Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения

Феоктистова, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения"

На правах рукописи

Феоктистова Наталья Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ РОДА РЯОТЕШ, КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ БИОПРЕПАРАТА И РАЗРАБОТКА ПАРАМЕТРОВ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов — 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно - санитарной экспертизы ФГОУ ВПО "Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия"

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, профессор Золотухин Сергей Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор Обухов Игорь Леонидович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Защита диссертации состоится «. У* 2006 года в

часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04. в Федеральном . государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410600, г. Саратов, Театральная пл., 1. Тел./факс (8452) 74-96-20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335. Тел./факс (8452) 69-25-32.

Автореферат разослан «&» 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук ¡Г* р Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В последние годы, благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей, расширилось представление о роли энтеробактерий рода Proteus в патологии животных и человека (Papapetropoulou, Pagonopoulou, Kouskouni, 1997; Золотухин, 2004; 2005).

Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Lamikanra, Fayinka, Olusanya, 1989; Золотухин, 2002). В то же время представители этого рода являются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и др. (Бутакова, Илинская, Юрова, 1991; Зыкин, 2003; Заркуа, Мечурчлишвили, Гадуа, 2005; Чанишвили с соавт., 2005; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

Также имеется множество экспериментальных данных о патогенности названных микроорганизмов для животных. Протеи выделяются при маститах, эндометритах, раневых инфекциях и других воспалительных процессах у различных видов животных. Особое внимание заслуживают работы по изучению этиологической роли протея в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных (Каврук, Брито ва, Гиряева, 1983; Каврук, 1986; 1994; Парайко, Парайко, 1990; Мищенко с соавт., 1999; Золотухин, 2004, Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

В настоящее время лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых протеем, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации по общепринятым тестам. Этот метод трудоемок и требует затрат времени, питательных сред и реактивов. Поэтому перед исследователями стоит задача изыскания более простого и доступного для лабораторий любого уровня метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В ветеринарной практике для ускоренного обнаружения некоторых родов микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги с использованием реакции нарастания титра фага РНФ (Гольдфарб, 1961; Капырина, Бакулов, 1972; Ганюшкин, 1988; Русалеев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990; 1992; Натидзе с соавт., 2005). Методы индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.

Цель исследования. Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Proteus с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Proteus в хозяйствах неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйственых животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Proteus.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, морфологию фаговых корпускул, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.

4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат-диагностикум.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.

7. Разработать схему идентификации протеев с помощью бактериофагов.

Научная новизна

Получены новые штаммы бактериофагов, активные в отношении штаммов бактерий рода Proteus, выделенных из объектов ветеринарного надзора. Изучены основные биологические свойства выделенных фагов.

Впервые разработаны биотехнологические параметры фагоиндикации и фагоидентификации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов с диагностической целью.

Практическая значимость

Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, которые используются для изготовления диагностических препаратов. Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата из выделенных фагов и схемы фагодиагностики.

Для конструирования биопрепарата были отобраны два фага, которые депонированы в государственной коллекции Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов ФГУ «ВГНКИ» (Справка о депонировании штамма бактериофага П-16 УГСХА от 21.02.2006 №263-3/19; Справка о депонировании штамма бактериофага П-261 УГСХА от 21.02.2006 №263-4/19) для получения патентов.

Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных протейных бактериофагов П-16 УГСХА, П-261 УГСХА», одобренная Ученым Советом Ульяновской ГСХА и утвержденная ректором академии 17.01.2006.

Для врачей-бактериологов предложены «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН) (26.06.2006).

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждена актом производственных испытаний (от 10.01.2006), актами комиссионных испытаний в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006), актами комиссионных испытаний в Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 17.02.2006).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Усовершенствована схема выделения бактериофагов применительно к протеям, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.

2. Сконструирован би опрепарат-диагноста кум из селекционированных фагов и разработаны технологические параметры его изготовления для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

3. Разработаны схемы ускоренной индикации бактерий Proteus в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и идентификации протеев с использованием созданного биопрепарата.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов «Аграрная наука — развитию агропромышленного комплекса» (Ульяновск, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), на Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2006), на Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно — исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных» при творческом сотрудничестве с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и эпидемиологии (ВНИИВСГиЭ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературных источников, 197 источников, в том числе 150 отечественных, и приложения. Работа изложена на 166 страницах и иллюстрирована 36 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Штаммы бактерий, В работе были использованы 40 штаммов бактерий рода Proteus: 14 штаммов были получены из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА»; 14 штаммов получены из музея лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГиЭ; 12 штаммов выделены из объектов ветеринарного надзора.

Использовали также 97 штаммов бактерий гетерологичных родов и семейств: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Ульяновская ГСХА».

Штаммы бактериофагов. Изучались биологические свойства 22 изолятов протейных бактериофагов, выделенных из объектов ветеринарного

надзора Ульяновской и Самарской областей.

Исследуемые объекты. В качестве объектов ветеринарного надзора использовали интактные: водопроводную воду, сточные воды животноводческих ферм и общественных туалетов, фекалии животных и комбикорм, патологический материал от больных и павших животных, контаминированное бактериями рода Proteus мясо.

Методы. Для выделения бактерий рода Proteus использовали схему, изложенную в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», утвержденных Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 11.10.1999. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), Л.И. Адельсоном (1962), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), A.C. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвили (1968), И.М. Габриловичем (1973), И.П. Ревенко (1978), В Л. Ганюшкиным (1988). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной и использованной И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий рода Proteus в объектах окружающей среды, кормах и пшцевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методикам В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), В .-Я. Ганюшкина (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Бейли, 1962; Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).

Результаты собственных исследований и их обсуждение Выделение бактерий рода Proteus из объектов ветеринарного надзора. Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий рода

Proteus из объектов ветеринарного надзора. В период с 2003 по 2006 год было исследовано на наличие бактерий рода Proteus 64 пробы фекалий, сточных вод, патологического материала от больных и павших животных, взятые в 10 хозяйствах Ульяновской и Самарской областей. В результате проведенных исследований было выделено 12 штаммов бактерий рода Proteus из проб, взятых в 7 хозяйствах, что составило 70 %.

Изучение спектра литического действия коммерческого коли-протейного бактериофага. Вторым этапом наших исследований было изучение спектра литического действия коммерческого колипротейного бактериофага на 14 музейных штаммах бактерий рода Proteus и 12 штаммах бактерий рода Proteus, выделенных от животных. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения бактериофага на газон бактериальной культуры. В наших исследованиях изучаемый поливалентный бактериофаг проявил активность в отношении 11 культур, процент лизиса был равен 42,3 %.

Поиск и селекция бактериофагов. Следующим этапом работы была попытка выделить бактериофаги Proteus из имеющихся штаммов бактерий рода Proteus. Мы предполагали возможное наличие лизогенных культур, так как бактериофаги, выделенные из них, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985). В первой серии опытов использовали методику выделения бактериофагов энтеробактерий без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3, В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 30 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ 8, 18,0 % мощности которой приходилось на область 254 нм. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах Proteus методом агаровых слоев. В наших исследованиях нам не удалось выделить фаги бактерий рода Proteus. Следующий этап работы был

посвящен выделению бактериофагов из объектов внешней среды. При исследовании 20 проб сточных вод и 12 проб фекалий, удалось выявить присутствие 22 изолятов фагов по наличию на газоне индикаторной культуры Proteus негативных колоний или зон лизиса. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний по методикам, описанным И.М. Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994).

Характеристика выделенных фагов Proteus Морфология негативных колоний. Морфологию негативных колоний изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые выделенными бактериофагами, были разделены нами на пять типов. 1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0-1,5 мм в диаметре — 7 фагов. 2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,0-4,0 мм в диаметре - 4 фага. 3 тип: мутные негативные колонии округлой формы, 1,0-2,5 мм в диаметре — 6 фагов. 4 тип: менее мутные негативные колонии округлой формы с выраженным вторичным ростом бактерий в центре и ореолом по периферии, 6,0-8,0 мм в диаметре — 1 фаг. 5 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы с ровными краями и ореолом по периферии, 2,0-3,0 мм в диаметре — 2 фага.

Спектр литической активности. Для изучения спектра литической активности селекционированных фагов использовали 26 штаммов бактерий рода, проводили его методом нанесения фага на газон бактериальной культуры. Наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, которые лизировали 24 штамма протеев из 26 изученных штаммов, независимо от вида, что составляет 86,5 %.

Литическая активность. Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методами Аппельмана и Грациа (Ревенко, 1978). Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что выделенные , протейные бактериофаги обладали различной литической активностью,

показатели которой колебались по Аппельману от 10*5 до 10"8, по Грациа от 2,1x106 до 2,0x109. Наиболее высокой литической активностью обладали фаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА: титр по Аппельману 10"8 у обоих фагов, по Грациа 2,0хЮ9 и 1,8х109, соответственно. Для конструирования биопрепарата было отобрано два фага: П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами по Грациа и Аппельману и широким спектром литического действия.

