Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика некоторых биологических свойств бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процесах различной локализации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика некоторых биологических свойств бактерий рода Citrobacter, выделенных при инфекционных процесах различной локализации"

Р Г Б ОД 1 О ФЕВ 1998

На правах рукописи

Туйгунов Марсель Маратович,

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ ПРОЦЕССАХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ

03.00.07.-микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

УФА-1998

Работа выполнена на кафедре микробиологии Башкирского Государственного медицинского университета.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Габидуллин З.Г.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Зурочка A.B. доктор медицинских наук Михайлова H.A.

Ведущее учреждение - Самарский Государственный

медицинский университет

Защита диссертации состоится Л? 1998г.

В^часов на заседании диссертационного совета К08 4 .71.01. При Уфимском НИИБС им.И.И.Мечникова, НПО «Иммунопрепарат» по адресу: 450024, г.Уфа, ул.Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского НИИВС им. И.И.Мечникова.

Автореферат разослан _1998г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета К 084.71_ЛЦ кандидат медицинских наук

.¿■¿-С-^В.П. Головин.

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В последние годы в связи с неблагоприятной экологической ситуацией и не всегда рациональным применением антибактериальных препаратов возникли серьезные проблемы, связанные с изменением этиологической структуры инфекционных заболеваний с четким обозначением тенденций повышения удельного веса условно-патогенных микроорганизмов.

В настоящее время, одной из основных проблем практического здравоохранения является решение вопросов профилактики, диагностики и лечения заболеваний, вызванных грамотрицательными условно-патогенными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae, к которым относятся и бактерии рода Citrobacter.

Представители рода Citrobacter широко распространены в окружающей среде [Бондаренко В.М. и соавт. (1987)]. Некоторые исследователи относят их к естественным обитателям кишечника, т.к. часто обнаруживаются у практически здоровых людей [Muller Н.Е.(1986)/Соколова К.Я. соавт (1988)].

Тем не менее, в последние годы участились сообщения, где авторы не сомневаются в возможности развития гнойно-воспалительных, урологических и кишечных инфекций, вызванных исключительно бактериями рода Citrobacter и особенно C.freundii О-антигеннесущими серотипами (022, 03, 04, 08, 05, Об, 09, 010, 023, 024, 029, 030)[Tschape Н. (1995), Kocharova N.A.(1996)].

Однако, дифференцировка патогенных и непатогенных представителей этого рода не проводится, что делает невозможным четкий контроль за циркуляцией возможных этиологических агентов и проведение противоэпидемических мероприятий. В этой связи разработка критериев отнесения выделенных культур Citrobacter spp. к этиологическим, значимым, в особенности при инфекционных процессах различной локализации, представляется актуальной.

Исходя из этого целью настоящего исследования явилось изучение морфологии и биологических свойств клинических штаммов Citrobacter spp., изолированных при инфекционных процессах различной локализации.

При этом планировалось решение следующих задач:

1.Установить частоту встречаемости Citrobacter spp. при кишечных, гнойно-воспалительных и урологических инфекциях и изучить их культуральные и морфологические свойства с использованием электронного микроскопа.

2.Определить адгезивную, гемолитические (а~, тиолза-висимый и энтерогемолизин), лецитиназную, ДНК-азную активности, персистирующие свойства Citrobacter spp.

3. Дать характеристику патогенных свойств клинических штаммов Citrobacter spp. на различных биологических моделях экспериментальной инфекции.

4. Выяснить природу генетического детерминанта, контролирующих адгезивную, гемолитическую, LT, ST - энтеро-токсигенную активности.

5. Определить спектр лекарственной устойчивости клинических штаммов Citrobacter spp.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые с помощью электронного микроскопирования описаны морфологические особенности Citrobacter spp. и изучены взаимоотношения бактериальных клеток Citrobacter spp. в колониях. При этом, выявлено два типа контактов: плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран. У штаммов обладающих высокой адгезивной активностью обнаружены реснички по периметру клеток.

У клинических штаммов Citrobacter spp. обнаружена способность к синтезу холероподобного термолабильного и термостабильного энтеротоксинов.

Получены новые сведения о серологической пейзаже Citrobacter spp., в зависимости от источника выделения культур.

Впервые получены данные об адгезивной, гемолитической, антилизоцимной и антиинтерфероновой, лецитиназной, ДНК-азной активности Citrobacter spp.

Впервые у части штаммов, выделенных при кишечных инфекциях, обнаружена способность к синтезу гемолизина нового типа - энтерогемолизина, формирующего на кровяном агаре с 5% дефибринированной кровью барана зоны двойного лизиса и вызывающего накопление гемморагической жидкости в петле тонкого кишечника кролика. Показан широкий спектр антибиотикоустойчивости у клинических штаммов Citrobacter spp.

Результаты исследований представлены в виде 2 заявок на патент, на один из них (№95121309/13) получено положительное решение Роспатента от 17.01.97г., в виде 1 рационализаторского предложения и отражены в б публикациях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Показано, что клинические штаммы Citrobacter spp. обладают рядом факторов патогенности, которые могут быть использованы в качестве критериев отнесения их к этиологическим.

Среди клинических штаммов Citrobacter spp. выделен штамм Citrobacter diversus №244, обладающий комплексом факторов патогенности и депонирован в коллекции живых культур в ГИСК им. JI.A. Тарасевича, которого можно использовать в качестве эталона, при изучении биологических свойств бактерий рода Citrobacter.

