Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам

Лукьянцев, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам"

На правах рукописи

UÜ4613160

Лукьянцев Михаил Александрович

ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОФИТНЫХ ШТАММОВ BACILLUSSUBTILIS COHN С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ АНТАГОНИЗМА К ФИТОПАТОГЕННЫМ ГРИБАМ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ноя 2010

Саратов-2010

004613160

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Хайруллин Рамиль Магзинурович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович кандидат биологических наук Актуганов Глеб Эдуардович

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится 25 ноября 2010 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан октября 2010 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных задач сельскохозяйственной биологии является разработка эффективных средств и способов снижения развития болезней растений. При этом требования к безопасности мероприятий по защите сельскохозяйственных культур от вредных организмов постоянно возрастают. В настоящее время можно выделить два основных подхода для экологически безопасного контроля фитопатогенов: создание устойчивых генетически модифицированных (ГМ) растений и разработка биологических препаратов как альтернативы химическим пестицидам. Поскольку устойчивость к вредным организмам у ГМ-растений контролируется только одним-двумя генами, эффективность их «действия» может со временем преодолеваться. Кроме того, безопасность таких культур до сих пор остается предметом дискуссий. Следовательно, второе направление представляется более перспективным.

Идея использования микроорганизмов в качестве основы биопрепаратов для защиты растений не нова (Худяков 1935; Новогрудский, 1936; Красильников, 1952; Билай, 1961). В ряду первых агентов биоконтроля численности вредителей и фитопатогенов были представители рода Bacillus (Смирнов и др., 1982; Powell, Jutsum, 1993), продуцирующие, соответственно, токсины, убивающие насекомых или антибиотики, подавляющие развитие грибов (Bais et al., 2004; Shoda, 2000; Tome et al., 2004). Однако, несмотря на многочисленность исследований в этом направлении, количество коммерческих биопрепаратов, разрешенных в настоящее время к применению в качестве биофунгицидов, ограничено. На наш взгляд, одними из причин этого являются недостаточное изучение биологических особенностей бактерий - антагонистов фитопатогенов, а также понимание механизмов становления системы антагонистические бактерии - фитопатогены - растение.

В связи с вышесказанным, целью данной работы явилось определение особенностей биологической активности эндофитных штаммов Bacillus subtilis с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Провести сравнительную оценку антагонистической активности различных эндофитных штаммов В. subtilis к фитопатогенным грибам.

2. Выяснить возможные механизмы проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов.

3. Определить особенности проявления биологической активности исследуемых штаммов по отношению к растениям.

4. Выявить характер взаимоотношений эндофитных штаммов В. subtilis с другими видами бактерий, обладающими хозяйственно-полезными признаками.

5. Изучить характер проявления антагонистической активности исследуемых бацилл к микромицетам почвы.

6. Оценить возможность создания нового биофунгицида на основе перспективных эндофитных штаммов.

Научная новизна. Впервые изучен характер взаимоотношений эндофитных штаммов В. subtilis, в том числе пггамма 26Д - основы биофунгицида фитоспорин-М, с отдельными представителями азотофиксирующих бактерий почвы. Рассмотрен спектр антибиотиков и предложен вероятный механизм проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов В. subtilis. Показано, что при поиске эндофитных бактерий для создания биофунгицидов наряду с оценкой их антагонистической активности и способности стимулировать рост растений необходимо исследовать характер взаимодействия с «полезной» почвенной микрофлорой, выживаемость бактерий в почвах разных типов и способность подавлять в них рост фитопатогенных грибов. Обнаружена способность клеток и метаболитов штамма В. subtilis 11В повышать урожайность зеленой массы укропа. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования штаммов В. subtilis 26 Д и ИВ в газовихревом биореакторе нового типа «БИОК», показана возможность использования однотипной схемы производства биофунгицидов на основе эндофитных штаммов бацилл с хозяйственно-полезными свойствами.

Практическая значимость работы. Выявление биологических особенностей эндофитных антагонистических штаммов В. subtilis позволяет повысить эффективность поиска и отбора бактерий, перспективных для разработки новых полифункциональных биофунгицидов для сельского хозяйства. Оптимизированные параметры культивирования штаммов в газовихревом биореакторе «БИОК» могут успешно использоваться для наработки биомассы клеток, спор а также метаболитов В. subtilis и производства экспериментальных образцов различных биопрепаратов на основе этих бактерий.

Предложен удобный метод полуколичественного определения антагонистической активности метаболитов бактерий. Эндофитный антагонистичный штамм В. subtilis 11В предложен в качестве основы препарата для повышения устойчивости зеленных культур (укропа) к корневым гнилям, а также урожайности надземной массы растений. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по дисциплинам «Биотехнология в растениеводстве» в Башкирском государственном аграрном университете (г. Уфа) и «Биотехнология растений» в Стерлитамакской государственной педагогической академии им. 3. Биишевой (г. Стерлитамак).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антагонистическая активность эндофитных штаммов В. subtilis 49РН, 26Д и 11В к фитопатогенным грибам обусловлена не продукцией ими высокоактивных внеклеточных хитиназ и глюканаз, а связана с синтезом антибиотиков.

2. Суммарная фракция антибиотиков каждого из эндофитных штаммов В. subtilis 49РН, 26Д и 11В в концентрации 0,01 мг/л является сильным ингибитором прорастания семян пшеницы.

3. Эндофитные штаммы В. subtilis, подавляющие рост грибных фитопатогенов отличаются по антагонистичности к некоторым почвенным азотофиксаторам: штаммы 26Д и 11В не подавляют рост бактерий Azotobacter chroococcum В1616, A. vinelandii ИБ-1, Azospirillum irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b in vitro, тогда как штамм 49PH антагонистичен по отношению к ним.

4. Одним из важных отличий штамма В. subtilis 49РН от менее антагонистичных штаммов 26Д и 11В является пониженная жизнеспособность его спор в выщелоченном черноземе.

5. Бактерии В. subtilis 11В стимулируют рост растений укропа и повышают их устойчивость к корневым гнилям, что вместе с безопасностью штамма для человека делает возможным его использование в качестве основы полифункционального биофунгицида для повышения урожайности этой культуры.

Работа выполнена в Башкирском государственном аграрном университете в рамках заказа Минсельхоза России за счет средств Федерального бюджета по теме «Разработка полифункциональных биофунгицидов для растениеводства» (№ Госрегистрации 01200853490).

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на: II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов «Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы» (Уфа, 2008); Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов с международным участием «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009); 5-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегии взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; двух глав: обзора литературы и экспериментальной части, включающей объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение; а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 134 страницах, содержит 20 рисунков, 19 таблиц. Список использованных литературных источников включает 209 наименований, в том числе 188 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объект, материалы и методы исследования

Объектом исследования служили эндофитные штаммы-антагонисты: В. subtilis 26Д (получен из коллекции ВНИИСХМ, №128) использовался в качестве «эталона»; В. subtilis 11В (получен из коллекции ИБФМ РАН, №ВКМ В-2218Д); В. subtilis 49РН, 'выделен из внутренних тканей растений пшеницы в лаборатории биотехнологии Башкирского государственного аграрного университета. В качестве фитопатогенных тест-культур при оценке антагонистической активности использовали микромицетов - представителей родов Fusarium, Bipolaris, Penicillum, Botrytis, Mucor и других, полученных из коллекции ДП «БИОФАГ» ГУП «Иммунопрепарат» (г. Уфа). Штаммы бактерий Azospiriüum были получены из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН, г. Саратов; штаммы Azotobacter chroococcum, А. vinelandii, Pseudomonas putida и Р. aureofaciens - любезно предоставлены д.б.н., проф. О.Н. Логиновым из коллекции

микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН (г. Уфа), за что автор выражает ему глубокую благодарность.

Антагонизм штаммов по отношению к грибам определяли методом агаровых блоков (Нетрусов, 2005). Антагонистическую активность бактериальных метаболитов оценивали предложенным нами методом двухслойной агаризованной среды. В чашки Петри последовательно вносили: нижний слой питательной среды, бумажный фильтр, равный внутреннему диаметру чашки, второй слой среды, куда по центру чашки помещали стеклянное кольцо, которое после застывания агара фиксировалось, частично выступая над средой. Культуру штаммов высевали внутрь кольца. После инкубирования верхний слой среды вместе с бумажным фильтром, снимали. На нижний слой, содержащий метаболиты, высевали тест-культуру фитопатогена, либо выкладывали агаровые блоки с мицелием гриба. Учитывали площадь зоны роста гриба вокруг блока либо зоны подавления прорастания конидий. Характер взаимоотношений исследуемых штаммов с другими видами бактерий определяли методом перпендикулярных штрихов (Machan et al., 1991) и агаровых блоков.

Суммарную фракцию антибиотиков получали глубинным культивированием штаммов в жидких средах различного состава. Культуральную жидкость добавляли в агаризованную питательную среду, поверхность которой засевали конидиями грибов и затем учитывали их прорастание. Для получения порошка метаболитов, содержащих антибиотики, культуральную жидкость подкисляли 6N НС1 до рН 2,0. Осадок отделяли центрифугированием, перерастворяли в 96%-ном этаноле, центрифугировали, надосадок упаривали. Экстракты из нейтрализованного после подкисления остатка культуральной жидкости и вегетативных клеток штаммов получали, используя в качестве экстрагентов хлороформ и метанол. Анализ антибиотиков проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu LC-20 (Shimadzu, Япония) с диодноматричным детектором. Две колонки Luna Silica 250x4,6 мм, 5 мкм (Phenomenex, США) соединяли последовательно. В качестве подвижной фазы использовали элюент состава ацетонитрил:вода=85:15. Скорость потока составляла 1 мл/мин. В качестве стандартов использовали сурфактин и итурин (Sigma, США).

Активность глюканазы, хитиназы, целлюлазы и пектиназы определяли реакцией с динитросалициловой кислотой (Хазиев, 2005). В качестве субстратов

использовали, соответственно, ламинарин, коллоидный хитин из панцирей крабов, карбоксиметилцеллюлозу, яблочный пектин (Sigma, США). Активность протеаз определяли с азоказеином (Sigma, США) (Griffen et al., 1997).

Влияние В. subtilis на рост растений определяли, обрабатывая их семена суспензией спор или метаболитами штаммов и проращивая на влажной фильтровальной бумаге в темноте. У проростков измеряли длину корня и побега.

Для изучения антагонизма эндофитных штаммов по отношению к микромице-там в почве навески чернозема (10 г) обрабатывали суспензией бактериальных спор. Через двое и трое суток методом предельных разведений производили подсчет количества грибных пропагул в почве. Для определения жизнеспособности эндофитов в почвах получали стрептомицин-устойчивые мутанты. Навески почв инокулировали спорами мутантов из расчета 106 КОЕ/г почвы. На 3, 6 и 9 сутки эксперимента производили посев почвенной суспензии на поверхность среды со стрептомицином и определяли показатель КОЕ.

Для глубинного культивирования в газовихревом биореакторе «БИОК» (ЗАО «Саяны», г. Новосибирск) использовали полусинтетическую среду (Недорезков, 2003). Управление процессом культивирования осуществляли с помощью программы Quadrus Lonet. Среду аэрировали компрессором, снабженным регулятором скорости воздушного потока. В пробах определяли pH, концентрацию клеток, проводили мик-роскопирование культуры.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью стандартных программ пакета Microsoft Office, данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В 2005-2006 гг. с целью разработки новых эффективных биофунгицидов в лаборатории биотехнологии Башкирского ГАУ из внутренних тканей растений пшеницы было выделено около 50-ти штаммов В. subtilis с высокой антагонистической активностью по отношению к широкому спектру фитопатогенных грибов. Однако данные, полученные в лаборатории ранее (Минина и др., 2009), показали, что препараты на основе некоторых высокоантагонистичных эндофитных штаммов В. subtilis, в т.ч. самого сильного антагониста 49РН, не обеспечивали существенного снижения поражения растений корневыми гнилями и прибавки урожайности зерна по сравнению со

слабым антагонистом - «эталонным» коммерческим штаммом В. хиЫШз 26Д. Таким образом, было выявлено, что наличие у штаммов В. знЬШи высокой антагонистической активности к фитопатогенам и способность стимулировать рост растений в лабораторных условиях не является достаточным критерием отбора бактерий для создания биофунгицидов. Это побудило нас к детальному сравнительному изучению биологической активности «эталонных» слабоантагонистичных и одного из новых высокоантагонистичных штаммов бацилл.

Сравнительная антагонистическая активность эндофитных штаммов В. шЬМЬ. Исследуемые штаммы проявляли различную степень антагонистической активности к фитопатогенным грибам. При использовании метода агаровых блоков самым сильным антагонистом против большинства грибов был штамм 49РН, наиболее слабым - штамм 11В (табл. 1).

Таблица 1 - Антагонистическая активность исследуемых штаммов

Тест-организм Размеры зоны угнетения роста грибов исследуемым штаммом, мм "мм

В. subtilis 26Д В. subtilis 49РН В. subtilis 11В

Alternaria alternata 25x27 32x34 20x22

Bipolaris sorokirtiana ПП ПП ПП

Botrytis aclada 10x11 15x16 CA

B. byssoidea 21x23 25x27 18x20

B. cinerea 17x18 12x15 14x12

Cladosporium sp. 12x13 16x20 9x10

Fusarium avenaceum 11x11 14x15 11x10

F. sporotrichiella 13x14 20x20 9x9

F. moniliforme 10x10 15x20 10x12

F. culmorum 12x18 24x26 14x15

F. oxysporum 11x11 20x22 10x10

Penicillum lividium 20x20 8x8 CA

Примечание: С А - слабо выраженный антагонизм; ПП - полное подавление роста тест-организма.

Синтез и выделение штаммами в среду антагонистичных метаболитов происходит и в отсутствии фитопатогенов (табл. 2). Однако при росте на плотной среде в отсутствии грибов различия в фунгистатической активности у бактериальных метаболитов оказались менее выраженными, что, вероятно, указывает на различия в спектре синтеза или активности бактериальных фунгистатиков в присутствии и отсутствии гриба. Мы также выяснили, что самая высокая антагонистическая активность

метаболитов штаммов проявляется при их выращивании в картофельно-глюкозном бульоне.

Анализ фракций метаболитов выявил, что антибиотической активностью обладал только экстракт, осажденный из культуральной жидкости соляной кислотой. Его мы использовали в дальнейших экспериментах.

Таблица 2 - Антагонистическая активность метаболитов исследуемых штаммов при росте на плотной питательной среде

Вариант Площадь зоны роста, мм2* % от контроля

F. avenaceum контроль 202±12,1

F. avenaceum + 26Д 5±0,4 • 2

F. avenaceum + 49РН 5±0,6 2

F. avenaceum + 11B 7±0,8 3

F. culmorum контроль 527±26,4

F. culmorum + 26Д 30±1,2 6

F. culmorum + 49PH 28±1,3 5

F. culmorum + 11B 31 ±2,2 7

F. sporotrichioides контроль 410±18,5

F. sporotrichioides + 26Д 27±1,8 7

F. sporotrichioides + 49PH 16±1,5 4

F. sporotrichioides + 11B 28±1,9 7

Примечание: * - учитывалась площадь зоны роста тест-организма вокруг блока на среде с метаболитами без площади агарового блока.

Возможные механизмы проявления антагонистической активности эндо-фитными штаммами В. subtllis. Существует два основных механизма подавления роста микроорганизмов антагонистичными бактериями (Stein, 2005) - за счет выделения антибиотиков с бактерицидным или фунгицидным эффектом и за счет действия внеклеточных гидролаз, например хитиназ, хитозаназ и глюканаз (Логинов, 2001; Ак-туганов, 2003; Мелентьев, 2008). Для оценки наличия у штаммов первого механизма мы провели анализ фракции антибиотиков. По данным ВЭЖХ у штаммов 26Д и ИВ один из преобладающих антибиотиков был из группы сурфактина (рис. 1 а, б), тогда как штамм 49РН преимущественно синтезировал вещество, близкое к сурфактину по времени удержания на колонке, однако обладающее совершенно другим спектром поглощения (рис. 1 в). Вероятно, именно оно и обуславливает высокую антагонистическую активность штамма 49РН. В среде культивирования штаммов отсутствовала четко регистрируемая активность хитиназ, глюканаз, целлюлаз и пектиназ.

Активность протеаз штаммов отражена на рисунке 2. Штамм 49РН проявил высокую протеолитическую активность, штамм ИВ - наиболее низкую. Максимум активности протеаз у штамма 49РН отмечен в 12-часовой пробе, тогда как у штаммов 26Д и 11В -на более поздних стадиях культивирования. Не исключено, что высокая активность протеаз у штамма 49РН с одной стороны может быть одним из факторов, подавляющих рост фитопатогенных грибов, а с другой - негативно действующих и на клетки самих растений.

Рис. 1. Хроматограммы суммарной фракции антибиотиков штаммов: а) В. subtilis 11В (2 - сурфактин); б) В. subtilis 26Д (2 - сурфактин); в) В. subtilis 49РН

Биологическая активность метаболитов В. subtilis по отношению к растениям. В лабораторных экспериментах нами установлено, что метаболиты всех трех штаммов в очень низкой концентрации --0,01 мг/л многократно в сравнении с контролем подавляют рост проростков пшеницы (рис. 3 а, б).

eoo

3 700

sí

£ 600

i- 500

М- 400

i 300

» 200

g < 100

Рис. 2. Активность протеаз штаммов В. subtilis. --В. subtilis 26Д, "Лс- - В. subtilis 11В

" - В. subtilis 49РН,

5 Е,

а)

ю о

я-я

б)

0 0,01 0,001 0,0001

Концентрация, мг/мл

0.01

0,001 0,0001

Концентрация, мг/ш

Рис. 3. Влияние различных концентраций суммарной фракции антибиотиков штаммов на рост корней (а) и побегов (б)проростков пшеницы. ИИ - контроль, □ - В. ¡тЪИШ 49РН, - В. жбй'Ду 26Д, £88И - В. яиЫШя 11В

Наибольшая ингибирующая активность проявилась у метаболитов штамма 49РН. При снижении концентрации метаболитов наблюдался обратный эффект -стимуляция роста проростков, причем штамм 49РН превосходил по этой способности штамм 11В.

Таким образом, для проявления высокой антагонистической активности штаммами необходима высокая плотность их клеток на поверхности семян растений, в то же время повышение концентрации бактериальных клеток приводит к ингибирова-нию роста растений. Для штамма 49РН, как одновременно сильного антагониста фи-топатогенов и ингибитора роста растений такое противоречие свойств, вероятно, отражается в снижении эффективности его применения в полевых условиях.

В этих экспериментах у штамма В. subtilis 11В неожиданно проявилась способность стимулировать рост корней укропа даже при высокой концентрации клеток (109 кл/мл). Таким образом, стимуляция роста растений эндофитными штаммами зависит не только от концентрации клеток, но и штамма бактерий.

Взаимоотношения эндофитных штаммов В, subtilis с другими видами бактерий с хозяйственно-полезными признаками. На данном этапе исследования нами методом штрихов было выявлено, что штаммы 26Д и 11В имеют нейтральные отношения с большей частью протестированных микроорганизмов. Штамм 49РН, напротив, проявлял антагонистическую активность ко всем тест-микроорганизмам, кроме бактерий рода Pseudomonas. Бактерия Р. aureofaciens (основа биофунгицида «Елена») оказалась способна в значительной степени подавлять жизнедеятельность всех трех эндофитных бацилл. С целью полуколичественного определения антагонистической активности штамма 49РН и подтверждения отсутствия таковой у штаммов 26Д и 11В мы повторили эксперимент, используя метод агаровых блоков (табл. 3). Штамм 49РН проявляет наиболее выраженный антагонистический эффект по отношению к бактериям рода Azospirillum, в меньшей степени - к бактериям рода Rhizobium и Azotobacter. Таким образом, вполне вероятно, что подобное действие штамма 49РН на полезную микрофлору может воспроизводиться в почве, обуславливая негативное влияние на взаимоотношения растений с азотфиксаторами и снижая тем самым продуктивность сельскохозяйственных культур.

Изучение проявления антагонизма штаммов к микроминетам в почве. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что стремление повысить эффективность биофунгицида путем увеличения в нем концентрации клеток может отрицательно сказаться на продуктивности растений из-за ингибирования их роста метаболитами бацилл. Однако эти выводы не дают объяснения того, что высокоантагонистичный штамм 49РН не обеспечивает высокую степень защиты растений от корневых гнилей при высоком титре клеток в препарате (Минина и др., 2009).

Таблица 3 - Антагонистическая активность эндофитных штаммов В. яиЫШз по отношению к хозяйственно-полезным видам бактерий

Вариант Зона подавления роста, мм2 Вариант Зона подавления роста, мм2

А. скгоососсит В1616 + В.в. 49РН 255±11,5 А. Иро/егит Йр59Ь + В.э. 11В 0

А. сИгоососсит В161 б + В.э. 26Д 0 Р. ангео/аЫет ИБ-6 + В.в. 49РН* 0

А. сИгоососсит В161 б + В.Б. ИВ 0 Р. аигео/аЫет ИБ-6 + В.э. 26Д* 0

А. \nnelandii ИК-1 + В.Б. 49РН 177±13,3 Р. аигео/аЫепз ИБ-6 + В.Б. 11В* 0

А. уте1апсЫ ИБ-1 + В.Б. 26Д 0 Р. риМа ИБ-56 + В.Б. 49РН 154±9,7

А. утеШпсШ ИБ-1 + 11В 0 Р. риИ(1а ИБ-56 + В.Б. 26Д 0

А. ¡гакеюе КБ С1 + В.б. 49РН незначительно Р.риМа ИБ-56 + В.Б. 11В 0

А. 1гакете КВС1 + В.в. 26Д 0 Я 1е$иттозагит 1078 + В.э. 49РН 123±6,2

А. 1гакете КВС1 + В.8. 11В 0 & ^иттоэагит 1078 + В.Б. 26Д 0

А. Иро/егит вр59Ь + В.Б. 49РН 111±10,9 Я. 1е^итто5агит 1078 + В.Б. 11В 0

А. Иро/егит Бр59Ь + Ва 26Д 0 •

Примечание: * - антагонистичным является сам тест-объект.

Для поиска ответа на этот вопрос мы изучили особенности проявления антагонистической активности бацилл по отношению к микромицетам в почве, значительная часть которых может быть представлена фитопатогенными видами. Обработка почвы спорами штамма 49РН независимо от их концентрации приводила к росту в 1,5-4 раза числа грибных пропагул в почве по сравнению с остальными вариантами

опыта и контролем (табл. 4). В то же время штаммы 26Д и 11В эффективно снижали число жизнеспособных микромицетов в почве, особенно на вторые сутки опыта. С целью уточнения полученных данных мы изучили динамику сохранения жизнеспособности у стрептомицин-устойчивых мутантов исследуемых штаммов в почвах разных типов (табл. 5).

Таблица 4 - Влияние обработки почвы спорами различных штаммов В. яиЬМя на численность микромицетов

Вариант Количество пропагул грибов, 104 КОЕ в 1 г почвы

Вторые сутки Третьи сутки

Контроль 1,4 ±0,13 1,5 ± 0,20

49РН, 104 кл* 2,1 ±0,23 2,5 ± 0,35

49РН, 106 кл 2,3 ±0,18 2,6 ± 0,33

26Д, 104 кл 0,9 ± 0,09 1,3 ±0,14

26Д, 106 кл 0,5 ± 0,06 1,1 ±0,17

11В, 104 кл 1,0 ±0,11 1,1 ±0,15

11В, Ю^кл 0,7 ± 0,06 1,0 ±0,18

Примечание: * - указана конечная концентрация клеток на 1 грамм почвы.

В результате было выявлено, что клетки В. яиЫШх 49РН плохо выживают в черноземах; численность жизнеспособных клеток штамма снизилась за 6 суток с 1 млн. до 4. тыс. КОЕ/г почвы. В серой лесной почве количество жизнеспособных клеток штамма с 3 по 6 сутки выросло на 26 тыс. Численность клеток штаммов 26Д и 11В, напротив, увеличивалась в черноземе, а в серой лесной почве снижалась.

Таким образом, второй причиной низкой эффективности штамма В. зйЬШЬ 49РН в подавлении развития корневых гнилей пшеницы в полевых опытах, проведенных на черноземах (Минина и др., 2009), является снижение выживаемости клеток этого штамма в данном типе почв.

Таблица 5 - Динамика численности стрептомицин-устойчивых мутантов исследуемых штаммов в почвах разных типов

Вариант Концентрация, КОЕ/г почвы *10!

3 сутки 6 сутки

49РН, чернозем 0,15 ±0,03 0,04 ±0,01

49РН, серая лесная 0,78 ±0,13 1,04 ±0,20

26Д, чернозем 2,05 ±0,31 4,37 ± 0,61

26Д, серая лесная 1,39 ±0,26 0,80 ±0,18

11В, чернозем 1,15 ±0,25 2,04 ±0,31

11В, серая лесная 0,93 ±0,15 0,78 ±0,14

Разработка биофунгицида на основе штамма В. зиЫНЬ 11В для повышения устойчивости и продуктивности зеленных культур. Согласно полученным результатам штамм В. зиЬИНя 11В, проявивший слабый антагонизм по отношению к фито-патогенным грибам, в значительной степени стимулировал рост растений укропа при обработке семян, при этом не угнетал развитие представителей полезной микрофлоры, и, кроме того, стрептомицин-устойчивый мутант проявлял высокую жизнеспособность в почве, что может свидетельствовать о его конкурентоспособности в естественных условиях. В связи с этим нами были проведены дополнительные эксперименты по изучению влияния штамма 11В и его метаболитов на рост растений укропа в условиях закрытого грунта. В качестве эталонного препарата использовали фитоспорин-М, действующим агентом которого является штамм В. йиЫШз 26Д. В ходе эксперимента было выявлено, что опрыскивание молодых растений препаратом на основе клеток штамма 11В приводит к двукратному увеличению зеленой массы по сравнению с контролем (табл. 6).

Таблица 6 - Влияние обработки укропа препаратами на основе спор и метаболитов штамма В. зиЬИШ 11В на биомассу растений

Вариант Масса 10 растений (г):

корня побега

Контроль 0,31 ± 0,07 4,46 ±0,12

Фитоспорин-М 0,22 ± 0,08 5,46 ±0,14

В. ¡нЫШз 11В 0,38 ±0,11 8,95 ± 0,05

Метаболиты неразведенные. 0,36 ± 0,04 6,27 ± 0,09

Метаболиты разведенные в 10 раз 0,32 ± 0,05 6,61 ± 0,07

При этом действие штамма 11В на корни укропа оказалось гораздо менее выраженным, хотя при обработке семян наблюдалось обратное. Вероятно, это связано с изменением реакции растений на способ обработки и, следовательно, места первичного нахождения микроорганизма. При обработке семян бактерии могут преимущественно колонизировать корни проростков и, соответственно, в большей степени воздействовать на рост именно подземных органов растения. При опрыскивании растений по вегетации бактерии попадают непосредственно на листья и стебли растений, и именно эти органы проявляют большую отзывчивость на воздействие препаратов.

Интересными также оказались данные, полученные при оценке распространенности корневых гнилей укропа (рис. 4). Штамм 11В проявил хорошие защитные свойства, несмотря на невысокую антагонистическую активность in vitro. Эти данные

свидетельствуют, что способность микроорганизмов эффективно осуществлять био-коитроль фитопатогенов не всегда может быть обнаружена в классических тестах in vitro, поскольку такие опыты не позволяют выявить все возможные способы взаимодействия между микроорганизмами, в частности, конкуренцию за экологическую нишу или источники питания. При этом в почве указанные выше механизмы биоконтроля, вероятно, могут играть не менее важную роль, чем продукция гидролитических ферментов и/или антибиотиков. На основании полученных данных штамм В. subtilis 1 IB рекомендован в качестве основы биологического препарата комплексного действия для обработки растений укропа в условиях закрытого грунта.

60-г

Контроль фитоспорин-М В. виЫШэ 11В

Рис. 4. Распространенность корневых гнилей укропа

Разработка схем культивирования штамма В. ьиЫШь 11В и производства биофунгицида на его основе. В связи с возможностью применения штамма 11В в качестве основы биопрепарата нами была отработана схема культивирования данного эндофита в газовихревом биореакторе нового поколения «БИОК» (ЗАО «Саяны», г. Новосибирск). Основные преимущества биореактора газовихревого типа над классическими моделями - максимально сниженное механическое воздействие на клетки, отсутствие «застойных зон» с замедленным массообменном и пониженное энергопотребление обусловили выбор биореактора «БИОК» для культивирования эндофитных штаммов В. зиЫШз. Предварительно параметры процесса были апробированы для штамма В. виЬНШ 26Д, сведения об условиях культивирования которого при производстве препарата фитоспорин-М нам были уже известны. Наиболее подходящей питательной средой по различным критериям оказалась полусинтетическая среда (ПСС) постоянного состава. Было исследовано влияние скорости вращения активатора от

1800 об/мин до 2350 об/мин (предельное по характеристике реактора значение - 2400) на динамику роста и спорообразование бактерий при культивировании в 4 л среды (80% от максимальной загрузки) и расходе воздуха 1л воздуха/л среды в минуту.

Установлено, что скорость роста культуры и объем биомассы клеток В. зиЬШй 26Д прямо пропорциональны скорости перемешивания культуральной среды (рис. 5). Далее было изучено влияние различной интенсивности аэрации среды на скорость роста, спорообразование и концентрацию клеток при одинаковой скорости вращения перемешивающего устройства (2350 об/мин). Выявлено, что наиболыне число спор (близкое к 100%) и наивысший их титр наблюдается при интенсивности подачи воздуха 0,9-1,0 л/л в минуту (рис. 6). Таким образом, нами были определены значения отдельных параметров культивирования эндофитного штамма В. ¡иЫШз 26Д в газовихревом биореакторе «БИОК».

Рис. 5. Зависимость роста концентрации клеток штамма В. яиЫШз 26Д от скорости перемешивания среды (об/мин). ♦ - 1800, ■ - 2000, • - 2150, А - 2350

Оптимизированная схема культивирования была использована при культивировании штамма В. хиЫИи ИВ (рис. 7). Выяснено, что, несмотря на незначительные различия в способности микроорганизмов расти и образовывать споры в описанных условиях, предложенная схема применима для культивирования штамма В.зиЪай 11В.

6 8 10 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Время культивирования, ч

Рис. 6. Зависимость роста концентрации клеток штамма В. ¡иЪЧШ 26Д от интенсивности аэрации среды (л воздуха/л ПС в минуту). ♦ - 0,5, А - 0,9, • -1, * -1,3 л, ■ - 1,4

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Врем* культивирошишя, ч

Рис. 7. Динамика роста концентрации клеток штаммов В. зиЪШк 26Д (■) и В. $иЫШз 11В (А) при культивировании в биореакторе «БИОК»

Таким образом, на основе штамма В. ¡иЫШз 11В и его метаболитов нами предлагается биопрепарат для использования в качестве стимулятора роста растений и биофунгицида, способный при обработке семян и вегетирующих растений укропа существенно повышать зеленую массу культуры в условиях закрытого грунта. В лабораторных условиях разработана технология производства биопрепарата в газовихревом биореакторе «БИОК».

Выводы

1. Сравнительная оценка антагонистической активности эндофитных штаммов В. subtilis 11В, В. subtilis 26Д, В. subtilis 49РН к фитопатогенным грибам показала, что проявление антагонизма бактериями связано не с продукцией ими гидролитических ферментов - хитиназ и глюканаз, а с синтезом антибиотиков, в том числе группы сурфактина.

2. Выявлено, что фракция метаболитов изученных штаммов бактерий, содержащая антибиотики в концентрации 0,01 мг/л проявляет высокую ингибирующую рост растений активность. Повышение концентрации клеток эндофитов в биопрепаратах для обработки семян с одной стороны усиливает их фунгицидную активность, а с другой - подавляет рост растений.

3. Установлено, что штаммы В. subtilis 26Д и В. subtilis 11В не проявляют антагонизма к изученным штаммам хозяйственно-полезных бактерий A. chroococcum, A. vinelandii, A. irakense, A. lipoferum, Р. aureofaciens, Р. putida, R. leguminosarum, тогда как штамм В. subtilis 49РН подавляет их рост.

4. Показано, что эндофитные штаммы В. subtilis могут различаться по жизнеспособности в почвах различных типов и, как следствие, по способности подавлять развитие почвенных микромицетов в естественных условиях.

5. Установлено, что штамм В. subtilis 11В в определенных концентрациях способен стимулировать рост растений укропа и повышать их устойчивость к корневым гнилям. Данный штамм предлагается в качестве основы биопрепарата для повышения продуктивности культуры и защиты ее от фитопатогенных грибов в условиях закрытого грунта.

6. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования эндофитных штаммов В. subtilis в биореакторе газовихревого типа и предложена технология производства биофунгицидов на их основе в лабораторных условиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лукьянцев, М.А. Изучение способов культивирования штамма бактерии Bacillus subtilis 26Д в газо-вихревом биореакгоре / М.А. Лукьянцев, P.M. Хайруллин // Молодежная наука и АПК: проблемы и перспективы: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и аспирантов, 14-16 апреля, 2008. -Уфа, 2008. - С. 49.

2. Лукьянцев, М.А. Разработка полифункционального биофунгицида «СТАРТ» на основе эндофитного штамма Bacillus subtilis 11ВМ / М.А. Лукьянцев, A.A. Егоршина, H.A. Уразбахтина, P.M. Хайруллин // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы пятого московского международного конгресса, 16-20 марта, 2009. -Москва, 2009. - С. 239-240.

3. Лукьянцев, М.А. Оптимизация состава питательной среды для продукции фунги-цидных и фунгистатических веществ эндофитным антагонистом Bacillus subtilis 49РН / М.А. Лукьянцев, A.A. Егоршина, Д.Р. Кутлубердина, P.M. Хайруллин // Симбиоз Россия 2009: Материалы II Всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов с международным участием, 25-29 мая, 2009. - Пермь, 2009. - С. 47.

4. Лукьянцев, М.А. Эндофитный штамм Bacillus subtilis 49РН как перспективная основа нового биофунгицида / М.А. Лукьянцев, A.A. Егоршина, P.M. Хайруллин //Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 1-2 декабря, 2009. - Киров, 2009. - С. 42.

5. Лукьянцев, М.А. Оптимизация параметров культивирования штамма Bacillus subtilis 26Д в газо-вихревом биореакторе «БИОК» / М.А. Лукьянцев, P.M. Хайруллин, Р.Ш. Захарова, H.A. Уразбахтина // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - Спецвыпуск. - С. 466-468.

6. Лукьянцев, М.А. Мобилизация нерастворимых неорганических фосфатов эндофит-ными штаммами Bacillus subtilis / A.A. Егоршина, М.А. Лукьянцев, P.M. Хайруллин // Материалы XII съезда Общества микробиологов Украины им. С.М. Вин оград ского, 25-30 мая, 2009. - Ужгород, 2009. - С. 302.

7. Лукьянцев, М.А. Влияние эндофитных антагонистических штаммов Bacillus subtilis на некоторые виды бактерий / М.А. Лукьянцев, P.M. Хайруллин // Стратегии взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Материалы V Всероссийской конференции молодых ученых 28 сентября - 1 октября, 2010. - Саратов, 2010.-С. 99.

8. Хайруллин, P.M. Некоторые причины низкой эффективности использования высокоантагонистичных эндофитных штаммов Bacillus subtilis в качестве основы биофунгицидов / P.M. Хайруллин, М.А. Лукьянцев, H.A. Уразбахтина // Вестник Казанского государственного аграрного университета. -2010. -№ 3 (17). - С. 146-149.

Подписано в печать 15.10.2010. Формат бумаги 60x84'/i6 Усл. печ. л. 1,40. Бумага офсетная. Печать трафаретная Гарнитура «Тайме». Заказ 578. Тираж 100 экз.

Типография ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет» 450001, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лукьянцев, Михаил Александрович

Сокращения и условные обозначения.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Краткая характеристика эндофитных бактерий.

1.2. Представители рода Bacillus как потенциальные стимуляторы роста растений.

1.3. Явление бактериального антагонизма и его общие механизмы.

1.4. Бактериальные антибиотики.

1.4Л. Антибиотики, продуцируемые В. subtilis.

1.5. Внеклеточные гидролитические ферменты бактерий Bacillus.

1.6. Другие способы антагонистического воздействия почвенных бактерий на фитопатогенную микрофлору.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬАЯ ЧАСТЬ.

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.1. Объект исследований и питательные среды.

2.1.2. Методы оценки культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков штамма В. subtilis 49РН.

2.1.3. Определение антагонистической активности штаммов

В. subtilis in vitro.

2.1.4. Получение и анализ антибиотиков штаммов В. subtilis.

2.1.5. Определение активности внеклеточных гидролаз.

2.1.6. Оценка биологической активности штаммов бактерий по отношению к растениям.

2.1.6. Выявление характера взаимоотношений исследуемых штаммов с другими видами бактерий.

2.1.7. Анализ антагонистической активности штаммов В. subtilis к микромицетам в почве.

2.1.8. Оценка жизнеспособности штаммов В. япЬИИя в почвах.

2.1.9. Биохимический анализ зеленой массы укропа.

2.1.10. Анализ зараженности растений корневыми гнилями.

2.1.11. Оптимизация параметров культивирования штамма В. БиЬНШ

11В в газовихревом биореакторе «БИОК».

2.1.12. Разработка препаративной формы споровой культуры штамма В.БиЪПШ 11В.

2.1.13. Токсико-гигиеническая оценка штаммов.

2.1.14. Статистическая обработка результатов.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.2.1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма В. йиЫШз 49РН.

2.2.2. Токсико-гигиеническая характеристика штамма В. БиЬИШ

49РН.

2.2.3. Антагонистическая активность эндофитных штаммов В. знЫШя

2.2.4. Антибиотическая активность метаболитов бактерий.

2.2.5. Возможные механизмы проявления антагонистической активности исследуемыми штаммами В. зиЬНШ.

2.2.6. Взаимоотношения эндофитных штаммов В. яиЫШз с другими видами бактерий.

2.2.7. Антагонистическая активность исследуемых штаммов к микромицетам в почве.

2.2.8. Регуляция роста растений эндофитными представителями

В. БиЫШз.

2.2.9. Влияние бактерий В. зыЫШб 11В на рост и некоторые биохимические показатели укропа в закрытом грунте.

2.2.10. Разработка биофунгицида на основе штамма В. зиЫШй 11В для повышения устойчивости и продуктивности зеленных культур.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам"

Актуальность темы. Одной из актуальных задач сельскохозяйственной биологии является разработка эффективных средств и способов снижения развития болезней растений. При этом требования к безопасности мероприятий по защите сельскохозяйственных культур от вредных организмов постоянно возрастают. В настоящее время можно выделить два основных подхода для экологически безопасного контроля фитопатогенов: создание устойчивых генетически модифицированных (ГМ) растений и разработка биологических препаратов как альтернативы химическим пестицидам. Поскольку устойчивость к вредным организмам у ГМ-растений контролируется только одним-двумя генами, эффективность «действия» которых может со временем преодолеваться, при этом безопасность таких культур до сих пор остается предметом дискуссий, второе направление представляется более перспективным.

Идея использования микроорганизмов в качестве основы биопрепаратов для защиты растений не нова [1, 4, 13, 21]. В ряду первых агентов биоконтроля численности вредителей и фитопатогенов были представители рода Bacillus [18, 158], продуцирующие, соответственно, токсины, убивающие насекомых или антибиотики, подавляющие развитие грибов [36, 168, 176]. Однако, несмотря на многочисленность исследований в этом направлении, количество коммерческих биопрепаратов, разрешенных в настоящее время к применению в качестве биофунгицидов, ограничено. На наш взгляд, одними из причин этого являются недостаточное изучение биологических особенностей бактерий - антагонистов фитопатогенов, а также понимание механизмов становления системы антагонистические бактерии - фитопатогены - растение.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

1. Провести сравнительную оценку антагонистической активности различных эндофитных штаммов В. зиЫШз к фитопатогенным грибам.

2. Выяснить возможные механизмы проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов.

3. Определить особенности проявления биологической активности исследуемых штаммов по отношению к растениям.

4. Выявить характер взаимоотношений эндофитных штаммов В. БиЬИИз с другими видами бактерий, обладающими хозяйственно-полезными признаками.

5. Изучить характер проявления антагонистической активности исследуемых бацилл к микромицетам почвы.

6. Оценить возможность создания нового биофунгицида на основе перспективных эндофитных штаммов.

Научная новизна. Впервые изучен характер взаимоотношений эндофитных штаммов В. зиЫШз, в том числе штамма 26Д — основы биофунгицида фитоспорин-М, с отдельными представителями азотофиксирующих бактерий почвы. Рассмотрен спектр антибиотиков и предложен вероятный механизм проявления антагонистической активности у изучаемых штаммов В. зиЫШя. Показано, что для создания биофунгицидов при поиске эндофитных бактерий наряду с оценкой их антагонистической активности и способности стимулировать рост растений необходимо исследовать характер взаимодействия с «полезной» почвенной микрофлорой, выживаемость бактерий в почвах разных типов и способность подавлять в них рост фитопатогенных грибов. Обнаружена способность клеток и метаболитов штамма В. хиЫШз 11В повышать урожайность зеленой массы укропа. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования штаммов В. зиЫШя 26Д и 11В в газовихревом биореакторе нового типа «БИОК», показана возможность использования однотипной схемы производства биофунгицидов на основе эндофитных штаммов бацилл с хозяйственно-полезными свойствами.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Антагонистическая активность эндофитных штаммов В. subtilis 49РН, 26Д и 11В к фитопатогенным грибам обусловлена не продукцией бактериями высокоактивных внеклеточных хитиназ и глюканаз, а связана с синтезом антибиотиков.

3. Эндофитные штаммы В. subtilis, подавляющие рост грибных фитопа-тогенов отличаются по антагонистичности к некоторым почвенным азото-фиксаторам: штаммы 26Д и 11В не подавляют рост бактерий Azotobacter chroococcum В1616, A. vinelandii ИБ-1, Azospirillum irakense КВС1 A. lipoferum Sp59b in vitro, тогда как штамм 49PH антагонистичен по отношению к ним.

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Башкирский ГАУ» в рамках заказа Минсельхоза России за счет средств Федерального бюджета по теме «Разработка полифункциональных биофунгицидов для растениеводства» ((№ Госрегистрации 01200853490).

2008); Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов-биологов с международным участием «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития» (Киров, 2009); 5-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва,

2009); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегии взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов,

2010).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лукьянцев, Михаил Александрович

ВЫВОДЫ

1. Сравнительная оценка антагонистической активности эндофитных штаммов В. яиЬиШ 11В, В. хиЬИНх 26Д, В. БиЫШз 49РН к фитопатогенным грибам показала, что проявление антагонизма бактериями связано не с продукцией ими гидролитических ферментов - хитиназ и глюканаз, а с синтезом антибиотиков, в том числе группы сурфактина.

2. Выявлено, что фракция метаболитов изученных штаммов бактерий, содержащая антибиотики в концентрации 0,01 мг/л проявляет высокую ингибирующую рост растений активность. Таким образом, повышение концентрации клеток эндофитов в биопрепаратах для обработки семян с одной стороны усиливает их фунгицидную активность, а с другой -подавляет рост растений.

3. Установлено, что штаммы В. зиЫШз 26Д и В. БиЫШз 11В не проявляют антагонизма к изученным штаммам хозяйственно-полезных бактерий А. скгоососсит, А. уте1апс1И, А. /гакете, А. Иро/егит, Р. аигео/асгет, Р. риШа, Я. leguminosarllm, тогда как штамм В. БиЫШх 49РН подавляет их рост.

4. Показано, что эндофитные штаммы В. зиЫШя могут различаться по жизнеспособности в почвах различных типов и, как следствие, по способности подавлять развитие почвенных микромицетов в естественных условиях.

5. Установлено, что штамм В. зиЫШя 11В в определенных концентрациях способен стимулировать рост растений укропа и повышать их устойчивость к корневым гнилям. Данный штамм предлагается в качестве основы биопрепарата для повышения продуктивности культуры и защиты ее от фитопатогенных грибов в условиях закрытого грунта.

6. Впервые оптимизированы основные параметры культивирования эндофитных штаммов В. БиЬИШ в биореакторе газовихревого типа и предложена технология производства биофунгицидов на их основе в лабораторных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эндофитные микроорганизмы стали объектом исследований сравнительно недавно и в настоящее время представляют собой весьма интересную и «перспективную» в плане научных изысканий группу микроорганизмов. Однако среди множества эндофитных видов, к числу которых относятся как представители царства прокариот, так и различные грибы, лишь небольшая группа микроорганизмов заинтересовала исследователей. С течением времени размеры этой группы увеличиваются значительно медленнее, по сравнению с ростом числа открываемых эндофитов. Этот факт объясняется тем, что эндофитные бактерии и грибы рассматриваются лишь с точки зрения их принадлежности к группе РвРВ, остальные же представители могут быть только описаны при выделении из растения. Данное направление исследований выразилось в применении эндофитов в качестве агентов биоконтроля, благодаря наличию у них, как у представителей РОРВ, ряда свойств, способствующих проявлению комплексного эффекта, «улучшающего жизнь» растения. В случае с эндофитами к полезным свойствам добавляется уникальная способность существовать внутри растения, не вызывая в ответ продолжительной защитной реакции. В эндофитных бациллах, в том числе В. БиЬНШ, исследователи, особенно практики, видят, прежде всего, антагонистов патогенной микрофлоры, по аналогии с неэндофитными штаммами-продуцентами антибиотиков. Наличие данного признака у бактерии считается, бесспорно, полезным и одним из основных, если речь идет о защите сельскохозяйственных культур и повышении урожайности.

Детально изучив биологические особенности одного из высокоантагонистичных эндофитных штаммов В. зиЬИШ 49РН мы, однако, убедились, что так же активно стимулировать рост растений и защищать их от заболеваний он не способен. Полученные результаты легли в основу идеи о недостаточной эффективности критерия «высокий антагонизм» для отбора эндофитных штаммов бацилл как перспективных агентов биоконтроля. Исследование свойств штамма позволило пролить свет на некоторые стороны проблемы сильный антагонист - слабый стимулятор роста и агент биоконтроля». Так, оказалось, что штамм 49РН в отсутствии объекта антагонистического воздействия синтезирует антимикробные метаболиты в значительно меньших количествах, чем в классических экспериментах с двойной системой «антагонист-патоген (тест-объект)»; штамм 49РН существенно подавлял рост «полезных» азотофиксирующих бактерий in vitro-, антагонистическая активность исследуемого штамма по отношению к микромицетам почвы оказалась значительно ниже, чем у слабоантагонистичных бацилл, что было, вероятно, связано с низкой выживаемостью культуры 49РН в черноземе. Наконец, ин-гибирующее действие фракции антимикробных метаболитов штамма на рост проростков пшеницы проявилось сильнее, чем у «эталона» В. subtilis 26Д и слабого антагониста В. subtilis 11В. Сопоставив значимость результатов, мы заключили, что при скрининге эндофитных штаммов с точки зрения возможности их использования в качестве агентов биоконтроля и основы для биофунгицидов необходимо уделять внимание также изучению особенностей проявления антагонизма и жизнеспособности бактерий в тех условиях, в которых микроорганизм планируется использовать (в нашем случае это почва). В то же время, мы считаем, что исследование механизма проявления антагонистической активности у каждого потенциально перспективного штамма и последующее выявление особенностей воздействия бактерии на растение посредством этих механизмов, может позволить более точно определять «полезность» изучаемых микроорганизмов.

Для более полного понимания особенностей проявления свойств эндофитных микроорганизмов в конечном итоге требуется исследование этих бактерий в среде обитания эндофитов - растении. Нам удалось показать, что выраженный антагонизм у эндофитных бацилл не является главным признаком, обуславливающим их пригодность в качестве основы для биофунгицидов и стимуляторов роста растений. Более того, чрезвычайно сильно выраженный антагонизм может сочетаться со столь же выраженным ингибирова-нием роста растения. Проявление исследованных свойств эндофитных бацилл-антагонистов в условиях, приближенных к естественным, может сильно отличаться от результатов, полученных в лабораторных экспериментах.

Разностороннее исследование особенностей проявления биологической активности эндофитов позволили обнаружить у слабоантагонистичного штамма В. subtilis 11В способность к стимуляции роста и защите от фитопа-тогенов растений укропа. На основании этих результатов был разработан экспериментальный препарат для повышения продуктивности и устойчивости укропа в закрытом грунте. Дальнейшие исследования свойств этого штамма по отношению к другим видам растений, возможно, позволят расширить перечень культур, на которых будет разрешено применение разработанного препарата.

112

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лукьянцев, Михаил Александрович, Уфа

1. Билай, В.И. Микроскопические грибы продуценты антибиотиков. -Киев : АН УССР, 1961.- 183 с.

2. Влияние микроорганизмов, продуцирующих цитокинины, на рост растений / Т.Н. Архипова и др. // Биотехнология. 2006. - №. 4. - С. 50-55.

3. Красильников, H.A. Антибиотики в растениеводстве / H.A. Красильников // Природа. 1952. - № 7. - С. 17-27.

4. Мелентьев А.И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. М. : Наука, 2007. - 147 с.

5. Мертвецов Н.П. и др. Газовихревые биореакторы «БИОК»: использование в современной биотехнологии. Новосибирск : Наука, 2002. - 118 с.

6. Механические воздействия на микроорганизмы при культивировании / Е.В. Гусева и др. // Биотехнология. 2007. - № 5. - С. 72-77.

7. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение (обзор) / Е.А. Цавкелова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42, № 2. - С. 133-143.

8. Минеев В.Г. и др. Практикум по агрохимии. М. : Изд-во МГУ, 2001. -689 с.

9. Недорезков В.Д. Биологическое обоснование применения эндофитных бактерий в защите пшеницы от болезней на Южном Урале. Дисс. д-ра с.-х. наук. - Уфа, 2003. - 280 с.

10. Новогрудский Д.М. Антагонистические взаимоотношения у микробов и биологические методы борьбы с грибковыми заболеваниями культурных растений // Успехи современной биологии. 1936. - Т.5, Вып.З. - С. 509-536.

11. Новые эндофитные штаммы Bacillus subtilis как основа биофунгицидов / Т.С. Минина и др. // Вестник Казанского государственного аграрного университетаю 2009. - № 2(12). - С. 55-59.

12. Роль бактерий антагонистов фитопатогенов в защите сельскохозяйственных растений от болезней / О.Н. Логинов и др. - Уфа : Гилем, 2001. -66 с.

13. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ.

14. Киев: Наукова думка, 1982. 278 с.

15. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии // М.: Наука, 2005. 252 с.

16. Хитинолитическая активность бактерий Bacillus Cohn антагонистов фитопатогенных грибов / Г.Э. Актуганов и др. // Микробиология. -2003. - Т. 72, № 3. - С. 356-360.

17. Худяков, Я.П. Литическое действие почвенных бактерий на почвенные грибы / Я.П. Худяков // Микробиология. 1935. - Т.4, Вып.2. - С.193-203.

18. A plant defense response effector induces microbial apoptosis / M.L. Narasimhan et al. // Mol. Cell. 2001. - Vol. 8. - P. 921-930.

19. Agarwal, S. Tetrazolium reducing microorganisms inside the root of Brassica species / S. Agarwal, S.T. Shende // Curr. Sei. 1987. - № 56. - P. 187-188.

20. Altered srf expression in Bacillus subtilis resulting from changes in culture pH is dependent on the SpoOK oligopeptide permase and the ComQX system of extracellular compounds / W.M. Cosby et al. // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180.-P. 1438-1445.

21. Amicoumacin antibiotic production and genetic diversity of Bacillus subtilis strains isolated from different habitats / I.V. Pinchuk et al. II Res. Microbiol. -2002.-Vol. 153.-P. 269-276.

22. Antoun, H. Ecology of plant growth promoting rhizobacteria / H. Antoun, D. Prévost // PGPR: Biocontrol and Biofertilization / Z.A. Siddiqui. Springer, 2005. - Chapter l.-P. 1-38.

23. Attachment of Enterobacter cloacae to hyphae of Pythium ultimum', possible role in biological control of Pythium pre-emergence damping-off / E.B. Nelson et al. II Phytopathology. 1986. - № 76. - P. 327-335.

24. Bacillaene, a novel inhibitor of prokaryotic protein synthesis produced by Bacillus subtilis: production, taxonomy, isolation, physico-chemical characterization and biological activity / P.S. Patel et al. II J. Antibiot. -1995. Vol. 48. - P. 997-1003.

25. Bacillomycin F, a new antibiotic of iturin group. Isolation and characterization / A. Mhammedi et al. // J. Antibiot. 1982. - Vol. 35. - P. 306-311.

26. Bacilysocin, a novel phospholipids antibiotic produced by Bacillus subtilis 168 /N. Tamehiro et al. // Antimicrob. Agents Chemoter. 2002. - Vol. 46. -P. 315-320.

27. Bacon, C.W. Endophytic and biological control potential of Bacillus mojavensis and related species / C.W. Bacon, D. M. Hinton // Biological control. 2002. - Vol. 23. - P. 274-284.

28. Bacterial communities associated with flowering plants of the Ni hyperaccumulator Thlaspi goesingense / R. Idris et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - Vol. 70, № 5. - P. 2667-2677.

29. Bacterial endophytes in agricultural crops / J. Hallman, et al. // Can. J. Microbiol. 1997. - Vol. 43, № 4. - P. 895-914.

30. Bacterial endophytes in processing carrots (Daucus carota L. var. sativus): Their localization, population density, biodiversity and their effects on plant growth / M.A. Surette et al. // Plant Soil. 2003. - Vol. 253. - P. 381-390.

31. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis thaliana / C.-M. Ryu et al. // Plant Biol. 2003. - Vol. 100, № 8. - P. 4927-4932.

32. Bais, H.P. Biocontrol of Bacillus subtilis against infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae is facilitated by biofilm formation and surfactin production / H.P. Bais, R. Fall, J.M. Vivanco // J. Plant Physiol. -2004.-Vol. 134.-P. 307-319.

33. Bashan, Y. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture / Y. Bashan, H. Levanony // Can. J. Microbiol. 1990. - Vol. 36. - P. 591-608.

34. Benhamou, N. Induction of resistance against Fusarium wilt of tomato by combination of chitosan with an endophytic bacterial strain / N. Benhamou, J.W. Kloepper, S. Tuzun // Planta. 1998. - Vol. 204. - P. 153-168.

35. Berg, G. Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes / G. Berg, J. Kallmann // Microbial root endophytes / Schulz B., Boyle C., Sieber T.N. Springer-Verlag, 2006.

36. Biosynthesis of rhizocticins, antifungal phosphonate oligopeptides produced by Bacillus subtilis ATCC6633 / S.A. Borisova, et al. // Chemistry and Biology. 2010. - Vol. 17. - P. 28-37.

37. Bloemberg, G.V. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria / G.V. Bloemberg, B.J.J. Lugtenberg // Current Opin. Plant Biol. 2001. - Vol. 4. - P. 343-350.

38. Boven, B. Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method / B. Boven, J. Hooper, J. Parisot // J. Antimicrob. Chemother. 2008. - Vol. 61.-P. 1295-1301.

39. Brinkmann, U. Simultaneous utilization of heterotrophic substrates by Hansenula polymorpha MH30 results in enhanced growth rates / U. Brinkmann, W. Babel // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. - № 37. - P. 98-103.

40. Brogden, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? / K.A. Brogden // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3. - P. 238250.

41. Characterization of plant growth-promoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase / A.A. Belimov et al. // Can. J. Microbiol. 2001. - Vol. 47, № 3. - P. 642652.

42. Characterization 3a genes involved in biosynthesis of a novel antibiotic from Bulkholderia cepacia BC11 and their role in biological control of Rhizoctoniasolani / Y. Kang et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - № 64. - P. 3939-3947.

43. Chemical characterization of root exudates from rice (Oryza sativa) and their effects on the chemotactic response of endophytic bacteria / M. Bacilio-Jimenez et al. // Plant Soil. 2003. - Vol. 249. - P. 271-277.

44. Cherry, R. Cell death in the thin films of bursting bubbles / R. Cherry, C. Hulle // Biotechnol. Prog. 1992.- №-P. 11-18.

45. Cherry, R. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors / R. Cherry, E. Papoutsakis // Biotechnol. Bioeng. 1988. - № 32. -P. 1001-1004.

46. Cherry, R. Transient shear stresses on a suspension cell in turbulence / R. Cheny, K. Kwon // Biotechnol. Bioeng. 1990. - № 36. - P. 563-571.

47. Chet, I. Mycoparasitism and lytic enzymes /1. Chet, N. Benhamou, S. Haran // Trichoderma and gliocladium / G.E. Harman, C.P. Kubieek. London: Taylor, and Francis, 1998. - Vol. 2. - P. 153-172.

48. Cloning and DNA sequencing of bga A, a gene encoding an endo-(3-l,3-l,4-glucanase, from an alkalophilic Bacillus strain (N137) / C. Tabernero et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60, № 4. - P. 1213-1220.

49. Cloning and sequencing of chiC gene of Bacillus circulans WL-12 and relationship of its product to some other chitinases and chitinase-like proteins / M.M. Alam et al. // J. Ferment. Bioeng. 1995. - № 80. - P. 454-461.

50. Cotter, P.D. Bacteriocins: developing innate immunity for foods / P.D. Cotter, C. Hill, R.P. Ross // Microbiology. 2005. - № 3(10). - P. 777-788.

51. Davies, J. What are antibiotics? Archaic functions for modern activities / J. Davies // Mol. Microbiol. 1990. -№ 4. - P. 1227-1232.

52. De Bruijn, I. Regulation of cyclic lipopeptide biosynthesis in Pseudomonas fluorescens by the ClpP protease /1, de Bruijn, J.M. Raaijmaker // J. Bacteriol. -2009.-Vol. 191, №6.-P. 1910-1923.

53. De Freitas, J.R. Phosphate-solubilizing rhizobacteria enhance the growth and yield but not phosphorus uptake of canola (Brassica napus L.) / J.R. de

54. Freitas, M.R. Banerjee, J.J. Germida // Biol. Fértil. Soil. 1997. -Vol. 24. - P. 358-364.

55. De Lucca, A.J. Antifungal peptides: novel therapeutic compounds against emerging pathogens / A.J. de Lucca, T.J. Walsh // Antimicrob. Agents Chemother. 1999.-Vol. 43.-P. 1-11.

56. Difficidin and oxydifficidin: novel broad spectrum antibacterial antibiotics produced by Bacillus subtilis. II. Isolation and physico-chemical characterization / K.E. Wilson et al. // J. Antibiot. (Tokyo). 1987. - Vol. 40.-P. 1682-1691.

57. Doering, J. Different amino acid requirements for sporulation in Bacillus subtilis / J. Doering, K. Bott // J. Bacteriol. 1972. - Vol. 112, № 1. - P. 345355.

58. Dorr, J. Type IV pili are involved in plant-microbe and fungus-microbe interactions / J. Dorr, T Hurek, B. Reinhold-Hurek // Mol. Microbiol. 1998. -№30.-P. 7-17.

59. Duffy, B.K. Environmental factors modulating antibiotic and siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains / B.K. Duffy, G. Défago // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, № 8. - P. 2429-2438.

60. Dunstan, W.A. Effects of bacteria on mycorrhizal development and growth of container grown Eucalyptus diversicolor F. Muell. seedlings / W.A. Dunstan., N. Malajczuk, B. Dell 11 Plant Soil. 1998. - Vol. 201. - P. 241-249.

61. Duval-Iflah, Y. Antagonism among isogenic strains of Escherichia coli in the digestive tracts of gnotobiotic mice / Y. Duval-Iflah, P. Raibaud, M. Rousseau // Infect. Immun. 1981. - № 34. - P. 957-969.

62. Ecological interaction of a biocontrol Pseudomonas fluorescens strain producing 2,4-diacetylphloroglucinol with the soft rot potato pathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica / D. Cronin et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 1997. - № 23. - P. 95-106.

63. Effect of chitin on biological control activity of Bacillus spp. and Trichoderma harzianum against root rot disease in pepper / A.S. Ahmed et al. // Eur. J. Plant Pathol. 2003. - Vol. 109, № 6. - P. 633-637.

64. Effect of the lipopeptide antibiotic, iturin A, on morphology and membrane ultrastructure of yeast cells / L. Thimon et al. // FEMS Microbiol. Lett. -1995.-Vol. 128.-P. 101-106.

65. Effects of red pine (Pinus resinosa Ait.) mycorrhizoplane-associated actinomycetes on in vitro growth of ectomycorrhizal fungi / D.L. Richter, et al.//Plant Soil.- 1989,-Vol. 115.-P. 109-116.

66. Endophytic bacteria and their potential applications / C. Lodewyckx, et al. // Critical Rev. Plant Sei. 2002. - Vol. 21. - P. 583-606.

67. Endophytic bacteria in grapevine / C.R. Bell, et al. // Can. J. Microbiol. -1995.-№41.-P. 46-53.

68. Endophytic colonization of rice by a diazotrophic strain of Serratia marcescens / P. Gyaneshwar, et al. // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183, № 8. -P. 2634-2645.

69. Enebak, S.A. Evidence for induced systemic protection to fusiform rust in loblolly pine by plant growth-promoting rhizobacteria / S.A. Enebak, W.A. Carey // Plant Dis. 2000. - Vol. 84. - P. 306-308.

70. Enhanced growth and nodulation of pigeon pea by co-inoculation of Bacillus strains with Rhizobium spp. / G. Rajendran, et al. // Bioresource Technology. 2008. - Vol. 99. - P. 4544-4550.

71. Entian, K.-D. Genetics of subtilin and nisin biosyntheses: biosynthesis of lantibiotics / K.-D. Entian, W.M. de Vos // Antonie Leeuwenhoek. 1996. -Vol. 69.-P. 109-117.

72. Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect / E.E. Idriss et al. // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 2097-2109.

73. Extracellular proteases produced by the Quorn myco-protein fungus Fusarium graminearum in batch and chemostat culture / A.M. Griffen et al. II Microbiology. 1997.-Vol. 143.-P. 3007-3013.

74. Fengycin a novel antifungal lipopeptide antibiotic produced by Bacillus subtilis F-29-3 / N. Vanittanakom et al. // J. Antibiot. - 1986. - Vol. 39. - P. 888-901.

75. Fertilizing soil microorganisms to improve productivity of agroecosystems / G. Welbaum et al. // Critical Rev. Plant Sei. 2004. - Vol. 23. - P. 175193.

76. Finking, R. Biosynthesis of nonribosomal peptides / R. Finking, M.A. Marahiel // Annu. Rev. Microbiol. 2004. - Vol. 58. - P. 453-458.

77. Fränberg, E. Antifungal activity of chitinilytic bacteria isolated from airtight stored cereal grains / E. Fränberg, J. Schnürer // Can. J. Microbiol. 1998. -Vol. 44.-P. 121-127.

78. Fuentes-Ramirez, L.E. Bacterial Biofertilizers / L.E. Fuentes-Ramirez, J. Caballero-Mellado // PGPR: Biocontrol and Biofertilization / Z.A. Siddiqui. -Springer, 2005. Chapter 5. - P. 143-172.

79. Garbaye, J. Helper bacteria: a new dimension to the mycorrhizal symbiosis / J. Garbaye//New Phytologist. 1994. - Vol. 128. - P. 197-210.

80. Garcia de Salamone, I.E. Role of cytokinins in plant growth promotion by rhizocphere bacteria / I.E. Garcia de Salamone, R.K. Hynes, L.M. Nelson // PGPR: biocontrol and biofertilization / Z.A. Siddiqui. Springer, 2005. -Chapter 6.-P. 173-195.

81. Glucanolytic actinomycetes antagonistic to Phytophtora fragariae var. rubi, the causal agent of raspberry root rot / D. Valois et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - № 62. - P. 1630-1635.

82. Grimault, V. Invasiveness of Pseudomonas solanacearum in tomato, eggplant and pepper: a comparative study / V. Grimault, P. Prior // Europ. J. Plant Pathol. 1994. - Vol. 100. - P. 259.

83. Growth inhibition of enteric bacteria by Vibrio cholerae in nutrient media containing lactate, acetate or citrate / K. Bhaskaran et al. // Antimicrob. Agent. Chemother. 1974. - Vol. 6, № 3. - P. 375-378.

84. Halverson, L.J. Enhancement of soybean nodulation by Bacillus cereus UW85 in the field and in a growth chamber / L.J. Halverson, J. Handelsman // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 2767-2770.

85. Hancock, R.E. Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides / R.E. Hancock, A. Rozek // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol. 206.-P. 143-149.

86. Hancock, R.E. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defenses / R.E. Hancock, G. Diamond // Trends Microbiol. 2000. - Vol. 8. -P. 402^10.

87. Harish, S. Fusarium udum is resistant to the micolytic activity of a biocontrol strain of Bacillus subtilis AF1 / S. Harish, K. Manjula, A.R. Podile // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. - Vol. 25. - P. 385-390.

88. Hogan, D.A. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influence Candida albicans morphology / D.A. Hogan, A. Vik, R. Kolter // Mol. Microbiol. -2004. Vol. 54.-P. 1212-1223.

89. Hogan, D.A. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role of virulence factors / D.A. Hogan, R. Kolter // Science. 2002. - Vol. 296. - P. 2229-2232.

90. Identification of amino acid substitutions in the lipopeptide surfactin using 2D NMR spectroscopy / F. Baumgart et al. // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1991. - Vol. 177. -P. 998-1005.

91. In vitro anti-Chelicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics / I.V. Pinchuk et al. II Antimicrob. Agents. Chemoter. 2001. - Vol. 45. - P. 3156-3161.

92. Interaction between Pseudomonas aeruginosa and Staphilococcus aureus: description of an antistaphilococcal substance / Z.A. Machan et al. II J. Med. Microbiol. 1991. - Vol. 34. - P. 213-217.

93. Involvement of pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium-induced damping-off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 / S. Buysens et al. II Appl. Environ. Microbiol. -1996. Vol. 62, № 3. - P. 865-871.

94. Iron availability affects induction of systemic resistance to Fusarium wilt of radish by Pseudomonas fluorescens / M. Leeman et al. II Phytopathology. -1996.-Vol. 86.-P. 149-155.

95. Isolation and characterization of ACC-deaminase genes from two different plant growth promoting rhizobacteria / S. Shah et al. // Can. J. Microbiol. -1998. Vol. 44, № 4. - P. 833-943.

96. Isolation and characterization of endophytic bacteria from the nickel hyperaccumulator plant Alyssum bertolonii / R. Barzanti et al. II Microbial Ecol. 2007. - Vol. 53.-P. 306-316.

97. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie plants / D.K. Zinniel et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2002. Vol. 68, № 5. - P. 2198-2208.

98. Jack, R.W. Lantibiotics and microcins: polypeptides with unusual chemical diversity / R.W. Jack, G. Jung // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - Vol. 4. -P. 307-310.

99. Jack, R.W. Lantibiotics and related peptides / R.W. Jack, G. Bierbaum, H.-G. Sahl // Springer-Verlag, Berlin, Germany, 1998.

100. Jacobs, M.J. Enumeration, location and characterization of endophytic bacteria within sugar beet roots / M.J. Jacobs, W.M. Bugbee, D.A. Gabrielson // Can. J. Botany. 1985 - № 63. - P. 1262-1265.

101. Jagadeesh, K.S. Evaluation of role of fluorescent siderophore in the biological control of bacterial wilt in tomato using Tn5 mutants of fluorescent Pseudomonas sp. / K.S. Jagadeesh, J.H. Kulkarni, P.U. Krisharaj // Curr. Sci. -2001.-№81.-P. 882-883.

102. Jakubovics, N. Out of the iron age: new insights into the critical role of manganese homeostasis in bacteria / N. Jakubovics, H. Jenkinson // Microbiology.-2001.-№ 147.-P. 1709-1718.

103. Jenssen, H. Peptide antimicrobial agents / H. Jenssen, P. Hammil, R.E. Hancock //. Clin. Microbiol. Rew. 2006. - Vol. 19, № 3. - P. 491-511.

104. Klich, M.A. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis / M.A. Klich, A.R. Kax, J.M. Bland //Mycopathology. 1991.-Vol. 116.-P. 77-80.

105. Kloepper, J.W. Bacterial endophytes as elicitors of induced systemic resistance / J.W. Kloepper, C.-M. Ryu // Microbial root endophytes / Schulz B., Boyle C., Sieber T.N. Springer-Verlag, 2006. - Chapter 3. - P. 33-52.

106. Kobayashi, D.Y. Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture / D.Y. Kobayashi, Palumbo J.D. // Microbial endophytes / C.W. Bacon., J.F. White. Marcel Decker Inc., 2000. - P. 199-233.

107. Kreth, J. Streptococcal antagonism in oral biofilms: Streptococcus sanguinis and Streptococcus gordonii interference with Streptococcus mutants / J. Kreth, Y. Zhang, M.C. Herzberg // J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190, № 13. - P. 46324640.

108. Ladha, J.K. Assessing opportunities for nitrogen fixation in rice: a frontier project / J.K. Ladha, F.J. de Bruijn, K.A. Malik // Plant Soil. 1997. - Vol. 194.-P. 1-10.

109. Lamb, T.G. Movement of Pseudomonas aureofaciens from the rhizosphere to aerial plant / T.G. Lamb, D.W. Tonkyn, D.A. Kluepfel // Can. J. Microbiol. -1996.-№42.-P. 1112-1120.

110. Lang, S. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants) / S. Lang // Curr. Opin. Colloid and Interface Sci. 2002. - Vol. 7. - P. 12-20.

111. Lim, H.-S. Pseudomonas stutzeri YPL-2 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot / H.-S. Lim, Y.-S. Kim, S.-D. Kim // Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol. 57. - P. 510516.

112. Lindow, S.E. Microbiology of the phyllosphere / S.E. Lindow, M.T. Brandl // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69, № 4. - P. 1875-1883.

113. Loper, J.E. Siderophores in microbial interactions on plant surfaces / J.E. Loper, J.S. Buyer // Mol. Plant-Microbe Interact. 1991. - Vol. 4. - P. 129136.

114. Loper, J.E. Utilization of heterologous siderophores enhances levels of iron available to Pseudomonas putida in the rhizosphere / J.E. Loper, M.D. Henkels // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, № 12. - P. 53575363.

115. Mabuchi, N. Characterization of chitinases excreted by Bacillus cereus CH / N. Mabuchi, I. Hashizume, Y. Araki // Canad. J. Microbiol. 2000. - Vol. 4. -P. 370-375.

116. Mahadevan, B. Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 / B. Mahadevan, D. Crawford // Enzyme and Microbial Technol. 1997. - Vol. 20. - P. 489-493.

117. Mantelin, S. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake / S. Mantelin, B. Touraine // J. Exp. Bot. 2004. - Vol. 55, № 394. - P. 27-34.

118. Martin, E. Defensins and other endogenous peptide antibiotics of vertebrates / E. Martin, T. Ganz, R.I. Lehler // J. Leukoc. Biol. 1995. - Vol. 58. - P. 128136.

119. Mayak, S. Plant growth-promotion bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and peppers / S. Mayak, T. Tirosh, B.R. Glick // Plant Sci.2004. Vol. 166, № 2. - P. 525-530.

120. McInroy, J.A. Survey of indigenous bacterial endophytes from cotton and sweet corn / J.A. Mclnroy, J.W. Kloepper // Plant Soil. 1996. - Vol. 173, № 1. - P. 337-342.

121. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli / M. Wu et al. // Biochemistry. 1999. - Vol. 38. - P. 7235-7242.

122. Mercier, J. Field performance of antagonistic bacteria identified in a novel laboratory assay for biological control of fire blight of pear / J. Mercier, S.E. Lindow//Biol. Control. -2001. -№22. -P. 66-71.

123. Microbial community composition affects soil fungistasis / W. de Boer et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69, № 2. - P. 835-844.

124. Microbial co-operation in the rhizosphere / J.-M. Barea et al. // Exp. Bot.2005. № 56(417). - P. 1761-1778.

125. Mitchell, R. Suppression of Pythium debarianum by lytic rhizosphere bacteria / R. Mitchell, E. Hurwitz // Phytopathology. 1965. - № 55. - P. 156-158.

126. Molecular mechanism of membrane permeabilization by the peptide antibiotic surfactin / C. Carrillo et al. // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - Vol. 1611. -P. 91-97.

127. Nakano, M.M. Molecular biology of antibiotic production in Bacillus CRC / M.M. Nakano, P. Zuber // Critical Rev. Biotechnol. 1990. - Vol. 10. - P. 223-240.

128. Nelson, E.B. Microbial dynamics and interactions in the spermosphere / E.B. Nelson // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. - Vol. 42. - P. 271-309.

129. Newman, L.A. Bacteria and phytoremediation: new uses for endophytic bacteria in plants / L.A. Newman, C.M. Reynolds // Trends in Biotechnology. -2005.-Vol. 23, № l.-P. 6-8.

130. Nowak, J. Priming for transplant stress resistance in vitro propagation / J. Nowak, V. Shulaev // Annu. Rev. Phytopathol. 2003. - Vol. 41. - P. 107124.

131. Okon, Y. Agronomic applications of Azospirillum an evaluation of 20 years worldwide field inoculation / Y. Okon, C.A. Labandera-Gonzalez // Soil Biol. Biochem. - 1994. - Vol. 26. - P. 1591 -1601.

132. Optimisaton of biosurfactant lipopeptide production from Bacillus subtilis S499 by Plackett-Burman design / P. Jacques et al. II Appl. Biochem. Biotechnol. 1999. - Vol. 77. - P. 223-233.

133. Optimization of physical factors on the production of active metabolites by Bacillus subtilis 355 against wood surface contaminant fungi / C. Moita et al. II International Biodeterioration & Biodégradation. 2005. - Vol. 55. - P. 261-269.

134. Overproduction of an inducible serine protease improves biological control of Pythium ultimum by Stenotrophomonas maltofilia strain W81 / C. Dunne et al. II Microbiology. 2000. - Vol. 146. - P. 2069-2078.

135. Paenibacillus polymyxa antagonizes oomycete plant pathogen Phytophthora palmivora and Pythium aphanidermatum / S. Timmusk et al. II J. Appl. Microbiol. -2009.-№ 106.-P. 1473-1481.

136. Patten, C.L. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system / C.L. Patten, B.R. Glick // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68, № 8. - P. 3795-3801.

137. Peptide sequence of epidermin, a ribosomally synthesized antibiotic with four sulfide-rings / N. Schnell et al. // Nature. 1998. - Vol. 333. - P. 276-278.

138. Peypoux, F. Recent trends in the biochemistry of surfactin / F. Peypoux, J.M. Bonmatin, J. Wallach // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 51. - P. 553-563.

139. Phosphate solubilizing microorganisms associated with maize rhizosphere in Brazilian acid savanna soils / N. Sa et al. // Rhizosphere 2 / International Conference Montpellier, France, 26-31 August. Montpellier, 2007. - P. 44.

140. Pleban, S. Chitinolytic activity of an endophytic strain of Bacillus / S. Pleban, L. Chernin, I. Chet // Lett. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 25. - P. 284-288.

141. Potato-associated bacteria and their antagonistic potential towards plant-pathogenic fungi and plant-parasitic nematode Meloidogyne incognito (Kofoid & White) Chitwood / A. Krechel et al. // Can. J. Microbiol. 2002. - Vol. 48.-P. 772-786.

142. Powell, K.A. Technical and commercial aspects of biological control products / K.A. Powell, A.R. Jutsum // Pestic. Sci. 1993. - Vol. 37. - P. 315-321.

143. Press, C.M. Role of iron in rhizobacteria-mediated induced systemic resistance of cucumber / C.M. Press, J.E. Loper, J.W. Kloepper // Phytopathology. 2001. - № 91. - P. 593-598.

144. Production of kanosamine by Bacillus cereus UW85 / J.L. Milner et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. -№ 62. - P. 3061-3065.

145. Properties of nisin Z and distribution of its gene, nisZ, in Lactococcus lactis / W.M. de Vos et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 213218.

146. Protection of cucumber against Pythium root rot by fluorescent pseudomonads: predominant role of induced resistance over siderophores and antibiosis / M. Ongena et al. // Plant Pathol. 1999. - Vol. 48. - P. 66-76.

147. Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains / C. Mawadza et al. //J. Biotechnol. 2000. - Vol. 83. - P. 177-187.

148. Reactive oxygen species play no role in the candidacidal activity of the salivary antimicrobial peptide histatin 5 / E.C. Veerman et al. // Biochem. J. 2004. - Vol. 381. - P. 447^452.

149. Reinhold, B. Strain-specific chemotaxis of Azospirillum spp. / B. Reinhold, T. Hurek, I. Fendrik//J. Bacteriol. 1985. - Vol. 162, № l. p. 190-195.

150. Roberts, W. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity / W. Roberts, C. Selitrinnikoff// J. Gen. Microbiol. 1988. - Vol. 134. - P. 169176.

151. Rodriguez, H. Phosphate solubilizing bacteria qnd their role in plant growth promotion / H. Rodriguez, R. Fraga // Biotechnical advantages. 1999. - Vol. 17.-P. 319-339.

152. Role of lipopeptides produced by Bacillus subtilis GA1 in the reduction of grey mould disease caused by Botrytis cinerea on apple / Y. Toure et al. // J. Appl. Microbiol. 2004. - Vol. 96.-P. 1151-1160.

153. Roos, I.M.M. Fluorescent Pseudomonas associated with bacterial canker of stone fruit in South Africa / I.M.M. Roos, M.J. Hatting // Plant Dis. 1983. -№67.-P. 1267-1269.

154. Rosenberg, E. High and low-molecular-mass microbial surfactants / E. Rosenberg, E.Z. Ron // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 52. - P. 154-162.

155. Rosenzweig, W.D. Influence of environmental factors on antagonism of fungi by bacteria in soil: nutrient levels /W.D. Rosenzweig, G. Stotzky // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 39, № 2. - P. 354-360.

156. Ryan, R.P. Diffusible signals and interspecies communication in bacteria / R.P. Ryan, J.M. Dow//Microbiology. 2008. - № 154.-P. 1845-1858.

157. Schmidli-Sacherer, P. The global regulator GacA of Pseudomonas fluorescens for suppression of root diseases in dicotyledons but not in Gramineae / P. Schmidli-Sacherer, C. Keel, G. Defago // Plant Pathol. 1997. - № 46(1). -P. 80-90.

158. Selection and scrinning of endorhizosphere bacteria from solarised soils as biocontrol agents against Verticillium dahliae of solanaceous hosts / E.C. Tjamos et al. // Eur. J. Plant Pathol. 2004. - Vol. 110. - P. 35-44.

159. Shoda, M. Bacterial control of plant diseases / M. Shoda // J. Biosci. Bioeng. 2000. - Vol. 89. - P. 515-521.

160. Siddiqui, I.A. Mixtures of plant disease suppressive bacteria enhance biological control of multiple tomato pathogens / I.A. Siddiqui, S.S. Shaukat // Biol. Fertil. Soil. 2002. - Vol. 36. - P. 260-268.

161. Siddiqui, Z.A. PGPR: prospective biocontrol agents of plant pathogens / Z.A. Siddiqui // PGPR: biocontrol and biofertilization / Z.A. Siddiqui. Springer, 2005. - Chapter 4. - P. 111-142.

162. Sieber, S.A. Learning from nature's drug factories: nonribosomal synthesis of macrocyclic peptides / S.A. Sieber, Marahiel M.A. // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185.-P. 7036-7043.

163. Sprent, J.I. Mechanisms of infection of plants by nitrogen fixing organisms / J.I. Sprent, S.M. de Faria//Plant Soil. 1988. - Vol. 110.-P. 157-165.

164. Srinivasan, M. Nodulation of Phaseolus vulgaris by Rhizobium etli is enhanced by the presence of Bacillus / M. Srinivasan., D.J. Petresen, F.B. Holl // Can. J. Microbiol. 1997.-Vol. 43.-P. 1-8.

165. Steenhoudt, O. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects / O. Steenhoudt, J. Vanderleyden // FEMS Microbiol. Rev. 2000. - Vol. 24. - P. 487-506.

166. Stein, T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions / T. Stein // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 56, № 4. - P. 845-857.

167. Strobel, G.A. Endophytes as sources of bioactive products / G.A. Strobel // Microbes and Infection. 2003. - Vol. 5. - P. 535-544.

168. Strom, M.S. Structure-function and biogenesis of the type IV pili / M.S. Strom, S. Lory // Annu. Rev. Microbiol. 1993. - Vol. 30. - P. 565-596.

169. Structural and functional characterization of gene clusters directing non-ribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42 / A. Koumoutsi et al. // J. Bacteriol. 2004. -Vol. 186.-P. 1084-1096.

170. Structural and functional organization of fengycin synthetase multienzyme system from Bacillus subtilis b213 and Al/3 / S. Steller, et al. // Chemistry & Biology. 1999. - Vol. 6. - P. 31-41.

171. Sturz, A.V. The role of endophytic bacteria during seed piece decay and potato tuberization / A.V. Sturz // Plant Soil. 1995. - Vol. 175. - P. 257263.

172. Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli / A. Patrzykat et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46. - P. 605-614.

173. Surface-active properties of antifungal lipopeptides produced by Bacillus subtilis / L. Thimon et al. // J. Am. Oil Chem. Soc. 1992. - Vol. 69. - P. 92-93.

174. Synergistic interaction between cell wall degrading enzymes and membrane affecting compounds / M. Lorito et al. // Mol. Plant-Microbe Interact. -1996.-№9.-P. 206-213.

175. Tanaka, H. Glucanases and chitinases of Bacillus circulans WL-12 / H. Tanaka, T. Watanabe // J. Ind. Microbiol. 1995. - Vol. 14. - P. 478-483.

176. The genes degQ, pps, and lpa-8 (sfp) are responsible for conversion of Bacillus subtilis 168 to plipastatin production / K. Tsuge et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 2183-2192.

177. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis at the level of transglycosylation / H. Brotz et al. // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 246. -P. 193-199.

178. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonization of wheat roots / G.A. Turnbull et al. // FEMS Microbiol. Ecol. 2001. - Vol. 36. - P. 21-31.

179. The role of salicylic acid in induced systemic resistance elicited by plant growth-promoting rhizobacteria against blue mold of tobacco / S. Zhang et al. // BioControl. 2002. - Vol. 25. - P. 288-296.

180. Thomashow, L.S. Biological control of plant root pathogens / L.S. Thomashow // Curr. Opin. Biotechnol. 1996. - Vol. 7. - P. 343-347.

181. Three newly isolated plant-promoting bacilli facilitate the seedling growth of canola, Brasssica campestris / S. Ghosh et al. // Plant Physiol. Biochem. -2003.-Vol. 43.-P. 277-281.

182. Tsigarida, E. Bacterial synergism or antagonism in a gel cassette system / E. Tsigarida, I.S. Boziaris, G-J.E. Nychas // Appl. Environ. Microbiol. 2003. -Vol. 69, № 12. - P. 7204-7209.

183. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects / S. Compant et al. // Appl. Environ. Microbiol. -2005. Vol. 71, № 9. - P. 4951-4959.

184. Van Loon, L.C. Induced systemic resistance as a mechanism of disease suppression by rhizobacteria / L.C. Van Loon, P.A.H.M. Bakker // PGPR:

185. Biocontrol and Biofertilization / Z.A. Siddiqui. Springer, 2005. - Chapter 2. -P. 39-66.

186. Wang, Z. APD: the Antimicrobial Peptide Database / Z. Wang, G. Wang // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32. - P. 590-592.

187. Weaver, V.B. Burkholderia spp. alter Pseudomonas aeruginosa physiology through iron sequestration / V.B. Weaver, R. Kolter // J. Bacteriol. 2004. -Vol. 186.-P. 2376-2384.

188. Weller, D.M. Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria / D.M. Weiler // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. -Vol. 26.-P. 379-407.

189. Whipps, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere / J.M. Whipps // J. Exp. Bot. 2001. - Vol. 52. - P. 487-511.

190. Xylem residing bacteria in alfalfa roots / S. Gange et al. // Can. J. Microbiol. 1987. - № 33. - P. 996-1000.

191. Yim, G. The truth about antibiotics / G. Yim, H.H.M. Wang, J. Davies // Int. J. Med. Microbiol. 2006. - № 296. - P. 163-170.

Информация о работе

Лукьянцев, Михаил Александрович
кандидата биологических наук
Уфа, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Особенности биологической активности эндофитных штаммов Bacillus Subtilis Cohn с различной степенью антагонизма к фитопатогенным грибам - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы