствие изменений экспрессии свойств

В экспериментах in vivo установлена способность штамма С. freundii № 255 вызывать «отек лапки» у белых мышей и одновременно диссеминиро-вать в легкие экспериментальных животных при «легочной модели» инфекции.

Исследование природы токсического вещества, вызвавшего развитие «отека лапки» экспериментальных животных, выявило, что гретый при 56° С центрифугат культуры С. freundii № 255 давал разницу в весе между отечной и контрольной лапками от 50 до 75 мг, а при 85° С - от 25 до 40 мг, что свиде-

тельствовало о присутствии в супернатанте исследуемого штамма цитробактера термочувствительного и лабильного токсического компонента белковой природы. По данным литературы таким белком может являться JIT-энтеротоксин, обусловленный активностью генов, входящих в состав плизмид микробной клетки (Бондаренко В.М., 1993, Габидуллин З.Г., 1995).

В связи с этим предположением был проведен анализ плазмидного профиля Citrobacter spp. с целью обнаружения плазмиды массой 60 МД, кодирующей энтеротоксин. В качестве контроля использовали культуры цитробактеров, не продуцирующие ЛТ-энтеротоксин (различия в массе не более 35 мг на модели «отека лапки» белых мышей).

В результате анализа полученных в эксперименте фореграмм, установлено наличие у С. freundii № 255 плазмиды, соответствующей положительному контролю наличия ЛТ-энтеротоксина (рис. 7).

Рис. 7. - Электрофореграмма профиля плазмидной ДНК клонов Citrobacter spp., после сокультивирования, продуцирующих ЛТ-энтеротоксин.

Условные обозначения: 1 - маркеры молекулярных масс ДНК; 2 - штамм С. freundii № 255, содержащий плазмиду 60 МД (токсигенный штамм); 3,4,5,6 -клоны штамма С. freundii № 255 не содержащие плазмиду 60 МД.

Для исследования изменений плазмидного профиля С. freundii в ассоциации с бактериями, в экспериментах in vitro был использован модельный штамм

В. subtilis 3 Н, изолированный из пробиотика «Бактиспорин». Данный штамм также представляет интерес, поскольку биологически активные вещества, выделяемые при культивировании бацилл, наряду с пробиотической активностью, перспективны в качестве основы антимикробных препаратов, действующих избирательно на патогенные микробы без нарушений сложившегося микробиоценоза, обычно имеющих место при применении антибиотиков широкого спектра действия (Бондаренко В.М., 2003).

Исследование плазмидного профиля популяции токсигенного штамма С. freundii после совместного культивирования с В. subtilis 3 Н, выявило исчезновение плазмиды 60 МД у клонов исследуемой культуры цитробактера. Из 40 отобранных клонов цитробактера, у двух на фореграмме просматривалась плазмида массой 60 МД, а остальные клоны родительского штамма С. freundii № 255 оказались не несущими данной плазмиды (рис. 7.).

Элиминация плазмиды 60 МД у клонов С. freundii № 255, сопровождалось изменением их токсинопродукции. В экспериментах in vivo бесплазмид-ные клоны С. freundii № 255 не вызывали дилатацию и экссудацию в петле тонкого кишечника кролика и гибель инфузорий в течение 5 минут.

Исследование других фенотипических признаков С. freundii № 255 после сокультивирования с В.subtilis ЗН выявило также снижение уровня антилизо-цимной активности цитробактера (с 1,9 до 1,2 мкл/мл*ОП), его способности синтезировать а-гемолизин и проявлять липолитическую активность.

Анализ антибиотикорезистентности С. freundii № 255 показал, что его совместное культивирование их с В. subtilis ЗН приводит к снижению минимальной подавляющей концентрации ß-лакгамных антибиотиков (незащищенные ампицилли-ны, цефазолин) и аминогликозидов (канамицин), что можно расценивать как повышение чувствительности цитробактера к данным антимикробным препаратам.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об изменении плазмидного профиля бактерий рода Citrobacter при сокультивировании с бактериями. На модели взаимодействия С. freundii и B.subtilis 3 Н в условиях совместного культивирования происходит элиминация плазмиды токсигенности, что сопровождается исчезновением токсического действия изогенных бесплазмидных клонов на организм экспериментальных животных. Изменение антилизоцим-ной, гемолитической, липолитической активностей и антибиотикочувствитель-ности С. freundii после сокультивирования со штаммом B.subtilis возможно связано с нарушением ферментных систем микробной клетки цитробактера и/или разрушения факторов патогенности протеазами, секретируемыми бациллами (Wangetal., 2006).

В итоге проведенной работы следует выделить три основных момента:

• Инфекционный процесс с участием бактерий рода Citrobacter, сопровождается формированием микробных ассоциаций цитробактера с условно-патогенной микробиотой усилением их факторов патогенности: адгезивной активности, персистентных свойств, токсигенности и антибиотикорезистентности.

• Образование бактериальных консорциумов с ассоциативной микробиотой сопровождается синергидным эффектом - усилением вирулентного и персистентного потенциала бактерий рода Citrobacter при дисбиозе/инфекции, и, напротив, формированием антагонистических отношений с доминантными бактериями при эубиозе.

• Сокультивирование модельных штаммов С. freundii и В. subtilis приводит к элиминации плазмиды токсигенности цитробактера, что фенотипи-чески проявляется в отсутствии токсигенного действия Citrobacter spp. экспериментальных животных и снижении патогенного потенциала и антибиотикорезистентности исследуемых культур в условиях in vitro.

ВЫВОДЫ:

1. Среди клинических изолятов бактерий рода Citrobacter независимо от источника их выделения, преобладает вид С. freundii, обладающий высокой адгезивной а-гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной, «антиинтерфероновой» активностями, проявляющий способность синтезировать термолабильный энтеротоксин и характеризующийся множественной ан-тибиотикоустойчивостью.

2. Бактерии рода Citrobacter выявляются в виде консорциумов с ассоциативными бактериями (Proteus spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и др.), при воздействии метаболитов которых происходит увеличение экспрессии и пенетрантности факторов вирулентности и персистенции цитробактеров, способствуя формированию патологического микросимбиоценоза.

3. Бифидобактерии и лактозопозитивные негемолитические эшерихии ингибируют антилизоцимную активность и биопленкобразование С. freundii, что можно рассматривать в качестве одного из защитных механизмов нормоф-лоры при функционировании микросимбиоценоза в условиях эубиоза.

4. Защитное действие доминантной микробиоты (бифидобактерий) проявляется в их способности «распознавать» токсигенные и гемолитические штаммы С. freundii в качестве «чужеродного» микроорганизма, усиливая свое антагонистическое действие в отношении адаптивной функции цитробактера.

5. Уменьшение патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter при совместном сокультивировании с Bacillus subtilis ЗН, связано с элиминацией плазмиды массой 60 МД контролирующих синтез JIT-энтеротоксина, что при-

водит к исчезновению токсического воздействия цитробактера на организм экспериментальных животных и снижению его патогенного потенциала.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Использование антагонистических свойств бактерий Bacillus subtilis в терапии госпитальной инфекции мочевых путей /A.M. Пушкарев, Р.Р.Зайнуллин, Т.Н.Кузнецова, В.Г. Туйгунова, Ю.З. Габидуллин // Журнал Микробиологии, -2007. - № 2. - С. 90 - 93.

2. Комплексов лечение гнойно-воспалительных заболеваний, вызванных ассоциациями грамположительных и грамотрицательных бактерий / Р.С.Суфияров, З.Г.Габидуллин, М.В.Тимербулатов, В.Г. Туйгунова и др. // Научно-практический журнал «Медицинский вестник Башкортостана», -2010. -Т.5., - № 3, -С.60-64

3. Лечение ассоциированных ран цитробактерно-стафилококковой природы. / Р.С.Суфияров, З.Г.Габидуллин, Р.Р.Суфияров, А.А.Ахтариева, В.Г. Туйгунова // Вестник Южноуральскогогосудаственного университета, -2011-вып. 28.-№ 26. - С.108-111.

4. Биологические свойства клинических штаммов батерий рода цитробак-тер, выделенных в моно и ассоциированных инфекциях / В.Г. Туйгунова, З.Г.Габидуллин, М.М.Туйгунов, А.Г. Губайдуллин, И.Р. Хажин // Журн. «Инфекция и иммунитет» - 2012 г. -Т.2., -№1-2, -С.328

5. Изменение биопленкообразования и антилизоцимной активности Citrobacter freundii под действием метаболитов кишечной микробиоты / Н.Б.Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В.Иванова, Ю.З.Габидуллин // Научно-практический журнал «Медицинский вестник Башкортостана, 2013. Т.8., - № 4. -С. 61-64.

Патенты

6. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 281, обладающий способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин; Патент РФ №2293764 /З.Г.Габидуллин, М.М.Алсынбаев, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Н.Н.Гибазов, Э.Ф.Мамбетова, В.Г. Туйгунова, Д.Т.Гашимова, Ю.З.Габидуллин, А.А.Ахтариева, Ф.С.Билалов// -2007 г. -Бюл. -№5. -3 с.

7. Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 280, обладающий способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин; Патент РФ №2293765 / З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, М.М.Туйгунов, А.К. Булгаков, H.H. Гиба-зов, Э.Ф.Мамбетова, В.Г. Туйгунова, Д.Т.Гашимова, Ю.З. Габидуллин, Ф.С. Билалов, А.А.Ахтариева// -2007 г. -Бюл. -Na 5. -3 с.

Список сокращений:

АТСС - АтегісапТуреСиІШгеСоІІесІіоп (американская

коллекция типовых культур)

КОЕ - колониеобразующая единица

БПО - биопленкообразование

АЛА - антилизоцимная активность

АИА - «антиинтерфероновая» активность

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

г - коэффициент ранговой корреляции Спирмена

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

МД - мегадальтон (молекулярная масса ДНК)

Туйгунова Вера Георгиевна

Характеристика биологических свойств бактерий рода Citrobacter при межмикробных взаимодействиях в микросимбиоценозе

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оригинал-макет подготовлен в программе Microsoft Office Word 2003 Подписано в печать <Р6. СР. ß Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Тираж 100 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Туйгунова, Вера Георгиевна, Оренбург

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201450880 Туйгунова Вера Георгиевна

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER ПРИ МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗЕ

03.02.03 - микробиология ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Габидуллин З.Г.

Оренбург-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 6

ГЛАВА 1. БАКТЕРИИ РОДА CITROBACTERH ИХ РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 11

1.1. Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter в инфекционной патологии человека 11

1.2. Факторы патогенности бактерий рода Citrobacter 14 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в

работе 26

2.1.1. Изучениебактериальныхколоний и

особенностейклеточнойслруктурыбакгерийродаС//го^£7с^г 26

2.1.2.Изучение биохимической активности бактерий рода Citrobacter 27 2.1.3 .Изучение сероваров бактерий рода Citrobacter

2.2. Методика определения состояния микробиоценоза кишечника 27

2.3.Методы выделения и идентификации микроорганизмов 29

2.4.Методы изучения биологических свойств

микроорганизмов 32

2.4.1. Изучение антилизоцимной активности микроорганизмов 33

2.4.2. Методика определения «антиинтерфероновой» активности микрофлоры 34

2.4.3. Определение гемолитической активности микроорганизмов 35

2.4.4. Методика определения липолитической активности микроорганизмов 35

2.4.5. Выявление ДНК-азной активности микроорганизмов 35 2.4.9. Методика определения антибиотикочувствительности 36

исследуемых культур бактерий

2.4.7. Исследование адгезивной активности микроорганизмов 37

2.4.8. Количественная оценка адгезивной активности Citrobacter spp. 38

2.5. Методы изучения влияния микроорганизмов в ассоциации 38

2.6. Метод определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» в микросимбиоценозе кишечника человека 40

2.7. Методы изучения токсигенности культур Citrobacter

spp.ua моделях invivo 42

2.7.1. Изучение вирулентности на "легочноймодели"инфекции 42

2.7.2. Изучение вирулентности на модели «изолированной

петли тонкого кишечника кролика» 43

2.7.3. Изучение LT-энтеротоксигенности бактерий рода Citrobacter 43

2.8. Генетические методы исследования 44

2.8.1. Методвыделенияплазмидной ДНК 44

2.8.2.Метод изучения клональной структуры популяции микроорганизмов 44

2.9. Методы статистической обработки полученных результатов 45 ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER В МИКРОСИМБИОЦЕНОЗАХ РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПОВ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА 47 ГЛАВА 4. ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER ПРИ 65 ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С АССОЦИАТИВНОЙ И ДОМИНАНТНОЙ МИКРОБИОТОЙ ЧЕЛОВЕКА

4.1. Изменение антилизоцимной активности и

биопленкообразования С. freundii при соинкубировании с экзометаболитами ассоциативной и доминантной микробиоты в экспериментах invitro 65

4.2. Изменение патогенного потенциала С. freundii в микробной ассоциации (эксперименты invitro) 73

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ПЛАЗМИДНОГО ПРОФИЛЯ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER В АССОЦИАЦИИ С БАКТЕРИЯМИ (НА МОДЕЛИ АССОЦИАЦИИ С. FREUNDII - В. SUBTILIS). 77

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84

ВЫВОДЫ 92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 93

ПРИЛОЖЕНИЕ 123

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АЛА - антилизоцимная активность

АИА - антиинтерфероновая активность

КОЕ -колоние-образующая единица

КГА - картофельно-глюкозныйагар

09-0 соматический антиген бактериальной клетки

РГА-реакции гемагглютинации

СПА -средний показатель адгезии

УПЭ - условно-патогенные энтеробактерии.

АТСС— Американская коллекция типов культур

11ТХ-токсины {гереШятШхтз)

КО - килоДальтон

МДА - мегаДальтон

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Бактерии рода Citrobacter высокоадаптивные микроорганизмы, о чем свидетельствует их широкое распространение в окружающей среде и обнаружение в составе различных микросимбиоценозов организма человека, где данный род бактерий является представителем ассоциативной микробиоты. Наряду с другими условно-патогенными бактериями семейства Enterobacteriaceae, Citrobacter spp. способны вызывать оппортунистические инфекции, удельный вес которых в структуре инфекционной патологии человека, в настоящее время имеет тенденцию к неуклонному росту. Представители этого рода часто являются этиологической причиной гнойно-воспалительных и токсико-септических процессов, инфекций мочеполового тракта, острых кишечных, респираторных и внутрибольничных инфекций. При этом выделенные штаммы, как правило, проявляют в определенной степени факторы патогенности и мультирезистентности к широко применяемым антибактериальным препаратам (Страчунский Л.С., Козлов С.Н., 2002, 2004).

С позиции инфекционной симбиологии, популяции микроорганизмов, вступая в сложные взаимоотношения - конкурентные или кооперативные, при заселении различных биотопов макроорганизма формируют специфический микросимбиоценоз, являющийся одним из векторов ассоциативного симбиоза человека (Бухарин О.В. и др., 2006, 2012). Исходя из данной концепции, патогенный потенциал бактерий рода Citrobacter, при формировании симбиотических взаимосвязей с микробиотой, также подвержен изменениям, что может отражаться на гомеостазе организма человека. В ряде работ отмечены различия экспрессии вирулентных и некоторых персистентных (АЛА и АИА) свойств Citrobacter spp., изолированных при моно- и ассоциированой инфекции (Габидуллин З.Г. и др. 2006 г., Суфияров P.C. 2012 г.). Однако отсутствует комплексная характеристика патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter в

ассоциации с другими видами бактерий, представителями доминантной и ассоциативной микробиоты, не изучены регуляторные взаимоотношения Citrobacter spp. с доминантной микрофлорой, не определены изменения генетического профиля цитробактера при этих взаимодействиях. Указанные моменты и предопределили тематическую направленность наших исследований.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение биологические свойств бактерий рода Citrobacter при взаимодействии с ассоциативной и доминантной микробиотой человека.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Оценить качественный и количественный состав Citrobacter spp., изолированных от пациентов с различной патологией (дисбиоз кишечника, инфекции мочеполовой системы, а также гнойно-воспалительные заболевания кожи и мягких тканей). | 2. Определить видовой состав микробиоты, образующей

i ассоциации с Citrobacter spp. и провести сравнительную характеристику

вирулентных и персистентных свойств цитробактеров при моно- и ассоциированной инфекции.

3. Изучить особенности персистентных и вирулентных свойств Citrobacter spp. при воздействии на них метаболитов представителей доминантной и ассоциативной микрофлоры на модели микробиоты дистального отдела толстого кишечника человека.

4. Определить внехромосомную генетическую изменчивость Citrobacter spp. при сокультивировании с ассоциативной микробиотой (на модели взаимодействия со штаммом В. subtilis).

Новизна исследования

Представлена комплексная характеристика патогенного потенциала бактерий рода Citrobacter, изолированных из различного клинического материала, при моно- и ассоциированной инфекции. Установлено, что клинические изоляты Citrobacter spp. обладают набором факторов персистенции (АЛА, АИА, БПО), вирулентности (гемолизины, липолитическая, ДНК-азная активности, токсинопродукция), антибиотикорезистентности, а также способностью образовывать ассоциации с условно-патогенной микробиотой человека, определяя формирование патологического микросимбиоценоза.

В экспериментах in vitro определено два типа направленности коммуникативой активности бактерий при формировании ассоциаций с Citrobacter spp. - синергидный и антагонистический. Представители ассоциативной микробиоты, стимулировали антилизоцимную активность и биопленкообразование С. freundii, и, напротив, бифидобактерии (доминанты) и лактозопозитивные негемолитические эшерихии (представители нормофлоры), изолированные при эубиозе, ингибировали адаптационную функцию Citrobacter spp.

Установлено, что метаболиты С. freundii, предварительно соинкубированные с культурами бифидобактерий, индуцировали у доминантов усиление антагонистической активности, подавляя АЛА и БПО цитробактеров. Полученные данные свидетельствуют о том, что бактерии рода Citrobacter распознаются доминантами как «чужеродный» микроорганизм, что может рассматриваться в качестве механизма защитного действия нормофлоры при эубиозе.

Впервые установлены изменения биологических свойств клинических штаммов бактерий рода Citrobacter при их совместном сокультивировании с модельным штаммом Bacillussubtilis ЗН, которые проявлялись как на фенотипическом (повышение чувствительности к антибактериальным

препаратам, снижение патогенного потенциала), так и на генотипическом уровнях (элиминации плазмид токсигенности).

Практическая ценность работы

Выявленные фенотипические изменения биологических свойств бактерий рода Citrobacter в условиях in vitro и in vivo, а также изменение плазмидного профиля токсигенных штаммов при совместном культивировании с В. subtitlis ЗН, расширяют теоретические представления о механизмах межмикробных взаимодействий в микросимбиоценозе при ассоциативном симбиозе человека.

Практическое значение исследований определяется подбором модельных штаммов, обладающих высоким патогенным потенциалом, депонированных в НИИ ГИСК им. JI.A. Тарасевича (патенты РФ № 2293764 и № 2293765). Данные культуры используются в работе практических лабораторий и научных учреждений в качестве модельных штаммов при изучении изменений патогенного потенциала бактерий под влиянием на них различных препаратов, а также в исследованиях механизмов формирования микросимбиоценозов человека.

Результаты исследований используются в учебном процессе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Башкирского государственного медицинского университета, в бактериологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений г.Уфы (Акт внедрения ГБОУ ВПО БГМУ, Акт внедрения № 10 РКБ им. Куватова, Акт внедрения №11 ДРКБ.).

Представленные данные - составная часть темы открытого плана НИР по теме «Молекулярная диагностика инфекций, вызываемых патогенами различных уровней организации» (№ гос. регистрации 01200906698).

Положения, выносимые на защиту

1. Ассоциативная микробиота усиливает вирулентный и персистентный потенциал бактерий рода Citrobacter, способствуя формированию патологического (дисбиотического) микросимбиоценоза.

2. Доминантные микросимбионты - бифидобактерии обладают антагонистической направленностью воздействия в отношении Citrobacter spp. и способны распознавать данный вид бактерий как чужеродный, снижая персистентный потенциал цитробактеров.

3. Регуляция токсигенности бактерий рода Citrobacter осуществляется на внехромосомном генетическом уровне посредством элиминации плазмиды LT-энтеротоксина под действием В. subtilis.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Ежегодной междисциплинарной научно-практической конференции стран СНГ (г. С.-Петербург, 2006, 2007 гг.), Всероссийской научно-практической конференции (г. Уфа, 2009 - 2012 гг.)

Публикации:По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ в журналах, рекомендованных ВАК и 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертационной работы: диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 87 отечественных и 197 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 4 таблицами и 14 рисунками.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиологическая роль бактерий рода Citrobacter в инфекционной патологии человека

Название бактерий рода Citrobacter впервые предложено C.Werkman, G.Gillen (1932), а позже было подтверждено И.Е.Микекевичем (1948) благодаря их способности утилизировать цитрат, и использовать его, как единственного источника углерода.

Согласно IX Определителю Берги род Citrobacter входит в семейство Enterobacteriaceae и включает 3 вида: Citrobacter freundii, Citrobacter diversus, Citrobacter amalonaticus [126].

Геномный полиморфизм бактерий рода Citrobacter и разнородность биохимических признаков позволили Brenner DJ et al. предложить совершенно новую классификацию бактерий рода Citrobacter, где различают следующие виды: Citrobacter freundii, Citrobacter koseri(C.diversus), Citrobacter amalonaticus, Citrobacter farmeri, Citrobacter youngae, Citrobacter braakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter sedlakii [110, 128, 154,312], Citrobacter rodentium [210] и пока еще неназванные 2 вида: 10 и 11, хотя указанная классификация не получила широкого применения.

Представители рода Citrobacter широко распространены в почве, в воде открытых водоемов, [27, 36, 59, 67, 81, 95], в окружающей среде[26, 44]. Некоторые исследователи считают их представителям естественной микрофлоры кишечника человека, т.к. часто обнаруживаются у практически здоровых людей [56, 57, 65, 70, 80, 151, 299, 411].

Тем не менее, в последние годы участились сообщения, где авторы не сомневаются в этиологии развития гнойно-воспалительных, урологических и кишечных инфекций, вызванных исключительно бактериями рода Citrobacter и особенно C.freundii О-антигеннесущими серотипами (022, 03, 04, 08, 05, 06, 09, 010, 023,024, 029, ОЗО) [21,45, 72, 379,409].

При этом данные ряда исследователей [75, 423] показывают, что по частоте встречаемости бактерии рода Citrobacter при различных инфекционных процессах составляет от 9,3% до 14,5%, от общего числа из всех выделенных условно-патогенных грамотрицательных возбудителей. По мнению же других авторов высеваемость бактерий рода Citrobacter при острых кишечных заболеваниях значительно выше и достигает 19,4-39,0% [6, 30,36, 59, 62, 135, 148, 424].

Sedlak J. et Rische H. описали случай вспышки пищевой токсикоинфекции, вызванные бактериями рода Citrobacter, еще в первой половине XX века. Plots J. et al. у больных с пищевой токсикоинфекцией выделили культуры Citrobacter серотипов 8а, 1с:8, а у реконвелесцентов обнаружили соответствующие агглютинины в титре 1:320. Описан случай вспышки пищевой токсикоинфекции, вызванный исключительно токсигенной культурой C.freundii, источником которых явились растительный салат, которых удобряли навозом свиней [409].

Имеются многочисленные сведения о том, что бактерии рода Citrobacter могут вызывать заболевания мочеполовой системы [73, 84, 92, 150, 244], а также являться причиной воспалительных процессов у гинекологических больных [133, 406]. Они часто выделяются также от больных с бронхитами и воспалительными процессами легких [203, 339, 423], при раневых инфекциях, аппендиците [40, 144, 301, 373], септическом состоянии [39, 117, 152, 155, 329, 408, 410].

В последние годы особую актуальность приобретает внутрибольничная инфекция, вызываемые условно-патогенными грамотрицательными микроорганизмами. Так, по данным В.Г.Петровской с соавт. [66] внутрибольничная инфекция, вызываемая условно-патогенными микроорганизмами регистрируется у 4,5-18% госпитализированных больных и 3% из них погибают от осложнений. При этом дети и люди пожилого возраста представляют группы риска. На долю,, так называемых условно-патогенных грамотрицательных бактерий, к которым относятся и бактерии

рода Citrobacter, приходится до 40% всех возбудителей внутрибольничных септициемий.

Многочисленны случаи послеоперационных осложнений в виде перитонита [334, 373], абсцесса печени [112], перитонзилярного и ретрофоренгиального абсцессов [153,408].

Наряду с E.coli, P.mirabilis и другими возбудителями внутрибольничных инфекций, C.freundii обнаруживается на раневых поверхностях при ожогах [244, 273], осложняя при этом заживление ран.

C.diversus вызывает спорадические и эпидемические вспышки менингитов [223, 309, 334]. При этом одна третья часть заболевших погибает, у 75% реконвелесцентов наблюдается тяжелые неврологические осложнения, что свидетельствует о наличие определенных особенностей возбудителя проходит через гематоэнцефалический барьер макроорганизма [203, 309, 334, 395, 424]. Finn et al.[401] описали случай септицемии и менингита у новорожденного, вызванного исключительно бактериями C.diversus. При этом источником инфекции у новорожденного явилась мать, что, возможно, свидетельствует на внутриутробное заражение плода, либо на алиментарный путь передачи возбудителя. Зачастую менингиты осложняются абсцессом мозга, и что часто заканчиваются летальным исходом [149,385].

В литературе имеются достаточно данных, где указываются развитие септического шока, вызванными токсигенными и антибиотико-резистентными штаммами C.freundii [155, 329].

Таким образом, бактерии рода Citrobacter могут быть причиной развития гнойно-воспалительных, токсико-септических, урологических и кишечных заболеваний. Многообразие клинических проявлений, где этиологическим агентом являются бактерии рода Citrobacter, указывает на наличие разнообразных факторов патогенности, и механизмы их патогенного действия остаются еще не до конца выясненными, и требует своего решения.

1.2. Фак