В процессе выполнения диссертационной работы разработана консервирующая питательная среда «БАГЕ-1» (Рац. предложение БГМУ №1796 от 25 июня 199*7 года), которая используется в учебном процессе кафедры микробиологии Баш-госмедуниверситета.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы работы представлялись на научных конференциях Башкирского медицинского института (199б-1997г.г.)

В журнале «Здравоохранение Башкортостана» 1997г.

В научно-практической конференции «Проблемы теоретической медицины» поев, к 65-летию БГМУ, 1997г.

Республиканский научно-практической конференции «Новые технологии в педиатрии и детской хирургии» поев, к 25-летию ДРКБ.

Работа апробирована на совместном заседании кафедры микробиологии, ЦНИЛа и сотрудников НПО "Иммунолрепарат" в 1997 г.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Частота встречаемости Citrobacter spp. при инфекционных процессах различной локализации.

2. Культурально-морфологические особенности клинических штаммов Citrobacter spp., изолированных при инфекционных процессах различной локализации.

3. Характеристика токсигенности и вирулентности Citrobacter spp., изученных на различных биологических моделях экспериментальной инфекции.

4. Молекулярный зонд в опытах ДНК-ДНК гибридизации для выявления ST-энтеротоксигенных штаммов Citrobacter.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, который включает 197 источников (62 отечественных и 135 зарубежных авторов) и приложения, изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц, 17 рисунков и 5 диаграмм.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ

В работе были использованы 97 клинических штаммов Citrobacter spp., среди которых 63,17% составляли штаммы, выделенные от больных с кишечными инфекциями, 23,46% -гнойно-воспалительными и 11,89% - урологическими заболеваниями. В качестве эталонных культур использовали штаммы С. diversus №244 депонированный нами в ГИСК им. JI.A. Та-расевича (Полож. решение Роспатента 95121309/13 от 17.01.97г.), С.diversus №946 и C.freundii №1486 любезно предоставленные нам профессором В.М. Бондаренко (НИИ им. Н.Ф. Гамалея).

Из 97 выделенных и 3 эталонных штаммов при первичном посеве на поверхность плотной питательной среды 86 давали характерный рост в виде изолированных колоний. На среде Эндо лактозоположительные варианты Citrobacter spp. образовали колонии, окрашенные в розовый или красный цвет, у лактозоотрицательных вариантов колонии были бесцветными или серовато-розовым оттенком. На висмут-сульфит агаре давали обильный рост, образуя светло-зеленые, коричневые или черные колонии без окрашивания участка среды под колонией .

На жидких питательных средах давали помутнение с образованием через 2 суток слабого осадка на дне пробирки, а также нежной пленки на поверхности среды. При бактериоскопии в раздавленной и висячих каплях бактериальные клетки обладали поступательным и маятникообразным движением. При посеве на полужидкий агар диффундировали среду через 12-24 часов при температуре 37°С. На окрашенных по Граму препаратах бактериальные клетки представляли собой мелкие грамотрицательные палочки. Изучение ультраструктуры на электронном микроскопе показало, что бактериальные клетки представляли собой палочки длиной 1,5-4,0 мк и 0,5-0,7 мк в поперечнике с перитрихиальными расположении ми жгутиками. Следует отметить, что выращенные на богаты питательных средах популяции обычно были однородными по формам и размерам и отмечали лишь возрастные различия. Тогда как клетки выращенные на бедных полусинтетических

средах обладали выраженным полиморфизмом. Среднее число жгутиков колебалось от 8 до 60-70. При этом надо отметить, что клетки одних и тех же штаммов имели разное количество жгутиков и на количество жгутиков определенное влияние оказывали используемые в приготовлении препарата вещества.

Исследования структуры колонии Citrobacter spp. показали, что между бактериальными клетками внутри колоний существуют контакты двух типов: плотное слипание клеток между собой и образование внутрицитоплазматических мостиков (перемычек) между клетками, образованных наружной мембраной клеточных стенок. Контакты между клетками в бактериальных колониях позволяют им образовывать трехмерные структуры и обеспечивают прочные пространственные связи между собой.

Электронно-микроскопическое изучение морфологии и ультраструктуры проводили на базе лаборатории физических методов исследования НПО «Иммунопрепарат» зав. лаб. снс. к.б.н. И.Б.Ишкильдин.

При определении групповой, родовой и видовой принадлежности учитывали ферментативные свойства. По биохимическим признакам все использованные штаммы были типичными для рода Citrobacter spp. и 76 культур были отнесены к С. freundii, 17 - к C.diversus и 7 - к C.amalonaticus.

Все штаммы, выделенные при кишечных инфекциях, расщепляли лактозу, сахарозу, а выделенные при урологических заболеваниях - обладали уреазной активностью.

По типу питания из 100 клинических штаммов Citrobacter spp. 69 оказались прототрофами, а 31 ауксотрофами, среди которых С.freundii составлял 34,4%, 14,2% и 33,3% C.diversus и С.amalanaticus, соответственно.

Ауксотрофность, при этом проявляли не к определенной аминокислоте или витамину, а к нескольким. При этом, все ауксотрофные штаммы нуждались в лейцине, большая потребность отмечалась к витамину В5 (никотиновая кислота) 91,6% и Вп - 66,7%.

