Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические параметры разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические параметры разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания"

На правах рукописи

Мустафин Али Хамзеевич

Биотехнологические параметры разработки фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 май 2G12

Саратов - 2012

005043568

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич

кандидат биологических наук, доцент Феоктистова Наталья Александровна

Официальные оппоненты:

Дьпсман Лев Абрамович доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН», ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Морозов Николай Васильевич доктор биологических наук, профессор

ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической

безопасности» (г. Казань)

заведующий лабораторией биотехнологии с основами микробиологии

Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского»

Защита диссертации состоится «31» мая 2012 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВІІО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан «2&> апреля 2012 года.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Контаминация пищевого сырья и продуктов питания бактериями Bacillus subtilis на всех этапах технологического процесса — это серьезная проблема перерабатывающей промышленности. Эти почвенные сапрофиты встречаются повсеместно, отличаются высокой температурной устойчивостью, солетолерантны и способны продуцировать токсины (Крючков, 2006; Бахаровская, 2011). При контаминации бациллами пищевое сырье и выработанные из него продукты питания зачастую не изменяют свои органолептические свойства, поэтому определить их присутствие в пище невозможно до тех пор, пока у потребителя не появятся симптомы интоксикации (Мерчина, 2004; Калдыркаев, 2009). Пищевые токсикозы, вызванные бактериями В. subtilis, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход (Мирзоева 1957; Пучкова, 2005, Медведев, 2010).

Учитывая сложность лабораторной диагностики, остается актуальной проблема унифицированной схемы бактериологического исследования, повышается значимость бактериофагов как высоко специфичного инструмента для индикации микроорганизмов, позволяющего точно идентифицировать пищевые контаминанты, а также осуществлять более детальную дифференциацию отдельных биотипов и фаговаров внутри вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия бактериофагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые пггаммы в пределах одного вида (Ковалева, 2009; Шестаков, 2010). Поэтому все большее число исследователей предпочитают использовать фаговые тесты, как высокоспецифичнын метод, способный дифференцировать близкородственные штаммы (Золотухин, 2007; Феоктистова, 2011).

Типовые высокоспецифичные бактериофаги — это биоиндикаторы, благодаря которым можно проводить определение бактерий отдельных видов, иметь возможность установить источник и путь передачи инфекционного заболевания, т.е. провести его эпидемиологический анализ. Так в Канаде в промежуток с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов Bacillus cereus, причастных к 18 вспышкам пищевого отравления. Из них 142 штамма было разделено на 17 типов фагов (Ahmed, 1995).

В настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики фагоиндикации и фагоидентификации бактерий В. subtilis в объектах санитарного надзора. Использование подобных методик позволит в сжатые сроки типировать бактерии вида В. subtilis, используя минимальное количество расходных материалов и трудозатрат в течение 25 часов.

Цель работы - разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis d пищевом сырье и продуктах питания.

Задачи работы:

1. Изучить распространение бактерий В. subtilis в пищевых продуктах.

2. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий B.subtilis.

3. Селекционировать и изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность,

температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, изменение литической активности при хранении) вьщеленных бактериофагов.

4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий В.

6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий В. тЬШк в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания тигра фага с использованием созданного биопрепарата.

7. Разработать схему идентификации бактерий В. зиЬНШ с помощью бактериофагов.

Научная новизна. Выделены из объектов санитарного надзора и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги В. из них отобраны

наиболее оптимальные специфические бактериофаги Вэ-13 УГСХА и Вэ-16 УГСХА для создания биопрепарата.

Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата и усовершенствована схема фагоиндикации В. яиЫШх в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с применением созданного биопрепарата.

Усовершенствована схема выделения и идентификации бактерий вида В. зиЫШя в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата

Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема фагоидентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать штаммы бактерий В. бнЫШя из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Сконструирован диагностический биопрепарат на основе специфичных бактериофагов и усовершенствована схема индикации бактерий В. яиЪИШ методом реакции нарастания титра фага (РИФ) в течение 25 часов.

По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 февраля 2010 г.) «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Вэ-13 УГСХА и Вэ-16 УГСХА для индикации и идентификации бактерий В. ¡иЫИт, «Методические рекимендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий В. виЫШз в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Схема выделения бактериофагов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям В. зиЫШх, изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.

2. Биопрепарат, созданый из селекционированных фагов бактерий В. зиЫШя и технологические параметры его изготовления.

3. Схема идентификации бактерий В. subtilis разработана с применением биопрепарата на основе фагов Bs-13 УГСХА и Bs-16 УГСХА ускоряющая определение видовой принадлежности В. subtilis.

4. Схема ускоренной индикации бактерий В. subtilis в объектах санитарного надзора разработана с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) и использованием созданного биопрепарата.

Апробация работы:

Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК» (Москва, 2009); Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура н объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, включают 33 таблиц и 7 рисунков. Список использованных литературных источников включает 157 наименования, в том числе 30 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований

Объекты исследований: 40 штаммов бактерий Bacillus subtilis, из них 5 музейных штаммов из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-саннтарной экспертизы Ульяновской ГСХА; 5 музейных штаммов из лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГиЭ; 30 штаммов выделены из проб пищевых продуктов и объектов санитарного надзора Штаммы бактерий гетерологичных видов, родов и семейств: Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Y.enterocolitica, В. cereus, В. mycoides, В. megaterium, В. mesentericus, В. thuringiensis полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГОУ ВПО

«Ульяновская ГСХА».

