Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам"
Направахрукописи
Широков Алексей Валерьевич
МИКОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS COHN И ИХ РОЛЬ В АНТАГОНИЗМЕ К ПОЧВЕННЫМ МИКРОМИЦЕТАМ
Специальность: 03.00.07 — микробиология 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Уфа-2004
Работа выполнена в институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук.
Научный руководитель: кандидат биологических наук,
Актуганов Глеб Эдуардович
Научный консультант: доктор биологических наук
профессор Мелентьев Александр Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Чемерис Алексей Викторович
доктор химических наук,
профессор Варламов Валерий Петрович
Ведущая организация: Башкирский государственный университет
Защита состоится Ч&сю^я 2004 г. в 14.00 часов на заседании Регионального Диссертационного Совета КМ 002.124.01. при Президиуме Академии наук республики Башкортостан, 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Уфе «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г.Уфа, ул. Новороссийская, 105.
Автореферат разослан 5 ноября 2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, Л
Доктор медицинских наук /¡! К. А. Лукманова
& 9 6$ 8
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Создание эффективных средств защиты культурных растений от заболеваний, вызываемых почвенными грибами, является актуальной задачей современной микробиологии. Одним из способов биологического контроля фитосанитарного состояния почвы может быть миколитическая активность почвенных бактерий (S.Pleban и др., 1997; S.Harish и др., 1998). В этом аспекте значительный интерес представляют бактерии Bacillus Cohn в связи с их способностью к синтезу широкого спектра антибиотических соединений и гидролитических ферментов (P.Nielsen, J.Sorensen, 1997).
Лизис фитопатогенных грибов (миколизис) почвенными бактериями Bacillus описан давно (C.L.Porter, 1931; Я.ПХудяков, 1935) и рассматривается как одно из проявлений микробного антагонизма (Ю.М.Возняков-ская, А.К.Труфанова, 1988). Причины лизиса грибов, как правило, связаны с повреждением/разрушением их клеточной стенки, либо нарушением проницаемости ЦПМ в результате действия бактериальных ферментов и антибиотиков (K.Horikoshi, S.Iida, 1958; D.Backhouse, A.Stewart, 1989). Одной из причин бактериального миколизиса может быть конкуренция за субстрат (S.M.Olsen, K.F.Baker, 1968; А.К.Никонорова, 1996).
Гидролитические ферменты, способные разрушать компоненты клеточной стенки грибов, широко распространены у бактерий рода Bacillus в связи с присутствием в почве достаточного количества индукторов. Основной их функцией является извлечение доступных источников углерода из мертвых органических остатков (R.Mitchell, MAlexander, 1962; M.B.Howard et. al., 2003), поэтому роль этих ферментов в лизисе клеток живых и активно растущих грибов остается неясной. Не очень понятна также роль миколитических ферментов бацилл в явлении микробного антагонизма.
Результаты проведенных исследований позволят расширить научные представления о свойствах миколитических ферментов бактерий рода Bacillus, уточнить их роль в антагонизме m гриб-
ного мицелия в почве и оценить перспективы применения бактериальных продуцентов миколитических ферментов в биоконтроле болезней культурных растений.
Цель работы - изучение роли внеклеточных гидролитических ферментов бактерий Bacillus Cohn, таких как хитиназа, ß- 1.3-глюканаза. хи-тозаназа и протеаза в антагонизме к фитопатогенным грибам. В соответствии с целью были определены следующие задачи:
1. Провести отбор антагонистических штаммов бактерий Bacillus Cohn - продуцентов миколитических ферментов из коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН.
2. Определить миколитическую активность гидролазного комплекса, а также индивидуальных ферментов бактерий Bacillus Cohn.
3. Оценить антигрибную активность индивидуальных миколитичес-ких ферментов in vitro.
4. Изучить взаимодействие миколитических ферментов с низкомолекулярными веществами антибиотической природы.
Научная новизна. Проведено комплексное исследование взаимосвязи миколитической и антигрибной активности как у отдельных штаммов, так и у групп бактерий Bacillus, отличающихся по своим свойствам. Показано, что способность бацилл подавлять рост фитопатогенных грибов не коррелирует с их общей миколитической и хитиназной активностью. Обнаружено, что наибольшую активность в гидролизе клеточных стенок грибов проявляют хитиназа и ß- 1,3 -глюканаза. Установлена ключевая роль ß- 1,3-глюканазы Bacillus sp. 739 (ИБ-30) в лизисе нативного (неповрежденного) мицелия фитопатогенных грибов. Показано, что миколитичес-кие ферменты проявляют низкую собственную антигрибную активность (хитиназа) или не имеют таковой (протеаза), но способны усиливать действие антибиотических веществ бактерий Bacillus на 10-70%. Выявлено, что лизис живой культуры гриба в питательной среде происходит только при совместном действии ферментов и антибиотиков бактерий Bacillus Cohn. В ход^ работы выделены белковые соединения неферментной приро-
ды, подавляющие рост фитопатогенных грибов, в частности, у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30) обнаружен антигрибной белок с Mw~14 кДа.
Практическая значимость. Установлены индивидуальные особенности продукции миколитических ферментов штаммами бацилл - антагонистов, что имеет значение для разработки технологии получения ферментных препаратов в лабораторных и промышленных условиях. Отобраны штаммы - наиболее перспективные продуценты миколитических ферментов и антибиотических веществ. Штамм Bacillus sp. 739 запатентован как продуцент комплекса хитинолитических ферментов и ламина-риназы (Патент РФ № 2213773).
Положения, выносимые на защиту:
1. Антигрибная активность бактерий Bacillus Conn не коррелирует с активностью их миколитических ферментов. Синтез таких ферментов не является критерием антагонистических свойств бактерий.
2. Миколитическая активность бактерий Bacillus Cohn определяется составом их ферментного комплекса. Ключевым ферментом в лизисе на-тивного мицелия грибов является р-1,3-глюканаза.
3. Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn проявляют низкую антигрибную активность, и их роль в антагонизме к фитопатоген-ным грибам ограничивается лизисом ослабленного мицелия.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 6-й и 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003), Первой Всероссийской интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем» (Уфа, 2002), Первом Международном конгрессе Европейского микробиологического общества FEMS (Любляна, Словения, 2003), 7-й Международной конференции Российского хитинового общества «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано научных 10 работ.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), объекты и методы исследований (1 глава), результаты и их обсуждение (3 главы), заключение, выводы и список литературы, включающий 203 ссылки, из них 33 на русском языке. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит 41 рисунок и 15 таблиц.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились в 2001-2003 гг. в лаборатории прикладной микробиологии института биологии УНЦ РАН.
Объекты исследований. Основным объектом исследований являлись аэроиные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn из коллекции института биологии Уфимского научного центра РАН. В работе изучали штаммы двух групп бацилл, выделенных по различным схемам скрининга. Первую представляли штаммы — антагонисты фитопатогенных грибов. Большинство из них принадлежало к виду В subtilis (Мелентьев и др., 1991). Вторую группу составляли антагонисты, близкие к виду В. circulans, выделенные в ходе скрининга бактерий - продуцентов хитинолитичес-ких ферментов.
В качестве тест-объектов для анализа антагонистической и миколити-ческой активности бактерий Bacillus и их ферментов использовали фито-патогенные и сапрофитные грибы из коллекции Института биологии УНЦ РАН: Alternaria alternata (Fr.) Keissl, Aspergillus niger van Tieghem, A. glaucusLh, FusariumsolaniMart. App. et Wr, F. oxysporum (Schlecht) Snyd. etHans, F. graminearum Schwabe, F. moniliforme Sheild., F. sporotrichiella Bilai. Var. sporotrichioid.es (Sherd.) Bilai, F. nivale (Fr.) Ces., Helminthosporium sativum Pom., King et Bakke (= Drechlera sorokiniana (Sacc.) Subram. et gain, или Bipolaris sorokiniana), Paecilomyces variotiiBainier, Rhizoctonia solani, Trichoderma sp. Pers. В работе использовали также штаммы Fusarium culmorum (W. G. Smith) Sacc. nF. culmorum (W. G. Smith)Sacc. из коллекций ВИЗР и ВКМ, депонированные под номерами 227 и 844, соответственно.
Питательные среды и условия культивирования. Бактериальные штаммы-антагонисты поддерживали на твердой питательной среде следующего состава (г/л): агар, 16,0; коллоидный хитин, 5,0; пептон, 1,0; дрожжевой экстракт, 1,0; кукурузный экстракт, 0,5; (NH4)2HP04, 1,0; КН2Р04, 1,0; MgS04*7H20, 0,5; дистиллированная вода, ~1 л.
Комплексный препарат миколитических ферментов получали выращиванием бактерий в жидкой питательной среде того же состава, включающей в качестве источников углерода 0,4% (с/в) измельченных плодовых тел гриба Macrolepiotaprocera; 0,1% коллоидного хитина и 0,1 % коллоидного хитозана. Культивирование проводили в качалочных колбах емкостью 250 мл при 35±1°С и 160 мин"1 в течение 48-60 ч.
Культуры микромицетов поддерживали пересевами на агар Чапека или КГА Биомассу грибов для анализа миколитической активности антагонистов выращивали в картофельно-сахарозной среде при 28°С в течение 10-12 сут.
Общую антигрибную активность бактерий Bacillus оценивали по степени подавления роста гриба Н. sativum в смешанной жидкой культуре. Картофельно-сахарозную среду (1%, в/о) предварительно засевали суспензией спор гриба (Ю4-105 КОЕ/ объем среды), инкубировали 48 ч при 28°С, затем вносили биомассу 24-ч бактериальной культуры. Совместное культивирование проводили в течение 6 сут с момента внесения спор гриба при 28°С без дополнительной аэрации. Выросший мицелий отмывали от остатков культуральной среды последовательно водопроводной и дистиллированной водой на воронке Бюхнера под вакуумом. В качестве подложки использовали фильтровальную бумагу Whatman No. 1 с измеренными значениями сухого веса. Отмытый мицелий высушивали при 105°С в течение 60 мин и измеряли его сухой вес. Выход грибной биомассы в опытных образцах рассчитывали в % по отношению к контролю, который принимали равным 100%. Степень ингибирования роста грибов в совместной культуре определяли по простой формуле: СИ=К-О (%),
где СИ - степень ингибирования, К - выход биомассы гриба в контрольном варианте, равный 100%, О-в опытном варианте в % от контро-
ля. Эксперименты проводили в 3-кратной повторности.
Антигрибную активность ферментов и метаболитов бактерий Bacillus определяли методом, аналогичным описанному выше. В качестве суммарного препарата внеклеточных метаболитов бацилл использовали супернатант культуральной жидкости, полученный при их культивировании в жидких питательных средах различного состава. Соотношение вносимых метаболитов и очищенных литических ферментов к объему питательной среды варьировали от 1:10 до 1:500. Во избежание контаминации бактериальной микрофлорой исследуемые препараты пропускали через бактериальные фильтры ("Mülipore") с диаметром пор 0,45 мкм, либо вносили в питательную среду стерильный раствор гидрохлорида тетрациклина в 0,9%-ном NaCl (0,4 мг/мл).
Общую миколитическую активность в препаратах КЖ бацилл определяли по степени гидролиза компонентов клеточных стенок в измельченном мицелии Н sativwn. Реакционная смесь включала 1,5 мл раствора КЖ в фосфатно-цитратном буфере (рН 6,0,50 мМ) и 1% (в/о) субстрата. Ферментативную реакцию проводили 1-3 ч при 50°С. Миколитичес-кую активность рассчитывали по скорости образования восстанавливающих Сахаров в надосадочной жидкости (мкМ М-ацетил-Б-глюкозамина на 1 мл за 1 час). Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли феррицианидным методом (Синицын и др., 1993).
Определение активности миколитических ферментов. Хитиназ-нуюихитозаназную активность оценивали, используя в качестве субстрата 1%-ную суспензию коллоидного хитина и хитозана (степень деацетили-рования~85%), соответственно. Время инкубации составляло 1 ч при 50°С и рН 6,0. Активность $-1,3-глюканазы определи по степени гидролиза 0,2% раствора ламинарина (10 мин при 50°С, рН 6,0). За единицу активности карбогидраз принимали количество фермента, образующее 1 мкМ-экв соответствующего продукта за 1 мин в 1 мл. Протеолитическую активность бацилл-антагонистов определяли на основе модифицированного метода Haab с соавт. (1990).
Специфическую активность компонентов хитинолитического комплекса оценивали по гидролизу хромогенных производных N-aueran-D-глюкозамина и его олигомеров - п-нф-Ы-АГА, п-нф-(Ы-АГА)2 и п-нф-(Ы-АГА)3 (10 мин при 50°С, рН 6,0). Активность выражали как скорость образования свободного п-нитрофенола, мкМ/мл*мин.
Очистка миколитических ферментов Bacillus sp. 739 (ИБ-30) Суммарную фракцию литических ферментов осаждали из супернатанта КЖ сульфатом аммония (65%, в/о). Осажденный препарат диализовали в течение ночи и наносили на колонку (9,6x11 см) с ДЭАЭ-Сефадексом А-50, уравновешенную трис-НС1 (50 мМ, рН 7,1). Сорбент промывали двойным объемом равновесного буфера, связанные белки элюировали ступенчатым градиентом 0,1-0,2 М NaCl в том же буфере со скоростью 1,5 мл/ см2хмин. Белковые фракции с активностью различных ферментов объединяли. Хитиназу затем очищали аффинной адсорбцией на коллоидном хитине (Мелентьев и др., 2001). Дополнительную очистку хитозаназы Bacillus sp. 739 проводили с помощью хроматографии на тойоперле HW-50 (Актуганов и др., 2003).
Электрофорез очищенных белков проводили в 12,5%-ном ПААГ с 0,1 % ДДС-Na в системе Laeramli (1970). Молекулярную массу определяли по калибровочной кривой относительной подвижности белковых маркеров ("Bio-Rad").
Микроскопия. Влияние живых культур антагонистов, их ферментов и метаболитов на грибы изучали, используя световой микроскоп "Amplival" 30-G048a ("Carl Zeiss Jena") с увеличением до 500х. Дифференциальное окрашивание клеточных стенок грибов осуществляли универсальным методом (Методы экспериментальной микологии, 1983). Микрофотографии получали с помощью автоматической фотоприставки mfmatic ("Carl Zeiss Jena").
Статистическую обработку результатов результатов осуществляли на персональном компьютере с помощью программ Ехсе1-97 и Origin 5,0, применяя критерий Стьюдента при Р=0,95. Эмпирический коэффициент корреляции вычисляли по формуле
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отбор штаммов бацилл-антагонистов — продуцентов миколити-ческих ферментов осуществляли из двух групп бактерий рода Bacillus, выделенных по различным схемам скрининга В качестве критерия отбора использовали способность к синтезу хитиназы Среди 70 коллекционных штаммов бацилл-антагонистов лишь 19 проявляли хитиназную активность, что составляет около 27% В группе 20 коллекционных хити-нолитических штаммов антигрибную активность проявляли также около трети всех штаммов (рис 1)
А Б
Рис 1 Содержание продуцентов хитиназы среди антагонистов (А) и штаммов, проявляющих антигрибную активность, среди хитинолитичес-ких бактерий (Б)
Для дальнейших исследований отбирали 26 культур, в том числе в качестве типового миколитического штамма - Bacillus sp 739 (ИБ-30), продуцирующий широкий спектр гидролитических ферментов, но проявляющий слабую антигрибную активность В качестве типового антагонис-.та дополнительно отобрали штамм В subtihs IB-54, проявляющий высокую антигрибную активность, но неспособный к синтезу основных ми-колитических ферментов
Антигрибная активность бактерий Bacillus Cohn и их метаболитов. Из 26 отобранных штаммов бацилл 20 подавляли не только прорастание конидий Н sativum в картофельно-сахарозной среде, но и дальнейший рост 24 ч культуры гриба Три штамма подавляли рост 3 сут культуры гриба на 65-80%
и
По проявлению антигрибной активности бактерий и их метаболитов в зависимости от состава питательной среды их условно разделили на три группы: 1. Штаммы, активность которых возрастает при выращивании в среде, дополненной индукторами миколитических ферментов (хитин-со-держащая среда);
2. Штаммы, чья активность выше на среде, не содержащей специфических индукторов хитиназы и других ферментов (крахмал-содержащая среда);
3. Штаммы, активность которых не зависит от состава питательной среды.
Полученные результаты позволяют охарактеризовать отобранные штаммы как по конкурентоспособности собственно бактериальных культур, так и по антигрибной активности их метаболитиов (рис. 2). Перспективными в качестве агентов биологического контроля фито-патогенов являются штаммы с высокими показателями по обоим этим признакам.
■11
EU 2
36 26-6 739 X 6 34-с 39-3 26-а 24-2 54
Рис. 2. Подавление роста Н. sativum в смешанной культуре (1,2) и под действием метаболитов (3,4) некоторых штаммов Bacillusspp на крахмал-(1,3) и хитин- (2,4)-содержащих средах.
Для отобранных штаммов были характерны как различия, так и сходство во внешнем проявлении их воздействия на Н sativum. Одной из общих черт антагонистов являлась способность бактерий сорбироваться на поверхности гиф, скапливаясь в массе мицелия и размножаясь in situ Быстрый рост бацилл часто сопровождался лизисом спор и гиф гриба. Действие других антагонистов приводило к нарушениям в развитии гриба и резкому подавлению его роста Одним из характерных нарушений развития являлось массовое формирование сферопластов и утолщений на гифах гриба В отдельных случаях наблюдались явления смешанного характера - нарушения развития, сопровождающиеся лизисом спор и гиф (рис 3)
Рис. 3. Действие (Б, поздняя стадия) бацилл-антагонистов (Bacillus sp X-b) на мицелий и споры Helminthospormm sativum в смешанной культуре. Стрелками указаны лизирующиеся спора и сферопласты на гифах гриба. Световая микроскопия. Увеличение х400. А - контроль.
Синтез миколитических ферментов бациллами-антагонистами в
смешанной культуре с микромицетами был достоверно выявлен у некоторых типично миколитических штаммов (табл. 1)
У штамма Bacillus sp 739 (ИБ-30), на поздней стадии совместного культивирования с Н sativum значительно возрастала также протеазная активность.
Рост активности миколитических ферментов бацилл в совместной культуре с Н sativum коррелировал со степенью деградации гриба, что косвенным образом указывало на ферментативную природу этого процесса
Б
Таблица 1
Активность миколитических ферментов в смешанной 6 сут культуре Bacillus sp. X-b с некоторыми грибами
Тест-объект Экзохитиназа, ед x мл-1 Р-1,3-глюканаза, ед х мл"1
контроль опыт контроль опыт
Fusarium moniliforme 0,05 0,13 0,01 0,17
F. culmorum ВИЗР-227 0,06 0,13 0,01 0,08
Helminthosporium sativum 0,03 0,12 0,01 0,14
Paecilomyces variotii 0,05 0,13 0,02 0,15
Aspergillus niger 0,04 0,13 0,01 0,03
ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя ошибка измерений не превышала 10%.
Миколитическая и антигрибная активность внеклеточных метаболитов бацилл-антагонистов. Миколитическая активность некоторых штаммов возрастала на хитин-содержащей среде, что, очевидно, объясняется усилением синтеза соответствующих ферментов (рис. 4).
Однако, это не оказывало существенного влияния на уровень их антигрибной активности (рис. 2). Анализ двух этих показателей не выявил какой-либо корреляции между ними в группе исследуемых штаммов (гху=0,095). Например, наибольшую миколитическую активность проявляли штаммы Bacillus sp. 739 (ИБ-30), В. subtihs ИБ-517, Bacillus sp. G2-P, тогда как их антигрибная активность оставалась относительно низкой по сравнению с другими штаммами. Аналогичные результаты были получены при изучении взаимосвязи между антигрибной и хитиназной активностью.
Рис. 4. Общая миколитическая (1), хитиназная (2), ß- 1,3-глюканазная (3) и протеазная (4) активность бактерий Bacillus spp. - представителей разллчных групп антагонистов на питательных средах с крахмалом (А) и хитином (Б).
На рис. 4 (А, Б) представлены данные по синтезу некоторых ферментов и общей миколитической активности представителей трех групп бацилл-антагонистов на крахмал- и хитин-содержащих средах. Анализ представленных данных показал отсутствие корреляции между миколитичес-кой и хитиназной активностью штаммов-антагонистов (г^-0,014).
По спектру миколитических ферментов отобранные штаммы были подразделены в две группы. В первую группу входило большинство бактерий-антагонистов (18 штаммов), все они идентифицированы как вид В subtilis (Мелентьев и др., 1991). У этих штаммов отсутствовала способность к синтезу хитозаназы и Р-1,3-глюканазы при высоком уровне хитиназной и протеазной активности. Их общая миколитическая активность была незначительной. Штаммы второй группы, близкие к виду В. circulans, проявляли высокую миколитическую активность, были способны к КОНСТИТУТИВНОМУ синтеру 1,3-глюканазы и продуцировали также хитоза-назу и протеазу. Хитинолитические ферменты этих штаммов, в отличие от штаммов первой группы, характеризовались ярко выраженным преобладанием хитобиозидазы (соотношение экзо- и эндо-хитиназной активности было 10:1). N-ацетилглюкозаминидазная активность большинства штаммов составляла 0,1-0,2 мкМ/мл х мин.
Очистку миколитических ферментов отобранных штаммов проводили с целью выделения фракций индивидуальных ферментов для определения их миколитической и антигрибной активности.