Большинство ауксотрофов оказались авирулентными и неспособными вырабатывать токсические вещества, кроме штамма C.diversus (№719), который обладал способностью продуцировать высокоактивный LT- энтеротоксин и множественной лекарственной устойчивостью.

Серотипирование штаммов Citrobacter spp. проводили с поливалентными и типовыми О - сыворотками. Было типирова-но 87 штаммов Citrobacter spp. Наибольшее количество штаммов, циркулирующих в регионе относились к серогруппам

22 - (15 шт.), ЗаЗвЗс (8шт.), по 5 штаммов 1а1в1с, 2а1в, 4а4в, 8а8в, 7а7вЗв1с, 21а21в серогруппам. При кишечных инфекциях преимущественно выделялись штаммы, относящиеся к 22 серогруппе, при инфекциях мочевыводящих путей к ЗаЗвЗс серогруппе, что указывало на эпидемиологическую и этиологическую значимость определенных серогрупп в развитии кишечных и урологических инфекций.

В последние годы отмечено увеличение удельного веса антибиотикорезистентных штаммов бактерий Citrobacter spp. [Jones G.M. et al.1994]. В этой связи нами была изучена антибиотикоустойчивость клинических штаммов Citrobacter spp., изолированных при инфекционных процессах различной локализации.

Результаты проведенных исследований показали, что все выделенные штаммы Citrobacter spp. оказались устойчивыми к ристомицину, ампициллину, оксациллину, олеандомицину и фузидину, 96,6% культуры были чувствительными к клофара-ну, 92,4% - к таревиду, сизомицину, 90,3% - к сумамеду, цефалотину, 86,1% - к мономицину и полимиксину, 63,9%- к небцину, лизолину, мандолу, 51,7% к гентамицину, канами-цину и 47,3% - к стрептомицину, левомицетину и эритромицину .

В доступной нам литературе мы не встречали данных о механизме развития резистентности Citrobacter spp. к широко применяемым в практике антибиотикам. Исходя из этоп нами было проведено изучение природы генетического детер минанта антибиотикорезистентности клинических штаммов Citrobacter spp., изолированных при различных инфекционных процессах. При этом была выявлена возможность конью-гативной передачи между штаммами Citrobacter spp. устойчивости к стрептомицину и частота передачи составила 5*10~7-5•10~8. Частота коньюгативной передачи от C.freun-dii к E.coli Ki2(Sms, Rif®) была относительно невысокой и колебалась в переделах 5• 10"8-5• 10"9, что указывало на возможность существования R-плазмид, контролирующий устойчивость к стрептомицину среди клинических штаммов Citrobacter spp.

По мнению многих исследователей адгезивность являет важным фактором в начальном этапе развития инфекционногс процесса и определяет этиотропность возбудителей к чувс вительным клеткам и тканям организма. Для выявления адг! зинов бактериальных клеток широко используют реакцию ге магглютинации с эритроцитами различных видов животных и птиц. Исходя из этого, нами был проведен поиск клеток-мишеней для изучена адгезивной активности штаммов Citro

bacter spp.

При этом среди 100 изученных штаммов Citrobacter spp. 41 давали MS, и у 29 MR реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка. Среди штаммов способных давать MR реакции гемагглютинации 44,8% проявляли высокую, 27,5% -среднюю, 20,6% - умеренную и 6,8% слабую адгезивную активности. Необходимо отметить, что штаммы обладающие высокой и средней адгезивной активностями были выделены 52%, 36% и 12% при кишечных инфекциях, урологических и гнойно - воспалительных заболеваниях, соответственно.

Одновременно, нами была изучена адгезивная активность штаммов Citrobacter spp. в опытах на формалинизированных эритроцитах 1(0) группы крови человека, при микроскопическом учете результатов в соответствии с методом, описанным Бриллисом В.И. и соавторов (1986).

Результаты этих исследований показали, что из всех изученных культур 7 штаммов проявляли высокий уровень среднего показателя адгезии (СПА)(Рис. 4), 13. - средней (Рис.5), 14 и 62 слабой и отрицательной активности, соответственно (Рис.6). При этом нужно отметить, что все штаммы имеющие высокий СПА в реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка давали положительную Д- маннозсре-зистентную реакцию гемагглютинации.

Для выявления роли отдельных структурных элементов или органелл в адгезивной активности, нами было проведено электронно-микроскопическое исследование бактериальных клеток штаммов Citrobacter spp., дающих резко положительную реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка. При этом, у штаммов Citrobacter spp., дающих положительную MR и MS реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка обнаружены наличие ресничек длиной от 110 до 420 нм и шириной от 5,0 до 5,4 нм. Тогда как, клетки не дающие феномен реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не имели ресничек или имели их в небольшом количестве. По нашим предположениям, наличие таких ресничек, видимо, определяет способность возбудителя адгезии к чувствительным клеткам, однако, адгезивная активность возможно зависит и от других структур бактериальной клетки, выяснение которых требует дальнейших исследований.

Клетками-мишенями для определения адгезивной активности в реакции гемагглютинации наиболее приемлемыми оказались эритроциты цыпленка.

