Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков"

Гринько, Ольга Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков"
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков""

На правах рукописи

064603944

ГРИНЬКО Ольга Михайловна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММА БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS «ПАШКОВ»

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2010

2 6 АВГ 2010

004608944

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН и ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

Росздрава

Научный руководитель

доктор медицинских наук профессор Михайлова Наталья Александровна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Истратов Валерий Григорьевич

доктор медицинских наук профессор Бондаренко Виктор Михайлович

Ведущая организация

Федеральное Государственное учреждение науки Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора

Защита состоится «£<% ¿¿///ии^шОт. в часов на заседании совета Д. 208.040.08 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 119992, г. Москва, ул. Малая Трубецкая, д.8., стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан 201^-.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Бактерии рода Bacillus обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Блинкова Л.П., 2005, Бондаренко В.П., 2010, Михайлова H.A., 1995, Успенский Ю.П., 2009, Muhammad S.A., 2009, Romero D., 2007).

Каждый производственный штамм бацилл характеризуется уникальностью и многообразием биохимических процессов, что проявляется в различии спектра и выраженности их антимикробного действия (Давыдов Д.С., 2007, Duc le H., 2004).

Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus лежит в основе создания споровых препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения различной патологии человека (Осипова И.Г., 2006, Успенский Ю.П., 2009, Duc le H, 2004, Hong H.A., 2008).

На отечественном фармацевтическом рынке существует более двух десятков препаратов из бацилл, содержащих штаммы B.subtilis и B.licheniformis (Похиленко В.Д., 2007). Другие представители бактерий рода Bacillus, например, B.pumilus не изучены (Бондаренко В.М., 2003, Мацулевич Т.В., 2007).

Критериями отбора пробиотических штаммов бацилл являются, помимо спектра и уровня антагонистической активности, способность к адгезии, стабильные генетические характеристики, безопасность для макроорганизма, таксономическая идентификация с применением современных и валидированных методов (Булатова Е.М., 2009, Ермоленко Е.И., 2009, Осипова И.Г., 2007, Duc le H., 2004, Hong H.A., 2008).

Антагонистическая активность спорообразующих бактерий обусловлена биологически-активными веществами, в основном белковой природы, синтез которых генетически запрограммирован и может реализоваться в полной мере при оптимальным параметрах культивирования (Блинкова Л.П., 2003, Jack R.W., 2005, Hong H.A., 2005, Stein T., 2005). Одним из значимых факторов,

влияющих на продукцию биологически-активных веществ, является состав питательной среды (Подберезный В.В., 1997, Abdel-Mawgoud A.M., 2008, Jamil В., 2007, Muhammad S.A., 2009).

Метаболиты бацилл, выделяемые при культивировании, наряду с пробиотической активностью, представляют огромный интерес в качестве основы антимикробных препаратов, действующих избирательно на условно-патогенные и патогенные микробов без резких нарушений сложившегося микробиоценоза, имеющих место при применении антибиотиков широкого спектра действия (Вахитов Т.Я. и др., 2005, Онищенко Г.Г. и др., 2002, Teusink В. et al., 2005, Villas-Boas S. G. et al., 2005).

Таким образом, поиск новых перспективных штаммов - кандидатов в пробиотические, а также получение микробных продуктов на основе их метаболитов, обладающих направленным лечебным действием как в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, а также против вирусов, являются актуальными и перспективными направлениями.

Цель настоящего исследования - экспериментальное изучение антагонистической активности штамма Bacillus pumilus «Пашков» в отношении различных видов бактерий, грибов и вирусов.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические и физиолого-биохимические свойства выделенного штамма Bacillus pumilus.

2. Оценить антагонистическую активность штамма B.pumilus «Пашков» в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов.

3. Подобрать оптимальные параметры выращивания штамма B.pumilus «Пашков» для получения культуральной жидкости с максимальной ингибирующей активностью в отношении микробов и определить условия сохранения ее активности.

4. Изучить противовирусную активность культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма B.pumilus «Пашков» на новой питательной среде, на примере возбудителей энтеровирусных инфекций.

Научная новизна работы:

Составлен генетический паспорт штамма, идентифицированного как B.pumilus «Пашков». Подана заявка на изобретение (№ 2009129639 от 04.08.2009г.): «Штамм бактерий B.pumilus «Пашков» - продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов».

Разработана новая жидкая питательная среда, обеспечивающая максимальную выработку штаммом B.pumilus «Пашков» метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий, клинических штаммов P.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов.

Впервые, на примере изучения метаболитов, показана противовирусная активность спорообразующих бактерий в отношении энтеровирусов: полиовируса I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки В нетипированных с 1 по б типы.

Практическая значимость работы

Выделенный и идентифицированный штамм бактерий рода B.pumilus «Пашков» депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича под номером 286. Изученный штамм может быть рекомендован для разработки нового оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика медицинского и ветеринарного назначения, а также других лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выделенный штамм бактерий по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствует виду B.pumilus «Пашков». Он не содержит плазмид, антагонистически активен в отношении условно-патогенных и патогенных микробов разных таксономических групп, имеет низкий уровень адгезии. По своим характеристикам штамм можно рекомендовать в качестве пробиотического.

2. Культуральная жидкость B.pumilus «Пашков» содержит метаболиты, обладающие бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, в том числе возбудителя госпитальных инфекций P.aeruginosa, и фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов. Активность метаболитов зависит от параметров культивирования.

3. Разработанная питательная среда для культивирования B.pumilus «Пашков» позволяет получить БАВ, активно влияющие на условно-патогенные и патогенные микробы.

4. Биологически-активные вещества, выделяемые при культивировании В. pumilus «Пашков» обладают противовирусной активностью.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008).

Диссертация апробирована на совместном заседании отдела микробиологии Учреждения Российской академии медицинских наук НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии МПФ ММА им. И.М.Сеченова (Москва, 14 мая 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста, иллюстрированы 7 рисунками и 28 таблицами, состоят из введения, обзора литературы, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 263 источников (127 отечественных и 136 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований Объекты исследований:

- штаммы бактерий: B.pumilus «Пашков», выделенный из окружающей среды; B.subtilis ЗН, являющийся основой биопрепарата Бактиспорин; B.subtilis 534, входящий в состав пробиотического препарата Споробактерин; B.subtilis 1719, депонированный в коллекции ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича (№ 277);

- штаммы микробов, используемые для определения антагонистической активности:

- тест-культуры бактерий из ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича (п=10);

- клинические штаммы дрожжевых грибов (п=6) из НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, любезно предоставленные профессором В.Г. Арзуманян;

- клинические штаммы P.aeruginosa (п=42) из музея Государственного института гигиены (Будапешт, Венгрия);

- клеточные культуры Vero: Vero-ECC, Vero-E6, Vero-к из Учреждения Российской Академии медицинских наук Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН;

- энтеровирусы: вирус полиомиелита I типа, вирусы ECHO 3 и ECHO 6, вирусы Коксаки В нетипированные из Учреждения Российской Академии медицинских наук Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, любезно предоставленные профессором О.Е. Ивановой;

Исследования осуществлены на лабораторных животных - беспородных мышах обоего пола массой 14-16 г. При выполнении экспериментов на животных руководствовались «Правилами гуманного обращения с лабораторными животными» (2003). Использованы:

1) стандартные среды, традиционно применяемые при микробиологических исследованиях;

2) среды, рекомендуемые для изучения свойств бацилл;

3) среды, используемые в производстве споровых пробиотиков.

Методы исследования

Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенного штамма проводили в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов В. В. с соавт., 1983).

Антагонистическую активность бацилл в отношении тест-штаммов микробов определяли методом отсроченного антагонизма (ФС 42-3476-98).

Чувствительность к антибиоткам В.ритИш «Пашков» изучали диско-диффузионным методом в соответствии с Методическими указаниями (Москва, 1983) с использованием стандартного набора антибиотиков (НИЦФ, г. Санкт-Петербург).

Адгезивные свойства В.ритИш «Пашков» изучали на формалинизированных эритроцитах человека 1(0) группы Ш1+ с оценкой индекса адгезивности (Брилис В., 1984).

Безопасность В.ритИш «Пашков» оценивали в соответствии с Методическими рекомендациями (Смирнов В. В. с соавт., 1983).

Плазмидный профиль В.ритИш «Пашков» определяли с использованием щелочного лизиса (Маниатис Т. и др., 1984).

Риботипирование 168 субъединицы рРНК В.ритИш «Пашков» проводили с использованием праймеров, подобранных с помощью базы данных СепВапк.

Культуральную жидкость В.ритИш «Пашков» получали методом периодического культивирования в течение 72 часов в условиях постоянной аэрации при температуре 37 °С с последующим центрифугированием и стерилизацией.

Ингибирующую активность культуральной жидкости в отношении бактерий и дрожжевых грибов оценивали с помощью микробиологического анализатора с планшетным фотометром «ВЮ8СЯЕЕМ/ШМ8-геас1ег МР» (фирма «ЬаЬМеЮё», Финляндия).

Инфекционную активность энтеровирусов изучали методом предельных разведений на культуре клеток по цитопатогенному действию вируса.

Цитотоксичность культуральной жидкости В. ритНш «Пашков» определяли по влиянию на жизнеспособность клеточной культуры с

использованием красителя трипанового синего с оценкой острой, хронической цитотоксичности и максимально переносимой дозы (Kinchington D. et al., 1995).

Противовирусную активность культуральной жидкости определяли по лечебной и профилактической схемам воздействия и оценивали по цитопатогенному действию вируса (Kinchington D. et al., 1995).

Обработка результатов проводилась методами методами вариационной статистики с использованием программы SPSS vi 1,5. Микробиологические эксперименты по оценке количественных показателей проводили не менее 3 раз. Статистическую обработку результатов проводили с использованием параметрических критериев (М+ш) при уровне достоверности р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика выделенного штамма

На кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова профессором Пашковым Е.П. и доцентом Будановой Е.В. были обнаружены микробные колонии, выросшие на чашке Петри с грибами рода Pénicillium, вокруг которых образовались четкие зоны задержки роста.

При окраске мазков по Граму и последующем микроскопическом исследовании выявлено, что выделенный штамм грамположительный, характеризуется парацентральным и центральным расположением эндоспор.

На чашках с МПА обнаружено два варианта колоний, характерных для бактерий рода Bacillus.

Штамм обладал физиолого-биохимическими свойствами, типичными для представителей B.pumilus. Бактерии были подвижны, росли на 7% NaCl, характеризовались набором различных ферментов, расщепляющих такие субстраты, как глюкоза, ксилоза, маннит, сахароза, мальтоза, казеин, цитрат, желатин, редуцировали нитраты, не образовывали сероводород.

Таким образом, по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств штамм идентифицирован как Bacillus pumilus и ему присвоено название В. pumilus «Пашков».

Известно, что бактерии рода Bacillus обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микробов. Антагонистическую активность B.pumilus «Пашков» оценивали в сравнении с другими пробиотическими штаммами спорообразующих бактерий методом отсроченного антагонизма, используя тест-культуры из коллекции ФГУН ГИСК им. JI.A. Тарасевича РАМН (рис.1)

■ B.pumilus "Пашков" - B.subtilis ЗН ■ B.subtilis 534 я B.subtilis 1719

Рис.1. Антагонистическая активность штамма B.pumilus «Пашков» в сравнении с другими представителями рода Bacillus

Штамм B.pumilus «Пашков» проявил высокую антагонистическую активность в отношении 9 тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий, а также дрожжевых грибов.

Сравнительное исследование антагонистической активности выделенного штамма и 3-х пробиотических штаммов B.subtilis показало, что по выраженности и спектру активности они идентичны.

Известно, что штаммы бактерий рода Bacillus используются в качестве основ препаратов-пробиотиков, поэтому наряду с изучением антагонистической активности, проведено комплексное изучение

биологических свойств ВритНш «Пашков», руководствуясь следующими критериями:

- отсутствие факторов патогенности;

- отсутствие или низкий уровень адгезии;

- природа и уровень антибиотикоустойчивости;

- безопасность для макроорганизма;

- таксономическая идентификация с применением генетических методов.

У изучаемого штамма В.ритНиз «Пашков» не выявлены факторы патогенности (гемолизинов и лецитиназы).

Адгезивная активность В.ритИиз «Пашков» оценена как низкая (табл. 1).

Таблица 1

Адгезивная активность штамма В.ритНия «Пашков» на эритроцитах

человека

Культура бактерий Адгезивная активность

СПА (М+т) К,% Индекс адгезии микроорганизма (ИАМ), (М+т) Уровень адгезии

В. ритИш «Пашков» 1,04+0,24 53,6+4,56 1,93+0,29 Низкий

Примечание: СПА - средний показатель адгезивности; К - коэффициент, процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности прилипшие микробы.