В итоге были очищены ферменты нескольких штаммов. Наиболее существенные результаты были достигнуты при разделении ферментов Bacillus sp. 739, в ходе которого удалось получить высокоочищенные препараты хитиназы (70 кДа), хитозаназы (46 кДа) и р--1,3-глюканазы (смесь белков с Mw-90-l 10 кДа) (рис. 5).
Рис. 5. Общая схема очистки миколитических ферментов бацилл-антагонистов (на примере штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30)).
Протеазная активность преимущественно сосредотачивалась во фракциях белков, неадсорбированных на хитине и тойоперле HW-50.
Миколитическая активность очищенных ферментов. Изучение действия различных гидролаз на клеточные стенки измельченного мицелия Н. sativum показало примерно одинаковую активность р-1,3-глюка-назы и хитиназы, которая значительно превышала активность других ферментов (рис. 6). Однако, в отличие от Р-1,3-глюканазы, хитиназа Bacillus sp. 739 слабо действовала на интактные клеточные стенки различных грибов (рис. 7), что обусловлено меньшей доступностью хитина в них по сравнению с измельченным мицелием.
Время инкубации, ч
Рис. 6. Скорость гидролиза клеточных стенок измельченного мииелия Н. sativum (1% с/в) очищенными ферментами миколитического комплекса Bacillus sp. 739 (фосфатно-цитратный буфер, 50 мМ, рН 6,0, 50°С).
Рис. 7. Степень гидролиза клеточных стенок нашивного мииелия различных грибов очищенными хитиназой и ß-1,3-глюканазой Bacillus sp. 739.
Доминирующая роль р-1,3-глюканазы в начальном этапе гидролиза интактных клеточных стенок подтверждалась ее способностью лизиро-вать гифы и споры Н. sativum (рис. 8).
Рис. 8. Действие очищенной хитиназы (0,11 ед/мл, Б) и ß-1,3 -глюканазы (0,50 ед/мл, В) Bacillus sp. 739 на мицелий Н. sativum (контроль, А). Световая микроскопия. Увеличение х 400. Стрелками указаны участки лизиса гиф и спор гриба.
При совместном действии хитиназы и Р-1,3-глюканазы Bacillus sp. 739 степень гидролиза клеточных стенок несколько возрастала (рис. 7), что указывает на ключевую роль обоих ферментов в литической активности исследуемых штаммов и процессах микробной деградации грибного мицелия в почве.
Антигрибная активность очищенных Ферментов. Суммарная фракция миколитических ферментов Bacillus sp. 739 и ряда других штаммов проявляла низкую антигрибную активность in vitro. У большинства индивидуальных ферментов (хитиназа, хитозаназа, протеаза) антигрибная активность выявлена не была. Минимальная ингибирующая концентрация наиболее активного литического фермента (Р-1,3-глюканаза) для Н. sativum в жидкой среде со ставляла >5-10 МГХМЛ"1, что зн ачительно превышает ингибирующую концентрацию растительных хитиназ (~10'3 мг/мл, Roberts и Selitrenikoff, 1988) и ферментов гриба Trichoderma harzianum (Lorito et al., 1993). Полученные результаты не позволяют рассматривать литические ферменты как самостоятельный компонент антигрибного комплекса бацилл-антагонистов.
Основные источники антигрибной активности бацилл-антагонистов и их взаимодействие с литическими ферментами. Дальнейшие исследования показали, что до 70-90% антигрибной активности внеклеточных метаболитов бактерий Bacillus связано с низкомолекулярными веществами антибиотической природы (табл. 2).
Таблица 2
Распределение антигрибной активности в низкомолекулярной и высокомолекулярной фракциях внеклеточных метаболитов бактерий Bacillus spp.
Фракция Выход антигрибной активности, %
В. subtilis ИБ-21 Bacillus sp. 739 Bacillus sp. X-b
1. Культуральная 100 100 100
жидкость 2. Сульфат-аммонийная фракция (САФ), 80% от 17+3 45+4 33+4
нас, недиализованная 3. САФ после диализа 9±3 30+3 21,5+3
В ходе работы были выделены антибиотические фракции штаммов Bacillus sp. 739 (ИБ-30), Bacillus sp. X-b и В. subtilis ИБ-54. Остаточная антигрибная активность, выявляемая в высокомолекулярных фракциях, была обусловлена как взаимодействием антибиотиков с высокомолекулярными компонентами, так и собственной активностью этих компонентов. Это было подтверждено при обнаружении антигрибных белков неферментной природы у штаммов Bacillus sp. 739 (-14 кДа) и Bacillus sp. X-b (10-20 кДа).
Рис. 9. Влияние антигрибных факторов бацилл-антагонистов на рост и развитие В. sorokiniana. А - смесь хитиназы (0,1 ед/мл) и рЧ,3-глкжа-назы (0,35 ед/мл) Bacillus sp. X-b; Б - антибиотические вещества В. subtilis ИБ-54 (~150 мкг с/в на мл); В - совместное действие антибиотических веществ и литических ферментов (В). Световая микроскопия. Увеличение х400. Стрелками указаны лизирующиеся споры, гифы и сферопласты.
Потери в первоначальной активности при выделении низкомолекулярной фракции могли быть также вызваны комплексным характером активности исходного препарата, различные компоненты которого способны усиливать активность друг друга- Нами было обнаружено, что антигрибная активность антибиотических веществ возрастала на 10-70% при введении в смесь одного или нескольких миколитических ферментов. В ходе работы выяснилось, что эффективный лизис живой культуры гриба происходит только при совместном действии антибиотиков и миколитичес-ких ферментов бактерий Bacillus (рис. 9).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что миколитические ферменты бацилл должны рассматриваться не как самостоятельные вещества с собственной антигрибной активностью, но как необходимые компоненты сложной системы антагонистического взаимодействия бактерий-антагонистов с фитопатогенными почвенными грибами.
ВЫВОДЫ
1. Миколитический комплекс Bacillus Cohn включает Ь-1,3-глюкана-зы, хитиназы, хитозаназы и протеазы. Ключевую роль в лизисе клеточных стенок нативного мицелия ферментами бацилл играет р-1,3-глюка-наза. Роль хитиназы и протеазы в процессе миколизиса носит вспомогательный характер.
2. Индивидуальные ферменты миколитического комплекса бацилл практически не оказывают ингибирующего действия на рост фитопато-генных грибов in vitro, однако, усиливают антигрибную активность вторичных метаболитов на 10-70%.
3. Лизис фитопатогенных грибов, вызываемый бактериями Bacillus Cohn, является результатом взаимодействия антибиотических веществ и ферментов. Доминирующую роль в этом процессе играют антибиотики.
4. Показано, что синтез миколитических ферментов, как единственный признак, не может служить строгим критерием антагонистических свойств Bacillus Cohn, поскольку доля низкомолекулярных веществ не-
ферментной природы в проявлении антигрибной активности составляет 70-90%.
5. У штамма Bacillus sp. 739, представителя группы смешанного типа действия, обнаружен, выделен и частично охарактеризован антигрибной белок неферментной природы с Mw~14 кДа.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Широков А.В., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 - ингибиторы роста фитопа-тогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38, №2.-С. 161-165.
2. Широков А.В., Актуганов Г.Э. Характеристика Ь-1,3-глюканазы штамма Bacillus sp. 739 // «Биология - наука XXI века»: Тезисы б-й Пу-щинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 20-24 мая 2002 г. Т. 1.С. 347-348.
3. Широков А.В., Актуганов Г.Э. Метаболиты с фунгицидной активностью, продуцируемые штаммом Bacillus sp. X-b // «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазных систем»: Тезисы 1-й Всероссийской интернет-конференции.
- Уфа, УГНТУ, 25-27 декабря 2002 г. С. 7
4. Широков А.В., Актуганов Г.Э. Изучение взаимодействия бактерий-антагонистов Bacillus spp. с фитопатогенными грибами // «Биология - наука XXI века»: Тезисы 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых.
- Пущино, 14-18 апреля 2003 г. С. 297-298.
5. Aktuganov G.E., Melent'evA.I., ShirokovA.V. Antifungal substances of antagonistic bacteria Bacillus sp. 739 //Abstract Book of lth FEMS Congress ofEuropean Microbiologists. - Slovenia, Ljubljana, 29.06-03.07.2003. P. 231232.
6. Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю., Галимзянова Н.Ф., Широков А.В. Хитинолитическая активность бактерий Bacillus Cohn -антагонистов фитопатогенных грибов // Микробиология. - 2003. - Т. 72, №3.-С. 356-360.
7. Мелентьев А.И., Широков А.В., Актуганов Г.Э. Хитозаназа — ключевой фермент в гидролизе хитозана штаммом Bacillus sp. 739 // «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»: Материалы 7-й Международной конференции. - С.-Петербург - Репино, 15-18 сентября 2003 г.-С. 408-411.
8. Широков А.В., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Применение коллоидного хитозана для выделения хитозаназы Bacillus sp. 739 // «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»: Материалы 7-й Международной конференции. - С.-Петербург - Репино, 15-18 сентября 2003 г.-С. 419-422.
9. \ктуганов Г.Э., Широков А.В., Мелентьев А.И. Выделение и свойства хитозаназы Bacillus sp. 739 // Прикладная биохимия и микробиоло-гия.-2003.-Т. 39, №5.-С. 536-541.
10. Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И., Широков А.В. Коллоидный хито-зан как аффинный адсорбент для очистки хитозаназы штамма Bacillus sp. 739 // Биотехнология. - 2003. - №6. - С. 3-9.
А. В. Широков
Широков Алексей Валерьевич
МИКОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ BACILLUS COHN И ИХ РОЛЬ В АНТАГОНИЗМЕ К ПОЧВЕННЫМ МИКРОМИЦЕТАМ
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Подписано в печать 1.11.2004 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Компьютерный набор. Гарнитура Times. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 0,9. Заказ 193. Тираж 100 экз.
Государственное унитарное предприятие Республиканский информационно-издательский центр «Деловая литература» 450077 Республика Башкортостан,. Уфа, ул К Маркса, 32. Тел (3472) 50-56-28
Лицензия на издательскую деятельность № Б 848347 от 21.06 2000 г
#22133
РНБ Русский фонд
2005-4 20713
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Широков, Алексей Валерьевич
ВВЕДЕНИЕ.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Миколитическая активность сапротрофных почвенных бактерий как одно из проявлений антагонизма к мицелиальным грибам.
1.2. Природа миколитической активности и строение клеточной стенки грибов.
1.3. Характеристика миколитических ферментов бактерий и данные об их роли в антагонизме к почвенным микромицетам.
1.3.1.Ферменты, гидролизующие хитин и хитозан.
1.3.2. |3-1,3-глюканазы и родственные ферменты.
1.3.3. Ферменты, гидролизующие компоненты матрикса клеточной стенки грибов.
1.4. Сравнительная оценка роли ферментов и метаболитов бактерий
Bacillus в механизмах лизиса и подавления роста микромицетов.37 1.5 Перспективы применения миколитических ферментов
Bacillus Cohn в защите растений от болезней и других областях.
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Бактериальные культуры.
2.2. Культуры грибов.
2.3. Физико-химические методы.
2.3.1. Получение коллоидного хитина.
2.3.2.Получение коллоидного хитозана.
2.3.3.Получение других источников углерода.
2.4. Определение антигрибной активности бацилл в смешанной культуре с фитопатогенными и сапротрофными грибами.
2.5. Оценка антигрибной активности ферментов и метаболитов бактерий Bacillus Cohn.
2.6. Методы измерения активности миколитических ферментов.
2.6.1. Определение общей миколитической активности.
2.6.2. Определение хитиназной активности.
2.6.3. Определение хитозаназной активности.
2.6.4. Определение Р-1,3-глюканазной (ламинариназной) активности.
2.6.5. Определение общей протеазной активности.
2.7. Оценка литического воздействия ферментов бактерий Bacillus на клеточные стенки и интактный мицелий микромицетов.
2.8. Микроскопия.
2.9. Методы выделения и очистки миколитических ферментов.
2.9.1. Осаждение сульфатом аммония.
2.9.2. Анионообменная хроматография на ДЭАЭ-носителях.
2.9.3. Аффинная адсорбция на коллоидном хитине.
2.9.4. Хроматография натойоперле HW-50.
2.9.5. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях.
2.10. Методы выделения, очистки и идентификации метаболитов с антигрибной активностью.
2.10.1. Ультрафильтрация.
2.10.2. Осаждение ацетоном.
2.10.3. Хроматография на бумаге и в тонком слое.
2.10.4. Гель-хроматография на тойоперле HW-40.
2.10.5. Аминокислотный анализ.
2.11. Определение концентрации белка.
2.12. Статистическая обработка результатов.
ОТБОР ПРОДУЦЕНТОВ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ КОЛЛЕКЦИИ БАЦИЛЛ-АНТАГОНИСТОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ МИКОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.
3.1. Основные критерии отбора штаммов.
3.2. Действие отобранных штаммов бацилл-антагонистов и их метаболитов на рост и развитие Bipolaris sorokiniana в смешанной жидкой культуре.
3.3. Синтез миколитических ферментов бактериями-антагонистами в совместной культуре с микромицетами.
3.4. Миколитическая и фунгистатическая активность внеклеточных метаболитов бактерий Bacillus spp.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСНОВНЫХ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ BACILLUS COHN.
4.1. Характеристика отобранных штаммов Bacillus Cohn по уровню и спектру синтезируемых ферментов.
4.2. Изучение взаимосвязи между миколитической активностью и синтезом внеклеточных ферментов у бацилл-антагонистов.
4.3. Особенности выделения и очистки миколитических ферментов.
4.3.1. Хитиназа.
4.3.2. Хитозаназа.
4.3.3. р~1,3-глюканаза (ламинариназа).
4.3.4. Общая протеазная активность бактерий-антагонистов.
4.4. Характеристика основных физико-химических и каталитических свойств миколитических ферментов ряда бактерий Bacillus.
4.5. Сравнительная характеристика миколитической активности бациллярного ферментного комплекса и его индивидуальных компонентов.
4.6. Взаимодействие миколитических ферментов бацилл-антагонистов при гидролизе клеточных стенок микромицетов.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ БАЦИЛЛ - АНТАГОНИСТОВ ПОЧВЕННЫХ МИКРОМИЦЕТОВ.
5.1. Общая характеристика антигрибных веществ, продуцируемых штаммами бацилл-антагонистов.
5.2. Выделение и свойства низкомолекулярных метаболитов бактерий
Bacillus Cohn.
5.3. Антигрибная активность миколитических ферментов бацилл.
5.4. Взаимодействие миколитических ферментов и вторичных метаболитов антибиотической природы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Миколитические ферменты бактерий Bacillus Cohn и их роль в антагонизме к почвенным микромицетам"
В разработке современных методов биологической борьбы с фитопато-генными грибами большое значение имеют исследования процессов микробного антагонизма. Среди почвенных бактерий-антагонистов перспективными агентами биологического контроля фитопатогенов являются бактерии Bacillus Cohn. Бациллы широко распространены в почве и обладают такими преимуществами, как легкость выделения, быстрый рост на относительно простых питательных средах, возможность культивирования в промышленных масштабах для получения биомассы, ферментов, биологически активных веществ и других технологических препаратов.
Актуальность темы. Создание эффективных препаратов биологического контроля грибных фитопатогенов является одной из актуальных задач современной микробиологии. По мнению многих исследователей, одним из ключевых элементов таких препаратов может быть миколитическая активность внеклеточных ферментов бактерий, например, хитиназы. В антагонизме бактерий рода Bacillus к почвенным микромицетам наиболее изучена роль антибиотических веществ, тогда как значение внеклеточных гидролитически» ферментов остается не очень ясным, хотя эти ферменты широко распространены у бацилл-антагонистов. Исследование взаимосвязи между синтезом гидролитических ферментов и антагонистической активностью бацилл на примере целой группы штаммов представляет большой интерес и позволит сделать некоторые обобщения практического характера, в том числе и о перспективности направления, связанного с поиском штаммов - продуцентов гидролитических ферментов для биоконтроля фитопатогенов.
Результаты проведенных исследований позволят расширить научные представления о свойствах миколитических ферментов бактерий группы Bacillus, уточнить их роль в антагонизме и в процессах деградации грибного мицелия в почве и оценить перспективы применения бактериальных продуцентов миколитических ферментов в борьбе с болезнями культурных растений.
Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы являлось изучение роли внеклеточных гидролитических ферментов бактерий Bacillus Cohn, таких как хитиназа, хитозаназа, Р-1,3-глюканаза и протеаза, в антагонизме к фитопатогенным грибам. В соответствии с этим были определены следующие задачи:
1. Провести отбор наиболее активных продуцентов миколитических ферментов среди бацилл - антагонистов фитопатогенных грибов из коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии ИБ УНЦ РАН;
2. Определить миколитическую активность как комплекса, так и индивидуальных внеклеточных ферментов бацилл (хитиназа, хитозаназа, протеаза и Р-1,3-глюканаза);
3. Оценить антигрибную активность индивидуальных миколитических ферментов бактерий Bacillus in vitro',
4. Изучить взаимодействие комплекса миколитических ферментов бацилл-антагонистов с вторичными метаболитами антибиотической природы.
Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование взаимосвязи миколитической и антигрибной активности бацилл-антагонистов, как на уровне отдельных штаммов, так и у групп бактерий, отличающихся по своим свойствам. В последнем случае показано, что способность бацилл подавлять рост фитопатогенных грибов не коррелирует с их общей миколитической и хи-тиназной активностью. Изучена антигрибная и миколитическая активность очищенных хитиназы, хитозаназы, Р-1,3-глюканазы и протеазы нескольких штаммов бацилл. Наибольшую активность в гидролизе компонентов клеточных стенок грибов проявляют хитиназа и Р-1,3-глюканаза. Установлена ключевая роль Р-1,3-глюканазы Bacillus sp. 739 (ИБ-30) в лизисе нативного мицелия фитопатогенных грибов. Показано, что миколитические ферменты бацилл проявляют низкую собственную антигрибную активность (хитиназа) или не имеют таковой (протеаза). Участие хитиназы и Р-1,3-глюканазы бацилл в антагонизме подтверждено при комплексном воздействии на микромицеты совместно с вторичными метаболитами бацилл. Впервые для бактерий Bacillus показано усиление антигрибной активности их антибиотических веществ в комплексе с мико-литическими ферментами на 15-70%. В ходе работы у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30) обнаружен новый антигрибной белок неферментной природы с Mw ~ 14,000.
Практическая значимость. Установлены индивидуальные особенности продукции миколитических ферментов штаммами бацилл - антагонистов, что имеет значение для разработки технологии получения ферментных препаратов в лабораторных и промышленных условиях. Отобраны штаммы — наиболее перспективные продуценты миколитических ферментов и антибиотических веществ. Штамм Bacillus sp. 739 запатентован как продуцент комплекса хити-нолитических ферментов и ламинариназы (Патент РФ № 2213773).
Апробация результатов. Основные результаты работы были представлены на 6-й и 7-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003), Первой Всероссийской интернет-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем» (Уфа, 2002), Первом Международном конгрессе Европейского микробиологического общества FEMS (Любляна, Словения, 2003), 7-й Международной конференции Российского хитинового общества «Современные перспективы в исследовании хитина и хито-зана» (Санкт-Петербург - Репино, 2003).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 10 работ, включая 4 статьи в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), объекты и методы исследований (1 глава), результаты и их обсуждение (3 главы), заключение, выводы и список литературы, включающий 203 ссылки, из них 33 на русском языке. Работа изложена на 149 страницах машинописного текста и содержит 41 рисунок и 15 таблиц.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Широков, Алексей Валерьевич
ВЫВОДЫ
1. Миколитический комплекс бактерий Bacillus Cohn включает Р-1,3-глюкаиазы, хитиназы, хитозаназы и протеазы. Ключевую роль в лизисе клеточных стенок нативного мицелия ферментами бацилл играет Р-1,3-глюканаза. Роль хитиназы и протеазы в процессе миколизиса носит вспомогательный характер.
2. Индивидуальные ферменты миколитического комплекса бацилл практически не оказывают ингибирующего действия на рост фитопатогенных грибов in vitro, однако, усиливают антигрибную активность вторичных метаболитов на 10-70 %.
3. Лизис почвенных микромицетов, вызываемый бактериями Bacillus Cohn, является результатом взаимодействия антибиотических веществ и ферментов. Доминирующую роль в этом процессе играют антибиотики.
4. Синтез миколитических ферментов, как единственный признак, не может служить строгим критерием антагонистических свойств Bacillus Cohn, поскольку доля низкомолекулярных веществ неферментной природы в проявлении антигрибной активности составляет 70-90 %.
5. У штамма Bacillus sp. 739, представителя группы миколитических бактерий, обнаружен, выделен и частично охарактеризован антигрибной белок неферментной природы с Mw~ 14,000.
129
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе проведенной работы из коллекции института биологии УНЦ РАН были отобраны 26 антагонистических штаммов бактерий рода Bacillus - продуцентов миколитических ферментов. Хитиназную активность проявляли менее 30% коллекционных штаммов-антагонистов, а среди хитинолитических штаммов также лишь 30% проявляли антагонистическую активность к фитопатоген-ным грибам. Эти данные показывают, что способность бактерий Bacillus к синтезу хитиназы как первичный признак не может служить строгим критерием при их скрининге в качестве агентов биологического контроля над фитопато-генными грибами. То же следует сказать о способности к синтезу 0-1,3-глюканазы, хитозаназы и протеазы, которую проявляли все хитинолитические штаммы, тогда как у коллекционных антагонистических штаммов наблюдался только синтез хитиназы и протеазы. Обе группы бактерий отличались также по составу своих хитинолитических ферментов. Если в ферментном комплексе типовых антагонистических штаммов доминировала эндохитиназа, то у хитинолитических штаммов - экзохитиназа (хитобиогидролаза).