Многие исследователи[Welch R.A. et. al., 1987] считают, что гемолитические активности могут быть основными факторами патогенности энтеробактерий и использованы в

качестве маркера этиологической значимости возбудителя. Исходя из этого, мы исследовали наличие у клинических штаммов Citrobacter spp. ^-гемолитическую, тиолзависимой гемолитической и энтерогемолитической активности.

Из 100 изученных штаммов Citrobacter spp. 10 обладала ^-гемолитической активностью, среди которых 7 по биохимическим свойствам принадлежали к C.freundii, 2 - c.diver-sus и 1 - С. amalonaticus. При этом, из них 4 проявляли высокий уровень «-гемолитической активности, 4 - средний и 2 - слабой активности. Способностью синтезировать тиол-зависимый гемолизин обладали 63 штамма Citrobacter spp., среди которых 48 по биохимическим свойствам принадлежал i С. freundii, 12 - C.divexsus и 3 - С.amalonaticus и согласуются с данными некоторых исследователей[Якушенко О.С. 1989].

Мы не нашли, в доступной нам литературе, данные пока зывающие о способности бактерий рода Citrobacter продуци ровать энтерогемолизин. Исходя, из этого мы на среде Blood agar (Difco и Oxoid)содержащий 5% дефибринированно крови барана, 10 М хлористого кальция и в изолированной петле тонкого кишечника кролика изучали энтерогемолитиче скую активность культур Citrobacter spp. Результаты изучения 100 клинических штаммов показали, что 13 обладали энтерогемолитической активностью, среди которых 6 штаммо проявили высокую активность (в разведении 1:80), 3 -среднюю (1:40) и 4 штамма проявили слабую активность (1:10). При этом 12 штаммов были изолированы при кишечнь инфекциях и 1 при урологических заболеваниях. Исследования энтерогемолизина на биологической модели описано ниже .

Анализ корреляции гемолитических активностей и виру лентности показало, что наиболее вирулентными при интра-назальном заражении белых мышей и в протистоцидном тесте являются штаммы обладающие способностью одновременно пр< дуцировать а-гемолизин и энтерогемолизин. Кроме того, среди штаммов продуцирующих одновременно гемолизины дву; типов преобладали культуры, выделенные при кишечных инфекциях, тогда как штаммы, выделенные при гнойно-воспал тельных и урологических заболеваниях чаще всего продуци ровали о- и тиолзависимый гемолизины.

Таким образом, результаты исследований показывают, что гемолизины различных типов в определенной степени м гут быть использованы в качестве маркера этиологической значимости культур Citrobacter spp., выделенных при ки-

шечных, урологических и гнойно-воспалительных инфекциях.

Ряд исследователей к важным факторам патогенности относят лецитиназную, протеолитическую активности и рекомендуют их использовать в бактериологических лабораториях в качестве показателей этиологической значимости бактерий .

Исходя из этого, мы сочли необходимым изучить лецитиназную активность клинических штаммов Citrobacter spp. Из 100 штаммов Citrobacter spp. у 58 была обнаружена способность продуцировать фермент лецитиназу. При этом, среди лецитиназа активных штаммов Citrobacter spp. 22,5% обладали высокой лецитиназной активностью, 41,3% и 36,2 -средней и слабой активностями, соответственно.

Так у лецитиназа активных штаммов Citrobacter spp. вирулентность на легочной модели белых мышей была выражена у 9(15,5%), из них 6 обладали высокой лецитиназной активностью. Кроме этого, 3 штамма Citrobacter spp. одновременно проявляли а- гемолитическую активность, 2 - продуцировали ST- энтеротоксин и 1 - синтезировал тиолзави-симый гемолизин. В связи с этим можно полагать, что леци-тиназная активность может быть использована в комплексе другими факторами патогенности при оценке этиологической значимости клинических штаммов Citrobacter spp.

Известно, что некоторые представители семейства Enterobacteriaceae, выделенные от больных с кишечной патологией, по сравнению с культурами изолированные из окружающей среды и от здоровых людей, обладают ДНК-азной активностью [Nassif х. 1987]. В доступной нам литературе, мы не нашли данных касающихся ДНК-азной активности бактерий рода Citrobacter. Исходя, из этого мы сочли необходимым изучить ДНК-азную активность клинических штаммов Citrobacter spp. Результаты исследования показали наличие у 24(31,5%) штаммов C.freundii, 8 (47,05%) - C.diversus и 2(28,5%) - С.amalonaticus ДНК-азной активности. При этом 7 штаммы при интраназальном заражении мышей вызывали болезненное состояние у лабораторных животных и по серологическим свойствам 3 штамма принадлежали к 22 серогруппе, 2 - к 4а4в, и по одной к 1а1в1с и 8а8с серогруппе. Из 13 штаммов, обладающих высокой ДНК-азной активностью, 11 штаммов были выделены при кишечных инфекциях (9 случаев дисбактериоза кишечника) и 2 штамма при гнойно - воспалительных процессах. Таким образом, ДНК-азная активность штаммов Citrobacter spp., в той или иной степени, может

служить маркером патогенности у штаммов выделенные при кишечных инфекциях и гнойно-воспалительных процессах.

В целях самосохранения от бактерицидных факторов макроорганизма, микробная клетка располагает средствами направленные на инактивацию механизмов иммунитета. К таким свойствам по мнению Бухарина О.В. с соавт. (1982) относятся антилизоцимная и антиинтерфероновая активности микроорганизмов .