Оценка антибиотикочувствительности штамма В.ритИш «Пашков» показала, что он устойчив к 13 и чувствителен к трем из 22 антибиотиков различных химических групп (рис. 2).

Ш1

5 ® 2 а

5 к к о

4 о о у

О К И й

н о га га

5 о. ь 5 „ -е- К о о.

и л -е- ь Я

Я и я как

Я га я

я -В" га

2 >« Й

° £ о

Р> & к

к к а а,

Э ¿г, га

+ -в- -е- ¡з 3 о п

я я га к я

2 <

я я

н я

К я

5? И

Я 5

я я я

я ч я

га я о

а, я я 3"

к я ®

-I. -

а 03

я йз Си

>• (О

| - устойчив, И - умеренно-чувствительный, □ - чувствителен

Рис.2. Показатели чувствительности штамма В-рипШиэ «Пашков» к антибиотикам

12 3 4

||1|| «ИГ —

Рис. 3. Данные электрофореза препаратов ДНК, выделенных из штамма В. ритИт «Пашков»

Расшифровка обозначений

1 - ДНК плазмиды pCMV-SPORT-Pgal (размер 7853 н.п.), выделенная с помощью набора для выделения плазмидной ДНК «GenElute™ Direct mRNA Miniprep Kit» фирмы Sigma.

2 - ДНК плазмиды pCMV-SPORT-(3gal (размер 7853 н.п.), выделенная с помощью набора для выделения плазмидной ДНК «Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System» фирмы Promega.

3 — ДНК штамма В. pumilus «Пашков», выделенная с помощью набора для выделения плазмидной ДНК «GenElute™ Direct mRNA Miniprep Kit» фирмы Sigma.

4 - ДНК штамма В. pumilus «Пашков», выделенная с помощью набора для выделения плазмидной ДНК «Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System» фирмы Promega.

Плазмидный анализ показал, что в препаратах выделенной ДНК из штамма В. pumilus «Пашков» плазмид не обнаружено, что подтверждало природный характер устойчивости к антибиотикам, связанной с хромосомной локализацией генов резистентности.

Безопасность выделенного штамма оценена по токсичности, токсигенности, вирулентности и безвредности для экспериментальных животных (табл. 2).

Таблица 2

Изучение безопасности штамма B.pumilus «Пашков»

Токсичность Токсигенность Вирулентность Безвредность

Доза Кол-во Доза Кол-во Доза Кол-во Доза Потеря

(х109 живых/ (мл) живых/ (х109 живых/ (хЮ9 массы

КОЕ/м павших павших КОЕ/ павших КОЕ/мл через 5

л) мышеи мышеи мл) мышей суток

1 10/0 0,5 10/0 0,5 10/0 5 отсут.

2 10/0 1,0 10/0 1 10/0 10 отсут.

3 10/0 10/0 2 10/0 20 отсут.

Полученные результаты свидетельствовали о нетоксичности, нетоксигенности, авирулентности и безвредности изучаемого штамма.

Его таксономическая идентификация проведена методом риботипирования 16Э субъединицы рРНК. Генетический паспорт штамма описан следующим образом:

ТСОСТСАООАСОААСОСТСОСООССТСССТААТАСАТОСААСТСОАССООАСАОААаС ОАССТТССТСССаОАТСТТАОСООСООАСОООТСАОТААСАСОТСООТААССТСССТОТ ААОАСТСООАТААСТСССООАААССООАОСТААТАССООАТАСТТССТТСААССОСАТ ОСТТСЛЛССАТСААЛСАССОТТТСООСТСТСАСТТАСАСАТСОАССССССОСССАТТАС СТАОТТСОТСОООТААТСОСТСАССААООСОАСОАТСССТАаССОАССТСАОАОООТС АТСООССАСАСТСООАСТСАОАСАСООСССАОАСТССТАСОООАООСАОСАСТАОООА АТСТТССОСААТООАСОАААСТСТОАСООАОСААСОССОСОТСАСТОАТОААСОТТТТС ООАТСОТАААОСТСТСТТСТТАОООААОААСААОТССОАОАОТААСТССТСОСАССТТС АСОСТАССТААССАОАААОССАСООСТААСТАСОТСССАССАСССОСОСТААТАССТА ООТСОСААОСОТТСТССООААТТАТТОООССТАААОООСТСОСАООСООТТТСТТААСТ СТСАТСТСАААОСССССООСТСААССООООАООСТСАТТСОАААСТСООАААСТТСАО ТССАОААОАООАОАОТСОААТТССАСОТОТАОСООТСАААТСССТАОАОАТСТСОАОС ААСАССАОТСОСОААООСаАСТСТСТООТСТСТААСТОАСОСТСАООАОСОАААОССТ ООООАОСОААСАООАТТАОАТАСССТССТАСТССАСОСССТАААСОАТОАОТССТААО ТСТТАОООООТТТССОССССТТАОТССТССАОСТААСОСАТТААОСАСТССОССТСООО АСТАСООТСОСААСАСТСАААСТСАААСОААТТСАСОООСССССССАСААОССОТСОА ОСАТСТСОТТТААТТСОААОСААСаСОААОААССТТАССАООТСТТСАСАТССТСЮАС ААСССТАОАОАТАООССТТТСССТТСООООАСАОАОТСАСАООТСОТССАТССТТСТСС ТСАОСТСОТСТСОТСАОАТСТТСОСТТААСТСССОСААСОАОСОСААСССТТСАТСТТА ОТТСССАОСАТТТАОТТСООСАСТСТААООТСАСТСССОСТОАСАААССООАООААОО ТОСОСАТОЛСОТСЛААТСАТСАТСССССТТАТСАССТСООСТАСАСАСОТОСТАСААТС ОАСАОААСАААСООСТССОАОАССОСААОСТТТАаССААТСССАТАААТСТСТТСТСА СТТСООАТСОСАСТСТССААСТСОАСТССОТСААОСТСОААТСОСТАСТААТСОСООАТ САССАТСССОСООТСААТАСОТТСССОООССТТСТАСАСАССОССССТСАСАССАСОАС АаТТГССААСАСССОААСТСОСТСАСОТААССТТТАТСОАСССАО

Штамм депонирован в Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича под номером 286.

Изучение ингибирующих свойств метаболитов, синтезируемых штаммом

В.ритНиз «Пашков»

Известно, что антагонистическая активность микробов обусловлена биологически-активными веществами, синтез которых запрограммирован на генетическом уровне и может реализоваться в полной мере при оптимальных параметрах культивирования, среди которых особенно важным является состав питательной среды.

На первом этапе исследований, штамм В. ритИш «Пашков» культивировали на жидких питательных средах известного состава,

применяемых в производстве споровых пробиотиков и средах, предназначенных, по данным литературы, для культивирования бацилл: ВК-2, Спицайзена и Ь-бульон.

О наличии биологически-активных веществ (БАВ) в культуральной жидкости судили по их влиянию на кинетику роста тест-культур. Задержка вступления тест-штаммов в стадию экспоненциального роста свидетельствовала о бактериостатическом эффекте (БСЭ) БАВ, а отсутствие роста более 18 часов оценивалось как бактерицидный эффект (табл. 3).

Таблица 3

Показатели БСЭ БАВ, выделяемых при культивировании штамма В.ритИт «Пашков» на различных средах

Время культивирования (час) Среднее значение БСЭ (%) в отношении тест-штаммов бактерий (М+гп)

Среда №9 Среда №5 Среда ВК-2 Среда Спицайзена Ь-бульон

24 13,3+6,8 5,4+7,1 1,1+0,5 0 0

48 36,6+5,4 35,6+6,2 2,7+0,8 0 0

72 61,7+3,8 51,2+3,9 7,3+3,9 0 0

Как видно из табл. 3 синтез БАВ начинался в течение 24 часов и достигал максимального уровня к 72 часам. Наибольшая активность выявлена у проб, взятых после культивирования штамма В. ритНив «Пашков» на среде № 9. Среды № 5 и ВК-2 слабо стимулировали выход БАВ, а в средах Спицайзена и Ь-бульоне он вообще отсутствовал.

Известно, что одним из значимых условий для синтеза антимикробных субстанций у бацилл, является состав питательной среды, особенно ее углеводный компонент. Испытано влияние различных углеводов: глюкозы, маннита, лактозы, инулина и мальтозы на синтез БАВ, обладающих ингибирующими свойствами. Выявлено, что добавление лактозы приводило к получению максимального уровня БСЭ в отношении тест-штаммов, который достигал 77,6+4,9%. Другие углеводные источники оказывали меньшее

стимулирующее влияние на изучаемый показатель (рис. 4).

100

Ч? о

Ь "

Я «

и н

м 5

2 н

— и

Я «

01 Н

ЕГ _

Я S

5 г

а I

S о

s Р

90 ■ 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Т ,6

61,6

глюкоза маннит лактоза

инулин мальтоза

Рис. 4. Влияние углеводного компонента в составе питательной среды на ингибирующие свойства БАВ, полученных при культивировании В. pumilus «Пашков»

На основании полученных данных, лактоза выбрана в качестве источника углеводов для новой питательной среды.

Другие компоненты подобраны на основании данных литературы о влиянии различных химических соединений неорганической и органической природы, а также на основании анализа известных питательных сред, рекомендованных для культивирования бактерий рода Bacillus. Рецептура среды имеет следующий состав: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г/л; магний сернокислый 7-водный - 0,1г/л; хлористый марганец - 0,01г/л; кальций хлористый - 0,08г/л; К2НР04*ЗН20 - 0,3 г/л; цитрат аммония (NH4OOCC(OH)(CH2COOH)2) - 2,0г/л; триптон - 5г/л; дрожжевой экстракт - 3,0 г/л; лактоза - 5 г/л; pH 7,3+0,2.

При подборе оптимальных концентраций лактозы (рис. 5) выявлено, что содержание лактозы 10 г/л обеспечивало БСЭ КЖ, равный 86,7%. Ее уменьшение или увеличение снижало уровень активности метаболитов.

Концентрация, г/л

Рис. 5. Влияние лактозы в составе питательной среды на ингибирующие свойства БЛВ В.ритИиь «Пашков»

В дальнейшем изучено влияние дрожжевого экстракта (рис. 6).

100

а 90

Р) с; ее ь 70

и = 60

« £ и а 50

* 40

= я ю 30

а 20

? о в 10

а о 0

Н(1,7

"85

3-"Ч

-93

Г»-

5 6

Концентрация, г/л

Рис. 6. Влияние дрожжевого экстракта в составе питательной среды на ингибирующие свойства БАВ В.ритИиз «Пашков»

Полученные результаты свидетельствовали, что увеличение концентрации дрожжевого экстракта до 7 г/л повышало ингибирующую активность метаболитов, содержащихся в культуральной жидкости - БСЭ 95,6%. Дальнейшее увеличение содержания дрожжевого экстракта снижало этот показатель.

После подбора дрожжевого экстракта мы попробовали достичь бактерицидного эффекта КЖ варьированием концентраций цитрата аммония и фосфорнокислого калия. Опыты показали, что снижение или увеличение содержания этих соединений существенно не влияет на специфическую активность БАВ (рис. 7).

■ := и о.

£ 5

Я я - ю

<и

с.

цитрат ЫН4

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

97,6

-32Н-

13,11

Концентрация, г/л

К,НР04

97,6

Концентрация г/л

Рис. 7. Влияние солей металлов в составе питательной среды на ингибирующие свойства БАВ В. ритНия «Пашков»

Известно, что с увеличением вязкости жидкой среды, увеличивается

синтез антимикробных субстанций. С этой целью в среду вносили различные концентрации глицерина (рис. 8).

ч® О

С £

И а

« ; г

: 5 ь

а а и

' т ^

л 5 «

я 2 в

100 ■ 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

95.6

-г

100

глицерин

16.1

Концентрация, мл/л

Рис. 8. Влияние глицерина на ингибирующие свойства БАВ В. ритИш «Пашков»

Установлено, что синтез БАВ, обладающих бактерицидным эффектом, происходил при добавлении глицерина в концентрации 40 мл/л.

Задачей следующего этапа исследования стало изучение специфической активность БАВ, выделяемых при культивировании В.ритНш «Пашков» на новой питательной среде в отношении Pмeruginosa. В опыте использовано 42 клинических штамма. В результате опытов выявлен бактерицидный эффект БАВ КЖ в отношении всех исследуемых штаммов.

Известно, что бациллы способны секретировать БАВ, обладающие ингибирующей активностью не только в отношении бактерий, но и грибов. На следующем этапе культуральная жидкость, полученная при выращивании В.ритИиз «Пашков» на новой питательной среде, была протестирована в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов (табл. 4)

Таблица 4

Показатели активности БАВ, выделяемых при культивировании штамма В. ритИич «Пашков» в отношении клинических штаммов дрожжевых

грибов

Название штамма дрожжевых грибов Задержка роста грибов (фунгистатический эффект %)

С. albicans (№1) 94,6+8,4

С. albicans (№2) 92,2+7,4

C.haemuloni 91,7+6,6

С. tropical is 89,5+8,1

Rhodotorula spp. 88,4+9,2

Debaryomyces hansenii 92,6+8,6

Данные таблицы свидетельствуют о выраженном фунгистатическом эффекте БАВ в отношении изучаемых штаммов дрожжей.

Оценка стабильности ингибирующих свойств метаболитов, содержащихся в КЖ, является необходимым условием при разработке новых лекарственных препаратов на их основе. При определении параметров сохранения, выявлено, что специфическая активность КЖ сохранялась в условиях замораживания при температуре минус 18 в течение 12 мес.

В результате проведенных исследований получена новая жидкая питательная среда, состав которой стимулирует выработку штаммом B.pumilus «Пашков» БАВ, обладающих бактерицидным действием в отношении 9 тест-штаммов бактерий, 42 клинических штаммов P.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении 6 клинических штаммов грибов.

Оценка противовирусной активности биологически-активных веществ, синтезируемых штаммом B.pumilus «Пашков»

Известно, что бациллы способны оказывать противовирусное действие за счет синтеза активных биосурфактантов, таких как сурфактин, фенгуцин, итурин, плипластин и др. (Berditsch М., 2006, Chollet-imbert М., 2009, Ongena М., 2007, Romero D., 2007).

КЖ, полученная при выращивании штамма B.pumilus «Пашков» в течение 72 часов на разработанной питательной среде исследована в отношении актуальных энтеровирусов: вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки нетипированных 1-6 типы.

Для определения инфекционных титров энтеровирусов использована клеточная линия Vero Е6, оказавшаяся наиболее чувствительной. КЖ B.pumilus «Пашков» исследована на острую и хроническую цитотоксичность в отношении выбранной культуры клеток, а также максимально переносимую дозу (табл. 5).

Таблица 5

Оценка цитотоксичности КЖ штамма В. pumilus «Пашков» для клеточной

культуры Vero Е6

Разведения КЖ Количество живых, мертвых клеток в процессе культивирования и оценка жизнеспособности (%)*( время оценки в часах)

24 72 168

жив. мертв. % жив. мертв. % жив. мертв. %

неразв. 148,1 ±3,8 33,5 ±5,3 81,5 217,6 ±4,7 16,6+3. 2 92,9 121,6 ±4,1 56,9 ±3,8 68,1

1:5 159,5 ±1,9 28,9 ±1,4 84,7 227,3 ±3,3 12,8±2, 4 94,7 130,8 ±3,8 49,3 ±4,6 72,3

1:10 176,0 ±2,5 26,1 ±2,8 87,1 274,1 ±2,5 10,1±2, 4 96,5 148,0 ±2,8 32,0 ±3,5 82,2

1:20 243,8 ±4,3 28,5 ±4,9 89,5 319,0 ±3,2 4,6±2,2 98,6 150,1 ±2,0 30,3 ±2,5 83,2

1:60 266,8 ±7,9 10,1 ±4,0 96,4 343,8 ±2,7 1,8±1,5 99,5 209,9 ±1,8 10,1 ±2,5 95,4

1:80 296,1 ±7,2 0,91 ±0,6 99,7 384,1 ±7,5 0 100 274,1 ±3,3 0 100

КК 312,0 ±2,4 0 100 391,0 ±4,3 0 100 320,0 ±4,8 0 100

Примечание: КК-контроль клеток; *- жизнеспособность клеток оценивали как отношение живых клеток к количеству мертвых клеток и выражали в процентах от общего числа клеток

Данные таблицы свидетельствуют, что неразведенная КЖ B.pumilus «Пашков» не обладала острой цитотоксичностью (84,5% жизнеспособности клеток через 24 ч) и хронической цитотоксичностью (91,2% жизнеспособности клеток через 72 ч). Максимально переносимая доза при добавлении неразведенной КЖ составляла 69,9%.

Противовирусный эффект КЖ оценивали по лечебной и профилактической схемам, предусматривающим разное время обработки культуральной жидкостью клеточной культуры Vero Е6.

По лечебной схеме исходную и в разведениях от 1:5 до 1:640 КЖ вносили после заражения культуры клеток различными дозами энтеровирусов (табл. 6).

Таблица 6

Эффективность лечебного действия КЖ в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro

Вирусы Время наблюдения (час) Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект

Доза вируса в ^ТЦЦ5(1/о.5мл

100 50 25 12,5

Polio-1 48 1:80 1:160 1:640 1:640

72 1:80 1:80 1:640 1:640

ECHO 3 48 1:40 1:40 1:640 1:640

72 1:40 1:40 1:160 1:320

ECHO 6 48 1:40 1:640 1:640 1:640

72 1:40 1:160 1:160 1:640

Сох В (1-6) 48 1:80 1:80 1:40 1:40

72 1:80 1:80 1:40 1:40

Результаты выявили эффективную противовирусную защиту клеток Vero Е6, максимальную в отношении вируса полиомиелита I типа и ECHO 6 и менее выраженную в отношении вирусов Коксаки В (1-6).

Профилактическая схема оценки противовирусной активности КЖ предусматривала внесение различных разведений КЖ (от неразведенной до 1:640) на культуру клеток до добавления вируссодержащего материала (табл. 7).

Таблица 7

Эффективность профилактического действия КЖ в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в

опытах in vitro

Вирусы Время наблюдения (час) Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект

Доза вируса в logTЦД5o/o,5мл

100 50 25 12,5

Polio-1 48 1:40 1:160 1:160 1:640

72 1:40 1:160 1:160 1:640

ECHO 3 48 0 1:160 1:640 1:640

72 0 1:160 1:640 1:640

ECHO 6 48 0 1:20 1:640 1:640

72 0 1:20 1:640 1:640

Сох В (1-6) 48 0 1:20 1:640 1:640

72 0 1:20 1:320 1:640

Выявлено, что профилактический эффект КЖ зависел от дозы вируса, разведения КЖ и вида вируса и наиболее выражен в отношении вируса полиомиелита I типа.

Таким образом, штамм В.ритИиз «Пашков» обладает антибактериальной, противогрибковой и противовирусной активностью. Степень выраженности антагонистических свойств штамма зависит от параметров культивирования, в частности, от состава питательной среды. Изученные свойства штамма позволяют рекомендовать его в качестве пробиотического, а его метаболиты как основу для создания лекарственных препаратов.

выводы

1. Составлен генетический паспорт штамма, идентифицированного по физиолого-биохимическим свойствам как B.pumilus «Пашков». Штамм депонирован под номером 286 в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича, клетки которого продуцируют биологически-активные вещества, обладающие антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов.

2. Установлена антагонистическая активность штамма B.pumilus «Пашков в отношении широкого спектра тест-штаммов условно-патогенных, патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

3. Доказаны безопасность штамма B.pumilus «Пашков», о чем свидетельствовало отсутствие факторов патогенности, низкая адгезивность, нетоксичность, нетоксигенность, авирулентность и безвредность.

4. Разработана новая жидкая питательная среда, обеспечивающая максимальную выработку штаммом B.pumilus «Пашков» метаболитов, обладающих бактерицидной активностью в отношение 9 тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий, 42 клинических штаммов P.aeruginosa, а также выраженным фунгистатическим действием в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов.

5. Выявлена противовирусная активность в отношении вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки В нетипированных с 1 по 6 типы культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма B.pumilus «Пашков» в течение 72 часов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гринько О.М., Зверев В.В., Калошин A.A., Михайлова H.A. Выделение и изучение перспективного спорообразующего пробиотического штамма спорообразующих бактерий рода Bacillus II Сб. тезис. Всеросс. научно-практ. конф. «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва, 10-11 ноября 2008. - С. 44.

2. Гринько О.М., Зверев В.В., Калошин A.A., Михайлова H.A., Арзуманян В.Г. Выделение и изучение перспективного спорообразующего пробиотического штамма спорообразующих бактерий рода Bacillus. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - №3. - С.85-44.

3. Гринько О.М., Зверев В.В., Михайлова H.A. Изучение влияния питательной среды на антагонистические свойства бактерий B.pumilus. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2010. - №1. - С.72-76.

4. Михайлова H.A., Нагаева Ф.Г., Гринько О.М., Зверев В.В. Экспериментальное изучение противовирусной активности спорообразующих бактерий B.pumilus «Пашков». Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2010. - №2. - С.69-74.

5. Михайлова H.A., Гринько О.М. Бактерии рода Bacillus - продуценты биологически-активных веществ антимикробного действия. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2010. - №3. - С.85-90.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. БАВ - биологически-активные вещества

2. БСЭ — бактериостатический эффект

3. ИАМ - индекс адгезивности микроорганизма

4. КЖ - культуральная жидкость

5. МПА - мясо-пептонный агар

6. СПА - средний показатель адгезии

7. ТЦЦ - тканевая цитопатогенная доза

8. ФС - фармакопейная статья

9. ЦПД - цитопатогенное действие

Подписано в печать:

24.06.2010

Заказ № 3909 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Гринько, Ольга Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода Bacillus — антагонистически активные агенты против бактерий, грибов и вирусов.

1.1.1. Характеристика антагонистической активности бацилл.

1.1.2. Препараты пробиотиков на основе бактерий рода

Bacillus.

1.1.3. Пробиотические препараты на основе метаболитов.

1.2. Биологически-активные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus.

1.2.1. Физико-химические свойства биологически-активных веществ, выделяемых бациллами.

1.2.2. Условия синтеза биологически-активных веществ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2,ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Методы исследований.

2.3. Статистическая обработка результатов исследований.

ГЛАВА 3. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫДЕЛЕННОГО ШТАММА В. PUMILUS «ПАШКОВ».

3.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штамма В. pumilus.

3.2. Антагонистическая активность штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий и дрожжевых грибов в сравнении с другими представителями рода Bacillus.

3.3. Адгезивная активность штамма В. pumilus «Пашков» в опытах in vitro.

3.4. Определение чувствительности к антибиотикам и плазмидного профиля штамма В. pumiliis «Пашков».

3.5. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и безопасности штамма В. pumilus «Пашков» в опытах in vivo.

3.6. Характеристикарибосомальной РНК штамма/?.pumilus «Пашков».

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРУЮЩИХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ ШТАММОМ В. PUMILUS «ПАШКОВ» В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ И ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ.

4.1. Влияние состава питательной среды на ингибирующую активность биологически-активных веществ, синтезируемых штаммом В. pumilus «Пашков» в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов.

4.2. Оценка специфической активности продуктов синтеза штамма В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий

Pseudomonas aeruginosa.

4.3. Определение условий сохранения антимикробной активности культуральной жидкости Ä pumilus «Пашков».

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, СИНТЕЗИРУЕМЫХ ШТАММОМ В. PUMILUS «ПАШКОВ».

5.1. Изучение репродуктивной активности энтеровирусов на клеточных линиях Vero.

5.2. Определение инфекционного титра энтеровирусов.

5.3. Выявление цитотоксичности культуральной жидкости, полученной в результате культивирования В. pumilus «Пашков».

5.4. Оценка противовирусной активности культуральной жидкости

В. pumilus «Пашков» по лечебной схеме.

5.5. Оценка противовирусной активности культуральной жидкости

В. pumilus «Пашков» по профилактической схеме.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков""

Биологически-активные вещества, продуцируемые бактериями и обладающие антагонистическими свойствами, все активнее используются в качестве основ лекарственных средств, подавляющих рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей, а также нормализующих различные патологические и биохимические процессы в организме человека (22, 142, 169, 208, 234).

Наряду с известными бактериями, в основном, представителями нормальной микрофлоры кишечника, достаточно хорошо изученными в качестве продуцентов биологически-активных веществ, в последние годы активно исследуются бактерии рода Bacillus. Они являются представителями транзиторной микрофлоры кишечника и привлекают пристальное внимание исследователей, занимающихся разработкой лекарственных средств медицинского назначения на их основе (34, 97, 117, 256). Известно, что различные штаммы бацилл синтезируют биологически-активные вещества (БАВ), обладающие широким спектром антагонистических свойств не только против своего вида, но и неродственных патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (19, 80, 111, 165, 239).

В настоящее время наметилась тенденция в использовании пробиотиков как с профилактической целью, так и для лечения инфекций желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, онкологии, аллергических заболеваний и вирусных инфекций (140, 166, 168, 211). Однако на сегодняшний день противовирусный потенциал этих препаратов изучен недостаточно (264).

Биологически-активные вещества, выделяемые при культивировании бацилл, наряду с пробиотической активностью, представляют огромный интерес в качестве основы антимикробных препаратов, действующих избирательно на патогенные микробы без резких нарушений сложившегося микробиоценоза, обычно имеющих место при применении антибиотиков широкого спектра действия (99). Примером актуальных для медицины возбудителей являются Р. aeruginosa. Несмотря на успехи в антибактериальной терапии, достигнутые за последние десятилетия, Р. aeruginosa остается одним из наиболее проблемных возбудителей нозокомиальных и внебольничных инфекций (102). Р. aeruginosa обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам среды, антибактериальным препаратам и сохраняют жизнеспособность во многих антисептических растворах (53, 96). Поэтому получение и изучение новых антибактериальных субстанций, обладающих избирательным действием против Р. aeruginosa, по-прежнему является одной из актуальных задач современной микробиологии.

Метаболиты, полученные при культивировании различных штаммов, представляют ценность в качестве основы для безвредных безмикробных бесклеточных пробиотических продуктов и лекарств, имеющих направленный терапевтический эффект (1, 30, 74).

Синтез БАБ у микробов, в том числе у бактерий рода Bacillus, имеет генетическую детерминацию и наиболее полно реализуется при оптимально подобранных условиях культивирования. Поиск этих наиболее оптимальных условий культивирования, позволяющих эффективно выделять БАВ, также является актуальным.

Таким образом, отбор новых штаммов бактерий — кандидатов в пробиотики, в том числе рода Bacillus, исследование биологических свойств их метаболитов, обладающих направленным лечебным действием в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, грибов, вирусов, являются актуальными и перспективными направлениями современной Фарминдустрии.

Цель работы:

Цель работы — экспериментальное изучение антагонистической активности В. pumilus «Пашков» в отношении различных видов бактерий, дрожжеподобных грибов и вирусов.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические и физиолого-биохимические свойства выделенного штамма Bacillus pumilus.

2. Оценить антагонистическую активность штамма В. pumilus «Пашков» в отношение условно-патогенных, патогенных бактерий и дрожжевых грибов и определить возможность его использования в качестве пробиотического.

3. Подобрать оптимальные параметры выращивания штамма В. pumilus «Пашков» для получения культуральной жидкости с максимальной ингибирующей активностью в отношении микробов и определить условия сохранения ее активности.

4. Изучить противовирусную активность культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма В. pumilus «Пашков» на новой питательной среде, на примере возбудителей энтеровирусных инфекций.

Научная новизна

Составлен генетический паспорт штамма, идентифицированного как В. pumilus «Пашков». Подана заявка на изобретение (№ 2009129639 от 04.08.2009г.): «Штамм бактерий В. pumilus «Пашков» - продуцент биологически-активных веществ, обладающих антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов».

Разработана новая жидкая питательная среда, на которой происходит максимальная выработка штаммом В. pumilus «Пашков» метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий, клинических штаммов Р. aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов.

Практическая значимость работы

Выделенный и идентифицированный штамм бактерий рода В. pumilus «Пашков» депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Изученный штамм может быть рекомендован для разработки нового оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика медицинского и ветеринарного назначения и других лекарственных средств.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выделенный штамм бактерий по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствует виду В. pumilus «Пашков». Он не содержит плазмид, антагонистически активен в отношении условно-патогенных и патогенных микробов разных таксономических групп, имеет низкий уровень адгезии. По своим характеристикам штамм можно рекомендовать в качестве пробиотического.

2. Культуральная жидкость В. pumilus «Пашков» содержит метаболиты, обладающие бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, в том числе возбудителя госпитальных инфекций P. aeruginosa, и фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов. Активность метаболитов зависит от параметров культивирования.

3. Биологически-активные вещества, выделяемые при культивировании В. ритйш «Пашков» обладают противовирусной активностью.

4. Разработанная питательная среда для культивирования В. ритйиБ «Пашков» позволяет получить БАВ, активно влияющие на условно-патогенные и патогенные микробы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гринько, Ольга Михайловна

118 ВЫВОДЫ

1. Составлен генетический паспорт штамма, идентифицированного по физиолого-биохимическим свойствам как В. pumilus «Пашков». Штамм депонирован под номером 286 в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича, клетки которого продуцируют биологически-активные вещества, обладающие антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов.

4. Разработана новая жидкая питательная среда, обеспечивающая максимальную выработку штаммом В. pumilus «Пашков» метаболитов, обладающих бактерицидной активностью в отношение 9 тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий, 42 клинических штаммов P.aeruginosa, а также выраженным фунгистатическим действием в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов.

5. Выявлена противовирусная активность в отношении вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки В нетипированных с 1 по 6 типы культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма В. pumilus «Пашков» в течение 72 часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день для лечения различных патологических состояний, вызванных условно-патогенными и патогенными микробами, широко применяются антибиотики, которые помимо несомненного преимущества имеют ряд серьезных недостатков, в том числе осложнения на макроорганизм и формирование резистентности микробов. Поиск доступной и эффективной альтернативы антибиотикам побуждает исследователей разрабатывать и внедрять в практику препараты на основе бактерий рода Bacillus (47, 97, 164, 256). В основе лечебного действия таких препаратов лежит выраженный микробный антагонизм в отношении патогенных и условно-патогенных микробов. Доказанные преимущества пробиотических препаратов на основе спорообразующих бактерий это - безвредность, физиологичность для организма человека, отсутствие побочных эффектов (259). Поэтому для профилактики и лечения инфекций желудочно-кишечного тракта, дисбиозов различного генеза, аллергодерматозов, туберкулеза, гнойно -септических осложнений и других состояний широко используют препараты, содержащие различные штаммы бактерий рода Bacillus (25, 61, 97, 104, 114, 118, 119, 164, 168, 169, 170, 256).

Исследование биологических свойств спорообразующих бактерий выявило разнообразие их метаболических процессов, генетической структуры и биохимических свойств. Преимущества представителей бактерий рода Bacillus заключаются в высокой технологичности при производстве, стабильности при хранении, экологической безопасности (112).

Данные литературы наглядно демонстрируют широкие антагонистические возможности спорообразующих бактерий (13, 38, 39, 40, 41, 66, 69, 76, 80, 87, 90, 99, 220, 229). Однако высокая активность штаммов против одного набора тест-культур не гарантирует его активности против другого. Учитывая многообразие нозологических форм заболеваний с постоянно меняющимися возбудителями, для современной медицины востребован постоянный скрининг штаммов-антагонистов с заданными свойствами.

Целью нашего исследования являлось экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий рода В. pumilus «Пашков», выделенного из окружающей среды на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии ММА им. И. М. Сеченова.

Изученный штамм обладал морфологическими и физиологическими свойствами рода Bacillus, характеризовался набором ферментов, расщепляющих различные субстраты, что позволило идентифицировать его как В. pumilus.

Для культур микробов, рекомендуемым в качестве пробиотических, в настоящее время, определены требования: спектр и уровень антагонистической активности, показатели адгезии, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении (18, 22, 37, 107, 112, 122, 154). Важно также отсутствие приобретенной резистентности к антибиотикам у исследуемых штаммов (79, 194).

При разработке пробиотиков особое внимание уделяется критериям безопасности используемых штаммов для здоровья человека (18, 79, 83, 111, 112, 154, 169,198).

Бактериальный штамм, являющийся основой пробиотического препарата, должен быть таксономически идентифицирован с применением самой современной и валидированной методологии для сравнения с музейными штаммами всемирных коллекций микроорганизмов — АТСС, DSMZ, LMG, CIP, NCIMB, JAM с целью выявления их молекулярно-генетического полиморфизма (18, 79, 97). Для этого исследуются специфические для штамма пробы, полученные из хромосомальной ДНК или рибосомальной РНК.

При изучении антагонистических свойств В. pumilus «Пашков» выявлен высокий уровень активности в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий и дрожжевых грибов. Сравнительное изучение тестируемых штаммов рода Bacillus показало, что выделенный штамм В. pumilus «Пашков» не уступает по спектру и выраженности антагонистических свойств другим представителям спорообразующих бактерий.

Адгезивные свойства штамма бактерий В. pumilus «Пашков» соответствовали низкому уровню адгезии - ИАМ 1,93+0,29.

Оценка антибиотикочувствительности штамма B.pumilus «Пашков» показала, что он устойчив к 13 и чувствителен к трем из 22 антибиотиков различных химических групп.

Частой причиной лекарственной устойчивости у бактерий является наличие плазмид, несущих гены, контролирующие антибиотикорезистентность, поэтому проведено определение плазмидного профиля штамма бактерий В. pumilus «Пашков». Плазмидный анализ показал, что в препаратах выделенной ДНК из штамма В. pumilus «Пашков» плазмид не обнаружено, что подтверждает природный характер устойчивости к антибиотикам, связанной с хромосомной локализацией генов резистентности.

Безопасность выделенного штамма для макроорганизма оценена по токсичности, токсигенности, вирулентности и безвредности.

Изучение токсичности штамма В. pumilus «Пашков» показало, что все животные, которым вводили инактивированную культуру, остались живы и у них отсутствовали признаки заболевания.

Исследование токсигенности выявило, что за период наблюдения (5 суток) все животные, получавшие надосадочную жидкость после культивирования штамма В. pumilus «Пашков», оставались активными, прибавляли в весе, что свидетельствовало об отсутствии изучаемого признака.

Штамм В. pumilus не обладал вирулентностью в испытанных концентрациях от 0,5 до 2хЮ9КОЕ/мл. Все животные оставались живыми в течение периода наблюдения (5 суток), ни у одного из них не выявлено признаков заболевания.

Оценка безвредности штамма В. pumilus «Пашков» при введении возрастающих доз культуры при пероральном введении показала, что однократное введение per os больших доз (10x10 и 20 xl О9 КОЕ/мл) штамма не приводило к гибели животных. В. pumilus «Пашков» вызывал несущественное снижение веса животных в первые сутки после введения, в последующие дни вес животных нарастал и достигал нормальных значений для этого вида животных.

Результаты исследований свидетельствовали о безопасности изучаемого штамма.

В ходе работы проведена генетическая паспортизация штамма В. pumilus «Пашков» на основании риботипирования 16S субъединицы рРНК. Изученный штамм депонирован в ГИСК им. JI. А. Тарасевича под номером 286.

Таким образом, охарактеризован выделенный штамм бактерий В. pumilus «Пашков». Штамм обладал широким спектром антагонистической активности в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий и дрожжевых грибов, низкой адгезивностью, природной устойчивостью к 13 из 22 изучаемых антибиотиков, безопасностью и наличием генетического паспорта, что позволяет рекомендовать его в качестве кандидата в производственные пробиотические штаммы.

Известно, что бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество БАВ — протеолитических и амилолитических ферментов, антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других, которые являются интересными объектами для биотехнологической промышленности (106). При этом выработка бактериями БАВ, оказывающих ингибирующее влияние на условно-патогенные и патогенные микробы, имеет корреляционную зависимость от условий культивирования (12, 14, 15, 48, 141). Наиболее значимым фактором являются качественные и количественные характеристики питательной среды (12, 54). Генетически запрограммированные индивидуальные питательные потребности обуславливают синтез уникальных БАВ, свойственных только определенному виду и штамму бактерий. Возможность управления процессом получения БАВ открывает перспективы получения препаратов направленного действия.

Культивирование штамма В. pumilus «Пашков» наряду с другими пробиотическими штаммами рода Bacillus проводилось на жидких питательных средах известного состава, применяемых в производстве споровых пробиотиков (среда №9 и среда №5) и средах, предназначенных по данным литературы для культивирования бацилл: ВК-2, Спицайзена и L-бульон.

По данным опытов выявлено, что синтез БАВ начинался в течение 24 часов и достигал максимального уровня к 72 часам. Наибольшая активность выявлена у проб, взятых после культивирования штамма В. pumilus «Пашков» на среде № 9. Среды № 5 и ВК-2 слабо стимулировали выход БАВ, а в средах Спицайзена и L-бульоне он вообще отсутствовал.

Известно, что одним из значимых условий для синтеза антимикробных субстанций у бацилл, является состав питательной среды, особенно ее углеводный компонент. Такое обстоятельство явилось основанием для испытания влияния различных углеводов: глюкозы, маннита, лактозы, инулина и мальтозы на синтез БАВ, обладающих ингибирующими свойствами. Выявлено, что использование лактозы приводило к получению максимального уровня БСЭ в отношении тест-штаммов, который достигал

77,6+4,9%. Другие углеводные источники оказывали менее стимулирующее влияние на изучаемый показатель.

На основании полученных данных, лактоза выбрана в качестве перспективного компонента для новой питательной среды.