Биологические свойств фагов П-16 и П-261 серии УГСХА Спектр литической активности. Для изучения спектра литической активности бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА мы использовали дополнительно 14 штаммов бактерий рода Proteus из музея ВНИИВСГиЭ. Результаты опыта представлены в таблице 1.

Таким образом, совместный процент лизиса бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА на 40 штаммах бактерий рода Proteus составил 95,0 %.

Таблица 1

Спектр литического действия бактериофагов П-16 и П-261 серии УГСХА

Название бактериофага Количество исследуемых культур Из них чувствительны к фагу Процент лизируемых культур

П-16 УГСХА 40 22 55,0

П-261 УСХА 40 27 67,5

Процент лизиса 95,0

Специфичность действия бактериофагов Proteus. Изучение специфичности двух бактериофагов Proteus (П-16 УГСХА, П-261 УГСХА) проводили по отношению к представителям других семейств и родов с использованием штаммов: E.coli - 46 штаммов, Citrobacter spp - 6 штаммов, Morganella spp. — 6 штаммов, Klebsiella spp. — 4 штамма, Salmonella spp. — 6 штаммов, Enterobacter spp. — 4 штамма, X en terocolitica — 12 штаммов, Staphylococcus spp. — 3 штамма, Streptococcus spp. - 2 штамма, Pseudomonas aureginosa — 4 штамма, Bacillus cereus — 3 штамма. Полученные результаты

позволяют сделать вывод, что фаги неактивны к представителям бактерий гетерологичных родов и семейств. Таким образом, селекционированные нами фаги являются специфичными для рода Proteus.

Температурная устойчивость бактериофагов Proteus. Результаты проведенных исследований позволяют применять прогревание как метод инактивации микрофлоры при работе с протейными бактериофагами, так как воздействие температуры в диапазоне 60-73 °С не понижали литическую активность бактериофагов, в то время как бактериальные клетки протеев в наших исследованиях погибали при температуре 62 °С в течение 30 минут.

Устойчивость к воздействию хлороформа. Бактериофаги обычно устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий (Ревенко, 1978). Определение чувствительности бактериофагов и бактерий проводили методом обработки фаговой суспензии и бульонных культур протеев хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что селекционированный бактериофаг П-16 УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию хлороформа. В то время как бактериофаг П-261 УГСХА уже через 15 минут обработки хлороформом значительно терял свою активность. Обработка бактерий индикаторных штаммов P.vulgaris 261 и Р.vulgaris 3 в течение 15 минут хлороформом приводила к их полной гибели.

Морфология фаговых корпускул. Для изучения морфологии фаговых корпускул проводили электронно-микроскопические исследования лизатов бульоных культур: Р. vulgaris 261 и Р. vulgaris 3 с бактериофагами П-16 и П-261 серии УГСХА в титре от 1,8x109 до 2,0x109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грациа). В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага П-16 УГСХА имеют структуры, состоящие из головки гексагональной формы размером 25 нм (± 4) и аналога отростка длиной 1,2 нм (± 0,2). Вирионы бактериофага П-261 УГСХА имеют сходные с фагом П-16 УГСХА структуры: головку гексагональной формы размером 22,5 нм (± 0,2) и

аналог отростка длиной 0,6 нм (± 0,1). В соответствии с Международной номенклатурой вирусов по морфологическим параметрам оба фага, П-16 УГСХА и П-261 УГСХА, были отнесены к семейству Podoviridae (Murphy, 1995), по классификации A.C. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

Изменение л um и чес кой активности при хранении. Для разработки технологических параметров изготовления биопрепатара из фагов П-16 и П-261. серии УГСХА необходимо было установить изменение литической активности указанных штаммов при хранении в условиях 2-4 °С. Полученные результаты свидетельствуют о том, что селекционированные протейные бактериофаги при хранении в условиях 2-4 °С в течение 12 месяцев незначительно снижали литическую активность до Ю7-10 8 фаговых корпускул в 1 см3.

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий Proteus Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к бактериям рода Proteus, нами была разработана схема ускоренной идентификации этих микроорганизмов по показателям лизиса культур на плотной питательной среде. Предлагаемая нами схема позволяет идентифицировать бактерии рода Proteus за 48 часов (2 суток). Срок бактериологического исследования по схеме, изложенной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями», составил 96 часов (4 суток) при больших затратах посуды и реактивов.

Определение количественного показателя РНФ, имеющее диагностическое значение Определение параметров постановки РНФ и разработку количественного

показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по

методике, предложенной В,Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962).

Проведены эксперименты с использованием МПБ, контаминированного 18

часовыми индикаторными культурами Р. vulgaris 261 (для фага П-261 УГСХА)

и Р. vulgaris 3 (для фага П-16 УГСХА) от 101 до 105 м.к./мл. В качестве контроля был использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, образовавшихся на плотной питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Учет результатов РНФ проводили согласно оценке, предложенной В .Я. Ганюшкиным (1988): при увеличении количества частиц от 3 до 5 раз бактериофага в опытной пробе по отношению к контролю результат считался слабо положительным, при увеличении свыше 5 раз — положительным, при увеличении в 10 и более раз — резко положительным.

По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации протеем МПБ в концентрации 102 м.к./мл.

Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями

Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты

на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus, оптимальное время экспозиции устанавливали из шести следующих параметров:

- при предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- при увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10,16 и 24 часов при температуре 37 °С.

Для изучения чувствительности РНФ, в зависимости от времени подращивания, МПБ контаминиро вали бактериями рода Proteus в концентрации от 101 до 103 м.к./мл и инкубировали в термостате при

температуре 37 °С в течение 5, 16, 24 часов. Результаты исследования представлении в таблице 2.

Таблица 2

Чувствительность РНФ в зависимости от времени подращивания исследуемого материала, контаминированного бактериями рода Proteus

Варианты исследований Минимальное количество протеев, обнаруживаемое с помощью Время, затраченное на проведение исследований, (в часах)

Фаги № Длительность подращивания исследуемого материала РНФ Бактериологиче ский метод РНФ Бактериологиче ский метод

Часы

П-16 1 5 10' 104 22 79

УГСХ 2 16 10J 10' 32 88

А 3 24 10z I0Z 40 96

П-261 1 5 10* ю4 22 79

УГСХ 2 16 10^ 32 88

А 3 24 10' 1ÜJ 40 96

Установлено, что подращивание материала в течение 5 часов позволяет обнаружить протей с помощью РНФ в концентрации 102 м.к./мл фагами П-261 УГСХА и П-16 УГСХА. При подращивании исследуемого материала в течение 16 часов чувствительность реакции не повышается и позволяет обнаружить бактерии фагами П-261 УГСХА и П-16 УГСХА в количестве 102 и 103 м.кУмл, соответственно. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество протеев обнаружить удалось через 88 часов. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.

Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный бактериями рода Proteus в концентрации от 101 до 105 м.к./мл, не подращивали, а увеличивали время контакта с фагом до 5, 10, 16, 24 часов. Результаты представлены в таблице 3.

По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что

Таблица 3

Чувствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования _исследуемого материала с фагами_

Фаги № Время контакта исследуемого материала с фагом РНФ Бактериологиче ский метод РНФ Бактериологиче ский метод

часы

П-16 УГСХ д 1 5 10* 10" 18 79

2 10 10х 10* 23 82

3 16 10* 29 88

4 24 10* 10* 41 96

П-261 УГСХ А 1 5 10* ю4 18 79

2 10 10* 10' 23 82

3 16 10* 10* 29 88

4 24 10' 10' 41 96

увеличение времени до 5 часов позволяет обнаружить протеев с помощью РНФ. в концентрации 102 м.к,/мл фагами П-16 УГСХА и П-261 УГСХА. При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 10-16 часов чувствительность реакции не повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл, соответственно. Бактериологическим методом это же количество протеев удалось обнаружить через 88 часов. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции также не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 и 102 м.к./мл соответственно. Бактериологическим методом протеев удавалось обнаружить в концентрации 102 м.к./мл, но на обнаружение затрачивается 88 часов. На основании наших данных, считаем, что наиболее оптимальным являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 102 и 10 м.к. в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 18 часов.

Разработка схемы постановки РНФ при помощи селекционированных бактериофагов с образцами объектов ветеринарного надзора Пробы образцов объектов ветеринарного надзора (водопроводная вода,

комбикорм, фекалии, мясо) в объеме 10 г (мл) вносили в колбы и

контаминировалн P. vulgaris 261 и P. vulgaris 3 в концентрации IO'-Ю5 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г (мл) пробы. Пробы мяса (кусочки свинины) растирали в фарфоровой ступке. Для контроля использовали колбы с пробами, не контаминированными бактериями Proteus.

По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов П-16 и П-261 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации: 102 м.к. протеев в 1 мл водопроводной воды, 103 м.к. протеев в 1 г комбикорма, 103 м.к. протеев в 1 г фекалий, 103 м.к. протеев в 1 г мяса.

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования по фагодиагностике кишечной инфекции поросят, протекающей с участием протеев. Обнаружение проводили бактериологическим методом и с помощью РНФ.