В связи с этим мы сочли необходимым изучить у 100 клинических штаммов Citrobacter spp. АЛА и АИА. При этом у 35 штаммов было выявлено АЛА, среди которых по биохимическим свойствам 28(36,8%) принадлежали к C.freundii, 5 (29,4%) - к C.diversus и 2 (28,6%) - к С.amalonaticus. Тогда как, АИА обладали 65 штаммов Citrobacter spp., среди которых 53 (69,8%) по биохимическим свойствам принадлежали к C.freundii , 10 (58,9%) - к С. diversus и 2 (28,6%) - к С.amalonaticus.

В дальнейшем, мы попытались выяснить природу генетического детерминанта контролирующего персистирующие свойства штаммов Citrobacter spp. При этом в опытах по изучению профили, элиминации, прямой коньюгативной передачи нам не удалось обнаружить роль плазмид в АЛА и АИА свойствах штаммов Citrobacter spp.

Результаты этих исследований показывают, что бактерии рода Citrobacter обладают АЛА и АИА, чего необходимо учитывать при оценке персистирующей роли возбудителя.

Если мнения многих авторов в отношении энтеротокси-генности эшерихий сходятся, то вопрос о способности Citrobacter spp. продуцировать LT и ST энтеротоксины и их роль в развитии инфекций остается недостаточно изученным.

В связи с этим, мы, используя биологические методы: "отек лап" мышей, "изолированная петля тонкого кишечника кролика" и протистоцидный тест, исследовали у Citrobacter spp. способность продуцировать LT - энтеротоксин.

Из 100 исследованных культур при введении центрифуга-та 20 часовой бульонной культуры 8 давали разницу между опытной и контрольной лапками 65 мг и более. Среди них 3 штамма оказались способными продуцировать LT - энтеротоксин высокой активности (разница составила 110 мг и более) (2 - C.diversus и 1 -С. freundii). При введении гретого при 56° С центрифугата разница между опытными и контрольными лапками была не более 35 мг, что указывало на термолабильность токсического вещества.

Результаты опытов на изолированной петле тонкого кишечника кролика показали, что при введении центрифугата

штаммов Citrobacter spp., продуцирующих LT, ST энтероток-сины, а также энтерогемолизин наблюдали накопление жидкости и соотношение объема экссудата к длине петли тонкой кишки V/L оставило 1,0 и более. При этом, в сегменты, куда вводили центрифугат штаммов, продуцирующих LT и ST -энтеротоксины наблюдали накопление серозного экссудата, а у штаммов продуцирующие энтерогемолизин наблюдали геморрагический экссудат. Далее, для дифференцирования энтеро-токсинов, вызвавшие накопление жидкости в изолированных сегментах тонкого кишечника кролика, мы центрифугаты нагревали при 56°С, 85°С, 100°С в течение 10 минут. При введении гретого (56°С) центрифугата, у штаммов, продуцирующих высокоактивный LT - энтеротоксин, соотношение V/L экссудата уменьшился в двое (до 0,8), а гретый при 85°С не вызывал накопление жидкости. Тогда как, гретый при 100°С в течение 10 минут центрифугат штаммов продуцирующие ST- энтеротоксин вызывал накопление жидкости (V/L = 1,1), а энтерсгемолизин гретый при 5б°С инактивировался и не вызывал накопление жидкости в петле тонкого кишечника кролика.

Патоморфологические исследования срезов тонкого кишечника показали, что в тканях кишечника зараженные штаммами продуцирующие энтеротоксины и энтерогемолизин наблюдается воспалительные проиессы различной степени и характера, с образованием язвенно-некротических участков в слизистой тонкой кишки и десквамацией обрывков некротических детритов в просвет кишки, с явлениями местного перитонита.

Проведенные нами исследования на различных биологических моделях экспериментальной инфекции показали, что ин-траназальное заражение, плантарный тест, петля тонкого кишечника кролика требуют значительного количества экспериментальных животных и не всегда выполнимы в условиях бактериологической лаборатории.

В связи с этим, мы использовали более простой и доступный протистоцидный тест для выявления вирулентных свойств Citrobacter spp. Использование этого метода показало, что из 100 штаммов 24 вызывали гибель инфузорий туфелек: среди которых 8 штаммов были продуцентами LT- эн-теротоксина, б - энтерогемолизина, 7 штаммов ST- энтеро-токсина и 3 - а- гемолизина.

Так, б штаммов вызывающие гибель инфузорий в течении 30-90 сек. оказались способными давать "отек лап" с разницей до 7 5 мг и более, вызывать гибель более 50% взятых

в опыт экспериментальных животных в течение 5 часов с момента интраназального заражения. Из 8 штаммов вызывающих гибель инфузорий в течение 1,5-2,5 минут 2 штамма оказались способными вызывать "отек лап" 75 мг и более, 3 штамма на мышах-сосунках давали соотношение 0,065 и более и 3 штамма оказались продуцентами а-гемолизина и вызывали гибель до 50% животных в течение 18 часов. Из 11 штаммов вызывающих гибель простейших в теч. 3,5-5,5 минут 8 обладали слабой вирулентностью, среди которых 2 штамма продуцировали ST- энтеротоксин и 1 - энтерогемолизин. Среди 76 авирулентных штаммов Citrobacter spp. ни один не вызывал гибель простейших в течение 5 минут.

Таким образом, полученные результаты исследований дают нам основание полагать, что время, в течении которого происходят гибель инфузорий - зависит от биологической активности клинических штаммов Citrobacter spp., в частности от их способности продуцировать токсические вещества типа LT, ST - энтеротоксинов, гемолизинов и других, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель интраназально зараженных животных. Кроме того, этот тест более доступен и показателен в связи с чем тест на инфузориях туфельках может быть рекомендован для выявления в условиях бактериологических лабораторий потенциально патогенных штаммов Citrobacter spp.

Наиболее перспективным представляется тестирование энтеротоксигенности при использовании полимеразной цепной реакции, к несомненным достоинствам которой следует отнести высокую специфичность при небольших затратах во времени и низкую трудоемкость на фоне отсутствия необходимости культивирования микроорганизмов, сопряжённой с угрозой элиминации генетических детерминант токсигенности.

Данный раздел выполнен на базе ОБЦ УНЦ РАН (руководитель вице президент АН РБ профессор В.А.Вахитов}.

Анализируя аминокислотные и соответствующие олигонук-леотидные последовательности банка генов ST-энтеротоксина Citrobacter spp. нами были созданы три олигонуклеотида, 2 из которых использовали в качестве праймеров в серии опытов по амплификации ДНК клинических штаммов Citrobacter spp., а третий - в качестве зонда в экспериментах по дот-блот гибридизации с ДНК указанных культур. При этом были обнаружены штаммы продуцирующие ST-энтеротоксин, которые были верифицированы на мышах-сосунках по обнаружению ST-энтеротоксинов.

Штаммы Citrobacter spp.. свежевыделенные от больных с выраженным диарейным симптомокомплексом в 100 % давали положительную реакцию с радиоактивным зондом. Среди 100 исследованных штаммов Citrobacter spp. б давали в процессе радиоавтографии положительный гибридизационный сигнал, хотя они при тестировании in vivo в соответствующих экспериментах показали себя кг:к отрицательные. Это может указывать на слабую чувствительность и специфичность биологических методов обнаружения ST- энтеротоксигенности, хотя не исключено, что гены кодирующие ST - энтеротокси-генность находятся в "отключенном" состоянии при данных условиях исследования и возможно, могут активироваться при попадании этих штаммов в благоприятные условия обитания .

Таким образом, результаты проведенных опытов дают основание полагать, что клинические штаммы Citrobacter spp. способны продуцировать ST- энтеротоксины, для расшифровки роли которых нами предложен олигонуклеотидный зонд и пара праймеров и проведенные клинические испытания позволили предложить их в качестве зонда и праймера для ПЦР, применительно для Citrobacter sp>p./заявка на изобретение №97102756 от 18.02.97г./.

Факторы патогенности бактерий рода Citrobacter только начинают исследоваться и сведения об их генетическом контроле отсутствуют. В связи с этим, в настоящее время возникает настоятельная необходимость выяснения природы генетического контроля ведущих факторов патогенности, обуславливающих адгезивность, LT, ST-энтеротоксигенности, гемолитические, лецитиназную, антилизоцимную антиинтерфе-роновую активности, позволяющие в каждом конкретном случае расшифровать этиологическую значимость возбудителя.

Для выяснения природы генетического контроля адгезивной активности нами были отобраны штаммы, выделенные при урологических и кишечных инфекциях, дающие положительные MS и MR реакции гемагглютинации, и изучали профиль их плазмидной ДНК (Kado С.Т., Liu S.T. 1981)Для этого брали 29 штаммов дающих MS и MR реакции гемагглютинации и изучали профиль их плазмидной ДНК. При этом 17 штаммов оказались бесплазмиднкми, 1 штамм имел 4 плазмиды (120МД, 60МД, 3,2МД, 1,4МД) 3 штамм - по 2 плазмиды (60МД, 1,4МД), остальные - по 1 плазмиде 3 штамма (60МД) и (1,4МД), 2 штамма - 40МД.

В качестве контроля использовали депонированный нами штамм С. diversus ГИСК №244, несущий плазмиду 40 МД., дающий положительную MS и MR реакции гемагглютинации с

эритроцитами цыпленка и с его изогенных бесплазмидных клонов

В ходе экспериментов нам не удалось установить роль плазмид в способностью культур Citrobacter spp. давать реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка. Аналогично, не было обнаружено каких-либо различий в адгезивной активности изогенных пар эталонного штамма N'24 4 С. dxversus.

Наши попытки в опытах прямой передачи плазмид между штаммами Citrobacter spp., детерминанта, контролирующего реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка не увенчались успехом. Полученные результаты дают нам основание полагать, что генетическим детерминантом, контролирующей MR и MS реакции у Citrobacter spp., возможно являются структурные элементы хромосомной природы.

Для выяснения природы генетического детерминанта, контролирующего синтез LT - энтеротоксина брали две группы штаммов и изучали профиль их плазмидной ДНК. Первую группу составляли 4 штамма суперпродуценты LT - энтеротоксина, вторую - 6 штаммов не продуцирующие LT - энте-ротоксин и вызывающие "отек лап" не более 35 мг.

Из 4 штаммов суперпродуцентов LT-энтеротоксина двое (719, 50 9,) оказались несущими плазмиду 60 МД и 1 штамм №882 - 60 и 3,2 МД и 1 штамм №968 - 60, 40, 1,4 МД. У 6 штаммов второй группы (611, 769. 795, 843, 532, 258) не было выявлено плазмиды массой 60 МД.

В дальнейшем были отобраны штаммы несущие плазмиды массой 60 МД и продуцирующие! высокоактивный LT- энтеро-токсин (882, 719, 968) . Пугегм культивирования их в бульоне Хоттингера содержащий 5% концентрации додецилсульфата натрия проводили элиминацию плазмид массой 60 МД и у клонов утративших свойство продуцировать изучили профиль плазмидной ДНК.

Из 4 0 клонов каждого штамма утративших свойство продуцировать LT- энтеротоксин у двух на фореграмме просмат ривалась плазмида массой 60 МД, остальные клоны оказалис не несущими данной плазмиды.

В дальнейшем изучали возможность комьюгативной передачи Ent плазмиды между бактериями рода Citrobacter и от Citrobacter к E.coli Kiz Gö2 Rif©. Для чего брали в качестве донора №882 C.diversus (Ent+, Str®, Mons) и реципиеь та N'901 C.freundii (Ent.~, St.rs, Mon®). Приготовили селективную среду содержащий 300 мкг/мл мономицина и стрептомицина в концентрации 500 мкг/мл. Полученные трансконью-

гаты имели плазмиду массой 60 МД и были способными давать "отек лап" 95 мг и более.

Наши попытки в прямой передачи плазмид осуществить передачу Ent плазмиды от Citrobacter к Е. coli К12 G«2 Rif® не увенчались успехом.

Таким образом, результаты наших исследований дают основание полагать, что генетическим детерминантом контролирующий у Citrobacter spp. продукцию LT - энтеротоксина видимо является коньюгативная плазмида массой 60 МД, выявляемая у ряда штаммов, вызывающие "отек лап" 95 мг и более.

Учитывая важную роль гемолизинов в патогенезе инфекционного процесса, мы попытались выяснить природу генетического детерминанта, контролирующий способность продуцировать et- гемолизин.

Исследование проводили на 10 штаммах Citrobacter, обладающих а-гемолитической активностью и 6 штаммов не способных продуцировать а- гемолизин. В качестве эталонного использовали штамм Р.vulgaris Rts-1 обладающий гемолитической активностью и несущий плазмиду с массой 120 МД.

Результаты исследований показали, что среди клонов 10 штаммов, обладающих а-гемолитической активностью, у большинства клонов 8 штаммов обнаружили плазмиду массой 120 МД, что указывало на возможную роль данной плазмиды в продукции ct-гемолизина. В дальнейшем элиминировали эти плазмиды по общепринятой методике и у клонов изучили профиль плазмидной ДНК. При этом клоны 8 штаммов потеряли свойство продуцировать а - гемолизин, а клоны культур 896 и 235 продолжали продуцировать а-гемолизин. Данные этих исследований, по нашему мнению, свидетельствуют о вероятности существования у Citrobacter генетического детерминанта иной природы, контролирующего продукцию я- гемолизина. Не исключено, что часть штаммов способны продуцировать биологически активные вещества, вызывающие гемолиз эритроцитов, ко по своей природе не относящиеся к гемолизину. Все наши попытки осуществить коньгативную передачу плазмиды массой 120 МД между бактериями рода Citrobacter и от Citrobacter к универсальному реципиенту E.coLi не увенчались успехом.

В дальнейшем с целью конкретизации роли 120 МД плазмиды в "-гемолитической активности брали изогенные пары штаммов. При этом у большинства а-гемолитически активных штаммов 724, 220, 800 (соответственно 30, 29. 32 из 50)

на фореграмме наблюдали наличие плазмиды массой 120 МД, а у мутантов 724-эЗ, 800-э1 не проявляющих гемолитической активности, не было обнаружено плазмиды массой 120 МД. Все эти данные являются дополнительным подтверждением о возможной роли плазмиды массой 120 МД в о1—гемолитической активности бактерий рода Citrobacter.

Проведенные опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и коньюгативной передачи плазмид не позволили нам выявить плазмид, контролирующих синтез тиолзависимого гемолизина, энтерогемолизина, лецитиназной и ДНК-азной активности.

Таким образом, совокупность полученных результатов позволяют сделать заключение, что из патологического материала больных с гнойно-септическими, урологическими диарейными заболеваниями наиболее часто выделяется C.freundii, реже C.diversus и C.amalonaticus. При этом, штаммы выделенные при кишечных заболеваниях по антигенной структуре принадлежали к 022 серогруппе, при урологических инфекциях - к ЗаЗвЗс. Штаммы выделенные при кишечных, урологических и гнойно-воспалительных заболеваниях обладали множественной устойчивостью, к широко применяемым в практике, антибиотикам и проявляли адгезивную, гемолитические, ДНК-азную, лецитиназнуга активности, LT, ST энтеротоксигенности и вирулентность, чего необходимо учитывать при оценке этиологической роли бактерий рода Citrobacter.

Исследования показали принципиальную возможность использования методов "отека лгтки", изолированной петли тонкого кишечника кролика, опыты на мышах-сосунках и про-тистоцидный тест при выяснении токсигенности и вирулентности штаммов Citrobacter spp.

В опытах ДНК-ДНК гибиридизации предлагается использовать молекулярный зонд для выявления среди Citrobacter spp. продуцентов ST-энтеротоксина.

Наши данные по изучению факторов патогенности бактерий рода Citrobacter, в совокупности могут служить основанием для отнесения ряда выделенных штаммов Citrobacter spp. к этиологическим, что должно учитывать при лечении заболеваний, вызванных этими микроорганизмами.

ВЫВОДЫ

1. Из 97 штаммов Citrobacter ;;рр., выделенные при инфекционных процессах, 63,17% составляли штаммы, изолированные от больных страдающих кишечными инфекциями, 23,46% -при

гнойно-воспалительных и 11,89% - при урологических заболеваниях. При кишечных инфекциях преимущественно выделялись штаммы, относящиеся к 22 серогруппе, при инфекциях мочевыводящих путей к ЗаЗвЗс серогруппе.

!. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры бактериальных колоний Citrobacter spp. показало, что между клетками внутри колоний существуют контакты двух типов: плотное слипание клеток между собой и образование внутрицитоплазматических перемычек на уровне наружных мембран клеточных стенок.

5. Штаммы Citrobacter spp., выделенные от больных кишечными и урологическими инфекциями, чаще обладали адгезивной активностью. Высокоадгезивные штаммы по периметру имели реснички длиной от 110 до 420 нм и шириной от 5,0 до 5,4 нм, не подавляемые Д- маннозой.

I. Среди штаммов продуцирующих одновременно энтерогемоли-зин и а-гемолизин преобладали культуры выделенные при кишечных инфекциях, тогда как штаммы, выделенные при гнойно -воспалительных и урологических заболеваниях чаще продуцировали а~ и тиолзависимый гемолизин.

з. Штаммы Citrobacter spp., выделенные от больных страдающих кишечными, урологическими и гнойно-воспалительными заболеваниями, обладали лецитиназной, ДНК-азной, антили-зоцимной и антиинтерфероновой активностями.

5. Молекулярный зонд можно использовать для обнаружения ST-энтеротоксигенных штаммов Citrobacter spp.

7. Клинические штаммы Citrobacter spp. были устойчивыми к широко применяемым в практике антибиотикам (ристомицин, ампициллин, оксациллин, олеандомицин, фузидин), и 96,6% штаммов были чувствительными к клафорану, 92,4% - к таре-виду, сизомицину, 90,3% - к сумамеду, цефалотину, 86,1% -к мономицину и полимикеину.

3. Генетическим детерминантом адгезивной активности являются структурные элементы хромосомной природы, а - гемолитической активности, по-видимо плазмида массой 120 МД, а также хромосома, LT-энгеротоксигенносги - плазмида массой 60 МД.

Э. Получен и депонирован в федеральную коллекцию живых культур ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича штамм №244 C.diversus, как обладающий комплексом факторов патогенности, который может быть использован качестве эталонной культуры при изучении биологических свойств Citrobacter spp.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты являются обоснованием для объяснения этиопатогенеза инфекций, вызванных бактериями рода Citrobacter spp.

2. Для оценки этиологической значимости выделенных штаммоЕ Citrobacter spp. рекомендуется использовать в условиях баклаборатории методы интраназального заражения мышей, плантарный и протистоцидный тесты, феномен гемагглютинации с эритроцитами цыпленка.

3. Штамм C.diversus ГИСК N'244 рекомендуются в качестве эталонной культуры при изучении биологических свойств Citrobacter spp.

4. Сконструированный молекулярный зонд рекомендуется для обнаружения ST-энтеротоксигеиных штаммов Citrobacter spp. в опытах ДНК-ДНК гибридизации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Серологический пейзаж бактерий рода Citrobacter, выделенных от больных в г.Уфе. Тезисы докладов 61-ой конференции молодых ученых БГМУ -Уфа. -1996. -с.27-28.

2.Морфологические свойства и адгезивная активность клинических штаммов Citrobacter. Ж. Здравоохранение Башкортостана - 1996.-№6. стр.25-27.(Соа^вт. З.Г.Габидуллин, И.Б.Иш-кильдин, А. Р.Мавзютов, Д.Т.Ге.шимова, А.К.Булгаков,

Т.А.Савченко) .

3. Некоторые биологические свойства бактерий рода Citrobacter. Тезисы докладов конференции молодых ученых поев.50-летию СНО БГМУ -1997.(Соавт.А.К.Булгаков, А.В.Алексеев).

4.Персистируюшие свойства клинических штаммов Citrobacter Тезисы докладов конференции «Новые технологии в педиатрии и детской хирургии» посвященной к 25-летию ДРКБ. -1997. -стр.119-120. (Соавт. З.Г.Габидуллин, С.Г.Хасанова, А.М. Абдрахманов, Т.Р.Хомякова, Р.Х.Кудакаева).

5.Микробиологические аспекты патологии человека, связанной с условно-патогенными энтеробактериями. Проблемы теоретической медицины. -К 65-летию БГМУ.-Уфа. -1997г.-стр.16-20. (Соавт. З.Г.Габидуллин, А.Р.Мавзютов, А.К.Булгаков,

Д.Т.Гашимова, Р.Ш.Хамзин).

6. Этиологическая значимость условно-патогенных энтеробакте-рий и перспективы совершенствования лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний. Ж. Здравоохранение Башкортостана -1996, -N'6, -С. 19-25. (Соавт. З.Г.Габидуллин,