После определения источника углеводов составлена рецептура питательной среды. Оптимизация количественного состава углевода, дрожжевого экстракта, цитрата натрия, фосфата калия, глицерина в питательной среде способствовала выработке БАВ, обладающих бактерицидным эффектом в отношении 9 тест-иггаммов бактерий, 42 клинических штаммов P. aeruginosa и выраженного фунгистатического эффекта в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов. Для усиления фунгистатического действия вплоть до фунгицидного возможно требуется другая питательная среда, обеспечивающая синтез иных БАВ, проявляющих активность в отношении грибов.

Антагонистическая активность микроорганизмов является видо- и штаммоспецифичной (54). Проведено сравнительное культивирование представителей рода Bacillus: В. pumilus «Пашков», В. subtilis ЗН, В. subtilis 534, В. subtilis 1719 на новой питательной среде. Опыт показал, что все культуры бактерий, в отличие от В. pumilus «Пашков», не проявляли способности синтезировать БАВ, обладающих бактерицидным действием в отношении тест-штаммов, на предложенной питательной среде.

При определении параметров сохранения ингибирующей активности КЖ, выявлено, что ее специфическая активность сохранялась в условиях замораживания при температуре минус 18 в течение 12 мес.

Таким образом, проведенные эксперименты с культивированием штаммов бактерий рода Bacillus подтвердили данные различных источников о зависимости эффективного синтеза БАВ с максимальными ингибирующими свойствами от полноценности питательной среды. В результате экспериментов получена и испытана новая жидкая питательная среда для культивирования штамма В. pumilus «Пашков» с целью получения продуктов синтеза, активно влияющих на условно-патогенные и патогенные микробы.

Достаточное количество публикаций свидетельствуют о выраженном антагонистическом влиянии бактерий рода Bacillus в отношении бактерий и грибов (2, 55, 114, 130, 192, 208, 209, 220, 235, 265). Противовирусная активность бацилл изучена мало (130, 132,151, 179).

КЖ, полученная при выращивании штамма В. pumilus «Пашков» в течение 72 часов на разработанной питательной среде исследована в отношении актуальных энтеровирусов: вируса полиомиелита I типа, вирусов ECHO 3 и ECHO 6, вирусов Коксаки нетипированных 1-6 типы.

Для определения инфекционных титров энтеровирусов использована клеточная линия Vero Е6, оказавшаяся наиболее чувствительной. КЖ В. pumilus «Пашков» исследована на острую и хроническую цитотоксичность в отношении выбранной культуры клеток, определена максимально переносимая доза.

Данные опыта свидетельствовали, что неразведенная КЖ В. pumilus «Пашков» не обладала острой цитотоксичностью (81,5% жизнеспособности клеток через 24 ч) и хронической цитотоксичностью (92,9% жизнеспособности клеток через 72 ч). Максимально переносимая доза при добавлении неразведенной КЖ составляла 68,1%. С увеличением разведения КЖ изучаемые показатели снижались и наименее выраженные цитотоксические эффекты (ОЦД50=99,1%, ЦД50=100%) экспериментально зарегистрированы для разведения препарата 1:80.

Исследования показали, что КЖ обладала высокой антивирусной активностью в отношении всех исследованных энтеровирусов. При этом необходимо отметить, что лечебное действие КЖ несколько превосходило профилактическое действия в отношении неполиомиелитных энтеровирусов и практически не отличалось в отношении вируса полиомиелита I типа. Этот результат вероятно можно объяснить с позиций различной рецепторной специфичности энтеровирусов человека. Так, многими исследователями показано, что рецепторная специфичность является одним из ключевых параметров, определяющих чувствительность клеток к инфицированию энтеровирусами как in vitro, так и in vivo (57, 73, 186). Эффективность КЖ в лечебной схеме позволяет предположить, что БАВ проникают в инфицированные клетки и действуют на одну из стадий репликации энтеровирусов.

Эффективный профилактический эффект КЖ В. pumilus «Пашков» связан, по-видимому, с блокировкой репродукции энтеровирусов до проникновения в клетку, что является важной характеристикой БАВ, потенциально связанной с затруднением формирования резистентности к таким соединениям в связи с нежизнеспособности мутантов. Эффективность КЖ в профилактической схеме позволяет предположить, что БАВ действуют также на ранних этапах взаимодействия вирус - клетка.

Таким образом, впервые показана эффективная противовирусная активность КЖ В. pumilus «Пашков», установлен дозозависимый эффект препарата. Данный препарат в дальнейшем может быть использован в качестве препарата выбора для эффективной терапии энтеровирусных инфекций.

В заключении следует отметить, что изученный нами штамм B.pumilus «Пашков» и его метаболиты могут использоваться как основа для пробиотических препаратов с выраженной антибактериальной активностью (в том числе против P. aeruginosa), противогрибковой и противовирусной активностью в отношении некоторых энтеровирусов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Гринько, Ольга Михайловна, Москва

1. Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В. В. и др. Становлениепробиотикотерапии в России. Вестн. РАМН. 2005. - № 12. — С. 3-13.

2. Арзуманян В.Г., Михайлова Н. А., Гайдеров А. А. и др. Количественныйспособ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Журн. микробиол. — 2005. № 4.-С. 53-54.

3. Арчакова Е. Г., Несчисляев В. А. Оценка эффективности примененияновой питательной среды для контроля антагонистической активности пробиотиков // Объединенный мед. журнал. — 2004 № 5. — С. 93-94.

4. Асланов Б. И. Антибиотикорезистентность грамотрицательныхмикроорганизмов возбудителей внутрибольничных инфекций в стационарах: автореф. дис. .канд. мед. наук. СПб., 2001. — 24 с.

5. Ахметова Л. И., Бейкин Я. Б., Розанова С. М. Резистентностьвозбудителей внутригоспитальных инфекций // «Человек и лекарство»: тезис. VI Российского национального конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997.-С. 11.

6. Бациллы. Генетика и биотехнология / Под ред. Хервуда К. М.: Мир, 1992.

7. Белоусова Л. Н., Льнявина В. М. Дисбиоз кишечника и сердечно —сосудистые заболевания // Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению под ред. Е. И. Ткаченко, А. Н. Суворова. — СПб.: ИнформМед, 2009. С. 149-165.

8. Белявская В. А., Сорокулова И. Б., Масычева В. А. Рекомбинантныепробиотики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // «Дисбактериозы и эубиотики»: тезисы Всеросс. научно практ. конф., Москва, 26 - 28 марта 1996. - С. 7.

9. Биргер М. О. Справочник по микробиологическим и вирусологическимметодам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Медицина, 1982. — 464с.

10. Блинкова JI. П., Альтшулер М. Л., Дорофеева Е. С.и др. Молекулярныеосновы продукции и действия бактериоцинов // Журн. микробиол. — 2007.-№2.-С. 97-104.

11. Блинкова JI. П., Михайлова Н. А., Горобец О. Б. и др. Экспериментальноеизучение воздействия биологически активных препаратов на С. albicans. Клиническая лабораторная диагностика // 2005. № 5. — С. 5354.

12. Блинкова Л. П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства,методы выявления // Журн. микробиол. 2003. - № 3. - С. 109-113.

13. Блинкова Л. П., Семенов С.А., Бутова Л. Г. и др. Антагонистическаяактивность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // Журн. микробиол. 1994. - № 5. - С. 71-72.

14. Блинкова Л. П. Получение томицида — нового бактерийного препарата иизучение его биологической активности: автореф. дис. .докт. биол. наук. М., 1986.-25с.

15. Блинкова Л. П. Перспективы использования бактериоцинов дляпрофилактики и терапии инфекции // Журн. микробиол. 1984. - № 5. -С. 10-14.

16. Бойко Н. В., Лисецька М. В. Розробка пробютиюв виб1рковощп:

17. Протисклеромна ефектившсть деяких штам1в В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - № 4. - С. 194-198.

18. Бойко Н. В., Туряница А. И., Попович Е. П. и др. Антагонистическоедействие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella // Журн. микробиол. 1989. - № 1. - С. 87-91.

19. Бондаренко В. М. О совершенствовании пробиотических препаратов.

20. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» // Науч. — практ. журн. 2007. - № 1-2. - С. 24.

21. Бондаренко В. М. Характеристика и терапевтический потенциалпробиотиков по данным клинических испытаний // Биопрепараты. — 2007.-№ 1.-С. 11-15.

22. Бондаренко В. М. Метаболитные пробиотики: механизмытерапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях // Consilium medicum. 2005. - № 1. - С. 36-45.

23. Бондаренко В. М. Стабилизирующее действие метаболитного пробиотика

24. Хилак форте на нормальную микрофлору кишечника // Фарматека. -2005. -Ко 1.-С. 36-43.

25. Бондаренко В. М., Воробьев А. А. Дисбиозы и препараты спробиотической функцией // Журн. микробиол. 2004. - № 1. - С. 8492.

26. Бондаренко В. М. и др. Микроэкологические изменения кишечника и ихкоррекция с помощью лечебно-профилактических препаратов // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 2003. № 20. — С. 66-75.

27. Брилис В. И., Брилене Т. А., Ленцнер X. Б. и др. Методика изученияадгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. — 1986 № 4. — С. 210-212.

28. Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я., Хуснутдинова JI. М. Межбактериальныевзаимодействия // Журн. микробиол. 2003. - № 4. - С. 3-8.

29. Вахитов Т. Я., Бондаренко В. И., Петров Л. Н. Перспективы созданияпробиотических препартов на основе «чувства кворума» у бактерий // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 105-113.

30. Вахитов Т. Я., Момот Е. Н., Толпарев Ю. Н. Динамика и функцииэкзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М -17 // Журн. микробиол. 2005. - № 1. - С. 16-21.

31. Вахитов Т. Я., Момот Е. Н., Шалаева О. Н. и др. Состав и биологическаяактивность экзометаболитов Escherichia coli М -17 // Журн. микробиол. -2003.-№6.-С. 20-25.

32. Всемирная Организация Здравоохранения Электронный ресурс.

33. Доступ: http ://www;who. int/features/qa/07/ru/

34. Волков М. Ю., Ткаченко Е. И., Воробейчиков Е. В. и др. Метаболиты

35. Bacillus subtilis как новые перспективные пробиотические препараты // Журн. микробиол. 2007. - № 2. - С. 75-80.

36. Волков М. Ю. Комбинированный пробиотический препарат Бактистатинпродукт безотходной технологии. // Хранение и перераб. сельхозсырья. — 2006. — № 11. — С. 52—54.

37. Воробейников Е. В., Степанов А. В., Волков М. Ю. и др. Иммунотропныеэффекты пробиотического комплекса Бактистатин на фоне применения антибиотиков // Антибиот. и Химиотер. — 2008. — № 1-2. С. 3—9.

38. Воробьев А. А., Абрамов Н. А., Бондаренко В. М. и др. Дисбактериозыактуальная проблема медицины // Вестник АМН. 2005. - № 3. — С. 3-9.

39. Гайдеров А. А. Изучение свойств штаммов Escherichia coli М-17 и

40. Bacillus subtilis 1719 на модели экспериментального дисбиоза: дисс. . канд. мед. наук. — Москва, 2007. 96с.

41. Гатауллин А.Г. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis,перспективных для создания новых пробиотиков: дисс. . канд. мед. наук. Москва, 2005. - 131с.

42. Герасимов А. Н. Медицинская статистика: Учебное пособие. — М.: ООО

43. Медицинское информационное агенство», 2007. 480 с.

44. Гинцбург А. Л., Ильина Т. С., Романова Ю. М. "Qourum sensing" илисоциальное поведение бактерий // Журн. микробиол. 2003. - № 5. — С. 86-93.

45. Государственный реестр лекарственных средств: Официальное издание1. Минздрав РФ, 2006.

46. Егоров Н. С, Баранова И. П. Бактериоцины. Образование, свойства,применение // Антибиот. и Химиотер. — 1999. № 6. — С. 33-40.

47. Елфимова И. А., Ясников С. В., Перов А. Н. Интестивит и биокорм

48. Пионер» для повышения сохранности молодняка // Ветеринария. — 2006.-№7.-С. 16-17.

49. Ермоленко Е. И. Методы определения антагонистической активностипробиотических штаммов // Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению под ред. Е. И. Ткаченко, А. Н. Суворова. -СПб.: ИнформМед, 2009. С. 34-42.

50. Колганова Т. В., Ватанабэ X., Далин М. В. и др. К вопросу о механизмезащитного действия пробиотиков // Биомедицинские технологии: сб. науч. тр. Москва, 2001. - Вып. 16. - С. 23-29.

51. Коршунов В. М., Ефимов Б. А., Пикина А. П. Характеристикабиологических препаратов и пищевых добавок для функционального питания и коррекции микрофлоры кишечника // Журн. микробиол. -2000.-№ 2.-С. 86-91.

52. Коршунова Г. С., Садовникова В. Н. Состояние заболеваемостивнутрибольничными инфекциями в Российской Федерации // Внутрибольничные инфекции проблемы эпидемиологии, клиники диагностики, лечения и профилактики. — Москва, - 1999, — С. 124-125.

53. Кудлай Д. Г., Лиходед В. Г. Бактериоциногения. Л.: Медицина, 1966.204 с.

54. Кудрявцев В. А., Сафронова Л. А., Осадчая А. И. и др.

55. Антагонистическое действие аэробных спорообразующих бактерий на возбудителей эндометритов крупного рогатого скота // Микробиол. журн. (Киев). 1993. - № 2. - С. 74-82.

56. Лахтин В. М., Афанасьев С. С., Алешкин В. А. и др. Стратегическиеаспекты конструирования пробиотиков будущего // Вестн. РАМН. -2008. № 2. - С. 33-44.

57. Лашкевич В. А. 100 лет изучения вируса полиомиелита инеполиомиелитных энтеровирусов // Вопросы вирусологии. — 2008. № 4.-С. 41-44

58. Лобанок А. Г., Астапович Н. И., Михайлова Р. А. Биотехнологиямикробных ферментов. Минск: Наука и техника, 1989. — 205с.

59. Лукин А. А. Защитная функция пептидных антибиотиков бацилл //

60. Антибиот. и мед. биотехнол. 1987. - № 7. - С. 538-541.

61. Лукманова К. А., Гизатуллина С. В., Магазов Р. Ш. и др.

62. Антагонистическая активность бактерий рода Bacillus в отношении грибов дерматофитов // Журн. микробиол. — 2008. № 4. - С. 21-23.

63. Мазанкова JI. Н.,Ильина Н. О., Кондракова О. А. и др. Клинико -лабораторная эффективность пробиотика метаболического типа Хилак — форте при острых кишечных инфекциях у детей // Consilium Medicum. Педиатрия (Приложение). 2004. - № 2. - С. 34-38.

64. Мазанкова Jl. Н., Михайлова Н. А., Курохтина И. С. и др. Бактиспоринновый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей // «Человек и лекарство»: тез. докл. V Росс. Нац. Конгресс., Москва, 8 -12 апреля 1997. С. 199.

65. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии.

66. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. — 479с.

67. Мефед К. М. Новый споровый пробиотик ирилис и его использование вветеринарной практике : автореф. дис. . биол. мед. наук. Москва, 2007. 24 с.

68. Митрохин С. Д. Значение синегнойной палочки в инфекционнойпатологии человека // Инфекции и антимикробная терапия. — 2004. № З.-С. 10-15.

69. Михайлова Н. А., Никитенко В. И., Кузнецова Т. Н. Новый препарат

70. Методические указания по определению чувствительностимикроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04. М., Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России. -2004.-91с.

71. Молчанов О. В., Позняк A. JI. Применение Биоспорина в комплекснойтерапии бактериального вагиноза // Тез. докл. научной конф. «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней», СПб, 27-28 октября 1999. С. 187.

72. Несчисляев В. А. Пробиотики: микробиологические и технологическиеаспекты получения, контроля и конструирования препаратов: дисс. . докт. мед. наук. Пермь, 2005 — 277с.

73. Несчисляев В. А., Чистохина JI. П. О способности препарата

74. Микростим» влиять на чувствительность ряда патогенных микроорганизмов к антибиотикам // Пермский мед. журнал. — 2004. № 2. - С. 96-99.

75. Несчисляев В. А., Сафонова Г. М., Чистохина JL П. Новыйпробиотический препарат «Микростим» // Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: тезис, междунар. научно-практич. конф. — Москва, 2002.-С. 11.

76. Носов С. Д. Неполиомиелитные энтеровирусные (Коксаки и ECHO)инфекции. Руководство по инфекционным болезням у детей / Под ред. чл.-кор. АМН СССР, проф. С. Д. Носова. М.: Медицина, 1980. - 350с.

77. Онищенко, Г. Г., Алешкин В. А., Афанасьев С. С. и др.

78. Иммунобиологические препараты, перспективы применения в инфектологии. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ; 2002.

79. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / Под ред. Хулта Д., Крита Н.,

80. Снита П. и др.; пер. с англ. под ред. Заварзина Г.А. М.: Мир, 2001. -800 с.

81. Осадчая А. И., Кудрявцев В. А., Сафронова JL А. и др. Влияниеисточников питания на синтез экзополисахаридов и аминокислот штаммами Bacillus subtilis // Микробил. журн. (Киев) 1999. - № 5. — С. 56-63.

82. Осипова И. Г., Сорокулова И. Б. Безопасность споровых пробиотиков:современные аспекты // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты: Тезис. Межд. Конгрес., СПб, 15-16 мая 2007. — С. 59.

83. Осипова И. Г. Экспериментально-клиническое изучение споровыхпробиотиков: автореф. дис. . .докт. биол. наук. Москва, 2006. — 24с.

84. Осипова И. Г., Михайлова Н. А., Сорокулова И. Б. и др. Доклиническиеиспытания новых споровых пробиотиков // Вестн. РАМН. 2005. — № 12. - С. Зб^Ю.

85. Осипова И. Г., Михайлова Н. А., Сорокулова И. Б., и др. Споровыепробиотики // Журн. микробиол. 2003. - № 3. - С. 113-117.

86. Осипова И. Г., Сорокулова И. Б., Терешкина Н. В. и др. Изучениебезопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых пробиотиков // Журн. микробиол. 1998. - № 6. - С. 68-70.

87. Осипова И. Г. Некоторые аспекты механизма защитного действияколибактерина и споровых эубиотиков и новые методы контроля: автореф. дис. .канд. биол. наук. Москва, 1997. — 24с.

88. Парфенов А. И., Калоев Ю. К., Федотова Н. Г. Лечение дисбактериозакишечника препаратом Хилак — форте // Провизор. — 1998. — № 9. — С. 12-15.

89. Пат. 2181596 Российская Федерация. А61К35/74, C12N1/20, C12N1/20,

90. C12R1:125. Лекарственный препарат из бактерий рода Bacillus / Байгузина Ф. А., Алсынбаев М. М., Штроман Г. А., Кулагин В. Ф., Осипова И. Г., Байгузина С. Н.; опубл. 27.04.2002 // Бюл. № 12.

91. Пат. 2130316 Российская Федерация. А61К35/74, C12N1/20, C12N1/20,

92. C12R1:125. Лечебно — профилактический биопрепарат «Бактиспорин» // Михайлова Н. А., Кузнецова Т. Н., Кунягина О. В.; опубл. 20.05.99 // Бюл. № 14.

93. Пат. 2142287 Российская Федерация. А61К35/74, C12N1/20, C12N1/20,

94. Пат. 2115725 Российская Федерация. C12N1/20, А61К35/66, А61К35/74,

95. Пат. 2120992 Российская Федерация. C12N1/20, А61К39/04, А61К35/74,

96. C12N1/20, C12R1:125. Штамм Bacillus subtilis МЖ 6 - антагонист микобактерий туберкулеза / Марков И. И., Жданов И. П., Марков А. И.; опубл. 27.10.98 // Бюл. № 30.

97. Пат. 1722502 Российская Федерация. Ф 61, К 39/02, 35/74. Препаратбиоспорин для профилактики и лечения желудочно кишечных заболеваний человека / Смирнов В.В., Резник С. Р., Сорокулова И. Б. и др.; опубл. 30.03.92 // Бюл. № 12

98. Пат. 1723116 Российская Федерация. C12N1/20. А61К35/75. C12N1/20.

99. C12R1:125. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний / Никитенко В. И., Никитенко И. К.; опубл. 30.03.92 //

100. Петров Л. Н., Бондаренко В. М., Вахитов Т. Я. и др. QS- системы убактерий и перпективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов // Вестн. РАМН. 2006. - № 1. - С. 35^15.

101. Поберий И. А., Харечко А. Т., Садовой Н. В. и др. Новый комплексныйэубиотик «Биоспорин» для детей и взрослых // Здравоохранение Башкортостана. 1998. - № 1. - С. 97-99.

102. Покровский В. И., Семина Н. А. Внутрибольничные инфекциипроблемы и пути решения. // Эпидемиол. и инф. бол. — 2000. — № 5. — С. 12-14.

103. Похиленко В. Д., Перелыгин В. В. Пробиотики на основеспорообразующих бактерий и их безопасность // Химич. и биолог, безоп. 2007. - № 2 - 3. - С. 32-33.

104. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечениябольных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника // Методические рекомендации. — 1986, С. 23.

105. Пушкарев А. М., Туйгунова В. Г., Зайнуллин Р. Р. и др. Использованиеантагонистических свойств бактерий В. subtilis в терапии госпитальной инфекции мочевыводящих путей // Журн. микробиол. — 2007. № 2. -С. 90-93.

106. Розанова С. М. Резистентность к антибактериальным препаратам грамотрицательной флоры палат интенсивной терапии: автореф. дис. .канд. биол. наук. Екатеринбург, 2004. 24 с.

107. Розанова С. М. Р. aeruginosa как представитель госпитальной флоры // Успехи современного естествознания. — 2003. — № 11. С. 85-86.

108. Руднов В.А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации // Инфекции и антимикробная терапия. — 2002. №6. — С. 170-176.К

109. Сидоренко С. В., Резван С. П., Стерхова Г. А. и др. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия. — 1999. — № 3. — С. 25-33.

110. Скала Л. 3., Сидоренко С. В., Нехорошева А. Г. и др. Современные технологии в клинической микробиологии и химиотерапии. Автоматизированное место врача микробиолога, химиотерапевта и эпидемиолога// Клинич. лаб. диагн. — 2001. - № 12. - С. 25-33.

111. Слабоспицкая А. Т., Крымовская С. С.,Резник С. Р. Ферментативная активность бацилл, перспективных для включения в состав биопрепаратов // Журн. микробиол. 1990. - № 2. - С. 9-14.

112. Смирнов В. В., Косьюк И. В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus компонента пробиотиков // Журн. микробиол. — 1997. - № 6. -С. 36-43.

113. Смирнов В. В., Резник С. Р., Вьюницкая В. О. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus // Журн. микробиол. — 1993. № 4.-С. 92-112.

114. Смирнов В. В., Резник С. Р., Сорокулова И. Б. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных. Киев, 1983. — 54 с.

115. Смирнов В. В., Резник С. Р., Василевская И. А. Спорообразующие аэробные бактерии — продуценты биологически активных веществ. -Киев.: Наукова думка, 1983. -278с.

116. Сорокулова И. Б., Осипова И. Г., Терешкина Н. В. и др. Изучение безопасности бацилл — пробиотиков // Вестник РАМН. 2006. - № 1. -С. 50-54.

117. Сорокулова И. Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антиб. и химиотер. 1996. — № 10.-С. 13-15.

118. Страчунский Л. С., Богданович Т. М. Состояние резистентности к антиинфекционным химиопрепаратам в России // В кн.: Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под ред. Л. С.

119. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. — М.: Боргес, 2002. — С. 32-39.

120. Тарасова Т. А., Хамадеева JL Р. Комплексное лечение трихомонадных вагинитов во время беременности с использованием препарата Бактиспорин. Актуал. вопр. акушерства и гинекол. — 2001—2002. — Т. 1, № 1.-С. 15.

121. Урсова Н. И. Перспективы применения пробиотиков метаболитного типа в педиатрии. // Consilium-medicum. 2003. - Т.5. - № 6 Приложение.

122. Урсова Н.И. Роль и место пробиотиков в лечении и профилактике различных заболеваний и состояний, обусловленных дисбиотическими нарушениями кишечника. Научный обзор. М., 2002; 28 с.

123. Успенский Ю. П., Суворов А. Н. Современные принципы коррекции дисбиоза кишечника // Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению под ред. Е. И. Ткаченко, А. Н. Суворова. -СПб.: ИнформМед, 2009. С. 246-271.

124. Фазылова А. А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста: автореф. дис. .канд. мед. наук. Уфа, 1998. -24 с.

125. Хилько Т. В. Оптимизация питательных сред для роста и спорообразования бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis // Микробиол. журн. (Киев). 2004. - №1. - С. 63-68.

126. Царукьянова И. Г., Осадчая А. И. Совместное культивирование штаммов Bacillus subtilis и Escherichia coli, перспективных для создания комплексного пробиотика // Микробиол. журн. (Киев). -2007. №2. - С. 43 - 49.

127. Шарипова М. Р. Поздние стадии секреции белков у бацилл. Биохимия. -2002.-№11.-С. 1461-1472.

128. Широков А. В., Логинов О. Н., Мелентьев А. И. и др. Белковые и пептидные факторы из Bacillus spp. 739 ингибирующие рост фитопатогенных грибов // Прикл. биох. и микробиол. — 2002. №2. — С. 161-165.

129. Щербаков И. Т., Малышев Н. А., Грачева H. М. и др. Применение пребиотика Хилак — форте в комплексном лечении больных ОКИ и хроническими заболеваниями ЖКТ у взрослых // Новые лекарственные препараты. 2003. - № 7. — С. 51-59.

130. Abdel-Mawgoud A. M., Aboulwafa M. M., Hassouna N. A. Optimization of surfactin production by Bacillus subtilis isolate BS5 // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. - № 3. - C. 305-325.

131. Akpa E., Jacques P., Wathelet B. et al. Influence of culture conditions on lipopeptide production by bacillus subtilis // J. Zhejiang Univ. Sci. B. -2001. № 91-93. - C. 551-561.

132. Arena A., Maugeri T. L., Pavone B. et al. Antiviral and immunoregulatory effect of a novel exopolysaccharide from marine thermotolerant Bacillus licheniformis // Int. Immunopharmacol. 2006. - Vol. 1. - P. 8-13.

133. Asuma T., Demain A. L. Interaction between gramicidin S and its produser, Bacillus brevis // J. Ind. Microbiol. 1996. - Vol. 1. - P. 56-61.

134. Baron M. A. Patented strain of Bacillus coagulans increased immune response to viral challenge // Postgrad Med. 2009. - Vol. 2. - P. 114-118.

135. Basabaki K., Takao T., Shimonishi Y. et al. Subtilosin A, a new antibiotic peptide prodused by Bacillus subtilis 168: isolation, structural analysis, and biogenesis // J. Biochem. 1985. - Vol. 3. - P. 585-603.

136. Berditsch M., Afonin S., Ulrich A. S. The ability of Aneyrinibacillus migulanus (Bacillus brevis) to produse the antibiotic gramicidin S is correlated with phenotype variation // Appl. and Environ. Microbiol. — 2007. Vol. 20.- P. 6620-6628.

137. Besson F., Michel G. Influence of divalent ions on the solubility of iturin and bacillomycin L, antifungal peptidolipids of Bacillus subtilis // Microbios. — 1991. Vol. 262. - P. 15-21.

138. Bierbaum G., Brotz H., Koller K. et al. Cloning, sequencing and production of the lantibiotic mersacidin // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 1-2. -P.121-126.

139. Bizani D., Brandelli A. Influence of media and temperature on bactericin production by Bacillus cereus 8A during batch cultivation // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - Vol. 2. - P. 158-162.

140. Bonmatin J. M., Laprevote O., Peypoux F. Diversity among microbial cyclic lipopeptides: iturins and surfactins. Activity structure relationships todesign new bioactive agents // Comb. Chem. High Throughput Screen. — 2003. Vol. 6. - P.541—556.

141. Bottone E.G., Peluso R. W. Production by Bacillus pumilus (MSH) of an antifungal compound that is active against Mucoraceae and Aspergillus species: preliminary report. J. Med. Microbiol. 2003, 52:69-74.

142. Casula G., Cutting S. M. Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract // Appl. and Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - P. 2344-2352.

143. Cheigh C.l.,Pyun Y. R. Nisin biosynthesis and its properties // J. Biotechnol. Lett.-2005.-Vol. 27. P. 1641-1648.

144. Chen H., Chen Z. J., Wu M. B. et al. Screening the Fusarium graminearum ingibitory mutant strain from Bacillus subtilis by atmospheric-pressure plasma jet // J. Appl. Microbiol. 2010. - Vol. 1. - P. 96-103.

145. Cherif A.,Rezgui W., Raddadi N. et al. Characterization and purification of entomocin 110, a newly identified bacteriocin from Bacillus thuringiensis subsp. Entomocidus HD 110// Microbiol. Res. 2008. - Vol. 6. - P. 684692.

146. Cherif A., Chehimi S., Limem F. et al. Detection and characterization of the novel bacteriocin entomocin 9, and safety evaluation of its produser, Bacillus thuringiensis spp. entomocidus HD9 // J. Appl. Microbiol. — 2003. -Vol. 5.-P. 990-1000.

147. Chevanet C., Besson E., Michel G. Effect of various conditions on spore formation and bacillomycin L production in Bacillus subtilis // Can. J. Microbiol. 1986. - Vol. 3. - P. 254-258.

148. Chollet-imbert M., Gancel F., Slomianny C. et al. Differentiated pellicle organization and lipopeptide production in standing culture of Bacillus subtilis strains // Arch. Microbiol. 2009. - Vol. 1. - P. 63-71.

149. Cladera-Olivera F., Caron G., Brandelli A. Bactericin-like substansce production by Bacillus licheniformis strain P40 // Lett. Appl. Microbiol. -2004. Vol. 4. - P. 251-256.

150. Dash C., Ahmad A., Nath D. et al. Novel bifunctional inhibitor of xylanase and aspartat protease: implications for ingibition of fungal growth // Antimicrobial Agents & Chemotherapy. — 2001. Vol. 7. - P. 161—165.

151. Dirk Vollenbroich, Muhsin Ozel, Joachim Vater et al. Mechanism of Inactivation of Enveloped Viruses by the Biosurfactant Surfactin from Bacillus subtilis // Biologicals. 1997. - Vol. 3. - P. 289-297.

152. Dong Y. H., Zhang X. F., Xu J. L. et al. Insecticidal Bacillus thuringiensis silences Erwinia carotovora virulence by a new form of microbial antagonism, signal interference // Appl. and Environ. Microbiol. — 2004. -Vol. 2. P. 954-960.

153. Dubois J. Y., Kouwen T. R., Schurich C. R. et al. Immunity to the bacteriocin sublancin 168 is determined by the SunI (YolF) protein of Bacillus subtilis // Antimicrob. Agents Chemother. 2009. - Vol. 2. - P. 651-661.

154. Duc le H., Hong H. A., Barbosa T. M. et al. Characterization of Bacillus probiotics available for human use // Appl. and Environ. Microbiol. 2004. -Vol. 4.-P. 2161-2171.

155. Duc le H., Cutting S. M. Bacterial spores as heat stable vaccine vehicles // Expert Opin. Biol. Ther. 2003. - Vol. 8. - P. 1263-1270.

156. Egorov N. S., Loriia Zh. K., Vybornykh S. N. et al. Effect of the culture medium composition on bacitracin synthesis and sporulation in Bacillus licheniformis 28 KA // Prikl. Biokhem. Microbiol. 1986. - Vol. 1. - P. 107-111.

157. Egorov N. S., Vybornykh S. N., Loriia Zh. K. et al. Effect of temperature on exoprotease and bacitracin synthesis and sporulation in Bacillus licheniformis 28 KA // Prikl. Biokhem. Microbiol. 1983. - Vol. 6. - P. 733-737.

158. Egorov N. S., Udalova T. P. Processes of spore formation and gramicidin C formation by Bacillis brevis var. G. B. // Antibiotiki. 1977. - Vol. 4. - P. 308-312.

159. Ennahar S., Sonomoto K., Ishizaki A. Class Ha bacteriocins from lactic acid bacteria: antibacterial activity and food preservation // J. Biosci Bioeng. -1999.-Vol. 6. P. 705-716.

160. Entian K. D., de Vos W. M. Genetics of subtilin and nisin biosynthesis of lantibiotics // Antonie Van Leeuwenhoek. 1996. - Vol. 2. - P. 109-117.

161. Fiegnier C., Besson P., Michel G. Studies on lipopeptide biosinthesis by Bacillus subtilis: isolation and characterization of iturin, surfacing mutans // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - Vol. 1-2. P. 11-15.

162. Gary D. M., Bettina L. A. B. Cell cell communiticion in gram-positive bacteria // Annu. Rev. Microbiol. - 1997. - Vol. 51. - P. 527-564.

163. Gil M. C., de la Rosa M. C., Mosso M. A. Numerical taxonomy of Bacillus isolated from orally administered drugs // J. Appl. Bacteriol. 1986. - Vol. 4. - P. 347-356.

164. Gupta V, Garg R. Probiotics // Indian J Med Microbiol. 2009. - Vol. 3. -P. 202-209.

165. Hanlon G. W., Hodres N. A. Bacitracin and protease production in relation to sporilation exponential growth of Bacillus licheniformis on poorly utilized carbon and nitrogen sources // J. Bacterid. 1981. - Vol. 2. - P. 427-431.

166. Hoa T. T., Due L. H., Isticato R. et al. Fate and dissemination of Bacillus subtilis spores in a murine model // Appl. and Environ. Microbiol. 2001. -Vol. 67.-P. 3819-3823.

167. Hong H. A., Huang J. M., Khaneja R. et al. The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus food probiotics. // J. Appl. Microbiol. 2008. — Vol. 2. -P. 510-520.

168. Hong H. A., Due le H., Cutting S. M. The use bacterial spore formers as probiotics // FEMS Microbiol. Rev. 2005. - Vol. 4. - P. 813-835.

169. Hrusovska F., Blanarikova Z., Ondrisova M et al. Hylak forte drops in the treatment of atopic eczema in children. // Cesk. Pediar. 1993. - Vol. 48. -P. 94-96.

170. Hyronimus B., Le Marrec C., Urdaci M. C. Coagulin, a bacteriocin — like ingibitory substance produced by Bacillu coagulans 14 // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 85. - P. 42-50.

171. Ivanovich G., Alfoldi L. Bacteriocinogenesis in Bacillus megaterium // J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 3 - P.522-530.

172. Ivanovich G., Alfoldi L. A new antibacterial principle: megacine // Nature. — 1954.-Vol. 174.-P. 465.

173. Jack R. W., Tagg J. R., Ray B. Bacteriocins of Gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. 1995. - Vol. 2. - P. 171-200.

174. Jamil B., Hasan F., Hameed A. et al. Isolation of Bacillus subtilis MH-4 from soil and its potential of polypeptidic antibiotic production // Pak. J. Pharm. Sci. 2007. - Vol. 1. - P. 26-31.

175. Jarosz J. Polypeptide antibiotic 26a from Bacillus subtilis. I. Taxonomy and fermentative production // Acta Microbiol. Pol. — 1978. Vol. 3. - P. 213— 224.

176. Jetten A. M., Yogels G. D., de Windt F. Production and purification of Staphylococcus epidermidis bacteriocin // J. Bacteriol. 1972. - Vol. 112. -P. 235-242.

177. Liu G., Zhai Q., Schaffher D. et al. Bacillus alcalophilus peptidoglycan indused IFN-alpha-mediated inhibition of vaccinia virus replication // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004. - Vol. 2. - P. 197-204.

178. Kajimura Y., Kaneda M. Fusaricidin A, a new depsipeptide antibiotic produced by Bacillus polymyxa KT-8. Taxonomy, fermentation, isolation, structure elucidation and biological activity // J. Antibiot. (Tokyo). 1996. -Vol. 2.-P. 129-135.

179. Kajimura Y., Sugiyama M., Kaneda M. Bacillopeptins, new cyclic lipopeptide antibiotics from Bacillus subtilis FR-2 // J. Antibiot. (Tokyo). -1995.-Vol. 10.-P. 1095-1103.

180. Kamoun F., Mejdoub H., Aouissaoui H. et al. Purification, mino acid sequence and characterization of Bacthuricin F4, a new bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis // J. Appl. Microbiol. 2005. - Vol. 4. — P. 881-888.

181. Kaneda M., Kajimura Y. New antifungal antibiotics, bacillopeptins and fusaricidins // Yakugaku Zasshi. — 2002. Vol. 9. — P. 651-671.

182. Kelstrup J., Gibbson R. J. Bacteriocins from human and rodent streptococci // Arch. Oral. Biol. 1969. - Vol. 14. - P. 251-258.

183. Kinchington D., Kangro H., Jeffries D. J. Design and testing of antiviral compounds // In: Medical Virology: A Practical Approach. — 1995. — P. 147-171.

184. Kleerebezem M., Quadri L. E. N., Kuipers O. P. et al. Quorum sensing by peptide pheromones and two-component signal-transducction systems in Gram-positive bacteria // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - P. 895-904.

185. Klich M. A., Lax A. R., Bland J. M. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis // Mycopathologia. 1991.-Vol. 2.-P. 77-80.

186. Konishi M., Nishio M., Saitoh K. et al. Cispentacin, a new antifungal antibiotic. I. Production, isolation, physoco — chemical properties and structure // J. of Antibiotics. 1989. - Vol. 12. - P. 1749-1755.

187. Konishi M., Sugawara K., Tomita K. et al. Bu-2470, a new peptide antibiotic complex.I. Production, isolation and properties of Bu-2470 A, B1 and B2 // J. Antibiot. (Tokio). 1983. - Vol. 6. - P. 625-633.

188. Lebbadi M., Valdivia E., Galves A. et al. Cocultivation of the amoeba Naegleria Fowleri and the amoebicin producing strain Bacillus licheniformis M-4 // Appl. and Environ. Microbiol. - 1995. - Vol. 4. - P. 1649-1652.

189. Leclere V., Bechet M., Adam A. et al. Mycosubtilin overproduction by Bacillus subtilis BBG100 enchances the organism's antagonistic and biocontrol activities // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol. 8. — P. 4577-4584.

190. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occuing plasmids // Molec. Gen. Genet. 1977. - Vol. 157. - P. 167-174.

191. Lee K. H., Jun K. D., Kim W. S. et al. Partial characterization of polyfermenticin SCD, a newly identified bacteriocin of Bacillus polyfermenticus // Lett. Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 32. - P. 146-151.

192. Leifert C., Li H., Chidburee S. et al. Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillis subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45 // J. Appl. Bacteriol. 1995. - Vol. 2. - P. 97-108.

193. Leviveld H. L. M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. - Vol. 3. - P. 389-393.

194. Li J., Yang Q., Zhao L. H. et al. Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus subtilis strain B29 // J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2009. - Vol. 4. - P. 264-272.

195. Liu X., Haddad N. I., Yang S. et al. Structural characterization of eight cyclic lipopeptides produced by Bacillus subtilis HS0121 // Protein Pept. Lett. 2007. - Vol. 8. - P. 766-773.

196. Lukin A. A., Rozov A. N., Planutene M. V. Sporulation in Bacillus licheniformis strains that do not synthesis bacitracin and serine exo- and endoproteases // Antibiot. Med. Biotekhnol. 1986. - Vol. 12. - P. 886889.

197. Lukin A. A., Permogorov V. I., Rozov A. N. et al. Sporulation in Bacillus licheniformis during altered bacitracin synthesis // Antibiotiki. 1983. — Vol. 7. - P. 494-497.

198. Lukin A. A., Korolev V. I. Participation of the antibiotics of Bac. Pumilus and Bac. Subtilis in the regulation of bacterial spore formation // Antibiotiki. -1979.-Vol.3.-P. 182-185.

199. Maget-Dana R., Peypoux F. Iturin, a special class of spore-forming lipopeptides: biological and physicochemical properties // Toxycology. — 1994.-Vol. 1-3.-P. 151-174.

200. Marahiel M. A., Nakano M. M., Zuber P. Pegulation of peptide antibiotic production in Bacillus // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 5. - P. 631-636.

201. McAuliffe O., Hill C., Ross R. P. Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 3. - P. 285-308.

202. Motta A. S., Cannavar F. S., Tsai S. M. et al. Characterization of a range antibacterial substance from a new Bacillus species isolated from Amason Basin // Arch. Microbiol. 2007. - Vol. 4. - P. 367-375.

203. Muhammad S. A., Ahmad S., Hameed A. Antibiotic production by thermophilic Bacillus specie SAT 4 // Pak. J. Pharm. Sci. - 2009. - Vol. 3. -P. 339-345.

204. Munimbazi C., Bullerman L. B. Ingibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus // Mycopathologia. 1997-1998. - Vol. 3. - P. 163-169.

205. Murray P. R., Baron E. J., Pfaller M. A. et al. Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Washington D. C., ASM Press, 1999.

206. Muscettola M., Grasso G., Blach-Olszewska Z. et al. Effect of Bacillus Subtilis spores on interferon production. // Pharmacol. Res. 1992. - Vol. 2. -P. 176-177.

207. Nam D. N., Ryu D. D. Relationship between butirosin biosynthesis and sporulation in Bacillus circulans // Antimicrob Agents Chemother. — 1985. — Vol. 5.-P. 798-801.

208. Nakano M. M., Zuber P. Molecular biology of antibiotic production in Bacillus // Crit. Rev. Biotechnol. 1990. - Vol. 3. - P. 223-240.

209. Nefelova N. V., Filippova M. S., Egorov N. S. Effect of polymyxsin on Bacillus polymyxa sporogenesis // Mikrobiologiia. — 1980. Vol. 2. - P. 294-297.

210. Ochi K., Ohsawa S. Initiation of antibiotic production by the stringent response of Bacillus subtilis Marburg // J. Gen. Microbiol. 1984. — Vol. 10.-P. 2473-2482.

211. Ongena M., Jourdan E., Adam A. et al. Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitor of induced systemic resistance in plants // Environ Microbiol. .2007. - Vol. 4. -P. 1084—1090.

212. Osadchaia A. I., Kudriavtsev V. A., Safronova L. A. Effect of microelements on accumulation of biomass and exopolysaccharides in Bacillus subtilis strains // Mikrobiol. Z. 2000. - Vol. 1. - P. 20-29.

213. Osadchaia A. I., Kudriavtsev V. A., Safronova L. A. The effect of the acidity of the medium and of the temperature on the growth and polysaccharide excretion of Bacillus subtilis under submerged cultivation // Mikrobiol. Z. 1998. - Vol. 4. - P. 25-32.

214. Ozaki M. Y., Higashi H., Saito T. An. et al. Identity of megacin A with phospholipase A // Biken J. 1966. - Vol. 9. - P. 201-213.

215. Ozcengiz G., Alaeddinoglu N. G., Demain A. L. Regulation of biosynthesis of bacilysin by Bacillus subtilis // J. Ind. Microbiol. 1990. - Vol. 2. - P. 91-100.

216. Paik H. D., Bae S. S., Park S. H. et al. Identification and partial characterization of tochicin, a bacteriocin offduced by Bacillus thuringiensis subsp. Tochigiensis // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 1997. — Vol. 4. — P. 294-298.

217. Papagianni M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function and applications // Biotechnol. Ad. 2003. - Vol. 6. - P. 465-499.

218. Patton G. C., van der Donk W.A. New developments in lantibiotic biosynthesis and mode of action // Curr. Opin. Microbiol. 2005. — Vol. 8. -P. 543-851.

219. Perez C., Suarez C., Castro G. R. Production of antimicrobials Bacillus subtilis MIR 15 // J. Boitechnol. 1992.- Vol. 2-3. - P. 331-336.

220. Peypoux F., Bonmatin J. M., Wallach J. Recent trends in the biochemistry of surfactin // Appl. Micribiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 5. - P. 553-563.

221. Pinchuk I. V., Bressolier P., Verniuil B. et al. In vitro anti — Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics // Antimicrob. Agents and Chemother. 2001. - Vol. 45. — P. 3156-3161.

222. Polishchuk O. I., Koltukova N. V., Cherniavs'ka L. M. et al. The identification of freshly isolated strains, causative agents of human candidiasis and the search for effective antifungal probiotics. // Microbiol. Z. 1999. - Vol. 4. - P. 45-53.

223. Priest F. G., Goodfellow M., Todd C. A numerical classification of genus Bacillus // J. Gen. Microbiol. 2006. - Vol. 7. - P. 1847-1882.

224. Quan C. S., Wang J. H., Xu H. T. et al. Identification and characterization of a Bacillus amyloliquefaciens with haigh antifungal activity // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006. - Vol. 1. - P. 7-12.

225. Rahman M. S., Ano T., Shoda M. Second stage production of iturin A by induced germination of Bacillus subtilis RB14 // J. Biotechnol. 2006. — Vol. 4.-P. 513-515.

226. Rochfort S. Metabolomics reviewed: a new "omics" platform technology for systems biology and implications for natural products research. J. Nat. Prod. -2005. Vol. 12.-P. 1813-1820.

227. Romero D., de Vicente A., Rakotoaly R. H. et al. The iturin and fengycin families of lipopeptides are key factor in antagonism of Bacillus subtilis toward Podosphaere fiisca // Mol. Plant. Microb. Interact. 2007. - Vol. 4. -P. 430^140.

228. Rudkowski Z., Bromirska J. Reduction of the duration of salmonella excretion in infants with Hylak forte // Pedietr. Padol. 1991. - Vol. 26. -P. Ill -114.

229. Sablon E., Contreras B., Vandamme E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2000. - Vol. 68. - P. 21-60.

230. Sanders M. E. Probiotics: considerations for human health // Nutr Rev. — 2003.-Vol.3.-P. 91-99.

231. Sandrin C., Peypoux F., Michel G. Coproduction of Surfactin and iturin A, lipopeptides with antifungal properties, by Bacillus subtilis // Biotechnol. Appl. Biochem. 1990. - Vol. 4. - P. 370-375.

232. Sharga B. M., Turianitsa A. I., V'iunitskaia V. A. The antagonistic activity of spore bacteria in relation to representatives of genus Erwinia. // Microbiol. Z. 1994. - Vol. 1. - P. 9-16.

233. Shibazaki M., Shimizu Y., Yamaguchi H. et al. YM 47522, a novel antifungal antibiotic produced by Bacillus sp. I. Taxonomy, fermentation, isolation and biological properties. // J. of Antibiotics. - 1996. - Vol. 4. -P. 340-344.

234. Senesi S. Bacillus spores as probiotic products for human use. In: Ricca E., Henriques A. O., Cutting S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging application // Norfolk, UK: Horizont Bioscences Rpess. 2004. — P. 131-141.

235. Smirnov V. V., Sorokulova I. B., Pinchuk I. V. Bacteria of Bacillus species procpective source for biologically active substances // Mikrobiol. Z. -1996.-Vol. l.-P. 72-79.

236. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and cell death // Mol. Microbiol. Ibid. 2005. - Vol. 4. - P. 845-857.

237. Stover A. G., Driks A. Secretion, localization, and antibacterial activity of TasA, a Bacillus subtilis spore associated protein // J. Bacteriol. - 1999. -Vol. 5.-P. 1664—1672.

238. Svetoch E. A., Stern N., Eruslanov B. V. et al. Isolation of Bacillus circulans and Paenibacillus polymyxa strains inchibitory to Campylobacter jejuni and characterization of associated bacteriocins // J. food Prot. 2005. - Vol. 1. -P. 11-17.

239. Tagg J., Read R., Mc Given A. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria // Bact. Rev. 1976. - Vol. 3. - P. 722-756.

240. Tenoux I., Besson F., Michel G. Studies on bacillomycin D byosintesis by Bacillus subtilis // Microbios. 1993. - Vol. 298. - P. 29-37.

241. Tenoux I., Besson F., Michel G. Studies on the antifungal antibiotics: bacillomycin D and bacillomycin D methylester // Microbios. 1991. - Vol. 272-273.-P. 187-193.

242. Tong Y., Ma Z., Chen W. et al. Purification and partial characterization of antagonistic proteins from Bacillus subtilis B034 // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1999. - Vol. 4. - P. 339-343

243. Tsuge K., Ano T., Shoda M. Isolation of gene essential for biosynthesis of the lipopeptide antibiotics plipastatin B1 and surfactin in Bacillus subtilis YB8 // Arch. Microbiol. 1996. - Vol. 4. - P. 243-251.

244. Tzeng Y. M., Rao Y. K., Tsay K. L. et al. Effect of cultivation conditions on spore production from Bacillus amyloliquefaciens B128 and its antagonism to Botrytis elliptica // J. Appl. Microbiol. 2008. - Vol. 5. - P. 1275-1282.

245. Urdaci M. C., Bressllier Ph., Pinchuk I. Bacillus clausii probiotic strains: antimicrobial and immunomodulatory activities // J. Clin. Gastroenterol. -2004.-Vol. 2.-P. 86-90.

246. Wang Y., Zhang Z. Bacterial spore — a new vaccine vehicle-a review // Wei Sheng Wu Xue Bao. 2008. - Vol. 3. - P. 413-417.

247. Wei Y. H., Wang L. F., Chang J. S. Optimization iron supplement strategies for enhanced surfactin production with Bacillus subtilis // Biotechnol. Prog. 2004. - Vol. 3. - P. 979-983.

248. World Health Organization. Meeting of the Strategic Advisory Group of Experts on immunization, April 2010 — conclusions and recommendations // Weekly Epidemiological Record (WER). 2010. - Vol. 85. - P. 197-212.

249. Xie D., Peng J., Wang J. et al. Purification and properties of antifungal protein X98III from Bacillus subtilis // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1998. -Vol. l.-P. 13-19.

250. Yeh M. S., Wei Y. - H., Chang J. - S. Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by addition of solid carriers // Biotehnol. Progr. -2005. - Vol. 4. - P. 1329-1334.

251. Yilmaz M., Soran H., Bevatli Y. Antimicrobial activities of some Bacillus spp. strains isolated from the soil // Microbiol. Res. 2006. - Vol. 2. - P. 127-131.

252. Zarubina A. P., Aslanian R. R., Egorov N. S. Lyophilization of the spore and vegetative cells of Bacillus brevis var. G-B.- producer of gramicidin S // Antibiotiki. 1983. - Vol. 8. - P. 605-608.

Информация о работе

Гринько, Ольга Михайловна
кандидата медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Экспериментальное изучение антагонистических свойств штамма бактерий Bacillus pumilus "Пашков" - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы