Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма"

На правах рукописи

Калдыркаев Андрей Иванович

Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1«м ар т

Саратов-2013

005050556

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Научные руководители: доктор биологических наук

Алёшкин Андрей Владимирович кандидат биологических наук Феоктистова Наталья Александровна

Официальные оппоненты: Тихомирова Елена Ивановна

доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный технический университет им. Гагарина Ю.А.», заведующая кафедрой «Экология»

Алеикина Татьяна Владимировна

кандидат медицинских наук ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, заведующая лабораторией диагностических препаратов

Ведущая организация: ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «/У» марта 2013 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» (410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова)).

Автореферат диссертации разослан » февраля 2013 года.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Карпунина Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Бактерии Bacillus cereus относятся к грамположительным факультативно-анаэробным, подвижным, спорообразующим, палочковидным бактериям, широко распространенным в окружающей среде (почве, пресной и морской воде, кишечнике беспозвоночных, на растениях и т.д.) и имеющим фенотипические и генетические (16S рРНК) признаки, сходные с рядом других видов бактерий рода Bacillus: В. mycoides, В. pseudomycoides, В. thuringiensis и В. anthracis (Rasko et al., 2005; Han et al., 2006; Auger et al., 2009). Бактерии В. cereus способны при определенных условиях вызывать у человека широкий спектр заболеваний, включающих пищевые токсикоинфекции, системные и местные гнойные инфекции, в т.ч. молниеносный сепсис, менингит, абсцесс мозга, эпдофтальмит, пневмонию, эндокардит, остеомиелит, кожную инфекцию по типу газовой гангрены и т.д., а у животных -мастит крупного рогатого скота (Musa et al., 1999; Brett et al., 2005; Darbar , Harris and Gosbell, 2005; Avashia et al., 2007; Abusin et al., 2008; Orthop et al., 2008). Основные факторы патогенности В. cereus связаны с выделением разрушающих ткапи' реактивных экзоферментов: гемолизинов, фосфолипаз, токсина вызывающего рвоту и энтеротоксинов (HBL, NHE, и цитотоксина К) (Ghelardi et al. 2007; Arnesen et al., 2008; Edward, 2010).

Пищевую токсикоиифекцию с преобладающим диарейным синдромом вызывает употребление в пищу термически не обработанных мясных и рыбных блюд, немытых овощей, непастеризованного молока, в то время как контаминированный бактериями В. cereus (105-Ю8КОЕ/г) рис и другие крахмал содержащие продукты, а также сыр вызывают гастроэнтерит с ведущим рвотным синдромом (Wijnands et al. 2006). По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC Foodborne Outbreak Online Database) в США ежегодно регистрируется более 60 000 случаев заболеваний, вызванных бактериями В. cereus. При этом отмечается, что некоторым пациентам с рвотной симптоматикой при бациллярной пищевой инфекции ошибочно диагностируют интоксикационный синдром, вызванный Staphylococcus aureus, в то время как ложным возбудителем диарейного типа этой токсикоинфекции считают Clostridium perfringens (Scallan et al., 2011). В связи с этим контроль В. cereus в ряде продуктов является обязательным санитарно-эпидемиологическим показателем, утвержденным в СанПиН 2.3.2.1078-01.

Для подтверждения наличия бактерий В. cereus в пищевых продуктах и клинических образцах зарубежом пытаются использовать серологические (ИФА) и молекулярно-генетические (ПЦР) методы (Jung et al., 2011; Tallent et al., 2012). Наиболее распространенный (классический) метод идентификации этого вида бацилл основан на выделении чистой культуры на МУР среде Мозеля - желточный агар с маннитом, полимиксином и феноловым красным, и ее последующем биохимическом тестировании (Schulten et al., 2000; Food, 2000; Rhodehamel, Harmon, 2001). Однако нестабильность ферментативных реакций В. cereus за7рудняют межвидовую дифференциацию бактерий первой морфологической группы рода Bacillus и, кроме

того, требуют серьезных временных затрат (Глинская, Пермякова, 2004; Селенинов, 2008; Ефимочкина, 2010). В связи с этим, вопрос о разработке ускоренного достоверного метода идентификации бактерий В. cereus все еще остается актуальным.

Начиная с 2006 года сначала в США, а потом и в Европе все более широкое распространение получает теория использования бактериофаг-опосредованного биоконтроля в сфере санитарно-эпидемиологических мероприятий, проводимых в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, пунктах общественного питания, ЛПУ и организованных коллективах (Алешкин и др., 2012). W.J. Lee (2011) и J.H. Lee (2012) продемонстрировали возможность включения специфических бактериофагов, литически активных в отношении бактерий В. cereus, в процедуры по депонтами нации продуктов питания. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствуют данные о созданных фаговых биопрепаратов, в том числе диагностических, специфичных в отношении бактерий В. cereus. Разработка бактериофаговой тест-системы позволит не только ускорить процедуру по идентификации бактерий В. cereus в продуктах питания и клинических образцах, но и даст возможность дифференцировать бациллы внутри данного вида на фаговары и фаготипы.

Цель работы - разработка системы фаговаров бактерий В. cereus для идентификации и мониторинга бактерий В. cereus в объектах санитарного надзора

Задачи исследования:

1. Изучить биологические свойства, отработать методы идентификации и с их помощью определить уровень распространенности бактерий В. cereus в пищевых продуктах и объектах внешней среды.

2. Разработать оптимальную схему выделения бактериофагов В. cereus и изолировать с ее помощью новые штаммы.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, изменение литической активности при храпении) выделенных бактериофагов.

4. Разработать систему фаговаров В. cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма.

5. Отработать пилотную технологию и произвести опытную партию набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов В. cereus для определения фаговаров указанных бактерий.

6. Сконструировать алгоритм ускоренной идентификации бактерий В. cereus в пробах пищевых продуктов, включающий использование набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов.

Научная новизна. Модифицирована схема выделения бактерий В. cereus и с ее помощью изучены показатели распространённости этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды. Разработан способ выделения бактериофагов, позволивший изолировать новые штаммы, активные в отношении бактерий В. cereus. Создана система из 18 фаговаров бактерий В. cereus для идентификации и мониторинга данных микроорганизмов в объектах санитарного надзора. Отработана

пилотная технология получения линейки диагностических биопрепаратов для определения фаговаров В. cereus.

Практическая значимость

Усовершенствованная схема классической идентификации бактерий В. cereus позволяет определять возбудителя с высокой достоверностью в срок, не превышающий установленный в ГОСТе 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus».

Разработанный алгоритм диагностики бактерий В. cereus с помощью набора специфичных биопрепаратов бактериофагов, не только сокращает до 52 часов процедуру идентификации, но и предполагает дополнительное типирование данного вида бацилл на фаговары.

Полученные в соответствии с пилотной технологией фаговые биопрепараты прошли производственные испытания в аккредитованной лаборатории ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» и подтверждены актом производственных испытаний (30.10.2012), утвержденным директором Юсуповым P.M.

Алгоритм ускоренной диагностики бактерий В. cereus с помощью специфичных бактериофагов послужил основой для разработки «Методических рекомендаций по ускоренной идентификации бактерий В. cereus в объектах санитарного надзора с применением специфических бактериофагов», рассмотренные на научно-техническом совете и утвержденные первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина» (14.11.2012).

На основании отработанной пилотной технологии получения бакгериофаговых биопрепаратов создана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов В. cereus» (14.11.2012), утвержденная первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина».

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринаркой медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также размещенны в виде электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированная схема выделения и идентификации В. cereus, позволившая изучить распространённость этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды.

2. Методика выделения бактериофагов В. cereus, создание линейки фаговых биопрепаратов для выявления фаговаров указанных бактерий и пилотная технология их получения.

3. Алгоритм идентификации бактерий В. сегеия с помощью специфичных бактериофагов, сокращающий процедуру идентификации до 52 часов и позволяющий типировать данный вид бацилл на 18 фаговаров.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина». Исследования были поддержаны: фантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК 2010»), грантом Федеральной целевой программы «Поддержка научных исследований, проводимых коллективами научно-образовательных центров по научному направлению «Наука о жизни (Живые системы)»» (Шифр лота 2012-1.1-12-000-2008, наименование «Бактериофаги, как природные биосенсоры для индикации и идентификации бактериальных агентов, вызывающих пищевые инфекции и порчу пищевого сырья»).

Апробация работы. Материалы диссертации были предъявлены на: I Международной научно - практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров,2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), 12-й региональной научной школе-семинаре «Актуальные проблемы физической и функциональной электроники» (Ульяновск, 2009), III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки' в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Ульяновск, 2011), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), III Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), Международной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционных патологий в ветеринарной медицине» (Покров, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 17 работ, из них 3 статьи в

журналах рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.

Структура и объём диссертации. Работа изложена на 179 страницах текста, содержит 18 таблиц и 43 рисунка Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических предложений, перечня сокращений и условных обозначений, списка литературных источников (208 наименований, в том числе 89 отечественных авторов) и приложения.

СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты н методы исследований

Объекты исследований. 105 штаммов бактерий В. cereus, из них 3 референс-штамма Bacillus cereus №8035, №96, №2527 . Штаммы бактерий рода Bacillus: В. subtilis - 8 штаммов из них 2 референс-штамма №6633 и L2; В. mycoides - 8 штаммов из них 2 референс-штамма № 537 и Н; В. thuringiensis - 3 штамма из них 1 референс-штамм В. thuringiensis var. kurstaki,твид В: meseníericus - 8 штаммов из них 1 референс-штамм № 66; В. megalerium - 8 штаммов из них 1 референс-штамм № 182; В. pseudoantracis - 3 штамма из них 1 референс-штамм. Референс-штачмы подученны из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. Г1.А. Столыпина».

Штаммы бактериофагов - 57 изолята бактериофагов В. cereus, выделенные из проб почвы различного хозяйственного назначения Приволжского федерального округа, Южного федерального округа, Центрального федерального округа

В качестве объектов использовали сырье и продукты питания, также объекты санитарного надзора

Методы: для выделения и типизации бактерий В. cereus использовали схемы дифференциации бактерий рода Bacillus: Полховского, 1969; Гордона, 1973; Nortis et al., 1981; Смирнова, 1983; Сидорова, 1995; Васильева и др., 1999. Изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств выделенных бактерий проводили по методам, рекомендованным A.C. Лабинской, Е.Г. Волгиной, (2008). Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными Д.М. Гольдфарбом (1961), Дж. Мейнеллом (1965), С. Лурия, Д. Дарнелом (1970), И.П. Ревенко (1978), В.Я. Ганюшкиным (1988), С.Н. Золотухиным (2007). Селекцию бактериофагов и повышение их литической активности проводили по методике, описанной С.Н. Золотухиным (2007).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. (for Windows; «Stat Soft Ins.», США), Microsoft Exsel 2003 (for Windows XP).

. Результаты исследований и их обсуждение Изучение биологических свойств и совершенствование методов

идентификации бактерий вида Bacillus cereus, выделенных из объектов санитарного надзора

Первоочередной задачей наших исследований стало выделение бактерий В. cereus из объектов санитарного надзора, оптимизация и усовершенствование схемы выделения бактерий. В настоящее время определение бактерий вида Bacillus cereus производится по ГОСТ 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus», а также по схеме, предложенной Гордоном (1973). Анализируя вышеуказанные методики, можно сказать, что по росту на диагносических средах В. cereus, В. anthracis, В. mesenteris, В. megaterium, В. subtillis, В. thuringiensis морфологически очень схожи.

Используя систему биохимических тестов предложенных в ГОСТ 1044.8-88 и Гордоном (1973), мы сталкивались с рядом недостатков:

- проблемой вариабельности биохимических признаков и соответственно с высокой вероятностью недостоверного результата;

- малое количество тестов (анализы по предложенным тестам дают картину, при которой большинство биологических свойств попросту слиты и не дают равнозначного результата);

- диагностируя бактерии по данным схемам и свойствам, возникает ряд трудностей: во-первых, это длительность исследования по причине исследования биохимическими методами и второе, используемые здесь тесты дают спорный результат, так как схожие свойства имеют близкородственные виды.

На основании проведенных собственных исследований по методам предложенньм в ГОСТ 1044.8-88 и в схеме, предложенной Гордоном (1973), нам удалось типировать бактерии до рода, а видовая идентификация в виду скудности тестов оказалась недостаточно надежна.

Изучив свойства имеющихся рефереис-штаммов В. cereus с помощью множества биохимических тестов, нами была разработана новая схема (рис. 1) выделения, делящая объекты исследования на 2 группы в зависимости от формы, в которой находится возбудитель (вегетативной или споровой). В данную процедуру дополнительно включены среда накопления и ряд биологических тестов (табл. 1) в соответствии с результатами полученными в ходе собственных экспериментов.

На основании составленного идентификационного алгоритма (рис. 1), тестирующего бактерии по 30 культуральным признакам, нами в период с 2007 по 2011 год проанализировано 536 проб, отобранных в хозяйствах Ульяновской, Самарской и других областях РФ. В результате исследований было выделено 398 штаммов рода Bacillus: 210 - из почвы; 67 - из воды рек, озер, сточных вод; 46 - из сена и остатков растительного происхождения; 90-е пряностей и приправ; 67 — из молочной и 56 — мясной продукция. 102 из них идентифицированы как В. cereus.

Общий уровень контаминации исследуемого пищевого сырья и готовых продуктов бактериями В. сегеая составил 31 %.

Рисунок 1 - Модифицированная схема выделения бактерий В. сегеиз

Таблица 1 - Идентификационная таблица бактерий рода Bacillus

Признаки Вид

В. cereus B.mega terium B.mesem ericus В. ту со ides B.anthr acis B.subtilis B.thurin giensis

Рост в присутствий лизоцима 0,001 + - - + + ± +

Тест Хью-Ляйфсона + - - + + - +

Каталаза + + + + + + +

Фосфатаза + ± ± - - + +

Тест Фогес-Проскауера + - - ± + + +

Внутриклеточные кристаллы - - - - - - +

Подвижность + ± + - - + +

Рост при тем. 45 С0 + + + - - + +

Капсулообразование в атмосфере с повышенным содержанием С02 ± з: ± ±

Гемолиз + - ± + - - +

Лецитиназа + ± - - - - ±

Редукция нитратов до нитритов + ± - + ± + +

Утилизация цитрата + + + ± ± + +

Расщепление тирозина + ± - ± + - ±

Казеина ± - -f- - + + +

Крахмал + + - + + + +

Мочевина ± - - - - + ±

Сероводород - - + - - + -

Арабиноза - + + + - + ±

Галактоза - + - - ± - -

Мальтоза + + ± 4. -г - +

Маннит - + + - - + -

Раффиноза - + - - - - -

Ксилоза - ± + - - + -

Галактоза - + - - ± - -

Эскулин ± - - - + ±

Саллицин + - - + ± + +

Примечание - «+» - положительный; «-» - отрицательный; « ±» - вариабельный признак.

Таким образом, разработанная схема позволяет типировать бактерии В. сегет с высокой достоверностью в срок не превышающий установленный ГОСТом 1044.888.

Разработка оптимальной схемы выделения бактериофагов Bacillus cereus и изучение их основных биологических свойств

Второй этап исследования был посвящен выделению фагов бактерий В. cereus. В первой серии опытов мы исследовали штаммы В. cereus на содержание профага без индуцирующего фактора по методике, предложенной С. Лурия и Д. Дарнелла (1970) в модификации А.Г. Шестакова (2010).

Во второй серии экспериментов на культуры В. cereus оказывалось воздействие индуцирующим фактором — ультрафиолетовыми лучами, по методике Дж. Мейнелла (1965). В результате проведенного комплекса исследований лизогенных штаммов В. cereus среди тестируемых культур не обнаружено.

В третьей серии экспериментов проводили выделение бактериофагов из объектов окружающей среды по методике Д.М. Гольдфарба (1961) в оригинальной модификации И.П. Ревенко (1978). По литературным данным, наиболее эффективно в качестве источника выделения бактерий рода Bacillus использовать пробы почвы, так как они являются почвенными сапрофитами. В результате исследования 388 проб почвы различного хозяйственного назначения Приволжского федерального округа, Южного федерального округа, Центрального федерального округа, нам удалось выделить 57 изолятов бактериофагов бактерий В. cereus.

Четвертым этапом . наших исследований было изучение основных биологических свойств (морфологии негативных колоний; специфичности действия; литической активности и ее измепения при хранении; спектра литического действия) выделенных бактериофагов В. cereus.

Экспериментальным путем было установлено, что негативные колонии, образуемые 57 изолятами фагов В. cereus, имели различный тип колоний. Согласно данным Ревенко И.П. (1978) морфология негативных колоний - это важный признак дифференциации фагов на умеренные и вирулентные. В нашем случае было выявлено 4 типа негативных колоний различающихся по размеру, форме и прозрачности.

Литическая активность выделенных фагов составила от 10"5 до 10~ш по методу Аппельмана и от 1,8х 107± 0,4* 107до4х1012±1,8* 10 по методу Грациа.

Для изучения спектра литического действия отобранных фагов использовали 102 штамма бактерий В. cereus, выделенных из пищевых продуктов и объектов ветеринарного надзора и 3 референс-штамма, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Определение спектра литической активности проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Адаме М, 1961; Г'анюшкин В.Я., 1988). Установлено, что спектр литической активности фаготипов бактериофагов B.cereus находился в интервале от 0,9 до 12,4 % от всего количества изучаемых бактериальных штаммов. Причем, наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладали штаммы бактериофагов: FBc-1 - 9,5 %, FBc-4 - 11,4 % , FBc -7 - 12,4 %, FBc-28 - 12,4 %. Кроме того имелись «нетипирующиеся» штаммы бактерий В. cereus №3, №10, №24,

№34, №40, №44, №58, №63, №73, №86, №96, которые не лизировались ни одним из имеющихся бактериофагов.

Важнейшей характеристикой фага, входящего в состав биопрепарата для индикации и идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида (Золотухин, 2007). Изучение специфичности 57 выделенных изолятов бактериофагов В. cereus проводили на культурах гомологичного рода: В. mesentericus, В. subtilis, В. mycoides, В. megaterium, В. mesentericus В. thuringiensis, В. pseudoanthracis. Самой важной характеристикой выделенных фагов была специфичность по отношению к штаммам В. cereus и отсутствие способности лизировать культуры В. mycoides и В. thuringiensis, которые по биохимическим свойствам сходны с исследуемыми культурами. В результате исследований установлено, что бактериофаги обладают выраженной специфичностью только по отношению к бактериям вида В. cereus.

Создание схемы фаговаров Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма

В результате проведенных исследований, была выявлена особенность селекционированных бактериофагов, связанная с избирательным лизисом тестируемых штаммов бацилл, позволившая объединить бактериофаги и бактерии во взаимосвязанные группы. Перекрест фагов не допускался, каждый фаг имел лизис строго внутри своей группы фаговаров. Фаг, обладающий более широким спектром литической активности исключался и далее не рассматривался. В результате такого отбора были исключены фаги FBc - 2; 5; 13; 29; 39; 53;54 серии УГСХА.

Таким образом, отобранные фаги были разделены на 18 групп (табл. 2). В последующем на их основе предложили схему фаготипирования, позволяющую идентифицировать бактерии В. cereus на 18 фаговаров (табл. 3).

Алгоритм фаготипирования может быть представлен следующим образом: чашку Петри делят бактериологическим карандашом на сектора, предварительно нумеруя группы бактериофага наносимого на газон. На поверхность МПА засеянного газоном исследуемой культуры пипеткой в намеченный сектор наносят каплю фага, дав ей впитаться в поверхность газона. В каждой чашке обязательно оставляют сектор, на который аналогичным образом наносится МПБ (для контроля). Результат учитывают по лизису исследуемой культуры.

Лизируемые культуры сравниваются со схемой фаготипирования (табл. 3) и тестируемому штамму бацилл присваивается название группы фага, которой он лизируется (например, фаговар 1-Тип Вс - № штамма).

Таблица 2 - Характеристика фаговаров В. сегеиэ

Фаговары В. сегеш Название бактериофагов угсха Морфология негативных колоний Название лизируемых штаммов В. сегсив

1-Фаг Вс ЬВс- 7 УГСХЛ 2 тип №8035, №96,4, 8,18,12, 17, 18,20, 37,42,49,50,54

ГВс-28 УГСХА 4 тип 1,2,4, 8, 18, 12, 17, 18,20,21, 37, 42, 49, 50

2-ФагВс ЕВс-г УГСХА 2 тип 5,6, 16,25,29,30,31,33

/•Вс - 6 УГСХА 1 тип 16, 31,33

гас-56УГСХА 4 тип 13,25,26,29,30

3-ФагВс гас-1 УГСХА 2 тип №2527, 53, 64, 82, 85,87,90, 95, 98, 100

гас-17 УГСХА 4 тип 38, 65, 82,101

4-ФагВс гас-50 УГСХА 3 тип 22, 76, 83

5- Фаг Вс гас-43 угсхл 4 тип 56

гас-44 УГСХА 2 тин 102

6-ФагВс гас -зо угсха 2 тип 9,27, 55, 77

гас-47 УГСХА 4 тип 1 9,72

7- Фаг Вс гас-зз угсха 2 тип 19,28,32,36,57,68,71,80

8- Фаг Вс гас-14УГСХА 2 тип 7, 15,39,41,74, 89

гас-38УГСХА 4 тип 14,52

9- Фаг Вс гас-21УГСХА 1 тип 75

гас-55УГСХА 3 тип 75

10-ФагВс гас—9 УГСХА 1 тип 23

гас-15 УГСХА 3 тип 23

11- Фаг Вс гас-18 УГСХА 2 тип 92

гас-49 УГСХА 1 тип 92

гас-41 УГСХА 1 тип 46, 51

гас-46 УГСХА 2 тип 51, 94

гас-23 УГСХА 2 тип 84

гас-37 УГСХА 1 тип 84

гас-19 УГСХА 2 тип 45, 59

гас-52 УГСХА 4 тип 45,62

15-Фаг Вс гас -27 УГСХА 1 тип 60, 70,88,91,97

16-ФагВс гас-20 УГСХА 2 тип 66, 78, 79

17- Фаг Вс гас-34 УГСХА 2 тип 43,81

18- Фаг Вс гас-51 УГСХА 2 тип 35,47,48,61,67,93,99

Таблица 3 - Схема фаготипирования

Типы фагов 1-Тип Вс 2-Тип Вс З-Тип Вс 4-Тип Вс о CQ С S н t Vi о 03 с S н 7-Тип Вс 8-Тип Вс о 03 ¡7 if 10-Тип Вс о аз ь о и н 13-Тип Вс 14-Тип Вс 15-Тип Вс |l 6-Тип Вс 17-Тип Вс 18-Тип Вс 1

Фаговары (фаготипы) бактерии

1-ТипВс - - - - - - - - - - - - - - - -

2-Тип Вс - ■Л- ■ ' -

З-Тип Вс

4-Тип Вс

5-Тип Вс

6-Тип Вс

7-Тип Вс -

8-Тип Вс

9-Тип Вс -

10-ТипВс -

И-Тип Вс

12-Тип Вс

13-ТипВс

14-Тип Вс

15-Тип Вс

16-Тип Вс •f ■ - -

-

18-Тип Вс

Примечание — «+» - лизие; «-» - отсутствие лизиса.

Конструирование и отработка пилотной технологии получения линейки диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов Bacillus cereus для определения фаговаров указанных бактерий

Из отобранных фагов изготовлен набор из 18 фаговых биопрепаратов для проведения фаготипирования В. cereus. Для этого нами разработаны

технологические параметры изготовления и контроля типовых бактериофагов В. cereus.

Для конструирования опытных образцов фаговых биопрепаратов было отобран 31 бактериофаг бактерий В. cereus: FBc - 1, FBc - 3, FBc - 6, FBc - 7, FBc - 9, FBc -14, FBc - 15, FBc - 17, FBc - 18, FBc - 19, FBc - 20, FBc- 21, FBc - 23, FBc - 27, FBc - 28, FBc - 30, FBc - 33, FBc - 34, FBc - 37, FBc - 38, FBc - 41, FBc - 43, FBc - 44, FBc - 46, FBc - 47, FBc - 49, FBc - 50, FBc- 51, FBc - 52, FBc - 55, FBc - 56 серии УГСХА.

Основными критериями отбора служили: спектр литической активности, специфичность и морфология негативных колоний. Перечисленные бактериофаги согласно предложенной выше схеме фаготипирования были разделены на 18 групп, от 1 до 3 фагов серии УГСХА в каждой (табл. 2).

Как было показано выше изоляты бактериофагов образуют не однородные негативные колонии, всего выделено 4 типа колоний диаметром 0,5 - 8,0 мм, литическая активность фагов составляет от 10"5 до Ю"10 по методу Аппельмана и от 1,8*107± 0,4'107до 4х10'2±1,8х1012 по методу Грациа. Фаги являются специфичными для бактерий вида Bacillus cereus и не лизируют бактерии геггерологичных родов и видов. Спектр литической активности выделенных фагов варьировал 0,9 до 12,4 %.

В виду вариабельности биологических свойств селекционированных бактериофагов было предложено изготавливать каждый из них в отдельности и смешивать перед фасовкой по флаконам.

В результате проведенных исследований была разработана следующая пилотная технология производства биопрепарата:

1. получение биологического сырья для изготовления биопрепарата (подготовка индикаторных культур бактерий B.cereus и подготовка специфичных' фагов B.cereus);

2. определение биологической активности полученного сырья (концентрации бактерий, литической активности и титра бактериофага);

3. расчет оптимальных соотношений индикаторной бактериальной культуры и фага, с учетом температуры и времени культивирования;

4. стерилизующая фильтрация фаголизата, с целью получения отдельных штаммов бактериофагов (31 фаг);

5. составление линейки из 18 наборов диагностических фаговых биопрепаратов - смешивание штаммов с учетом фагогрупп;

6. розлив суспензии фагов во флаконы (ампулы);

7. контроль биопрепаратов (проверка специфичности, спектра литической активности бактериофагов, стерильности и т.д.).

Качество изготовленных биопрепаратов «1-Фаг Вс» - «18-Фаг Вс» определяли по следующим показателям: внешнему виду, микробиологической чистоте, литической активности (титру), спектру литической активности и специфичности. Количество контролируемых образцов зависело от объема партии готовой продукции, но не могло составлять менее 3 штук каждого из 18 биопрепаратов. Соответствие внешнего вида готового продукта определяли визуально. Индикаторный фаг не может содержать посторонних примесей, фаголизат должен быть прозрачным, светло-желтого или желтого цвета. Стерильность каждой партии биопрепаратов подтверждалась отсутствием роста бактериальной микрофлоры (в том числе бацилл), дрожжей и плесневых грибов на селективных питательных средах в течение установленного срока (5 суток). Оценку литической активности 31 штамма фага проводили по методу Грациа, на эталонной культуре соответствующей каждому штамму бактериофага. Препарат считали годным, если

содержание фаговых частиц было на уровне не ниже 108 в 1 мл. Спектр литического действия и специфичность фаговых биопрпаратов определяли по методике изложенной в разделе «Разработка оптимальной схемы выделения бактериофагов Bacillus cereus и изучение их основных биологических свойств» и оценивали на соответствие исходным штаммам, составлявшим каждую композицию. Дату изготовления серии исчисляли со дня закупорки флаконов. Срок годности диагностических наборов бактериофагов при температуре 2-4"С. в течение которого не происходило снижения уровня литической активности биопрепаратов, устанавливали экспериментальным путем. Препарат оставался годным в течение 12 месяцев после фасовки.

Разработка алгоритма ускоренной идентификации бактерий вида Bacillus cereus в пробах пищевых продуктов, включающего использование набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов

С учетом строгой редовой специфичности селекционированных бактериофагов, нами была разработана схема ускоренной идентификации В. cereus в пробах пищевых продуктов (рисунок 2) с использованием набора специфичных фаговых биопрепаратов. Для оценки эффективности ускоренного диагностического алгоритма в процессе производственных испытаний, проведённых в аккредитованной лаборатории ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория», параллельно с ним осуществляли идентификацию В. cereus, используя традиционную схему по ГОСТ 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus».

Процедуру ускоренной идентификации проводили следующим образом: на поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 18-24 часовую бульонную культуру исследуемых микроорганизмов. Чашки термостатировали в течение 15-20 минут для подсушивания, а затем, предварительно поделив на 7 секторов, на поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой в размеченные сектора вносили поочередно 18 биопрепаратов с ¡-Фаг ВсУГСХА по 18-Фаг ВсУГСХА. Для исследования 1 бактериальной культуры в опыте использовали 3 чашки Петри с МПА.

По результатам производственных испытаний было установлено, что новый диагностический метод позволяет идентифицировать бактерии В. cereus за 52 часа, в то время как по традиционной бактериологической схеме идентификации проводится в течение 96 - 120 часов. Таким образом, разработанный алгоритм диагностики бактерий В. cereus с помощью набора специфичных биопрепаратов бактериофагов, не только существенно сокращает время проведения процедуры идентификации, но и предполагает дополнительное типирование данного вида бацилл на фаговары.

Рисунок 2 - Схема типирования бактерий Bacillus cereus с помощью бактериофагов (I) в сравнении с традиционной схемой бактериологического

исследования (И)

ВЫВОДЫ

1. Модифицирование схема выделения В. cereus и с ее помощью определен общий уровень контаминации 536 проб пищевого сырья, готовых продуктов и др. объектов бациллами данного вида, который составил 31 %.

2. Разработана -оптимальная схема выделения бактериофагов В. cereus, позволившая изолировать из объектов внешней среды и селекционировать 57 бактериофагов, активных в отношении В. cereus.

3. Изучены основные биологические свойства 57 изолятов фагов В. cereus: определено 4 типа негативных колоний (3 вирулентных и 1 умеренный), литическая активность выделенных фагов составила от КГ5 до Ю"10 по методу Аппельмана и от 1,8х107±0,4х107 до 4х1012±1,8х10'2 по методу Грациа, все выделенные бактериофаги проявляли свою литическую активность только в отношении вида В.cereus, причем 2 из них FBc-7 и FBc-28 обладали максимальным спектром, лизируя 12,4 % тестируемых штаммов бацилл.

4. Разработана схема фаготипирования штаммов В. cereus, делящая все изученные штаммы данного микроорганизма на 18 фаговаров. Доказана возможность ее применения для идентификации и мониторинга В. cereus в объектах санитарного надзора.

5. Отработана пилотная технология и произведена опытная партия из 18 видов диагностических препаратов на основе бактериофагов В. cereus для определения фаговаров указанных бактерий.

6. Создан новый алгоритм ускоренной идентификации бактерий вида Bacillus cereus методом фаготипирования, позволяющий сократить время исследования до 52 часов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выделения и идентификации бактерий В. cereus рекомендуем использовать модифицированную схему исследования, включающую методику выделения с использованием среды накопления и расширенный спектр биохимических тестов. Предлагаемая схема позволяет выделять микроорганизмы в концентрации 101 КОЕ/г в срок, не превышающий установленные ГОСТ 1044.8-88 нормы.

2. Для идентификации бактерий В. cereus предлагаем использовать систему фаговаров, состоящую из 18 диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов В. cereus, «капельным методом». Время исследования составляет 52 ч.

3. Разработанную систему фаговаров В. cereus, предлагаем применять для мониторинга объектов санитарного надзора на наличие бактерий В. cereus и ускоренной идентификации данных микроорганизмов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калдыркаев, А.И. Пищевые отравления, вызванные бактериями вида Bacillus cereus II А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, М.А. Юдина [и др.] // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы 1 всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. - Краснодар, 2007. - С.283-286

2. Калдыркаев, А.И. Изучение биохимических свойств Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, H.A. Феоктистова // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: материалы научно-практической конференции. - Покров, 2008. - С.222-224.

3. Калдыркаев, А.И. Изучение вирулентных бактерий вида Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, М.А. Юдина, H.A. Феоктистова [и др.] // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА. - Ульяновск, 2009. - Т 4. -С. 114-116.

4. Калдыркаев, А.И. Изучение биохимической активности бактерий вида Bacillus cereus, выделенных из пищевых продуктов и объектов внешней среды /А.И. Калдыркаев, М.А. Юдина, H.A. Феоктистова [и др.] // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА. - Ульяновск, 2009. - Т 4. - С. 117-120.

5. Калдыркаев, А.И. Выделение бактериофагов вида Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, Г.Ф. Архипова // Акггуальпые проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученных. - Покров, 2009. - С. 154-157.

6. Калдыркаев, А.И. Изучение некоторых биологических свойств бактериофагов вида Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, Г.Ф. Архипова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученных. - Покров, 2009. — С.157-159

7. Калдыркаев, А.И. Исследование специфичности сибиреязвенного «Fah-ВНИИВВиМ» // А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, Г.Ф. Архипова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученных. - Покров, 2009. - С.157-159.

8. Калдыркаев, А.И. Биотехнологические параметры разработки диагноста кума, включающего комплекс бактериофагов и позволяющего проводить дифференциацию сибиреязвенной бациллы от бацилл других видов, наиболее часто встречающихся в пищевом сырье и продуктах питания // А.И. Калдыркаев // Актуальные проблемы физической и функциональной электроники: материалы 12-й региональной научной школы-семинара. -Ульяновск, 2009. - С.131-134.

9. Калдыркаев, А.И. Перспективы применения бактериофагов для индикации и идентификации Bacillus cereus в речной воде и рыбе / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, М.А. Юдина [и др.] // Задачи ветеринарной науки в реализации

доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации: материалы международной научно-практической конференции. - Покров, 2011. - С. 175-181.

10. Калдыркаев, А.И. Разработка фаговых препаратов индикации и идентификации бактерий рода Bacillus в пищевом сырье и продуктах питания / А.И. Калдыркаев, А.Х. Мустафин, H.A. Феоктистова [и др.] // Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее: материалы всероссийского симпозиума с международным участием. - Москва, 2011. — С.86.

11. Калдыркаев, А.И. Анализ изменений литической активности фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subiilis при хранении / А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, М.А. Юдина [и др.] / Анализ изменений литической активности фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis при хранении // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: материалы международной научно-практической конференции. - Ульяновск, 2011. - С. 188-191.

12. Калдыркаев, А.И. Методика выделения фагов бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis, перспективы их применения / А.И. Калдыркаев, Д.А. Васильев, А.Х. Мустафин [и др.] // Естественные и технические науки. - 2011. — №2 (52). - С. 83-86.

13. Калдыркаев, А.И. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, В.А. Макеев [и др.] // Вестник Ветеринарии. -2011- №4. - С.88-89.

14. Калдыркаев, А.И. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus cereus и Bacillus subtilis / А.И Калдыркаев, H.A. Феоктистова, А.Х. Мустафин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011. — №4(32). - С. 288-291.

15. Калдыркаев, А.И. Модификация методики выделения фагов бактерий вида Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, Д.А. Васильев // Актуальные проблемы инфекционных патологий в ветеринарной медицине: материалы конференции молодых ученых. - Покров, 2012. -168с.

16. Калдыркаев, А.И. Биохимические свойства бактерий Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, A.B. Алёшкин [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: материалы международной научно-практической конференции. - Саратов, 2013. - С. 186-188.

17. Калдыркаев, А.И. Основные биологические свойства фагов бактерий Bacillus cereus / А.И. Калдыркаев, H.A. Феоктистова, A.B. Алёшкин [и др.] // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве: материалы международной научно-практической конференции. - Саратов, 2013. - С.213-215.

Подписано в печать 25.02.13 Формат 60x90/16. Бумага писчая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № ■

Отпечатано в типографии Ульяновской ГСХА им. П.А.Столыпина 432017, Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калдыркаев, Андрей Иванович, Ульяновск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени ___П.А.-Столыпина»____

На правах рукописи

04201355122

Калдыркаев Андрей Иванович

Разработка системы фаговаров бактерий Bacillus cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Алёшкин Андрей Владимирович

кандидат биологических наук Феоктистова Наталья Александровна

Ульяновск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Систематика и идентификация бактерий рода Bacillus 10

1.2. Бактерии рода Bacillus, обнаруживаемые в пищевых продуктах 20

1.3. Значение Bacillus cereus в пищевых отравлениях человека 24

1.4. Изучение вирулентности бактерий вида Bacillus cereus 33

1.5. Бактериофаги и их применение в лабораторной практике 37 1.5. 1. Морфология негативных колоний 41

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 43 2.1. Объекты, материалы и методы исследований 43

2.2 Результаты собственных исследований и их обсуждения 47 2.2.1 Изучение биологических свойств Bacillus cereus 47

2.2.1.1. Тинкториальные свойства Bacillus cereus 47

2.2.1.2. Изучение культуральных свойств Bacillus cereus 49 2.2.1.3 Изучение биохимических свойств Bacillus cereus 57

2.3 Выделение и идентификация бактерий вида Bacillus cereus 68 2.3.1 Оптимизация схемы выделения Bacillus cereus 72

2.4 Методы выделения и изучения биологических

свойств бактериофагов 78

2.4.1 Методы выделения бактериофагов Bacillus cereus 78

2.4.2 Селекция бактериофагов и повышение их

литической активности 89

2.4.3 Изучение основных биологических свойств выделенных

фагов бактерий Bacillus cereus 90

2.4.3.1 Морфология негативных колоний 91

2.4.3.2 Определение литической активности фага 96

2.4.3.3 Спектр литической активности 100 2.4.3.4. Специфичность действия исследуемых фагов

бактерий вида Bacillus cereus 104

2.5 Создание схемы фаготипирования 107

2.6 Изменение литической активности фагов при хранении 122

2.7 Конструирование и разработка технологических параметров изготовления и контроля индикаторного биопрепарата на основе специфичных бактериофагов Bacillus cereus 125

2.7.1 Получение индикаторных культур Bacillus cereus 127

2.7.2 Приготовление рабочей культуры материнского фага 127

2.7.3 Приготовление культур фагов для конструирования

биопрепаратов 128

2.7.4. Конструирование биопрепаратов 128

2.7.5. Контроль качества изготовленных биопрепаратов 135

2.8 Разработка параметров ускоренной идентификации

бактерий вида Bacillus cereus с помощью бактериофагов 137

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 140

ВЫВОДЫ 148

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 149 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 150

СПИСОК ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ 151

ПРИЛОЖЕНИЯ 171

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Бактерии Bacillus cereus относятся к грамположительным факультативно-анаэробным, подвижным, спорообразую -щим, палочковидным бактериям, широко распространенным в окружающей среде (почве, пресной и морской воде, кишечнике беспозвоночных, на растениях и т.д.) и имеющим фенотипические и генетические (16S рРНК) признаки, сходные с рядом других видов бактерий рода Bacillus: В. mycoides, В. pseudomycoides, В. thuringiensis и В. anthracis (Rasko et al., 2005; Han et al., 2006; Auger et al., 2009). Бактерии В. cereus способны при определенных условиях вызывать у человека широкий спектр заболеваний, включающих пищевые токсикоинфекции, системные и местные гнойные инфекции, в т.ч. молниеносный сепсис, менингит, абсцесс мозга, эндофтальмит, пневмонию, эндокардит, остеомиелит, кожную инфекцию по типу газовой гангрены и т.д., а у животных - мастит крупного рогатого скота (Musa et al., 1999; Brett et al., 2005; Darbar , Harris and Gosbell, 2005; Avashia et al., 2007; Abusin et al., 2008; Orthop et al., 2008). Основные факторы патогенности В. cereus связаны с выделением разрушающих ткани реактивных экзоферментов: гемолизинов, фосфолипаз, токсина вызывающего рвоту и энтеротоксинов (HBL, NHE, и цитотоксина К) (Ghelardi et al. 2007; Arnesen et al., 2008; Edward, 2010).

Пищевую токсикоинфекцию с преобладающим диарейным синдромом вызывает употребление в пищу термически не обработанных мясных и рыбных блюд, немытых овощей, непастеризованного молока, в то время как контаминированный бактериями В. cereus (Ю5-108КОЕ/г) рис и другие крахмал содержащие продукты, а также сыр вызывают гастроэнтерит с ведущим рвотным синдромом (Wijnands et al. 2006). По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC Foodborne Outbreak Online Database) в США ежегодно регистрируется более 60 000 случаев заболеваний, вызванных бактериями В. cereus. При этом отмечается, что некоторым пациентам с рвотной симптоматикой при бациллярной пищевой инфекции ошибочно диагностируют

интоксикационный синдром, вызванный Staphylococcus aureus, в то время как ложным возбудителем диарейного типа этой токсикоинфекции считают Clostridium perfringens (Scallan et al., 2011). В связи с этим контроль В. cereus в

ряде-продуктов—является_обязательным_санитарно-эпидемиологическим

показателем, утвержденным в СанПиН 2.3.2.1078-01.

Для подтверждения наличия бактерий В. cereus в пищевых продуктах и клинических образцах за рубежом пытаются использовать серологические (ИФА) и молекулярно-генетические (ПЦР) методы (Jung et al., 2011; Tallent et al., 2012). Наиболее распространенный (классический) метод идентификации этого вида бацилл основан на выделении чистой культуры на MYP среде Мозеля -желточный агар с маннитом, полимиксином и феноловым красным, и ее последующем биохимическом тестировании (Schulten et al., 2000; Food, 2000; Rhodehamel, Harmon, 2001). Однако нестабильность ферментативных реакций В. cereus затрудняют межвидовую дифференциацию бактерий первой морфологической группы рода Bacillus и, кроме того, требуют серьезных временных затрат (Глинская, Пермякова, 2004; Селенинов, 2008; Ефимочкина, 2010). В связи с этим, вопрос о разработке ускоренного достоверного метода идентификации бактерий В. cereus все еще остается актуальным.

Начиная с 2006 года сначала в США, а потом и в Европе все более широкое распространение получает теория использования бактериофаг-опосредованного биоконтроля в сфере санитарно-эпидемиологических мероприятий, проводимых в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, пунктах общественного питания, ЛПУ и организованных коллективах (Алешкин и др., 2012). W.J. Lee (2011) и J.H. Lee (2012) продемонстрировали возможность включения специфических бактериофагов, литически активных в отношении бактерий В. cereus, в процедуры по деконтаминации продуктов питания. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствуют данные о созданных фаговых биопрепаратов, в том числе диагностических, специфичных в отношении бактерий В. cereus. Разработка бактериофаговой тест-системы позволит не только ускорить процедуру по идентификации бактерий В. cereus в продуктах питания и клинических образцах,

но и даст возможность дифференцировать бациллы внутри данного вида на фаговары.

Цель работы - разработка системы фаговаров бактерий В. сегеш для идентификации и мониторинга бактерий В. сегеш в объектах санитарного надзора.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические свойства, отработать методы идентификации и с их помощью определить уровень распространенности бактерий В. сегеш в пищевых продуктах и объектах внешней среды.

2. Разработать оптимальную схему выделения бактериофагов В. сегеш и изолировать с ее помощью новые штаммы.

3. Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.

4. Разработать систему фаговаров В. сегеш для идентификации и мониторинга данного микроорганизма.

5. Отработать пилотную технологию и произвести опытную партию набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов В. сегеш для определения фаговаров указанных бактерий.

6. Сконструировать алгоритм ускоренной идентификации бактерий В. сегеш в пробах пищевых продуктов, включающий использование набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов.

Научная новизна. Модифицирована схема выделения бактерий В. сегеш и с ее помощью изучены показатели распространённости этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды. Разработан способ выделения бактериофагов, позволивший изолировать новые штаммы, активные в отношении бактерий В. сегеш. Создана система из 18 фаговаров бактерий В. сегеш для идентификации и мониторинга данных микроорганизмов в объектах санитарного надзора. Отработана пилотная технология получения линейки диагностических биопрепаратов для определения фаговаров В. сегеш.

Практическая значимость

Усовершенствованная схема классической идентификации бактерий В. cereus позволяет определять возбудителя с высокой достоверностью в срок, не превышающий установленный в ГОСТе 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus».

Разработанный алгоритм диагностики бактерий В. cereus с помощью набора специфичных биопрепаратов бактериофагов, не только сокращает до 52 часов процедуру идентификации, но и предполагает дополнительное типирование данного вида бацилл на фаговары.

Полученные в соответствии с пилотной технологией фаговые биопрепараты прошли производственные испытания в аккредитованной лаборатории ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» и подтверждены актом производственных испытаний (30.10.2012), утвержденным директором Юсуповым P.M.

Алгоритм ускоренной диагностики бактерий В. cereus с помощью специфичных бактериофагов послужил основой для разработки «Методических рекомендаций по ускоренной идентификации бактерий В. cereus в объектах санитарного надзора с применением специфических бактериофагов», рассмотренные на научно-техническом совете и утвержденные первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина» (14.11.2012).

На основании отработанной пилотной технологии получения бактериофаговых биопрепаратов создана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов В. cereus» (14.11.2012), утвержденная первым проректором - проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина».

Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также размещенны в виде

электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Положения, выносимые на защиту:

¡"Модифицированная схема—выделения—и—идентификации—В.—сегеш,-позволившая изучить распространённость этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды.

2.Методика выделения бактериофагов В. сегеш, создание линейки фаговых биопрепаратов для выявления фаговаров указанных бактерий и пилотная технология их получения.

3.Алгоритм идентификации бактерий В. сегеш с помощью специфичных бактериофагов, сокращающий процедуру идентификации до 52 часов и позволяющий типировать данный вид бацилл на 18 фаговаров.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина». Исследования были поддержаны: грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК 2010»), грантом Федеральной целевой программы «Поддержка научных исследований, проводимых коллективами научно-образовательных центров по научному направлению «Наука о жизни (Живые системы)»» (Шифр лота 2012-1.1-12-000-2008, наименование «Бактериофаги, как природные биосенсоры для индикации и идентификации бактериальных агентов, вызывающих пищевые инфекции и порчу пищевого сырья»).

Апробация работы. Материалы диссертации были предъявлены на: I Международной научно - практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), научно-практической конференции «Проблемы профилактики

и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров,2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2010), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Ульяновск, 2011), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), III Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), Международной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционных патологий в ветеринарной медицине» (Покров, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 17 работ, из них 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах текста, содержит 18 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических предложений, перечня сокращений и условных обозначений, списка литературных источников (208 наименований, в том числе 89 отечественных авторов) и приложения.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1.Систематика и идентификация бактерий рода Bacillus

Спорообразующие аэробные бактерии объединены в род Bacillus, включенный в семейство Bacillaceae. Отличительными признаками этого рода являются: формирование эндоспор, присутствие каталазы, в основном положительно окрашиваемых по Граму (Bergey's, 1993).

Спорообразующие бактерии распространены повсеместно, в большинстве это обитатели почвы. Благодаря развитому ферментативному аппарату, отличаются разнообразием ферментов участвующих в деградации сложных органических соединений. Бациллы важное звено в круговороте веществ в природе. Вариабельность биологических свойств аэробных споровых бактерий, обусловленная их приспособляемостью к условиям обитания, на протяжении всей истории изучения бацилл была и является одной из главных причин нечеткой таксономии внутри рода и многочисленных попыток ее усовершенствования. По этой причине, многие организмы этого рода переименовывались четыре-пять раз, предлагалось более 150 наименований (Bonde, 1975).

В первых изданиях определителя Берджи, спорообразующие бактерии подразделялись на 9 групп с 28 видами, в предложиложенной Фордом классификации, за основу внутриродового разграничения бацилл аэробные спорообразующие бактерии была положена система основанная на морфологических признаках (Мирзоева, 1959). На способности ферментировать сахара и наличии ацетоина основывалась классификация Т. Gibson (1974). Данная классификация не получила поддержки, так как деление только по механизму углеводного обмена, имело разночтения с общепринятым таксономическим делением, по причине того, что механизмы брожения развивались в каждой группе бактерий по своему, независимо друг от друга в зависимости от арела распространения (Мерчина, 2003).

N. Smith с соавт. (1952) за основу классификации принял биологических

свойств аэробных бацилл, но с учетом строгого упорядочения и стандартизации условий их выращивания и приведения методов исследования к единому образцу. Данная классификация приведена в 7-м издании определителя Берджи (1937), где авторы—всесторонне—описывают^ 25 видов бацилл. Н.А.Красильников (1949) предложил классифицировать спорообразующие бактерии на три группы в зависимости от размера спороганглия, положения спор и формы вегетативных клеток. Эти признаки легли в основу классификации при родовой и видовой дифиренциации спорообразующих бацилл (Мерчина, 2003).

Дальн