При исследовании 11 проб фекалий от больных диареей поросят, бактериологическим методом выделено бактерий рода Proteus из 36 % проб, а в РНФ -55 % проб. Результаты исследований свидетельствуют о более высокой чувствительности РНФ (18 часов) при обнаружении бактерий рода Proteus в испражнениях больных диареей поросят в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени (96 часов), реактивов и посуды.

Изучение эффективности поливалентного фагового препарата В таблице 4 приведены результаты предварительного титрования фагов и их смеси на индикаторных штаммах протеев.

Таблица 4

Литическая активность протейных монофагов и их смесей

Название фага Титр фага в моноварианта Титр смеси фагов

П-16 УГСХА 2,0x10* 1,0x10*

П-261 УГСХА l,8xl0v 1,0х10у

Так как исходное число фаговых корпускул в смеси у каждого фага было практически в два раза меньше, то и результаты титрования смеси показали по каждой культуре двукратное уменьшение титра фага (по Грациа), что составило

1,0x109 для обоих фагов соответственно. В абсолютных числах этот показатель являлся диагностическим - 1,0x109 корпускул при исходной концентрации обоих фагов 104. Таким образом, на индикаторных культурах была установлена возможность использования смеси протейных фагов с целью индикации.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании 64 проб патологического материала и объектов ветеринарного надзора из 10 хозяйств Ульяновской и Самарской областей в 7 хозяйствах, что составило 70 %, было выделено 12 культур бактерий рода Proteus.

2. Выделено из объектов внешней среды 22 изолята фагов, активных по отношению к бактериям рода Proteus и изучены их биологические свойства.

3. Отобрано два штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, которые имели титр 10"8 по Аппельману и 1,8х109 - 2,0х109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий рода Proteus, не лизировали представителей родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas, сохраняли литическую активность в пределах 107-108 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2-4 °С и были термостабильными.

4. Установлено, что фаг П-16 УГСХА был устойчив к действию 10 % раствора хлороформа в течение 30 минут, а фаг П-261 УГСХА был чувствителен к данному реагенту.

5. Определено, что по морфологическим параметрам бактериофаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА могут быть отнесены к семейству Podoviridae согласно Международной номенклатуре вирусов, а по классификации A.C. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

6. Разработаны биотехнологические параметры изготовления и контроля специфического диагностического биопрепарата с высокой литической активностью, состоящий из двух штаммов фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА.

7. Разработана схема идентификации протеев с помощью сконструированного фагового препарата, позволяющая идентифицировать бактерии рода Proteus за 48 часов.

8. Разработана схема ускоренной индикации бактерий рода Proteus с помощью РНФ в объектах ветеринарного надзора с использованием набора фагов, которая позволяет обнаружить их за 18 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены для конструирования биопрепарата-диагностикума 2 штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, активных по отношению к представителям бактерий рода Proteus, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности.

2. Индикацию и идентификацию бактерий рода Proteus предлагаем проводить с помощью набора диагностических фагов, согласно «Методические рекомендациям по ускоренной индикации и идентификации энтеробактерий рода Proteus в патологическом материале, кормах, пищевом сырье и объектах внешней среды с применением специфических бактериофагов»,

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно «Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-261 УГСХА и П-16 УГСХА»,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Феоктистова H.A. Биологические особенности бактерий рода Proteus и их роль в патологии животных И Региональные проблемы народного хозяйства: Матер. Всерос. науч.- практ. конф. молодых ученых, 8-9 апреля 2004 г. — Ульяновск, 2004. - Ч. 1 - С.329-336.

2. Феоктистова H.A., Мелехин A.C., Золотухин С,Н., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Proteus из объектов внешней среды // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы:

Матер. Всерос. науч-практ. конф., 26-28 апреля 2005 г. - Ульяновск, 2005. -4.4,5. -C.-173-176.

3. Феоктистова H.A., Мелехин A.C., Золотухин CH., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных фагов бактерий рода Proteus // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Матер. Всерос. науч.-практ. конф., 26-28 апреля 2005 г. — Ульяновск, 2005. - 4.4,5. - С.-176-179.

4. Феоктистова Н. А. Температурная устойчивость протейных бактериофагов // Молодежь и наука XXI: Матер. Межд. науч.-практ. конф., 2123 марта 2006 г. - Ульяновск, 2006. - 4.1. - С.401-403.

5. Феоктистова НА., Юдина М.А. Устойчивость протеев и их бактериофагов к воздействию хлороформа // Молодежь и наука XXI: Матер. Междунар. науч.- практ. конф., 21-23 марта 2006 г. — Ульяновск, 2006. — 4.1. — С.403-406.

6. Феоктистова H.A., Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Тарасова A.B. Поиск бактериофагов бактерий рода Proteus и селекция клонов фагов // Вестник УГСХА. - Ульяновск, 2006. - №1. - С.54-56.

7. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Каврук JT.C., Молофеева Н.И., Пульчеровская Л.П., Коритняк, Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова H.A., Пожарникова E.H., Мелехин A.C., Барт Н.Г., Катмакова Н.П. Выделение и селекция клонов бактериофагов патогенных бактерий И Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. науч. конф., 21-23 июня 2006 г. - Ульяновск, 2006. - С.221-231.

8. Золотухин С.Н., Мелехин A.C., Васильев Д.А., Каврук Л.С., Молофеева H.H., Пульчеровская Л.П., Коритняк, Б.М., Бульканова Е.А., Феоктистова H.A., Пожарникова E.H. 4увствительность патогенных энтеробактерий, выделенных при диареях молодняка животных к антибиотикам и специфическим бактериофагам // Профилактика, диагностика и лечение

инфекционных болезней, общих для людей и животных: Матер. Междунар. науч. конф., 21-23 июня 2006 г. - Ульяновск, 2006. - С.233-236.

9. Золотухин С.Н., Васильев Д.А., Бульканова Е.А,, Феоктистова H.A., Пожарникова ЕЛ., Мелехин A.C. Бактериофаги малоизученных энтеробактерий и перспективы их применения в ветеринарии // Ветеринарная патология. - 2006. - №3. - С.80-85.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Феоктистова, Наталья Александровна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика бактерий рода Proteus.

1.2. Резервуар и распространение инфекции.

1.3. Патогенность протеев.

1.4. Идентификация бактерий рода Proteus.

1.5. Устойчивость.

1.6. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике.

1.6.1.Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.

1.6.2. Развитие фаговых корпускул в клетке хозяина.

1.6.3. Реакция нарастания титра фага (РНФ).

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Выделение бактерий рода Proteus из патологического материала и объектов окружающей среды.

2.2.2. Изучение спектра литического действия коммерческого коли-протейного бактериофага.

2.2.3. Поиск бактериофагов Proteus и селекция клонов фагов.

2.2.4. Изучение биологических свойств фагов бактерий рода Proteus.

2.2.5. Характеристика выделенных фагов бактерий рода Proteus, выбранных для конструирования диагностического препарата.

2.3. Разработка технологических параметров изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

2.4. Разработка метода выделения и ускоренной идентификации бактерий рода Proteus с использованием фагов.

2.5. Разработка оптимальных условий постановки РНФ.

2.5.1.Определение количественного показателя РНФ, имеющего диагностическое значение.

2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.

2.5.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора.

2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями рода Proteus, с помощью РНФ.

2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями рода Proteus, с помощью РНФ.

2.5.3.3. Исследование проб фекалий, контаминированных бактериями рода Proteus, с помощью РНФ.

2.5.3.4. Исследование мяса, контаминированного бактериями рода Proteus, с помощью РНФ.

2.5.3.5. Результаты исследований фекалий от больных диареей поросят с помощью РНФ.

2.6. Изучение эффективности поливалентного фагового биопрепарат.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения"

Актуальность работы

Представители данного рода широко распространены в природе, их выделяют из воды, почвы, фекалий животных и человека. Некоторые штаммы входят в состав нормальной микрофлоры кишечника (Lamikanra, Fayinka, Olusanya, 1989; Золотухин, 2002). В то же время представители этого рода являются возбудителями внутрибольничных инфекций, энтеритов у детей и взрослых людей, способны вызывать воспалительные процессы мочевыводящих путей, быть причиной послеоперационных и ожоговых осложнений, сепсиса, дисбактериоза, токсикоинфекций и других заболеваний (Бутакова, Илинская, Юрова, 1991; Ба-кулов, Смирнов, Васильев, 2003; Зыкин, 2003; Заркуа, Мечурчлишвили, Гаду а, 2005; Чанишвили с соавт., 2005; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

Также имеется множество экспериментальных данных о патогенности названных микроорганизмов для животных. Протеи выделяются при маститах, эндометритах, раневых инфекциях и других воспалительных процессах у различных видов животных. Особое внимание заслуживают работы по изучению этиологической роли протея в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных животных (Каврук, Бритова, Гиряева, 1983; Каврук, 1986; 1994; Парайко, Парайко, 1990; Мищенко с соавт., 1999; Золотухин, 2004, Золотухин, Каврук, Васильев, 2005).

Цель исследования

Разработка технологических параметров по индикации и идентификации бактерий рода Proteus с помощью специфических бактериофагов.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение бактерий рода Proteus в хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям молодняка сельскохозяйст-веных животных.

2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Proteus.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий рода Proteus.

7. Разработать схему идентификации протеев с помощью бактериофагов.

Научная новизна

Практическая значимость

Результаты изучения биологических свойств бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА и индикации бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора методом РНФ подтверждена актом производственных испытаний (от 10.01.2006), актами комиссионных испытаний в Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии (от 30.01.2006), актами комиссионных испытаний в Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных препаратов для животных и кормов (ВГНКИ) (от 17.02.2006).

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

2. Сконструирован биопрепарат-диагностикум из селекционированных фагов и разработаны технологические параметры его изготовления для фагоди-агностики бактерий рот Proteus.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, 2004), Научнопрактической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов «Аграрная наука - развитию агропромышленного комплекса» (Ульяновск, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, 2005), Международной научно-практической конференции «Молодежь и наука XXI» (Ульяновск, 2006), Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно - исследовательской темы кафедры «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных» при творческом сотрудничестве с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГиЭ).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературных источников, 197 источников, в том числе 150 отечественных, и приложения. Работа изложена на 166 страницах и иллюстрирована 36 таблицами, 9 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Феоктистова, Наталья Александровна

выводы

3. Отобрано два штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, которые имели титр 10" по Аппельману и 1,8x109 - 2,0x109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий рода Proteus, не лизировали представителей родов Escherichia, Enterobacter, Citrobcicter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Streptococcus, Pseudomonas, Bacillus, Yersinia,

7 8 сохраняли литическую активность в пределах 10 - 10 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2-4 °С и были термостабильными.

5. Определено, что по морфологическим параметрам бактериофаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА могут быть отнесены к семейству Podoviridae согласно Международной номенклатуре вирусов, а по классификации А.С. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложены для конструирования биопрепарата-диагностикума 2 штамма фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, активные по отношению к представителям бактерий рода Proteus, обладающие строгой специфичностью, широким спектром литической активности.

3. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно "Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии бактериофагов Proteus П-261 УГСХА и П-16 УГСХА».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важное место среди условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих различные заболевания у животных и человека, занимают энтеробактерии рода Proteus. Борьба с любыми инфекционными заболеваниями зависит от своевременной диагностики, поэтому усовершенствование методов лабораторной диагностики заболеваний, вызываемых этими микроорганизмами, уделяется большое внимание. Современные методы диагностики, которые могут быть использованы для индикации и идентификации микроорганизмов дорогостоящи и недоступны большинству районных бактериологических лабораторий. Поэтому изысканию простых и доступных методов для лабораторий любого уровня является актуальной проблемой.

В связи с этим наша работа была посвящена изысканию вирулентных специфических бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Proteus, выделенных от животных.

Как указывают В.Д. Тимаков и Д.М. Гольдфарб (1962), идентификация возбудителей инфекционных заболеваний при помощи бактериофагов является очень тонким методом, превосходящим по чувствительности все иммунологические реакции. Поэтому основной задачей проведенных исследований являлось выделение и изучение бактериофагов с типоспецифическими свойствами в отношении бактерий рода Proteus для индикации и идентификации указанных бактерий. Выделение бактериофагов проводилось из объектов ветеринарного надзора.

При проведении бактериологических исследований 64 проб объектов ветеринарного надзора 10 хозяйств Ульяновской и Самарской областей нами было выделено 12 культур бактерий рода Proteus из проб, взятых в 7 хозяйствах, что составило 70 %. Этот показатель свидетельствует о широком распространении бактерий рода Proteus в объктах ветеринарного надзора на территории Ульяновской и Самарской областей.

В результате нами было выделено и селекционировано 22 изолята протейных бактериофагов. Они были изучены по основным биологическим свойст-вамсвойствам, которые имеют таксономическое значение: 1) морфологии негативных колоний; 2) специфичности действия; 3) литической активности; 4) спектру литической активности; 5) температурной устойчивости; 6) чувствительности к хлороформу, 6) морфологии фаговых корпускул, 7) изменению литической активности фагов при хранении.

Выделенные бактериофаги различались по морфологии образуемых на индикаторных штаммах негативных колоний, поэтому разделены нами на пять типов. Была изучена литическая активность селекционированных бактериофагов по методам Аппельмана и Грациа (Гольдфарб, 1961), которая составила: по методу Аппельмана 10"5-10"8, по Грациа от 2,1х106 до 2,0х109 фаговых корпускул в 1 мл. Был изучен совместный спектр литического действия двух активных бактериофагов: процент лизиса составил 95,0 %. Нужно отметить, что бактериофагов, лизирующих только один штамм, обнаружено не было.

Выделенные фаги исследовали на специфичность: они проявили себя не активными в отношении гетерологичных бактерий.

Воздействие температуры в диапазоне 60-73 °С не понижало литическую активность селекционированных бактериофагов, инактивация наступала при температуре 88 °С. Так как изучаемые фаги были термостабильными, метод прогревания в исследованиях мы использовали для инактивации микрофлоры с целью освобождения от них фаголизата. Фаги проявили неодинаковую устойчивость к хлороформу: П-16 УГСХА был устойчив, а П-261 был не устойчив к воздействию реагента.

Результаты проведенных исследований соответствуют литературным данным (Хейс, 1965, Ревенко, 1978, Золотухин, 1994) о более высокой устойчивости бактериофагов по сравнению с бактериями к воздействию факторов внешней среды.

После проведения электронной микроскопии было определено, что по морфологическим параметрам бактериофаги П-16 УГСХА и П-261 УГСХА могут быть отнесены к семейству Podoviridae согласно Международной номенклатуре вирусов, а по классификации А.С. Тихоненко (1968) - ко II морфологической группе: «Фаги с аналогами отростка».

Хотя некоторые литературные данные (Пульчеровская, 2004; Коритняк, 2005; Пожарникова, 2006) о стороении фаговых вирионов энтеробактерий свидетельствуют о том, что они, в основном, относятся к семейству Myoviridcie (Murphy, 1995), по классификации А.С. Тихоненко (1968) - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».

Селекционированные протейные бактериофаги при хранении в условиях

0 7

2-4 С в течение 12 месяцев незначительно снижали литическую активность (10 - 109) и поэтому могут входить в состав биопрепарата для фагодиагностики.

Проведенные исследования позволили сконструировать диагностический препарат на основе фагов П-261 УГСХА и П-16 УГСХА и разработать технологических параметры для изготовления лабораторных серий препарата. Сконструированный диагностический препарат рекомендуем использовать в РНФ для индикации бактерий рода Proteus. При этом сокращаются сроки исследования с меньшим расходом сред и реактивов, чем при использовании бактериологического метода.

О высокой чувствительности РНФ для индикации возбудителей во внешней среде сообщают многие исследователи (Земцова, 1965; Золотухин, Каврук, Васильев, 2005). Нами изучена возможность использования индикаторных бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА для идентификации бактерий рода Proteus.

Существующие методы идентификации бактерий рода Proteus основаны на определении биохимических свойств выделенных культур (Покровский, По-здеев, 1999). Нами предложена схема ускоренной их идентификации с помощью индикаторных бактериофагов П-16 УГСХА и П-261 УГСХА. Лизис культуры на поверхности питательнога агара служит основанием для отнесения исследуемого штамма к роду Proteus. Для ускоренной индикации протеев в объектах ветеринарного надзора нами разработаны оптимальные условия постановки РНФ.

В первую очередь для постановки РНФ определяли концентрации протейных бактериофагов, имеющих диагностическое значение. По данным В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962) известно, что при обнаружении бактерий в РНФ считается отрицательным, если увеличение количества фага в опытной пробе по сравнению с контрольной составляет до 3 раз. Увеличение количества фага от 3 до 5 учитывается как слабо положительная реакция, от 5 до 10 раз -положительная.

Для определения количества фага, имеющего диагностическое значение при обнаружении бактерий рода Proteus, нами проведены эксперименты на МПБ контаминированном культурами P. vulgaris 3 и P. vulgaris 261 в концентрации от 101 до 105м.к./мл.

Выбранный критерий гарантировал достоверность результатов, поскольку он позволял исключить технические погрешности при титровании, при которых возможно выявление невысокой степени увеличения количества фага. Достоверность РНФ подтверждали выделением бактерий рода Proteus бактериологическим методом исследования.

Определив количество фага, имеющее диагностическое значение при обнаружении бактерий рода Proteus в исследуемом тест-объекте, мы приступили к разработке режимов постановки РНФ. Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. Оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 16 часов при температуре 37 иС, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 24 часов при температуре 37 °С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37 °С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10 часов при температуре 37 °С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 16 часов при температуре 37 °С;

- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 24 часов при температуре 37 °С.

В результате этих исследований было установлено, что при подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность не повышалась по сравнению с чувствительностью РНФ при подращивании материала в течение 16 часов и позволяла обнаруживать протеи 10" м.к./мл. При подращивании исследуемого материала в течение 5 часов при температуре 37 °С, нам удалось обнаруживать данные бактерии в концентрации 102 м.к./мл. При этом режиме подращивания чувствительность РНФ не снижается, но сокращается время исследования до 18 часов. Поэтому, это время подращивания мы считаем оптимальным.

В результате исследований установлено, что при увеличении контакта исследуемого субстрата с фагом в течение 10 часов при температуре 37 °С заметное нарастание количества фагов бактерии рода Proteus не наблюдается при концентрации гомологичных бактерий не менее 102 м.к./мл. Удлинение сроков инкубации (16-24 часа) также не дают возможности получить увеличение количества фага.

Исходя из этого, можно предположить, что значение инкубации в течение 5 часов при температуре 37 °С сводится к тому, что за это время бактерии, находящиеся в исследуемом субстрате в очень малых количествах, размножаются. В результате этого между добавленным индикаторным фагом и бактериями устанавливаются такие количественные соотношения, при которых вероятность встреч между ними повышается, и бактерии инфицируются фагом. Отсюда вытекает, что исход реакции зависит не только от свойств индикаторного фага, но и от биологических особенностей данного возбудителя, обнаруживаемого с помощью РНФ.

Таким образом, из числа испытанных режимов наиболее быстрым и чувствительным является подращивание исследуемого материала с фагом в течение 5 часов при температуре 37 °С. Учет результатов в этом случае проводят через 16 часов. Бактерии рода Proteus удается обнаружить в количестве 10 м.к./г.

Таким образом, сопоставление результатов бактериологического исследования и РНФ позволили подтвердить специфичность РНФ и высокую чувствительность, которые согласуются с работами многих авторов.

В.Д. Тимаковым, Д.М. Гольдфарбом (1956), Д.М. Гольдфарбом, В.Н. Кузнецовой (1961), Ф.И. Ершовым (1959) была доказана возможность применение РНФ для обнаружения дизентерийных бактерий в испражнениях людей. РНФ позволяла определять в искусственно зараженных испражнениях людей дизентерийные бактерии в концентрации 150000 м.к./г фекалий. Проведенное параллельно бактериологическое исследование давало отрицательные результаты.

В.Я. Ганюшкин (1967), сообщает об исследовании фекалий от 6 поросят, зараженных внутривенно сальмонеллами, что положительная РНФ была через 26 дней у 100 %.

Сведений о применении РНФ для обнаружения бактерий рода Proteus в объектах внешней среды мы не встречали. Поэтому необходимо было изучить возможность использования РНФ для обнаружения данных микроорганизмов в объектах ветеринарного ндзора. Для этого мы провели исследования по выяснению возможности использования РНФ для обнаружения бактерий рода

Proteus в патологическом материале, объектах внешней среды и пищевом сырье. Прежде всего, мы провели опыты с фекалиями, содержащую постороннюю микрофлору, контаминировали различным количеством бактерий рода Proteus -от 101 до 105 м.к./г. На основании полученных данных при исследовании фекалий, РНФ оказалась эффективнее бактериологического метода исследования. С помощью РНФ выявляли бактерии Proteus в фекалиях в концентрации 10" м.к./г за 18 часов. На обнаружение бактерий рода Proteus в фекалиях бактериологическим методом требовалась более высокая концентрация протеев, исчисляемая 104 м.к./г и выше. Время же исследования увеличивалось до 96 часов. При исследовании мяса, содержащего постороннюю микрофлору в количестве от 101 до 105 м.к./мл, нами было обнаружено явное преимущество РНФ перед бактериологическим методом исследования. С помощью РНФ менее чем за 24 часа з исследования можно обнаружить протеев в мясе в количестве 10 м.к./г.

В результате проведенных исследований были выполнены все поставленные задачи, предложен диагностический препарат, состоящий из 2 фагов: П-261 УГСХА и П-16 УГСХА, разработаны технологические параметры для изготовления лабораторной серии бактериофагов. Доказана возможность применения РНФ с целью обнаружения бактерий рода Proteus в объектах ветеринарного надзора, позволяющая сократить время исследования, уменьшить расход питательных сред и лабораторной посуды, увеличить эффективность обнаружения бактерий рода Proteus.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Феоктистова, Наталья Александровна, Ульяновск

1. Абдусаматов М.А. Сравнительное изучение реакции нарастания титра фага и бактериологического метода при диагностике брюшного тифа у больных и реконвалесцентов // ЖМЭИ. 1960. - № 1. - С. 23-27.

2. Аврех В.В. О понятии "Серологический тип бактериофагов"// В кн.: XIII Всесоюзный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов. Т.2. Л.,1959. - С. 537-540.

3. Аврех В.В. О применении бактериофагов в диагностике сальмонелле-зов // ЖЭМИ. 1954. - №7. - С. 93-96.

4. Адаме М. Бактериофаги. М., 1961. - С. 26-121.

5. Адельсон Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропато-генным кишечным палочкам // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии. М., 1962. - С. 184-194.

6. Адельсон Л.И., Гуторова В.Д., Ключарева Г.Г. Современное состояние проблемы теории бактериофага и его практическое применение // Тезисы докладов юбилейной научной сессии Ленинградского сан.- гиг. мед. ун-та.-Л.,1958.-С.34.

7. Азизбекян P.P. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии // В кн. Микробиология. Т.З. (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР). М., 1974. - С. 191-233.

8. Аль-Санори Тарек Мохаммад Микробные ассоциации при трихомонад-ных уретритах // Мшробюл. ж. 1996. - №2. - С.64-69.

9. Алымова А.Ф., Гортинская В.В., Кузнецова А.П., Логинова Л.Л., Смирнова Е.А. Применение реакции нарастания титра фага в очагах брюшного тифа // Тр. Горьковского гос. мед. ин-та им. С.М.Кирова. Горький, 1964. -T.XYIII. - С. 10-12.

10. Аранович A.M.; Клюшин Н.М.; Розова JI.B. Протей и его чувствительность к антибиотикам у больных хроническим остеомиелитом // Соврем. пробл. мед. и биол. Курган, 1997. - С.213-214.

11. Арский В.Г., Ахметов 3.3., Ясенский А.В. Применение реакции нарастания титра фага для диагностики хронической дизентерии // Здравоохранение Таджикистана. 1961. - № 2. - С. 5-11.

12. Архангельский И.И., Степанов Б.А. Фаготипирование патогенных стафилококков, выделенных из молока коров // Ветеринария. 1966. - №3. -С. 27.

13. Ашмарин И.П., Васильев Н.И., Амбросов В.А. Быстрые методы обработки и планирование эксперимента. М.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. -76 с.

14. Бабков В.В. Биологическая характеристика умеренных бактериофагов Е. coli 0124:В17 // Проблемы бактериофагии и биологии кишечных бактерий: Сб. кафедры микробиологии 1 Лен. Мед. ин-та им. акад. И.П. Павлова,-Л, 1973.-С.53.

15. Байрак В.А. Тесты патогенности и фаготипы стафилококков, выделенных при мастите коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.,1970. -19с.

16. Бакулов И.А., Смирнов A.M., Васильев Д.А. Токсикоинфекции и токсикозы. Вопросы профилактики. Ульяновск,2003. - С.26-28.

17. Балаклеец B.C., Неломинская Т.Д. Двуслойная питательная среда дляидентификации энтеробактерий: А.с. 1631090, МКИ С 12 Q 1/ 04, С 12 1/20: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -М., 1991. -20с.

18. Башмаков Г.А. Индикация дизентерийных бактерий на поверхности методом реакции нарастания титра фага // Военно-мед. журн. — 1961. —4.-С. 39-42.

19. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.:Изд-во иностр. лит., 1962.- 135с.

20. Белоусов Ю.Б., Комарова В.П., Ефременкова О.В. Выбор антибактериальной терапии при лечении инфекций у лиц пожилого возраста П Антибиотики и химиотерапия. 1998. - №10. - С. 19-23.

21. Блохина И.Л., Соколова К.Я., Левалова Г.Ф. Новое в классификации энтеробактерий // ЖМЭИ. 1992. - №1. - С.49-52.

22. Бритова С.В., Каврук Л.С. Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных // Матер. Всесоюзн. конф. -Львов,1988. С.343-344.

23. Бутакова Л.Ю., Илинская Б.В., Юрова В.А. Эпидемиология госпитальной инфекции в травматологическом стационаре // Тез. докл. 6 Всерос. съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. М.,1991. -Т.1.-С.161-162.

24. Быкова З.И. Некоторые свойства чумных фагов // Тр. Армянской противочумной станции. М.,1964. -№3. - С. 171-175.

25. Вилькомирская Т.С. О диагностическом значении реакции нарастания титра фага при дизентерии //ЖМЭИ. 1971. -№ 1.-С. 136-138.

26. Висконти Р. Генетика бактериофага // В кн.: Онтогенез вирусов. -М.,1956.-С. 141.

27. Воронцова А.А. Применение метода реакции нарастания титра фага при эпидемиологическом и санитарном обследовании // Кишечные инфекции: Тез.докл. на межинстит.конф. -М.,1961. С. 127-128.

28. Габидуллин З.Г., Ишкильдан Б.И. Морфологические свойства и адгезивность бактерий рода Proteus IIЖМЭИ 1989. - №6. - С.83-86.

29. Габрилович И.М. Биологические свойства бактериофагов Serratia marcences //ЖМЭИ. 1992. -№6. - С. 10-12.

30. Габрилович И.М. Лизогения. Минск, 1970. - С.68-89.

31. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов // Основы бактериофагии. Минск, 1973. - С.5. - 24.

32. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги Salmonella choleraesuis, сравнительная характеристика и практическое применение: Автореф. дис. . докт. вет. наук. М., 1984. - С.13-34.

33. Ганюшкин В .Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Ульяновск. - 1988. - С.45.

34. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика // Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск, 1990. - С.20-28.

35. Ганюшкин В.Я. Реакция нарастания титра фага при диагностике паратифа поросят//Ветеринария. 1967. -№ 3. - С. 69-71.

36. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М.: Медгиз,1961. - С. 6-184.

37. Гольдфарб Д.М., Кузнецова В.Н. Опыт применения реакции нарастания титра фага для диагностики дизентерии // ЖМЭИ. 1957. - № 8. - С.90.94.

38. Гольдфарб Д.М., Островская З.С. Индикация брюшнотифозной палочки в воде с помощью реакции нарастания титра фага // ЖМЭИ. 1957. -№5. - С.17.

39. Гордина Р.В. Фаготипирование паратифозных В бактерий и действие на них бактериофагов: Автореф. дис. . докт. вет. наук. М., 1954. - С.24-27.

40. Гуторова Л.Д. Фаготипирование бреславской палочки // ЖМЭИ. 1958. -№ 12.-С. 53-55.

41. Давиденко Г.П., Назарметова Н.Р., Хусаинова Н.Ш. Микрофлора ожоговой раны и ее чувствительность к антибиотикам // Кратк. тез. докл. 1 съезда мол. ученых у медиков и врачей Узбекистана. Андижан, 1991. -С.160.

42. Давиденко Т.А., Зарицкий A.M. Фаготипирование S.typhimurium, выделенных в Киеве в 1966-1970 гг. // В кн.: Кишечные инфекции. Киев, 1972.-С.41.

43. Дегтярев Ю.А. Реакция нарастания титра фага и ее применение для диагностики брюшного тифа и выявление бактерионосителей // Тез. докл. ин-та эпидемиол. и гигиены. Душанбе, 1960. - С. 12.

44. Домарадский И.В., Мосолова О.Н., Денисенко Л.К. Методика быстрого обнаружения чумного микроба при помощи бактериофага. Иркутск, 1957. - С.44-51.

45. Ершов Ф.И. Индикация дизентерийных бактерий с помощью РНФ// В кн.: Изменчивость микроорганизмов и иммунитет. М .,1959. - С. 188.

46. Грузия. Тбилиси, 2005. - С.22.

47. Жугова Т.Ч. Бактериофаги Yersinia enterocolitica: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Минск, 1985. - 20с.

48. Жукова Э.В., Ризаева А.А., Чарыева JI.K., Капитонова Ю.А.,Бердыева М.Б. Частота и этиологическая структура внутрибольничных бактериальных кишечных инфекций в детском инфекционном стацинаре // ЖМЭИ. 1992. - №5-6. - С.72.

49. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morganii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят // Автореф. дис. . канд. вет. наук. М, 1994.-20с.

50. Золотухин С.Н. Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. Ульяновск, 2004. - С.29-37.

51. Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Курс лекций по санитарной микробиологии. Ульяновск, 2002. - С.29-147.

52. Золотухин С.Н., Каврук JI.C., Васильев Д.А. Смешанная кишечная инфекция телят и поросят, вызываемая патогенными энтеробактериями. -Ульяновск, 2005. С.20-25.

53. Зыкин Л.Ф. Лабораторная диагностика пневмоний // Ветеринария Поволжья. 2003. - №2. - С. 19-21.

54. Игути Н. Частота выделения бактерий из мочи и мокроты в госпитале Керицу и чувствительность выделенных штаммов к антибиоткам // Ика-гаку кэнса. Jap. J. Med. Technol. 1991. - № 9. - С. 81 -84.

55. Иллютович А.Ю., Петрова З.С., Голубева Е.Е., Четверкина Р.С. Приме-не-ние РНФ для индикации дизентерийных бактерий флекснера в организме зараженных кроликов // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1958. - № 6. -С. 78.

56. Каврук J1.C. Роль Morganella morganii в этиологии инфекционной диареи молодняка// Ветеринария. 1986. -№3. - С.56-58.

57. Каврук J1.C. Тесты, критерии и методы ускоренной санитарно-бактериологической оценки репродуктивных помещениий животноводческих ферм и пути оптимизации в них микробиоциноза: Автореф. дисс. . докт. вет. наук. -М., 1994. С.24-26.

58. Камборатов П.И. Значение РНФ при распознавании сальмонеллеза // ЖМЭИ. 1963. - № 6. - С. 35.

59. Камборатов П.И. Клиническая оценка РНФ как метода лабораторной диагностики острой дизентерии // ЖМЭИ. 1963. - № 4. - С. 29.

60. Капырина Н.А., Бакулов И.А. Идентификация возбудителя листериоза с помощью бактериофага // Симпозиум "Профилактика и меры борьбы с лептоспирозом и листериозом с/х животных". Новочеркасск, 1972. -С. 76-78.

61. Кацитадзе Т.К. Применение брюшнотифозного фага Vi-I в РНФ // ЖМЭИ. 1963.-№3,-С. 126-127.

62. Кац-Чернохвостова Л.Я. Проблема фаготипирования брюшнотифозных и паратифозных микробов и ее эпидемиологическое значение // ЖМЭИ. 1947. -№ 8.-С. 312-315.

63. Кебу Т.И., Стасилевич З.К., Джикидзе Э.К., Крылова Р.И. Условно-патогенные энтеробактерии у здоровых и больных острыми кишечными инфекциями обезьян // Bait. J. Lab. Anim. Sci. 1998. - № 3. - С. 177 -182.

64. Килессо В.А. Идентификация сальмонеллёзных культур с помощью 0-бактериофага // Тез. докл. конф. Таллин, научн.- иссл. ин-та эпидемиол., микробиол. и гигиены. Таллин, 1960. - С.5.

65. Ковальчук В.П., Пархоменко JI.B. Особенности инициального звена при поражении кишок условно-патогенными бактериями Proteus mirabilis II Микробиологический журнал. 1991. - №6. - С.78-82.

66. Козелько О.А. Применение метода РНФ для контроля качества дезинфекции в очагах кишечных инфекций // ЖМЭИ. 1961. - № 2. - С. 3640.

67. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научной конференции ВНИИВиМ. Покров, 1992. - Ч. 11. - С.211-212.

68. Колпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листе-рий // Ветеринария. 1990. - №6. - С.31-32.

69. Коритняк Б.М. . Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Yersinia enterocolitica и их применение в диагностике // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2005. - 20с.

70. Корнилова Г.В. РНФ при индикации дизентерийных бактерий в воде в сопоставлении с бактериологическим методом // Материалы 16 межоб-ластн.научн.-практ.конф.лабор.работников в Зап. Сибири в г. Томске. -1960.-С. 20-21.

71. Кременчук Г.А., Гицевич М.А., Бояршинова К.П. Применение реакции нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. -1961.-№7.-С. 124.

72. Кривиский А.С. Вирусы против микробов М.,1962. - С.23-29.

73. Крылова М.Д. Перспективы и возможности метода фаготапирования бактерий // Материалы юбилейного симпозиума, посвящен. 50-летию Тбилисского НИИВС. Тбилиси, 1974. - С. 276-280.

74. Крылова М.Д. Применение бактериофагов для типирования бактерий //

75. В кн.: Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. М., 1961. - С. 220.

76. Крылова М.Д. Схема фаготипирования нетоксигенных дифтерийных бактерий типа gravis IIЖМЭИ. 1970. - № 12. - С. 16-22.

77. Крылова М.Д. Фаготипы бактерий. М.,1963. - С.76.

78. Кузнецов В.И., Сененко В.И., Бахарева Л.П. Этиологическая структура острых кишечных инфекций, вызванных условно-патогенными микро-ортанизмами (Иркутск, 1984-1988 гг.) // Лаб. дело. 1991. - №4. - С.62-63.

79. Кузнецова В.Н., Хазанов М.И., Ремова Т.Н. Применение реакции нарастания титра фага для индикации дизентерийных бактерий в условиях внешней среды // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 59.

80. Лебедев В.И. Опыт применения РНФ в эпидемиологической практике // ЖМЭИ. 1963. - № 12. - С. 29.

81. Лебедев В.И. РНФ как ранний метод индикации дизентерии в детских учреждениях // Тр. науч. конф. аспирантов и ординаторов I Моск. мед. ин-та. М.Д 964. - С. 105-107.