При смешанном культивировании с мицелиальными грибами в жидкой среде различные штаммы бацилл-антагонистов оказывали угнетающее и/или лизирующее действие на грибы. В некоторых случаях внешнее проявление действия живой культуры совпадало с результатом действия низкомолекулярных внеклеточных метаболитов (антибиотических веществ) того же штамма (В. subtilis ИБ-54). Однако, как выяснилось, максимальный миколитический эффект некоторых штаммов обеспечивался только при комплексном действии антибиотиков и внеклеточных ферментов, в особенности, р-1,3-глюканазы и хитиназы. Сами эти ферменты не способны лизировать активно растущий мицелий грибов даже при больших концентрациях (до 10 мг/мл). Участие литических ферментов в непосредственном воздействии бактериальной культуры на мицелий гриба было обнаружено у штаммов Bacillus sp. 739 (ИБ-30) и Bacillus sp. X-b. В данном эксперименте лизис гиф тест-гриба усиливался с дальнейшим увеличением в питательной среде активности таких ферментов как р-1,3-глюканаза, протеаза и хитиназа. Показано, что в зависимости от возраста культуры гриба В. sorokiniana (время от начала взаимодействия с антагонистом), он способен формировать гифы, устойчивые к действию ферментов и антибиотиков некоторых штаммов бацилл.
Анализ миколитической и антигрибной активности внеклеточных метаболитов 26 штаммов бацилл-антагонистов показал полное отсутствие корреляции между двумя этими характеристиками. Последующие эксперименты подтвердили, что внеклеточная антигрибная активность бацилл главным образом сосредоточена во фракции низкомолекулярных антибиотических веществ (до 90 %) и в большей степени зависит от уровня их концентрации. Остаточная антигрибная активность в той или иной мере связана с действием высокомолекулярных соединений, в том числе миколитических ферментов и белков неферментной природы. Это было подтверждено обнаружением антигрибного белка с молекулярной массой — 14,000 у штамма Bacillus sp. 739 (ИБ-30). Однако, ми-колитические ферменты, такие как хитиназа, р-1,3-глюканаза, хитозаназа и протеаза, не проявляли собственной антигрибной активности при концентрациях 1-10 мг/мл. Для сравнения, по данным литературы, хитиназы из ячменя; пшеницы и кукурузы имеют минимальную ингибирующую концентрацию порядка 1-10 мкг/мл (W. Roberts, С. Selitrennikoff, 1988); для ферментов гриба Trichoderma harzianum Р10 эта цифра составляет 50-250 мкг/мл (М. Lorito et al., 1993). Таким образом, роль миколитических ферментов в непосредственном антигрибном эффекте внеклеточных метаболитов бацилл сведена к нулю. Тем не менее, нами было обнаружено, что различные ферменты в той или иной мере способны усиливать действие антибиотических соединений бацилл-антагонистов. Наибольшее увеличение антигрибной активности наблюдалось при добавлении смеси очищенных миколитических ферментов (65-70 %). Это может восполнять недостающую антигрибную активность (10-20 %) низкомолекулярных антибиотических веществ. Однако, синергичного эффекта, свойственного совместному действию ферментов и антибиотиков Т. harzianum (Н.А. Маркович, Г.Л. Кононова, 2003) в данном случае не наблюдалось.
Миколитическая активность внеклеточных продуктов бацилл, характеризуемая по способности гидролизовать клеточные стенки грибов, зависит от состава их гидролазного комплекса и уровня активности отдельных ферментов. Наиболее активно клеточные стенки грибов разрушались под действием препаратов ОС бактерий, имеющих полный набор ферментов, включавший хитиназу, Р" 1,3 -глюканазу, хитозаназу и протеазу. Очищенные ферменты бацилл были способны воздействовать только на мертвые или нерастущие грибы. При этом основную роль в лизисе интактного (неповрежденного) мицелия играла Р-1,3-глюканаза, тогда как все остальные ферменты, включая хитиназу, гидролизова-ли только измельченный или частично деградированный мицелий.
Таким образом, роль миколитических ферментов в антагонизме бактерий Bacillus Cohn к фитопатогенным грибам сводится к взаимодействию с веществами антибиотической природы. Лизис грибного мицелия, как одно из проявлений антагонизма некоторых штаммов бацилл, наблюдаемый при их непосредственном контакте с культурой гриба, представляет собой результат действия либо исключительно антибиотиков (В. subtilis ИБ-54), либо результат совместного действия антибиотиков и миколитических ферментов (Bacillus sp. ИБ-30).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Широков, Алексей Валерьевич, Уфа
1. Билай В.И. Методы экспериментальной биологии // Под ред. В.И. Би-лай. Киев: Наукова думка, - 1982. - 552 с.
2. Возняковская Ю.М. Взаимодействие Helminthosporium sativum возбудителя корневой гнили культур с сапрофитными почвенными бактериями / Ю.М. Возняковская, А.К. Труфанова // Микология и фитопатология. - 1988. Т. 22,№2.-С. 157-161.
3. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности / Н.С Егоров. // М.: Высшая школа, 1965. -211с.
4. Ильина А.В. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана /
5. A.В. Ильина, В.П. Варламов.// В кн.: Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М., Наука, 2002. - С. 79-90.
6. Максимов В.И. Фитоактивные хитиновые соединения / В.И. Максимов,
7. B.Е. Родоман, В.Г. Лунцевич // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. - Т. 33, №4.- С. 355-362.
8. Маркович Н.А. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней. Обзор / Н.А. Маркович, Г.Л. Кононова // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 4. - С. 389-400.
9. Мелентьев А.И. Влияние метаболитов бацилл-антагонистов на прорастание спор и развитие грибов-возбудителей обыкновенной корневой гнили / А.И. Мелентьев, Н.Ф. Галимзянова // Прикл. биохимия и микробиология. -1999. Т. 35, № 3. - С. 353-357.
10. Мелентьев А.И. Изучение антагонизма между почвенными бациллами и микромицетами рода Fusarium Lk: Fr. / А.И. Мелентьев, A.M. Еркееев // Мик-робиол. журн. 1990. - Т. 52, № 1. - С. 53-56.
11. Мелентьев А.И. Роль хитиназы в проявлении антигрибной активности штаммом Bacillus sp. 739 / А.И. Мелентьев, Г.Э. Актуганов, Н.Ф. Галимзянова// Микробиология. 2001. - Т. 70, - №5. - С. 636-641.
12. Мелентьев А.И. Хитиназа Bacillus sp. 739: выделение, очистка и характеристика / А.И. Мелентьев, Г.Э. Актуганов // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, № 6. - С. 624-628.
13. Микроорганизмы возбудители болезней растений / В.И. Билай, Р.И. Гвоздяк, И.Г. Скрипаль, В.Г. Краев и др. // К.: Наукова думка, - 1988. - 552 с.
14. Мирчинк Т.Г. Почвенный фунгистазис / Т.Г. Мирчинк, О.Е. Марфе-нина // Науч. докл. высш. шк. 1975, № 6. - С. 93-101.
15. Морозов В.В. Исследование хитиназного препарата, полученного из бактерии Bacillus thuringiensis / В.В. Морозов, В.Н. Шелегедин, И.А. Болотников // Биотехнология. 1994. - Т. 31, № 7. - С. 20-23.
16. Муромцев Г.С. Корневые инфекции растений актуальная проблема почвенной микробиологии / Г.С. Муромцев, И.И. Черняева // Тр. ВНИИСХМ. -1980.-Т. 49.-С. 18-36.
17. Никонорова А.К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke. / A.K. Никонорова // Микология и фитопатология. 1996. - Т. 30. - С. 69-73.
18. Новогрудский Д.М. Использование микробов в борьбе с грибковыми заболеваниями культурных растений. / Д.М. Новогрудский // Известия АН СССР. 1936, № 1. - С. 277-293.
19. Очистка и характеристика бактериального токсина, ингибирующего рост фитопатогенных грибов / Н.Ф. Папета, Т.Е. Ковалевич, Н.Т. Николаишви-ли, О.Ю. Чертов, Г.М. Цилосани, Г.И. Квеситадзе // Прикл. биохим. и микро-биол. 1994. - Т. 30, № 4-5. - С. 593-596.
20. Поиск и идентификация бактерий антагонистов возбудителей корневых гнилей сельскохозяйственных растений // Отчет о НИР. - 1991. Уфа. Институт биологии БНЦ УрО АН СССР. - № ГР 0189.0916126. - 62 с.
21. Сержанина Г.И. Грибы / Г.И. Сержанина, И .Я. Яшкин //. Минск: Наука и техника, 1986. - 232 с.
22. Синицын А.П. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов / А.П. Синицын, В.М. Черноглазое, А.В. Гусаков // М., (Итоги науки и техники.) Сер. Биотехнология; Т. 25. - 1993. - 152 с.
23. Слабоспицкая А.Т. Хитиназы аэробных спорообразующих бактерий, выделенных из различных экологических источников / А.Т. Слабоспицкая, С.С. Крымовская // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, № 6. - С. 16-22.
24. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская // К.: Наукова думка, - 1982. - 280 с.
25. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс // М.: Мир, 1991.-544 с.
26. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шиль-никова, Г.И. Переверзева. // М.: Колос, - 1972. — 200 с.
27. Тиунова Н.А. Хитинолитические ферменты микроорганизмов / Н.А. Тиунова // Успехи биологической химии. 1989. - Т. 30. - С. 199-219.
28. Физиолого-биохимическая характеристика штамма Serratia marces-cens с повышенной хитиназной активностью / Д.В. Юсупова, О.В. Порфирьева, Р.Б. Соколова, А.З. Пономарева, Л.А. Габдрахманова // Биотехнология. 1997, № 2. - С. 3-9.
29. Хитиназы Bacillus cereus: выделение и характеристика. / J1.A. Трачу к, Т.М., Шемякина, Г.Г. Честухина, В.М. Степанов // Биохимия. 1996. - Т. 61, № 2. - С. 357-368.
30. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза / О.В. Порфирьева, Д.В. Юсупова, H.J1. Зоткина, Р.Б. Соколова, JI.A. Габдрахманова //Микробиология. 1997. - Т. 66, № 3. - С. 347-353.
31. Худяков Я.П. Литическое действие почвенных бактерий на почвенные грибы / Я.П. Худяков // Микробиология. 1935. - Т. 4, №2. - С. 193-203.
32. Эндофитные бактерии рода Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней / И.А. Козачко, В.А. Вьюницкая, Т.Г. Бережницкая, С.Р. Резник, В.В. Смирнов // Микробиол. журн. - 1995. - Т. 57, № 5. - С. 69-78.
33. Andreeva N.B. Chitinolytic activity of pigmented Pseudomonas and Xan-thomonas bacteria / N.B. Andreeva, T.A. Sorokina, I.A. Khmel // Microbios. 1996. -V. 87,N350.-P. 53-57.
34. A novel endo-|3-l,3-glucanase, BGN13.1, involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum / J. De la Cruz, J.A. Pintor-Toro, T. Benitez, A. Llobell, L.C. Romero // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6937-6945.
35. Antifungal properties of chitinolytic dune bacteria / W. De Boer, P.J. Klein Gunnewiek, P. Lafeber, J.D. Janse, B.E. Spit, J.W. Woldendorp // Soil. Biol. Biochem. 1998. - V. 30, N 2. - P. 193-203.
36. Antimicrobial enzymes: applications and future potential in the food industry. Review / C.C. Fuglsang, C. Johansen, S. Christgau, J. Adler-Nissen // Trends Food Science Technol. 1995. - V. 6, N 12. - P. 390-396.
37. Baker K.F. Mechanisms of biological control of soilborne pathogens / K.F. Baker // Ann. Rev. Phytopathol. 1968. - V. 6. - P. 263-294.
38. Bamberg R.H. A bacterium antibiotic to Ustilago zeae / R.H. Bamberg // Phytopahology. 1931. - V. 21. - P. 881 цит. по Новогрудский, 1936.
39. Barthomeuf C. Impovement in tannase recovery using enzymatic disruption of mycelium in combination with reverse micellar enzyme extraction / C. Barthomeuf, F. Regerat, H. Pourrat // Biotechnol. Tech. 1994. - V. 8. - P. 137-142.
40. Benhamou N. Attempted localization of a substrate for chitinase in plant cells reveals abundant N-acetyl-D-glucosamine residues in secondary walls / N. Benhamou, A. Asselin // Biol. Cell. 1989. - V. 67. - P. 341-350.
41. Berdy J. Recent developments of antibiotic research and classification of antibiotics according to chemical structure / J. Berdy // Adv. Appl. Microbiol. 1974. -V. 18.-P. 309-406.
42. Bergey's Manual of systematic bacteriology // Baltimore. Williams & Wil-kins, 1986.-P. 1104-1141.
43. Berthe M.C. Chemical and enzymatic degradation of Helminthosporium spiciferum cell walls. Protective role of pigments / M.C. Berthe, R. Bonaly // Can. J. Microbiol. 1976. - V. 22, N 7. - P. 929-936.
44. Blechschmidt D. Arthrobacter globiformis a new yeast-lysing bacterium / D. Blechschmidt, C. Gohr, R. Troger // Z. Allg. Mikrobiol. - 1982. - V. 22, N 7. - P. 443-451.
45. Bloomfield B.J. Melanins and resistance of fungi to lysis / B.J. Bloomfield, M. Alexander // J. Bacteriol. 1967. - V. 93, N4. - P. 1276-1280.
46. Brurberg M. Comparative studies of chitinases A and В from Serratia marcescens / M. Brurberg, I. Nes, V. Eijsink // Microbiol. 1996. - V. 142. - P. 15811589.
47. Characterization of a novel, antifungal, chitin-binding protein Steptomyces tendae Tu901 that interferes with growth polarity /С. Bormann, D. Baier, I. Horr, C. Raps, J. Berger, G. Jung, H. Schwartz // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 7421-7429.
48. Chattopadhyay J.P. Control of plant infections by antibiotics and antagonistic organisms / J.P. Chattopadhyay, S.K. Bose // Process Biochem. 1980. - V. 15, N 5. - P. 27-28.
49. Chet I. Biological control of fungal pathogens / I. Chet, J. Inbar // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 48, N 1. - P. 37-43.
50. Chiang C.-L. Purification and properties of chitosanase from a mutant of Bacillus subtilis IMR-NK1 / C.-L. Chiang, C.-T. Chang, H.-Y. Sung // Enzyme Mi-crob. Technol. 2003. - V. 32. - P. 260-267.
51. Chitinase for biopesticide applications // Bioprocess. Technol. 1989. - V. 11, N 12. - P. 3.
52. Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839: Isolation and properties / L. Trachuk, L. Revina, T. Shemyakina, G. Chestukhina, V. Stepanov // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42, N 4. - P. 307-315.
53. Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and importance of chitinase Al in chitin degradation / T. Watanabe, W. Oyanagi, K. Suzuki, H. Tanaka // J. Bac-teriol. 1990. - V. 172, N 7. - P. 4017-4022.
54. Chitin deacetylases: new, versatile tools in biotechnology / I. Tsigos, A. Martinou, D. Kafetzopoulos, V. Bouriotis // Trends Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 305-312.
55. Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: purification of chito-biosidase and endochitinase / G.E. Harman, C.K. Hayes, M. Lorito, R.M. Broadway, A. Di Pietro, C. Peterbauer, A. Tronsmo // Phytopathology. 1993. - V. 83, N 3. - P. 313-318.
56. Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum: antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase / M. Lorito, G. Harman, C. Hayes, R. Broadway, A. Tronsmo, S. Woo, A. Di Pietro // Phytopathology. 1993. - V. 83, N3. P. 302-307.
57. Chitinous component of the cell wall of Fusarium oxysporum, its structure deduced from chitosanase digestion / T. Fukamizo, Y. Honda, H. Toyoda, S. Ouchi, S. Goto // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. - V. 60, N 10. - P. 1705-1708.
58. Chitin utilization by marine bacteria: degradation and catabolism of chitin oligosaccharides by Vibrio furnissii / B.L. Bassler, C. Yu, Y.C. Lee, S. Roseman // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, N 36. - P. 24276-24286.
59. Chitosanase activity of the enzyme previously reported as beta-1,3-1,4-glucanase from Bacillus circulans WL-12 / Mitsutomi M., Isono M., Uchiyama A., Nikaidou N., Ikegami Т., Watanabe T. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. - V. 62,N11.-P. 2107-2114.
60. Chitosanase, a novel enzyme / R.L. Monaghan, D.E. Eveleigh, R.P. Tewari, E.T. Reese // Nat. New. Biol. 1973. - V. 245, N 142. - P 78-80.
61. Chitosanase from Streptomyces sp. strain N174: a comparative review of its structure and function / T. Fukamizo, R. Brzezinski // Biochem. Cell Biol. 1997. -V. 75, N 6. - P. 687-696.
62. Cloning and sequencing of chiC gene of Bacillus circulans WL-12 and relationship of its product to some other chitinases and chitinase-like proteins / M. Alam, N. Nikaido, H. Tanaka, T. Watanabe // J. Ferment. Bioeng. 1995. - V. 80, N 5. P. 454-461.
63. Cloning of putative chitinase genes from Bacillus to control toxin producing fungi / R. Boyapati, A. Moyne, T. Cleveland, S. Tuzun // Phytopathology. 1994. -V. 84,N 10.-P. 1081.
64. Cohen-Kupies R. The molecular biology of chitin digestion / R. Cohen-Kupies, I. Chet //Current Opinion in Biotechnology. 1998. - V. 9. - P. 270-277.
65. Collins M. Lysozyme enhanced killing of Candida albicans and Coccidi-oides immitis by amphotericin В / M. Collins, D. Pappagianis // Sabouraudia. 1974. -V. 12.-P. 329-340.
66. Comparative studies of P-l,3-glucanase Al and В of Bacillus circulans WL-12: purification and enzymatic properties / K. Aida, T. Okada, N. Kasahara, N. Nikaidou, H. Tanaka, T. Watanabe // J. Ferment. Bioeng. 1995. - V. 80, N 3. - P. 283-286.
67. Control of plant diseases by chitinase expressed from cloned DNA in Escherichia coli / R. Shapira, A. Ordentlich, I. Chet, A. Oppenheim I I Phytopathology. -1989.-V. 79.-P. 1246-1249.
68. Crystal structure of chitosanase from Bacillus circulans MH-K1 at 1.6-E resolution and its substrate recognition mechanism / J. Saito, A. Kita, Y. Higuchi, Nagata Y., Ando A., Miki K. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. N 43. - P. 3081830825.
69. Davies D.A. Mycolase, a new kind of systemic antimycotic / D.A. Davies, A.M. Pope // Nature. 1978. - V. 273. - P. 235-236.
70. Davis В. Chitosanases: occurrence, production and immobilization / B. Davis, D.E. Eveleigh // In: Chitin and related enzymes, pp. 161-179. Ed. J.P. Zikakis. Academic Press, FL, 1984.
71. Debono M. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development / M.' Debono, R.S. Gordee // Ann. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 471-497.
72. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes. Review paper / M.B. Howard, N.A. Ekborg, R.M. Weinier, S. W. Hutcheson // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 30. - P. 627-635.
73. Effects of fungal lytic enzymes and non-ionic detergents on the actions of some fungicides against Pyricularia oryzae / T. Watanabe, N. Ogasawara, H. Tanaka, T. Uchiyama // Agric. Biol. Chem. 1988. - V. 52. - P. 895-901.
74. Enzyme nomenclature recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes // NC-IUBMB. Academic Press. N.Y., 1992.
75. Esteban R. Synthesis and regulation of Bacillus circulans WL-12 P-1,3-glucanases / R. Esteban, A. Nebrada, T.G. Villa // J. Gen. Microbiol. 1984. - V. 130. - P. 2483-2487.
76. Flores A. Improved biocontrol activity of Trichoderma harzianum strains by overexpression of the proteinase encoding gene prbl / A. Flores, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Curr. Genet. 1997. - V. 31, N 1. - P. 30-37.
77. Formation of the extracellular proteases from Trichoderma reesi QM 9414 involved in cellulase degradation / D. Haab, K. Hagspiel, K. Szakmary, P. Kubicek // Journal of Biotechnology. 1990. - V. 16. - P. 187-198.
78. Frandberg E. Antifungal activity of chitinolytic bacteria isolated from airtight stored cereal grains / E. Frandberg, J. Schnurer // Can. J. Microbiol. 1998. - V. 44,N2.-P. 121-127.
79. Frandberg E. Chitinolytic properties of Bacillus pabuli K1 / E. Frandberg, J. Schnurer // J. Appl. Bacteriol. 1994. - V. 76, N 4. - P. 361-367.
80. Fukamizo T. Fukamizo T. Chitinolytic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application / T. Fukamizo // Curr. Protein Pept Sci. Jul. 2000. - V. 1. -P. 105-124.
81. Fukamizo T. Comparative biochemistry of chitinases — anomeric form of the reaction products / T. Fukamizo, D. Koga, S. Goto // Biosci. Biotech.Biochem. -1995.-V. 59,N2.-P. 311-313.
82. Fukamizo T. Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus / T. Fukamizo, T. Ohkawa, Y. Ikeda, S. Goto // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V. 1205, N 2. -P. 183-188.
83. Gegen Pilze wirksame antibiotika der Bacillus subtilis Gruppe / W. Loef-fler, W. Katzer, S. Kremer, M. Kugler, F. Petersen, G. Jung, C. Rapp, J. Tchen // Forum Microbiol. - 1990.-V. 13, N3.-P. 160-163
84. Genes from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens / M. Lorito, S.L. Woo, I.G. Fernandez, G. Colucci, G.E. Harman, J.A. Pinter-Toro et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. - P. 7860-7865.
85. Gokhale D.V. Fungal protoplast fusion — a tools for mycological research / D.V. Gokhale // J. Sci. Ind. Res. 1992. - V. 51. - P. 497-506.
86. Gordon R.E. The genus Bacillus / R.E. Gordon // Agricultural handbook N 427. Wash. C.D., - 1973. - 275 p.
87. Grenier J. Colloidal gold-complexed chitosanase: a new probe for ultra-structural localization of chitosan in fungi / J. Grenier, N. Benhamou, A. Asselin // J. Gen. Microbiol. -1991. V. 137, N 8. - P. 2007-2016.
88. Grenier J. Some pathogenesis-related proteins are chitosanases with lytic activity against fungal spores, / J. Grenier, A. Asselin // Mol. Plant-Microbe Interact. 1990. - V. 3. - P. 401-407.
89. Gupta R. / Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis / R. Gupta, R. Saxena, P. Chaturvedi, J. Virdi // J. Appl. Bacteriol. 1995. - V. 78. - P. 378-383.
90. Harish S. Fusarium udum is resistant to the mycolytic activity of a bio-control strain of Bacillus subtilis AF1 / S. Harish, K. Manjula, A.R. Podile // FEMS Microbiol. Ecology. 1998. - V. 25. - P. 385-390.
91. Hedges A. Extracellular enzyme from Myxobacter AL-1 that expressing both P-l,4-glucanase and chitosanase activities / A. Hedges, R.S. Wolfe // J. Bacteriol. 1974. - V. 120, N 2. - P. 844-853.
92. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities / B. Henrissat // Biochem. J. 1991. - V. 280. - P. 309-316.
93. Hong T.-Y. Biochemical characterization and antifungal activity of an endo-l,3-P-glucanase of Paenibacillus sp. isolated from garden soil / T.-Y. Hong, M. Meng // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 61. - P. 472-478.
94. Horikoshi K. Effect of lytic enzyme from Bacillus circulans and chitinase from Streptomyces sp. on Aspergillus oryzae / K. Horikoshi, S. Iida // Nature. 1959. -V.183.-P. 186-187.
95. Horikoshi К. Lysis of fungal mycelia by bacterial enzymes / K. Horikoshi, S. Iida // Nature. 1958. - V. 181, N 4613. - P. 917-918.
96. Horikoshi K. Purification and properties of p-l,3-glucanase from the lytic enzyme of Bacillus circulans / K. Horikoshi, H. Koffler, K. Arima // Biochym. Bio-phys. Acta. 1963. - V. 73. - P. 267-275.
97. Hornby D. Microbial antagonisms in the rhizosphere / D. Hornby // Ann. Appl. Biol. 1978. - V. 89, N 1. - P.97-99.
98. Immunopharmacological studies of |3-l,3-glucan/M. Rios-Hernandez,N. Dos-Santos, J. Silvia-Cardoso, J.L. Bello-Garciga, M. Pedroso // Arch. Med. Res. -1994.-V. 25.-P. 179-180.
99. Inbar J. Evidence that chitinase produced by Aeromonas caviae is involved in the biological control of soil-borne plant pathogens by this bacterium / J. Inbar, I. Chet // Soil. Biol. Biochem. 1991. - V. 23, N 10. - P. 973-978.
100. Isolation and characterization of Aphanocladium album chitinase-overproducing mutants / V. Vasseur, F. Arigoni, H. Andersen, G. Defago, G. Bom-peix, J.-M. Seng//J. Gen. Microbiol. 1990. - V. 136. - P. 2561-2567.
101. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u / T. Takayanagi, K. Ajisaka, Y. Takiguchi, K. Shimahara // Bio-chim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1078, N 3. - P. 404-410.
102. Isolation of extracellular 28- and 42-kilodalton p-l,3-glucanases and comparison of three P-l,3-glucanases produced by Bacillus circulans 1АМ1165/ R. Aono, M. Hammura, M. Yamamoto, T. Asano // Appl. Environ. Microbiol. 1995. -V. 61, N 1. - P. 122-129.
103. Johnson D.E. The antibiosis of certain bacteria to smuts and some other fungi / D.E. Johnson // Phytopathology. 1931. - V. 21. - P. 843.
104. Kim P.I. Production of an antifungal protein for control of Colletotrichum lagenarium by Bacillus amyloliquefaciens MET0908 / P.I. Kim, K.-C. Chung // FEMS Microbiol. Letters. 2004. - V. 234. - P. 177-183.
105. Kobayashi S. A novel method for synthesis of chitobiose via enzymatic ^ glycosylation using a sugar oxazoline as glycosyl donor / S. Kobayashi, T. Kioysada,
106. S.-I. Shoda // Tetrahedron Lett. 1997. - V. 38. - P. 2111-2112.
107. Kobayashi T. Concerted inductions of multiple p-l,3-glucanases in Bacillus circulans WL-12 in response to three different substrates / T. Kobayashi, H. Tanaka, N. Ogasawara // Agric. Biol. Chem. 1974. - V. 38. - P. 967-972.
108. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227, N 5259. - P. 680-685.
109. Laine R.A. Diagnosis of fungal infections with a chitinase / R.A. Laine, W.C.J. Lo // PCT Int. Appl. WO 9802742 Al 22, 1998 (CA 1998; 128: 86184).
110. Lim H.-S. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot / H.-S. Lim, Y.-S. Kim, S.-D. Kim // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57, N 2. - P. 510-516.
111. Lockwood J.L. Soilborne pathogens: concepts and connections / J.L. ф Lockwood // Phytopathology. 1986. - V. 76, N 1. - P. 20-27.
112. Lytic enzyme complex of an antagonistic Bacillus sp. X-b: Isolation and purification of components / P. Helisto, G. Aktuganov, N. Galimzianova, A. Melent-jev, T. Korpela // J. Chrom. В Biomed Sci. Appl. 2001. - V. 758, N 2. - P. 197-205.
113. Mabuchi N. Cloning and sequencing of two genes encoding chitinases A and В from Bacillus cereus CH / N. Mabuchi, Y. Araki // Can. J. Microbiol. 2001. -V. 47,N10.-P. 895-902.
114. Mahadevan B. Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 / B. Mahadevan, D. Crawford // Enzyme Mi-crob. Technol. 1997. - V. 20. - P. 489-493.
115. Mitchell R. Lysis of soil fungi by bacteria / R. Mitchell, M. Alexander // Can. J. Microbiol. 1962. - V. 9. - P. 169-177.
116. Mitchell R., Alexander M. Mycolytic phenomenon and biological control of Fusarium in soil. // Nature. 1961. P. 109-110.
117. Monreal J. The chitinase of Serratia marcescens / J. Monreal, E.T. Reese // Can. J. Microbiol. 1969. - V. 15, N. 7. - P. 689-696.
118. Nanjo F. Purification and characterization of exo-P-D-glucosaminidase, a novel type of enzyme, from Nocardia orientalis / F. Nanjo, R. Katsumi, K. Sakai // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 10088-10094.
119. Nielsen P. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizoshere / P. Nielsen, J. S&rensen // FEMS Microbiol. Ecology. 1997. - V. 22. -P. 183-192.
120. Odds F.C. Antifungal agents: mechanisms of action. A review / F.C. Odds, A.J. Brown, N.A. Gow // Trends Microbiol. 2003. - V. 11, N 6. - P. 272-279.
121. Olsen S.M. Selective heat treatment of soil, and its effect on the inhibition of Rhizoctonia solani by Bacillus subtilis / S.M. Olsen, K.F. Baker // Phytopathology. 1968. - V. 59. - P. 79-87.
122. Ordentlich A. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsi / A. Ordentlich, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 84-88.
123. Patil R.S. Chitinolytic enzymes: an exploration / R.S. Patil, V. Ghormade, M.V. Deshpande // Enzyme Microb.Technol. 2000. - V. 26. - P. 473-483.
124. Peberdy J.F. Fungal cell wall. A review / J.F. Peberdy // In Biochemistry of cell walls and membranes in fungi. P. 5-30. - Ed. by Kuhn P.J., Trinchi A.P.J., ^ Jung M.J. et al. London, - 1990.
125. Pelletier A. Purification and characterization of three chitosanase activities from Bacillus megaterium PI / A. Pelletier, J. Sygusch // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 844-848.
126. Pitson S.M. Noncellulolytic fungal P-glucanases: their physiology and ^ regulation. Review / S.M. Pitson, R.J. Seviour, B.M. McDougall // Enzyme Microbiol. Technol. 1993. - V. 15, N 3. - P. 178-192.
127. Planas A. Bacterial 1,3-1,4-p-glucanases: structure, function and protein engineering / A. Planas // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1543. - P. 361-382.
128. Pleban S. Chitinolytic activity of an endophytic strain of Bacillus cereus / S. Pleban, L. Chernin, I. Chet // Lett. Appl. Microbiol. 1997. - V. 25. - P. 284-288.
129. Podile A.R. Lysis and biological control of Aspergillus niger by Bacillus subtilis AF1 / A.R. Podile, A.P. Prakash // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42. - P. 533-538.
130. Porter C.L. Concerning the characters of certain fungi as exhibited by their growth in the presence of other fungi / C.L. Porter // Amer. J. Bot. 1924. - V. 11.-P. 168.
131. Poulose A.J. Biotechnology and fungal control / A.J. Poulose // In: Target sites of fungicide action. P. 311-318. Ed. by W. Koller. Boca Raton, FL, 1992.
132. Price J.S. Production, purification and characterization of an extracellular chitosanase from Streptomyces / J.S. Price, R. Storck // J. Bacteriol. 1975. - V. 124, N3.-P. 1574-1585.
133. Production of antifungal compounds from chitin by Bacillus subtilis / S.-L. Wang, I.-L. Shih, C.-H. Wang, K.-C. Tseng et al. // Enzyme Microb. Technol. -2002.-V. 31.-P. 321-328.
134. Properties of chitosanase from Bacillus cereus SI / M. Kurakake, S. Yo-u, K. Nakagawa, M. Sugihara, T. Komaki // Curr. Microbiol. 2000. - V. 40, N 1. - P. 6-9.
135. Protoplast formation by a mycolase from Streptomyces olivaceoviridis and purification of chitinases / A. Romaguera, A. Tschech, S. Bender, H.J. Plattner, H. Diekmann // Enzyme Microb. Technol. 1993. - V. 15, N 5. - P. 412-417.
136. Purification and characterization of a novel type of chitinase from Vibrio alginolyticus / S. Murao, T. Kawada, H. Itoh, H. Oyama, T. Shin // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. - V. 56. - P. 368-369.
137. Purification and characterization of chitinases produced by Bacillus amy-loliquefaciens / S. El-Aassar, K. Ghanem, A. Sabrys, N. Ghanem // Bioseparation. -1992.-V.3,N1.-P. 37-46.
138. Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orien-talis / K. Sakai, R. Katsumi, A. Isobe, F. Nanjo // Biochem. Biophys. Acta. 1991. -V. 1097. - P. 65-72.
139. Purification and properties of chitosanase from Bacillus circulans MH-K1 / M. Yabuki, A. Uchiyama, K. Suzuki, A. Ando, T. Fujii // J. Gen. Appl. Microbiol. 1988.-V. 34.-P. 255-270.
140. Purification and some properties of a novel chitosanase from Bacillus sub-tilis KH-1 / C.A. Omumasaba, N. Yoshida, Y. Sekiguchi, Kariya K., Ogawa K. // J. Gen. Appl. Microbiol. 2000. - V. 46, N 1. - P. 19-27.
141. Purification and some properties of chitinase В1 from Bacillus circulans WL-12 / T. Watanabe, T. Yamada, W. Oyanagi, K. Suzuki, H. Tanaka // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. - V. 56, N 4. - P. 682-683.
142. Pusey P.L. Use of Bacillus subtilis and related organisms as biofiingicides / P.L. Pusey // Pestic. Sci. 1989. - V. 27. - P. 133-140.
143. Razafindralambo H. Puification of antifungal lipopeptides by reversed-phase high-performance liquid chromatography / H. Razafindralambo, M. Paquot // J. Chrom. 1993. - V. 639. - P. 81-85.
144. Rehav-Moiseev S. Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish waste chitin to single-cell protein / S. Rehav-Moiseev, P.A. Carroad // Biotechnol. Bioeng. 1981. - V. 23. - P. 1067-1078.
145. Roberts W. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity / W. Roberts, C. Selitrennikoff// J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 169-176.
146. Rombouts F.M. Lysis of yeast cell walls. Lytic (l-6)-glucanase from Bacillus circulans WL-12 / F.M. Rombouts, H.J. Phaff// Eur. J. Biochem. 1976. - V.• 63.-P. 109-120.
147. Ryan E.M. Study of effect of p-l,3-glucanase from basidiomycete QM 806 on yeast extract production / E.M. Ryan, O.P. Ward // Biotechnol. Lett. 1985. -V. 7.-P. 409-412.
148. Schaeffer H.J. Cloning and targeted gene disruption of EXG1, encoding exo-p-l,3-glucanase, in the phytopathogenic fungus Cochliobolus carbonum / H.J. Schaeffer, J. Leykam, J.D. Walton // App. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60. - P.594.598.
149. Scott J.H. Lyticase: endiglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis // J.H. Scott, R. Schekman // J. Bacteriol. 1980. - V. 142, N 2. - P. 414-423.
150. Seifert K.A. Evaluation of Bacillus subtilis С186 as a potential biological ^ control of sapstain and mould on unseasonned lumber / K.A. Seifert, W.E. Hamilton,
151. C. Breuil, M. Best // Can. J. Microbiol. 1987. - V 33. - P 1102-1107.
152. Seino H. Properties and action pattern of a chitosanase from Bacillus sp. PI-7S / H. Seino, K. Tsukuda, Y. Shimasue // Agric. Biol. Chem. 1991. - V. 55. - P. 2421-2423.
153. Selitrennikoff C.P. Antifungal proteins / C.P. Selitrennikoff // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, N 1. - P. 2883-2894.
154. Skujins J.J. Dissolution of fungal cell walls by a streptomycete chitinase and beta-(l-3)-glucanase / J.J. Skujins, H.J. Potgieter, M. Alexander // Arch. Bio4 chem. Biophys. 1965. - V. 111, N 2. - P. 358-364.
155. Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae / A. Regev, M. Keller, N.
156. Strizhov, В. Sneh, E. Prudovsky et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62, N 10.-P. 3581-3586.
157. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination / M. Lorito, C. Peterbauer, C. Hayes, G. Harman // Microbiol. 1994. - V. 140. - P. 623-629.
158. Somashekar D. Chitosanases properties and applications: A review / D. Somashekar, R. Joseph // Bioresource Technol. - 1996. - V. 55, N 1. - P. 35-45.
159. Tanaka H. Concerted induction of (3-glucanases of Bacillus circulans WL-12 in response to various yeast glucans / H. Tanaka, K. Itakura, K. Toda // Agric. Biol. Chem. 1978. - V. 42.-P. 1631-1636.
160. Tanaka H. Enzymatic hydrolysis of yeast cell walls / H. Tanaka, H.J. Phaff// J. Bacteriol. 1965. - V. 89. - P. 1570-1580.
161. Terayama H. Large-scale preparation of N,N'-diacetylchitobiose by en-zymic degradation of chitin and its chemical modifications / H. Terayama, S. Takaha-shi, H. Kuzuhara // J. Carbohyd. Chem. 1993. - V. 12. - P. 81-93.
162. Thara K.V. Biological control of rice sheath blight in India: Lack of correlation between chitinase production by bacterial antagonists and sheath blight suppression / K.V. Thara, S.S. Gnanamanickam // Plant and Soil. 1994. - V. 160, N 2. -P. 277-280.
163. The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan / M. Mitsutomi, H. Kidon, H. Tomita, T. Watanabe // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - V. 59, N 3. - P. 529-531.
164. The determination of soil chitinase activity: conditions for assay and ecological studies / R. Rodriguez-Kabana, G. Godoy, G. Morgan-Jones, R. Shelby // Plant and Soil. 1983. - V. 75. - P. 95-106.
165. Thermostable chitosanase from Bacillus sp. strain CK4: cloning and expression of the gene and characterization of the enzyme / H.-G. Yoon, H.-Y. Kim, Y.-H. Lim et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66, N 9. - P. 3727-3734.
166. The use of fluorogenic substrates for measure fungal presence and activity in soil / M. Miller, A. Palojarvi, A. Rangger, M. Reeslev, A. Kjoiler // Appl. Environ.• Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 613-617.
167. Thomas K.R. The effect of beta-glucuronidase and chitinase on the cell wall of Aspergillus niger and Aspergillus fumigatus / K.R. Thomas, B. Davis, J. Mills // Microbios. 1979. - V. 25, N 100. - P. 111-123.
168. Thomashow L.S. Biological control of plant root pathogens / L.S. Thomashow // Curr. Opin. Biotecnol. 1996. - V. 7. - P. 343-347.
169. Three chitinase genes (chiA, chic and ChiD) comprise chitinase system of ф Bacillus circulans WL-12 / M. Alam, T. Mizutani, M. Isono, N. Nikaidou, T. Watanabe // J. Ferment. Bioeng. 1996. - V. 82, N 1. P. - 28-36.
170. Three N-terminal domains of (3-1,3-glucanase Al are involved in binding to insoluble (3-1,3-glucan / T. Watanabe, N. Kasahara, K. Aida, H. Tanaka // J. Bacte-riol. 1992. - V. 174. - P. 186-190.
171. Tissue-specific and pathogen-induced regulation of a Nicotiana plum-baginifolia (3-1,3-glucanase gene / C. Castresana, F. De Carvalho, G. Gheysen, M. Habets, D. Inze, M. Van Montagu // Plant Cell. 1990. - V. 2. - P. 1131-1143.
172. Tominaga Y. Degradation of cell wall of Mucor mucedo by chitosanase from Bacillus R-4 / Y. Tominaga, Y. Tsujisaka // Agric. Biol. Chem. 1979. - V. 43, N 12.-P. 2607-2609.
173. Tominaga Y. Purification and some enzymatic properties of the chitosanase from Bacillus R-4 which lyses Rhizopus cell walls / Y. Tominaga, Y. Tsujisaka // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V. 410, N 1. - P. 145-155.
174. Tsujisaka Y. Purification and some properties of the lytic enzyme from Bacillus R-4 which acts on Rhizopus cell wall / Y. Tsujisaka, Y. Tominaga, M. Iwai // Agric. Biol. Chem. 1975. - V. 39. - P. 145-152.
175. Tweddell R.J. Production of chitinases and P-l,3-glucanases by Stachy-botrys elegans, a mycoparasite of Rhizoctonia solani / R.J. Tweddell, S.H. Jabaji• Hare, P.M. Charest // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V. 60, N 2. - P. 489-495.
176. Uchida Y. Chitosanase from Bacillus species / Y. Uchida, A. Othakara // Meth. Enzymol. 1988. - V. 161. - P. 501-505.
177. Van de Rhee M.D, Analysis of regulatory elements involved in stress-induced and organ-specific expression of tobacco acidic and basic P-l,3-glucanase genes / M.D. Van de Rhee, R. Lemmers, J.F. Bol // Plant Mol. Biol. 1993. - V. 21. -P. 451-461.
178. Ф 199. Vrsanska M. Enzymes of the yeast lytic system produced by Arthrobacter
179. GJM-1 bacterium and their role in the lysis of yeast cell walls / M. Vrsanska, P. Biely, Z. Kratky // Z. Allg. Mikrobiol. 1977. - V. 17, N 6. - P. 465-480.
180. Wang S.-L. Purification and characterization of a new antifungal compound produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium / S.-L. Wang, T.-C. Yieh, I.-L. Shih // Enzyme Microb. Technol. 1999. -V. 25.-P. 439-446.
181. Wang S.-L. Purification and characterization of two bifunctional chiti-nase/lysozymes extraxellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in ashrimp and crab shell powder medium / S.-L. Wang, W.T. Chang // Appl. Environ.
182. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 380-386.
183. Wiwat C. Purification and characterization of chitinase from Bacillus circulans No.4.1 / C. Wiwat, P. Siwayaprahm, A. Bhumiratana // Curr. Microbiol. -1999.-V. 39, N3.-P. 134-140.
184. X-ray structure of an antifungal chitosanase from Streptomyces N174 / E.M. Marcotte, A.F. Monzingo, S.R. Ernst, R. Brzezinski, J.D. Robertus // Nature Structural Biology. 1996. - V. 3, N 2. - P. 155-162.
-
Широков, Алексей Валерьевич
-
кандидата биологических наук
-
Уфа, 2004
-
ВАК 03.00.07
- Свойства хитиназы Bacillus sp. 739 - антагониста фитопатогенных грибов
- Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. как агенты биологического контроля болезней растений
- Биотические связи микромицетов чернозема выщелоченного в агроэкосистемах лесостепи
- Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам
- Перспективные штаммы бактерий - продуценты микробиопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике
