Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиоценоз дыхательной системы и межмикробные взаимодействия при гриппе

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиоценоз дыхательной системы и межмикробные взаимодействия при гриппе"

0050521о»

На правах рукописи

ПАНЬКОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

МИКРОБИОЦЕНОЗ ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И МЕЖМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ГРИППЕ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 9 ДПР ¿813

Оренбург - 2013

005052189

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Усвяцов Борис Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», Минздрава России

доктор медицинских наук, доцент, ИКВС УрО РАН

доктор медицинских наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет»

Габидуллин Зайнулла Гайнулинович

Черкасов Сергей Викторович

Потатуркина-Нестерова Наталия Иосифовна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Челябинская Государственная Медицинская академия» Министерства здрвавоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «25» апреля 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, в конференц-зале (аудитория № 205), тел. (3532) 40-35-62, факс: (3532) 77-24-59, e-mail: orgma dsl@;esoo.ru, официальный сайт: http://orgma.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА.

Автореферат разослан « 2013 г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации в сети интернет «22» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор /77/ /Р// Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Проблема гриппа - одна из актуальных научных проблем последнего столетия. Многоликость и непредсказуемость этой инфекции обусловлена множеством подтипов основного возбудителя - вируса гриппа А и его чрезвычайной изменчивостью. (Киселев О.И., Цыбалова JI.M., 2005). Трудности в борьбе с гриппозной инфекцией обусловлены многими факторами, прежде всего неполной картиной патогенеза и выраженными микробиологическими нарушениями на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, которые ухудшают развитие заболевания и приводят к возникновению бактериальных осложнений.

Роль микрофлоры дыхательных путей в развитии бактериальных осложнений очевидна, хотя и не совсем ясна. Изучению микробной экологии дыхательных путей в последние годы уделяли достаточно большое внимание (Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П. и соавт., 2009). К сожалению, в большинстве публикаций нет четких указаний, какие отделы дыхательного тракта подвергались исследованию (Ермолина Г.Б., 2003). Немногочисленные публикации последних лет описывают состояние микробиоценоза верхних дыхательных путей при острых и хронических бактериальных процессах, а изменения микрофлоры респираторного тракта при гриппе подробно не рассматривалось (Миронов А.Ю. и соавт., 2000; Вавилова В.П. и соавт., 2002).

Формирование инфекционного процесса зависит не только от взаимодействия возбудителя заболевания с макроорганизмом, но и от особенностей симбиоза бактерий и вирусов, обитающих в нем (Medzhitov R., Janeway С., 2000). Большинство исследователей считают, что вирусо-бактериальные инфекции протекают значительно тяжелее, чем вирусные или бактериальные (Adam Н., 2007).

Частое сочетанное течение вирусных и бактериальных инфекций создает большие трудности в оценке роли микробных ассоциаций при инфекционном процессе. При гриппе эта проблема стоит остро, так как основную группу осложнений составляют бактериальные инфекции (McCullers J.A, 2003).

Малоизученными остаются межбактериальные и особенно виру-

со-бактериальные взаимодействия, открывающие одну из сторон возникновения бактериальных осложнений при гриппе.

В литературе нет единого представления о механизмах влияния бактерий на вирусы и вирусов на бактерии. Есть лишь единичные работы, которые касаются выделения ассоциаций вирусов и бактерий из того или иного биотопа (Набо.ка Ю.Л., 2006, Колобухина Л.В., 2001).

В связи с этим особое значение приобретает изучение межмикробных взаимодействий при гриппе, которое позволит раскрыть определенные звенья механизма развития бактериальных осложнений и разработать методы их прогнозирования.

Указанный комплекс нерешенных проблем определяет актуальность проведенных исследований.

Цель исследования: изучить изменения микрофлоры дыхательных путей при гриппе с учетом межмикробных взаимодействий для прогнозирования течения заболевания и развития бактериальных осложнений.

Задачи исследования:

1. Оценить количественные и качественные изменения бактериальной микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе.

2. Выявить особенности межбактериальных взаимодействий в условиях ассоциаций микробиоценоза верхних дыхательных путей при гриппе.

3. Изучить особенности вирусо-бактериальных взаимодействий в условиях ассоциации.

4. Определить роль межмикробных взаимодействий в патогенезе бактериальных осложнений при гриппе.

5. Разработать способ прогнозирования бактериальных осложнений с учетом особенностей межмикробных взаимодействий в биоценозе верхних дыхательных путей.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение микросим-биоценоза верхних дыхательных путей с учетом экспрессии факторов па-тогенности и персистенции. Выявлен высокий патогенный и персистент-ный потенциал микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом.

Выявлено, что микросимбиоценоз верхних дыхательных путей

при гриппе характеризуется более сложной популяционной структурой и менее сопряженными связями в ассоциациях, чем микросимбиоценоз верхних дыхательных путей здоровых людей.

Показаны различия в таксономическом составе и экспрессии факторов патогенности микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе А/С)ренбург/4/2009 (Н 1N1)v и сезонном гриппе.

Анализ результатов исследования микросимбиоценоза верхних дыхательных путей выявил особенности межбактериальных взаимодействий при гриппе. Микроорганизмы, выделенные со слизистых оболочек верхних дыхательных путей от больных гриппом, реже образовывали ассоциации, чем микроорганизмы, выделенные из биоценоза верхних дыхательных путей здоровых людей. У больных с бактериальными осложнениями микроорганизмы верхних дыхательных путей чаще формировали ассоциации, чем микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе без осложнений. Выявлена модификация свойств выделенных микроорганизмов в условиях бактериальной ассоциации. Показано, что в ассоциации микроорганизмы верхних дыхательных путей у больных гриппом активно влияют друг на друга, стимулируя факторы патогенности и персистенции.

Получены новые знания по микросимбиоценозу верхних дыхательных путей при гриппе с учетом изменения свойств симбионтов в условиях вирусо-бактериальных ассоциаций. Обнаружено взаимное влияние вируса гриппа В и Staphylococcus aureus в вирусо-бактериальной ассоциации на культуре клеток MDCK. Установлено повышение факторов патогенности как S. aureus, так и вируса гриппа в условиях вирусо-бактериальной ассоцияции.

Проведенные исследования позволили подобрать методический ключ к изучению модификации свойств бактерий и вирусов на модели вирусо-бактериальной ассоциации и рассматривать патогенез гриппа, учитывая роль симбиоза вирусов и бактерий в реализации механизмов постгриппозных осложнений.

Разработан способ прогнозирования бактериального осложнения после гриппа (Патент РФ № 2452960).

Практическая значимость работы

Впервые с микробиологических позиций расширено представление о течении гриппа и механизме развития бактериальных осложнений после гриппа.

Получен патент РФ на изобретение № 2452960 «Способ прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа».

Практическая ценность работы заключается в обосновании целесообразности использования полученных данных о микросимбиоценозе верхних дыхательных путей с учетом особенностей межмикробных взаимодействий при гриппе для прогнозирования бактериальных осложнений, что позволит уменьшить их количество и длительность течения заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику

По результатам исследования разработано информационно-методическое письмо «Прогнозирование бактериальных осложнений стафилококковой этиологии при гриппе» (Министерство здравоохранения Оренбургской области, 4.07.2011), которое распространено по территории Оренбургской области. Предложенные в нем практические рекомендации используются в работе врачей МБУЗ «ГКИБ» г. Оренбурга (акт внедрения от 20.08.2012 г.) и вирусологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области" (акт внедрения от 20.08.2012 г.).

Результаты работы включены в программу обучения студентов Оренбургской государственной медицинской академии на кафедрах микробиологии и эпидемиологии и инфекционных болезней (акты внедрения от 27.08.2012 г.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для гриппозной инфекции в остром периоде заболевания характерны значительные нарушения микросимбиоценоза верхних дыхательных путей, которые проявляются изменением таксономического состава микрофлоры, повышением.уровня экспрессии факторов патогенности и персистенции.

2. Вирусо-бактериальные взаимоотношения при гриппе in vitro и in vivo характеризуются взаимным усилением факторов патогенности и персистенции ассоциантов, что способствует дисбиозу верхних дыхательных

путей с преобладанием патогенной флоры и развитию бактериальных осложнений.

3. Усиление экспрессии факторов патогенности вируса гриппа и золотистого стафилококка в ассоциации является важным звеном патогенеза заболевания и может быть использовано для прогнозирования его течения.

Апробация работы

Основные материалы диссертационного исследования доложены на: шестой Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2009; Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням, г. Москва, 2009, 2010, 2011; V Международной Пироговской научной медицинской конференции, г. Москва, 2010; VIII межрегиональной научно-практической конференции эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и паразитологов, г. Оренбург, 2010; в комиссии по внедрению новых достижений в практику здравоохранения при министерстве здравоохранения Оренбургской области, г. Оренбург, 2011; VIII mezinarodni vCdecko - prakticka conference «Dny vedy - 2012», Praha, 2012.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 22 печатных работах, из которых 11 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, а также 1 патент РФ на изобретение и 1 информационно-методическое письмо.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 241 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 56 рисунками. Библиографический указатель содержит 150 отечественных и 174 зарубежных источников.

Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательной учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации согласно плана НИР (№ государственной регистрации темы 0120.0 809351).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для выполнения поставленной цели были сформированы 2 группы людей. Первую группу составили (п-318) больные гриппом, в грудо-способном возрасте от 17 до 60 лет. Из них 278 больных эпидемическим гриппом, а 40 - больные гриппом АЮренбург/4/2009 (HlNl)v. Вторую фуппу (п-37) составили здоровые люди, у которых последние 2 месяца не было острых заболеваний и обострений хронических заболеваний. Больные гриппом находились на лечении в МБУЗ ГКИБ г. Оренбурга,

Диагноз «Грипп» ставился на основании анамнестических, эпидемиологических, клинических данных. Помимо клинического обследования всем больным проводились рутинные методы лабораторной диагностики: общий анализ крови (OAK), общий анализ мочи (ОАМ). Диагноз гриппа подтверждался вирусологически, путем забора материала из носа и зева, его посева в культуру клеток MDCK и выделения вируса гриппа, а также постановкой реакции иммунофлюоресценции (РИФ) с использованием меченых флюорохромом специфических противогриппозных антител1. Больным по показаниям проводилось инструментальное обследование: рентгенография органов грудной клетки, электрокардиография (ЭКГ), ультразвуковое исследование внутренних органов (УЗИ). Было изучено 653 штаммов микроорганизмов, выделенных со слизистой оболочки носа и слизистой оболочки миндалин, из которых 530 микроорганизмов выделено от больных гриппом, а 123 - от здоровых людей. Выделение и идентификацию штаммов проводили на основании общепринятых методов (Биргер М.О., 1982; Шапиро A.B. с соавт., 1984).

Дальнейшая идентификация до вида проводилась с помощью дифференциально-диагностических тест-систем STAPHYtest, STREPTOt-est, ENTEROtest, NEFERMtest (LaChema, Чехия)2.

' Выделение и идентификация вируса гриппа проводилось п вирусологической лаборатории Федерального государственного учреждения здравоохранении «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» при консультировании заведующего вирусологической лаборатории Сморцова В.О.

'Выделение и идентификация микроорганизмов проводилась автором совместно с сотрудниками бактериаологической лаборатории МБУЗ ГКИБ г. Оренбурга, заведующая лабораторией А.Р. Миронова.

У выделенных микроорганизмов изучали факторы патогенности (гемолитическую, лецитовителлазную активности), колонизации (лизо-цимную активность) и персистенции (антилизоцимную активность) по общепринятым методикам (Биргер М.О., 1982; Бухарин О.В. с соавт., 1999).

Для группировки таксонов выделенной микрофлоры использовался метод кластерного анализа, позволяющий определить близость бактерий в ассоциациях (Мандель И.Д., 1988). Степень сопряженности связей бактерий в ассоциациях определяли с помощью коэффициента Жаккара, являющегося наиболее достоверным показателем экологического сходства различных видов микроорганизмов: q = с х 100 / (а + Ь - с), где с - число выборок, содержащих оба таксона; а - число выборок, содержащих один таксон; b -число выборок, содержащих другой таксон (Зубков М.Н., 1995). Для изучения факторов патогенности в условиях межбактериальных взаимодействий был использован метод перекрестного посева штаммов-симбионтов (Хуснутдинова J1.M., 2004)'. Для изучения вирусобактериаль-ных взаимодействий была разработана экспериментальная модель (Патент РФ от 10.06.2012, № 2452960). Изучено взаимодействие вируса гриппа В и S. aureus in vitro (в культуре клеток). Было изучено 40 штаммов S. aureus, выделенных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей больных гриппом людей. Тампон с исследуемым материалом (слизистый секрет из носоглотки больного гриппом) засевали на чашки Петри с 5% кровяным агаром методом секторов по Gould, выделяли чистую культуру S. aureus (Методические рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus. - Москва, 1990). У выделенных штаммов S. aureus определяли по известным методикам гемолитическую активность (ГА) и антилизоцимную активность (АЛА). Вирус гриппа В выделялся в период эпидемического сезона. Выделенные изоляты вируса гриппа В хранились в вирусологической лаборатории в замороженном состоянии при - 20°С в течение I года (до начала следующего эпидемического сезона) и общедоступны для различных исследований (Методические рекомендации «Выделение вируса гриппа в клеточных культурах и куриных эмбрионах и их идентификация, 2006).

'Микробиологические исследования проведены автором в лаборатории экологии микроорганизмов ИКВС УрО РАН, руководитель - дм.п., профессор Усвяцов Б.Я.

Модель ассоциации вируса гриппа В и S. aureus воспроизводили на культуре клеток MDCK. На первом этапе формировали монослой клеток MDCK. Ростовая среда готовилась по общепринятой методике: к 19 мл среды DMEM (без сыворотки) добавляли 0,5 мл бычьего альбумина (V фракция), 0,5 мл 1 М HEPES-буфера, 0,4 мл ТРСК-трипсина (до конечной концентрации 2,0 мкг/мл). ТРСК-трипсин из 1 ампулы предварительно регидратировали в 2 мл стерильной дистиллированной воды и добавляли в среду в указанном выше количестве. В подготовленную среду добавляли 30 мкл концентрированного раствора пенициллина и стрептомицина. Затем к 1 мл взвеси клегок MDCK. (в концентрации 400 тыс. клеток/мл) добавляли 2 мл ростовой среды. Для формирования монослоя клеток MDCK пробы инкубировали в термостате 48 часов при 37 °С. Затем ростовую среду сливали и 2-3 раза отмывали средой DMEM, после чего среду DMEM удаляли. Параллельно готовили опытную и контрольную пробы. В опытной пробе и контроле в монослой клеток MDCK вносили 0,1 мл вируса гриппа В в концентрации 4 агглютинирующие единицы (АЕ) на 1 мл 1 % суспензии эритроцитов. Для адсорбции вируса на культуре клеток MDCK пробы инкубировали в термостате 60 минут при 37°С. В контроле в монослой клеток MDCK вместо вируса добавляли 0,1 мл физиологического раствора и также инкубировали 60 минут в термостате при 37°С. Затем в опытную пробу и контроль 1 добавляли 0,1 мл 106 взвеси S. aureus и 1 мл среды DMEM, поддерживающей рост культуры клеток. При добавлении к 0,1 мл 106 КОЕ/мл взвеси 5. aureus 1 мл среды DMEM получается конечная концентрация стафилококка 1х10б КОЕ/мл. Опытную и контрольные пробы инкубировали 48 часов при 37°С. После соинкубирования в опыте и контроле определяют у S.aureiis гемолитическую и антилизо-цимную активность. У вируса гриппа были определены гемагглютини-рующая способность вируса, цитопатическое действие (Методические рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus. - Москва, 1990) и способность к репродукции. Количественное определение вируса гриппа проводили методом ПЦР в режиме реального времени аппаратом Rotor Gene 6000 (Инструкция по применению набора реагентов для выявления РНК вируса гриппа A {Influenza virus А) и гриппа В (Influenza vims В) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Ам-

плиСснс* Injluenza virus A/B-FL. Утверждена приказом Росздравнадзора от 05.06.09. № 4481-Пр/09)'.

Для оценки эффективности способа прогнозирования осложнений после гриппа проведено обследование 85 больных, у которых выделен S. aureus со слизистой оболочки верхних дыхательных путей.

Для проведения клинической апробации предложенного способа прогнозирования бактериальных осложнений после гриппа была изучена микрофлора верхних дыхательных путей и мокроты, выделенная от больных пневмонией осложнившей грипп, и проведен сравнительный анализ с микрофлорой верхних дыхательных путей больных гриппом без бактериальных осложнений. Было исследовано 12 больных постгриппозной пневмонией. Забор материала со слизистой ротоглотки проводился с помощью стерильного тампона на 1-2 день заболевания. Мокроту у больных собирали с момента ее появления (на 4-5 день болезни) согласно методическим рекомендациям (МУ 4.2.2039-05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2006). Пневмония подтверждалась рентгенологически.

Было обследовано 13 больных людей с первичной внебольничной пневмонией, от которых со слизистых оболочек верхних дыхательных путей выделено 34 штамма микроорганизма.

Данные по видовому составу и биологическим свойствам микрофлоры верхних дыхательных путей были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Exel 2003 и лицензионных программ «Биостат» (Гланц С, 1999) путем подсчета средней арифметической (М) и средней ошибки средней арифметической (m), среднеквадратичного отклонения (а) и показателей достоверности различий с помощью вычисления критерия Стьюдента (t) с последующим нахождением уровнем достоверности различий (р). Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.

' ПЦР диагностика проводилась в вирусологической лабораторииФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области» автором совместно с сотрудниками лаборатории и заведующим лабораторией Скворцовым В О.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного исследования выявленных особенностей таксономического состава микрофлоры верхних дыхательных путей больных сезонным гриппом выявлены различия микробиоценозов носа и миндалин у больных и здоровых людей по частоте выделения и показателю микробной обсемененности таксонов. Микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе характеризовалась увеличением определенных видов бактерий, преимущественно S. aureus, Streptococcus pyogenes и снижением нормальной (условно-патогенной) микрофлоры, прежде всего Staphylococcus epidermidis. Эти различия наблюдались как в микрофлоре носа, так и миндалин. Со слизистой оболочки носа больных гриппом людей в 5 раз чаще выделялся S. aureus, чем со слизистой оболочки носа здоровых людей (31,1 ± 3,9 % против 6,3 ± 2,5 %), менее часто выделялся S. pyogenes (6,5 ±2,1 % против 4,3 ± 2,0 %) и реже выделялись: S. epidermidis (4,3 ± 1,9 % против 12,8 ±3,5 %), Staphylococcus saprophytics (2,2 ± 1,2% против 6,4 ± 2,5 %), Streptococcus salivarius (1,6 ± 1,0 % против 8,6 ± 2,9%) (рис. 1).

Со слизистой оболочки миндалин от больных гриппом чаще, чем от со слизистой оболочки миндалин здоровых людей выделялись S. aureus (27,7 ± 2,5 % против 1,3 ± 1,3 %; р<0,01), Aerococcus viridans (15,8±2,1 % против 7,9±3,1%; р<0,05).

Со слизистой оболочки миндалин больных гриппом людей реже высевались: S. epidermidis (0,3 ± 0,3 % против 7,9 ± 3,1 %; р<0,01), Staphylococcus hominis (1,0 ± 0,5 % против 4,0 ± 2,2 %; р<0,05), Micrococcus spp. (1,0 ± 0,5 % против 7,9 ± 3,1 %; р<0,01), S. salivarius (2,2 ± 0,8 % против 10,5 ± 3,5 %; р<0,01), Streptococcus oralis (1,3 ± 0,6 % против 9,2 ± 3,3 %; р<0,01) (рис. 2).

У.

S, saprophvticus «ajan»««

S. hominis wMM ' 1

S. liyicus msonoW

*S. epidenilidis UMUm«U«MiimM

S. warnen (äs

S. haeinolyticus —1 S. capitis 1

S. intermedius ma

S. klosii mm

S. gallinarum mimi

S. pisifermentans ebb

S. pyogeiies BBflflBM 3

S. mi tis jag '

*S. salivarías ¡¡3—

= S. oralis üb

g S. bovis 3

H. S. mutans 23

o

£ S. anginosus 3 S. agalactiae a S. sali s 3 S. vestibularis 2 E. faecium

^ E. faecalis

Micrococcus spp. § K. pneumoniae ■S K. oxytoca

„ Eikinella spp.

P. vulgaris

§ М.тогаат шк

0,0% 5.0% 10,0% 15,0% 20.0% 25,0% 30,0% 35.0%

□ больные гриппом О здоровые

Рис. 1. Частота выделения микроорганизмов со слизистой оболочки носа

здоровых и больных гриппом людей * - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистой оболочки носа здоровых и больных гриппом людей, р<0,05

'S. aureus S. saprophyticus *S. hominis S. hyicus *S. epi de nil id is jsGHE S. liaemolyticus S. capitis S. intermedins S. arleltae S. caprae S. klosii S. xylosus S. caseolyticus S. sanguis S. pyogenes S. miiis *S. salivarius *S. oralis S. bovis S. mutans — S. anginosus ^ S. agalacliae -3 S. pneumoniae aa S. constellans an

S. suis 1 S. vestibularis be Neisseria spp. ss Moraxella spp. ^ E. coli m *A. viridans 3» E. faecimn ¿ä E. faecalis bh "Micrococcus spp. sä K. pneumoniae — K. oxy toca 1 C. albicans — P., vulgaris es M. moreani

0.0°о 5,0°о 10.0°о 15.00о 20.0°о 25,0°° ЗОЛ0 о □ больные гриппом 1 здоровые

Рис. 2. Частота выделения микроорганизмов со слизистой миндалин здоровых и больных гриппом людей * - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистой оболочки миндалин здоровых и больных гриппом людей, р<0,05

Выявлены различия в показателе микробной обсемененности (ПМО) у микроорганизмов, выделенных со слизистой оболочки носа больных гриппом людей. Наибольшие различия были выявлены у S. aureus, S. pyogenes, S. warnen, S. epidermidis. ПМО этих видов бактерий из носа больных гриппом людей в 10 и более раз выше, чем у микроорганизмов, выделенных из носа здоровых людей: у S. aureus - Ig 7,1 ± 0,08 КОЕ/тампон против lg 5,7 ± 0,3 КОЕ/тампон; р<0,01), S. pyogenes lg 7,3 ± 0,1 КОЕ/тампон против lg 6,0 ± 0,5 КОЕ/тампон; р<0,01), S. warneri - lg 8,0±0,2 против lg 7,0±0,5; р<0,03). У больных гриппом людей из носа в 10 раз меньше выделялся S. epidermidis, чем из носа здоровых людей (lg 5,2 ± 0,3 КОЕ/тампон против lg 6,2 ± 0,2 КОЕ/тампон; р<0,01).

В микробиоценозе слизистой оболочки миндалин больных гриппом людей по сравнению с микробиоценозом слизистой оболочки миндалин здоровых людей значимо преобладали Staphylococcus haemolyticus - lg 6,8 ± 0,1 КОЕ/тампон против lg 5,0 ± 1,0 КОЕ/тампон; р<0,01, Streptococcus mitis - Ig 7,1 ± 0,1 КОЕ/тампон против lg 6,0 ± 1,0 КОЕ/тампон; р<0,05. Streptococcus oralis у больных гриппом людей выделялся в 10 раз меньше, чем у здоровых людей (lg 5,5 ± 0,2 КОЕ/тампон против lg 6,7 ± 0,2 КОЕ/тампон; р<0,01).

Анализ полученных результатов показал, что микрофлора верхних дыхательных путей при сезонном гриппе характеризовалась увеличением частоты встречаемости определенных видов, преимущественно за счет S. aureus, S. pyogenes и снижением количества нормальной микрофлоры, прежде всего S. epidermidis. Эти различия наблюдались как в микрофлоре носа, так и миндалин. Микробиоценозы верхних дыхательных путей при гриппе характеризовались различием распространенности, как факторов патогенности, так и факторов персистенции. Микрофлора верхних дыхательных путей больных гриппом, по сравнению с микрофлорой верхних дыхательных путей здоровых людей, характеризовалась выраженной распространенностью гемолитической активности (51,1 ± 2,1 % против 43,9 ± 2,6 %; р<0,05) и антилизоцимной активности (65,4 ± 4,1 % против 32,8 ± 2,3 %; р<0,05).

Распространенность гемолитической активности у стафилококков, выделенных от больных гриппом людей, была в 1,4 раза выше, чем у стафилококков, выделенных от здоровых людей (30,8 ±3,5 % против 21,9

± 2,7%; р<0,05), а распространенность антилизоцимной активности в 36 раз выше (28,6 ± 3,9 % против 0,8 ± 0,8 %; р<0,01) (табл. 1).

Таблица I.

Распространенность факторов патогенности у Staphylococcus и Streptococcus, выделенных из биоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных

путей от больных гриппом и здоровых людей

Таксоны Staphylococcus Streptococcus

Здоровые Больные Здоровые Больные

Распространенность М ± ш, % М ± ш, % М ± ш, % М ± т, %

ГА 21,9 ±2,7 30,8 ±3,5* 10,5 ±2,5 12,0 ±2,8

ЛецА 8,1 ±2,5 10,5 ±2,6 - -

ЛА 4,1 ± 1,7 3,0 ± 1,5 2,4 ± 1,4 0,8 ± 0,8

АЛА 0,8 ± 0,8 28,6 ± 3,9* 1,6± 1,1 18,8 ±3,4*

* - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей здоровых и больных гриппом людей, р<0,05

Различий в распространенности лецитовителлазной (8,1 ± 2,5 % против 10,5 ± 2,6 %) и лизоцимной активности (4,1 ± 1,7 % против 3,0 ±

1.5 %) в сравниваемых группах отмечено не было.

У микроорганизмов рода Streptococcus, выделенных от больных гриппом людей, отмечены более высокие показатели антилизоцимной активности, чем у стрептококков, выделенных от здоровых людей: антилизоцимная активность была выше в 11,7 раза (18,8 ± 3,4 % против

1.6 ± 1,1 %; р<0,01). Гемолитическая и лизоцимная активность у стрептококков отличались незначительно.

Учитывая, что стафилококки, выделенные от больных гриппом людей, характеризовались высокой распространенностью ГА и АЛА, было изучено проявление факторов патогенности у отдельных видов стафилококков.

Все виды рода Staphylococcus были разделены на 3 группы. В первую вошел патогенный вид S. aureus. Вторую группу составили коагулазоот-рицательные стафилококки (КОС), в которую вошли: S. hominis, S. haemolyti-cus, S. saprophyticus, S. warneri, S. epidermidis, S. gallinarum, S. caseolyticus, S. pisifermentans, S. caprae — это представители нормальной микрофлоры. Третья группа - коагулазоположительные стафилококки (КПС): S. hyicus и

S. intermedins (рис. 3).

Анализ данных, приведенных на рис. 3, свидетельствует о том, что S. aureus, выделенный от больных гриппом, обладал высокой распространенностью факторов патогенное™. Гемолитическая и лецитовителлазная активности выявлялись в 6 раз чаще (19,5 ± 3,4 % против 3,3 ± 1,5 %; р<0,01 и 9,8 ± 2,6 % против 1,6 ± 1,1 %; р<0,05 соответственно), а антилизоцимная активность обнаружена только у штаммов от больных гриппом (17,3 ± 3,3 %). Лецитовителлазная активность КОС, выделенных от больных гриппом, была в 7 раз выше, чем у КОС, выделенных от здоровых людей (5,7±2,1 % против 0,8±0,8 %, при р<0,05). АЛА выявлялась только у коагулазоотрица-тельных стафилококков, выделенных от больных гриппом (9,0 ± 2,5 %).

Рис. 3. Распространенность факторов патогенности Б1арку1ососсш ирр., выделенных из биоценоза слизистых верхних дыхательных путей от больных фиппом и здоровых людей * - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей здоровых и больных гриппом людей, р<0,05

В связи с возникновением пандемии гриппа А/СаПГогта/04/2009 (НШ1)5\у1 - в 2009 г., на следующем этапе работы был изучен микробиоценоз верхних дыхательных путей у больных гриппом А/Оренбург/4/2009 (Н1Ш)у с определением биологичеких свойств микроорганизмов данного биотопа.

Микрофлора при гриппе А/Оренбург/4/2009 (II1NI )у представле-

на преимущественно стрептококками (83,2 ± 6,2 %), причем на слизистой носа, в основном обнаружены S. pyogenes (33,3 ± 7,8 %), Streptococcus bovis (11,1 ± 5,2 %), Streptococcus agalactiae (22,2 ± 6,9 %), а на слизистой миндалин - S. nütis (21,7 ± 6,1 %). Также чаще выделялись энтерококки (17,4 ± 4,2 % против 5,2 ± 0,8 % при сезонном гриппе).

Из стафилококков при гриппе А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v выделялся только S. aureus. Отмечено преобладание распространенности ГА и АЛА у S. pyogenes и S. agalactiae. Так у S. pyogenes, выделенных из биоценоза верхних дыхательных путей больных гриппом АЮренбург/4/2009 (HlNl)v распространенность гемолитической активности была в 3 раза выше (10,8±3,4 % против 3,8±1,7 %; р<0,05), а антилизоцимной активности в 2,5 раза выше (13,5±3,8 % против 5,3±1,9 %; р<0,04), чем у таксонов S. pyogenes, выделенных от больных сезонным гриппом. У S. agalactiae, выделенных от больных гриппом АЮренбург/4/2009 (HlNl)v распространенность гемолитической активности была в 7 раз выше (10,8±3,4 % против 1,5±1,0 %; р<0,01), а антилизоцимной активности в 17 раз выше (13,5±3,8 % против 0,8±0,8 %; р<0,01), чем у таксонов S. agalactiae, выделенных от больных сезонным гриппом.

Течение гриппозной инфекции отягощается частым развитием бактериальных осложнений при гриппе. Бактериальными осложнениями

V i'

при гриппе среди обследованных больных были: бронхит - 27,0 ± 2,7 %, пневмония - 9,0 ± 1,9 %, синусит - 3,2 ± 1,0 %, и меньше 1 %: отит, астенический синдром, стоматит, геморрагический синдром, носовое кровотечение, пиелонефрит. Из мокроты больных гриппом с бактериальными осложнениями были выделены S. pyogenes (24,5 ± 4,7 %), А. viriclans (15,5 ± 4,0 %), 5. aureus (18,5 ± 4,2 %), в единичных случаях выделялся S. agalactiae (1,2 ± 1,2 %). У больных гриппом, осложненным пневмонией, по сравнению с гриппом, осложненным бронхитом, со слизистых оболочек верхних дыхательных путей в 1,7 раза чаще выделялся S. pyogenes (31,6 ± 5,0 % против 19,0 ± 3,9 %; р<0,05), в 3,3 раза чаще 5. saprophyticus (10,5 ± 3,2 % против 3,2 ± 1,8 %; р<0,05); с одинаковой частотой А. viriclans (26,3 ± 4,9 % против 25,4 ± 4,8 %) и Klebsiella pneumoniae (5,3 ± 2,5 % против 4,8 ± 2,4 %); в 1,5 раза реже выделялся S. aureus (15,8 ± 3,8 % против 23,8 ± 4,7 %). Ряд микроорганизмов выделялся только при бронхитах: S. homi-

nis, Klebsiella oxytoca, Enterococcus faecalis, Morganella spp., S. haemolyti-cus, S. agalactiae, 5. hyicus, S. salivarías, Candida albicans. При пневмониях, напротив, выделялся только S. mitis.

Показатель микробной обсемененности микроорганизмов при бактериальных осложнениях гриппа был высоким - от lg 5 КОЕ/тампон до lg 7,3 КОЕ/тампон. Наибольшие отличия выявлены в ПМО у штаммов Escherichia coli, выделенных со слизистой оболочки верхних дыхательных путей при бронхитах, чем при пневмониях (lg 7,0 ± 0,1 КОЕ/тампон против Ig 6,0 ± 0,1 КОЕ/ тампон; р<0,01). Микроорганизмы, выделявшиеся только при бронхитах (S. hominis, К. oxytoca, Е. faecalis, Morganella spp., S. haemolyticus, S. agalactiae, S. hyicus, S. salivarius, C. albicans) характеризовались высоким ПМО. S. mitis, напротив, выделялся только при пневмониях с ПМО lg 6,0 ±0,1. Факторы патогенности выделенных микроорганизмов при гриппе, осложненном бронхитом, и гриппе, осложненном пневмонией, достоверно не отличались ни по частоте выявления, ни по уровню экспрессии. Проведенные исследования показали, что микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе, осложненном бронхитом, более разнообразна, чем микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе, осложненном пневмонией. При этом наибольшей частотой выделения характеризовались S. aureus, S. pyogenes и A. viridans как при гриппе с пневмониями, так и при гриппе с бронхитами.

Следовательно, на слизистой оболочке верхних дыхательных путей при гриппе с бактериальными осложнениями происходит селекция определенных видов бактерий, которые влияют на характер заболевания. Учитывая, что при гриппе, осложненном пневмонией, патобиоценоз верхних дыхательных путей характеризовался преобладанием S. pyogenes и A. viridans, а при гриппе, осложненном бронхитом - S. aureus, можно предположить их транслокацию в нижние дыхательные пути, что является причиной развития бактериального осложнения. Было проведено сравнительное изучение экспрессии факторов патогенности и персистенции у микрофлоры верхних дыхательных путей больных гриппом с бактериальными осложнениями гриппа и без бактериальных осложнений (рис. 4).

Важной характеристикой выделенных ассоциаций является степень сопряженности микроорганизмов, как показатель стабильности ассоциаций и прочности формируемых ими взаимодействий.

Наиболее стабильные ассоциации микроорганизмов выявлены в микросимбиоценозе миндалин у здоровых людей. В микрофлоре здоровых людей со слизистой миндалин выявлено 4 ассоциации с выраженной сопряженностью связей (g>50 %): S. vestibularis + S. klosii, S. arletlae + 5". caseolyticus, S. arletlae + S. pneumoniae, S.caseolyticus + S. pneumoniae и 5 ассоциаций с умеренной сопряженностью связей (30<g<50 %) (рис. 7).

У больных гриппом со слизистой миндалин не выявлено ассоциаций с выраженной сопряженностью, 7 ассоциаций характеризовались умеренной сопряженностью и 8 ассоциаций со слабой сопряженностью (рис. 8).

S. capitis

............ слабая;----умеренная; -выраженная

20 %<£< 30 % 30 % < § < 50 % g > 50 % Рис. 7. Сопряженность таксонов микрофлоры слизистой оболочки миндалин у здоровых людей

5

3 5

О I--Г------Г---—---,--г—--,-----_____-_____-

1 23456789 10 11 серии опытов

• S. aureus+lnfluenza virus В —ЯН"Influenza virus В

Рис. 14. График циклов амплификации вирусной РНК в ПЦР методом

Real-time

Данные результаты показывают взаимное влияние вируса гриппа и S. aureus, что в итоге сказывается на патогенности симбионтов. Можно предположить, что, потенцируя действие друг друга, вирус гриппа и S. aureus отягощают течение гриппозной инфекции и приводят к развитию бактериальных осложнений.

Изучение закономерностей формирования вирусо-бактериальной ассоциации поможет расшифровке новых звеньев в механизме симбиоти-ческих взаимоотношений. Включение в симбиоз вирусов и бактерий может иметь разные последствия для гомеостаза хозяина и определять результат течения инфекционного процесса.

Экспериментальная модель вирусо-бактериальной ассоциации позволила разработать способ прогнозирования бактериальных осложнений после гриппа. Если у S. aureus, выделенного от больного гриппом, после соинкубирования с вирусом гриппа В ГА повышается на 1 мм и более и/или АЛА на 1 мкг/мл и более по сравнению с контролем, можно прогнозировать развитие бактериального осложнения стафилококковой этиологии (рис. 15).

Рис. 15. Способ прогнозирования постгриппозных осложнений с использованием экспериментальной вирусобактериальной модели

Для иллюстрации работы модели приводим клинические примеры.

Пример № 1. Больной Б., 22 года. Поступил в МГКИБ с диагнозом "Грипп". В первый день поступления больного со слизистой носоглотки выделили штамм S. aureus. Этот штамм соинкубировали с вирусом гриппа В по описанной методике. Были определены ГА и АЛА у S. aureus в опытной и контрольной пробах.

В результате исследования у S. aureus отмечено повышение ГА на

1 мм, АЛА на 4 мкг/мл. У больного развилось осложнение - правосторонняя нижнедолевая пневмония. Было сделано заключение о том, что штамм S. aureus, у которого наблюдалось повышение гемолитической активности на 1 мм и антилизоцимной активности на 4 мг/мл способствовал развитию у больного гриппом пневмонии.

Пример № 2. Больной П., 31 год. Поступил в МГКИБ с диагнозом "Грипп". В первый день поступления больного со слизистой носоглотки выделили штамм S. aureus. Этот штамм соинкубировали с вирусом гриппа по описанной методике. Были определены Г'А и АЛА у S. aureus в опытной и контрольной пробах.

В результате исследования у S. aureus отмечено повышение ГА на

2 мм, АЛА на 2 мкг/мл. У больного развилось осложнение - острый бронхит.

Пример № 3. Больной С., 17 лет. Поступил в МГКИБ с диагнозом "Грипп". В первый день поступления больного со слизистой носоглотки выделили штамм S. aureus. Этот штамм соинкубировали с вирусом гриппа по описанной методике. Были определены ГА И АЛА у S. aureus в опытной и контрольной пробах.

В результате исследования у S. aureus повышения ГА и АЛА не отмечено. Осложнений у больного не развилось.

Частота развития осложнений отличалась в зависимости от экспрессии ГА и АЛА S. aureus после сокультивирования с вирусом гриппа (табл. 3). При повышении значений ГА < 1 мм и АЛА < 1 мкг/мл у S. aureus бактериальных осложнений при гриппе не развивалось. При повышении значений ГА >1 мм у S. aureus бактериальные осложнения при гриппе развивались в 56,5±5,4 % случаев, а при повышении значений АЛА > 1мкг/мл у S. aureus бактериальные осложнения при гриппе развивались в 58,8 ± 5,3 %.

явлены различия в частоте выделения микроорганизмов со слизистых оболочек верхних дыхательных путей при неосложненном и осложненном пневмонией гриппом, а также из мокроты больных постгриппозной пневмонией (рис. 18).

50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0%

□ м/о со слизистой верхнихдыхательныхпутей без осложнений И м/о со слизистой верхнихдыхательныхпутей при пневмонии ■ м/о из мокроты при пневмонии

Рис. 18. Частота выделения микроорганизмов со слизистой оболочки ротоглотки и из мокроты больных гриппом, осложненным пневмонией * - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей при неосложненном гриппе и мокроты при постгриппозной пневмонии, р<0,05

** - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей и мокроты при постгриппозной пневмонии, р<0,05

Как видно из рис. 18 у больных пневмонией частота выделения S. aureus со слизистой оболочки верхних дыхательных путей была одинаковой с частотой выделения со слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больных без осложнений и сохранилась такой же высокой и на 4-5 день болезни, что подтвердилось выделением его из мокроты. S. pyogenes выделялся у больных пневмонией со слизистой оболочки верхних дыхательных путей в 2,3 раза чаще, чем от больных без осложнений (31,6 ± 5,0 % против 13,8 ± 2,6 %; р<0,05), а из мокроты - в 3,6 раза чаще (50,0 ± 4,4%

*

S. aureus S. pyogenes A. viridans

против 13,8 ± 2,6 %; р<0,05). A. viridans выделялся у больных пневмонией со слизистой оболочки верхних дыхательных путей в 2,2 раза чаще, чем от больных без осложнений (26,3 ± 4,9 % против 12,1 ± 1,9 %; р<0,05), а из мокроты - в 3,6 раза чаще (25,0 ± 12,5 % против 12,1 ± 1,9 %; р<0,05).

В показателе микробной обсемененности наибольшие различия выявлены у S. pyogenes, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом осложненным пневмонией по сравнению с S. pyogenes, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом без осложнений (lg 7,3 ± 0,3 КОЕ/тампон против lg 6,7 ± 0,1 КОЕ/тампон; р<0,05), при этом в мокроте сохраняется высокий показатель микробной обсемененности (lg 5,5 ± 0,2 КОЕ/тампон) (рис. 19).

S. aureus S. pyogenes A. viridans

□ м/о со слизистой верхнихдыхательных путей при гриппе без осложнений И м/о со слизистой верхних дыхательных путей при постгриппозной пневмо Ям/о из мокроты при пневмонии

Рис. 19. Г1МО микроорганизмов со слизистой оболочки ротоглотки и из мокроты больных гриппом, осложненным пневмонией * - достоверность при сравнении показателей микробиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей при неоСложнениом и осложненном пневмонией гриппе гриппе, р<0,05

Анализ полученных результатов показал высокие показатели Г'А и АЛА у микроорганизмов выделенных от больных пневмонией. У S. aureus, выделенных от больных пневмонией, как со слизистой верхних

A. viridans S. sawonlivticus E. coli S. milis

О внебольничная пневмония В пневмония при гриппе

S ovoüenes Л viridans S. sanroDhvticus !:' coli К. mieiimoniae S. aureus S. milis

□ внебольничная пневмония ЕЭ пневмония при гриппе

Рис. 22. Частота выделения микроорганизмов со слизистой верхних дыхательных путей больных гриппом, осложненным пневмонией * - достоверность при сравнении показателей частоты выделения микроорганизмов со слизистой оболочки верхних дыхательных путей людей, больных внеболышчной и постгриппозной пневмонией, р<0,05

Рис. 23. ПМО микроорганизмов, выделенных со слизистых верхних дыхательных путей больных гриппом, осложненным пневмонией

* - достоверность при сравнении ПМО микроорганизмов со слизистой оболочки верхних дыхательных путей людей, больных внеболышчной и постгриппозной пневмонией, р<0,05

При постгриппозной пневмонии ПМО был значимо выше у A. viridans (lg 7,2 ± 0,2 против !g 6,0 ± 0,3; р<0,01) и S. saprophytics (lg 7,0 ± 0,1 КОЕ/тампон против lg 6,0 ± 0,1 КОЕ/тампон; р<0,01) и значимо ниже у Е. coli (lg 6,0 ± 0,2 КОЕ/тампон против lg 7,0 ± 0,1 КОЕ/тампон; р<0,01) и S. milis (ig 6,0 ± 0,2 КОЕ/тампон против lg 7,0 ± 0,2 КОЕ/тампон; р<0,01) по сравнению с микроорганизмами, выделенными от больных внеболь-ничной пневмонией (рис. 23).

У микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных постгриппозной пневмонией экспрессия ГА и АЛА были более высокими, чем при внебольничной пневмонии (в среднем 4,52 мм против 1,3 мм и 4,5 мкг/мл против 2,2 мкг/мл соответственно). Различия выявлены как в ГА, так и в АЛА у S. aureus (4,5 ± 0,2 мм против 1,9 ± 0,1 мм; р<0,01; 4,7 ± 0,2 мкг/мл против 3,4 ± 0,3 мм; р<0,01) и S. pyogenes (5,5 ± 0,5 мм против 1,7 ± 0,9 мм; р<0,01; 4,0 ± 0,6 мкг/мл против 1,7 ±0,9 мм; р<0,01) (рис. 24).

S. aureus S. pyogenes

ГА (мы)

□ внебольиичная пневмония

S. aureus S. pyogenes

АЛА (мкг\.мл) S пневмония при гриппе

Рис. 24. Выраженность ГА и АЛА у S. aureus и S. pyogenes при постгриппозной пневмонии

* - достоверность при сравнении показателей ГА и АЛА микроорганизмов со слизистой оболочки верхних дыхательных путей людей, больных вне-больничной и постгриппозной пневмонией, р<0,05

Проведенные исследования открывают одну из сторон патогенеза развития бактериальных осложнений после гриппа, обращая внимание на прямую роль вирусо-бактериальных взаимодействий в их развитии.

Таким образом, проведенная работа по изучению микробиоценоза дыхательной системы и межмикробных взаимодействий при гриппе позволила выделить основные моменты.

1. Доказано, что для гриппозной инфекции в остром периоде заболевания характерны значительные нарушения микросимбиоценоза слизистых оболочек верхних дыхательных путей, которые проявляются изменением таксономического состава микрофлоры, уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции.

2. Межмикробные взаимодействия при гриппе складываются из взаимодействий бактерий в бактериальной ассоциации и вирусобактери-альных взаимодействий, что приводит к селекции патогенных микроорганизмов из условно-патогенной микрофлоры и развитию бактериальных осложнений после гриппа.

3. Вирусо-бактериальные взаимодействия являются важным звеном развития бактериальных осложнений при гриппе и могут быть использованы для прогнозирования течения заболевания, что сокращает пребывание больного в инфекционном стационаре и экономит затраты на лечение.

Выводы

1. Микрофлора верхних дыхательных путей при сезонном гриппе характеризовалась большей частотой встречаемости S. aureus, S. pyogenes и меньшим показателем микробной обсемененности S. epidermidis по сравнению с микрофлорой верхних дыхательных путей здоровых людей. Эти различия наблюдались как в микрофлоре носа, так и миндалин.

2. У больных сезонным гриппом с бактериальными осложнениями на слизистых оболочках верхних дыхательных путей выявлены высокая частота встречаемости и повышенный показатель микробной обсемененности S. aureus, S. pyogenes и A. viridans по сравнению с микрофлорой верхних дыхательных путей больных гриппом без осложнений.

3. Микрофлора верхних дыхательных путей больных сезонным гриппом, по сравнению с микрофлорой верхних дыхательных путей здоровых людей, характеризовалась высокой распространенностью гемолитической активности (51,1 ±2,1 % против 43,9 ± 2,6 %; р<0,05) и антили-зоцимной активности (65,4 ± 4,1 % против 32,8 ± 2,3 %; р<0,05).

4. Микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v представлена преимущественно стрептококками, с преобладанием S. mitis, S. bovis, S. agalactiae, S. anginosus. Из стафилококков выделялся S. aureus, но в 6 раз реже, чем при сезонном гриппе. Отмечено преобладание экспрессии факторов патогенности у S. pyogenes и S. agalactiae по сравнению с сезонным гриппом: гемолитической и антилизоцимной активностей. Различий в распространенности лецитови-теллазной и лизоцимной активностей в сравниваемых группах отмечено не было.

5. В микросимбиоценозе верхних дыхательных путей при гриппе выявлены взаимодействия в ассоциациях S. aureus, S. pyogenes и других условно-патогенных микроорганизмов. У здоровых людей микрофлора верхних дыхательных путей представлена ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов в которых S. aureus и S. pyogenes не встречались.

6. Микроорганизмы в ассоциациях при гриппе усиливали гемолитическую и антилизоцимную активность симбионтов, что способствовало развитию бактериальных осложнений.

7. Разработана модель вирусо-бактериальной ассоциации на куль-тутре клеток MDCK для оценки модификации факторов патогенности симбионтов. В культуре клеток MDCK выявлено усиление роста, экспрессии ГА и АЛА у S. aureus в присутствии вируса гриппа. Выявленная закономерность изменения гемолитической и антилизоцимной активности у S. aureus после соинкубирования с вирусом гриппа позволяет прогнозировать бактериальное осложнение гриппа.

8. В вирусо-бактериальной ассоциации под действием S. aureus наблюдалось усиление гемагглютинирующей способности и цитопатиче-ского действия вируса гриппа. В присутствии S. aureus потенцировалась жизнеспособность вируса гриппа, что проявлялось более ранней регистрацией циклов амплификации вирусной РНК в ПЦР при режиме реального времени. Вирусо-бактериальные взаимодействия являются важным звеном патогенеза гриппозной инфекции и могут быть использованы для прогноза его течения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Усвяцов Б.Я., Паньков A.C., Бухарин О.В. Механизмы взаимодействия ассоциативных симбионтов при вирусо-бактериальных инфекциях // Жури, микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2009. № 2. С. 1 IT-HI.

2. Паньков A.C., Скачков М.В., Усвяцов Б.Я., Лискова Е.В. Микрофлора дыхательных путей при гриппе, острых респираторных заболеваниях и их осложнениях // Эпидемиология и инфекционные болезни, 2011. № 2. С. 42-45.

3. Бухарин О.В., Паньков A.C., Усвяцов Б.Я., Скачков М.В. Характеристика бактериальных ассоциаций в микросимбиоценозе верхних дыхательных путей больных гриппом // Эпидемиология и вакцинопрофи-лактика, 2010. №6. С. 12-17.

4. Бухарин О.В., Паньков A.C., Усвяцов Б.Я., Скворцов В.О. Модификация свойств вируса гриппа и Staphylococcus aureus в условиях ассоциации // Эпидемиология и вакциноирофилактика, 2011. № 3. С.24-28.

5. Паньков A.C. Особенности микробиоцеиоза дыхательных путей у людей больных гриппом АЮренбург/4/2009 (HINI)v // Уральский медицинский журнал, 2011. № 2. С. 92-95.

6. Паньков A.C. Особенности межбактериальных взаимодействий

при гриппе // Известия Оренбургского аграрного университета, 2011. № 2. С. 278-281.

7. Паньков А.С. Микросимбиоценоз верхних дыхательных путей при бактериальных осложнениях гриппа // Медицинский альманах, 2011. №4. С. 112-114.

8. Паньков А.С. Усиление экспрессии факторов патогенности и персистенции микроорганизмов, выделенных от больных гриппом, в условиях межбактериальных взаимодействий // Эпидемиология и вакцино-профилактика, 2012. № 3. С. 36-41.

9. Паньков А.С. Бактериальные осложнения гриппа и их прогнозирование // Известия Самарского научного центра РАН, 2012. № 5. С. 490-493.

10. Паньков А.С. Характер межмикробных взаимодействий при гриппе// Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2012. № 5. С. 44-49.

11. Паньков А.С. Прогнозирование постгриппозных осложнений с учетом вирусно-бактериальных ассоциаций // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2012. № 6. С. 21-25.

Публикации в других изданиях

12. Паньков А.С. Микрофлора верхних дыхательных путей у больных фиппом, осложненным бронхитом или пневмонией // Вестник ОГУ,2011.№З.С. 82-85.

13. Паньков А.С. Особенности микрофлоры при гриппе и ОРЗ // Известия ОГАУ, 2011. № 3. С. 313-314.

14. Паньков А.С. Состояние микрофлоры верхних дыхательных путей у больных гриппом // Инфекционные болезни, 2009. Том 7. № 1. С. 163.

15. Паньков А.С. Микросимбиоценоз слизистой оболочки носа при гриппе // Инфекционные болезни, 2010. Том 8. № 2. С. 528.

16. Паньков А.С. Микрофлора носа и миндалин при гриппе // Вестник РГМУ, 2010. № 2. С. 529.

17. Паньков А.С. Характеристика бактериальных ассоциаций при гриппе // Вестник РГМУ, 2010. № 2. С. 528.

18. Паньков А.С. Межбактериальные взаимодействия при гриппе // Инфекционные болезни, 20! 1. Том 9. № 1. С. 285.

19. Паньков А.С. Модификация факторов патогенности в вирусо-бактериальной ассоциации // Materialy VIII mezindrodni vgdecko - prakticka conference «Dny vgdy-2012». Dil 70. LekaFstvi. Ekologie: Praha, 2012. C.7-10.

20. Паньков A.C., Скачков М.В., Усвяцов Б.Я., Лискова Е.В. Особенности клинического течения гриппа А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v по материалам ММУЗ МГКИБ г. Оренбурга // Информационный архив, 2010 Том 4. № 2. С. 147-148.

21. Паньков A.C., Скачков М.В., Усвяцов Б.Я. Прогнозирование бактериальных осложнений стафилококковой этиологии при гриппе // Информационно-методическое письмо. Министерство Здравоохранения Оренбургской области, 2011. 26 с.

Патенты на изобретение 22. Бухарин О.В., Паньков A.C., Усвяцов Б.Я., Скворцов В.О. Способ прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа. Патент РФ на изобретение № 2452960 от 10.06.2012 г.

Список использованных сокращений

АЕ - агглютинирующая единица;

АЛА - антилизоцимная активность;

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;

ГА — гемолитическая активность

ГгА - гемагглютинирующая активность;

ЛА - лизоцимная активность;

ЛецА - лецитовителлазная активность;

ПМО - показатель микробной обсемененности;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

упм. - условно-патогенный микроорганизм;

пм. - патогенный микроорганизм;

ЦПД - цитопатическое действие;

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (ростовая среда для культуры клеток);

MDCK - Madin Darby Canine Kidney (культура клеток для роста вируса гриппа).

ПАНЬКОВ Александр Сергеевич

МИКРОБИОЦЕНОЗ ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И МЕЖМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ГРИППЕ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук.

Подписано в печать 20.12.2012 г. Формат 64><84 1/16. Печать офсетная. Усл. печ. листов - 2,0. Тираж 100 экз.

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Office Word 2003 for Windows. Гарнитура Times New Roman.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора медицинских наук, Паньков, Александр Сергеевич, Оренбург

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

05201350905

ПАНЬКОВ Александр Сергеевич

МИКРОБИОЦЕНОЗ ДЫХАТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И МЕЖМИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРИ ГРИППЕ

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Б.Я. Усвяцов

Оренбург - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................5

Глава 1. Состояние микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе и механизмы взаимодействия микросимбионтов при вирусобактериальных

инфекциях (обзор литературы).........................................................11

Глава 2. Материалы и методы.........................................................55

2.1. Общая характеристика и методы обследования больных гриппом.....................................................................................55

2.2. Изучение бактериальной микрофлоры.................................56

2.2.1. Выделение и характеристика бактериальной микрофлоры.....56

2.2.2. Методы изучения факторов патогенности и персистенции, чувствительности к антибиотикам.....................................................58

2.2.3. Методика изучения факторов патогенности и персистенции в условиях межбактериальных взаимодействий....................................60

2.3. Методика изучения модификации свойств микроорганизмов в вирусо-бактериальных ассоциациях................................................61

2.4. Статистическая обработка результатов................................64

Глава 3. Состояние микрофлоры верхних дыхательных путей у больных сезонным гриппом в острый период заболевания (таксономия, распространенность, биологические свойства)..................................66

3.1. Состояние микрофлоры носа в норме и при гриппе...............66

3.2. Состояние микрофлоры миндалин в норме и при гриппе.........73

3.3. Характеристика факторов патогенности микрофлоры в изучаемых биотопах...........................................................................................82

3.4. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных сезонным гриппом

и здоровых людей.......................................................................87

Глава 4. Особенности микрофлоры верхних дыхательных путей у людей больных гриппом АЮренбург/4/2009 (НШ1)у.................................90

У

4.1. Состояние микрофлоры при гриппе АЮренбург/4/2009 (HlNl)v.....................................................................................90

4.2.Характеристика факторов патогенности микроорганизмов при гриппе А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v...............................................102

4.3. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом

А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v...........................................................108

Глава 5. Состояние микрофлоры верхних дыхательных путей при бактериальных осложнениях гриппа.........................................................111

5.1. Состояние микрофлоры носа при гриппе с бактериальными осложнения и без бактериальных осложнений.....................................112

5.2. Состояние микрофлоры миндалин при гриппе с бактериальными осложнения и без бактериальных осложнений...............................116

5.3. Характеристика факторов патогенности у микроорганизмов, выделенных от больных гриппом с бактериальными осложнениями и без бактериальных осложнений.............................................................121

5.4. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом с осложнениями и без осложнений...........................................................123

5.5. Сравнительная характеристика микрофлоры верхних дыхательных путей у больных гриппом, осложненным бронхитом и пневмонией.. 125 Глава 6. Микросимбиоценоз верхних дыхательных путей больных гриппом..........................................................................................134

6.1 Характеристика бактериальных ассоциаций в микросимбиоцено-зе верхних дыхательных путей больных гриппом...............................134

6.2. Общность и сопряженность связей бактериальных ассоциациий в микросимбиоценозе верхних дыхательных путей больных гриппом... 138 Глава 7. Модификация факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях бактериальной ассоциации.................................150

7.1. Модификация факторов патогенности и персистенции микроорганизмов в условиях бактериальной ассоциации...............................150

7.2. Модификация факторов патогенности и персистенции микроорганизмов на примере информативных пар-ассоциантов микросимбиоценозов

верхних дыхательных путей больных гриппом и здоровых людей.........159

Глава 8. Модификация свойств вируса гриппа и Staphylococcus aureus в условиях ассоциации...............................................................164

8.1. Модификация свойств S. aureus в условиях ассоциации с вирусом гриппа...........................................................................164

8.2. Модификация свойств вируса гриппа в условиях ассоциации с

S. aureus.................................................................................170

Глава 9. Прогнозирование бактериальных осложнений при гриппе с учётом

вирусо-бактериальных взаимодействий..........................................174

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................197

ВЫВОДЫ.................................................................................205

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................208

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................................241

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Проблема гриппа - одна из актуальных научных проблем последнего столетия. Многоликость и непредсказуемость этой инфекции связана с множеством подтипов основного возбудителя - вируса гриппа А и его чрезвычайной изменчивостью (Киселев О.И. Цыбалова JI.M.,2005). Трудности в борьбе с гриппозной инфекцией обусловлены многими факторами, прежде всего неполной картиной патогенеза и выраженными микробиологическими нарушениями на слизистых оболочках верхних дыхательных путей, которые ухудшают развитие заболевания и приводят к возникновению бактериальных осложнений (Whitley R.J. et al., 2006).

Роль микрофлоры дыхательных путей в развитии бактериальных осложнений очевидна, хотя и не совсем ясна. Изучению микробной экологии дыхательных путей в последние годы уделяли достаточно большое внимание (Сологуб Т.В., Ледванов М.Ю., Малый В.П. и соавт., 2009). К сожалению, в большинстве публикаций нет четких указаний, какие отделы дыхательного тракта подвергались исследованию (Ермолина Г.Б., 2003). Немногочисленные публикации последних лет описывают состояние микробиоценоза верхних дыхательных путей при острых и хронических бактериальных процессах, а изменения микрофлоры респираторного тракта при гриппе подробно не рассматривалось (Миронов А.Ю. и соавт., 2000; Вавилова В.П. и соавт., 2002).

Формирование инфекционного процесса зависит не только от взаимо»

действия возбудителя заболевания с макроорганизмом, но и от особенностей симбиоза бактерий и вирусов, обитающих в нем (Medzhitov R., Janeway С., 2000). Большинство исследователей считают, что вирусо-бактериальные инфекции протекают значительно тяжелее, чем вирусные или бактериальные (Adam Н., 2007).

Частое сочетанное течение вирусных и бактериальных инфекций создает большие трудности в оценке роли микробных ассоциаций при инфекционном процессе. При гриппе эта проблема стоит остро, так как основную

группу осложнений составляют бактериальные инфекции (МсCullers J.А., 2003). Малоизученными остаются межбактериальные и особенно вирусо-бактериальные взаимодействия, открывающие одну из сторон возникновения бактериальных осложнений при гриппе.

В литературе нет единого представления о механизмах влияния бактерий на вирусы и вирусов на бактерии. Есть лишь единичные работы, которые касаются выделения ассоциаций вирусов и бактерий из того или иного биотопа (Набока Ю.Л., 2006, Колобухина Л.В., 2001).

В связи с этим особое значение приобретает изучение межмикробных взаимодействий при гриппе, которое позволит раскрыть определенные звенья механизма развития бактериальных осложнений и разработать методы их прогнозирования.

Указанный комплекс нерешенных проблем определяет актуальность проведенных исследований.

Цель работы: изучить изменения микрофлоры дыхательных путей при гриппе с учетом межмикробных взаимодействий для прогнозирования течения заболевания и развития бактериальных осложнений.

Задачи исследования:

1. Оценить количественные и качественные изменения бактериальной микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе.

2. Выявить особенности межбактериальных взаимодействий в условиях ассоциаций микробиоценоза верхних дыхательных путей при гриппе.

3. Изучить особенности вирусо-бактериальных взаимодействий в условиях ассоциации.

4. Определить роль межмикробных взаимодействий в патогенезе бактериальных осложнений при гриппе.

5. Разработать способ прогнозирования бактериальных осложнений с учетом особенностей межмикробных взаимодействий в биоценозе верхних дыхательных путей.

Научная новизна. Проведено комплексное изучение микросимбиоце-ноза верхних дыхательных путей с учетом экспрессии факторов патогенно-сти и персистенции. Выявлен высокий патогенный и персистентный потенциал микроорганизмов, выделенных со слизистых оболочек верхних дыхательных путей больных гриппом.

Выявлено, что микросимбиоценоз верхних дыхательных путей при гриппе характеризуется более сложной популяционной структурой и менее сопряженными связями в ассоциациях, чем микросимбиоценоз верхних дыхательных путей здоровых людей.

Показаны различия в таксономическом составе и экспрессии факторов патогенности микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе А/Оренбург/4/2009 (HlNl)v и сезонном гриппе.

Анализ результатов исследования микросимбиоценоза верхних дыхательных путей выявил особенности межбактериальных взаимодействий при гриппе. Микроорганизмы, выделенные со слизистых оболочек верхних дыхательных путей от больных гриппом реже образовывали ассоциации, чем микроорганизмы, выделенные из биоценоза верхних дыхательных путей здоровых людей. У больных с бактериальными осложнениями микроорганизмы верхних дыхательных путей чаще формировали ассоциации, чем микрофлора верхних дыхательных путей при гриппе без осложнений. Выявлена модификация свойств выделенных микроорганизмов в условиях бактериальной ассоциации. Показано, что в ассоциации микроорганизмы верхних дыхательных путей у больных гриппом активно влияют друг на друга, стимулируя факторы патогенности и персистенции.

Получены новые знания по микросимбиоценозу верхних дыхательных путей при гриппе с учетом изменения свойств симбионтов в условиях виру-со-бактериальных ассоциаций. Обнаружено взаимное влияние вируса гриппа В и Staphylococcus aureus в вирусо-бактериальной ассоциации на культуре клеток MDCK. Установлено повышение факторов патогенности как S. aureus, так и вируса гриппа в условиях вирусо-бактериальной ассоцияции.

Проведенные исследования позволили подобрать методический ключ к изучению модификации свойств бактерий и вирусов на модели вирусо-бактериальной ассоциации и рассматривать патогенез гриппа, учитывая роль симбиоза вирусов и бактерий в реализации механизмов постгриппозных ос-

4

ложнений.

Разработан способ прогнозирования бактериального осложнения после гриппа (Патент РФ № 2452960).

Практическая значимость работы

Впервые с микробиологических позиций расширено представление о течении гриппа и механизме развития бактериальных осложнений после гриппа.

Получен патент РФ на изобретение № 2452960 «Способ прогнозирования развития бактериального осложнения стафилококковой этиологии после гриппа».

Практическая ценность работы заключается в обосновании целесообразности использования полученных данных о микросимбиоценозе верхних дыхательных путей с учетом особенностей межмикробных взаимодействий при гриппе для прогнозирования бактериальных осложнений, что позволит уменьшить их количество и длительность течения заболевания.

Внедрение результатов исследования в практику

По результатам исследования разработано информационно-методическое письмо «Прогнозирование бактериальных осложнений стафилококковой этиологии при гриппе» (Министерство здравоохранения Оренбургской области, 4.07.2011), которое распространено по территории Оренбургской области. Предложенные в нем практические рекомендации используются в работе врачей МБУЗ «ГКИБ» г. Оренбурга (акт внедрения от 20.08.2012 г.) и вирусологической лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области" (акт внедрения от 20.08.2012 г.).

Результаты работы включены в программу обучения студентов Оренбургской государственной медицинской академии на кафедрах микробиоло-

гии и эпидемиологии и инфекционных болезней (акты внедрения от 27.08.2012 г.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Для гриппозной инфекции в остром периоде заболевания характерны значительные нарушения микросимбиоценоза верхних дыхательных путей, которые проявляются изменением таксономического состава микрофлоры, повышением уровня экспрессии факторов патогенности и персистенции.

2. Вирусо-бактериальные взаимоотношения при гриппе in vitro и in vivo характеризуются взаимным усилением факторов патогенности и персистенции ассоциантов, что способствует дисбиозу верхних дыхательных путей с преобладанием патогенной флоры и развитию бактериальных осложнений.

3. Усиление экспрессии факторов патогенности вируса гриппа и стафилококка в ассоциации является важным звеном патогенеза заболевания и может быть использовано для прогнозирования его течения.

Апробация работы. Основные материалы диссертационного исследования доложены на: шестой Российской научной конференции «Персистен-ция микроорганизмов», (Оренбург, 23-24 сентября 2009 г.), Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011), V Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010 г.), УШ межрегиональной научно-практической конференции эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов и паразитологов (Оренбург, 2010), в комиссии по внедрению новых достижений в практику здравоохранения при министерстве здравоохранения Оренбургской области (Оренбург, 2011 г.), УШ mezinárodni vedecko - praktická conference «Dny védy - 2012» (Praha, - 2012).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 22 печатных работах, из которых 11 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, а также 1 патент РФ на изобретение и 1 информа-

ционно-методическое письмо.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 241 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 56 рисунками. Библиографический указатель содержит 150 отечественных и 174 зарубежных источников.

Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательной учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации согласно плана НИР (№ государственной регистрации темы 0120.0 809351).

Глава 1

Состояние микрофлоры верхних дыхательных путей при гриппе и механизмы взаимодействия микросимбионтов при вирусобактериаль-

ных инфекциях (обзор литературы).

Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) относятся к наиболее распространенным болезням, которые на протяжении многих лет превосходят все другие инфекционные заболевания, вместе взятые [199]. По данным всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно ОРВИ болеет каждый третий житель планеты [54, 233].

Ведущая роль в структуре ОРВИ принадлежит гриппу [108]. В России на грипп и ОРВИ ежегодно приходится до 90% от всех регистрируемых инфекционных заболеваний. Это до 30 млн. больных, из которых 45-60% составляют дети [110].

Грипп и другие острые респираторные вирусные инфекции имеют большое социальное значение, оказывая огромный ущерб здоровью населения и экономике страны [143-145]. В России ежегодный суммарный экономический ущерб от гриппа оценивается экспертами в сумму, достигающую 40 млрд. руб. Потери государства, наносимые одним случаем респираторной инфекции, составляют от 3000 до 5000 руб. При этом ущерб для каждого заболевшего, включающий стоимость базового набора медикаментов, может колебаться в пределах 450-3000 руб. [120].

Грипп среди ОРВИ протекает наиболее тяжело [68]. Сезонный грипп наблюдается ежегодно и является, например, в США причиной 200000 госпитализаций и 41000 смертей [177, 303].

По данным ВОЗ, в 6% случаев грипп является причиной летальных исходов, около 60% случаев смерти связано с вирусассоциированными респираторными болезнями [129, 307]. Непосредственной причиной смерти обычно является развитие тяжелых осложнений на