82. Лешкович Н.Л., Ермилова В.П. О диапазоне и специфичности действия чумных фагов 1701, 1710 и их мутантов // В кн.: Проблемы особо опасных инфекций.-М.,1974,-С. 38-41.

83. Литяева Л.А., Закопаева Е.С. Клинико микробиологический мониторинг за новорожденными детьми группы риска по кишечным инфекциям // Госпит. инфекции и лекарств, устойчивость микроорганизмов/ ЦНИИ эпидемиол. - М.,1992. - С.68-71.

84. Лихачев Н.В. Метод диагностики паратифа свиней при помощи бактериофага // Ветеринария. 1948. - № 7.- - С. 32.

85. Лурия С., Дарнелл Д. Общая вирусология М., «Мир», 1970. - С.36-47.

86. Мазурин Н.Д., Розина-Япкина Ц.С. РНФ при диагностике дизентерии// ЖМЭИ.- 1963.-№ 1.-С. 113-115.

87. Матвеева С.М. РНФ в диагностике брюшного тифа // Тез. докл. на меж-инстит. конф. по проблеме «Кишечные инфекции». М.,1961. - С. 146147.

88. Мац Л.И. Вопросы санитарной бактериологии и вирусологии. М.: Медицина, 1965. - С.44-59.

89. Мерджанов Г., Велев X., Петков Р. Некоторые аспекты роли бактериу-рий при хроническом пиелонефрите // Военн. мед. 1991. - №1. - С.29-32.

90. Методические указания по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции животных, утвержденные Департаментом ветеринарии Министерства селького хозяйства и Продовольствия РФ. -М., 1999.-19с.

91. Миляева Е.Н. Определение зараженности предметов бытовой обстановки дизентерийными микробами с помощью реакции нарастания титра бактериофага // ЖМЭИ. 1958. - № 12. - С. 34.

92. Мищенко В.А. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят // Ветеринария. 1999. - №9. - С.20-23.

93. Мнацканов С.Т. Энтеротоксигенность условно-патогенных энтеробак-терий при острых кишечных заболеваниях у детей // ЖМЭИ. 1983. -№6. - С.53-55.

94. Малофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Escherichia coli 0157 и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. - 20с.

95. Молочаева И.С. Особенности этиологии острых кишечных заболеваний (ОКИ) у детей в г. Душамбе // Актуал. пробл. химиотерапии бак-териал инфекций: Тез. докл. Всес. конф., 22-24 окт. 1991. М.,1991. -Ч.З.-С. 450-451.

96. Никитюк Н.М. Фаготипирование Styphimurium, выделенных на различных территориях СССР // ЖМЭИ. 1970. -№ 1. - С. 53.

97. Нурызгалиев С.Н. Фаготипирование стафилококков, выделенных от больных гнойными инфекциями // Материалы 10 научн. Сесс. Алма-Атин. гос. мед: ин-та. Алма-Ата, 1978. - С. 55-57.

98. Оливери С.А., Коростелева М.А., Кострицкий Н.Г. Опыт применения РНФ в лабораторной диагностике кишечных инфекций // Кишечные инфекции, главным образом, дизентерия: Материалы итоговой научно-практической конф. Киев, 1962. - С. 20-21.

99. Определитель бактерий Берджи // Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. М.; Мир, 1997. - Том 1. - С.221-222.

100. Островская З.С. Диагностика брюшного тифа у больных с помощью РНФ // Аннотация научной работы АМН СССР. 1956. - С. 57-59.

101. Островская З.С., Папкова Б.Н. Ускоренный метод диагностики брюшного тифа Vi-фага // ЖМЭИ. 1951. - № 2. - С. 37-40.

102. Островская Н.Н., Гольдфарб Д.М. К использованию метода нарастания титра фага для выявления бруцелл во внешней среде // ЖМЭИ. -1961,-№5.-С. 145.

103. Павлова И.П. Изучение морфологии и биологических свойств фагов

104. Вас. anthracis и Вас. cereus // ЖМЭИ. 1971. - № 7. - С. 147.

105. Парайко Е.Т., Парайко И.Н. Серологические варианты и группы протея у поросят при желудочно-кишечных болезнях // Биопрепараты, методы их стандартиз. и контроля: Всерос. гос. науч.- контр, ин-т вет. препаратов. М., 1990. - С. 157-160.

106. Поддубный Ф.Н. Изучение специфичности и чувствительности РНТФ при индикации дизентерийных бактерий в воде// ЖМЭИ. 1962. -№1. - С.29-31.

107. Покровский В.И. Энтеробактерии. М.: Медицина, 1985. - С.400-404.

108. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. - С.401-404.

109. Понявин Б.Я. Изучение реакции нарастания титра фага в условиях практической лаборатории // ЖМЭИ. 1960. - № 6. - С. 135.

110. Пожарникова Е.Н. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Enterobacter, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения: Авто-реф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2006. - С.4-19.

111. Попхадзе М.З. Использование бруцеллезного фага для дифференциации бруцелл // ЖМЭИ. 1968. - № 2. - С. 119-124.

112. Пульчеровская Л.П. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Citrobacter и их применение в диагностике: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2004. 21с.

113. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. Киев: Урожай, 1978. - С. 41-88.

114. Ревенко И.П. К диагностике рожи свиней // Ветеринария. 1970. -№6.-С. 13.

115. Рогов И.А., Нефедова Н.В., Митасева Л.Ф., Татарников И.В., Глаз-кова И.В. Микробиология мяса, обработанного высоким гидростатическим давлением // Мяс. индустрия. 1996. - №4. - С. 13-15.

116. Розова JT.B., Аранович A.M., Клюшин Н.М. Протеус-инфекция у больных хроническим остеомиелитом // Гений ортопедии. 1997. - №2. - С.73-74.

117. Рубашкина Б.К., Казакова С.Ф. Применение метода нарастания титра фага для исследования объектов внешней среды // ЖМЭИ. 1959. -№6.-С. 110-112.

118. Русалеев В.М. Фагочувствительность консервированных культур Bacillus anthracis 11 Ветеринария. 1990. - №9. - C.39.

119. Русалеев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария. 1990. - №8. - С.29-30.

120. Сергиенко Ф.Е. Новый метод бактерюлопчно д1агностики за допо-могою бактерюфага // Мкробюл. журн. АН УССР. 1936. - №1. - С. 85-112.

121. Сиволодский Е.П., Герасименко Л.М., Копейка А.А. Питательная среда Proteus PPM для одноэтапного выделения и идентификации бактерий Proteus, Providencia, Morganella 11 Клин. лаб. диагност. - 1992. -№9-10. - С.59-61.

122. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоо-патогенных микроорганизмов. М.: Колос, 1995. - С. 197-199.

123. Стронговская Н.В. Сравнительное изучение РНФ для выявления носительства дизентерийных бактерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Симферополь, 1964. - С.6-20.

124. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки // Вестник АМН СССР. 1958. - № 2. - С. 37.

125. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага (РНФ)-М, 1962.-С. 65-71.

126. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Экспериментальное обоснование нового принципа обнаружения дизентерийных и брюшнотифозных бактерий с помощью фага // ЖМЭИ. 1956. - № 10. - С. 3-7.

127. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М.: Наука, 1968.-С. 89.

128. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 259с.

129. Халитова В.И., Руссу Г.И., Семенюк С.С., Кристиан Д.А., Сербушка Л.И., Урсаки Л.П. Острые кишечные инфекции у детей, вызванные ус-ловно-патогеными энтеробактериями // Актуал. вопр. клин и теор. мед. Кишин. гос. мед. ин- т. Кишинев, 1991. - С.94-97.

130. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов. М.: «Мир», 1965. -С.288-294.

131. Хецкель С.Б., Ариэль Б.М. Пневмонии у детей с трисономией // 7 Нац. конгр. по болезням органов дыхания. М.,1997. - С.294.

132. Цветков К.И. Применение специфического фактериофага для диагностики паратифозного аборта кобыл // Ветеринария. 1941. - № 6.1. С. 4-6.

133. Чинашвили Т.Г. К механизму образования фагоустойчивых форм микроорганизмов // В кн.: Вопросы молекулярной генетики микроорганизмов. -М., 1968. С.225.

134. Чиракадзе Л.Г., Чанишвили Т.Г. Типирование S.typhimurium при помощи селекционированных фагов // ЖМЭИ. 1974. - № 3. - С. 7278.

135. Шантаренко И.В. Изучение РНФ как метода индикации бактерий дизентерии во внешней среде // Тез. докл. и выступл. на 5 Всес. научн. конф. по санитарн. микробиол. М.,1962. - С. 89-93.

136. Швиденко И.Г. Сравнительное изучение биологических свойств чувствительности и устойчивости к антибиотикам Proteus II ЖМЭИ. -1986. -№10. С.18-20.

137. Щеглова М.К. Некоторые свойства листериозного бактериофага //

138. ЖМЭИ. 1962. - № 1. - С. 99-102.

139. Энтеробактерии // Под ред. Голубевой И.В., Килессо В.А., Киселевой Б.С. с соавт.-М.Д 985. С. 57-87.

140. Adeniyi К.О., Ocholi R.A., Enurah L.U., Chima J.C., Ekhonu M.C. Notes on causes of nortality at the tos Zoo, Nigeria from 1977-1987 // Himalayan J. Environ and Zool. 1991. - № 1. - P. 1-4.

141. Avril I.L., Mesnard R., Roche G., Pouedras P. Place et sensibilite aux antibiotiques des Enterobacteriaceae Responsables d'infections urinaires // Sem. hop. Paris. 1993.-№4.-P. 81-86 .

142. Canderton L., Chawla J.C., Wimpenny J., Winters C., Stickler D.J. A scannino electron microscope study of biofilm on bladder cathefers // Sth Eur. Condr. Clin. Microbiol, and Infect. Diseases. Olso, Sept. 9-11. Olso, 1991.-P. 170.

143. Coetzee J.N. Bacteriocinony in strains of. Providencia and Proteus mor-ganii // Nature. 1967. - V.213. - P. 614-616.

144. Delia S., Fiumara M.A., Lagana P., Iannuzzi L., Lo Schiavo A., Minniti A., Panebianco A. Ricerca di Yersinia enterocolitica in carni fresche ed insaccate // Ann. ig.: Med prev comunita. 1989. - №6. - P.1459-1464.

145. Deutrich Ven V., Pioch Gudrun. Infektionsrisiko fur Mensch und Tier durch langjahrig gelagerte Rindergulle // Monatsh. Veterinarmed. 1991. -№18.-P. 651-655.

146. Edwards P.R., Ewing W.H. Identification of Enterobacterjaceae. Burgess publ. Co. Minneapolis, 1972. - P. 223-227.

147. Engler Howard D„ Troy Kevin, Bottone Edward J. Bacteremia and subcutaneous abscess caused by Proteus penneri in a neutropenic host // J. Clin. Microbiol. 1990. - №7. - P. 1645-1646.

148. Gomez A., Baguero F., Nombela C. El genero Proteus Aspectos pato-genicos у epidemiolodicos // Enferm. in fece. у microbiol. Clin. 1991. -№8.-P. 498-505.

149. Guibert Jacgueline. I infection urinaire sur sonde a demeure // Tempo med.- 1991.-№433.-P. 29-30.

150. Hoffmann Nannette, Jenkins Robert, Putney Karen. Nosocomial infection rates during a one-year period in a nursing home care unit of a Veterans administration hospital // Amer. J. Infec. Contr. 1990. - №2. - P.55-63.

151. Hussain Naqvi Zafar, Ansari Fasihuddin Ahmed, Khatoon Hajra. Multiple anitbiotic resistance amond gram negative bacteria isolated from fresh water fish Labeo rohita // Pakistan J. Zool. 1990. - №2. - P. 141-147.

152. Ishii Yukilco, Suzuki Yumiko, Ishihara Rika, Nakazawa Arisa, Deguchi Koichi. Антимикробная активность цефетамета против бактерий, выделенных из инфицированного мочевого тракта // Jap. J. Antibiot. 1996. -№12.-P. 25-36

153. Kauffmann F. On the classificacion and njmenclature of family Entero-bacteriaceae // Intern. Bull. bact. Nomencl. a. Taxonom. 1959. - V.9. - P. 1-8.

154. Kauffmann F. On the claccificion and nomenclature of family Entero-bacteriaceae // Internat. Bull. bact.Nomencl. a. Taxonom. 1963. - V.13. -P.187-193.

155. Katzheson H. Sutton M.D. Rapid phage plague count method for the detection of bacteria as applied to the demonsration of internalug borne bacterial infections of seed // J. Bact. 1951. - № 1. - P. 689.

156. Ketti I. A study of Escherichia coli from farm animals during // Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1981. - V.28.-P. 393-398.

157. Lamikanra A., Fayinka Susan Т., Olusanya O.O. Transfer of lomw level trimethoprim resistance jn faecal isolates obtained from apparently healthy Nigerian students // FEMS Microbiol. Lett. 1989. - №3. - P. 275-278.

158. Lautrop H. Genus X. Proteus hauser, 1885 // Bergey,s manual of deter-minantive bacteriology. 8 Ed. Baltimore, 1974. - P. 327-330.

159. Levintal C., Fisher A. Structural developmet of a bacteriae virus // Bio-chim. Biophys. Acta. 1952. - №4. - V.9. - P. 419.

160. Lindberg R.B., Latta R.L. Phage tuping of Ps.aeruginosa chinical and epidemiologi considerations // J. Infect. Diseases. 1974. - №5. - V.130. -P. 32-34.

161. Lukomski Stawomir, Muller Bodo, Schmidt Gunter. Extracellular haemolysin of proteus penneri coded by chromosomal hly genes is sjmjlar to the a-haemolysin of Escherichia coli // Zbl. Bateriol. 1990. - №2. - C. 150-155.

162. Marti Masias J., Conesa M.D., Cervantes M. Infecciones urinarias en adultos de edad avanzada // Rev. esp. geriatr у gerontol. 1992. - №3. - C. 160-163.

163. Mazyrova J., Vinter P. Ucin nost vybranych antibiotik na mikroorgan-ismy kontaminujici ejakulaty kancu // Vet. med. 1991. - №4. - P. 213-223.

164. McHenry Martin C., Rehm Susan J., Krajewski Leonard P., Duchesneau Paul M., Levin Howard S., Steinmuller Donald R. Vertebral osteomyelitis and aortic lesions: case report and review // Rev. Infec. Diseases. 1991. -№6. -P. 1184-1194.

165. Mercier P., Rideaud Patricia. Bacteriologie du sperme frais de larin: Etude preliminaire // Prod. anim. 1990. - №3. - P. 215-221.

166. Murphy F.A., Fauguet C.M., Bishop D.H.L., Ghabrial S.A., Jarvis A.M., Martelli G.P., Mayo M.A., Summers M.D. Virus Taxonomi. Classification and Nomenclature of Viruses. Wien: Springer Verlag, 1995. - 586 p.

167. Navarro Ferran, Fuentes Irene, Izquierdo Conchita, Sanchez Ferrari, Prats Guillermo. Evaluacion del medio cromogenico CPS ID2{R} (bioMerieux) en urinocultivos // Enferm. infecc. у microbiol. Clin. 1996. -№4.-P. 215-216.

168. Old D.C., Adegbola R.A. Hemagglutinins and Fibrial of Morganella, Proteus andProvidencia // J. Med. Macrobiol. 1982. - №4. - V.15. - P. 551-564.

169. Panda P.C., Sharma D.P. Bacterial contamination and spoilage of duck eggs // Haryana Agr. Univ. J. Res. 1996. - P. 83-86.

170. Papapetropoulou M., Pagonopoulou 0., Kouskouni E. Prevalence and sensitivity to antibiotics of Enterobacteriaceae isolated from urinary cultures in some microbiology laboratories of a city in West Greece // Pathol. Biol.1997.-№ 9.-P. 716 720.

171. Quentin R., Pierre F., Dubois M., Soutoul J.H., Goudeau A. Frequent isolation of capnophilic bacteria in aspirate from Bartholin s gland abscesse and cysts // Eur. J. Clin. Microbiol, and Infec. Diseoses. 1990. - №23. - P. 138-141.

172. Ramos C., Cruz M., Frada M. Estudio sobre la comunidad bacteriana en albanal domestico у su tratamiento mediante lechos biologicos Volun hidraul. 1991. - №85. - P. 28-31.

173. Sechter I.O. Metodika de cercetare a prezentei bacilului tifis in materufacale ajutorole bacterofagului // V. Academje RPSH Filialr Vasi Studii si cercetari Stintifie. Ann. 1962. - №3-4. - V.4. - P. 99.

174. Sekaninova G. Proticine typing of proteus mirabilis strains in patients with chronic urinary tract infections // Scr. med. №5-6. - 1995. - P. 187194.

175. Ugochukwu E.I., Anukam K.U. Isolation of enterobacteria from diar-rhoeic West African dwarf goats // Microbios. 1988. - №224-225. - P. 155-160.

176. Ugochukw E.I., Agwu C.O. Aerobic bacteria from nasal discharge of goats suffering from clinical PPR: isolation and identification // Microbios. -1991. -№263. P. 81-85.

177. Urbanova E., Manova K., Pacova Z. Bacteria of the tribe proteeae occurrence in raw materials and food, and resistance to antibiotics // Vet. med. -2000,-№6.-P. 171-176.

178. Watts J.R., Wright P.J., Whithear K.C. Uterine, cervical and vaginal microflora of the normal bitch throughout the reproductive cycle // J. Small Anim. Pract. 1996. - №2. - P. 54-60.

179. Wawrzyniak Wawrzynies, Grawiski Edward. An attempt diadnosis etiology an pathogenesis of ulcer and necrptic foci of some baltic fishes // Asta ichthyol. et. pise. 1991. - №1. - P. 43-58.

Информация о работе

Феоктистова, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Ульяновск, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов рода Proteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров практического применения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы