Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. как агенты биологического контроля болезней растений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. как агенты биологического контроля болезней растений"

pro oa

1 8 ДЕК 7000

На правах рукописи

МЕЛЕНТЬЕВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

АЭРОБНЫЕ СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ РОДА BACILLUS Cohn. КАК АГЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.07 - микробиология • 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Казань - 2000

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН

Научные консультанты: доктор биологических наук,

профессор Безбородов A.M.

доктор биологических наук Веселов С.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лещинская И.Б.

доктор биологических наук Чернов В.М.

': доктор химических наук

Варламов В.П.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург.

Защита состоится " 7" " декабря 2000 г. в

"/•Г часов на заседании разового Диссертационного Совета ДР 053.29.39. при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан " 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук А.Н.Аскарова

/7 0/ '

'Q.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn, широко используются в микробиологической и медицинской промышленности как продуценты ферментных препаратов, антибиотиков и пробиотиков. В сельскохозяйственном производстве их применение ограничивалось лишь в качестве основы инсектицидных препаратов. В последнее время, в связи с насущной проблемой перехода к биологическому земледелию, интенсивно разрабатываются методы биологической защиты растений от болезней и соответствующие биопрепараты, призванные минимизировать применение химических пестицидов. Бактерии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бацилл-антагонистов. Однако, зачастую применение таких биопрепаратов оказывалась мало- или абсолютно неэффективным. Причина неудач в этих случаях кроется в недостаточной изученности жизнедеятельности почвенных бацилл при их взаимодействии с растениями и фитопатогенной микрофлорой. Бактерии рода Bacillus не относятся к типично ризосферным. Вместе с тем, при искусственной инокуляции посевного материала они способны длительное время развиваться и доминировать в прикорневой зоне растений, выдерживая конкуренцию со стороны аборигенной и фитопатогенной микрофлоры. На способность бактерий приживаться в ризосфере и осуществлять жизнедеятельность оказывают влияние как биогенные факторы так и условия внешней среды. Для успешного практического применения необходимо учитывать видовую специфичность используемого микроорганизма и влияние внешних факторов. Продукты жизнедеятельности бацилл могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на растения. Состав, как продуцируемых метаболитов, так и секретируемых ферментов, определяющих взаимоотношения интродуцированных бацилл с растениями и патогенной :.::::фофлорой, исследован крайне недостаточно. В частности, до сих пор отсутствуют какие либо сведения о способности бактерий рода Bacillus синтезировать вещества фитогормональной природы. Недостаточно исследованы воздействия антибиотических веществ, продуцируемых бациллами различной видовой принадлежности, на фитопатогенные грибы. Не установлена роль миколитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам. Решение этих проблем позволит ускорить внедрение, в практику биологических методов защиты растений от болезней и создание высокоэффективных биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена детальному изучению процессов взаимодействия с растениями и микрофлорой

интродуцированных бацилл в ризосфере, влиянию внешних условий на процессы приживаемости и жизнедеятельности, исследованию природы р о ст ст 11 м у л и р у ю [ц и к веществ, продуцируемых отдельными штаммами рода Bacillus и исследованию роли экстрацеллюлярных миколитических ферментов бацилл в проявлении их антагонизма к микромицетам. В соответствии с этим были определены следующие задачи:

- выделить из почвенных образцов, описать и идентифицировать изоляты бацилл-антагонистов, определить спектр и особенности антигрибного действия;

- изучить особенности колонизации зерновки и корешков прорастающих семян пшеницы бациллами-антагонистами и их влияния на ультрастру.иуру растительных клеток;

- »следовать динамику и распространение интродуцированных бацилл в ризосфере пшеницы в лабораторных ,и полевых условиях;

- исследовать влияние интродукции бацилл-антагонистов на микробиологические процессы в прикорневой зоне растений пшеницы;

- оценить полевую эффективность применения бацилл-антагонистов в подавлении развития грибных болезней злаков и влияние на продукционные процессы растений;

- изучить влияние интродукции бацилл на фитогормональный статус растений пшеницы и оценить способность природных изоля-тов к продукции рострегулирующих веществ;

- разработать методику выделения микробных цитокининов и установить их химическую природу;

- исследовать состав комплекса бациллярных миколитических ферментов и изучить влияние условий на их продукцию;

- выделить, очистить и охарактеризовать хитиназу Bacillus sp.1V) и выяснить роль этого фермента в проявлении антагонизма к грибам;

- разработать и произвести в промышленных условиях бактериальный препарат "Бациспецин БМ" для расширенных производственных испытаний.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния интродуцируемых в ризосферу растений бацилл-антагонистов на ультраструктуру клеток и продукционные процессы растений, на реакцию фнтопатогенных грибов и развитие аборигенной микрофлоры в прикорневой зоне. Установлено, что при предпосевной инокуляции клетки развивающихся бактерий проникают в колеоризу и выступают как слабые патогены. Антагонистическое действие бацилл в отношении микромицетов проявляется в нарушении процесса прорастания грибных спор и строения скелета формирующегося мицелия, образованием сферопластов на кончиках гиф с последующим их лизисом. Показано, что колонизация поверхности формирующихся корней проростков пшеницы

бациллами происходит путем образования микроколоний, прикрепленных к эпидермальпому слою материалом, подобным гликокаликсу. Характер заселения ризосферы растений зависит от видовой принадлежности бацилл и факторов внешней среды и, в первую очередь, от температурного режима почвы. Развитие внедренных в ризосферу бацилл не оказывает угнетающего воздействия на основные агрономически значимые группы аборигенной микрофлоры, одновременно с этим увеличивает фунгистатический потенциал прикорневой зоны почвы. Эффективное подавление корневых гнилей растений происходит на ранних этапах развития, для злаков, - до стадии начала цветения.

Впервые обнаружена способность бактерий рода Bacillus воздействовать на фито1 „рмональный статус растений и продуцировать р:..тигельные гормоны цитокининовой группы. Выдезена и охарактеризована новая форма цитокининов, представляющая собой комплекс зеатинрибозида с полисахаридами.

Исследован миколитический комплекс ферментов культуры Bacillus 5/7.739, включающий Р-1,3-глкжаназу, хитиназу и хитозаназу. Подтверждена белковая множественность форм хитиназ, синтезируемых представителями рода Bacillus и установлено, что по механизму действия фермент является экзо-хитиназой. Впервые для бацилл проведено подробное исследование роли хитиназы в проявлении антигрибной активности к некоторым фитопатогенным грибам. Показано отсутствие взаимосвязи между ли-тической активностью очищенной хитиназы Bacillus sp. 739 и ее способностью ингибировать ростовые процессы у фитопатогенных грибов.

Практическая значимость. Установлены закономерности развития интродуцированных бацилл в ризосфере растений. Выявлен механизм антагонистического действия бацилл в отношении микромицетов и положительное влияние бактеризации растений отобранными штаммами на продукционные процессы и снижение заболеваемости.

Предложен штамм Bacillus sp.739 в качестве основы биопрепарата "Бациспецин БМ" и продуцента хитиназы. Заявлен штамм B.subtilis ИБ-22 - продуцент цитокининов.

Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на II Симпозиуме стран членов СЭВ по микробным пестицидам (Протвино, 1990), Всесоюзной конференции "Микробиология в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), конференции "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991), IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пу-щино, 1992), П-й конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993), конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного ком-

плекса: экономика, эффективность, экологичность" (Санкт-Петербург, 1995), Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь, 1996), 5-ом международном симпозиуме "Root Demographics and Their Efficiencies in Sustainable Agriculture, Grasslands and Forest Ecosystems" (Клемсон, ЮК, США, 1996), Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998), Международной, конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 37 науч...лх публикациях, включая 3 патента и авторских свидетельств.

Объем и структура работы. Диссертационная работ? состоит ::з введения, обзора литературы, экспериментальной части (7 глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 287 страницах, содержит 48 рисунков и _56 таблиц. Список литературы включает 559 наименований, в т.ч. 367 иностранных публикаций

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактерии. Основным объектом исследований служили аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn., выделенные из образцов почв отобранных на территории Республики Башкортостан, а также культуры, полученные из Всесоюзной коллекции микроорганизмов. Идентификацию изолятов бацилл производили согласно руководству (Bergey's manual).

Мицелиальные грибы. В качестве тест-объектов использовали следующие куль туры фитопатолгенных грибов: - возбудители корневых гнилей Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Choem., Fusarium Lk:Fr.. из коллекций BKM, ВИЗР и местные изоляты; - возбудители ржавчинных болезней Puccinia striiformis West, P.graminis Pers, P.recóndita Rob. Ex Desm.. и мучнистой росы Erysiphe graminis DC из коллекции СКНИИФ г.Краснодар; -возбудитель серой гнили Botrytis cinerea Pers. - из коллекции ВИЗР; - местный изолят возбудителя твердой головни Tilletia caries (DC.) Tul.; - возбудитель альтернариоза злаков Alternaría alternata (Fr.) Keissl. из коллекции BKM.

Растительными объектами в вегетационных и полевых опытах служили: яровая пшеница сортов Саратовская 55, Безенчукская 139 и Жница; озимая пшеница сорта Безостая 1. В полевых опытах растения выращивали по принятой для зоны агротехнике, в лабораторных условиях - на свето-площадке с 16-часовым периодом освещения.

Микроскопические исследования проводили с помощью светового микроскопа CarlZeiss, Jena, и электронного - Hitchi Н-600 со сканирующей системой Н-6010. Работы по электронной микроскопии выполнены во ВНИИ фитопатологии РАСХН совместно с Ю.М.Морозовым.

Исследование численности популяции «[продуцированных бактерий-антагонистов проводили с использованием клонов спонтанных мутантов, устойчивых к стрептомицину и рифампицину. Учет численности отдельных групп почвенных бактерий и мицелиальных грибов проводили общепринятыми методами (Мишустин, 1956, Егоров,1976, Звягинцев, 1991).Фунгистатический потенциал почвы определяли по степени прорастания спор В. sorokiniana в мембранных камерах (Берестецкий, 1973). Не-симбиотяческую актуальную и потенциальную азотфиксацию и дыхание почвы определяли газохроматографическими методами (Садыков, Кас-пранский, 1987).

Определение фитогормонов. Содержание абсцизовой кислоты и аук-лнюв в надземной части растений пшеницы оправляли после экстракции 80% этанолом, согласно Е";елову (Ves^lov et al, 1992). Содержание цито-кининов 'определяли в водном остатке методом твердофазного иммуно-ферментного анализа (Кудоярова и др., 1990). Антитела к индивидуальным цитокининам были любезно предоставлены С.Ю.Веселовым. Тонкослойную хроматографию цитокининов проводили на силикагелевых пластинах "Merk" в системе бутапол: аммиак: вода (6 : 1 : 2). Разделенный материал элюировали 0,1 M фосфатным буфером рН7,4 и подвергали иммуноанали-зу. Иммуноаффинную очистку проводили на колонке с привитыми иммуноглобулинами к зеатинриЬозиду, последовательной промывкой 0,01 M фосфатным буфером, 0,5М NaCI, водой и элюцией 70%-иым этанолом. Разделение свободных и связанных цитокининов осуществляли путем гель-фильтрации на колонках с сефадексом G-25 и G-200 фосфатным буфером. Ссотестироь чир содержания цитокининов осуществляли согласно (Biddington & Thomas, 1973). Высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией проводили на колонке Superphase Rp Select ВС18 ("Merck") элюцией системой метанол : 0,1М ацетат аммония (35:65; об/об), скорость 0,8 мл/ мин. в режиме сканирования или мониторинга селективного иона на масс-спектрометре (220- селективный диагностический ион для зеатина; 225- для дейтерированных стандартов зеатина и его производных).

Исследование ферментов миколитического комплекса. Хитиназную активное— измеряли по образованию редуцирующих Сахаров в реакционной смеси, включавшей 1 мл раствора фермента в фосфатно-цитратном буфере (50 мМ, pH 5.0) и 0.5 мл 1%-ной суспензии коллоидного хитина. Смесь инкубировали в течение часа при 55"С. Концентрацию редуцирующих Сахаров оценивали спектрофотометрически с феррицианидным реагентом (Синицин и др., 1993). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ N-ацетил-О-глюкозамина в мл в минуту при описанных условиях. Хитозаназную активность измеряли тем же методом, используя в качестве субстрата 1%-ную суспензию коллоидного хитозана. За единицу активности хитозаназы принимали количество фермента, образующее 1 мкМ D-глюкозамина на мл в минуту при описанных условиях. Ламинариназную (ß-1,3-

глюканазную) активность определяли аналогично, используя.в качестве субстрата ламинарии. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ D-глюкозы на мл в мин при описанных условиях.

Реактивы. В работе использовали отечественные реактивы марки х.ч. и ч.д.а., сорбенты фирм "Pharmacia" и "Bio-Rad", хромогенные реактивы -пара-нитрофенильныё производные N-ацетил-О-глюкозамина, N,N'-диацетил-р-и-хитобиозы и Ы,М',Ы"-триацетил-р-0-хитотриозы ("Sigma"), стандарты фитогормонов ("Sigma"), препараты альбуминов (Serva).

Статистическую обработку результатов выполняли по стандартным компьютерным программам. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента на 5% уровне знг .лмости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 .Скрининг природных бактерий рода BACILLUS Cohn - антагонистов фитопатогенов и спектр их антигрибной активности

Наибольшую сложность в разработке микробиологических средств защиты растений представляет поиск активной культуры антагониста -биологической основы создаваемого препарата. Безусловно, что для обеспечения экологической безопасности разрабатываемых препаратов им может быть только природный, генетически не трансформированный штамм. По этой причине вопросу скрининга должно уделяться первостепенное значение. Первичный отбор изолятов бацилл проводили из почвенных образцов, отобранных на территории Республики Башкортостан. Отобранные изоляты были подвергнуты тесту на способность ингибировать развитие грибов рода Fusarium, входящих в состав фитопатогенного комплекса грибов - возбудителей корневых гнилей и других, болезней растений. Полученные результаты (табл. 1.) свидетельствовали о том, что действие бацилл избирательно и специфически проявляется по отношению к определенным видам грибов. Не обнаружено изолята, который подавлял бы одновременно развитие всех 11 испытанных видов. Наибольшее число изолятов проявило антагонизм к F.avenaceum, F.sambucinum, F.gibbosum и F.semitectum. Меньше всего антагонистов обнаружено к F.culmorum, F.graminearum, F.sporoírichiella. Последние три вида подавлялись только изолятами, обладающими достаточно широким спектром действия. Такое разнообразие действия бацилл-антагонистов указывает на принципиальную возможность выделения таких культур, которые, подавляя развитие фитопатоген-ных почвенных грибов, не оказывали бы отрицательного воздействия на полезную для растений микрофлору.

Обнаруженное разнообразие действия изолятов бацилл-антагонистов вероятно связано с их таксономической принадлежностью. В связи с этим нами была проведена их идентификация. Большая часть изолятов принадлежала к видам B.subtilis (73,8%) и B.polymyxa (21,5 %). Остальные, по со-

вокупности признаков, представляли собой виды с неопределенным таксономическим положением.

Таблица 1.

Характеристика изолятов бацилл по их действию на виды рода Fusarium

Шифр изолята Тест организм

F.avena-ceum F.culmorum F.gibbosum F.gramine-arum F.monili-forme F.nivale F.oxyspo-rum F.sambu-cinum F.semitec-lum F.solani F.sporot-richiella

ЕМ-1 - - + - - - - - - - -

ЕМ-13 - - - - - - - + - - -

813 - - - - - - - - + - -

БМ-3 - - + - - - - - + - -

ЕМ-11 + - + - - - - - - - -

ЕМ-17 - - + - - - - + - - -

262 + + -t- - - - - - - - -

815 + - - - - - - - + - -

ЕМ-8 + - - - - - - + - - -

ЕМ-15 + - - - - - + - - - -

828/2 + - - - - - - + - - -

834 + + - - - - - - + - -

ЕМ-14 + - + - - - - + - - -

739/1 + - + - - - - + - + -

ЕМ-21 + - - - - - - + + + -

780 + - + - - + - + - - - -

851 + - - - - - - + + - +

822/3 + - - - - - + + + - -

807 + - + - - - + + + - -

815/3 + - + - - - - + + + -

832/3 - - + - + - - + + + -

669 + - + - - - - + + + -

222 + - + - - + + - + + -

283 + - + - + - + + + -

805 + - + - - + + + + + -

ЕМ-22 + - + + - - + + +- + +

250 + - + - + + - + + + '

ЕМ-9 + - + - + + + ■ + - +

ЕМ-10 4- - + - + + + + + + -

6/2 + - + - + + + + + + +

ЕМ-4 + - +■ + + + + + + + +

822 + + -ь + + - + + + + +

817 + + + + + ' + + + + -

ЕМ-8 + - + + + + + + + + +

ЕМ-16 + - + + + + + + + + +

Примечание:. (+) - подавляют развитие гриба; (-) - не оказывают влияние на развитие гриба.

Антагонизм бацилл в отношении микроскопических грибов связывают в основном с действием ферментов, лизирующих клеточные стенки грибов, и антибиотических веществ. Мы изучали характер действия метаболитов, выделяемых в среду бактериями-антагонистами двух доминирующих видог: В. subtilis и В. polymyxa на процесс прорастания спор и развитие мицелия грибов, возбудителей обыкновенной корневой гнили злаков. Для изучения воздействия нелетальных доз метаболитов бацилл на процесс прорастания конидий и морфогенез изучаемых грибов мы создавали в агаре зоны с радиальным градиентом концентраций. Бациллы выращивали сплошным газоном на поверхности капроновой мембраны (размер пор 0,2 мкм), помещенной на питательный агар. После трех суток инкубации при 32"С мембрану с биомассой бацилл удаляли, вырезали а> лро-вые блоки и помещали на свежий питательный агар, предварительно засеянный конидиями тестируемых грибов. Наблюдение за процессом прорастания грибных пропагул и конидий вели с помощью светового микроскопа, просматривая по 50-60 спор в каждом образце. Через 22 ч экспозиции четко проявился эффект градиента концентраций. В середине пятна антибиотиков B.svhtilis (место наложения блока) прорастания спор всех испытуемых грибов не происходило, а ближе к периферии из проросших спор формировался мицелий с морфологическими уродствами, проявившимися в образовании сферопластов на кончиках ростовых трубок (рис.1 Б) и растущих гиф (рис.2Б). Вне зоны диффузии антибиотика мицелий был хорошо развит и имел типичный для конкретной культуры вид (рис.1 А,2А). По другому проявилось действие антибиотических веществ В.polymyxa. Образования сферопластов в зоне метаболитов этого штамма нами не выявлено, но обнаружено нарушение морфогенеза грибов, проявившееся в резком увеличении степени ветвления мицелия как у B.sorokiniana (рис.1 В), так и у исследованных представителей рода Fusarium (рис.2В).

Таким образом, воздействие метаболитов бактерий группы В.subtilis на фитопатогенные мнцелиальные грибы характеризуется образованием сферопластов на кончиках растущих гиф, а группы B.polymyxa - нарушением строения скелета формирующегося мицелия. Описанные отличия обусловлены, вероятнее всего, природой и механизмом физиологического действия продуцируемых представителями этих групп антибиотических веществ.

2. Приживаемость и распространение интродуцированных штаммов в корневой системе проростков яровой пшеницы

Бактерии-антагонисты рода Bacillus, в целом, считаются перспективными для создания на их основе биопрепаратов и внедрения их в практику растениеводства. Однако, для их эффективного использования необходимо получить сведения о способности бацилл-антагонистов приживаться в ризосфере, колонизировать поверхность корня, взаимодействовать с тканями и клетками прорастающего семени.

б

Рис.1. Прорастание конидий В.зогоктапа: а - кон троль; б - метаболиты В.хиЬйИ$\ в -' метаболиты В.ро1утуха.

Рис.2. Формирование мицелия Р.агепасеит: а -кон троль; б - в присутствии метаболитов В.тЬИШ', в -в присутствии метаболитов В.ро1утуха

2.1. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия бацилл-антагонистов с поверхностными структурами и тканями семени пшеницы

Целью данного этапа работы было изучение особенностей заселения семени и формирующихся корней проростков при бактеризации семян и исследование анатомических и ультраструктурных изменений клеток прорастающего семени. Для этой цели из нашей коллекции бацилл-антагонистов были выбраны культуры различной видовой принадлежности, а именно Bacillus sp.739, B.subtilis ИБ-15 и B.polymyxa ИБ-37. Исходная плотность инокулята в этих исследованиях составила: B.subtilis ИБ-15 -2,6 106, B.polymyxa ИБ-37 - 8,9 104, Bacillus sp.739 - 4,3 106 КОЕ/зерно. Зерновки, обработанные культурами B.subtilis ИБ-15 и B.polymyxa ИБ-37, прорастали без видимых отличий от контрольных. Длина корней через 3 суток после помещения во влажную камеру составляла 3-4 см. В то же время, зерновки, обработанные бактериями Bacillus sp.739, формировали корни заметно меньшей длины (1-2 см).

На поверхности прорастающих зёрен и у основания формирующихся корней при сканирующей электронной микроскопии обнаружились скопления глобулярных образований разных размеров: от 1 до 40 мкм в диаметре (рис. 3.). С помощью просвечивающей электронной микроскопии было установлено, что эти глобулярные образования представляют собой микроколонии бактерий или единичные бактерии, окруженные чехлами. Материал чехлов на срезах выглядел слоистым, располагался концентрически вокруг бактериальных клеток и микроколоний (рис. 4а).

Рис.3. Микроколонии B.subtilis ИБ-15 на поверхности колеоризы и . корня пшеницы. Сканирующая электронная микроскопия.

-* % rr \ « *,

v „-,

ЧУ»

ь > ' Г, *

uV.W*

w

■ sm-

: - .'• «ли •

!.»МЦ

A э fc-^lbu

1ШЛ.....

^ \ ' - K.C —

Э 7 \

'Ш f

л' .1* ¿S.i / -Jjgi

i f л

Рис.4. Микроколонии B.subtilis ИБ-15 на поверхности корней пшеницы. Просвечивающая электронная микроскопия, а - микроколонии бактерий и некротизированные клетки эпидермы и экзодермы корня, б - микроколония бактерий и скопление муцилажа на поверхности корня. Кс -клеточная стенка, мк - микроколония бактерий, мц - муцилаж, п - плазма-лемма, э - клетки эпидермы, эк - клетка экзодермы.

По морфологическим признакам материал чехлов был схож с бактериальным гликокаликсом - отложением полисахаридов и гликопротеинов снаружи клеточной стенки (Costerton et al., 1981). Известно, что бактериальные чехлы играют существенную роль в адгезии дочерних клеток, в прикреплении микроколоний к субстрату, в защите бактерий от неблагоприятных факторов (Costerton et al., 1981; Foster et al., 1983).

Исследование срезов прорастающих семян пшеницы под световым и электронным микроскопом показало, что развивающиеся бактерии присутствовали в колеоризе, в утолщенной части семенной кожуры и в некоторых клетках щитка. Мы не обнаружили бактерий в крахмалистом эндосперме и в клетках алейронового слоя. Бактерии заселяли и лизировали клетки зародыша, поскольку фронт распространения некроза наблюдался впереди распространяющихся бактерий. В контрольных образцах некроза клеток или патологических изменений ультраструктуры мы не наблюдали.

Бактерии, развивающиеся в колеоризе и в пространстве между коле-оризой и корнем, находились, вместе с тем, в непосредственной близости

от щитка и, очевидно, могли отрицательно сказываться на его функциях. На это указывает обнаруженный нами в некоторых образцах некроз части клеток вблизи узла щитка (рис.5).

Рис. 5. Некроз клеток первичной коры корня при воздействии бактерий Bacillus sp.739. б - бактерии, нпк - некротизированная клетка первичной коры, пк - живая клетка первичной коры.

Клетки в центральной части узла щитка и удаленные от бактерий слои клеток щитка оставались живыми, но их ультраструктура претерпевала ряд патологических изменений: в центральных вакуолях и вновь образующихся вакуолях с разветвленной поверхностью накапливались элек-троноплотные отложения, строма митохондрий просветлялась, в пластидах исчезали крахмальные зерна и формировались крупные пластоглобулы и перефирический ретикулум.

При прорастании семян, обработанных бациллами, утолщенная часть семенной кожуры активно заселялась бактериями (рис.6а). При этом происходил почти полный лизис клеточных стенок (рис.66). Бактерии, развивающиеся в семенной кожуре, обычно были свободны от чехлов или чехлы имели измененную структуру (рис.66, 6в).

На основании выше изложенного можно предположить, что причиной ослабления роста корней в случае применения культуры Bacillus s/7.739 могли являться патологические изменения клеток щитка, вызывающие нарушение транспорта питательных веществ от эндосперма к зародышу. Вопрос, насколько часто подобные явления могут наблюдаться при бактеризации семян бациллами-антагонистами, должен явиться предметом дальнейших исследований.

Рис. 6. Утолщенная часть семенной кожуры и заселяющие ее бактерии B.polymyxa ИБ-37 (а), бактерии и полуразрушенные клеточные стенки семенной кожуры (б), микроколония бактерий с измененным чехлом (в), ас - клетки алейронового слоя, кс - клеточная стенка, мк - микроколония бактерий.

Таким образом, исследованные нами бактерии B.subtilis ИБ-15, B.polymyxa ИБ-37 и Bacillus лр.739 при взаимодействии с прорастающими семенами и образующимися корнями пшеницы в стерильных условиях выступали как слабые патогены. Очевидно, ущерб, причиняемый бактериями проросткам в этих условиях невелик, из-за отсутствия системного заселения тканей, а также заселения эндосперма и алейронового слоя.

2.2. Динамика численности и распространение бацилл-антагонистов в корневой системе проростков пшеницы

Очень важную информацию могут дать сведения о способности бацилл-антагонистов к распространению вдоль корней растущего растения. В настоящее время этот вопрос остается мало изученным, и одной из задач настоящей работы было сравнительное изучение динамики распространения бацилл-антагонистов по корневой системе пшеницы при их интродукции путем бактеризации семян. Для детального исследования были взяты бактерии различной видовой принадлежности: B.subtilis ИБ-15, B.polymyxa ИБ-37 и Bacillus sp.739, маркированные по устойчивости к антибиотикам.

Распределение исследуемых штаммов бацилл-антагонистов по отдельным фрагментам корневой системы 30 суточных проростков пшеницы в условиях вегетационного опыта представлено на рисунке 7.

ш 6

о

V5

' О, <N

'Ö .

. rs V

ON 45

OB subtilis ИБ-15 □ В polymyxa ИБ-37 D Bacillus sp.739

, Оч СЧ

4>

irT

не обнаружена

Фрагмент крневой системы

Рис.7. Численность бацилл по длине корня пшеницы. Фрагмент основания корня I; средняя часть корня И; апикальный фрагмент III. р=0,95.

ш

II

Как следует из представленных данных, бактерии B.subtilis ИБ-15 и B.polymyxa ИБ-37 распространялись по всей длине корня растений, но плотность популяций интродуцированных бактерий в основании корня была примерно в 5 раз выше, чем на апикальном фрагменте. Анализ физиологического состояния показал, что клетки B.subtilis ИБ-15 по всей длине корня находились в споровом состоянии, тогда как клетки B.polymyxa ИБ-37 на апикальном фрагменте присутствовали лишь в вегетативной форме. В отличие от этих двух культур, Bacillus sp.739 обнаруживался только на более старых по возрасту частях корня проростков и не высевался с апикальных фрагментов.

Полученные данные подтверждают в целом наблюдения других авторов, что численность микрофлоры ризопланы экспоненциально снижается от основания корня к его кончику (van Vurde, Schippers, 1980; Olsson et al., 1987). Активно растущие части корня, как правило, почти свободны от микроорганизмов. Вместе с тем, характер распространения интродуци-

рованнных клеток бацилл-антагонистов вдоль корней оказался штаммо-специфичным. Очевидно, что клетки Bacillus sp.739 менее подвижны и, скорее всего, пассивно переносятся вдоль развивающихся корней.

Эффективность действия бактерий-антагонистов при интродукции зависит и от их способности колонизировать ризосферу растений в меняющихся температурно-влажностных условиях, и способности преодолевать конкурентное давление со стороны аборигенной микрофлоры почвы. В серии экспериментов мы исследовали влияние этих факторов на динамику заселения корневой системы.

Изучение динамики численности бацилл в ризосфере пшеницы в условиях инфицированной почвы проводили в лабораторных вегетационных опытах. Для создания инфекционного фона использовали гриб B.sorokiniana, преобладающий в патогенном комплексе возбудителей корневых гнилей. Для более четкого выявления различий был создан заведомо высокий инфекционный фон-3,3 103 пропагул на 1 гпочвы.

8 7

а 6 2 5 Н1 4

ё з

О § 2

о

о 1 5

X О

Рис.8. Динамика численности штаммов бацилл в ризосфере пшеницы в почвах с В.яогоЫтапа и свободных от патогена.

B.subtilis ИБ-15

I ^контроль

ттттттт/

6 10 18 22

Время, сутки

а 6

8з

3

¡2 U

О

B.polymyxa ИБ-37

6„ 10 16 Время, сутки

Bacillus sp.739

А

fri-if

6 10 16 Время, сутки

Динамика численности популяции интродуцированных бацилл-антагонистов в присутствии фитопатогена носит индивидуальный характер (рис.8). Так для штамма B.subtilis ИБ-15 численность клеток в ризосфере-растений, выращиваемых в инфицированной почве, оказалась на два порядка ниже, чем в ризосфере контрольных растений (1,2-2,6 105 против 1,42,9 107 КОЕ/г). Численность B.polymyxa ИБ-37 в ризосфере пшеницы в варианте с патогеном, наоборот, достоверно выше, чем в варианте с неинфи-пированной почвой. Наличие инфекционного начала в почве не сказалось на колонизирующей активности антагониста Bacillus sp.139.

При изучении влияния температуры были заданы температурные режимы почвы, характеризующиеся для пшеницы как низкий, оптимальный и высокий на фоне полной влагообеспеченности.

й

I Ч

х

£3 #2

ВасШиг виЫШз ИБ-15 (а)

г^Г

| П13оС

□ 21 ОС

□ 30 ОС

ю 1в

Время, Сутки

ВасШиэ ро!утуха ИБ-37 (б)

ё6

X

о>5

А

О

13 с

X 2

1

□ 13 ос

□ 21 ОС

□ 30 оС

ВасШив ер. 739 (в)

53

X

у 2

1

а 13 ос

□ 21 ос

□ зо ос

№

10 16 Время, сутки

10 16 Время, сутки

ВасШиэ эиЫШв ИБ-15 (г)

5 ' §е

г

14 с

* з

и X

3" 2

оз7%пв □ 67 % П8

а юо % пв

13

Время, сутки

ВасШиэ ро!утуха ИБ-37 (д)

а7 Зе

¡4 г

¡3 х =" 2

1

0

□ 37 % ПВ 067 % ПВ

□ 100 % ПВ

ВасШиз ер. 739 (ж)

13

Время, сутки

Чиа

19 1 К 3

О

Е/2 1 О

о 37 % пв

□ 67 % ПВ

6 „ 13 22

Время, сутки

Рис.9 Динамика численности исследуемых штаммов бацилл в ризосфере пшеницы при различных температурных (а, б, в) и влажностных (г, д, ж) режимах выращивания растений. Примечание: нд - нет данных.

9

Анализ численности популяций интродуцированных бацилл показал, что для B.subtilis ИБ-15 существует прямая зависимость плотности популяции от температуры почвы (рис.9а). Анал1гё плотности клеток B.polymyxa ИБ-37 в ризосфере пшеницы, выращиваемой при различных температурных режимах, не выявил достоверных различий между вариантами (рис.9б). Очевидно, численность этого штамма в ризосфере предопределена его физиологическими особенностями и влияние температуры, в исследованном диапозоне, минимально. Существенных различий в численности Bacillus sp.739 в ризосфере растений пшеницы, выращиваемой в почве с температурой 13°С или 21°С, мы не обнаружили. Однако, при повышении температуры почвы до 29,5°С численность клеток Bacillus sp.739 достоверно увеличивалась, как минимум, на порядок. Таким образом, с повышением температуры численность интродуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере возрастает, однако реакция на изменение температуры зависит от видовой принадлежности штамма.

При исследовании влияния влажности почвы на динамику численности бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы были смоделированы режимы недостаточного влагообеспечения растений (37% ПВ), нормального (67% ПВ) и переувлажнения (100% ПВ). Анализ плотности популяции B.subtilis ИБ-15 (рис.9г) показал, что как при недостаточном влагообеспечения, так и при нормальном, численность этого штамма в ризосфере пшеницы поддерживалась на очень высоком уровне - порядка 107 КОЕ/г и практически не изменялась на протяжении всего эксперимента. При переувлажнении почвы наблюдалось непрерывное, на протяжении всего эксперимента, увеличение численности клеток, вероятно потому, что в этих условиях развитие популяции не лимитировалось корневыми эксудатами, а осуществлялось за счет потребления органики из почвенного раствора. То же и для культуры B.polymyxa ИБ-37. Нами не было обнаружено существенных отличий в динамике и уровне численности популяции при недостаточном и благоприятном влагообеспечении почвы (рис.9д). Аналогичная картина наблюдалась и с культурой Bacillus sp.739 (рис.9ж), но в этом случае при недостатке почвенной влаги численность культуры, как правило, была даже несколько выше, чем при оптимальном увлажнении.

Таким образом, исследованные штаммы бацилл оказались способными колонизировать ризосферу пшеницы не только при оптимальном, но и при недостаточном влагообеспечении почвы.

3. Влияние интродукции бацилл-антагонистов в ризосферу пшеницы на микробиологические процессы в прикорневой зоне

Интродукция микроорганизмов-антагонистов в корневую систему растений, оказывает существенное влияние на микрофлору прикорневой зоны (Bagnoli, Filippi, 1985; Vrany et al., 1990). Привнесение в ризосферу несвойственной микрофлоры может отрицательно отразиться на развитии микробиологических процессов в прикорневой зоне и, в конечном счете,

на продуктивности сельскохозяйственных растений. Поэтому при разработке микробиологических препаратов, предназначенных для предпосевной обработки семян необходимо учитывать их влияние на биологическую активность ризосферной микрофлоры. С этой целью нами были проведены серии лабораторных и микроделяночных полевых экспериментов, в которых изучалось влияние бактеризации семян пшеницы бациллами-антагонистами как на биологическую активность ризосферной микрофлоры в целом, так и на отдельные группы почвообитающих микроорганизмов.

В мелкоделяночных полевых опытах на выщелоченном черноземе были проведены исследования состава микрофлоры и ее биологической активности в прикорневой зоне яровой пшеницы, обработанной исследуемыми бактериями. Семена высевали на делянки, предварительно инфицированные внесением в почву смеси местных изолятов фитопатогенных грибов: В. яогокШапа, Р. '¿¡ЬЬо.тт, Р. охуярогит.

Как следует из полученных данных, наибольшие отличия по численности ризосферной микрофлоры между вариантами опытов наблюдаются в период интенсивного развития растений пшеницы, а именно в фазу кущения (рис.10). Результаты определения интенсивности дыхания и нитроге-назной активности почвы прикорневой зоны, в этот период, представлены в табл.2.

Таблица 2.

Интенсивность дыхания почвы и потенциальной фиксации азота в

ризосфере яровой пшеницы

Вариант, доза (кг/т) Интенсивность выделения CCK мг/кг ч Нитрогеназная активность, мкг Иг/кг ч

без глюкозы с глюкозой

Контроль 6,4 101 794

ТМТД, 1,5 7,0 107 974

Bacillus sp.739, 5,0 5,2 100 1059

Bacillus sp.739, 10,0 8,9 107 889

B.subtilis, 5,0 5,6 105 742

B.subtilis, 10,0 5,4 114 884

B.polymyxa, 5,0 5,7 102 1121

B.polymyxa,10,0 6,8 127 1390

Интенсивность актуального (без внесения глюкозы) и потенциального (с внесением глюкозы) выделения ССЬ из почвы ризосферы возрастала в вариантах с обработкой семян штаммами B.polymyxa ИБ-37 и Bacillus sp.139 в максимальных дозах. Высокий уровень нитрогеназной активности отмечен в вариантах с обработкой семян этими же культурами. Возможно, это связано с физиологическими особенностями использованных штаммов, поскольку азотфиксирующая активность описана для видов B.polymyxa (Смирнов и др., 1982), а для Bacillus 5/5.739 была определена нами экспериментально.

Всходы Кущение Уборка

Фазы развития

Рис.10. Численность гетеротрофных микроорганизмов (а), микроскопических грибов (б) и спорообразующих бактерий (в) в прикорневой зоне пшеницы при различных вариантах бактеризации семян. А - доза 5 кг/т; В 10 кг/т.

Определение фунгистатического потенциала в фазу колошения пшеницы показало, что степень подавления прорастания конидий B.sorokiniana в прикорневой зоне растений, обработанных препаратами культур B.subtilis ИБ-15, В. polymyxa ИБ-37 и Bacillus sp.139 существенно выше, чем у контрольных растений или обработанных ТМТД (рис.11).

Рис.11. Фунгистатический потенциал почвы прикорневой зоны пшеницы, инокулированной различными культурами бацилл-антагонистов. 1 -контроль, 2 - протравлены ТМТД, 3 - Bacillus sp.739 (Бациспецин БМ), 4 -В.polymyxa ИБ-37, 5 - B.subtilis ИБ-15.

На основании данных об интенсивности актуального и потенциального дыхания, уровне азотфиксации и супрессивности почвы в прикорневой зоне растений, обработанных биопрепаратами, можно заключить, что исследуемые штаммы бацилл-антагонистов не оказывают негативного воздействия на микробиологические процессы в ризосфере.

4. Эффективность применения бацилл-антагонистов для защиты растений от болезней

4.1. Эффективность применения "Бациспецина БМ" на озимой пшенице против аэрогенных инфекций

Наиболее вредоносными аэрогенными инфекциями злаков являются возбудители желтой ржавчины Puccinia striiformis West, стеблевой -P.graminis Pers, бурой - P.recondita Rob. Ex Desm. и мучнистой росы Erysiphe graminis DC. В связи с этим, представляло интерес выявить возможность подавления развития болезней злаков с помощью отобранных нами бацилл-антагонистов. Определить антагонистическое действие бацилл по отношению к данной группе грибов in vitro не представлялось

возможным, поскольку физиологически они являются облигатными паразитами и практически не культивируются на искусственных питательных средах. Испытания проводили на базе СКНИИФ (в настоящее время ВНИИ биологических средств защиты растений, г.Краснодар) в теплице на всходах озимой пшеницы сорта Безостая 1 при условиях, оптимальных для развития растений и фитопатогенов.Эффективность действия определяли учетом количества проявившихся пустул на 1 см2 листовой поверхности. В каждом варианте учитывали 40 растений. Контролем служили необработанные инфицированные растения.

Эффективность предпосевной обработки семян против аэрогенной инфекции была определена по развитию бурой ржавчины (возбудитель Р. recóndita).

Таблица 3.

Влияние обработки семян пшеницы биопрепаратами ___на развитие бурой ржавчины_

Вариант обработки Концентрация, кл/мл Количество проявившихся пустул, % Снижение проявляемое™ болезни, %

Контроль - 100 -

Бациспецин БМ 1,8x10' 43,5 56,5

0,4x109 62,3 37,7

0,4х108 78,3 21,7

Bacillus sp.139 0,8x10' 84,1 15,9

0,4x10' 84,9 15,1

0,2х107 97,1 2,9

B.subtilis ИБ-15 1,9x10х 23,1 76,9

0,95x10" 23,1 76,9

0,46х108 26,1 73,9

Наибольшую устойчивость проявили растения, выращенные из семян, обработанных отмытыми клетками культуры В. subtilis ИБ-15 - снижение проявления пустул патогена более 70% (табл.3). При обработке семян биопрепаратом «Бациспецин» с концентрацией 1,8 х 10ч КОЕ/мл, про-являемость пустул снизилась в 2 раза по сравнению с контролем. В то же время, обработка отмытыми клетками Bacillus sp.139 привела к снижению проявления пустул не более чем на 15%. Сам факт снижения проявления аэрогенной инфекции, в результате предпосевной бактеризации семян, свидетельствует о существовании неких механизмов индукции устойчивости растений, поскольку в этих условиях непосредственный контакт антагониста с фитопатогеном исключен. Ранее были описаны случаи подавления развития ржавчины на листьях лука (возбудитель Р. allii Rud) при обработке растений В. cereus (Doherty & Preece, 1978). Однако, снижение развития ржавчины при обработке семян обнаружено нами впервые.

При профилактической обработке растений пшеницы, за сутки до заражения, также установлено значительное снижение проявления болезни (табл.4). Опрыскивание растений препаратом "Бациспецин БМ" привело к снижению проявления бурой ржавчины на 47,2 - 73,9%%, стеблевой ржав-

Таблица 4.

Влияние профилактической обработки растений биопрепаратами на развитие болезней пшеницы

Вариант обработки Концентрация, кл/мл Бурая ржавчина Стеблевая ржавчина Желтая ржавчина Мучнистая роса

Количество пустул,% Снижение проявляемо сти болезни, % Количество пустул, % Снижение проявляемо сти болезни, % Количество пустул, % Снижение ! Количество проявляемо | пустул, % сти 1 болезни, % | Снижение проявляем ости болезни, %

Контроль - 100 . 0 100 0 ' 100 0 100 0

Бациспецин БМ 1,810" 26,1 73,9 27,8 72,2 0 100 31,3 68,7

0,410" 52,8 47,2 32,7 67,3 0 100 37,5 62,5

0,4 108 65,7 34,3 55,7 44,3 68,4 31,6 84,3 15,7

Контроль - 100 0 100 0 100 0 100 0

Bacillus sp. 739 0,8 107 76,1 23,9 45,9 54,1 14,1 85,9 70,3 29,7

0,4107 77,2 22,8 59,0 ' 41,0 40,0 60,0 73,4 26,6

0,2 107 78,1 21,9 100 0 43,5 56,5 78,1 21,9

Контроль - 100 0 100 0 100 0 100 о

B.subtilis ИБ-15 1,9 108 51,8 48,2 57,8 42,2 0 100 62,0 38,0

0,95 108 92,9 17,1 75,0 25,0 36,4 63,6 72,0 28,0

0,46 108 98,4 1,6 89,1 10,9 97,7 2,3 93,0 7,0

чины на 67,3 - 72,2%% и полному подавлению проявления желтой ржавчины. Развитие мучнистой росы в результате профилактической обработки этим же препаратом снизилось на 62,5 - 68,7%%. В то же время, применение для обработки растений отмытых клеток Bacillus sp.739, биологического начала препарата "Бациспецин БМ", оказалось менее эффективным (табл.4). Максимальный уровень снижения проявления бурой ржавчины и мучнистой росы при обработке клетками B.subtilis ИБ-15 составил 48,2 и 38,0%% соответственно. Следует отметить высокую эффективность применения клеток исследуемых культур бацилл-антагонистов в отношении возбудителя желтой ржавчины Puccinia striiformis - максимальное подавление его развития культурой Bacillus sp.739 достигало 85,9%, а культурой В. subtilis ИБ-15 - 100%.

Результаты оценки искореняющего действия препарата «Бациспецин» и культур антагонистов показали, что такая обработка растений менее эффективна, чем профилактическая. Применение Бациспецина снизило проявление болезней от 40,0 до 61,4%%, а использование клеток Bacillus sp.739 вообще не оказывало заметного влияния.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали возможность использования бацилл-антагонистов в защите пшеницы от таких распространенных аэрогенных инфекций, как желтая, стеблевая и бурая ржавчины, мучнистая роса. Одновременно показано, что для Bacillus sp.739 препаративная форма предпочтительнее, вероятно, потому что в ней содержатся активные метаболиты. Важное значение для понимания механизмов биологического воздействия на растения бацилл-антагонистов имеет обнаруженный феномен снижения развития аэрогенных инфекций при бактеризации семян.

4.2. Эффективность бацилл-антагонистов в отношении твердой головни пшеницы

К наиболее вредоносным болезням пшеницы относится твердая головня, возбудитель Tilletia caries (DC.) Tul., потери от которой приводят к недобору 10 -15% урожая. Инфекция передается через посевной материал, заражающийся при контакте с телиоспорами, сохраняющимися в пораженном зерне. Поэтому представляло интерес исследовать влияние бактеризации семян бациллами-антагонистами на развитие твердой головни пшеницы. Семена яровой пшеницы сорта Жница предварительно инфицировали телиоспорами местной популяции Tilletia caries (DC.) Tul. и обрабатывали культурами соответствующих бактерий с добавкой Na-КМЦ в качестве прилипателя. Начальная плотность инокулюма колебалась от 2 х 104 до 2 х 10 КОЕ/семя, в зависимости от штамма бактерий. Полевые микроделя-ночные испытания проводили в двух разных агроклиматических зонах Башкирии - Дуванском (Северо-восток Республики) и Уфимском (Центральный регион) районах. Результаты представлены в таблице 5. Как следует из представленных данных, во всех вариантах обработки семян про-

изошло снижение распространения болезни. Следует отметить высокую эффективность препарата на основе штамма Bacillus sp.739.

Таблица 5.

Влияние предпосевной бактеризации семян яровой пшеницы сорта Жница на проявление твердой голвни

Вариант Доза Дуванский р-н

обработки инокулюма, Кол-во пора- Количество Проявле-ние

кл/зерно женых колось- здоровых ко- болезни, %

ев, шт. лосьев, шт.

Контроль - 17 91 15,5

Bacillus sp.739 2,1x104 1 77 1,3

B.polymyxa ИБ-37 2,3х104 3 91 3,3

B.subtilis ИБ-37 1,9x106 3 97 зд

Таким образом, предпосевная бактеризация бациллами-антагонистами способна снизить проявление твердой головни пшеницы при исходной инфицированности семян.

4.3. Эффективность подавления корневых гнилей яровой пшеницы

Испытания в условиях полевых микроделяночных опытов были проведены в сезоны 1989-1993 гг. и 1996 г. Вегетационные периоды значительно различались по климатическим условиям. В наиболее благоприятном для развития яровой пшеницы 1990 г. отмечался самый низкий за период испытаний уровень распространения (36,8%) и развития корневых гнилей (9,7%). В условиях 1991, 1993 и 1996 годов проявление корневых гнилей было очень высоким, распространение и развитие болезни на яровой пшенице составило 71,7-75,0% и 24,2-27,3% соответственно. В очень холодном и слабо засушливом 1992 году так же наблюдалось значительное развитие корневых гнилей - 57,0%.

В этих опытах ставилась задача изучить влияние доз биопрепаратов, продуктов метаболизма культур антагонистов на эффективность подавления болезни и отдельные элементы структуры урожая в агроклиматических условий, складывающихся в различные полевые сезоны. Кроме того изучали возможность совмещения биопрепаратов с химическими протравителями. Результаты 4-х летних исследований суммированы в табл. 6-8.

В целом, результаты полевых исследований достоверно свидетельствуют о снижении развития болезни в раннем периоде вегетации растений (выход в трубку). Ко времени уборки урожая эффект действия бацилл-антагонистов снижается и различия между вариантами и контролем, как правило, нивелируются.

Влияние бактеризации семян пшеницы сорта Саратовская 55 и Безенчукская 139 биопрепаратом на основе культуры В.виЬИНх ИБ-15 на элементы структуры урожая и поражение растений корневыми гнилямн

Год Вариант опыта Доза, г/кг, кг/т ИЛИ КОЕ/ /зерно Продуктивная кустистость, шт Число колосков в глав, колосе, шт Число зерен в глав, колосе, шт Масса 1000 зерен,г Распространение корневых гнилей, % Биологич еская эффективность,0/« Развитие корневы х гнилей, % Биологич еская эффективность, % Развитие корневы х гнилей, % Биологическая эффектнв ность, %

Фаза выхода в трубку или цветение Полная спелость

1990 Контроль - 2,8+0,5 12,1+0,5 27,9+3,5 33,6+4,5 36,8+15,1 - 9,7+3,0 - 27,5+5,1 27,5+5,1

ТМТД 1,5 кг/т 2,3+1,5 13,2+1,0* 27,7+3,5 33,1+3,2 16,4+10,4* 55,4* 4,9+3,0* 49,5* 30,4+5,9 30,4+5,9

В.5иЫШ$ ИБ-15 5 кг/т 2,5+0,4 12,6+0,7 28,3+2,7 32,7+4,4 9,4+5,5* 74,5* 4,2+2,9* 56,7* 31,2+9,5 31,2+9,5

азиЬШв ИБ-15 7,5 кг/т 2,3+1,5 12,1 + 1,2 28,8+3,3 33,6+3,7 23,8+9,7* 35,3* 7,7+3,1 - 25,0+13,0 25,0+13,0

В.5иЫШ$ ИБ-15 10 кг/т 2,7+0,8 12,2+1,2 27,7+4,2 33,3+1,9 20,4+7,9* 44,6* 6,2+4,6 - 20,5+10,4 20,5+10,4

1991 Контроль - 1,2+0,2 9,9+0,7 20,7+1,3 40,8+1,3 71,7+9,9 - 24,2+4,9 - нд нд

В.звЫ|Нз ИБ-15г"(кл> 3,010 1,3+0,3 9,8+1,6 21,5+3,8 41,2+1,6 55,5+26,0 - 15,9+5,3* 34,3* нд нд

В^иМНю ИБ-15ГВД™0 6,8 г/кг 2,0+0,2* 10,1+0,6 21,9+3,4 42,9+1,2 60,0+6,5* 16,3* 17,9+4,1* 26,0* нд нд

1992 Контроль - 1,0±0,1 9.5+1,6 17,4+4,7 41,4+1,4 57,0+35,4 - 16,5+10,4 - нд нд

В^нЬНИз ИБ-15г'1гкл) 9,110 1,0+0 9,6+0,9 16,8+3,4 41,5+5,1 61.3+7,9 - 13,7+3,8 17,0 нд нд

НБ-15г'^пм) 2,5 г/кг 1,0+0 9,2+2,6 15,6+5,6 39,7+4,3 42,0+23,5 - 13,7+2,0 17,0 нд нд

1996 Контроль - 2,0+0,4 13,7+0,5 36,5+2,5 43,2+1,7 нд нд нд НД 27,9+6,5 -

ТМТД 1,5 кг/т 2,0+0,1 13,5+0,6 31,3+2,2 43,6+1,5 нд нд нд нд 23,7+8,4 -

В^иЬШЬ ИБ-151*''" 1,0-10'' 1,8+0,3 14,4+0.6 32,7+2,2 34,2+1,6 нд НД нд нд 27,4+12,9 -

В.5иЫШ8»Б-15»г 8,710 2,2+0,7 14,5+1,4 42,9± 11,2* 32,3+2,3 нд НД нд нд 30,7+4,2 -

В.;иЫП|$ИБ-15 Г'г 3.8-10 2,4+0,4 14,5+0,3* 43,4+7,9* 36,3+2,4 нд нд нд нд 18,1+8,5* 37,8*

* - Различия по сравнению с контролем существенны при р=0,95,' г|'" - рифаминшш устойчивый штамм, кл — инокуляция семян клетками, пм -обработка семян продуктами метаболизма, накопленными в среде в процессе ферментации.

Таблица 7.

Влияние бактеризации семян пшеницы сорта Саратовская 55 и Безенчукская 139 биопрепаратом на основе культуры В.ро1утуха ИБ-37на элементы структуры урожая и поражение растений корневым» гнилямн

Год Вариант опыта Доза, г/кг, ГК/Т или КОЕ/ /зерно Продуктивная кустистость, шт Число колосков в главом колосе, шт Число зерен в главом колосе, шт Масса 1000 зерен,г Распространение корневых гнплеп, % Биологическая эффективность Развитие корневых пшлей, % Биологи ческая эффект« вность, % Развитие корневых гнилей, % Бнологнче екая эффективность^

Фаза выхода в трубку или цветение Полная спелость

1990 Контроль - 2,8+0,5 12,1+0,5 27,9+3,5 33,6+4,5 36,8+15,1 - 9,7+3,0 - 27,5+5,1 -

ТМТД 1,5 кг/т 2,3+1,5 13,2+1,0* 27,7+3,5 33,1+3,2 16,4+10,4* 55,4* 4,9+3,0* 49,5" 30,4+5,9 -

В.ро1утуха ИБ-37 5 кг/т 2,5+0,3 13,2+1,0 30,0+2,2 32,4+3,3 27,0+9,5 - 7,1+2,1 26,8 29,5+7,5 -

В.ро1утуха ИБ-37 7,5 кг/т 2,0+0,2 12,1+0,7 26,0+1,1 32,2+2,9 30,0+4,2 - 8,2+1,9 - 32,5+6,7 -

В.ро1утуха ИБ-37 10 кг/т 2,1+0,4* 12,8+1,3 27,0+5,7 31,9+4,3 43,2+18,0 - 11,1+5,0 - 28,3+11,2 -

1991 Контроль - 1,2+0,2 9,9+0,7 20,7+1,3 40,8+1,3 71,7+9,9 - 24,2+4,9 - нд нд

В.ооКпгаа ИБ-37г'^кл> 2,4'10 1,5+0,2 10,5+0,7 22,7+1,2* 43,1+3,8 64,1+40,9 - 17,5+8,6 27,7 нд нд

В.оо1\туха 1ГГ;-37Г1^пм) 25 г/кг 1,4+0,1 /0,3+1,8 23,0+5,0 43,2+4,4 67,5+18,3 - 21,4+6,0 - нд НД

1992 Контроль - 1,0+0,1 9,5+1,6 17,4+4,7 41,4+1,4 57,0+35,4 - 16,5+10,4 - НД нд

В.поКтуха ИБ-37г'гГкл^ 2.310 1,0+0 Ю,2±1,6 15,7+2,4 43,4+1,2 46,0+22,3 - 11,7+3,7 29,1 нд нд

В.цоКпта ИБ-37г"(пм) 2,5 г/кг 1,0+0 9,8+0,9 15,9+4,3 40,5+4,8 58,0+26,7 - 19,2+9,6 - нд нд

* - Различия по сравненню с контролем существенны при р=0,95, - рпфа.мпшнш устойчивый штамм. Обозначения как в таблице I.

Влияние бактеризации семян пшеницы сорта Саратовская 55 и Безенчукская 139 биопрепаратом на основе культуры Вас1Ни8 5р. 739 на элементы структуры урожая и поражение растений корневыми тилями

Год

Вариант опыта

Доза, г/кг, гк/т пли КОЕ/ /зерно

Продуктнв пая кустистость, шт

Число колосков в главном колосе, гит

Число зерен в главн. колосе, шт

Масса 1000

зерен,г •

Распространение корневых гнилей, %

Биологическая эффективность, %

Развитие корневых гнилей. %

Биологическая эффективно сть.%

Флтя выхода в трубку или цветение

1990

Контроль

2,8+0.5

12,1+0,5

27,9+3,5

33,6+4,5

36,8+15,1

9,7+3,0

тмтд

1,5 кг/т

2.3+1,5

13,2+1,0*

27,7+3,5

33.1 ±3,2

16,4+10,4*

55,4*

4,9+3,0*

49,5*

Бациспецнн

5 кг/т

2,0+0,3*

12,5+1,4

25,4+3,4

30,6+0,8

29.8+2,9

8,6+3.7

Бациспецнн

7,5 кг/т

2,9+1,0

12,5+1,1

28,3+3,9

35,0+5,6

31,3+4.1

7,3+4,2

Бациспецнн

10 кт/т

3,0+0,6

12,9+0,4*

29,1 ±2,1

33,4+11,3

21,7+4,8*

41,0*

5,0+3,0*

48,4*

1991

Контроль

1,2+0,2

9,9+0,7

20,7+1,3

40,8+1,3

71,7+9,9

24,2+4,9

Bacillus sn. 739strta)

1.4 10

1,3+0,1

10,6+2,0

25,6±4,2

45,6+2,1 *

75,0+20,1

24,2+8,2

Bacillus sn. 739str(nMl

-11 г/кг

2,0+0,5*

12,0+1,0*

26,0+3,8*

2.6 10

45,8+2,2*

74,2+18,8

26;7+9,l

Баниспешш (кл)

1,7+0,3*

9,7+1,8

25,2+3,0-

42,8+3,8

66,7+9,9

25,2+1,7

Бациспецнн(пм)

24 г/кг

1,6+0,4*

10,7+1.7

23,4+6,4

43,5+5,1

78,3+29.2

24,4+4,6

1992

Контроль

1,0+0,1

9,5+1.6

17,4+4,7

41,4+1,4

57,0+35,4

16,5+10,4

Bacillus sn.739strto)

2J-10

1,1+0,1*

10,5+0,8

17,9+5,2

42,6+2,9

33,3+18,2

11,7+2,0

29,1

Бациспсцин(км)

2.5-10

1,0+0,0

9,6+1,7

16,3+5,3

40,4+4,9

64,0+9,0

26,0+5,0

Баииспецнн (пм)

2,5 г/кг

1,0+0,1

9,6+1,1

15,6+3,8

43,0+2,1

25,3+7,9*

55,6*

7,0±2,2*

57,6*

1993

Контроль

1,4+0,4

13,3+0,2

27,0+4,1

37,7+1,6

71,7+1,3

25,0+3,4

Bacillus sp.739str

4.8-10J ,2.5 r/k-r

1,3+0,4

13,8+0,9

24,4+3,9

40,4+3,9

61,3+3,0*

14,5*

21,3+3,0*

14,8*

Байтам

2,0 г/к г

,4+о,;

13,5+0,1*

28,1 + 1,4

38,3+6,0

61,0+9,5*

14,9*

21,7+11,1

13,2

Bacillus sn.739str+Eaii.

2,I-10J+2,0r/kT

1,3+0,3

13,6+0,1*

28,1+9,2

35,1 + 1,3

60,0+10,4*

16,3*

19,3+3,0*

22,8*

ТМТД

2.0 г/кг

1,4+0,4

14,8+0,5*

26,3+7,9

38,7+4,4

77,0+19,0

23,0+0

8.0

Bacillus sn.739slr+TMT.1

3,4-10'+2,0 г/кг

1,4±0,2

13,8+0,4*

28,9+2,4

39,2+4,3

69,3+3,0

22,0+0

12,0

Фундазол

1,2+0,2

13,7+0,8

27,5+4,5

38,2+2.9

71,1+26,0

29,3+16,9

Bacillus хр.7395<г+Фун.

1,0103+2,0г/кт

1,3+0,2

14,1+0,3*

26,9+7,2

36,3+3,1

64,0+33,3

10,7

26,7+13,4

2.0 г/кг

- Различия по сравнсшпо с контролем существенны при р=0,95, "5'г" - стрептомицин устойчивый штамм. Обозначения как в таблице 1.

По характеру действия препараты исследованных бацилл-антагонистов значительно различались. Для эффективной защиты растений пшеницы от корневых гнилей препаратами на основе Bacillus sp.739 необходимо было обязательное наличие в них биологически активных метаболитов, накапливающихся в процессе их ферментации. Вместе с тем необходимо и наличие в препарате жизнеспособных спор культуры-продуцента, поскольку заселение ризосферы данным штаммом положительно сказывается на структуре урожая.

Для препаратов на основе B.subtilis ИБ-15 наличие активных метаболитов не является определяющим, но важное значение имеет плотность инокулюма, поскольку эффективность протекторного действия напрямую зависит от количества нанесенных на зерно спор.

Биологическое действие B.polymyxa ИБ-37, как антагониста возбудителей корневых гнилей, в полевых условиях не проявилось.

Производственные испытания биопрепарата "Бациспецин БМ", проведенные в разные годы в хозяйствах Башкирии, расположенных в различных агроклиматических зонах, убедительно свидетельствуют о положительном влиянии предпосевной обработки семян пшеницы на урожай и снижение распространения основных болезней. Эффективность обработки семян биопрепаратом в производственных условиях сопоставима с обработкой семян химическими протравителями, а зачастую и значительно их превосходит. На рисунке 12 представлены, в качестве примера, результаты производственных испытаний на посевах пшеницы за 1990 год.

В Опыт

□ Химический протравитель

Саратовская 55

Московская 35

Жница

Рис. 12. Результаты полевых испытаний биопрепарата "Бациспецин" в 1990 г. Предпосевная обработка семян.

По эффективности применение биопрепарата для обработки семян превосходит (или сопоставимо) использование химических протравителей ТМТД и Байтан.

5. Продукция бациллами-антагонистами веществ фитогормональной природы

Наши многочисленные наблюдения о влиянии обработки растений пшеницы биопрепаратами позволили выделить некоторые особенности в реакции растений. Помимо снижения общей пораженности растений грибными болезнями, что можно объяснить антигрибными свойствами бактерий, очень часто у обработанных растений отмечались морфофизиологи-ческие изменения, в частности, увеличивались высота стебля, продуктивная кустистость, число зерен в колосе и масса 1000 семян. Зачастую отмечалось ускорение цветения. Поскольку такая полифункциональность реакции характерна для действия на растения рострегулирующих веществ и/или экзогенных фитогормонов, возникло предположение о возможной продукции бациллами-антагонистами подобных соединений. Изучению влияния бактерий на фитогормональный статус растений, определению способности отдельных штаммов синтезировать фитогормоны и секрети-ровать их в окружающую среду, установлению природы синтезируемых гормонов посвящена настоящая глава.

5.1. Влияние бактерий-антагонистов рода Bacillus на фитогормональный статус растений пшеницы

Влияние интродукции бацилл-антагонистов в корневую систему пшеницы на гормональный статус растений изучали в полевых мелкоделя-ночных экспериментах. Семена яровой пшеницы сорта Саратовская 55 обрабатывали препаратами и высевали на делянки площадью 5,0 м2 в четырехкратной повторное™. Контролем служили необработанные семена. Растения на анализ отбирали в фазе выхода в трубку.

В а cillu s sp .739 В .su b Ulis И Б -1 5 B.subtilis И Б -2 5 Контроль

кущение трубкование колошение Фазы развития

Рис. 13. Содержание эндогенных цитокининов в растениях пшеницы, инокулированных бактериями-антагонистами.

Содержание цитокининов определяли методом твердофазного им-муноферментного анализа с антисывороткой к зеатинрибозиду. Поскольку

уровень содержания цитокининов в растениях не является константой, а меняется во времени, в зависимости от стадии развития растений, содержание цитокининов определяли в трех точках: кущение, выход в трубку, колошение. Результаты эксперимента представлены на рис. 13.

Как следует из представленных данных, наибольшие различия в уровне содержания цитокининов в растениях наблюдаются в фазу трубко-вания. Поскольку гормональная регуляция развития и физиологического состояния растений определяется не столько уровнем содержания того или иного фитогормона, сколько их балансом, то в следующем эксперименте было определено влияние бактериальной обработки на гормональный статус растений (табл. 9).

Таблица 9.

Содержание гормонов в надземной части растений пшеницы при обработке семян биопрепаратами

Вариант обработки ИУК, нг/г АБК, нг/г Зеатиноподобные, нг/г

Контроль ' 98 172 30

ТМТД 165 235 20

B.pumilus ИБ-2 200 207 20

B.subtilis ИБ-15 164 264 80

B.polymyxa ИБ-37 152 383 155

Bacillus sp. 739 Бациспецин БМ 173 310 30

НСР,о 40 148 37

НСР05 52 190 48

Тот факт, что все обработанные растения содержали в целом больше ИУК и АБК чем контрольные, может свидетельствовать о воздействии экзогенных цитокининов, продуцируемых бактериями, развивающимися в ризосфере. Увеличение уровня ауксинов и абсцизовой кислоты у растений под воздействием экзогенных цитокининов отмечал Evans (1984). Отмеченную нами в предыдущей главе индукцию устойчивости растений при обработке их биопрепаратами, можно связать с изменением гормонального статуса, что в свою очередь может быть следствием синтеза цитокининпо-добных веществ интродуцированными в ризосферу бактериями-антагонистами.

5.2. Образование цитокининов бациллами-антагонистами

Для определения способности исследуемых бацилл-антагонистов продуцировать вещества фитогормональной природы, отдельные штаммы микроорганизмов были проанализированы в иммуноферментных тест-системах на наличие в культуральной жидкости цитокининов, ауксинов и абсцизовой кислоты. ИУК и АБК полностью отсутствовали в культуральной жидкости исследуемых штаммов. В тест-системе для определения зеа-тина/зеатинрибозида в культуральной жидкости B.subtilis ИБ-15, B.subtilis Ш>-2\, Bacillus.sp. 739 и B.polymyxa ИБ-43 наблюдалось ингибирование реакции, что свидетельствовало о возможном присутствии данных гормонов. Расширенный анализ коллекции бацилл-антагонистов на содержание ци-токининподобных веществ позволил выявить штаммы, способные продуцировать цитокинины в больших количествах. В таблице 10. представлены результаты иммуноферментного анализа культуральной жидкости штаммов-антагонистов бактерий рода Bacillus в тест-системе для определения цитокининов с расширенной специфичностью.

Таблица 10.

Иммунореактивность культуральной жидкости штаммов-антагонистов ро-

да Bacillus в тест-системе с расширенной специс мчностью.

Штамм ОД 492 Штамм ОД 492

B.subtilis ИБ-4 1.32+0,12 B.polymyxa ИБ-37 1.32+0,15

B.subtilis ИБ-7 1.56+0,15 B.subtilis ИБ-39 1.55+0,07

B.sublilis А 1.35+0,05 B.polymyxa ИБ-45 1.61+0,09

B.subtilis ИБ-16 1.36+0,09 В polymyxa ИВ-50 1.60+0,21

B.sublilis ИБ-18. 1.29+0,13 B.sublilis ИБ-54 1.66+0,11

B.subtilis ИБ-19 1.32+0,11 B.subtilis ИБ-55 1.59+0,17

B.subtilis ИБ-21 1.45+0,19 B.pwnilus ИЬ-2 1.16+0,07

Bacillus sp. ИБ-23 1.62+0,21 B.sublilis ИБ-6 1.05+0,10

B.sublilis ИБ-24 1.58+0,06 B.subtilis ИБ-15 0.80+0,16

Bacillus sp. ИБ-26 1.30+0,08 B.sublilis ИБ-22 0.50+0,09

B.subtilis НБ-29 1.38+0,10 Bacillus sp. 739 0.92+0,12

B.subtilis ИБ-34 1.52+0,11 B.subtilis ИБ-43 1.17+0,11

Контроль * 1.55+0.20

*Контроль - питательная среда до внесения в нее культуры бактерий.

Исследованные штаммы разделены по степени достоверного инги-бирования иммунологической реакции антиген-антитело. В использованном нами варианте непрямого Конкурентного ИФА количество цитокининов обратно пропорционально хромофорному ответу (оптической плотно-

сти). Штаммы, сгруппированные в светлой части таблицы, не продуцировали цитокинины. Культуральная жидкость штаммов B.subtilis ИБ-15, B.subtilis ИБ-22 и Bacillus sp. 739 достоверно и в значительной степени ин-гибировала реакцию антиген-антитело. В этой связи были основания предположить,^ что вышеназванные штаммы являются продуцентами цитоки-нинов. До сего времени продукция цитокининов аэробными спорообра-зующими бактериями рода Bacillus не была описана. Поэтому для подтверждения такого феномена нами была предпринята попытка выделения из культуральной жидкости, очистки и идентификации веществ, проявивших иммунореактивность в тест-системах на цитокинины.

5.3. Исследование природы цитокининов, продуцируемых аэробными спорообразующими бактериями рода Bacillus

Определенные сомнения в том, действительно ли иммунореактив-ные к специфическим антителам продукты метаболизма исследуемых бацилл-антагонистов являются цитокининами, вызвал тот факт, что при разведении тестируемых образцов отсутствовала пропорциональность между содержанием иммунореактивного вещества и кратностью разведения. Такие результаты обычно свидетельствуют об эффекте неспецифической интерференции, который связан с присутствием веществ, мешающих достоверному определению антигенов (Pengelly, 1986; Wong, Horgan, 1987). Неспецифическая интерференция обусловливается компонентами, которые препятствуют образованию комплекса между антигеном и антителом. Для подтверждения эффекта неспецифической интерференции обычно используют антитела к таким антигенам, которых заведомо нет в исследуемом объекте.

Последующую работу проводили со штаммом Bacillus subtilis ИБ-22, максимально ингибировавшим иммуноферментную реакцию в системе для определения цитокининов. Для определения в культуральной среде неспецифического ингибитора иммунохимической реакции, культуральную жидкость анализировали в тест-системах для определения гемагглютинина вируса гриппа (ГА) и овальбумина (ОвА), то есть веществ, заведомо отсутствующих в бактериальной среде. Тем не менее, в обеих системах происходило значительное ингибирование иммуноферментной реакции, что свидетельствовало о том, что в культуральной жидкости действительно содержится компонент или компоненты, обладающие способностью неспецифически ингибировать иммунологическую реакцию антиген-антитело. Было выяснено, что неспецифический ингибитор не диализуется и, следовательно, является высокомолекулярным компонентом. Нами была проведена очистка культуральной жидкости от неспецифического ингибитора при помощи буганольной экстракции и аффинной хроматографии.

На рисунке 14 представлены результаты иммуноферментного анализа фракций после хроматографии бутанольного экстракта культуральной жидкости на аффинной колонке в тест-системе для определения зеатина.

Суммарное содержание гормонов в спиртовой фракции составило 400 нг; что соответствует концентрации 16 иг/мл свободных цитокининов в куль-туралыюй среде.

мл

Рис. 14. Аффинная хроматография бутанольного экстракта культу-ральной жидкости В.зиЬйИз ИБ-22 на колонке с антителами к зеатинрибо-зиду.

Состав цитокининов собранной фракции был установлен с помощью тонкослойной хроматографии и дальнейшего анализа зон хроматограммы в тест-системах для ЗР-З, ИПА-ИП и ДЗР-ДЗ. В зонах, соответствующих положениям метчиков, были идентифицированы изопентениладенин, в количестве 4 нг/мл, зеатинрибозид и/или дигидрозеатинрибозид, - 1,5 нг/мл, и обширная зона, соответствующая положению метчиков зеатина и дигид-розеатина. Количество'гормона последней зоны в тест-системе к зеатинри-бозиду составило 15 нг.

Для окончательной идентификации свободных цитокининов культу-ралыюй жидкости В. .■¡иЬ/Ш.ч ИБ-22 образец, подготовленный при помощи бутанольной экстракции и аффинной хроматографии, анализировали методом масс-спектрометрии в сочетании с ВЭЖХ. Как следовало из данных хроматографии, в образце обнаруживался компонент со временем выхода, соответствующим времени выхода дейтерированного стандарта зеатина (рис 15). На масс-спектрограме обнаружился пик с максимумом отношения массы к заряду, равным 220, что характерно для зеатина (рис 16). По соотношению масса/заряд, пика дейтерированного стандарта зеатина и пика фракции образца, было вычислено содержание указанного цитокинина, составившее около 20 нг/мл КЖ.

Таким образом, иммунологическими методами, тонкослойной, ВЭЖХ и хроматомасс-спектроскопией было установлено, что в культу-ральной жидкости В. зиЫШ.ч ИБ-22 действительно содержится свободный цитокинин, идентифицированный нами как зеатин. Этот факт установлен для аэробных спорообразующих бактерий впервые.

Содержание свободных цитокининов в культуральной жидкости оказалось не столь велико, как это следовало из данных иммуноферментного анализа.

100%

100%

А

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

время выхода, мин

Рис. 15. Высокоэффективная хроматография цитокининов: а - культуральной жидкости В. хиЪНШ ИБ-22, образец подготовленный при помощи бутанольной экстракции и аффинной хроматографии; б - дейтериро-ванного стандарта зеатина.

100%

132

225

220

150

204 199

226

о 150 200 250 М/г

Рис. 16. Масс-спектр компонентов хроматографического пика, соответствующего времени выхода зеатина

Выявленное наличие неспецифического ингибитора иммунологической реакции антиген-антитело в культуральной среде бактерий, вынудило нас заинтересоваться его природой. При попытке освободиться от неспе-

цифического ингибитора, содержащегося в культуральной жидкости B.subtilis ИБ-22 с помощью аффинной хроматографии, было выяснено, что около 7% процентов ингибитора прочно удерживается аффинным сорбентом и вымывается только 70% этанолом, т.е. попадает во фракцию цитоки-нинов. Основное количество неспецифического ингибитора элюируется с колонки 0.5М NaCI. При элюции образца через колонку с нормальными иммуноглобулинами кролика, неспецифический ингибитор в спиртовом элюате не обнаруживался. Вероятно, часть неспецифического ингибитора содержит в своей структуре участок, способный специфически связываться с антителами к цитокининам. В этом случае он должен вытесняться с колонки избыточным количеством гормона. Действиетльно, при замене этанола на раствор БАП при элюции с афинной колонки неспецифический ингибитор вытеснялся в том же количестве. Этот результат свидетельствовал, что вещество, элюирующееся в спиртовой фракции, содержит цитоки-нин.

Для выяснения физико-химических параметров компонента, удерживаемого специфическими антителами, собранную фракцию подвергали, гельфильтрации на сефадексе G-200. Поскольку вся ингибирующая активность определялась во фракции, соответствующей свободному объему, молекулярная масса данного компонента была не менее 250 кДа. Максимум УФ-поглощения изучаемого компонента соответствовал 264 нм, что свидетельствовало о небелковой природе вещества.

Исследование высокомолекулярной фракции на наличие цитокини-новой активности с помощью биотеста на проростках щирицы Amaranthus caudatus L. показало, что данная фракция проявляет цитокининовую активность. Количество активного гормона соответствовало содержанию 200 нг зеатинрибозида в 1 мл культуральной жидкости. Таким образом, было подтверждено, что цитокинины, входящие в комплекс с неспецифическим ингибитором являются биологически активными.

Поскольку исследуемый высокомолекулярный ингибитор не относится к белкам, было предположено, что, возможно, он имеет полисаха-ридную природу. Обработка фракции 0.5% спиртовым раствором йода вызвала красно-коричневую окраску, характерную для некоторых микробных полисахаридов (Блинов, 1987). При анализе кислотного гидролизата фракции глюкозидазным методом присутствие в ней глюкозы не обнаружено. Очевидно, мономерной единицей полисахарида, образующего комплекс с цитокининами, является не глюкоза, а другой углевод, природу которого предстоит установить. Данный полимер, вероятно, синтезируются бактериями de novo.

Количественный и качественный состав цитокининов, входящих в высокомолекулярный комплекс, определяли с помощью иммуноанализа в сочетании с ТСХ. От интерферирующего действия неспецифического ингибитора освобождались путем прогревания аффинноочшценной высокомолекулярной фракции при 80°С в течение 15 мин. Количество цитокининов во фракциях определяли с помощью ИФА в тест-системе с расширен-

ной кросс-реактивностыо. Около 640 нг-экв./мл зеатина (в пересчете на культурапьную жидкость) иммунологически определялось в высокомолекулярной фракции и 12 нг/мл обнаруживалось низкомолекулярной фракции. В тест системе на производные зеатина в высокомолекулярной фракции обнаружилось 600 нг/мл и 12 и 4 нг цитокининов детектировалось в тест системах на производные дигидрозеатина и изоиентениладенина соответственно. Следовательно, иммунореактивность фракции определяется в основном наличием зеатина или его производных.

Исследование состава цитокининов, входящих в комплекс с полисахаридом с помощью тонкослойной хроматографии в сочетании с имму-ноанализом показало, что большая часть иммунореактивности присутствует в зоне выхода метчика рибозида зеатина. Соединения, способные реагировать с антителами к зеатинрибозиду, также были обнаружены в зоне с Rf 0-0,1, где можно ожидать присутствия сильно гидрофильных нуклеотидов зеатина (рис.17а). С помощью тест-системы для определения ИП/ИПА незначительная иммунореактивность была выявлена в зонах выхода метчи-ковИП и ИПА (рис.176). ___________________________________________________________________

300 - ЗР

а)

250 200 150 100 50 О

я

X

ЗН

Rf

-Н

0,5

ИПА

С S

о

0,5

0,4 + 0,3 0,2 0,1 + 0

----.(..

ип

б)

Rf

0,5

Рис. 17. Хроматографическое распределение цитокининов, входящих в состав высокомолекулярного комплекса в тест-системах для определения: а) зеатина; б) ИП.

Природа материала хроматографической зоны с ЯГ0,9, реагировавшего с анти-ЗР сывороткой, осталась не ясна. Таким образом, высокомоле-

кулярный компонент, удерживаемый на колонке с антителами к зеатинри-бозиду, содержит преимущественно рибозилированные формы зеатина (зеатинрибозид, зеатиннуклеотид) и небольшое количество изопентенила-денозина и изопентениладенина. Комплекс полисахарида с гормоном диссоциировал, поскольку при хроматографии цитокинины разделялись в виде свободных гормонов, а полисахаридный компонент выявлялся на старте. Согласно литературным данным, некоторые гормоны, например ауксины, обнаруживаются в растениях в форме комплекса с полисахаридом, однако, цитокинины в такой форме до сих пор обнаружены не были.

Обнаруженная нами способность отдельных представителей аэробных спорообразующих бактерий продуцировать фитогормоны цитокинн-нового ряда имеет важное значение. Гормоны этого класса ответственны за процесс деления клеток (Кулаева, 1973), регулируют их рост и дифференциацию (Полевой, 1982), индуцируют органогенез (Муромцев, 1984), повышают устойчивость растений к неблагоприятным факторам окружающей среды (Баскаков, 1988). Возможно, благодаря обнаруженной способности бацилл продуцировать цитокинины происходит и индукция устойчивости растений к болезням, установленная нами для штаммов Bacillus sp.739 и B.subtilis ИБ-15. Цитокинины, продуцируемые штаммами Bacillus sp.739, B.subtilis ИБ-15, B.subtilis ИБ-22 в достаточно большом количестве, присутствуют, в основном, в форме комплекса с полисахаридом. На наш взгляд это может иметь важное значение, т.к. диссоциация цитокининов из такого комплекса способна обеспечить пролонгированное и нетоксическое действие фитогормонов на растения.

6. Миколитические ферменты бацилл-антагонистов

В составе клеточных стенок большинства мицелиальных грибов хитин является одним из структурных компонентов. Лизис клеточных стенок, часто наблюдаемый при действии бактерий-антагонистов на фитопа-тогенные грибы, обычно связывают с воздействием комплекса экстрацел-люлярных ферментов, продуцируемых агентом биологического контроля. Важнейшая роль в комплексе гидролитических ферментов принадлежит хитиназе (поли-[1,4-Р-(2-ацетамидо-2-дезокси-0-глюкозид]-гликаногидро-лаза; КФ 3.2.1.14) и ламинариназе (глюкан-эндо-1,3-бета-глюкозидаза, КФ 3.2.1.39). Считается, что хитиназная активность является обычной для многих видов Bacillus (Слабоспицкая с соавторами, 1992), тем не менее, часто антагонистическая активность бацилл проявляется при отсутствии проявления хитинолитической или иной гидролазной активности. В связи с этим, представляло интерес определить - существует ли строгая взаимосвязь между способностью бацилл-антагонистов подавлять развитие мицелиальных грибов и способностью к синтезу экстрацеллюлярных хитиназ.

.онжоксоЯ .dooacnob'iöoj эп oaiiasqn отс нюснснта» (»отвньчоп'л

6.1. Характеристика гидролазного комплекса хитинолитических бацилл

В ходе работы со штаммом Bacillus sp. 739 было обнаружено, что при культвировании на хитинсодержащих субстратах кроме ферментов, осуществляющих гидролиз коллоидного хитина, в среду секретируются также такие гидролитические ферменты, как П амилаза - глюкан-1,4-а-0-мальтогидролаза (К.Ф.3.2.1.2), бета-глюканаза - глюкан-эндо-1,3-ß-D-глюкозидаза (К.Ф.3.2.1.39), хитозаназа - хитозан-М-ацетилглюкоз-аминигидролаза (К.Ф.3.2.1.132) и циклодекстринглюканотрансфераза (К.Ф.2.4.1.19). Целлюлазная и КМЦ-азная активности у этого штамма не обнаруживаются. Ферменты - бета-глюканаза, хитиназа и хитозаназа потенциально могут принимать участие в лизисе грибных клеточных стенок. При анализе ферментативной активности культуральной жидкости других хитинолитических изолятов также обнаружилось наличие бета-глюканазной и хтозаназной активностей. Данные по ферментативной активности некоторых изолятов бацилл, представлены в таблице 11.

Таблица 11.

Активность литических ферментов изолятов бацилл-антагонистов

Штамм Хитиназа, ед/мл Хитозаназа, ед/мл Ламинариназа, ед/мл

среда 1 * среда 2 среда 1 среда 2 среда 1 среда 2

B.subtilis-517 0,036 0,073 0,030 0,093 6,111 5,555

B.subtilis-522 0,045 0,078 0,040 0,171 1,000 0,391

Почвенные изоляты неопределенного вида Bacillus spp.:

F-2 i-3 0,043 0,084 0,038 0,181 1,111

EAstr 0,065 0,123 . 0,435

SS 0,048 0,073 0,031 0,031 0,722 0,351

ArmMell 0,024 0,053 0,030 0,121 1,322 2,555

Ci 0,025 0,054 0,030 0,117 1,322 2,488

B-96(a) 0,027 0,067 0,030 0,202 6,667 6,444

""Примечание: среда 1 включала 0,5% нативного хитина, среда 2 -0,5% измельченных плодовых тел гриба Macrolepiota procera (Трутовик чешуйчатый).

Представленные данные свидетельствуют о том, что хитинолитиче-ские бациллы способны продуцировать наряду с хитиназой другие ферменты, участвующие в лизисе грибных клеточных стенок. Следует отметить, что на средах, содержащих в качестве субстрата измельченные плодовые тела грибов, уровень хитиназной и хитозаназной активностей был выше, чем на среде с нативным хитином. Для ламинариназной (Р-глюканазной) активности это правило не соблюдалось. Возможно, (3-1,3-

глюканаза является конститутивным ферментом, поскольку она в равной степени продуцируется на средах с коллоидном хитином и грибном субстрате Интересно, что все протестированные хитинолитические изоляты, вошедшие в группу неопределенного вида, проявили и циклодекстринглю-канотрансферазную активность на обеих средах. Уровень активности этого фермента сравним с таковым у Bacillus sp. 739, что свидетельствует об их таксономической близости.

6.2. Влияние компонентов питательных сред на продукцию ферментов гидролитического комплекса

Для исследования роли хитиназ в проявлении антагонистического действия бацилл предстояло наработать препаративные количества фермента, для чего, в свою очередь необходимо было изучить условия максимального накопления фермента. Работу проводили с культурой Bacillus sp.739, перспективным агентом биологического контроля болезней растений. Характеристика роста штамма и накопления хитиназной активности в периодической культуре представлена на рис. 18.

I <

"Ei ¥

I 3

2,0 1.6 1.2 -0,8-

!Г/

-~т — Хитиназа ь Белок (А,„,) : Биомасса (A<ii0) » pH

0,0—,-г-

0 20

40 60 80

Время культивирования, ч

грН

8,0

7.6

6.8

Рис. 18. Динамика роста, синтеза хитиназы и внеклеточных белков в ходе периодического культивирования Bacillus sp. 739

Наряду с хитиназной обнаруживалась и активность Р-1,3-глюканазы и хитозаназы. Использование в качестве основного источника углерода грибной биомассы привело к значительному повышению синтеза этих ферментов (табл.12).

• Таблица 12.

Продукция миколитических ферментов штаммом Bacillus sp. 739 на различных субстратах (72 ч культивирования).

Фермент Активность, ед/мл

Коллоидный хитин из панцирей крабов, 0,5 % (в/о) Измельченные плодовые тела гриба Macrolepiota procera, 0,5 % (в/о) Коллоидный хитин (0,2%) в сочетании с коллоидным хито-заном, 0,1 % (в/о)

Хитиназа Хитозаназа Р-1,3-глюканаза 0,158+0,003 0,058+0,003 2,41+0,01 0,089+0,003 0,255+0,003 5,67+0,01 0,203+0,003 0,347+0,003 4,27+0,01

Повышенное образование |)-1,3-глюканазы и хитозаназы обусловлено, вероятно, тем, что биомасса грибов содержит непосредственные индукторы их синтеза в отличие от чистого хитина. В серии экспериментов по подбору состава питательных сред было установлено влияние природы хитинсодержащего субстрата, источников органического азота и некоторых возможных индукторов синтеза ферментов. В результате этих работ было установлено, что наибольший выход хитиназы обеспечивает биомасса гриба Botritis cinerea и хитин-глюкановый комплекс, выделенный из некоторых базидиомицетов, например, Armillariella mellea (опенок осенний). Повышенная секреция бациллами хитиназ при использовании биомассы грибов вместо чистого хитина в питательных средах связана вероятно с тем, что в клеточных стенках этих грибов, присутствуют неспецифические индукторы синтеза. Использование в качестве аддитива к основному субстрату ß-глюкана, пектина и хитозана индуцировало синтез хитиназы, тогда как N-ацетилглюкозамина угнетал образование фермента. Лучшими источниками органического азота оказались пептон, гидролизат казеина и кукурузный экстракт. Синтез фермента культурой осуществлялся в относительно узком интервале значений начального pH среды, - от 6,0 до 7,0. При pH выше 7,0 начиналось снижение хитиназной активности на 10-20%, а при pH ниже 6,0 синтез фермента полностью прекращался. Оптимум продукции хитиназы Bacillus sp. 739 находился в интервале температур от 28 до 38°С.

6.3. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp.739

Наработку хитиназы для препаративных целей осуществляли на средах с использованием хитин-глюканового комплекса из клеточных стенок Р.squamosus (Трутовик чешуйчатый). Очистку проводили по ниже приведенной схеме (табл.13).

4.4

Таблица 13.

Схема очистки хитиназы Bacillus sp. 739____

Этап Объем, Акптность Белок, мг Степень очистки Выход, %

мл всего единиц ед/мг белка

КЖ 500 51,000 0,017 2970 1 100

Осаждение 40-70% пас. 10 33,857 0,052 645,6 3 66

сульфатом аммония

Гель-фильтрация на Се- 42 22,176 0,120 185,1 7 44

фадексе 0-15

Адсорбция на коллоид- 7 12,242 0,540 22,67 32 24

ном хитине

Гель-хроматография на 37 8,177 0,961 8,51 56 16

Биогеле Р-100

Электрофорез в 7,5%-ном ПААГ с 1% ДДС-Ыа отдельных фракций, собранных в процессе хроматографии на Биогеле Р-100 показал присутствие в них белков различной молекулярной массы (рис. 19).

М I 11 111 IV V

Рис. 19. Электрофореграмма фракций хитиназы. 7,5% ПААГ, 1% ДДС-Na. I, II, III, IV, V - фракции хитиназы, отобранные при гель-хроматографии на Биогеле Р-100 ; М - маркеры: 1 - овотрансферрин (Мг 76-78,000); 2 - бычий сывороточный альбумин (Мг 66,250); 3 - овальбумин (Мг 43,000); 4 - карбангидраза (Мг 30,000).

Молекулярная масса двух доминирующих полос в наиболее активном препарате фермента составляла около 70 кДа и 65 кДа. Дополнительно выявляемый белок с хитиназной активностью имел молекулярную массу около 48 кДа. Близкие по массе белки были обнаружены ранее у Bacillus circulans WL-12 (хитиназы А2 и D), В. licheniformis X-7u (хитиназа III), В.

cereus (хитиназа 68 кДа) и В. circulons No.4.1 (Трачук и др., 1996, Takaya-nagi et al., 1991, Watanabe et al., 1990, Wiwat et al., 1999). Наибольшей хи-тиназной активностью обладала фракция, содержащая первые два белка. Несмотря на свою гетерогенность, препарат очищенной хитиназы имел ярко выраженный pH-оптимум, равный 6,0 и сохранял стабильность в диапазоне pH 4,0-9,0. Для температурного профиля активности фермента было характерно наличие двух пиков - максимального, при 50°С и более низкого при 65°С. Фермент был относительно стабилен при температурах от 50 до 60°С, сохраняя 70 - 80% первоначальной активности.

Изучение специфичности хитиназы Bacillus sp. 739 проводили по действию образцов фермента различной степени гомогенности на кристаллический и коллоидный хитин из панцирей краба, хитозан, а также на некоторые хромогенные производные хитоолигосахаридов (табл. 14). Самым активным был наиболее гетерогенный препарат фермента, обозначенный в таблице как фракция II.

Таблица 14.

Гидролиз различных субстратов образцами хитиназ Bacillus sp. 739

Активность по субстрату в ферментативной реакции, ед/мл

Фрак- Нативный хи- Коллоидный Хитозан, П-НФ- П-НФ- П-НФ-

ция* тин, 1,0% хитин, 1,0% 1,0% GlcNAc (GlcNAc)2 (GlcNAc)3

5 мМ 5 мМ 5 мМ

I 0,041+0,005 0,178+0,007 Пег Нет 0,75+0,06 0,09+0,04

II 0,079+0,006 0,498+0,008 Нет Нет 2,00+0,07 0,25+0,07

III 0,026+0,005 0,190+0,007 =0,010 Нет 1,10+0,07 0,24+0,08

IV - 0,047+0,005 - Нет 0,58+0,007 0,25+0,08

* Обозначения как на рис. 19.

Результаты исследований показали, что принципиальной разницы между фракциями фермента в специфичности гидролиза того или иного субстрата не наблюдалось. Все образцы очищенной хитиназы обладали способностью гидролизовать коллоидный хитин и п-нитрофенил-Ы^"-диацетил-р-0-хитобиозу. Помимо этого, ферменты гидролизовали кристаллический хитин, но не проявляли N-ацетилглюкозаминидазной активности. Скорость гидролиза п-нф-триацетилхитотриозы была примерно на порядок ниже, чем п-нф-диацетилхитобиозы. Таким образом, основным объектом действия хитиназного комплекса Bacillus sp. 739 являлась N,"N'-диацетил-р-Б-хитобиоза, что позволяет считать его основным компонентом хитобиозидазу, фермент с экзо-механизмом действия. Большинство изученных бактериальных хитиназ являются именно хитобиозидазами. О механизме действия исследуемых образцов свидетельствует и то, что они воздействуют на кристаллический хитин, расщеплять который способны только экзо-хитиназы. Динамика гидролиза коллоидного хитина наиболее активным препаратом очищенной хитиназы сохраняет линейный характер

в течение довольно долгого времени инкубации, что также свойственно только экзо-хитипазам.

6.4 Антагонистическая активность хитиназы ВасШги лух 739

Антагонизм бактерий к фитопатогенным грибам многие исследователи связывают с их способностью синтезировать хитиназу. Для выяснения роли хитинолитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам нами была проведена серия экспериментов, включающих биологические и биохимические тесты. В работе использовали препараты хитиназы ВасШш ¿р.739 различной степени очистки.

В биологических тестах на проявление способности препаратов хитиназы ингибировать рост мицелиальных грибов методом лунок было показано, что увеличение концентрации сырого препарата фермента приводит к увеличению зон ингибирования (табл. 15). Термическая инактивация фермента приводила к полной потере антагонистической активности. Фракция белков, не имевшая аффинного сродства к хитину, не проявила антагонистической активности. Напротив, активность аффинноочищенно-го препарата возросла по сравнению с исходным, хотя его активность была ниже. Более того, эта активность сохранялась и после 7 суток инкубации. Казалось бы, что все эти данные свидетельствуют о несомненной связи хи-тинолитической активности с проявлением антагонизма.

Таблица 15.

Антигрибная активность препаратов хитиназы ВасШш 5р. 739

Тестируемый препарат хити- Диаметр зон подавления, мм*

назы Р. 5о!ап1 Р. оху- К Ы- В.яогокт АН.

врогит тогит /'апа акегпаШ

1.Сырой препарат, 0,169 ед. 7,0/0,0 8,0/0,0 8,0/0,0 6,0/0,0 6,0/0,0

2.Сырой препарат, 0.339 ед. 10,0/0,0 12,0/8,0 10,0/8,0 9,0/0,0 12,0/0,0

З.Термоинактивированный

сырой препарат, 0,000 ед. 0 0 0 0 0

4.Несорбирующаяся на хити-

не белковая фракция, 0,010 ед. 0 0 0 0 0

5 Аффшшоочищенньш препа-

рат, 0,087 ед. 22,0/14,0 17,0/13,0 14,0/10,0 24,0/21,0 14,0/14,0

* Диаметр зон на 3-й / 7-е сутки инкубации

Однако, следует критически подойти к этим результаты. Термоинак- . тивация может свидетельствовать о лабильности антибиотических веществ, которые очевидно присутствуют в сыром ферментном препарате. Далее, аффинноочищенный препарат содержал продукты гидролиза хитина, которые, как известно, обладают широким кругом биологической активности, в том числе и фунгицидной (Максимов и др., 1997, Кривцов и др., 1996). В связи с этим мы провели дополнительные сравнительные эксперименты с использованием высокоочищенного ферментного препарата, не содержащего продуктов гидролиза хитина и сульфат-аммонийных фракций, полученных после культивирования Bacillus sp.739 как на среде с хитином, так и на среде с крахмалом (табл.16).

Как следует из представленных данных, способностью подавлять развитие грибов обладал только сырой препарат хитиназы. Вокруг лунок с высокоочищенным препаратом хитиназы, сопоставимой активности, инги-бирования роста грибов не обнаружено. В сульфат-аммонийной фракции белков, выделенной из культуральной жидкости Bacillus sp. 739, также не выявлено' антагонистической активности, что может быть следствием утраты способности культуры синтезировать вещества антибиотической природы при длительной адаптации к одному источнику углерода.

Таблица 16.

Антагонистическая активность препаратов хитиназы Bacillus sp. 739

Тест-объект Диаметр зон ингибирования роста грибов, мм

Сырой препарат, 0,160 ед. Высокоочшценный препарат, 0,138 ед. Сульфат-аммонийная фракция (рост на крахмале), 0,0 ед.

F. solani 7,0+0,5 0 0

F. oxysporum 8,0+0,5 0 0

F. culmorum 8,0+0,5 0 0

B.sorokiniana 6,0+0,5 0 0

Alt. alternata 6,0+0,5 0 0

Таким образом, результаты данной серии экспериментов свидетельствуют, что проявление антагонизма культуры Bacillus sp. 739 не связано напрямую с действием хитиназ. Вместе с тем, нельзя отвергать роли хити-наз в антагонистических отношениях бацилл к микромицетам в целом. Результаты ряда работ свидетельствуют, что этот фермент способен усиливать действие антибиотиков и других метаболитов (Joosten et al., 1995; Nielsen & Sorensen, 1997). Вполне возможно, что такое проявление корпоративного действия антибиотических веществ и фермента наблюдалось и в нашем случае, о чем свидетельствует отсутствие ингибирования грибов сульфат-аммонийной фракцией культуры, выращенной на крахмале (табл.

16.) и, наоборот, подавление роста сырым препаратом хитиназы. Можно было бы предположить, что исследуемый фермент вообще не имеет антигрибной активности. Однако микроскопические исследования влияния ферментных препаратов различной степени очистки свидетельствуют об участии фермента в деструкции клеточной облочки спор и мицелия грибов. При инкубации нативного мицелия тестируемых грибов с препаратами ферментов происходила визуально наблюдаемая деградация наружной и внутриклеточной структуры. Наблюдались такие явления, как вакуолизация мицелия и лизис гиф: Наиболее яркое проявление литического действия хитиназы на мицелий было отмечено для грибов рода Fusarium (рис.20).

Действие сырого и частично очищенного препаратов хитиназы име ло во многом сходный характер и различалось лишь по степени деградации. Безусловно, что лизис гиф не может происходить без участия хитина-, зы.

■' А . ; Б ••

•V ' ; • ■

Рис. 20. Литическое действие хитиназы Bacillus sp. 739 на мицелий Fusarium solani. 24 часа инкубации при 20°С. Световая микроскопия, х 400.

А - контроль; Б - сырой препарат; В - очищенный фермент.

Об участии фермента в процессе деградации мицелия можно судить по образованию редуцирующих Сахаров.

Для доказательства ферментативной природы разрушения грибных клеточных стенок проводили инкубацию живого мицелия в растворах препаратов хитиназы Bacillus sp. 739 и отслеживали динамику накопления редуцирующих Сахаров (рис.21). Как следует из представленных данных, в резултате инкубации нативного мицелия F. solani и А. alternata, при 37°С с ферментным препаратом, происходит накопление редуцирующих Сахаров в реакционной смеси.

-1-.-1-.-,-,-1--,-1--,---1-,-г-

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Время инкубации при 37°, ч

Рис. 21. Образование редуцирующих Сахаров при действии препарата хитиназы Bacillus sp. 739 на мицелий Fusarium solani и Alternaría altérnala. Температура 37°С. Обозначения: 1,3- Fusarium solani, опыт и контроль; 2, 4 - Alternaría altérnala (контроль и опыт). Содержание хитиназы - 0,510 ед/мл инкубационной смеси (0,05 М фосфатно-цитратный буфер, рН 6,0).

Таким образом, как визуальные, так и биохимические тесты подтверждают участие хитиназы в процессе деградации клеточных стенок ми-целиальных грибов. Вместе с тем, очевидно, что для проявления антагонистических свойств бацилл к микромицетам, признака образования экстра-целлюлярных хитиназ недостаточно. Высокоочищенный фермент не подавляет роста грибов. Это, в целом, согласуется с данными о весьма слабой антигрибной активности многих бактериальных хитиназ (Joosten et al., 1995, Lorito et al., 1993, 1994). Причина этого состоит очевидно в преобладании у бактерий хитиназ экзо-типа (Roberts, Selitrennikoff, 1988). Для известного грибного антагониста Trichoderma viride было показано, что эндо-хитиназа по ингибирующему эффекту в 2-3 раза превосходит хитобиозида-зу (Lorito et al., 1993). По видимому, антагонистическая активность препаратов неочищенной хитиназы Bacillus sp. 739 обусловлена присутствием низкомолекулярных соединений антибиотической природы. Безусловно, фунгицидное действие подобных соединений усиливается комплексом ли-тических ферментов.

В Ы В О Л ы

1. Из почвенных образцов Республики Башкортостан выделены, идентифицированы и охарактеризованы изоляты почвенных бактерий рода Bacillus,- антагонистов фитопатогенных грибов. Установлено, что в почвах Башкирского региона среди аэробных спорообразующих бактерий преобладают виды B.subtilis и B.polymyxa. Коллекция антагонистов положена в основу создаваемой в Институте биологии УНЦ РАН региональной коллекции микроорганизмов.

2. Установлено, что среди грибов, принадлежащих к роду Fusarium, наиболее устойчивы к действию бацилл-антагонистов виды F.culmorum, F.graminearum, F.sporotrichiella- возбудители фузариоза колоса.

3. Выявлены видовые различия в проявлении антигрибного действия бацилл. Метаболиты бактерий группы B.subtilis вызывают образование сферопластов на кончиках грибных гиф и последующий лизис, а группы B.polymyxa - нарушения строения цитоскелета.

4. Установлено, что при бактеризации семян пшеницы бактериями рода Bacillus колонизация поверхности прорастающего семени и формирующихся корней осуществляется путем образования микроколоний, состоящих из нескольких бактериальных клеток. Микроколонии связаны с эпидермальным слоем слизистым материалом, подобным гликокаликсу. Отдельные клетки развивающихся бактерий проникают в утолщенную часть семенной кожуры и калеоризу и выступают как слабые патогены. По характеру заселения корневой системы растений пшеницы существуют видовые различия. Для B.subtilis и B.polymyxa характерно распространение клеток по всей корневой системе, включая молодые фрагменты в апикальной части корня. Bacillus sp.739 заселяет корневую систему в зоне радиусом не более 10 см от основания корня.

5. Установлено влияние внешних факторов на численность интро-дуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере. Плотность популяции интродуцированных бактерий в ризосфере не зависит от уровня влажности почвы, но в значительной мере определяется температурой.

6. В процессе онтогенеза растений численность популяций интродуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере инокулированных растений не постоянна к не превышает 0,2 % от общего количества ризосферных бактерий. Максимальная численность отмечается в начальные периоды развития растений.

7. Интродукция бацилл-антагонистов в ризосферу сопровождается увеличением супрессивности прикорневой зоны почвы и не вызывает отрицательного влияния на аборигенную микрофлору и ее метаболическую активность (нитрогеназная активность, дыхание почвы). При бактеризации семян пшеницы бациллами-антагонистами эффективное подавление развития корневых гнилей происходит в раннем периоде вегетации растений, до наступления стадии выхода в трубку или цветения.

8. Впервые установлено явление индукции защитных реакций растений пшеницы к аэрогенным инфекциям, вызываемых предпосевной бактеризацией семян бациллами-антагонистами.

9. Применение биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов способствует значительному повышению продуктивности сельскохозяйственных растений. Препарат Бациспецин БМ (на основе штамма Bacillus sp.739) по эффективности действия не уступает таким химическим протравителям как Байтан, Фундазол и ТМТД. Биопрепарат совместим с фунгицидом Байтан.

10. Предпосевная обработка семян бациллами-антагонистами вызывает изменение фитогормонального статуса растений, вызывая значительное повышение содержания ауксинов (К-'К) и цитокининов.

11. Впервые у бактерий рода Bacillus обнаружена способность синтезировать растительные гормоны группы цитокининов. Выделен штамм B.subtilis ИБ-22 - суперпродуцент цитокинина. Выявлена новая форма биологически активных цитокининов, представляющая собой неко-валентный комплекс гормонов с полисахаридом. Цитокинины в макромо-лекулярном комплексе, главным образом, представлены рибозидом зеати-на и нуклеотидом зеатина. В состав минорных компонентов входят изо-пентениладенин иизопентениладенозин.

12. Обнаружена способность ряда бацилл-антагонистов продуцировать комплекс миколитических ферментов, включающих хитиназу (КФ. 3.2.1.14), р-1,3-глюканазу (КФ 3.2.1.6) и хитозаназу (КФ. 3.2.1.132).

13. Охарактеризована новая бактериальная хитиназа Bacillus sp. 739, относящаяся по механизму действия к экзо-хитиназе (хитобиозидазе). Фермент имеет оптимум pH, равный 6,0, стабилен в диапазоне pH от 4,0 до 9,0. Температурный профиль активности препарата характеризуется двумя пиками, соответствующими 50оС и 65оС.

14. Установлено, что высокоочищенный препарат хитиназы Bacillus sp. 739, в отличие от сырого препарата, не угнетает развития фи-топатогенных грибов in vitro, и не проявляет ингибирующего действия на процессы прорастания спор, удлинения ростовых трубок и скорости радиального роста грибов. Обнаружена способность высокоочищенного препарата хитиназы лизировать нативный мицелий грибов с освобождением редуцирующих Сахаров. Проявление антагонизма хитинолитических бактерий к фитопатогенным грибам обусловлено совместным действием низкомолекулярных антибиотических веществ и комплекса литических ферментов, продуцируемых бактериальной клеткой.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Толстиков Г.А., Джемилев У.М., Муринов Ю.И., Конкина И.Г., Яма-леев A.M., Сахипов Н.Р., Мелентьев А.И., Селимов Ф.А., Хафизов В.Р., Давыдова В.А. Способ борьбы с корневой гнилью пшеницы: А. с. СССР 1509013.-1989, Бюл. N35.

2. Мелентьев А.И., Еркеев A.M. Изучение антагонизма между почвенными бациллами и микромицетами рода Fusarium Lk:FR.// Микробиол. журн.. -1990 .-Т.52, N 1.-С.53-56.

3. Мелентьев А.И., Кочемасова А.П., Галимзянова Н.Ф. Использование микроорганизмов для защиты сельскохозяйственных растений от болезней //Актуаль,.-.1е вопросы биотехнологии.-Уфа, 1990.-С.4-12.

4. Мелентьев А.И. Видсзой состав и активность бацилл-антагонистов из выщелоченных .черноземов Башкирии. // II Симпозиум стран -членов СЭВ по микробным пестицидам.- М, 1990.-С.7.

5. Кудоярова Г.Р., Мелентьев А.И., Бойко Т.Ф., Фархутдинов Р.Г. Продукция цитокининов бациллами-антагонистами почвенных фитопатогенов // II Симпозиум стран -членов СЭВ по микробным пестицидам.-М, 1990.-С.39.

6. Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю., Галимзянова Н.Ф. Колонизирующая активность интродуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере яровой пшеницы // Микробиология в сельском хозяйстве: Тез.докл.-Киши-нев:Штиинца,1991 .-С.28.

7. Мелентьев А.И., Камалетдинова Р.Н., Яхин И.А., Хасанов P.A. Опыт применения бацилл-антагонистов как агентов биоконтроля болезней злаковых культур // Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу: Тез.докл.-Черновцы: Изд-во ЧГУ, 1991 .С.118.

8. Мелентьев А.И., Вялых А.К. Индукция устойчивости к ржавчине у ячменя и пшеницы, вызываемая препаратом Бациспецин БМ // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тез.докл. -Оренбург, 1991.-С.23-24.

9. Мелентьев А.И., Галимзянова Н.Ф., Кузьмина JI.IO:, Гильванова Е.А. Изучение способности бацилл-антагонистов к колонизации корней пшеницы // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тез.докл.- Оренбург,!991.-С.24 -25.

10. Кудоярова Г.Р., Мелентьев А.И., Юсупов A.A., Иванов И.И., Веселое С.Ю. Образование фитогормонов некоторыми почвенными бациллами, антагонистами фитопатогенных грибов // Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач: Сб.статей.- Уфа, 1991,-С.57 -66.

11. Усанов Н.Г., Логинов О.Н., Мелентьев А.И. Способ выделения бактерий Bacillus macerans из почвы: А. с. СССР 1703681,- 1992, Бюл. N 1.

12. Мелентьев А.И. Усанов Н.Г., Логинов О.Н. Штамм бактерий Bacillus sp.739 для получения препаратов против грибных возбудителей болезней злаковых кулмур: Пат. РФ N 1743019.

13. Мелентьев А.И., Кузьмина J1.IO. Влияние температуры и влажности на заселение ризосферы пшеницы интродуцированнымн бациллами-антагонистами // Микроорганизмы в сельском хозяй-стве:Т'ез.докл.1У Всес.науч.конф.- Пущино.1992.-С. 132.

14. Мелентьев А.И., Яхин И.А., Камалетдинова Р.Н., Исаев Р.Ф., Хаса-нов P.A., Вахитов В.А. Эффективность Бациспецина БМ против болезней зерновых культур // Новые средства и методы защиты растений: Сб.науч.тр. Уфа: БНЦ УрО РАН,1992.-С.93 - 99.

15. Иванова Т.Н., Веселов С.Ю., Мелентьев А.И. Влияние некоторых почвенных бацилл-антагонистов фитопатоганов на содержание эндогенных гормонов и урожайность растений пшеницы // Регуляторы роста и развития р„~тений:Тез.докл.И конф.- М.,1993.-С.28.

16. Морозов Ю.М., Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю. Ультраструктура клеток пшеницы при развитии бактерий Bacillus spp.- активного начала бактериального инокулянта Бациспецин БМ // Физология растений.-1994-Т.41, N 1.-С.36 - 43.

17. Андресон Р.К., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф., Мелентьев А.И. . Микробиологические процессы в ризосфере яровой пшеницы при обработке семян штаммами бацилл-антагонистов почвенных фитопатогенов // Сельско-хозяйственная биология .-1994-N 5.-С. 91-95.

18. Кузьмина Л.Ю.,.Гильванова Е.А., Мелентьев А.И. Распространение интродуцированных бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы // Интродукция микроорг анизмов в окружающую среду:Тез.докл. М.,1994.-С.56-57.

19. Алексеева Т.П., Вялых А.К., Мелентьев А.И., Ваганова О.Ф., Кась-яненко А.Г. Изучение эффективности применения Бациспецина и его штаммов против болезней пшеницы // Вопросы биотехнологии. Уфа.-БГУ, 1995.-С.47-52.

20. Иванова Т.Н., Мелентьев А.И., Веселов С.Ю. Использование иммунологических подходов для скрининга микроорганизмов-продуцентов ци-токининов // Науч. конф. по программе "Университеты России": Тез. докл. -Уфа: Изд-во БГУ, 1995,- С.78-80.

21. Мелентьев А.И., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Влияние инокуляции семян пшеницы бациллами-антагонистами на продуктивность растений и устойчивость к грибным патогенам // Биология почв антропогенных ландшафтов: Тез.докл. науч.конф., г.Днепропетровск, 15-17 окт., 1991 г, -Днерпопетровск: ДГУ, 1995. -С. 105.

22. Бойко Т.Ф., Андресон Р.К., Галимзянова Н.Ф., Мелентьев А.И. Микробиологическая активность и супрессивность почвы в прикорневой зоне растений пшеницы, инокулированных бациллами-антагонистами // Биология почв антропогенных ландшафтов: Тез.докл. науч.конф., г.Днепропетровск, 15-17 окт.,1991г.- Днерпопетровск: ДГУ, 1995. -С.126-127.

23. Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю., Морозов Ю.М. Колонизация корней пшеницы некоторыми агентами биоконтроля болезней, принадлежащими к роду Bacillus // Международная конф. "Микробное разнообразие:

состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы": Тез. докл., -Пермь, Россия, 1996. -С.68. Melentjev A.I., Kuzmina L.Y., Morozov Y.M. Colonization of wheat root by some agents of biocontrol of diseases belonging to the genus Bacillus // Microbial diversity: current situation, conser and ecological aspects.: Proceedings of the Int. Conf., 8-11 Oct., 1996, Perm/ Institute of E Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences .- Perm, 1996. -P.203.

24. Мелентьев А.И., Исаев Р.Ф. Возможность биологической защиты яровой пшеницы от Tilletia caries (DC.) Tul. путем инокуляции семян некоторыми почвенными бациллами II Там же. - С.67. Melentjev A.I., Isaev R.F. Possible biological protection of spring wheat from Tilletia caries (DC.) Tul. using seed inoculations ,/itli some soil bacilli // ( In the same edition) .-P. 202.

25. Актуганов Г.Э., Исаев Р.Ф., Мелентьев А.И., Ямапеев A.M. Эффективность хитинолитических бактерий рода Bacillus в подавлении фитофто-роза картофеля // Там же,- С.11. Aktuganov G.E., Isaev R.F., Melentjev A.I., Yamaleev A.M. The efficiency of chitinolitic bacteria of the genus Bacillus to protect Phytophtora infection on potato // (In the same edition).-P. 148.

26. Катаева C.P., Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю., Влияние инокуляции гороха клубеньковыми и ризосферными бактериями на азотфикси-рующую активность и устойчивость к корневым гнилям // Тез. докл. Всерос.съезда по защите растений.- С.-Петербург, 1995. -С.320-321.

27. Веселое С.Ю., Мелентьев А.И. Высокомолекулярные коньюгаты цитокининов, продуцируемые ризосферными бактериями // Второй съезд биохимического общества РАН :Тез. стендовых сообщений.- Пущино, 1997,-4.1.-С. 103.

28. Веселов С.Ю., Иванова Т.Н., Симонов М.В., Мелентьев А.И. Исследование цитокининов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами // Прикл. биохимия и микробиология. -1998. -Т.34, N2. -С. 175-179.

29. Veselov S., Ivanova Т., Symonyan М., Melentiev A., Kudoyarova G. Immunoassay of cytokinins produced by rhizosphere microorganisms// Proceedings of the 5-th symposium of the International Society of Root Research. Kluwer Academic Publishers, 1998. -P.641-649.

30. Ибрагимов Р.И., Мелентьев А.И. Агглютинирующая активность и углеводная специфичность ингибитора трипсина из семян пшеницы // Ме-ждунар. школа "Проблемы теоретической биофизики": -Тез. докл. М.-: МГ'У,1998.-С.129.

31. Актуганов Г.Э., Мелентьев А.И. Конструирование жидких питательных сред для продуцентов рода Bacillus на основе мицелия и плодовых тел некоторых высших грибов // Материалы Международ, конф. "Молекулярная генетика и биотехнология".- Минск, 1998. -С. 136-137.

32. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Хитиназа Bacillus sp.739 и ее роль в биологическом контроле фитопатогенов // Материалы Международной конф. "Молекулярная генетика и биотехнология".- Минск, 1998. -С.228-230.

33. Кузьмина Л.Ю., Мелентьев А.И. Колонизация ризосферы пшеницы бактериями-антагонистами рода Bacillus Cohn.// Тез. Респ. конф. "И.П.Павлов и современные проблемы биологии и медицины" ,Уфа, УГНТУ 29 октября 1999 г.-Уфа:-УГНТУ, 1999.- С.

34. Мелентьев А.И., Гапимзянова Н.Ф. Влияние метаболитов бацилл-антагонистов на прорастание спор и развитие возбудителей обыкновенной корневой гнили // Прикл. биохимия и микробиол. -1999.-Т.35 , N3 . -С.353-357.

35. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp. 739II Прикл. биохимия и микробиология.-1999. ■-Т. 35, N6.-С. 624-628.

36. Кузьмина Л.Ю., Меле.,<-ьев А.И. Влияние интродукции бацилл-антагонистов на численность почвенных бактгрий в прикорневой зоне пшеницы // Тезисы докл. III съезда Докучаевского общества почвоведов (11-15 июля 2000г., Суздаль). -М.: Почвенный институт им. В.В.Докучаева РАСХН, 2000. -Кн.2. -С.31-32.

37. Мелентьев А.И., Кузьмина Л.Ю., Гапимзянова Н.Ф. Влияние температуры и влажности почвы на колонизацию ризосферы пшеницы бактериями Bacillus Conh ., антагонистами фитопатогенов // Микробиология.-2000.-Т.69 ,N3. -С. 426-432.

/ .

///

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мелентьев, Александр Иванович

Список принятых сокращений ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль аэробных спорообразующих бактерий в почве и ризосфере растений

1.2. Аэробные спорообразующие бактерии как антагонисты фитопатогенных грибов

1.3. Особенности колонизации ризосферы растений аэробными спорообразующими бактериями

1.4. Механизм и природа антагонистического действия бацилл на фитопатогенные грибы

1.5. Миколитическая активность бактерий рода Bacillus и роль хити-наз в проялении антагонизма

1.6. Цитокинины - растительные гормоны и их синтез некоторыми микроорганизмами в ризосфере

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 .Бактериальные культуры

2.2. Культуры грибов

2.3. Растительные объекты

2.4. Методика проведения вегетационных опытов

2.5. Методика проведения опытов в теплице

2.6. Методика проведения полевых опытов

2.7. Производственные испытания

2.8. Характеристика вегетационных периодов

2.9. Методики определение микробиологической активности почвы в прикорневой зоне

2.10. Микроскопия

2.11. Методы определения растительных гормонов

2.11.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.11.2. Определение цитокининов

2.11.3. Определение индолилуксусной (ИУК) и абсцизовой (АБК) кислот

2.11.4. Определение неспецифического ингибитора иммунологической реакции антиген-антитело (НИ) в культуральной жидкости

2.12. Методы очистки, выделения и идентификации бактериальных цитокининов

2.12.1. Экстракционная очистка цитокининов

2.12.2. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

2.12.3. Ультрафильтрация

2.12.4. Приготовление аффинного носителя

2.12.5. Иммуноаффинная хроматография

2.12.6. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией

2.12.7. Разделение свободных и связанных форм цитокининов

2.12.8. Биотест на цитокинины

2.13. Методы изучения ферментативной и миколитической активностей

2.13.1. Получение коллоидного хитина

2.13.2. Получение коллоидного хитозана

2.13.3. Получение грибных хитинсодержащих материалов

2.13.4. Измерение хитиназной активности

2.13.5 Определение N-ацетилглюкозаминидазной активности

2.13.6. Измерение хитозаназной активности

2.13.7. Измерение ß-1,3-глюканазной активности

2.13.8. Методы изучения антигрибной и миколитической активности хитиназы

2.13.9. Определение концентрации белка

2.14. Методы исследования физико-химических свойств ферментов

2.14.1. Основные этапы выделения и очистки хитиназы

2.14.2. Определение рН-профиля и pH-стабильности хитиназы

2.14.3. Определение температурного оптимума и термостабильности препаратов хитиназы

2.14.4. Методика определения влияния pH на термостабильность хитиназы

2.14.5. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях

2.15. Статистическая обработка результатов

3. СКРИНИНГ ПРИРОДНЫХ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ РОДА BACILLUS Cohn И ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕКТРА ИХ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ ПОЧВЕННЫХ МИКРОМИЦЕТОВ

3.1. Выделение бацилл-антагонистов из почв, анализ их видового состава и спектра антагонистического действия.

3.2. Взаимодействие бацилл-антагонистов с некоторыми микромице-тами

4. ПРИЖИВАЕМОСТЬ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ ИНТРОДУЦИРО-ВАННЫХ ШТАММОВ БАЦИЛЛ В КОРНЕВОЙ СИСТЕМЕ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ

4.1 Колонизация зерновки и корневой системы проростков пшеницы при бактеризации семян

4.1.1. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия бацилл-антагонистов с поверхностными структурами и тканями семени пшеницы

4.2. Особенности заселения и колонизации ризосферы пшеницы при интродукции бацилл-антагонистов

4.3. Влияние водного и температурного режимов почвы на дйнамику численности бацилл в ризосфере пшеницы

4.3.1. Влияние температуры почвы на динамику численности бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы

4.3.2. Влияние влажности почвы на динамику численности бацилл-антагонистов в ризосфере пшеницы

5. ВЛИЯНИЕ ИНТРОДУКЦИИ БАЦИЛЛ-АНТАГОНИСТОВ В РИЗОСФЕРУ ПШЕНИЦЫ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ПРИКОРНЕВОЙ ЗОНЕ

5.1 Влияние интродукции бацилл-антагонистов на микробиологическую активность в прикорневой зоне пшеницы

5.2 Влияние интродукции бацилл-антагонистов на почвенные бактерии рода Pseudomonas в ризосфере пшеницы

5.3. Влияние инфекционного фона на численность интродуцирован-ных бацилл-антагонистов

6. ПОЛЕВАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ БАЦИЛЛ-АНТАГОНИСТОВ

6.1. Эффективность применения "Бациспецина БМ" на озимой пшенице против аэрогенных инфекций

6.2. Эффективность подавления аэрогенных инфекций на посевах яровой пшеницы

6.3. Эффективность бацилл-антагонистов в отношении твердой головни пшеницы

6.4. Эффективность подавления развития корневых гнилей на посевах яровой пшеницы

6.5. Производственные испытания опытно-промышленной партии препарата "Бациспецин БМ"

7. ПРОДУКЦИЯ БАЦИЛЛАМИ-АНТАГОНИСТАМИ ВЕЩЕСТВ ФИТОГОРМОНАЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

7.1. Влияние бактерий-антагонистов рода Bacillus на фитогормональ-ный статус растений пшеницы.

7.2. Образование цитокининов бациллами антагонистами

7.3 Исследование природы цитокининов, продуцируемых аэробными споробразующими бактериями рода Bacillus

8. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ БАЦИЛЛ-АНТАГОНИСТОВ

8.1. Хитинолитическая активность коллекционных штаммов бацилл-антагонистов

8.2. Характеристика гидролазного комплекса хитинолитических бацилл

8.3. Влияние компонентов питательных сред на продукцию ферментов гидролитического комплекса

8.4. Выделение, очистка и характеристика хитиназы Bacillus sp.

8.5. Субстратная специфичность и механизм действия хитиназы Bacillus sp.

8.6. Проявление антигрибной активности препаратами хитназы Bacillus sp.

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn. как агенты биологического контроля болезней растений"

Актуальность темы. Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn, широко используются в микробиологической и медицинской промышленности как продуценты ферментных препаратов, антибиотиков и пробиоти-ков. Применение их в сельском хозяйстве ограничивалось до последнего времени лишь как основы инсектицидных препаратов. В последнее время, в связи с насущной проблемой перехода к биологическому земледелию, интенсивно разрабатываются методы биологической защиты растений от болезней и соответствующие биопрепараты, призванные минимизировать применение химических пестицидов. Бактрии рода Bacillus рассматриваются как перспективные агенты биологического контроля болезней растений в силу их широко распространенного природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам. В последнее десятилетие во многих ведущих агропромышленных странах были созданы и испытаны некоторые препараты на основе бацилл-антагонистов. Однако зачастую, применение таких биопрепаратов оказывалась мало- или абсолютно неэффективным. Причина неудач в этих случаях кроется в недостаточной изученности жизнедеятельности почвенных бацилл при их взаимодействии с растениями и фитопатогенной микрофлорой. Бактерии рода Bacillus не относятся к типично ризосферным. Вместе с тем, при искусственной инокуляции посевного материала они способны длительное время развиваться и доминировать в прикорневой зоне растений, выдерживая конкуренцию со стороны аборигенной и фитопатогенной микрофлоры. На способность бактерий приживаться в ризосфере и осуществлять жизнедеятельность оказывают влияние как биогенные факторы так и условия внешней среды. Для успешного практического применения необходимо учитывать видовую специфичность используемого микроорганизма и влияние внешних факторов. Продукты жизнедеятельности бацилл могут оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие на растения. Состав, как продуцируемых метаболитов, так и секретируемых ферментов, определяющих взаимоотношения интродуцированных бацилл с растениями и патогенной микрофлорой исследован крайне недостаточно. В частности, до сих пор отсутствуют какие либо сведения о способности бактерий 8 рода Bacillus синтезировать вещества фитогормональной природы. Не достаточно исследованы воздействия антибиотических веществ, продуцируемых бациллами различной видовой принадлежности на характер воздействия на фито-патогенные грибы. Не установлена роль миколитических ферментов в проявлении антагонизма бацилл к мицелиальным грибам. Решение этих проблем позволит ускорить внедрение в практику биологических методов защиты растений от болезней и создание высокоэффективных биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов.

Цель и задачи исследований. Настоящая работа посвящена детальному изучению процессов взаимодействия с растениями и микрофлорой интродуци-рованных бацилл в ризосфере, влиянию внешних условий на процессы приживаемости и жизнедеятельности, исследованию природы ростстимулирующих веществ, продуцируемых отдельными штаммами рода Bacillus и исследованию роли экстрацеллюлярных миколитических ферментов бацилл в проявлении их антагонизма к микромицетам. В соответствии с этим были определены следующие задачи:

- выделить из почвенных образцов, описать и идентифицировать изоля-ты бацилл антагонистов, определить спектр и особенности антигрибного действия;

- изучить особенности колонизации зерновки и корешков прорастающих семян пшеницы бациллами-антагонистами и их влияния на ультраструктуру растительных клеток;

- исследовать динамику и распространение интродуцированных бацилл в ризосфере пшеницы в лабораторных и полевых условиях;

- исследовать влияние интродукции бацилл-антагонистов на микробиологические процессы в прикорневой зоне растений пшеницы;

- оценить полевую эффективность применения бацилл-антагонистов в подавлении развития грибных болезней злаков и влияние на продукционные процессы растений; 9

- изучить влияние интродукции бацилл на фитогормональный статус растений пшеницы и оценить способность природных изолятов к продукции рострегулирующих веществ;

- разработать методику выделения микробных цитокининов и установить их химическую природу;

- исследовать состав комплекса бациллярных миколитических ферментов и изучить влияние условий на их продукцию;

- выделить, очистить и охарактеризовать хитиназу Bacillus sp. 739 и выяснить роль этого фермента в проявлении антагонизма к грибам;

- разработать и произвести в промышленных условиях бактериальный препарат "Бациспецин БМ" для расширенных производственных испытаний,.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния интродуцируемых в ризосферу растений бацилл-антагонистов на ультраструктуру клеток и продукционные процессы растений, на реакцию фитопа-тогенных грибов и развитие аборигенной микрофлоры в прикорневой зоне. Установлено, что при предпосевной инокуляции клетки развивающихся бактерий проникают в калеоризу и выступают как слабые патогены. Антагонистическое действие бацилл в отношении микромицетов проявляется в нарушении процесса прорастания грибных спор и строения цитоскелета формирующегося мицелия, образованием сферопластов на кончиках гиф с последующим их лизисом. Показано, что колонизация поверхности формирующихся корней проростков пшеницы бациллами происходит путем образования микроколоний, прикрепленных к эпидермальному слою материалом, подобным гликокаликсу. Характер заселения ризосферы растений зависит от видовой принадлежности бацилл и факторов внешней среды и, в первую очередь, от температурного режима почвы. Развитие внедренных в ризосферу бацилл не оказывает угнетающего воздействия на основные агрономически значимые группы аборигенной микрофлоры, одновременно с этим увеличивает фунгистатический потенциал прикорневой зоны почвы. Эффективное подавление корневых гнилей растений происходит на ранних этапах развития, для злаков, - до стадии начала цветения.

10

Впервые обнаружена способность бактерий рода Bacillus воздействовать на фитогормональный статус растений и продуцировать растительные фито-гормоны цитокининовой группы. Выделена и охарактеризована новая форма цитокининов, представляющая собой комплекс зеатинрибозида с полисахаридами.

Исследован миколитический комплекс ферментов культуры Bacillus sp.739, включающий р-1,3-глюканазу, хитиназу и хитозаназу. Подтверждена белковая множественность форм хитиназ, синтезируемых представителями рода Bacillus и установлено, что по механизму действия фермент является экзо-хитиназой. Впервые для бацилл проведено подробное исследование роли хити-назы в проявлении антигрибной активности к некоторым фитопатогенным грибам. Показано отсутствие взаимосвязи между литической активностью очищенной хитиназы Bacillus sp. 739 и ее способностью ингибировать ростовые процессы у фитопатогенных грибов.

Практическая значимость. Установлены закономерности развития интро-дуцированных бацилл в ризосфере растений. Выявлен механизм антагонистического действия бацилл в отношении микромицетов и положительное влияние бактеризации растений отобранными штаммами на продукционные процессы и снижение заболеваемости. Предложен штамм Bacillus sp.739 в качестве основы биопрепарата "Бациспецин БМ" и продуцента хитиназы. Заявлен штамм B.subtilis ИБ-22 - продуцент цитокининов.

Апробация результатов. Основные результаты исследований были представлены на II Симпозиуме стран членов СЭВ по микробным пестицидам (Протвино, 1990), Всесоюзной конференции "Микробиология в сельском хозяйстве" (Кишинев, 1991), Всесоюзной конференции "Достижения биотехнологии - агропромышленному комплексу" (Черновцы, 1991), Всесоюзном симпозиуме "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" (Оренбург, 1991), конференции "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991), IV Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), П-й конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993), .конференции

11

Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994), Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологич-ность" (Санкт-Петербург, 1995), Международной конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь, 1996), 5-ом международном симпозиуме "Root Demographics and Their E iciencies in Sustainable Agriculture, Grasslands and Forest Ecosystems" (Клем-coh, ЮК, США, 1996), Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), Международной школе "Проблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998), Международной, конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998), III съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000).

Публикации. Основные результаты исследований изложены в 37 научных публикациях, включая 3 патента и авторских свидетельств.

12

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мелентьев, Александр Иванович

ВЫВОДЫ

1. Из почвенных образцов Республики Башкортостан выделены, идентифицированы и охарактеризованы изоляты почвенных бактерий рода Bacillus -антагонистов фитопатогенных грибов. Установлено, что в почвах Башкирского региона среди аэробных спорообразующих бактерий преобладают виды B.subtilis и B.polymyxa. Коллекция антагонистов положена в основу создаваемой в Институте биологии УНЦ РАН региональной коллекции микроорганизмов.

2. Установлено, что среди грибов, принадлежащих к роду Fusarium, наиболее устойчивы к действию бацилл-антагонистов виды F.culmorum, F.graminearum, F.sporotrichiella- возбудители фузариоза колоса.

3. Выявлены видовые различия в проявлении антигрибого действия бацилл. Метаболйты бактерий группы B.subtilis вызывают образование сферо-пластов на кончиках грибных гиф и последующий лизис, а группы B.polymyxa -нарушения строения цитоскелета.

4. Установлено, что при бактеризации семян пшеницы бактериями рода Bacillus колонизация поверхности прорастающего семени и формирующихся корней осуществляется путем образования микроколоний, состоящих из нескольких бактериальных клеток. Микроколонии связаны с эпидермальным слоем слизистым материалом, подобным гликокаликсу. Отдельные клетки развивающихся бактерий проникают в утолщенную часть семенной кожуры и ка-леоризу и выступают как слабые патогены. По характеру заселения корневой системы растений пшеницы существуют видовые различия. Для B.subtilis и B.polymyxa характерно распространение клеток по всей корневой системе, включая молодые фрагменты в апикальной части корня. Bacillus sp.739 заселяет корневую систему в зоне радиусом не более 10 см от основания корня.

5. Установлено влияние внешних факторов на численность интроду-цированных бацилл-антагонистов в ризосфере. Плотность популяции интроду-цированных бактерий в ризосфере не зависит от уровня влажности почвы, но в значительной мере определяется температурой.

234

6. В процессе онтогенеза растений численность популяций интроду-цированных бацилл-антагонистов в ризосфере инокулированных растений не постоянна и не превышает 0,2 % от общего количества ризосферных бактерий. Максимальная численность отмечается в начальные периоды развития растений.

7. Интродукция бацилл-антагонистов в ризосферу сопровождается увеличением супрессивности прикорневой зоны почвы и не вызывает отрицательного влияния на аборигенную микрофлору и ее метаболическую активность (нитрогеназная активность, дыхание почвы). При бактеризации семян пшеницы бациллами-антагонистами эффективное подавление развития корневых гнилей происходит в раннем периоде вегетации растений, до наступления стадии выхода в трубку или цветения.

8. Впервые установлено явление индукции защитных реакций растений пшеницы к аэрогенным инфекциям, вызываемых предпосевной бактеризацией семян бациллами-антагонистами.

9. Применение биопрепаратов на основе бацилл-антагонистов способствует значительному повышению продуктивности сельскохозяйственных растений. Препарат Бациспецин БМ (на основе штамма Bacillus sp. 739) по эффективности действия не уступает таким химическим протравителям как Байтан, Фундазол и ТМТД. Биопрепарат совместим с фунгицидом Байтан.

Ю.Предпосевная обработка семян бациллами-антагонистами вызывает изменение фитогормонального статуса растений, вызывая значительное повышение содержания ауксинов (ИУК) и цитокининов.

11. Впервые у бактерий рода Bacillus обнаружена способность синтезировать растительные гормоны группы цитокининов. Выделен штамм B.subtilis ИБ-22 - суперпродуцент цитокинина. Выявлена новая форма биологически активных цитокининов, представляющая собой нековалентный комплекс гормонов с полисахаридом. Цитокинины в макромолекулярном комплексе главным образом представлены рибозидом зеатина и нуклеотидом зеатина. В состав минорных компонентов входят изопентениладенин и изопентениладено-зин.

235

12.Обнаружена способность ряда бацилл-антагонистов продукциро-вать комплекс миколитических ферментов, включающих хитиназу (КФ. 3.2.1.14), ß-1,3-глюканазу (КФ 3.2.1.6) и хитозаназу (КФ. 3.2.1.132).

13. Охарактеризована новая бактериальная хитиназа Bacillus sp. 739, относящаяся по механизму действия к экзо-хитиназе (хитобиозидазе). Фермент имеет оптимум pH, равный 6,0, стабилен в диапазоне pH от 4,0 до 9,0. Температурный профиль активности препарата характеризуется двумя пиками, соответствующими 50°С и 65°С.

14. Установлено, что высокоочищенный препарат хитиназы Bacillus sp. 739, в отличие от сырого препарата, не угнетает развития фитопатогенных грибов in vitro, и не проявляет ингибирующего действия на процессы прорастания спор, удлинения ростковых трубок и скорости радиального роста грибов. Обнаружена способность высокоочищенного препарата хитиназы лизировать нативный мицелий грибов с освобождением редуцирующих Сахаров. Проявление антагонизма хитинолитических бактерий к фитопатогенным грибам обусловлено совместным действием низкомолекулярных антибиотических веществ и комплекса литических ферментов, продуцируемых бактериальной клеткой.

236

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мелентьев, Александр Иванович, Уфа

1. Агроклиматические ресурсы Башкирской АССР / Под ред. В.В. Кузнецова. JL: Гидрометеоиздат, 1976. - 236 с.

2. Агрономическая тетрадь по возделыванию озимых зерновых культур и яровой пшеницы по интенсивным технологиям / Под ред. В.П. Никонова.- М.: Россельхозиздат, 1985. 89 с.

3. Айзенман Б.Е. Антибиотические свойства бактерий. Киев: Наукова думка, 1973. - 183 с.

4. Андросова В.М., Вялых А.К., Вяткина Г.Г. Подавление корневой и прикорневой гнили озимой пшеницы бактофитом и ризопланом // Экологиз. с.-х. пр-ва Сев. Кавказ, региона: Тез. докл. участников семин.- совещ., Анапа, 26-29 июля, 1995. М., 1995. С. 74-76.

5. A.c. 1144377 СССР, МПК A01N63/00, С12Р1/04. Штамм Bacillus thuringiensis ИМП-215, обладающий фунгицидным действием в отношнии фитопатогенных грибов. Заявл. Опубл.

6. Афанасьева Л.Б., Скворцова И.Н. Перспектива применения бактерий против возбудителя белой гнили подсолнечника //Микробиологический метод защиты растений от вредителей, болезней и сорняков. -Кишинев; Штиинца, 1989. -С.86-92.

7. БабьеваИЛ., ЗеноваГ.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 336 с.

8. Бараев А.И., Бакаев Н.М., Веденеева М.Л., и др. Яровая пшеница.- М.: Колос, 1978.- 429 с.

9. Баскаков Ю.А. Новый антистрессовый препарат цитокининового типа действия // Агрохимия.-1988.-N4.- С. 103-105

10. Баталова Т.С., Тютерев С.А., Меликова Л.И. Борьба с фузариозом должна быть комплексной// Защита растений.- 1988.-N6.- С. 549.237

11. Бекер М.Е., Дамберг Б.Э., Мишке И.В., Приеде М.А. Микробный биосинтез метаболитов гормональной природы // Изв. АН ЛатвССР. -1988.-N12. -С.54-58.

12. Беккер Г., Бергер В., Домшке Г. Органикум. М.: Мир, 1979. - С.228-232, 247-250.

13. Бенкен A.A., Жукова Р.В. Возбудители корневых гнилей яровой пшеницы в эколого-географических зонах Башкирской АССР // Микология и фитопатология. 1974. - Т.6, вып. 1. - С. 31-37.

14. Берестецкий O.A. Изучение фитотоксических свойств грибов // Методы экспериментальной микологии. -Киев, 1973. -С.165-173.

15. Билай В.И. Фузарии.- Киев: Наукова думка., 1977,- 442 с.

16. Биологические и биорациональные средства защиты растений: Краткий справочник / Под ред. В.Ф.Кобзаря.-Краснодар,1995. -42 с.

17. Блохин В.Г. Концентрационная зависимость влияния 6-бензил-аминопурина на рост корней растений разных видов// Физиол. раст.- 1986.-Т.ЗЗ, вып.6.- С,1084-1089.

18. Борзенкова P.A., Зорина М.В. Влияние кинетина и абсцизовой кислоты на фотосинтез, отток и распределение 14С-ассимилятов у растений картофеля// Физиол. раст.- 1990.- Т.37, вып.З,- С.546-552.

19. Веселов С.Ю., Синяков М.С., Закомырдин Ю.А. и др. Выделение препаративных количеств геммаглютинина вируса гриппа с использованием аффинной хроматографии // Вопросы вирусологии. -1984, N1. С.- 93-97

20. Возняковская Ю.М., Труфанова А.К. Взаимодействие Helminthosporium sativum возбудителя корневой гнили культур с сапрофитными почвенными бактериями // Микология и фитопатология.- 1988.- Т.22, N2.- С. 157-161.

21. Гарагуля А.Д., Бабич Л.В., Киприанова Е.А., Смирнов В.В. Способность различных видов бактерий рода Pseudomonas к колонизации корней пшеницы // Микробиол. журн. 1988. - Т.50, N 6. - С.77-81.

22. Гирфанов В.К. Яровая пшеница. Уфа, 1976. - 294 с.

23. Горленко М.В. Состояние и перспективы биологического метода защиты растений от болезней // Общ. биол.- 1979.-Т.40.- С.325-332.238

24. Дерфлинг К. Гормоны растений. Системный подход. М.: Мир, 1985.206с.

25. Дорожкин H.A., Новикова JI.M., Вельская С.И., Викторчик И.В. Антагонистические бактерии, перспективные для защиты картофеля от болезней. // Докл. Академии наук БССР. -1991.- Т.35, N 11. -С. 1037-1038.

26. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-544 с.

27. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Агропромиздат, 1985.252 с.

28. Евдокимова Г.А. О численности микроорганизмов в ризосфере злаковых растений // Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов: Сб.научных тр.- JL: Наука, 1972. С. 230-235.

29. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. -М.: Высшая школа, 1965. 211 с.

30. Блинов Н.П. Общие закономерности строения и развития микробов-продуцентов биологически активных веществ // JL; Медицина, 1977.- 287 с.

31. Жукова Р.В. Корневые гнили яровой пшеницы в Башкирской АССР // Бюл. ВНИИ Защиты растений. 1973. - N25. - С. 54-58.

32. Зак P.A. Роль хелатирующих бактерий в почвенном питании растений // Конф. 5 Всес. микробиол. общ.: Тез. докл. конф.- Ереван, 1975. С. 91-92.

33. Заявка 96119503 /13 Россия, МПК A01G1/00, A01G1/06. Способ выращивания овощных культур / О.Д.Сидоренко. Заявл. 30.09.1996; Опубл. 10.10.1998.

34. Заявка 95110035/13 Россия, МПК А61К35/74, A01N63/00, C12N1/20. Способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis/ А.И.Леляк, В.Г.Костровский, О.И.Рязаннина, К.Ф.Набиев, Ю.Н.Мистюрин, Г.А.Ноздрин. Заявл. 14.06.1995; Опубл. 10.06.1997.

35. Захарова Н.Г., Алимова Ф.К., Егоров С.Ю. Скрининг микроорганизмов,239перспективных для биотехнологии. // Конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду": Тез. докл., Москва, 17-19 мая, 1994. М., 1994. - С.36.

36. Звягинцев Д.Г. Почва и микрооргнизмы. М.: Изд-во МГУ, 1987. - 256 с.

37. Илялетдинов А.Н. Микробиологические превращения азотсодержащих соединений в почве . Алма-Ата: Наука, 1976.- 281 с.

38. Исаев Р.Ф. Специфичность взаимодействия геномов пшеницы и эгилопса с возбудителем твердой головни : Автореф. дисс. канд. биол. наук, М., 1989.- 20 с.

39. Иутинская Г.А., Иванова Н.И., Остапенко А.Д. Экологическая оценка влияния антропологического воздействия на почвенную микрофлору // Конф. Проблемы изучения и сохранения биол. разнообразия: Тез. докл. конф., Фрунзе, 5-7 июня, 1990. Фрунзе, 1990. - С. 60.

40. Казарян Ф.Г., Агаджанян Д.А. Наличие гиббереллиновых веществ в метаболитах микроорганизмов и влияние их на высшее растение// Биол. журн. Армении.- 1971.- Т.24, N 9.- С.85-89.

41. Калько Г.В., Новикова И.И., Павлюшин В.А. Испытание биопрепаратов алирина Б и алирина С в борьбе с фузариозными заболеваниями растений // Конф. "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду": Тез. докл., Москва, 17-19 мая, 1994. М., 1994. - С. 45-46.

42. Кефели В.И. Проблема регуляторов роста и устойчивости ее возможности и перспективы // Материалы II Всесоюзн. конф. по регуляторам роста и разв.раст., Киев, 25-27 мая, 1988.- Киев, 1988.- С. 3-11.

43. Кобаяси X., Симада А. Противогрибковые антибиотики группы инулина, продуцируемые штаммом Bacillus subtilis KDK // Нихон сайкингаку дзасси. -1987. Т. 42, N1.-С. 307.

44. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережницкая Т.Г., Резник С.Р., Смирнов В.В. Эндофитные бактерии рода Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней. // Микробиол. журн. - 1995. - Т. 57, N5. - С. 69-78.

45. Красильников H.A. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд-во АН СССР; 1958. - 484 с.240

46. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко H.H., Гюли-Заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кулаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов// Физиол. раст.- 1990.- Т. 37, вып. 1.- С. 193-199.

47. Кузнецов В.В., Шиманн И., Заальбах И., Кулаева О.Н. Нитратредуктазы зародышей кукуля, индуцированные цитокинином и нитратом// Физиол. раст.-1986.-Т.ЗЗ, вып.2.-С.234-243.

48. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. -М.: Наука, 1973.263 с.

49. Кулаева О.Н., Цибуля Л.В. Действие цитокинина на рост высечек из этиолированных листьев фасоли// Физиол. раст.- 1974.- Т.21, вып.4.- С.709-713.

50. Кулаева О.Н. Гормональная регуляция физиологических процессов у растений на уровне синтеза РНК и белка / 41-е Тимирязевское чтение.- М.: Наука, 1982.- 82 с.

51. Кумаков В.А. Биологические основы возделывания яровой пшеницы по интенсивной технологии. М.: Росагропромиздат, 1988. - 104 с.

52. Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур / Под ред. К.В.Новожилова .-М., 1985.- 130 с.

53. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред.Ф.Герхарда и др. -М.: Мир, 1983. Т.1,-536с.

54. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д.Г.Звягинцева. -М.: Изд-во МГУ, 1991. -304 с.

55. Мишке И.В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. -Рига: Зинатне, 1988.- 151с.

56. Мишке И.В., Тевелева М.К., Озолиня.Р.К., Гривиня П. Сфера применения микробных цитокининов// Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез. Докл. 4 Всес. Науч. Конф., Пущино, 20-24 янв., 1992.- Пущино, 1992.- С.139.

57. Мишустин E.H., Наумова А.Н. Бактериальные удобрения, их эффективность и механизм действия // Микробиология. 1962. - Т.31, вып.З. - С. 543.

58. Мишустин E.H. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М.: Наука, 1972. - 344 с.

59. Морозов В.В., Шелегедин В.Н., Болотников И.А. Исследование хитиназ-ного препарата, полученного из бактерии Bacillus thuringiensis. // Биотехнология. 1994. - Т. 31, N 7. - С. 20-23.

60. Морозов Ю.М. Взаимодействие мицелия Pyricularia oryzae и клеток растения-хозяина до появления видимых симптомов II Микология и фотопатология. 1990. - Т.24, вып. 5. - С. 441.

61. Морозов Ю.М. Ультраструктура гиф возбудителя пирикуляриоза риса и пораженных клеток растения-хозяина на стадии споронашения // Микология и фотопатология. -1992. Т.26, вып. 3. - С. 224-228.242

62. Муромцев Г.С. Растворяющее действие некоторых корневых и почвенных микроорганизмов на водонерастворимые фосфаты кальция // Агробиология, 1958. - Т.113, N 5. - С. 9-14.

63. Муромцев Г.С. Регуляторы роста растений и урожай // Вестн. селькохо-зяйтвной науки.-1984.- Т.ЗЗ, N7.-C.75-83

64. Наумова А.Н. Влияние бактеризации семян на пораженность всходов яровой пшеницы грибными паразитами и на ее урожай // Микробиология. -1939.-Т.8, вып.2. -С.198-205.

65. Никонорова А.К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke // Микология и фитопатология. -1996. Т.30, N 5-6. - С. 69-74.

66. Новикова И.И., Иващенко В.Г., Калько Г.В., Бойкова И.В., Назаровская JI.A., Литвиненко А.И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса//Микол. и фитопатол. -1994. -T.28,N1. -С.70-75.

67. Новжава Л.М., Папоу Ф.А., Вельская C.I., Шабашова Т.Г. Возможность использования штамма бактерий Bacillus mycoides 683 для защиты картофеля и капусты от болезней // Весщ Акад. аграр. наук Беларусь -1994. -N1. -С. 89-92, 126.

68. Новогрудский Д.М. Антагонистические взаимоотношения у микробов и биологические методы борьбы с грибковыми заболеваниями культурных растений // Успехи современной биологии. -1936. -Т.5, вып.З, -С.509-536.

69. Новогрудский Д.М. Использование микробов в борьбе с грибковыми заболеваниями культурных растений // Известия АН СССР. -1936. -N1, -С. 277293.

70. Овсянникова E.H. Влияние корневой системы на активность фитогормо-нов в листьях огурцов // Гормонональная регуляция ростовых процессов. -М., Наука, 1985.- С.59-65.243

71. Оразова М.Х., Полянская Л.М., Звягинцев Д.Г. Гетерогенность корня как местообитания микроорганизмов // Микробиология. -1994. -Т.63, N4. -С.706-714.

72. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Азиз-бекян P.P. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus // VI Конф. РФ "Новые направления биотехнологии": Тез. докл. 24-26 мая, 1994. -Пушино, 1994. -С.35.

73. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Коваленко H.A., Антибактериальная активность Bacillus laterosporus // Биотехнология. -1995. -N1-2. -С.22-26.

74. Павар С.С., Клячко Н.Л., Романко Е.Г. Активация цитокинином синтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы// Физиол.раст.- 1983.- Т.ЗО, N3.- С.459-466.

75. Павлова В.Ф., Муромцев Г.С. Роль микроорганизмов в трансформации соединений фосфора в почве // Тр. ВНИИСХМ. 1980. - Т.49. - С. 37-47.

76. Пат. 2129375 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Биопрепарат фитоспорин жидкий для защиты растений от болезней / Ф.А.Байгузина, Г.А.Штроман, М.Я.Менликеев, М.М.Алсынбаев. Заявл. 30.03.1998; Опубл. 27.04.1999.

77. Пат. 2128915 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Способ получения препарата фитоспорин / Ф.А.Байгузина, Г.А.Штроман, М.М.Алсынбаев. Заявл. 30.03.1998; Опубл. 20.04.1999.244

78. Пат. 2128914 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Способ получения препарата фитоспорин / Ф.А.Байгузина, Г.А.Штроман. .Заявл. 30.03.1998; Опубл. 20.04.1999.

79. Пат. 2127976 Россия, МПК A01N63/00. Препарат против грибных фыто-патогенов / В А.Ипатьев, Д.А.Орехов, Я.И.Марченко, В.П.Тарасенко. Заявл. 04.05.1995; Опубл. 27.03.1999.

80. Пат. 2127520 Россия, МПК A01N63/00, С12Р1/04, С12Р21/00. Бревисин-сухой порошок из антигрибного антагониста бактерий Bacillus brevis. / В.А.Ипатьев, Д.А.Орехов, Я.И.Марченко, В.П.Тарасенко. Заявл. 04.05.1995; Опубл. 20.03.1999.

81. Пат. 2086128 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20 . Штамм бактерий Bacillus subtilis для получения препарата против грибных болезней растений / В.Г.Костровский, А.И.Леляк, Н.В.Ламанович, А.В.Варанд, В.Е.Репин. Заявл. 31.10.1995; Опубл. 10.08.1997.

82. Пат. 2084152 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для защиты растений от фитопатогенных бактерий / И.И.Новикова, Г.А.Быкова, М.Е.Сергеева, В.А.Павлюшин. Заявл. 10.10.1994; Опубл. 20.07.1997.

83. Пат. 2081167 Россия, МПК C12N1/20. Штамм бактерий Bacillus subtilis для получения препарата против фитопатогенных грибов / ИИ.Новикова, А.И.Литвиненко, Т.А.Нугманова, Г.В.Калько. Заявл. 08.04.1994; Опубл. 10.06.1997.

84. Пат. 2056855 Россия, МПК А61К35/74, C12N1/20. Способ получения препарата « Споробактерин « / Н.А.Михайлова, Т.Н.Кузнецова, А.Ш.Шаяхметов, О.В.Кунягина, Ф.А.Шаймухаметов. Заявл. 02.12.1991; Опубл. 27.03.1996.

85. Пат. 2032345 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Штамм бактерий Bacillus licheniformis для получения препарата против белой гнили подсолнечника / Л.В.Маслиенко, ОА.Лавриченко. Заявл. 03.07.1991; Опубл. 10.04.1995.

86. Пат. 2019966 Россия, МПК A01N63/00. Препарат для защиты растений от болезней / Н.Н.Галкина, А.И.Тур, Н.И.Дорогойченко, С.К.Жиглецова. Заявл. 24.07.1991; Опубл. 30.09.1994.

87. Пат. 603400124 ,США, МПК A01N047/28 Fungicidal toxins from biocon-trol bacteria / Handelsman Jo, Silo-Suh Laura, Clardy Jon, He Haiyin . Заявл. 16.12.1998; Опубл. 07.03.2000.

88. Пат. 6033659, США, МПК C12N001/20. Bacillus cereus strainW35 / Handelsman Jo, Stewart Sandra J, Stabb Eric V. Заявл. 27.05.1998; Опубл. 07.03.2000.

89. Пат. 6030610, США, МПК C12N001/20. Bacillus cereus strain Z8 / Han246delsman Jo, Stewart Sandra J, Stabb Eric V Заявл. 27.05.1998; Опубл. 29.02.2000.

90. Пат. 5998196 США, МПК C12N001/20. Disease suppression by novel Bacillus cereus strain soy 130 / Handelsrtian Jo, Stewart Sandra J, Stabb Eric V Заявл. 27.05.1998; Опубл. 07.12.1999.

91. Пат. 5994117 США, МПК C12N001/20. Use of Bacillus subtilis as an en-dophyte for the control of diseases caused by fungi / Bacon Charles W., Hinton Dorothy M. Заявл. 29.12.1995; Опубл. 30.11.1999.

92. Пат. 5869042 США, МПК A01N063/00. Methods for controlling above -ground plant diseases using antibiotic- producing bacillus sp. ATCC 55608 or 55609 / Marrone Pamela Gail, Heins Sherry D, Jimenez Desmond R. Заявл. 22.11.1996; Опубл. 09.02.1999.

93. Пат. 5830459 США, МПК C12N001/20. Effective plant biocontrol / Cuero Raul G, Osuji Godson О. Заявл. 17.04.1995; Опубл. 03.11.1998.

94. Пат. 5780080 США, МПК А23В7/10. Cabbages treated to control post-harvest diseases / Leifert Carlo, Epton Harold A.S., Sigee David С. Заявл. 27.03.1995; Опубл. 14.07.1998.

95. Пат. 5780023 США, МПК A01N63/00. Inhibiting plant pathogens with an antagonistic microorganism(s) / McLaughlin Randy J. , Wilson Charles L., Chalutz Edo. Заявл. 27.11.1996; Опубл. 14.07.1998.

96. Пат. 5762928 США, МПК C12N1/20. Biocontrol agent for green mold disease of mushrooms / Bolkan Hasan, Larsen Dennis J. Заявл. 05.06.1997; Опубл. 09.06.1998.

97. Пат. 5736382 США, МПК C12N1/20. Bacillus cereus strain DGA34 /247

98. Handelsman Jo., Jacobson Lynn M., Stabb Eric V. Заявл. 06.06.1995; Опубл. 07.04.1998.

99. Пат. 57333,55 США, МПК С05 Fll/08 . Bacterial Preparation for agricultural use / Hibino Susumu, Minami Zenrou. Заявл. 05.12.1996; Опубл. 31.03.1998.

100. Пат. 5702701 США, МПК C12N1/20. Treatment of soil and plants with a composition containing Bacillus laterosporus / 0»Donnell Boyd. Заявл. 07.06.1995; Опубл. 30.12.1997.

101. Пат. 5679560 США, МПК C12N 9/00. Genes for the synthesis of antipathogenic substances / Ligon James M., Hill Dwight Steven, Lam Stephen Ting, Hammer Philip E. Заявл. 01.06.1995; Опубл. 21.10.1997.

102. Пат. 5670368 США, МПК АО IN 3/00. Inhibiting plant pathogens with an antagonistic microorganism(s) / McLaughlin Randy J., Wilson Charles L., Chalutz Edo. Заявл. 29.08.1994; Опубл. 23.09.1997.

103. Пат. 5665354 США, МПК А61К 35/74. Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi / Neyra Carlos A., Sadasivan Lakshmi. Заявл. 26.05.1995; Опубл. 09.09.1997.

104. Пат. 5618692 США, МПК С07Н 21/04. Zwittermicin resistance gene and biocontrol bacteria with the gene / Handelsman Jo., Milner Jocelyn L., Stohl Elizabeth A., Stewart Sandra J.,Stabb Eric . Заявл. 12.09.1994, Опубл. 08.04.1997.

105. Пат. 5597565 США, МПК А61К 35/00. Antibiotics for biological control of post harvest diseases / Leifert Cario, Epton Harold A.S., Sigee David С. Заявл.2482703.1995; Опубл. 2806.1997.

106. Пат. 5589381 США, МПК C12N 1/20. Bacillus licheniformis producing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi / Neyra Carlos A., Sadasivan Lakshmi. Заявл. 30.06.1994; Опубл. 31.12.1996.

107. Пат. 5552138 США, МПК C12N 1/20. Bacillus cereus strain AS4-12 / Handelsman Jo., Jacobson Lynn M., Johnson David W., Smith Kevin P., Goodman Robert M., Stabb Eric V. Заявл. 06.06.1995; Опубл. 03.09.1996.

108. Пат. 5413783 США, МПК C12N 1/16. Inhibiting plant pathogens with an antagonistic microorganism(s). / McLaughlin Randy J., Wilson Charles L., Chalutz Edo. Заявл. 18.08.1989; Опубл. 09.05.1995.

109. Пат. 5364788 США, МПК A01N 63/00. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418 / Kubo Kazuhiro. Заявл. 30.06.1992; Опубл. 15.11.1994.

110. Пат. 5260608 США, МКИ 5 A01N 63/00, C12N 1/38. Fungicidal composition comprising chitinase and Enterobacter cloacae, and a method for stimulation proliferation of E. cloacae / Harman G.E., Lorito M., Hayes C.K. Заявл. 03.02.1993; Опубл. 01.11.1994.

111. Пат. 5215747 США, МПК АО IN 63/00. Composition and method for protecting plants from phytopathogenic fungi./Hairston William G., Arthur Karen S., Rosa Fred С. Заявл. 07.02.1992; Опубл.01.061993.

112. Пат. 5049379 США, МПК АО IN 0/00. Fungicidal toxin and method and inoculum for controlling root rot and damping off./ Handelsman Jo, Halverson Larry J., Balandyk Philip J. Заявл. 16.05.1988; Опубл. 17.09.1991.

113. Пат. 4940840 США, МПК А01Н 1/04. Novel chitinase-producing bacteria and plants/ Suslow Trevor V., Jones Jonathan D.G. Заявл. 18.08.1986; Опубл. 10.08.1990.

114. Пат. 4878936 США, МПК C05F 11/08. Method to enhance root nodulation in legumes and inoculum preparation therefor/ Handelsman Jo E., Halverson Larry J. Заявл. 27.08.1987; Опубл. 07.11.1989.

115. Пат. 4877738 США, МПК C12R 1/07. Biological control of damping off and root rot and inoculum preparation therefor/ Handelsman Jo, Mester Ellen H., Wunderlich Lynn. Заявл. 25.08.1986; Опубл. 31.10.1989.249

116. Пат. 4863747 США, МПК С23К 1/00. Bacterial treatment to preserve hay quality by addition of microorganisms of the genus Bacillus/ Tomes Nancy J. Заявл. 07.03.1988; Опубл. 05.09.1989.

117. Пат. 4764371 США, МПК А61К 39/07. Postharvest biological control of stone fruit brown rot by bacillus subtilis/ Pusey Paul L., Wilson Charles L. Заявл. 13.11.1985; Опубл. 16.07.1988.

118. Пат. 4663162 США, МПК А61К 39/07. Method of using Bacillus polymyxa 9A to protect plants against verticillium wilt/ Kado Clarence I., Schanthorst William C., AzadHamidR. Заявл. 14.03.1984; Опубл. 05.05.1987.

119. Пат. 4250170 США, МПК А61К 31/71. Antibacterial agents Bu-2349A and В and method of using same/ Kawaguchi Hiroshi, Konishi Masataka, Tsuno Takashi, Miyaki Takeo. Заявл. 11.07.1979; Опубл. 10.02.1981.

120. Пат. 4061488 США, МПК A01N 21/02. Plant treating mixtures and methods utilizing spores of Bacillus uniflagellatus/ Mann Elton W. Заявл. 18.09.1973; Опубл. 06.12.1977.

121. Пат. 4534965 США, МПК A01N 63/00. Controlling plant fungi using streptomycetes grown on chitin / Lewis R.Brown, Susan Brown-Skrobot. Заявл. 26.09.1983; Опубл. 13.08.1985.

122. Пат. 2048509A2 Япония, МПК A01N 63/00. Method for controlling plant disease injury by KF-44 strain belonging to genus Bacillus / Omori Kaoru, Suyama Kazuo, Negishi Hiromitsu, Fujii Itaru. Заявл.09.08.1988; Опубл. 19.02.1990.

123. Пат. 2101005A2 Япония, МПК АО IN 63/00. Control of Rhizoctonia large patch / Asumi Kenji, Ikenata Michihito. Заявл. 08.10.1988; Опубл. 12.04.1990.

124. Пат. 5051305A2 Япония, МПК АО IN 63/00. Method for controlling disease injury of plant with SC-3 strain belonging to genus Bacillus / Fushimi Susumu , Okada Akihiko. Заявл. 26.08.1991; Опубл. 02.03.1993.

125. Пат. 5146289A2 Япония , МПК C12N 1/20. New bacillus microorganism250and its use / Kubo Kazuhiro, Iizuka Takeshi. Заявл. 08.01.1992; Опубл. 15.06.1993.

126. Пат.8169804А2 Япония, МПК A01N 63/00. Disease injury controlling agent by Rhizoctonia bacterium/ Yamaguchi Kazuo, Tsubaki Kazuo. Заявл. 10.08.1995; 0публ.02.07.1996.

127. Пат.8175919А2 Япония, МПК АО IN 63/00. Sporal fraction of genus Bacillus and method for controlling plant disease and injury utilizing the same sporal fraction/ Kamata Shinji, Kawane Futoshi, Mochizuki Masarni. Заявл.20.12.1994; 0публ.09.07.1996.

128. Пат.9224655А2 Япония, МПК C12N 1/20. Disease injury-controlling microorganism and disease injury control using the same/ Kinooka Yuzo, Noguchi Katsunori. Заявл. 26.02.1996; Опубл. 02.09.1997.

129. Пат. 11049621A2 Япония, МПК A01N 63/00. Storage material for sowing plant seed and plant culture/ Matsuzaki Katsuhiko, Suzuki Genshi. Заявл. 01.08.1997; Опубл. 23.02.1999.

130. Пат. 11246324A2 Япония, МПК A01N 63/02. Plant disease-controlling agent and method thereof/ Yoshida Shigenobu, Shirata Akira, Tsukamoto Yoshitaka, Murakami Ritsuko. Заявл. 06.03.1998; Опубл. 14.09.1999.

131. Пат. 9850422A1 WIPO, МПК C07K 7/06. A novel strain of Bacillus for controlling plant diseases and corn rootworm/ Heins Sherry Darlene, Manker Denise Carol, Jimenez Desmond Rito, McCoy Randy Jay, Orjala Jimmy Eniso. Заявл. 08.05.1998; Опубл. 12.11.1998.

132. Пат. 9821968A1 WIPO, МПК A01N 63/02. Antibiotic-producing strain of Bacillus and methods for controlling plant diseases/ Marrone Pamela Gail, Heins251

133. Sherry D., Manker Denise С., Jimenez Desmond R. Заявл. 18.11.1997; Опубл. 28.05.1998.

134. Пат. 9727754А1 WIPO, МПК АО IN 63/00. Methods and compositions for the simultaneous control of rootdiseases/ Cook R.James, Weiler David M., Kim Dal-Soo, ThomashowLinda S. Заявл. 03.02.1997; 0публ.07.08.1997.

135. Пат. 9702749A1 WIPO, МПК AO IN 63/00. Bacillus licheniformis produsing antifungal agents and uses thereof for control of phytopathogenic fungi/ Neyra Carlos A., Sadasivan Lakshmi. Заявл. 07.07.1995; Опубл. 30.01.1997.

136. Полевой В.В. Фитогормоны. JL-: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982.- 249 с.

137. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. -М.: Изд-во МГУ, 1976. -307с.

138. Салишев Л.И., Бахтизин Н.Р., Рамазанов Р.Я., и др. Минимальная обработка и воспроизводство плодородия типичного чернозема. Уфа, 1993. - 120 с.

139. Сафиязов Ж., Шукри Мохамед Эль Греми, Саттарова Р.К. Действие антагонистов на фитопатогенные бактерии // Узб. Биол. журн. -1991. N1, -С.17-20.

140. Синицин А.П., Черноглазов В.М., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. М., 1993. - 152 с. - (Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология; Т. 25).244

141. Пат. 2128914 Россия, МПК A01N63/00, C12N1/20. Способ получения препарата фитоспорин / Ф.А.Байгузина, Г.А.Штроман. Заявл. 30.03.1998; Опубл. 20.04.1999.

142. Пат. 2127976 Россия, МПК A01N63/00. Препарат против грибных фыто-патогенов / В.А.Ипатьев, Д.А.Орехов, Я.И.Марченко, В.П.Тарасенко. Заявл. 04.05.1995; Опубл. 27.03.1999.

143. Пат. 2127520 Россия, МПК A01N63/00, С12Р1/04, С12Р21/00. Бревисин-сухой порошок из антигрибного антагониста бактерий Bacillus brevis. / В.А.Ипатьев, Д.А.Орехов, Я.И.Марченко, ВЛ.Тарасенко. Заявл. 04.05.1995; Опубл. 20.03.1999.

144. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Изд-во МГУ, 1984. - 26 с.

145. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С. Хитиназы аэробных спорообра-зующих бактерий, выделенных из различных экологических источников // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, N 6. - С. 16-22.

146. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ. Киев: Наукова думка, 1982.-280 с.

147. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. Методические рекомендации по идентификации бактерий рода Bacillus, выделенных из организма человека и животных,- Киев : Наукова думка, 1982.- 56 с.

148. Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Ганушкина JI.A., Кузнецова Н.И., Миненкова И.Б., Николаенко М.А., Азизбекян Р.Р. Штамм Bacillus laterosporus с множественной биологической активностью // Биотехнология. -1993. -N9. -С. 11-15.

149. Список химических и биологических средств борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками и регуляторов роста растений, разрешенных для применения в сельском хозяйстве на 1986-1990 гг. -М., 1987.- 204 с.

150. Степанова Н.Ю. Род фузариум ( Fusarium ) // Жизнь растений: В 6 т.- М., 1976.-Т.2.-С. 409-413.

151. Сэги Й. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983. - 296 с.

152. Тен Хак Мун, Чухлебова JIM., Меженная JI.B. Способы стерилизации253почвы закрытого грунта // « Микроорганизмы в сельском хозяйстве «: Тез. докл. 4 Всес. науч. конф., Пущино, 20-24 янв., 1992. Пущино, 1992. - С. 194195.

153. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1972. - 200 с.

154. Тесленко А .Я., Попов В.Г. Хитин и его производные в биотехнологии. -М., 1982. 40 с. -(Получение и применение ферментов, витаминов и аминокислот; Вып. 3).

155. Тиунова H.A. Хитинолитические ферменты микроорганизмов // Успехи биол. химии. 1989. - Т. 30. - С. 199-219.

156. Трачук JI.А., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Хитиназы Bacillus cereus: выделение и характеристика // Биохимия. 1996. - Т. 61, вып. 2. - С. 357-368.

157. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация в биогеоценозах // Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза.- М.Д984.-С. 185-199.

158. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во МГУ, 1986. - 136с.

159. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская A.C. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства. // Микробиология. 1995. - Т. 64, N 1. - С. 27-31.

160. Филипчук О.Д., Плотникова Т.В., Ярошенко В.А., Вяткина И.Г. Биологическая защита от болезней // Защита растений. -1995. -N8. -С. 18-19.

161. Фитоспорин // Защита и карантин растений. -1998. -N8. -С. 28.

162. Хеймен Д.С. Участие микрооргнизмов и корней растений в круговороте фосфора// Почвенная микробиология: Сб. науч. тр. М., 1978. - С. 90-119.

163. Худяков Я.П. Литическое действие почвенных бактерий на почвенные254грибы // Микробиология. -1935, -Т.4, вып.2. -С.193-203.

164. Чайлахян М.Х. Регуляция цветения высших растений.- М.:Наука, 1988.560с.

165. Чернядьев И.И. Фотосинтез и цитокинины // Прикл. биохимия и микро-биол.- 1993.- Т.29, вып.5.- С.644-673.

166. Шакирова Ф.М., Конрад К., Клячко H.JL, Кулаева О.Н. Связь между действием цитокинина на рост изолированных семядолей тыквы и синтезом в них РНК и белка // Физиол. раст.- 1982.- Т.29, N1.- С.52-61.

167. Шарга Б.М., Туряница А.И., Вьюницкая В.А. Антагонистическая активность споровых бактерий по отношению к некоторым представителям рода Ег-winia.// Микробиол. журн. -1994. -Т.56, N1. -С.1-25.

168. Шенин Ю.Д., Кругликова Л.Ф., Калько Т.Н., Новикова И.И. Характеристика алирина Bi основного компонента фунгицидного препарата, продуцируемого штаммом Bacillus subtilis 10-ВИЗР // Антибиотики и химиотерапия. -1995. -Т.40, N5. - С.3-7.

169. Яблоков А.В. Об отрицательных последствиях применения пестицидов // Сельскохозяйственая биология.- 1988.- N3.- С. 99-105

170. Ямалеев A.M., Яруллин Л.Г., Шакирова Ф.М. и др. Влияние байтана на содержание индолилуксусной и абсцизной кислот в растениях пшеницы при заражении корневыми гнилями // Физиология растений.- 1989, Т.36, вып. 2.-С.З 99-403.

171. Akiyoshi D.E., Regier D.A., Gordon М.Р. Cytokinin production by Agrobacte-rium and Pseudomonas spp. // J. Bacteriol. -1987. Vol.169,N 9. - P.4242-4248.

172. Aldrich J., Baker R. Biological control of Fusarium roseum sp.dianthii by Bacillus subtilis // Plant Disease Reporter. 1970. - Vol. 54. - P. 446-448.

173. Alten H.V., Schonbeck F. Zur Ifektiositat von Uromyces phaseoli-Uredosporen von induziert resistenten Wirtsplanzen // Z.Pflanzenkrnkh. 1985. -Bd. 92, N 4. -P.376-391.

174. Anderson L.E., Coffey G.L., Senos G.D., Underhill M.A., Vogler D.L., Ehrlich J. Butirosin, a new aminoglycoside antibiotic complex. Bacterial origin and some microbiological properties // Antimicrob. Agents Chemoter. 1972. -Vol.2. -P.79-83.

175. Armstrong D., Burrows W., Skoog F. Cytokinin in transfer RNA species of Escherichia colill Proc. Nat. Acad. Sei. USA.- 1969.- Vol.63. -P.834-841.

176. Armstrong D.J., Scarbough E., Skoog F., D.L., Leonard N.J. Cytokinins in Corynebacterium fascians cultures. Isolation and identification of 6-(4-hydroxy-3-methyl-cis-2-butenyl-amino)-2 -methylthio-purine // Plant Phisiol.- 1976.- Vol. 58.-P.749-752.

177. Arshad M., Frankenberger W. Microbial production of plant hormones // Plant and Soil. -1991.- Vol.133.-P.l-8.

178. Aung L.H. Action of cytokinins and anticytokinins on cotyledonary bud growth of Lycopersicum esculentum Mill // Biol. Plant.- 1986.- Vol. 28, N6.- P. 407411.

179. Azcon R., Barea J. Synthesis of auxins, gibberellins. and cytokinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter bijerinkii related to effects produced on tomato plants // Planta Soil.- 1975.- Vol. 43.- P. 609.

180. Babad J., Pinsky A., Turner-Graff R., Sharon N. An antifungal polypeptide produced by Bacillus subtilis //Nature. 1952. -Vol. 170. - P. 618-619

181. Backhouse D., Stewart A. Ultrastructure of antagonism of Sclerotium cepivorum by Bacillus subtilis // J.Phytopathol. 1989. - Vol. 124. - P. 207-214

182. Backhouse D., Stewart A . Interactions between Bacillus species and sclerotia of Sclerotium cepivorum // Soil. Biol, and Biochem. 1989. - Vol. 21, N 1. - P. 173176.256

183. Badel J., Kelemu S. In vitro inhibition of Colletotrichum gloeosporioides Penz and other phytopathogenic fungi through culture filtrates of Bacillus subtilis // Fitopatologia Colombiana.- 1994.-Vol. 18,-P. 30-35.

184. Bagnoli P.G.G., Filippi C. Influenza della carica di Bacillus subtilis M51 nella rizosfera di garofano e sulla durata dell' effetto protettivo verso Fusa-rium oxysporumf.sp.dianthi // Dif. piante. 1985. - Vol.8, N 2. - P. 107-113.

185. Bajpai P.D., SundaraRao W.V.B. // Soil Science. 1971. - Vol.17, N2. - P.4145.

186. Baker C. J., Stavely J.R. Control of bean rust with Bacillus subtilis : Пат. 4582704, США. Заяв. 14.03.84.- N 539907, Опубл. 15.04.86

187. Baker C.J., Stavely J.R., Thomas C.A., Sasser M., MacFall J.S. Inhibitory effect of Bacillus subtilis on Uromyces phaseoli and on development of rust pustules on bean leaves // Phytopathology. 1983. - Vol. 83, N 8. - P. 1148-1152.

188. Bamberg R.H. A bacterium antibiotic to Ustilago zeae. // Phytopathology. -1930. -Vol.20.-P.140 цит. по Новогрудский, 1936.

189. Bamberg R.H, Bacteria antibiotic toUstilago zeae // Phytopathology. -1931. -Vol.21. -P.881 цит. по Новогрудский, 1936.

190. Banik S., Datta M. Effect of inoculation of a phosphat-solubilizing phytohor-mohe producing Bacillus firmus on the growth and yield of soybean (Glicine max), grown in acid soil of Nagaland // Zbl. Mikrobiol. -1988. Vol.143, N2. - P.139-147.

191. Barea J.M., Brown M.E. Effects of plant growth produced by Azotobacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances // J. Appl. Bacteriol.- 1974.- Vol. 40.- P. 583-599.

192. Bashan Y. Migration of the rhizosphere bacteria Azospirillium brasilense and Pseudomonas fluorescens toward wheat roots // J. Cen. Microbial. 1986. - N 132. -P. 3407-4314.

193. Bassett E.N., Cook R.J., Weller D.M. Effecacy of bacterial seed treatments for control of take-all of wheat // Biological and Cultural Tests Control of Plant Diseases. 1987.-Vol. 2.-P. 47.

194. Bassi N.V., Mok D.W.S., Mok M.C. Partial purification of cis-trans-isomerase257of zeatin from immature seed of Phaseolus vulgaris L.// Plant Physiol.- 1993.-Vol.102.- P.867-872.

195. Bell R.G. Preparative high-performance liquid chromatographic separation and isolation of bacitracin components and their relationship to microbiologycal activity // J. Chromatogr. -1992. -Vol.59, N1.- P.165-168.

196. Benko R. Bacterije kot moznost bioloske zascitelesa pred modrenjem // Les ( SERJ ) . 1998. - Vol.40, N 1-2. - P. 21-24.

197. Beranek I., Beranek J. Prostredek к preventivni ochrane semen rostlin a jejich nadzemnich casti s fungistatickym a fungicidnim ucinkem : A.C. 262504 ЧССР, 3a-яв. 19.06.87.-N4532-87k; Опубл. 14.07.89

198. Berdy J. Recent developments of antibiotic research and classification of antibiotics according to chemical structure // Adv. Appl. Microbiol. 1974. -Vol.18. -. P.309-406.

199. Berg G. Rhizobacteria of oilseed rape antagonistic to Verticillium dahliae var. longisporum STARK // Zeitschrift fuer Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz.-1996.-Vol. 103.- P. 20-30.

200. Berg G., Ballin G. Bacterial antagonists to Verticillium dahliae Kleb. // J. Phytopathol. 1994. - Vol. 141, N 1. - P. 99-110.

201. Bergey s manual of sistematic bacteriology.- Baltimore : Williams and Wilkins Co., 1986.-P. 1104-1141

202. Besson F., Pzypoux F., Michel G., Delcambe L. Characterization of iturin A in antibiotics from varions strains of Bacillus subtilis // J. Antibiotics. 1976. - Vol.29. -P. 1043-1049.

203. Bettiol W., Kimati H. Selecao de microorganismos antagonikos a Pyricularia oryzae para o controle da Brusone do arroz // Summa phytopathol. 1990. - Vol. 15, N 3/4 .-P. 257-266.

204. Bhattacwaryya В., Purkayastha R.P. Isolation , characterization and biological activities of a toxin from Bacillus megaterium( B-23) // Indian J. Exp .Biol. 1989. -V. 27, N12.-P. 1050-1063.

205. Biddington N.L., Thomas Т.Н. A modified Amaranthus betacyanin bioassay for the rapid idetermination of cytokinins in plant extracts// Planta.- 1973,- Vol. Ill,2581. Nl.-P. 183-186.

206. Blagoeva- Nikolaeva V., Slavov S., Varsano L. Possibilities for biological control of black-shank disease in tobacco with Bacillus cereus // Biotechnol. and Biotechnol. Eq. 1995.-N 1.- P. 36-39.

207. Binns A.N. Cytokinins accumulation and action: biochemical, Genetic and Molecular approaches// Annu. Rev. Plant Physiol.- 1994.- Vol.45.- P.173-196.

208. Blondeau R. Nature d'une cytokinine presente dans les cultures de certains Arthrobacter//CR.Acad.Scl 1974.- Vol.D.297.- P. 1571- 1574.

209. Blondeau R. Contribution a l'etude au niveau de la rhisosphere // These doct. sei. nat. Lill.- Univ.Soet.Techn. 1985.- P. 212-215.

210. Bochow H. Possibilities of protecting plant roots against phytopathogens by biological means ( biological control ) // Proc. Int. Symp. « Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil «, 22-27 June, 1987. Praha, 1989. - P. 357-370.

211. Bochow H. Nutzung mikrobieller Antagonisten im biologischen Pflanzenschutz gegen pilzliche Wurzel und Welkeerkrankungen bei der Produktion von Gemüse und Zierpflanzen in Gewächshäusern . - Berlin : Gartenbau, 1989. - 3401. P

212. Bochow H. Biologischer Pflanzenschutz im Gartenbau : Nutzung von Biotechologie // Wiss. Z. Humboldt- Univ. Berlin. R. Agrarwiss. 1990. - Vol. 39, N2 . -P.159-164.

213. Bochow H. Phytosanitary effects of Bacillus subtilis as biocontrol agent // Meded. Jac. landbouwwetensch. 1992. - Vol.57, N 2B. - P. 387-393.

214. Bochow H., Hentscher K-D., Jacob M. Möglichkeiten und Wege zur biologischen Bekämpfung phytopathogener Bodenpilze durch Nutzung microbieller Antagonisten // Wiss. Z. Humboldt- Univ. Berlin. R. Agrarwiss. 1988. - Vol.37,N 2.-P. 168-176.

215. Bowen G.D., Rovira A.D. Microbial colonization of plant'// Ann. Rev. Phyto-pathol. 1976. - Vol.14. - P. 121-144.

216. Bowen G.D. Integrated and experimented approaches to the stady of growth of organisms araund roots // Schippers B., Gams W. Soilborn Plant Pathogens. -London, 1979. P. 207-227.

217. Broadbent P., Baker K.F., Waterworth Y. Bacteria and actinomycetes antagonistic to fungal root pathogens in Australian soils // Anst. J. Biol. Scii. 1971. -Vol. 24, N5.-P. 925-944.

218. Broadbent P., Baker K.F., Franks N., Holland J. Effect of Bacillus spp. on increased growth of seedlings in steamed and in nontreated soil // Phytopathology. -1977. Vol. 67, N 12. - P. 1027-1034.

219. Broadfoot W.C. Stadies on footrot of wheat. I Effect of age of the wheat plant upon the development of foot and root rot // Canad. J. Research, -1933a. -Vol.8. -P.483 uht. no HoBorpyßCKHfi, 1936.

220. Broadfoot W.C. Stadies on footrot of wheat. II Cultural relationships on solid media of certain microorganisms in association with a Ophiobolus graminis Jacc. // Canad. J. Research, -19336. -Vol.8.- P.545 mrr. no HoBorpy^ckhh, 1936.

221. Brown M.E. Seed and Root Bacterization // Annual Review of Phytopathology. 1974a. - Vol.12. - P. 181-197.

222. Brown M.E. // Annual Review of Phytopathology. 1974. - Vol.12. - P. 311331

223. Brown S.M., Kepner J.L., Smart G.C. Jr. Increased crop yields following applications of Bacillus penetrans to field plots infested with Meloidogyne incognita // Soil Biol. Biochem. 1985. -Vol. 17. - P.483-486.

224. Burachik M., Leardini N.A., Paladini A.C. Three antifungal polypeptides from Bacillus subtilis // Experientia. -1964. Vol. 20. - P. 504-505.260

225. Burch L.R., Horgan R. The purification of cytokinins oxidase from Zea mays kernels// Phytochemistry.- 1989.- Vol.28.-P.1313 -1319.

226. Buysens S., Scheffer R.J. Screening systems for bio-control and growth promotion // Pap. New Approaches Biol. Contr. Soil-Borne Diseases : Workshop, Copenhagen, 30 June-4 July, 1991.-IOBC / WPRS Bulletin. 1992. - Vol.15, N 1.145-146.

227. Campbell R., Clor A. Soil moisture affects the interaction between Gaeumannomyces graminis var. tritici and antagonistic bacteria // Soil Biol, and Biochem. 1985.- Vol.17, N 4. - P. 441-446.

228. Campbell R. The seach for biological control agents against plant patogens : a pragmatic approach // Biol. Agr. and Hort.- 1986.- 3, N 2-3.- P. 317-327

229. Capper A.L:, Campbell R. The effect of artificially inoculated antagonistic bacteria on the prevalence of take-all disease of wheat in field experiments // J. Appl. Bacterid. 1986. - Vol.60. - P. 155-160.

230. Chakraborty S., Bhowmink T.P. Chemical and biological control of sunflower collar root caused by Sclerotium rolfsii Sacc. // Pesticides. 1985. - Vol. 2, N 2. - 3133,38.

231. Chambers S.C., Millingtons J.R. Stadies on Fusarium species associated with a field planting of « pathogen-tested» potatoes // Austral. J. Agr. Res. 1974. - Vol. 25, N 2. - P. 293-297.

232. Chang I., Kommedahl T. Biological control of seedling blight of corn by coating kernels with antagonistic microorganisms // Phytopathology. 1968. -Vol.58,N 10.-P. 1395-1401.

233. Chanway C.P., Nelson L.M., Holl F.B. Cultivar-specific growth promotion of spring wheat ( Triticum aestivum L.) by coexistent Bacillus species // Can.J. Microbiol. 1988. - Vol. 34, N 7. - P.925-929.

234. Chanway C.P., Nelson L.M. Field and laboratory studies of Triticum aesti-vum L. inoculated with coexistent growth-promoting Bacillus strains // Soil Biol, and Biochem. 1990. - V.22, N 6. - P. 789-795.

235. Chao W.I., Nelson E.B., Harman G.E., Hoch H.C. Colonization of the rhizosphere by biological control agents applied to seeds // Phytopathology. 1986.2611. Vol.76, N1.-P. 60-65.

236. Chatfíeld J.M., Armstrong D.J. Regulation of cytokinin oxidase activity in callus tissues of Phaseolus vulgaris L. cv Great Northern // Plant Physiol.- 1986.-Vol.80.-P.493-499.

237. Chattopadhyay J.P., Bose S.K. Control of plant infections by antibiotics and antagonistic organisms // Process Biochemistry. 1980. - Vol. 15, N 5. - P. 27-28.

238. Chazanfari J., Gough F.J. Redused growth, ascocarp production, and infection of wheat by Pyrenophora trichostoma caused by microorganisms // Phytopathology.-1981.- Vol.71.- P. 876

239. Chen C.-M., Ertl J.R., Leisner S., Chang C.-C. Localization of cytokinin biosynthesis sites in pea plants and carrot roots // Plant Physiol.- 1985.- Vol.78.-P.510-513.

240. Chen B., Jir P., Mei R. Observation of hormones produced by yield increasing bacteria (YIB) 6th Int. Symp. Microb. Ecol. (ISME-6), Barselona, 6-11 Sept., 1992.: Abstr.- P. 258.

241. Cherayil J.D., Lipsett M.N. Zeatin ribonucleosides in trañfer ribonucleic acid of Rhizobium leguminosarum, Agrobacterium tumefaciens, Corynebacterium fas-cians, and Erwinia amilofora // J. Bacteriol. -1977. Vol.131, N 3. - P.741-744.

242. Chet I., Inbar J. Biological control of fungal pathogens // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 48, № 1. - P. 37-43.

243. Chitinase for biopesticide applications II Bioprocess. Technol. 1989. - Vol. 11,N12.-P. 3.

244. Chmara H. Woynarowska B., Borowski E. // J.Antibiot. 1981.Vol.34, N12. P.1608-1612.

245. Ciampi-Panno L., Fernandez C., Bustamante P. Biological control of bacteria wilt of potatoes caused by Pseudomonas solanacearum // Am. Potato J. 1989. - Vol. 66,N5. -P. 315-332.

246. Citernesi A.S., Filippi C., Bagnoli G., Giovannetti M. Effects of the antimycotic molecule Iturin A2, selected by Bacillus subtilis strain M51, on arbuscular mycorrhizal fungi // Microbiol. Res. 1994. - Vol.149, N 3. - P. 241-246.

247. Clark B.I., Reeder R.B., Ownley B.H. Evaluation of Bacillus and Pseudomonas262isolates from Tennessee soil for biological control of take-all // Phytopathology. -1995. Vol. 85, N 10. - P. 1191.

248. Cook R J., Baker K.F. The nature and practice of biological control of plant pathogens // American Phytopathol. Soc.: St. Paul, Minn., 1983.

249. Coppolla S., Giannattasio H. Activita citockinica in un actimicete rizosherico // Boll. Sci. Ital. Biol. Sper. 1968.- Vol. 44.- P. 1913-1915.

250. Costerton J.W., Irvin R.T., Cheng K.-J. The Bacterial Glycocalyx in Nature and Disease // Ann. Rev. Microbiol. 1981. - Vol.35. - P. 299.

251. Cruz C. M. A. P., Kimati H„ Pereira G.T. Mecanismos de aruacao de antagonistas selecionados para o controle biologico da ferrugem do feijoeiro ( Uromyces phaseoli (Reben.) Wint.) // Cientifica. 1994. - Vol. 22, N 2. - 163-175.

252. Cserhati Z., Sule S. Biologiai vedekezes a malna dyoxkergolyvaja ellen Nigrad megyben // Noveny-vedelem. 1977. - Vol. 13, N 8. - P. 368-369.

253. Cubeta M.A., Hartman G.L., Sinelar J. Interaction between Bacillus subtilis and fungi associated with soybean seeds // Plant Disease. 1985. - Vol. 69. - P. 506509.

254. Cuero R.G., Duffus E., Osuji G., Pettit R. Aflatoxin control in preharvest maize: Effects of chitosan and two microbial agents // L. Agr. Sci. -1991. Vol. 117, N2.-P. 165-169.

255. Davison J. Plsnt Benificial Bacteria // Biotechnology. 1988. - Vol.6, N 3. - P.282.

256. Deacon J.W. Rhizosphere constrainst affecting biocontrol organisms applied to seeds Proc. Symp. Brit. Crop Prot. Counc.: «Seed Treat.: Prog, and Prospects», 5-7 Jan., 1994, Canterbury. Farnham, 1994. - P. 315-326.

257. Debono M., Gordee R.S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development // Annu. Rev. Microbiol. 1994. - Vol. 48. - P. 471 -497.

258. Dijkstra A.F., Scholten G.H.N., Veen J.A. Colonization of wheat seedling263

259. Triticum aestivum) roots by Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis // Biology and Fertility of Soil. 1987. - Vol.4. - P. 41-46.

260. Doherty M.A., Preece T.F. Bacillus cereus prevents germination of uredospores of Puccinia allii and the development of rust disease of leek, Allium porrum, in controlled environments // Physiological Plant Pathology.-1978.-Vol. 12. -P. 123-132.

261. Dunleavy I. Control of damping-off of sugarbeet by Bacillus subtilis // Phytopathology. 1955. - № 45. - P. 252-258.

262. Eberle J., Wang T.L., Cook S., Wellse B., Weiler E.W. Immunoassey and ultrastructural localization of isopentenyladenine and related cytokinins using monoclonal antibobies // Planta.- 1987.- Vol. 172, N2.- P.289-297.

263. Effat L., Barakat F.M., Osman A.R., El-Khaleely M.I. Antagonism between phylosphere bacteria and Actinomycetes and Ulocladium botritis Preuss., cousing tomato leaf spot // Egypt. J. Phytopathol. -1985(1986). -Vol 17, N 1. -P. 15-22.

264. Einset J.W., Skoog F.K. Isolation and identification of ribozil-cis-zeatin from transfer RNA OF Corynebacterium fascians // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1977.-Vol.79.-P.l 117-1121.

265. El-Aassar S., Ghanem K., Sabrys A., Ghanem N. Purification and characterization of chitinases produced by Bacillus amyloliquefaciens // Bioseparation. 1992. - Vol. 3, N1. - P. 37-46.

266. Endo A., Misato T. A competitive inhibitor of UDP-N-acetylglycosamine: chi-tin-N-acetilglucosamine transferase in Neurospora crassa // Biophis. Res. Commun. -1968. -Vol.37. -P.718-722.

267. Entwistle A.R. Opportunities for the microbial control of Allium white rot // Bull. OEPP .- 1988. Vol. 18, N 1. - 19-28.

268. Evans M.L. Function of hormones at the cellular level of organisation // Hormonal regulation of development, 1984. P.- 23-79264

269. Falconi C., Mendgen K. Inhibition of postharvest pathogens by epiphytic bacteria isolated from Malus comunis c. v. Golden Delicious // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin- Dahlem. 1990. -N 266. - P. 336.

270. Falkhof A.-G., Dehne H.-W., Schonbeck F. Dependence of the effectiveness of induced resistans of environmental conditions // J.Phytopathology. 1988. - Vol. 123, N4.-311-321.

271. Faull J., Campbell R. Ultrastructure of the interaction between the take-all fungus and antagonistic bacteria // Can. J. Bot. 1979. - N57. - P. 1808-1820.

272. Ferreira J.H.S., Matthee F.N., Thomas A.C. Biological control of Eutypa lata on grapevine by an antagonistic strain of Bacillus subtilis // Phytopathology. 1991. -Vol. 81, N3.-P. 283-287.

273. Fiddaman P J., Rossall S. Selection of bacterial antagonists for the biological control of Rhizoctonia solani in oilseed rape (Braddica napus) // Plant Pathol. 1995.-Vol.44, N 4. - P. 695-703.

274. Flannigan B. Microflora of barley and malt in // Brewing Microbiology.- El-sevies, London. 1987. - P. 83-120.

275. Foster R.C., Rovira A.D. Ultrastructure of wheat rhizosphere // New. Phytol. 1976.-N2.- P. 343-352.265

276. Foster R.C., Rovira A.D., Cock T.W. Ultrastructure of Root-Soil Interface // St. Paul, Minnesota: The American Phutopathol. Soc. 1983. - 157 p.

277. Fravel D.R. Role of antibiosis in the biocontrol of plant disenses // Ann. Rev. Phytopathol.- 1988.- 26.- P. 75-91

278. Fravel D.R., Spur H.W. Biocontrol of tobacco brown-spot disease by Bacillus cereus subsp. mycoides in controlled eniveronment // Phytopathology. 1977. - Vol. 67. - P. 930-932.

279. Freitas J.R. de, Germida J. J. Plant growth promoting rhizobacteria for winter wheat // Can. J. Microbiol. 1990. - Vol.36, N 4. - P. 265-272.

280. Fucikovsky L., Luna I., Lopez C. Bacterial antagonists to Pseudomonas solanacearum in patatoes and some other plant pathogens // Poroc. 7th Int.Conf.: « Plant Pathog. Bact.», 11-16 June 1989, Budapest, Pt A. Budapest. - 1990. - P. 201206.

281. Fukamizo T., Honda Y., Toyoda H., Ouchi S., Goto S. Chitinous component of the cell wall of Fusarium oxysporum, its structure deduced from chitosanase digestion.// Biosci. Biotech. Biochem. 1996. - Vol. 60, N 10. - P. 1705-1708.

282. Fukamizo T., Ohkawa T., Ikeda Y., Gooto S. Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - Vol. 1205, N2. - P. 183-188.

283. Fukui R., Poinar E.I., Bauer P.H., Schroth M.N., Hendson M., Wang X.-L., Hancock J.G. Spatial colonization patterns and interaction of bacteria on inoculated sugar beet seed// Phytopathology. 1994. - Vol. 84, N 11. - P. 1338-1345.

284. Gaikwad S.J., Sen B., Meshram S.U. Effect of bottlegourd seedcoating with antagonists on seedlings, quantum of the pathogen inside the seedlings and266population of the soil against Fusarium oxysporum // Plant and Soil. 1987. - Vol. 101, N2.- P.205-210.

285. Garcia G.R. Inhibition del Fusarium oxysporum on semillas de tomate variedad Rutgers por bacterias antagónicas // Cent. agr. Rev. cient. Fac. cienc. agr, -1979.-Vol. 6, N 1.- P. 65-73.

286. Gaudino R.J., Pikaard C.S. Cytokinin induction of RNA-polymerase-I transcription in Arabidopsis thaliana/f J. of Biological Chemistry.- 1997.- Vol.272.-P.6799-6804.

287. Geels F.P., Schippers B. Selection of antagonistic fluorescent Pseudo-monas spp. and their root colonization and persistence following treatments of seed potatoes // Phytopathology. 1983. - Vol.108 - P. 193-206.

288. Gemrich E.G., Vandestreck E. Effectivenes of Bacillus uniflagellatum in controllings plant diseases // Plant Disease. -1980. -Vol.64. -P.382-384.

289. Ghazanfari J., Gough F.J. Redused growth, asocarp production, and infection of wheat by Pyrenophora trichostoma caused by microorganisms // Phytopathology. -1981.-Vol. 71.-P.876.

290. Gilbert G.S., Handelsman J., Parke J.L. Root camouflage and disease control // Phytopathology. 1994. - Vol. 84, N 3. - P. 222-225.

291. Gordon R. E. The genus Bacillus // Agricultural handbook N 427.- Wash. D.C. 1973.- 275 p.

292. Green E. Cytokinine production by microorganisms // Bot. Rev.- 1980.- Vol. 46, N1.-P. 25-74.

293. Gupta V.K., Utkhede R.S. Factors affecting the production of anti-fungal compounds by Enterobacter aerogenes and Bacillus subtilis, antagonists of Phytophthora cactorum // Phytopathol. Z. 1986. - Vol.117, N 1. - P. 9-16.

294. Gupta V.K., Utkhede R.S. Nutritional requirement for production of antifungal substance by Enterobacter aerogenes and Bacillus subtilis antagonists of Phytophthora cactorum // J. Phytopathology. 1987. - Vol. 120. - P. 143-153.

295. Gupta R., Saxena R., Chaturvedi P., Virdi J. Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis // J. Appl. Bacteriol. -1995.-Vol. 78.-P. 378-383.267

296. Hadar Y., Harman G., Taylor A., Norton J. Effect of pregermination of pea and cucumber seeds and of seed treatment with Enterobacter cloaceae on rots caused by Pythium spp. // Phytopathol. 1983. - Vol. 73. - P. 1322-1325.

297. Hall R., Shrivastava B. Cytokinin activity of compounds obtained from soluble RNA//Life Sei.- 1968.- Vol.7,N11.- P.7-13.

298. Hampson M., C., Coombes J.W. Use of crabshell meal to control potato wart in Newfoundland // Can. J. Plant Pathol. -1991. V. 13, N 2. - P. 97-105.

299. Handelsman J., Raffel S., Mester E.H., Wynderlich L., Grau C.R. Biological control of damping-off of alfalfa seedlings with Bacillus cereuc UWB5 // Appl. and Environ. Microbiol. 1990. - Vol.56, N 3. - P. 713-718.

300. Haral A.A., Konde B.K. Biological management of soil-borne plant pathogens: effects on nodulation and dry matter of chickpea // J. Maharashtra Agr. Univ. 1983.-Vol.8, N2.-P. 112-113.

301. Harish S., Manjula K., Podile A.R. Fusarium udum is resistant to the mycolytic activity of a biocontrol strain of Bacillus subtilis AFI // FEMS Microbiol. Ecology. -1998.-Vol. 25.-P. 385-390.

302. Heins Y., Inbar M. Effect of Bacillus subtilis on growth and Sclerotium formation by Rhizoctonia solani // Phytopathology. 1968. -Vol.58. - P. 933-938

303. Hentschel K.D., Bochow H. Biologiscer Pflanzenschetz gegen bodenburtige Mykosen durch Einsatz Bakterieller Antagonisten bei Gemusebau in Gewachshaus // Mitt. BioLBundesant. Land. und Forstwirt. Berlin-Dahlem. - 1990. - N 266. - P. 293.

304. Hirano S. Chitin biodégradation in soil // Dev. Ecol. Perspect. 21st Cent. 5th Int. Congr. Ecol., Yokohama, Aug. 23-30, 1990: Abstr. Yokohama: INECOL, 1990. - P.203

305. Höflich G., Steinbrenner K. Einflub acker-and pflanzen- baulicher Mabnahmen auf einige bodenbiologische Fakforen // Zbl. Microbiol. 1988. - Vol.143, N 8. - P. 161-162.

306. Horgan R. Present and future prospects for cytokinin research// Physiology and Biochemistry of cytokinis in plants /Eds. Kaminek M., Mok D.W.S., Zazimalova E.-The Hague: Academic Publ., 1992.- P.3-13.268

307. Horikoshi K., Iida S. Lysis of fungal mycelia by bacterial enzymes // Nature. -1958.-Vol. 181,N4613.-P. 917-918.

308. Hornby D. Microbial antagonisms in the rhizosphere // Ann. Appl. Biol. -1978. Vol. 89, N 1. - P. 97-99.

309. Hornby D. Field testing putative biological controls of take-all: rationales and resalts // Bull.OBPP Oxford etc. 1987. - Vol. 17, N4. - P. 615-623

310. Howie W.J., Cook R.J. The effect of motility on wheate root colonization by fluorescent Pseudomonads antagonistic to take-all of wheate // Phytopathology. -1985.-Vol.75.-P. 134.

311. Huber J., Bochow H., Junge H. Selection und biotechnische Herstellung von Kulturlosungen mikrobieller Antagonisten zur Unterdrückung phytopathogener Bodenpilze // J. Basis. Microbiol. 1987. - Vol. 27, N 9. - P. 497-503.

312. Jackson M.B. Are plant hormones involved in root to shoot communication?// Adv. inBot. Research.- 1993.- Vol.19.- P.107-187.

313. Jacques Ph., Vanhentenryck F., Thonart Ph. Study of production of iturin from Bacillus subtilis: a potential antifungal agent // Arch. Int. Phiziol., Biochem. et biophys. 1991. - Vol. 99, N 6. - P. 62.

314. Jakob M., Bochow H. Pflanzenschutzerfolge durch kombinierten Einsatz der VA-MyKorrhiza und bakteriellen Antagonisten in der Gerbera-Produktion // Mitt. Biol. Bundesamt. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. 1990.- N 266. - P. 256.

315. Jones H.G. Correction for Non-specifie Interference in Competitive Immunoassays // Physiol. Plant.- 1987.- Vol.70, N 2.- P. 146-154.

316. Joosten M., Verbakel H., Nettekoven M. et al. The phytopathogenic fungus Cladosporium fulvum is not sensitive to the chitinase and ß-l,3-glucanase defence proteins of its host, tomato. // Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1995. - Vol. 46, N 1. - P. 45-59.

317. Jordan V.W.L., Tarr H.S. Inoculum suppression of Verticillium dahliae // Ann. Appl. Biol. 1978. - Vol. 89, N1,- P. 139-141.

318. Juhnke M.E., Mathre D.E., Sands D.C. Relationship between bacterial seed inoculum density and rhizosphere colonization of spring wheat // Soil Biol, and Biochem. 1989. - Vol. 21, N 4. - P. 591-595.

319. Junge H., Krebs S., Freier K. Ergebnisse bei der Anwendung biologischer Methoden gegen bodenburtige Mykosen bei Zierpflanzen im Gewachshaus// Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlem. 1990. - N 266. - P. 290.

320. Kaiss-Chapman R.W., Morris R.O. Trans-zeatin in culture filtrates of Agro-bacterium tumefaciens // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1976. Vol.76, N2. -P.453-459.

321. Kampert M., Strzelczyk E. The synthesis of cytokinin-like substances by cory-neform bacteria isolated from roots of pine seedlings (Pinus silvestris L.) // Acta Microbiol. Pol. 1980. - Vol.29, N2. - P. 117-124.

322. Kapoor I.J., Kar B. Antagonism of Azotobacter and Bacillus to Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici // Indian Phytopathol. 1989.- Vol. 42, N 3.- P. 400404.270

323. Katoh. K., Okumura M., Yasida M., Sawada Y. Characteristics of bacteria isolated from soil and roots of wheat II Trans. 14th Int. Congr. Soil Sci., Aug., 1990, Kyoto. 1990. - Vol. 3, C. 3. - P. 72-77.

324. Katz E., Demain A.L. The peptide antibiotics of Bcillus: Chemistry, biogenesis and possible functions. // Bacteriol. Rev. 1977. - Vol.41, N2. -P.449-474.

325. Katznelson H., Cole S. Production of gibbereline-like substances by bacteria and actinomycetes // Canad. J. Microbiol. 1965. - Vol.11,N 3-4. -P.733-741.

326. Katzer W., Loeffler W., Zahner H., Rapp C., Jung G. Chlorotetain from Bacillus subtilis(ssp. amyloliquefaciens) BGSC 1E2 // Forum Mikrobiol. 1990. -Vol. 13,N 1-2.-P. 81.

327. Kehlenbeek H., Schonbeck F. Effects of indused resistance on disease severity/yield relations in mildewed barley // J.Phytopathol. 1995. - Vol. 143, N 9. -P. 561-567.

328. Kelemu S., Badel J.L. In vitro inhibition of Colletotrichum gloeosporiodes and other phytopathogenic fungi by an Amazonian isolate of Bacillus subtilis and its cellfree culture filtrate // Australasian Plant Pathology.- 1994.- Vol. 23.- P. 41-45.

329. Kellock L., Dix N.J. Antagonism by Hypomyces aurantius. 2. Ulrastructure studies of hyphal disruption // Trans. Br. mycol. Soc. 1984. - N 82 - P. 335-338.

330. Kende H. Preservation of in leaf sections by substanses obtained from root exudate // Science.- 1964.- Vol.145.- PJ066-1067.

331. Kimura N., Hirano S. Inhibitory strains of Bacillus subtilis for growth and aflatoxinproduction of aflatoxigenic fungi // Agric. Biol. Chem. 1988.- Vol.52, N 5. -P. 1173-1179.

332. Klich M.A., Lax A.R., Bland J.M. Inhibition of some mycotoxigenic fungi by iturin A, a peptidolipid produced by Bacillus subtilis // Mycopathologia.- 1991.- Vol. 116.-P. 77-80.

333. Klich M.A., Arthur K.S., Lax A.R., Bland J.M. Iturin A: A potential new fungicide for stored greins //Mycopathologia.- 1994.- Vol. 127.- P. 123-127.

334. Knudsen G.R., Spurr H.W. Field persistence and efficacy of five bacterial preparations for control of peanut leaf spot // Plant Disease. 1987. - Vol. 71, N 5. -P.442-445.271

335. Kommedahl T., Mew I.C. Biocontrol of corn root infection in the field by seed treatment with antagonists // Phytopathology. 1975.- Vol. 65. - P. 296-300.

336. Kong J., Wang W., Zhao B., Cheng H., Shen X., Zhang G. Characteristic antifungal substance from strain B-903 Bacillus subtilis // Acta microbiol. sin. -1992. -Vol. 32, N 6. P. 445-449.

337. Krekule J., Seidlova F. Effect of exogenous cytokinins on flowering of the short-day plant Chenopodium rubrum L.// Biol. Plant.- 1977.- Vol.19, N2.- P. 142149

338. Krezel Z., Stankiewicz M. Effect of Bacillus subtilis 93 on the infection of sugar beet seedlings with Phoma betae // Meded. Fac. landbouwwetench. Rijksuniv. Gent. 1984. - Vol. 49, N 2b. - P. 517-523.

339. Kshirsagar V.G., Diwany S.S. Production of antifungal substance by Bacillus licheniformis // Indian J. Microbiol. 1989. - Vol. 29, N 3. - P. 237-238.

340. Mabuchi N., Hashizume I., Araki Y. Characterization of chitinases excreted by Bacillus cereus CH // Can. J. Microbiol. -2000, -Vol.4,. N 4. P.370-375.

341. Mahadevan B., Crawford D. Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108 // Enzyme and Microbial Technol. 1997. - Vol. 20. - P. 489-493.

342. Mann E.N. Inhibitoin of tobacco mosaic virus by a bacterial extract .// Phytopathology. 1969. - Vol.59. - P.658-662.

343. Maplestone P.A., Campbell R. Colonization of roots of wheat seedlings by bacill proposed as biocontrol agents against take-all // Soil Biol, and Biochem. -1989. Vol.21, N 4. - P. 551-559.

344. Mari M., Guizzardi M., Pratella G.C. Biological control of gray moid in pears by antagonistic bacteria // Biological control.- 1996.-V. 7.- P. 30-37.

345. Markets // Biotechnol. Bull.- 1989.-Vol. 8, N 5.- P. 5-6

346. Mavingui P., Heulin T. In vitro chitinase and antifungal activity of a soil, rhizosphere and rhizoplane population of Bacillus polymyxa // Soil Biol, and Biochem. 1994. - Vol. 26, N 6. - P. 801-803.

347. McCloskey J.A., Hashizume T., Basile B., Ohno Y., Sonoki S. Occurence and274levels of cis- and trans-zeatin ribozides in the culture medium of a virulent strain of Agrobacterium tumefaciens // FEBS Letters -1980. -Vol. 111, NL P. 181-183.

348. McGaw B.A. Cytokinin metabolism // Plant Hormones in Search of a role. Monograph 14 .- Bristol: British Plant Growth Regulation Group, 1987.- P.9-17.

349. McKeen C.D., Reilly C.C., Pusey P.L. Production and partial characterization of antifungal substances antagonistic to Monilinia fructicola from Bacillus subtilis // Phytopathology. 1986. - Vol. 76, N 2. - P. 136-139.

350. Merriman P.R., Price R.D., Kollmorgen J.F., Piggott T., Ridge F.H. Effect of seed inoculation with Bacillus subtilis and Streptomyces griseus on the growth of cereals and carrots // Australian Journal of Agriculture Res. 1974. - Vol. 25. - P. 219-226.

351. Mew I.C., Kommedahl T. Interaction among microorganisms occuring naturally and applied to pericarps of corn kernels // Plant Disease Reporter. 1972. -Vol. 56.-P. 861-863.

352. Michael J., Beringer H. The role of hormones in yield formation // Physiol. Aspects. Crop. Prod.- Berlin: Wobflanfen, 1980.- P. 85-116.

353. Miller C. Kinetin and kinetin-like compound // Modern Methoden der Pflanzenanalyse.- 1963.- Vol.6.- P. 194-202.

354. Miller H.J., Henken G., van Veen L.A. Variation and composition of bacterial populations in the rhizosperes of maize, wheat, and grass cultivars //Can. J. Microbiol. 1989. - Vol.35, N 6. - P. 656-660.

355. Minoru X. Characterization of chitosanase produced by Bacillus circulans MH-K1 // Chitin and Chitosan: Sources, Chem., Biochem., Phys. Prop, and Appl.: Proc. 4th Int. Conf., Trondheim, Aug. 22-24, 1988. London, New-York, 1989. - P. 197206.

356. Misaghi I.J. Screening bacteria for root colonizing by a rapid method // Soil Biol. Biochem. 1990. - Vol.22, N 8. - P. 1085-1088.

357. Misato T., Yamaguchi I. Pesticides of microbial origin. // Outlook on Agriculture. 1984. - Vol. 13, N3. - P. 136-139.

358. Mitchell R., Alexander M. Mycolytic phenomenon and biological control of Fusarium in soil //Nature. 1961. -Vol.190, N 4770.- P. 109-110.- 275

359. Mitchell R., Alexander M. Lysis of soil fungi by bacteria // Can. J. Microbiol. -1962.-Vol. 9.-P. 169-177.

360. Mitsutomi M., Kidon H., Tomita H., Watanabe T. The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - Vol. 59, N 3. - P. 529-531.

361. Moller I., Breinholt J., Heide M., Manker D., Rosendahl C.N. In vitro screening for antifungal activity of secondary metabolites // 5 th Int. My col. Congr., Vancouver, 14-21 August, 1995: Abst. Vancouver, 1994. - P. 144.

362. Morgan F.L. Infection inhibition and germ-tube lisis of three cereal rusts by Bacillus pumilus //Phytopathology. 1963. - Vol. 53, N 11. - P. 1346-1348.

363. Motomura M., Hirooka E.Y. Antifungal substance produsing microorganisms with perspective of applications of Fusarium moniliforme control // Arquivos de Biologia e Tecnologia 1996.- Vol. 39.- P. 471-479.

364. Nakano M., Zuber P. Molecular biology of antibiotic production in Bacillus // CRC Crit. Rev. Biotrchn. 1990. - Vol. 10, N 3. - P. 223-240.

365. Nandi S.K., Letham D.S., Palni L.M.S., Wong O.C., Summons R.E. 6-BenzylaminopUrine and its glycosides as naturally occuring cytokinins // Plant. Sci.-1989.- Vol.61.- P.189-196.

366. Nesemann G., Praeve P., Sukatsch D., Vertesy L. Polyene antibiotic from bacteria // Naturwissenschaften. 1972, -H.59. -P.81-82.

367. Newman E.I., Watson A. Microbial abudance in the rhizosphere: a com-puter model // Plant and Soil. 1977. - N48. - P. 17-56.

368. Nicander В., Stahl U., Bjorkman P., Tillberg E. // Planta. 1993.Vol. 189, N2. -P. 312-320

369. Nielsen P., Sorensen J. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizoshere // FEMS Microbiol. Ecology. 1997. - Vol. 22. - P. 183-192.

370. Nishimura S. Minor components in transfer RNA: their characterization, location and function // Progress Nucl. Resaerch Molecular Biol.- 1972.- Vol.12.-P.49-85.276

371. Noel T.C., Sheng C., Yost C.K., Pharis R.P., Hynes M.F. Rhizobium legumi-nosarum as a plant growth-promoting rhizobacterium: direct growth promotion of canola and lettuce // Canad. J. Microbiol. -1996. -Vol.42, N 3. -P.279-283.

372. Odigie E.E., Ikotum T. In vitro and in vivo inhibition of growth Phtophthora palmivora (BUTL.) BUTL. by antagonistic microorganisms // Fitop. Brasil. 1982. -Vol.7.-P. 157-168.

373. Olsen C.M., Baker K.F. Selective heat treatment of soil, and its effect on the Inhibition of Rhizoctonia solani by Bacillus subtilis // Phytopathology. 1968. -Vol.59.- P. 79-87.

374. Olsson A.R., Fahim M.M., Abd-Elkader M.M. Biological control of lupin wilt // Egypt J. Phytopathol. 1986. - Vol.18, N 1. - P. 11-25.

375. Olsson S., Baath E., Soderstrom B. Grouth of Verticillium dahliae Klem. hyphae and of bacteria along the roots of rape (Brassica napus L.) seedlings // Can. J. Microbiol. 1987. - Vol. 33, N 10. - P. 916-919.

376. Omoifo C., Ikotum T. Inhibition of growth of some plant pathogens by antagonistic microorganisms // J. Bacic. Microbiol. 1987. - Vol. 27, N 9. - P. 515519.

377. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. Rhizosphere colonization by Serratia marcescens for the control of Sclerotium rolfsii // Soil Biol. &Biochem. 1987. -Vol. 19. - . P.747-751.

378. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii // Phytopathology. 1988. - Vol. 78. - P. 84-88.

379. Osburn R. M., Milner J.L., Oplinger E.S., Smith R.S., Handelsman J. Effect of Bacillus cereus UW85 on the yield of soybean at two field sites in Wisconsin // Plant Disease. 1995. - Vol. 79, N 6 . - P. 551-556.

380. Osman A.R., Fahim M.M., Abd-Elkader M.M. Biological control of lupin wilt // Egypt. J. Phytopathol. 1986. - Vol. 18, N 1. - P. 11-25.

381. Palmer M.V., Wong O.C. Identification of cytokinins from xylem exudate of Phaseolus vulgaris L // Plant Physiol.- 1985.- Vol. 79, N1.- P. 296-298.

382. Pandey A., Palni L.-M.S., Coulomb N. Antifungal activity of bacteria isolated from the rhizosphere of established tea bushes // Microbiological Research.- 1997.2771. Vol. 152.-P. 105-112.

383. Patil I.S., Srikant K., Hegde R.K. Antagonistic action of species of Trichoderma, Bacillus and Streptomyces on Drechlera sorokiniana (SACC) subram and jain // Pesticides. 1987. - Vol. 21, N 12. - P.22

384. Pelletier A., Sygusch J. Purification and characterization of three chitosanase activities from Bacillus megaterium PI // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56.-P. 844-848.

385. Pengelly W. Validation of immunoassays // Plant Growth substanses. (Proc. 12th Int. Conf., August 26-29., 1985).- Berlin .- 1986.- P. 35-43.

386. Petersen M. Identification of a cytokinin, 6-(3-methyl-2- butenylamino)purine in sea water and the effect of cytokinins of broun algae II Physiol. Plantarum 1973.-Vol.28.- P.101-105.

387. Peypoux F., Guinand M., Michel G., Delcambe L., Das B.C., Lederer E. Structure of iturin A, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis // Biochemistry. -1978. Vol. 17. - P. 3992-3996.

388. Phae C.G., Shoda M., Kubota H. Suppressive effect of Bacillus subtilis and its products on phytopathogenic microorganisms // J. Ferment. Technol. 1990. - Vol.69,N1.-P. 1-7.

389. Phae C.-G., Shoda M. Expression of the supressive effect of Bacillus subtilis on Phytopathogens in inoculated composts // J. Ferment, and Bioeng. 1990. - Vol.70, N6.-P. 409-414.

390. Phae C.-G., Sasaki M., Shoda M., Kubota H. Characteristics of Bacillus subtilis isolated from composts suppressing phytopathogenic microorganisms // Soil Sci. and Plant Nutr. 1990. - Vol. 36, N 4. - P. 575-586.

391. Phae C.-G., Shoda M., Kita N., Nakano M. Ushiyama K. Biological control of crown and root rot and bacterial wilt of tomato by Bacillus subtilis NB22 //Ann. Phytopathological Soc. Jap. -1992. -Vol. 58. -P.329-339.

392. Pharis R.P. Flowering of Chrisanthemum under non-inductive long days by gibberellins and N6-benziladenine // Planta.- 1972.- Vol.105, N3.- P.205-212.

393. Pietr S .J., Cros G. Antifungal activity of polypeptide antibiotics produced by some strains of Bacillus subtilis // Tagugsbericht- Acad, der Landwirtschaftswiss. der278

394. DDR.- 1987.-Vol. 253.-P. 261-266.

395. Pleban S., Chernin L., Chet I. Chitinolytic activity of an endophytic strain of Bacillus cereus // Letters in Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 25. - P. 284-288.

396. Pleban S., Ingel F., Chet I. Control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in the greenhouse using endophytic Bacillus spp. // Europ. J. Plant Pathol. 1995. -Vol. 101, N6.-P. 665-672.

397. Podile A.R., Dube H.C. Effect of Bacillus subtilis on the growth of vascular wilt fungi // Curr. Sci.(India). 1985. - Vol. 54, N 24. - P. 1282-1283.

398. Podile A.R., Dube H.C. Antagonism of Bacillus subtilis to Phytophtora drechsleri f.sp. cajani //Indian Phytopathology. 1987. - Vol. 40, N4. - P. 503-506.

399. Podile A.R., Dileep K.B.S., Dube H.C. Antibiosis of rhizobacteria against some plant pathogens // Indian J. Microbiol. 1988. - Vol. 28, N 1-2. - P. 108-111.

400. Podile A.R., Dube H.C. Plant growth-promoting activity of Bacillus subtilis AF1 // Curr. Sci. (India). 1988. - Vol. 57, N 4. - P. 183-186.

401. Podile A.R., Prakash A.P. Lysis and biological control of Aspergillus niger by Bacillus subtilis AF1 // Canadian Journal of Microbiology.- 1996. -Vol. 42.- P. 533538.

402. Porter C.L. Mixed cultures of bacteria and fungi // Proc. of the Ind. Acad. Sci., -1932. -Vol.41. -PI49 mrr. no HoBorpyncKHH, 1936.

403. Powell K.A., Rhodes D.J. Strategies for the progression of biological fungicides into field evaluation // Compar. Glasshouse and Field Pesticide Perform. 2: Proc. Int. Symp., Canterbury, 12-14 Apr., 1994. Farnham, 1994. - P. 307-315

404. Pusey P.L., Wilson C.L. Postharvest biological control of stone fruit brown rot by Bacillus subtilis // Plant Disease. 1984. - Vol 68, N 9. - 753- 756.

405. Pusey P.L., Wilson C.L., Hotchkiss M.W., Franklin J.D. Compatibility of Bacillus subtilis for postharvest control of peach brown rot with commercial fruit waxes, dicloran and cold-storage conditions // Plant Disease. 1986. -Vol. 70, N 6. -P. 587-590.

406. Pusey P.L. Use of Baccillus subtilis and related organisms as bioiungicides //Pestic. Sci.- 1989. Vol.27. -P.133-140.

407. Reddy M.S., Rahe J.E. Growth effects associated with seedbacte-rization not correlated with populations of Bacillus subtilis inoculant in onion seedling rhizospheres // Soil Biol, and Biochem. 1989. - Vol.21, N3. - P. 373-378.

408. Reddy M.C., Rahe J.E. Bacillus subtilis B-2 and selected onion rhozobacteria in onion seedling rhizospheres: effect on seedling growth and indigenous rhizosphere microflora // Soil Biol, and Biochem. 1989. - V. 21, N 3. - P. 379-383.

409. Renwick A., Campbell R., Coe S. Assessment of in vivo screening systems for potential biocontrol agents of Gaeumannomyces graminis // Plant Pathol. 1991. -Vol. 40,N4. -P. 524-532.

410. Rhodes D.J., Powell K.A. Biological seed treatments the development process // Seed Treat.: Progr. and Prospects : Proc. Symp. Brit. Crop. Prot. Counc., Canterbury, 5-7 Jan., 1994. - Farnham, 1994. - P. 303- 310.

411. Roberts W., Selitrennikoff C. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal activity // J. Gen. Microbiol. 1988. - Vol. 134. - P. 169-176.

412. Robins M.J., Hall R.H., Thedford R. N6-isopentenyladenosine. A component of the transfer ribonucleic acid of yeast and of mammalian tissue: method isolation and characterization // Biochemistry.- 1967.- Vol.6.- P. 1837-1848.

413. Rodriguez-Kabana R., Godoy G., Morgan-Jones G., Shelby R. The determination of soil chitinase activity: conditions for assay and ecological studies // Plant and Soil. 1983. - Vol. 75. - P. 95-106.

414. Rothrock C.S. Effect of chemical and biological treatments on take-all of whinter wheat // Crop Protect. 1988. - Vol. 7, N 1. - P. 20-24.

415. Roveratti D.S., Teixeira A.R.R., Moraes W.B.C. A new perspective for an induced protection to coffee leaf-rust // J. Phytopathol. -1989. -Vol.126, N 2. -P. 149159.

416. Rovira A.D., Campbell R. A scanning electron microscope study of interactions between microorganisms and Gaeumannomyces graminis (Syn. Ophiobolus graminis) on wheat roots // Microbiol. Ecol. 1975. - Vol.2 . - P. 177280185.

417. Rytter J.L., Lukezie F.L., Craig R., Moorman G.W. Biological control of geranium rust by Bacillus subtilis // Phytopathology. 1989. - Vol. 79, N 3. - P. 367370.

418. Salerno M., Sagardoy M.A. Presencia y caracterización de Bacillus spp. aislados de sue los cultivables de la zone sémiarida de la provincia de Buenos Aires, Argentina // Agrochemica. 1990. - Vol.34, N 4.- P. 341-351.

419. Salisbury F.B., Marinos N.G. The ecological role of plant growth substances. Hormonal regulation of development. III. Berlin : Springer-Verlag.- 1985.- P.707-764.

420. Sarhan A.R.T Biological control of fusarium root rot of broad bean // Acta phytopathol. et entomol. hung. 1989. - Vol. 24, N 3-4. - P. 271-275.

421. Sattar M.A., Gaur A.C. Production of auxins and gibberellines by phosphate dissolving microorganisms// Zentralbl. Microbiol.- 1987,- Vol. 142.- P.393-395.

422. Scher F.M., Kloepper J.W., Singleton C., Zaleska I., Laliberte M. Colonization of soybean roots by Pseudomonas and Serratia species: relation-ship to bacterial motility, Chemotaxis and generation time // Phytopathology .-1988. Vol.78, N8.-P. 1055-1059

423. Schmiedeknecht G. Erfolgreiche Anwendung mikrobiellér Antagonisten zur biologischen Bekamfung von Rhizoctonia solani bei Kartoffelpflanzen // Mitt. Biol. Bundesanst. Land- und Forstwirt. Berlin-Dahlen. 1990. - N 266. - P. 296.

424. Schmiedeknecht G. Effect of anatgonistic Bacillus strains on Rhizoctonia solani Kuhn infection of potatoes // JOBC/WPRS Bulletin. 1992. - Vol.15, N 1. - P. 139-141.

425. Schmulling T., Schafer S., Romanov G. Cytokinin as regulators of gene-expression//Physiol. Plant.- 1997.- Vol.100.- P.505-519.

426. Schumann K. Pathogengebundene Einflüsse auf den mikrobiellen281

427. Antagonismus // Wiss. Z. Humboldt-Univ. Berlin R. Agrarwiss. 1990. -Vol. 39, N 2.-P. 165-168.

428. Scott D.B., Wilken K. Antagonistic effects of manganese-reducing isolates of Bacillus against Gaeumannomyces graminis var. tritici // 5th Intern. Mycol. Congr. , Vancouver, August 14-21,1994. Vancouver, 1994. - P. 194.

429. Semkiattipong N., Hashimoto S., Sato S. A study on suppressive bacteria to phitopathogenic fungi. //JAERI-Res. {Rept. -1995. -N95-047. -P. 107-113.

430. Shigemitsu H., Hirano K., Kohno M., Ishizaki H., Kunoh H. Effect of Bacilluc Licheniformis on Fusarium oxysporum f. sp.cucumerinum // Trans. Mycol. Soc. Japan. 1983. - Vol. 24. - P. 477-486.

431. Shishido M., Loeb B.M., Chanway C.P. External and internal root colonization of lodgepole pine seedlings by two growth-promoting Bacillus strains originated from different root microsites // Can. J. Microbiol. 1995. - Vol. 41, N 8. - P. 707713.

432. Sholberg P.L., Marchi A., Bechard J. Biocontrol of postharvest diseases of apple using Bacillus spp. isolated from stored apples // Can. J. Microbiol. 1995. -Vol. 41, N3.-P. 247-252.

433. Siala A., Hill I.R., Gray T.R.G. Populations of spore-forming bacteria in acid forest soil with special reference to Bacillus subtilis // J. Gen. Microbiol. 1974. -Vol. 81.-P. 183-190.

434. Siala A., Gray T.R.G. Growth of Bacillus subtilis and spora germination in soil observed by a fluorescent-antibody technigue // J. Gen. Microbiol. 1974. - N 81. - P. 191-198.

435. Siepman R. Wachstumshemmung von Stammfaulepilzen und von Gremme-niella abietina durch Bacillus subtilis // Eur. J. Forest Pathol. -1987, -Vol.17, N1. -P.59-64.

436. Singh V., Deverall B.J. Bacillus subtilis as a control agent against fungal pathogens of citrus fruit // Trans. Brit.Mycol. Soc. 1984. - Vol. 83, N 3. - P. 487490.

437. Skoog F., Hamzi H.Q., Szweykowska A.M., Leonard N.Y., Carraway K.L. et al. Cytokinins: structure activity relationships // Phytochemistry.- 1967.- Vol.6, N 5.2821. P. 1169-1192.

438. Sneh B. Use of rhizoshere chitinolytic bacteria for biological control of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in carnation // Phytopathologische Zeitschrift. -1981. Vol. 100. - P. 251-256.

439. Sobiczewski P. Antagonistic bacteria in relation to Pseudomonas syringae pv. syringae occuring in necroses and cankers of sour cherry trees // Fruit. Sc. Rep. Skierniewice. 1987. - Vol. 14, N 4. - P. 179-185.

440. Spurr H.W., Knudsen G.R. Biological control of leaf diseases with bacteria // « Biol. Contr. Phylloplane « , Proc. Symp. Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc., Guelph, 15 Aug., 1984. St.Paul, Minn., 1985.- P. 45-62.

441. Stewart W., Fitzgeralad G., Burris R. In situ studies on N2 fixation using the acetilene reduction .//Proc.nation. acad. sci. USA. -1967. -Vol.58. -P.2067-2073.

442. Stevens G.A., Berry F.M. Cytokinin secretion by Frankia sp. HFPArl3 in defined medium // Plant Physiol.- 1988.- Vol. 87.- P. 15-16.

443. Strzelczyk E., Kampert M., Michalski L. Production of cytokinin-like substances by micorhizal fungi of pine (Pinus sylvestris L.) in cultures with and wilout metabolites of actinomycetes // Acta Microbiol. Pol. 1985. - Vol.34, N 2. -P. 177185.

444. Swadling I.R., Jeffrier P. Isolation of microbial antagonists for biocontrol of grey mould disease of strawberries // Biocontr. Sci. and Technol. 1996. - Vol.6, N1. -P. 125-136.

445. Taha S.M., Mahmoud S.A.Z., Halim El-Damatya, Abdel-Hefez A.M. Ac-tivity of phosphate-dissolving bacteria in Egyptian soil // Plant and Soil. 1969. - Vol.31, N 1.-P. 149-160.

446. Takayanagi T., Ajisaka K., Takiguchi Y., Shimahara K. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1078, N3. - P. 404-410.

447. Tanaka H., Watanabe T. Glucanases and chitinases of Bacillus circulans WL-12 // J. Ind. Microbiol. 1995. - Vol. 14, N 6. - P. 478-483.

448. Tao G.Q., Letham D.S., Palni M.S., Summons R.E. Cytokinins biochemistry in relation to leaf senescence. I. The metabolism of 6-benzylaminopurine and zeatin in283oat leaf segments // J. Growth Regul.- 1983,- Vol.2.- P.89-102.

449. Tautorus T.E., Townsley P.M. Biological control of olive green mold in Agari-cus bisporus cultivation // Appl. Environ. Microbiol. -1983. -Vol. 45, N2. -P.511-515.

450. Teramoto H., Momotani E., Takeba G., Tsuji H. Isolation of cDNA Clone for a cytokinin- repressd gene in excised Cucumber cotyledons// Planta.- 1994.- Vol.193.-P.573-579.

451. Thara K.V., Gnanamanickam S.S. Biological control of rice sheath blight in India: Lack of correlation between chitinase production by bacterial antagonists and sheath blight suppression // Plant and Soil. 1994. - Vol. 160, N 2. -P. 277-280.

452. Thayer A.M. Biopesticide producerr conurned over patent protection. Markets for bioengineered products look promising, but companies are hesitating to invest in production without secure patents // Chemical and Eng. News.- 1989 N 17. - P. 1113.

453. Thomas H., Blakesley D. Practical and potential uses of cytokinin in Agriculture and Horticulture // Plant Hormones in Search of a role. Monograph 14 ( R.Horgan and B.Jeffecoat, eds.).- Bristol: British Plant Growth Regulator Group, 1987.-P. 69-81.

454. Tominaga Y., Tsujisaka Y. Degradation of cell wall of Mucor mucedo by chitosanase from Bacillus R-4 // Agr. Biol. Chem. 1979. Vol. 43, N 12. - P. 26072609.

455. Torrey J.G. Root hormones and plant growth // Annu. Rev. Plant Physiol. -1976.-Vol.27.- P.435-459.

456. Tschen J. S.-M. Control of Rhizoctonia solani by Bacillus subtilis // Trans. Mycol. Soc. Japan. 1987. - Vol. 28. - P. 483-493.

457. Tschen J.S.-M., Lee Y.-Y. Control of Rhizoctonia solani on chrysanthemums by antibiotic microorganisms // Trans. Mycol. Soc. Japan. 1988. - Vol. 29, N 4. -P.391-400.

458. Tschen J.S.-M., Lee Y.-Y., Wu W.-S., Liu S.-D. Biological control of basal stem rot of chrysanthemum by antagonists // J.Phytopathol. 1989. - Vol. 126, N 4. -P. 313-322.284

459. Turner J.E., Mok D.W.S., Mok M.C., Shaw G. Isolation and partial purification of the enzyme catalysing the formation of novel zeatin metabolites in Phaseolus vulgares embryo // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1987.- Vol.84.- P.3714-3717.

460. Ueda M.,BandurskiR.S.//Plant Physiol. 1969. Vol. 44,N5.-P. 1175-1181.

461. Upadhyaya N.M., Letham D.S., Parker C.W., Hocart C.H., Dart P.J. Do rhizo-bia produce cytokinins? //Biochem. Int. 1991. -V.24. N 1. -P. 123-130.

462. Utkhede R.S., Rahe J.E. Biological control of onion white rot // Soil Biol, and Biochem. 1980. - Vol. 12, N 2. - P. 101-104.

463. Utkhede R.S., Rahe J.E. Chemical and Biological control of onion white rot in muck and mineral soils // Plant Disease. 1983. - Vol.67, N 2. - P. 153-155.

464. Utkhede R.S., Rahe J.E. Effect of Bacillus subtilis on growth and protection of onion against white rot // Phytopathol. Z. 1983. - Vol.106, N 3. - P. 199-203.

465. Utkhede R.S., Rahe J.E. Interaction of antagonist and pathogen in biological control of onion white rot // Phytopathology. 1983. - Vol.73, N 6. - P. 890-893.

466. Utkhede R.S., Sholberg P.L. In vitro inhibition of plant pathogens by Bacillus subtilis and Enterobacter aerogenes and in vivo control of two postharvest cherry diseases // Can. J.Microbiol. 1986. - Vol.32, N 2. - P. 963-967.

467. Utkhede R.S., Li T.S.C. Evaluation of Bacillus subtilis for potential control of apple replant disease // J.Phytopathol. 1989. - Vol. 126, N 4. - P. 305-312.

468. Vandemark G.J. Biological control of Botrytis cinerea by use of Pseudomonas corrugata and Bacillus subtilis // Phytopathology. 1995. - Vol. 85, N 10. - P. 1117.

469. Van Staden J., Harty R. Cytokinins and adventitious root formation// In: Adventitious root formation in cuttings.-1988.-Vol.2.-P.185-201.

470. Van Veen J.A., Merckx R., Van De Geijn S.C. Plant- and soil related controls of the flow of carbon from roots through the soil microbial biomass // Plant and soil. -1989. Vol. 115, N 2. - P. 179-188.

471. Vega F.E., Dowd P.F. An inmovative approach for the biological control of aflatoxins in corn//Phytopathology. 1994. - Vol. 84, N 10.- P. 1069.

472. Venkatasubbaiah P. Efficiacy of Bacillus subtilis as a biocontrol for collar rot of coffee pathogen // Geobios. 1985. - Vol.12, N 3-4. - P. 101-104.

473. Veselov S.U., Kudoyarova G.R., Egutkin N.L., Gyuli-Zade V.Z., Mustafma A.R., Kof E.M. Modifoed solvent partitioning scheme providing increased specifity and rapidity of immunoassey for IAA // Physiol. Plantarum.- 1992.- Vol.86, N1.-P.93-96.

474. Void B.S., Clinton G.M., Spizizen J. An effect of temperature on the Bacillus subtilis transfer RNA's which respond to codons beginning with U and A correlation with cytokinin activity // Biochim. Biophys. Acta 1970. -Vol.209. N 2. -P.396-404.

475. Wang Y.-P., Liu Y.-Q., Pan N.-S., Chen Z.-L. Скрининг антигрибного белка, продуцируемого штаммом TG 26 Bacillus spp. и изучение условий его куль286

476. THBHpoBaHHa // Acta Bot Sin. 1993. - Vol.35, N 3. - P. 222-228.

477. Watanabe T., Yamada T., Oyanagi W. et al. Purification and some properties of chitinase B1 from Bacillus circulans WL-12 // Bioscience, biotechnology and biochemistry. 1992. - Vol. 56, N 4. - P. 682-683.

478. Watanabe T., Oyanagi W., Suzuki K., Tanaka H. Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and importance of chitinase Al in chitin degradation // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172, N 7. - P. 4017-4022.

479. Weihs V., Jagnow G. Colonization of rye-grass roots by rhizosphere bacteria and their effects on plant development // Forum Microbiol. 1989. - Vol. 12, N 1-2. -P. 113

480. Weller D.M. Biological control of soilborna plant pathogens in the rhizosphera with bacteria // Ann. Rev. Phytopathol.- 1988.- Vol.26. -P. 379-407

481. Wilson C.L., Chalutz E. Postharvest biological control of Penicillium rots of citrus with antagonistic yeats and bacteria // Scientia Hortic. 1989. - Vol. 40, N 2. -P. 105-112.

482. Xenova and Monsante collaborate I I Bioprocess. Tachol.- 1989.- 11, N 7.- 8 p.

483. Xenova Ltd. ( Slough, UK ) // Biotechnol. News.- 1989.-Vol. 9, N 16.- 11 p.

484. Yamada S., Takayama Y., Yamanaka M., Ко К., Ymaguchi I. Bioligical activity of antifungal substances prodused by Bacillus subtilis // J. Pesticide Sei. -1990.-Vol. 15. -P. 95-96.

485. Yehia A.H., El-Hasson S.A., El-Bahadli A.H. Biological seed treatment to control fusarium root rot of broad bean // Egypt. J. Phytopathol. 1982. - Vol. 14, N 1-2.-P. 59-66.

486. Yokota Т., Murofushi N. Exstraction, Purification and Identification// Hormonal Regulation of Development 1.- New York, 1980.- P. 113-190.

487. Yuen G.Y., Schroth M.N., Mc Cain A.H. Reduction of Fusarium wilt of carration with suppressive soil and antagonistic bacteria // Plant Disease. 1985. -Vol. 69.-P. 1071-1075.

488. Zablotowicz R.M., Tapping E.M., Scher F.M., Ijzerman M., Kloepper J.W. In-furrow spray as a delivery system for plant growth-promoting rhizobacteria and other rhizosphere-competent bacteria // Can. J. Microbiol. 1991. - Vol. 37, N 8. - P. 632.

489. Zaspel I. Einflub einer Saatgufbehandlung mit bakterieiien Antagonisten auf den Ertag und den Befallsverlauf von Gaeumannomyces graminis // Zbl. Mikrobiol. -1992.-V. 147, N 3-4.-P. 173-181.

490. Zazzerini A., Tosi L. Prove di antagonismo di alcuni isolati batterici nei confronti della Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary // Informatore Fitopatologico. -1985.-Vol.35,Nl.-P. 27-30.

491. Zazzerini A., Tosi L. Osservazioni sull, efficacia antagonistica di alcuni, funghi e batteri nei confronti della Sclerotinia sclerotiorum // Dif. piante. 1985. - Vol. 8, N 12.-P. 163 - 168.

492. Zeng D., He Z., Fu Y., Lei Z. Изучение биологического метода борьбы с антракнозом камелии масличной // "Линье кэсюэ" (Sei. Silv. Sin.) 1987. - Vol. 23, N 2. - P. 144-150.цит. по РЖ 1987, N 12.

493. Zvyagintsev D.G. Dynamic of microbiol populations in soils in the light of the general concept of soil microorganisms complex functioning // Soil Biology and Conservation of the Biosphere, Budapest. 1984.