Штаммы бактериофагов - 22 изолята бактериофагов В. siibiilis, выделенные из объектов санитарного надзора Ульяновской и Самарской областей.

В качестве объектов использовали пищевые продукты, купленные на продовольственных рынках г. Ульяновска, г. Самары, г. Геленджика, г. Сочи и г. Сенгилея, комбикорм, пробы почвы и сточных вод.

Методы: Для выделения бактерий В. subtilis использовали общепринятые схемы (Затула, 1973; Смирнов, 1982.).

Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными М. Адамсом (1961), Д.М. Гольдфарбом (1961), Л.И. Адельсоном (1962), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), A.C. Тихоненко (1968), Т.Г. Чинашвили (1968), И.М. Габриловичем (1973), И.П. Ревенко (1978), BJL Ганюшкиным (1988). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной И.М. Габриловичем (1992), СЛ. Золотухиным (1994). Обнаружение бактерий В. subtilis в водопроводной воде, кормах и пищевых продуктах проводили с помощью реакции нарастания титра фага. Реакцию нарастания титра фага ставили по методикам В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), ВЛ. Ганюшкина (1988).

Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми статистическими методами (Бейли, 1962; Ашмарин, Васильев, Амбросимов, 1974; Урбах, 1975). Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение бактерий В. subtilis из объектов санитарного надзора

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий В. subtilis из объектов санитарного надзора. В период с 2008 по 2010 год было исследовано на наличие бактерий В. subtilis 74 пробы пищевых продуктов, приобретенных в Ульяновской, Самарской областях и Краснодарском крае, уровень контоминации исследованых пищевых продуктов бактериями В. subtilis составил 41 %. В результате проведенных исследований было выделено 30 культур бактерий, которые мы классифицировали по ферментативным свойствам (на основании тестов, описанных в литературных источниках и результатах изучения биохимических свойств штаммов бактерий вида В. subtilis, полученных из музея кафедры МВЭ и ВСЭ УГСХА) и отнесли к В. svbtilis (табл. 1).

Таблица 1—Выделенные культуры бактерий В. subtilis

№ п.п Номер культуры и присвоенное название Объект выделения культуры Место получения пробы

1 2 3 4

1. №! — Bacillus subtilis 1 Перец черный Прод. рынок г. Ульяновска

2. №2 — Bacillus subtilis 2 Мускатный орех Прод. рынок г. Ульяновска

3. Л13 — Bacillus subtilis 3 Кориандр Прод. рыпок г. Ульяновска

4. №4 — Bacillus subtilis 4 Смесь спетой для плова Прод. рынок г. Ульяновска

5. №5 — Bacillus subtilis 5 Смесь специй для шашлыка Прод. рынок г. Ульяновска

6. №6 — Bacillus subtilis 6 Мука пшеничная Прод. рынок г. Ульяновска

7. №7 — Bacillus subtilis 7 Мука пшеничная Прод. рынок г. Самары

8. №8 — Bacillus subtilis 8 Молоко коровье Прод. рынок г. Сенгилей

9. Л"?9 — Bacillus subtilis 9 Молоко коровье Прод. рынок г. Ульяновска

10, MIO -Bacillus subtilis 10 Молоко коровье Прод. рынок г. Самары

11. Nsll— Bacillus subtilis 11 Мясной фарш Прод. рынок г. Ульяновска

12. N°12 — Bacillus subtilis 12 Лавровый лист Прод. рынок г. Сочи

13. № 13 - Bacillus subtilis 13 Сухой чеспок Прод. рынок г. Геленджик

14. Nl 14 - Bacillus subtilis 14 Смесь специй доя мяса Прод. рынок г. Ульяновска

15. №15 — Bacillus subtilis 15 Перец черный Прод. рынок г. Ульяновска

16. jVsló— Bacillus subtilis 16 Мясо свинина Прод. рынок г. Самары

17. №17 - Bacillus subtilis 17 Мясной фарш Прод. рынок г. Самары

18. №18- Bacillus subtilis 18 Молоко коровье 1 Прод. рынок г. Самары

Продолжение таблицы 1

1 2 3 4

19. №19 — ВасШш аиЫШз 19 Смесь специй для плова Прод. рынок г. Геленджик

20. №20 - ВасШш ¡иЬПШ 20 Лавровый лист Прод. рынок г. Ульяновска

21. №21 - ВасШш зиЫШз 21 Мясо баранина Прод. рынок г. Самары

22. №22 - ВасШш я&ИШ 22 Мясной фарш Прод. рынок г. Ульяновска

23. №23 - ВасШиз ьиЫШз 23 Мясо говядина Прод. рынок г. Самары

24. №24 — ВасШш ьиЫШз 24 Мука пшеничная Прод. рынок г. Ульяновска

25. №25 — ВасШш зиЪгШз 25 Перец черный Прод. рынок г. Ульяновска

26. №26— ВасШш зиЫШз 26 Мука пшеничная Прод. рынок г. Ульяновска

27. №27 - ВасШш хиЫШз 27 Корина Прод. рынок г. Самары

28. №28 - ВасШш шЫШя 28 Молоко коровье Прод. рынок г. Ульяновска

29. №29 - ВасШш аиЬПШ 29 Молоко коровье Прод. рынок г. Ульяновска

30. N»30— ВасШш виЫШз 30 Сухой чеснок Прод. рынок г. Сочи

Все выделенные бактерии имели форму палочки размером 3 - 5 х 0,6 мкм, споры имели овальную форму не превышающие размер клетки. Грамположнтельные, подвижные, колонии сухие, мелкоморщинистые, бархатистые, в основном бесцветные. Положительно реагировали на глюкозу, сахарозу, сорбит, мглнозу, арабинозу, маннит, с ферментацией сахара и образованием кислоты, газа

Поиск и селекция бактериофагов

Следующим этапом работы было выделение фагов бактерий В. БиЫШз из имеющихся штаммов бактерий В. яиЬШк. Мы предполагали возможное наличие лизогенных культур, так как бактериофаги, выделенные из них, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985; Шесгаков, 2010). В первой серии опытов использовали методику выделения бактериофагов бацилл без воздействия на них индуцирующего фактора. Во второй серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором (применялось воздействие на бактерии ультрафиолетовых лучей в течение 5-20 минут при помощи бактерицидной лампы, 80 % энергии которой приходится на длину волны 2537 А, на расстоянии 50 см между лампой и объектом). Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах В. тЫИи методом агаровых слоев. В наших исследованиях нам не удалось выделить фаги бактерий В. $иЫШ$.

Дальнейшая наша работа была посвящена выделению бактериофагов из

объектов внешней среды (Адаме, 1962; Адельсон, 1962). При исследовании 10 проб сточных вод, 32 проб почвы и 40 проб пищевых продуктов удалось выделить 22 изолята фагов бактерий В. sublilis. Для получения чистой линии фага проводили до десяти пассажей из изолированных негативных колоний (Габрилович, 1992, Золотухин,1994).

Характеристика выделенных фагов бактерий В. subtilis

Морфология негативных колоний. Морфологию негативных колоний изучали при посевах фагов методом агаровых слоев (Грациа, 1936). Негативные колонии, образуемые выделенными бактериофагами, были разделены нами на два типа. 1 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 1,0 — 2,5 мм в диаметре; 2 тип: прозрачные негативные колонии округлой формы, 2,6 - 4,0 мм в диаметре.

Спектр литического действия. Дня изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 35 штаммов бактерий В. subtilis, исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Ганюшкин, 1988). Наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов Bs-ІЗ УГСХА и Bs-16 УГСХА, которые лизировали 32 штамма В. subtilis из 35 изученных штаммов, что составляет 91,5 % (табл. 2)

Литическая активность. Литическую активность выделенных бактериофагов определяли методом агаровых слоев (Грациа, 1936; Ревенко, 1978). Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что выделенные бактериофаги обладали различной литической активностью, показатели которой колебались от 1,7 х 106 до 8,0 х 109 корпускул в 1 мл фага (табл. 2). Наиболее высокой литической активностью обладали фаги Bs-ІЗ УГСХА и Bs-16 УГСХА: титр по Грациа 2,8 х 109 и 8,0 х 10°, соответственно.

Для дальнейших исследований по конструированию биопрепарата было отобрано два фага Bs-ІЗ УГСХА и Bs-16 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами литической активности и широким спектром литического действия.

Биопрепарат на основе бактериофагов должен бьпь высокоспецифичным, термоустойчивым, сохранять свою литическую активность при хранении в течение 12 месяцев.

Таблица 2 - Характеристика выделенных фагов бактерий В. subtilis

№ Бактериальная культура В. subtilis / название фага Хар-ка негативных колонии, мм в диаметре Спектр литического действия на 35 штаммах,% Количество корпускул в 1 мл фага (Грациа, 1936)

1 2 3 4 5

1. Bacillus subtilis 61 /Bs - 1 УГСХА 2,6-3,0 48,6 3,5 х 10'

2. Bacillus subtilis 3/ Bs - 2 УГСХА 3,0-4,0 42,9 1,0 х 105

3. Bacillus subtilis ЗП/ Bs - 3 УГСХА 1,0 71,4 2,2 х 10'

Продолжение таблицы 2

1. 2 3 4 5

4. ВасШиззиЫШз 98/Вэ-4 УГСХА 1,0-1,5 51,4 2,4x10"

5. ВасШиз виЫШь 8 / Вб - 5 УГСХЛ 0,5-1,0 37,1 2,0x10'

6. ВасШиз яиЫШз 21 / Вб - 6 УГСХА 1,0-1,3 34,2 6,0x105

7. ВасШиз зиЫШз 17 / Вб - 7 УГСХА 1,0-1,5 20,0 4,0 х 10'

8. ВасШиз яиЫШз 5 / Вэ - 8 УГСХА 1,0-1,5 28,6 1,7 x10й

9. ВасШиз йиЬйИз 16 / Вб - 9 УГСХА 1,0 22,9 2,4x10'

10. ВасШиз тЫШх 32/Вэ- 10 УГСХА 1,0-1,5 25,7 3,0 х 10"

11. ВасШизииЫМз Ю/Вз— 11 УГСХА 2,6-3,0 31,4 1,0 х 10"

12. ВасШга зиЫШя 12 / Вэ - 12 УГСХА 1,0-1,5 34,3 4,0 х 10'

13. ВасШиз зиЫШз 26 / Вб - 13 УГСХА 6,0-8,0 80,0 2,8 х 10у

14. ВасШиз зиЫШз 23 / Вэ - 14 УГСХА 1,0 22,9 2,4 х 108

15. 1 ВасШиз зиЫШз 12 / Вэ — 15 УГСХА 1,5 28,6 4,0x10'

16. ВасШиз зиЫШз 4 / Вэ — 16 УГСХА 2,6-3,0 88,6 8,0 х 109

17. ВасШиз зиЫШз 19/Вб- 17 УГСХА 1,5 17,1 1,5x10'

18. ВасШиз зиЫШз 4 / В в - 18 УГСХА 1,0-1,5 54,3 5,1 х 10*

19. ВасШиз зиЬиШ 31 /Вз - 9 УГСХА 1,0-1,5 37,2 3,0 х 10'

20. ВасШиз зиЬИШ 25 / Вэ - 20 УГСХА 3,0-3,5 20,0 1,2x10'

21. ВасШиз зиЬИШ 27 / Вб - 21 УГСХА 2,6-3,0 51,4 2,0x10'

22. ВасШиз зиЫШз 14 / Вэ - 22 УГСХА 2,0-2,5 28,6 3,4 хЮ8

Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата

Результаты определения оптимальных температурных показателей культивирования свидетельствуют о том, что оптимальной является температура культивирования биопрепарата на основе фагов - 37 °С. Нами решено инкубировать систему специфических бактериофагов Bs - 13 УГСХА и Bs -16 УГСХА с клетками В. subtilis при температуре 37 °С. Установлено оптимальное соотношение бактериофага Bs - 13 УГ'СХА и культуры В. subtilis 26-1 : 5, т.е. 0,2 мл фагах 1 мл индикаторной культуры, оптимальное время пассажа при температуре 37 °С составляет 6 часов (параметры культивирования бактериофага Bs - 16 УГСХА с культурой В. subtilis 4 атлогичны). За это время происходил лизис индикаторной культуры (растворение характерной пленки на поверхности МПА по сравнению с контролем). Очистка фагов от бактериальных клеток осуществлялась нами методом фильтрации с использованием мембранных фильтров фирмы Millipore (filter type: 0Д2 цт GV).

Спектр литического действия биопрепарата

Для изучения спектра литического действия биопрепарата на основе бактериофагов Bs - 13 УГСХА и Bs - 16 УГСХА мы использовали дополнительно 5 штаммов бактерий В. subtilis из музея ВНИИВСГиЭ. Результаты опыта представлены в таблице 2. Совокупный процент лизиса биопрепаратом на 40 штаммах бактерий В. subtilis составил 95,0 % (табл. 3).

Таблица 3 - Спектр литического действия биопрепарата

Название бактериофага Количество исследуемых культур Из них чувствительны к фагу Процент лизируемых культур

Вз- 13 УГСХА 40 31 77,5

Вв- 16 УГСХА 40 34 85,0

Процент лизиса исследуемых культур бактериофагами Вэ-13 УГСХА; Вз — 16 УГСХА 95,0

Специфичность действия биопрепарата

Изучение специфичности двух бактериофагов В. subtilis (Bs — 13 УГСХА, Bs -16 УГСХА) проводили по отношению к представителям гетерологичных семейств и родов с использованием штаммов: spp. Morgcmella - 6 штаммов, spp. Klebssiella - 6 штаммов, spp. Salmonella - 6 штаммов, spp. Staphjlococcus - 4 штамма, spp. Streptococcus - 2 штамма spp. Pseudomonas - 4 штамма, Y.enterocolitica - 12 штаммов; и гомологичного рода: В. cereus - 25 штаммов, В. myeoides - 15 штаммов, В. megaterium - 14 штаммов, В. mesentericus - 18 штаммов, В. thuringiensis - 4 штамма Полученные результаты позволяют сделать вывод, что биопрепарат неактивен к представителям бактерий гетерологичных видов, родов и семейств. В рамках диссертационных исследований проведены исследования по изучению температурной

устойчивости биопрепарата и его устойчивости к воздействию хлороформа Установлено, что бактериофаги В. subtilis (Bs — 13 УГСХА, Bs - 16 УГСХА) при воздействии температуры в диапазоне 64 - 76 °С не понижали своей литической активности. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о выраженной устойчивости биопрепарата к воздействию хлороформа.

Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий В. subtilis

Используя строгую специфичность биопрепарата, нами была разработана схема ускоренной идентификации бактерии В. subtilis по показателям лизиса культур на плотной питательной среде («метод стекающей капли»). Разработанная нами схема (рис. 1) позволяет идентифицировать бактерии В. subtilis за 48 часов (2 суток). Срок бактериологического исследования по традиционной схеме вьщеления и дифференциации бацилл первой морфологической группы (Gordon, 1973), составил 96 часов (4 суток) при больших затратах посуды и реактивов.

I II

«

о о

X

н >»

Я Я о сч

а в*

ts

I Итого: 25 часов

II Итого: 96 часа (4 суток)

Рис. 1. Схема ускоренной идентификации бактерий Я subtilis с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой вьщеления и дифференциации бацилл первой морфологической группы (П)

Изменение литической активности при хранении

Для разработки технологических параметров изготовления биопрепагара из фагов Вв - 13 УГСХА и Вэ - 16 УГСХА необходимо было установить изменение литической активности указанных штаммов при хранении в условиях 2 - 4 °С. Полученные результаты свидетельствуют о том, что селекционированные бактериофаги В. шЫНЬ при хранении в условиях 2 — 4 °С в течеште 12 месяцев незначительно снижали логическую активность до 108 фаговых корпускул в 1 см3.

Определение параметров постановки реакции нарастания титра фага с биопрепаратом на основе фагов В. шЬШк

Определение параметров постановки реакции нарастания титра и разработку количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методике, предложенной В.Д. Тимаковым и Д.М. Гольдфарбом (1962). Проведены эксперименты с использованием МПБ, контаминированного 18 часовыми индикаторными культурами В. зиЫШз 26 (для фага Вб - 13 УГСХА) и В. хыЫШб 4 (для фага Вэ - 16 УГСХА) от 101 до Ю3 м.к./мл. В качестве контроля был использован интактный МПБ. Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования, согласно оценке, предложенной В.Я. Ганюшкиным (1988). Установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации бактериями В. виЫШй МПБ в концентрации 102 м.к./мл.

Для определения оптимального времени, обеспечивающего наиболее полное взаимодействие фага с бактериями необходимо было провести эксперименты на тест-объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РИФ. В качестве тест - объекта использовали МПБ, контамннированный бактериями В. яиЫШз.

Полученные экспериментальные данные позволяют считать наиболее оптимальным временной режим реакции нарастания титра фага (РНФ) при 6 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом без дополнительного подращивания, когда удается провести индикацию бактерий бактерии В. зиЫШз в количестве 102 м.к. в миллилитре исследуемого субстрата. На исследование затрачивается 25 часов (0,5 часа - подготовка реакции + 6 часов - время экспозиции субстрата с фагом + 0,5 часа - постановка реакции + 18 часов — время термостатирования). Увеличение времени инкубирования до 10 - 24 часов не повышает чувствительность метода. Схема постановки РНФ с применением биопрепарата (рис, 2).

Реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз (Гашошкин, 1988)

Исследуемый материал Биопрепарат МПБ

9,0мл 9,0мл

Пробирка №1 6 ч 37 °С 0,25мл

1,0мл 1,0мл

Пробирка №2 6 ч 37 °С 0,25мл

1,0мл 9,0мл

Пробирка №3 6 ч 37 °С 0,25мл

Пробирка с 4,5 мл МПБ ч\з мембранный фильтр 1,0 мл

Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №1 1,5% МПА 18 ч 37 °С

Пробирка с 4,5 мл МПБ Пробирка с 4,5 мл МПБ ч\з мембранный фильтр ч\з мембранный фильтр 1,0 мл 1,0 мл

Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №2 1,5% МПА 18 ч 37 °С

Пробирка с 2,5мл 0,7% МПА + 0,2мл индикаторной культуры

чашка Петри №3 1,5% МПА 18ч 37°С

Рис. 2. Схема постановки реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата

Разработка схемы постановки реакции нарастапия титра при помощи селекционированных бактериофагов с образцами объектов санитарного надзора

Пробы образцов объектов санитарного надзора (водопроводная вода, комбикорм, специи, мясо) в объеме 10 г (мл) вносили в колбы и коптаминировали штаммами В. зчЬШ'и 26 и В. зиЫШз 4 в концентрации 101 - Ю5 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г (мл) пробы. Пробы мяса (кусочки свинины) растирали в фарфоровой ступке. Для контроля использовали колбы с пробами, неконтаминированными бактериями В. .чиЫШз 26 и В. зиЫШз 4 (рис. 2).

По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов В8-13 и В8-16 серии УГСХА в 5 раз произошло при концентрации 102 м.к. бактерий В. виЫШз в 1 мл водопроводной воды и 10' м.к. бактерий В. ьиЬйИз - в 1 г комбикорма, специй и мяса.

Для оценки эффективности реакции нарастания титра фага в условиях производства нами были проведены исследования по фагоиндикации бактерий В. subtilis в пробах молока. Обнаружение проводили бактериологическим методом и с помощью РНФ.

При исследовании 11 проб молока бактериологическим методом бактерии вида В. subtilis выделялись в концентрации 104 - Ю5 м.к./мл, а в РНФ - 103 м.к./'мл Результаты исследований свидетельствуют о более высокой чувствительности РНФ при обнаружении бактерий В. subtilis в пробах молока в сравнении с бактериологическим методом исследования при меньшей затрате времени (96 часов), реактивов и посуды.

Выводы

1. Обнаружено 30 культур бактерий вида В. subtilis при исследовании 74 проб объектов санитарного надзора. Уровень контаминации исследуемых пищевых продуктов бактериям В. subtilis составил 41 %.

2. Выделено из объектов внешней среды 22 изолята фагов, активных по отношению к бактериям В. subtilis, и изучены биологические свойства их изолягов (морфология негативных колоний, спектр лишческого действия, литическая активность).

3. Изучены биологические свойства бактериофагов и выбраны два штамма фагов Bs - 13 УГСХА и Bs - 16 УГСХА, которые имели титр 2,8 х 109 - 8,0 х 109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам бактерий В. subtilis, не лизироваликулыуры представителей родов Morganella, Klebssiella, Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, вида Yersinia enterocolitica; и гомологичного рода: Bacillus cereus, Bacillus lnycoides. Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus thuringiensis, сохраняли литическую активность в пределах Ю8 — 109 в течении 12 месяцев при хранении в условиях 2 — 4 °С, были термостабильными и хлороформоустойчивыми.

4. Установлено что оптимальными технологическими показателями для изготовления специфического биопрепарата на основе фагов Bs - 13 УГСХА и Bs - 16 УГСХА с высокой литической активностью являются: соотношение количества фаговых корпускул к количеству бактериальных клеток индикаторного штамма 1 : 5, оптимальное время инкубирования при температуре 37 °С — 6 часов,

5. Разработаны биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для фагодиагностики бактерий В. subtilis.

6. Разработана схема ускоренной индикации бактерий В. subtilis с помощью реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора с использованием биопрепарата на основе фагов Bs - 13 УГСХА и Bs - 16 УГСХА, которая позволяет обнаружить их за 25 часов.

7. Разработана схема идентификации бактерий В. subtilis с помощью сконструированного фагового препарата, позволяющая идентифицировать их в два раза быстрее (48 часов), в отличие от бактериального метода.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мустафин А.Х., Феоктистова H.A. Методика выделения Bacillus subtilis И Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы международной научно - практической конференции посвященной 65 - летшо УГСХА. Ульяновск, 2008. 4.IV. С. 100-102.

2. Мустафин А.Х., Феоктистова H.A. Контаминация бактериями вида Bacillus subtilis пищевых продуктов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы междунар. науч. практ. конф. посвященной 65-летию УГСХА. Ульяновск, 2008.4.IV. С. 102-104.

3. Воздействие теотропина на бактерии видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis I A.X. Мустафин, H.A. Феоктистова, Н.Х. Курьянова [и др.] // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения: материалы междунар. науч. практ. конф. Ульяновск, 2009. Т.4. С. 55—57.

4. Мустафин А.Х., Феоктистова H.A., Васильев Д.А. Роль Bacillus subtilis в обсеменении пищевых продуктов // Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК: материалы всероссийской науч. практ. конф. Москва, 2009. Т.2. С. 70-72.

5. Изучение биологических свойств выделенных фагов бактерий вида Bacillus subtilis / A.X. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] И Молодежь и наука XXI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.З. С. 65-70.

6. Выделение бактерий вида Bacillus subtilis из объектов санитарного надзора / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Молодежь и наука XXI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.З. С. 72-76.

7. Поиск фагов бактерий вида Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, ДА. Васильев [и др.] II Молодежь и наука XXI века: материалы междунар. науч. практ. конф. молодых ученых. Ульяновск, 2010. Т.З. С. 76—78.

8. Разработка фаговых препаратов индикации и идентификации бактерий рода Bacillus в пищевом сырье и продуктах питания / А.Х. Мустафин, НА. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее: материалы всероссийского симпозиума с международным участием: посвященного 90 - летию Заслуженного профессора Московского университета Н.С. Егорова. Москва, 2011. С. 86-87.

9. Анализ изменений литической активности фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis при хранении / A.X. Мустафин, H.A. Феоктистова, М.А. Юдина [и др.] // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы международной науч. практ. конф. Ульяновск 2011. Т.1. С. 188-189.

10. Изменение чувствительности бактерий рода Bacillus subtilis к различным концентрациям хлорида натрия / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, А.И. Калдыркаев [и др.] // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы международной науч. практ. конф. Ульяновск, 2011. Т. 1. С. 185-186.

11. Характеристика биологических свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Вестник

Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. jY°1 (13). С. 79.

12. Методика выделения фагов бактерий вида Bacillus cereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.Л. Васильев [и др.] //Естественные и технические науки. 2011. №2 (52). С. 83-84.

13. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2011. №1 (13). С. 61-67.

14. Мустафин А.Х., Феоктистова H.A., Калдыркаев А.И. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis И Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2011. №4 (32). С. 288-291.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП Кобыляцкая A.A. г. Ульяновск, ул. Федерации, 15, (8422)44-70-96

Подписало в печать 24.04.12 г. Заказ №947 Тираж 100 экз. Бумага офсетная

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мустафин, Али Хамзеевич, Ульяновск

61 12-3/1110

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

На правах рукописи

/

Мустафин Али Хамзеевич

Биотехнологические параметры разработки фагового препарата, для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 -микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., профессор Васильев Д.А. к.б.н., доцент Феоктистова Н.А.

Ульяновск 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ..................................................5

ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................11

1.1. Систематика и идентификация бактерий Bacillus subtilis..........................11

1.2. Распространение бактерий В. subtilis в пищевых продуктах..........................17

1.3. Бактерии В. subtilis в организме животных...................................................22

1.4. Бактериофаги и и их применение в лабораторной практике........................23

1.4.1. Фагоидентификация бактерий и фаготипирование.........................23

1.4.2. Морфологические и биологические свойства фагов........................28

1.4.2.1. Морфология негативных колоний....................................28

1.4.2.2. Морфология бактериальных вирусов...............................30

1.4.2.3. Развитие фаговых корпускул в клетке-хозяина....................32

1.4.2.4. Реакция нарастания титра фага........................................36

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................43

2.1. Объект, материалы и методы исследований...........................................43

2.2. Результаты исследований и их обсуждение.............................................51

2.2.1. Выделение бактерий В. subtilis из объектов

санитарного надзора..............................................................................51

2.2.2. Поиск бактериофагов бактерий В. subtilis и селекция

клонов фагов...............................................................................57

2.2.3. Изучение биологических свойств фагов бактерий В. subtilis...............63

2.2.3.1. Морфология негативных колоний...................................63

2.2.3.2. Спектр логического действия........................................66

2.2.3.3. Логическая активность выделенных бактериофагов

В. subtilis.............................................................................70

2.2.4. Характеристика выделенных фагов бактерий В. subtilis, выбранных для конструирования биопрепарата на основе индикаторных бактериофагов Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА................................................................73

2.2.4.1. Спектр литического действия бактериофагов Вз-13

и Вб-16 серии УГСХА, входящих в состав биопрепарата..................73

2.2.4.2. Специфичность действия фагов -13 и Вб-16 серии УГСХА, составляющих биопрепарат для индикации

бактерии В. яиЬНШ..................................................................76

2.2.4.3. Температурная устойчивость фагов бактерий В. тлЬП7и Вз-13 УГСХА и Вб-16 УГСХА, входящих в

состав биопрепарата..............................................................77

2.2.4.4. Устойчивость бактериофагов Вэ-13 и Вб-16 серии УГСХА, на основе которых разработан биопрепарат,

к воздействию хлороформа....................................................78

2.2.4.5. Изменение литической активности фагов Вб-13 и Вз-16 серии УГСХА, составляющих индикаторный биопрепарат, при хранении......................................................80

2.3. Технологические параметры по изготовлению и контролю лабораторной серии биопрепарата на основе индикаторных

бактериофагов Вз-13 и Вб-16 серии УГСХА..................................................81

2.3.1. Производственные штаммы индикаторных культур

и порядок работы с ними..................................................................81

2.3.2. Методика культивирования индикаторных фагов,

входящих в состав биопрепарата........................................................83

2.3.3. Приготовление питательной среды для культивирования бактериофагов, составляющих индикаторный биопрепарат......................84

2.3.4. Технология изготовления бактериофагов, входящих

в состав биопрепарата....................................................................85

2.3.5. Контроль бактериофагов Вз-13 УГСХА и Вб-16 УГСХА, составляющих биопрепарат.............................................................87

2.3.6. Кондиция бактериофагов.........................................................91

2.4. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной

идентификации бактерий Я subtilis............................................................91

2.4.1. Подбор параметров исследования..............................................91

2.4.2. Методика фагоидентификации бактерий В. subtilis............................94

2.5. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания

титра фага (РНФ).................................................................................96

2.5.1. Определение количественных показателей РНФ, имеющих диагностическое значение................................................................96

2.5.2. Установление оптимального времени, обеспечивающего

наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями.....................100

2.5.3. Использование РНФ для обнаружения бактерий

В. subtilis в объектах санитарного надзора..........................................107

2.5.3.1. Исследование водопроводной воды, контаминированной бактериями В. subtilis, с помощью РНФ.....................................107

2.5.3.2. Исследование комбикорма, контаминированного бактериями

В. subtilis с помощью РНФ......................................................110

2.5.3.3. Исследование проб специй, искусственно контаминированных бактериями В. subtilis, с помощью РНФ.....................................111

2.5.3.4. Исследование проб мяса, искусственно контаминированного бактериями В. subtilis, с помощью РНФ.....................................112

2.5.3.5. Результаты исследований проб молока на наличие бактерий

В. subtilis с помощью РНФ......................................................114

2.6. Изучение эффективности поливалентного фагового биопрепарата...............119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................121

ВЫВОДЫ........................................................................................128

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ........130

ПРИЛОЖЕНИЯ...............................................................................145

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЦ - гуанин - цитозин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахарид

М.к. - микробная клетка

М.к./г. - микробных клеток на 1 грамм

Мкм - микрометры

М.к./мл - микробных клеток на 1 миллилитр

МПА - мясопептонный агар

МПа - мега Паскаль

МПБ - мясопептонный бульон

МПЖ - мясопептонная желатина

Н.м. - нанометр

Об./мин - оборотов в минуту

ОКИ - острые кишечные инфекции

ОРЗ - острые респираторные заболевания

РА - реакция агглютинации

РГА - реакция гемагглютинации

РНФ - реакция нарастания титра фага

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЦР - полимеразно-цепная реакция

ЬТ - термолабильный энтеротоксин

ВВЕДЕНИЕ

Контаминация пищевого сырья и продуктов питания бактериями вида В. subtilis на всех этапах технологического процесса - это серьезная проблема перерабатывающей промышленности. Эти почвенные сапрофиты встречаются повсеместно, отличаются высокой температурной устойчивостью, солетолерантны и способны продуцировать токсины (Беленева 2008; Феоктистова, 2010). При контаминации бациллами пищевое сырье и выработанные из него продукты питания зачастую не изменяют свои органолептические свойства, поэтому определить их присутствие в пище невозможно до тех пор, пока у потребителя не появятся симптомы интоксикации (Динчева, 1970; Пивоваров, 1970; Бахаровская, 2011). Пищевые токсикозы, вызванные бактериями Bacillus subtilis, характеризуются острым течением болезни и могут вызвать летальный исход (Бургасов, 1984; Пучкова, 2005, Медведев, 2010).

Учитывая сложность лабораторной диагностики, остается актуальной проблема унифицированной схемы бактериологического исследования, повышается значимость бактериофагов как высоко специфичного инструмента для индикации микроорганизмов, позволяющего точно идентифицировать пищевые контаминанты, а также осуществлять более детальную дифференциацию отдельных биотипов и фаговаров внутри вида. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия бактериофагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида (Малофеева, 2004; Пожарникова, 2006). Поэтому все большее число исследователей предпочитают использовать фаговые тесты, как высокоспецифичный метод, способный дифференцировать близкородственные штаммы (Натидзе, 2005; Феоктистова, 2011).

Типовые высокоспецифичные бактериофаги - это биоиндикаторы, благодаря которым можно проводить мониторирование бактерий отдельных видов, иметь возможность установить источник и путь передачи инфекционного заболевания, т.е. провести его эпидемиологический анализ. Так в Канаде в промежуток с 1986 по 1993 было отобрано 146 изолятов Bacillus cereus, причастных к 18 вспышкам пищевого отравления. Из них 142 штамма было разделено на 17 типов фагов (Ahmed, 1995).

В настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus subtilis в объектах санитарного надзора. Использование подобных методик позволит в сжатые сроки типировать бактерии Bacillus subtilis, используя минимальное количество расходных материалов и трудозатрат в течение 25 часов.

Цель - разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus subtilis в пищевом сырье и продуктах питания.

Задачи работы:

1. Изучить распространение бактерий В. subtilis в пищевых продуктах.

2. Выделить бактериофаги, активные в отношении бактерий В. subtilis.

3. Селекционировать и изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, устойчивость к хлороформу, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.

4. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат.

5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата для фагодиагностики бактерий В. subtilis.

6. Разработать схеиу ускоренной индикации бактерий В. subtilis в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага с использованием созданного биопрепарата.

7. Разработать схему идентификации бактерий В. БиЪИШ с помощью бактериофагов.

Научная новизна

Выделены из объектов санитарного надзора и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги В. хиЫШз, из них отобраны наиболее оптимальные специфические бактериофаги В б -13 УГСХА и Вб -16 УГСХА для создания биопрепарата.

Разработаны биотехнологические параметры изготовления фагового биопрепарата и усовершенствована схема фагоиндикации В. зиЫШя в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с применением созданного биопрепарата.

Усовершенствована схема выделения и идентификации бактерий В. зыЫШб в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата.

Практическая значимость работы

Предложенная в диссертационной работе схема фагоидентификации и дифференциации позволяет выделять и типировать штаммы бактерий В. яиЬИШ из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

Сконструирован биопрепарат на основе специфичных бактериофагов Вэ-13 УГСХА и В э-16 УГСХА и усовершенствована схема индикации бактерий В. яиЫгШ методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 25 часов.

По материалам диссертационной работы разработаны и утверждены ректором УГСХА (от 10 марта 2010 г) «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Вб-13 УГСХА и Вб-16 УГСХА для индикации и идентификации бактерий В. яиЫШя», «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий В. яиЬиШ в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», разработаны для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной

работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Предложена усовершенствованная схема выделения бактериофаов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям В. БиЫШз изучены биологические свойства выделенных и селекционированных фагов.

2. Создан биопрепарат из селекционированных фагов бактерий В. яиЫШя и технологические параметры его изготовления.

3. Разработана схема идентификации бактерий В. БиЫШя с применением биопрепарата на основе фагов Вб-13 УГСХА и Вб-16 УГСХА ускоряет определение видовой принадлежности В. яиЫШз.

4. Предложена схема ускоренной индикации бактерий В. БиЫШз в объектах санитарного надзора с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием созданного биопрепарата.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на: Международной научно-практической конференции посвященной 65-летию УГСХА «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в отраслевую науку с учетом современных тенденций развития АПК» (Москва, 2009); Международной научно - практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения» (Ульяновск, 2009); III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва,

2011); Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011).

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 статей, 4 из них в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 147 страницах, включают 33 таблиц и 7 рисунков. Список использованных литературных источников включает 157 наименований, в том числе 30 зарубежных.

и

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Систематика и идентификация бактерий В. subtilis

Аэробные спорообразующие бактерии объединены в род Bacillus, включенный в семейство Bacillaceae. Основными признаками этого рода являются: образование эндоспор, наличие каталазы, в большинстве случаев положительная окраска по Граму (Bergey's manual, 1993).

Бациллы распространены повсеместно, большинство их обитает в почве. Они участвуют в круговороте веществ в природе. Благодаря наличию разнообразных ферментов вызывают деградацию сложных органических соединений. Нестабильность биологических свойств аэробных споровых бактерий, обусловленная их приспособляемостью к условиям обитания, на протяжении всей истории изучения бацилл была и остается одной из главных причин нечеткой таксономии внутри рода и многочисленных попыток ее усовершенствования. Для организмов этого рода предлагалось более 150 наименований. Многие виды переименовывались четыре-пять раз (Bonde, 1975).

Классификация Форда, по которой аэробные спорообразующие бактерии подразделялись на 9 групп с 28 видами, была положена в основу внутриродового разграничения бацилл в первых изданиях определителя Берджи и строилась главным образом на морфологических признаках (Мирзоева, 1959). Классификация Gibson (1974) основывалась на способности ферментировать глюкозу, образовывать ацетилметилкарбинол. Однако, как теперь известно, деление только по механизму углеводного обмена не совпадает с общепринятым таксономическим делением «Конкретные механизмы брожения развивались в ходе эволюции в некоторых группах бактерий независимо друг от друга» (Вуд, 1963).

Классификация F.E. Clark (1952) и R.E. Gordon (1973) базируется на всестороннем изучении биологических свойств аэробных бацилл с учетом

стандартизации условий их выращивания и методов исследования. Эта классификация включает описание 25 видов (Берджи, 1937). Авторы подразделяют спорообразующие бактерии на три группы по форме спор, соотношению поперечника спор и вегетативных клеток. Этим признакам придавал первостепенное значение при видовом и групповом разграничении спорообразующих бактерий H.A. Красильников (1949).

Попытка дальнейшего совершенствования классификации бактерий рода Bacillus предпринята в работе F. Lemille, Н. Barjac, A. Bonnefoi (1969), которые использовали 64 биохимических теста при изучении как музейных, так и выделенных аэробных бацилл. Авторы расширили спектр источников углерода и ввели такие тесты, как проба на оксидазу, обнаружение лизиндекарбоксилазы, галактозидазы, три