Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий"



На правах рукописи

-

Климентьва Елена Георгиевна

АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS В ОТНОШЕНИИ РЯДА ФИТОПАТОГЕННЫХ

БАКТЕРИЙ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических

наук

Москва 2001

Раби і.) шано і lit н.і н * іьиіінвіком Гінл іарі і вищим ^ ший (Kl! 11 и

Пах чныи p\ ново jiue п.. юкшр оно loi iimcikiiv на\ к

Каменск- В.М. Нахчный консультант: доктор биологических намс

Каменек- Л.К.

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор

Шильникова В.К., кандидат биологических наук

Сквориова И.Н.

Ведущая организация: Ульяновская гос>дарственная

сельскохозяйственная академия

Защита состоится «■

Защита состоится «-——« —2001 года в -

диссертационного совета Д 220 043 03 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

-2001 года в

часов на заседании

Автореферат разослан <<■

•2001 г

'V

Адрес 127550, Москва, И-550, ут Ученый совет МСХА

екая 49

С диссертацией можно ознакомиться р •

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат с х наук

В А Калинин

L Общая характеристика работы

Актуальность темы. Один из наиболее эффективных путей сокращения объема применения пестицидов в растениеводстве — разработка и внедрение биологических методов регуляции численности фигопатогенных микроорганизмов, сорняков и вредителей в рамках интегрированной системы защиты растений. Преимуществами микробиологических средств защиты перед химическими являются их высокая биологическая эффективность по отношению к восприимчивым видам вредителей и болезней, избирательность •действия, щадящее влияние на энтомофагов и насекомых-опылытелей, малая вероятность возникновения устойчивости патогенов и вредителей к микроорганизмам, безвредность для теплокровных животных и человека, отсутствие фитотоксичности и влияния на вкусовые качества растительной продукции, возможность применения микробопрепаратов в любую фазу вегетации растений, отсутствие опасности накопления токсических веществ в окружающей среде.

Первые сообщения об антибиотическом действии бактерий-антагонистов на фигопатогенные организмы сделал ЯЛ Худяков (1935). Вслед за этим были изучены многие виды бактерий и грибов, обладающих антибиотическим действием на возбудителей главным образом грибных заболеваний у растений.

Энгомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis - уникальная группа микроорганизмов, обладающих способностью к синтезу белкового дельта-эндотоксина, обеспечивающего эффективное избирательное действие на различных насекомых, нематод и клещей - паразитов растений и животных (Edwards et aL, 1990; Payne et al.,1994). В последнее время появились сообщения о том, что дельта-эндотоксины, продуцируемые радом подвидов В. thuringiensis - subsps. thuringiensis, kurstaki, galleriae, finitimus проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов (Юдина н Бурцева, 1997).

Дельта-эндотоксин является основным действующим началом В. turingiensis, остальные токсины и споры лишь усиливают вызванную им патологию (Aronson et aL, 1986).

Мишенью действия токсина являются клетки эпителия средней кишки чувствительных насекомых (Persy & Fast, 1983). Установлено, что, проникая в -клетку, токсин осуществляет протонодонорную функцию, вызывая разобщение процессов окислительного фосфоршшрования и дыхания, что приводит к деэнергизации клетки, нарушению транспорта ионов, синтеза белка, а также зависящего от ионов К* транспорта аминокислот (Persy & Fast, 1983; Каменек и Штерншис, 1985; Sacci et al, 1986; Каменек, 1998). \ß~~3ot 0

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧ -IАЛ Е^блнот^: -;А

Моск. сел.хксхоз, ака/г.егии им. К. А. Тимирязева

Инв. Г\'э_______________

Проявление антибиотических свойств дельта-эндотоксинов В thunngxensis в отношении фигопатогенных бактерий представляется весьма возможным, и так как в основе действия токсина лежит процесс разобщение дыхания и сопряженного с шаг окислительного синтеза АТР, и известно, что этот процесс сходен у разных типов клеток, то характер влияния дельта-эндотоксинов на прокариоты и эукариоты (в частности, на насекомые), очевидно, имеет общую природу (Скулачев, 1968, Юдина и соавт, 1988, Егоров исоавт, 1990)

Цель и задачи исследования. Цель - } становить бактерицидное действие В thunngiensis и ее дельта-эндотоксинов на фитопатогенные бактерии, выяснить особенности механизма их взаимодействия с дельта-эндотоксином, разработать практические приемы использования дельта-эндотоксина В thunngiensis в борьбе с бактериозами растении.

В связи с этим были поставлены следующие задачи 1) изучить бактерицидное действие 4-х подвидов В tliunngiensis на 5 родов фигопатогенных бактерий, 2) выявить наиболее чувствительные к детьта-эндотоксину В thunngiensis подвиды и штаммы, 3) изучить особенности цитотоксического действия дельта-эндотоксина на клетки прокариот, 4) в лабораторных (in vivo) и полевых испытаниях установить наличие защитного эффекта при действии раствора дельта-эндотоксина на капусту, инфицированную Envirna carotovora var carotovora, штамм 115

Нд\чная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение бактерицидных свойств 4-х подвидов В thunngiensis в отношении 5 родов бактерий-фитопатогенов Впервые было установлено, что В thunngiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52 и продуцируемые культурой дельта-эндотоксины оказывают антибиотическое действие на бактерии, вызывающие слизистый и сосудистый бактериозы капзсты Erwinia carotovora var carotovora, штаммы 72, 115, 216 и Xanthomonas campestns pv campestns, штамм 8169 Показано, что величина этого эффекта зависит от рода тестир>емого микроорганизма, концентрации дельта-эндотоксина, устовий совместного инкубирования Выявлены особенности цитотоксического действия дельта-эндотоксина на клетки культуры Ervvmia. carotovora var carotovora, штамм 115 С помощью манометрических методов изучено влияние дельта-эндотоксина на интенсивность поглощения кислорода клетками эрвинии В результате лабораторных (in vivo) и полевых испытаний установлено наличие защитного эффекта при обработке раствором дельта-эндотоксина, продуцируемого В thunngiensis subsp kurstaki, штамм Z-52 um сты, инфицированной Е carotovora var carotovora, штамм 115

Практическая значимость работы. Результаты проведенной работы, показывающие бактерицидное действие В. thuringiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52 и продуцируемых культурой дельта-эндотоксинов на фитопатогенные бактерии родов Erwinia и Xanthomonas, могут быть использованы для создания новых экологически безопасных микробиологических препаратов и разработки технологий их применения против бактериозов культурных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых УлГУ (Ульяновск, 1998), Межрегиональной научно-практической конференции «Экологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 1999), Первой Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2000), Первом рабочем совещании микробиологов Поволжья «Фундаментальные аспекты микробиологии» (Саратов, 2000), Четвертой республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга антропогенно-нарушенных территорий» (Ульяновск, 2000), .V Путинской конференции молодых ученых 16-20 апреля 2001 года г. Пущино.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

' Объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав и выводов общим объемом 100 страниц компьютерного набора. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 11 рисунками. Список литературы состоит из 158 наименования, в том числе 99 наименований на иностранном языке.

2: Объекты и методы исследовании.

В работе использованы типичные штаммы В. thuringiensis subsp. thuringiensis, штаммы 202, 555, 585; В. thuringiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52; В. thuringiensis subsp. galleriae, штамм 69-6; В. thuringiensis subsp. dendrolimus, штамм РСП-18 из коллекции экологического факультета УлГУ, а также фитопатогенные бактерии: Agrobacterium tumefaciens, штамм 8628, Erwinia. carotovora var. carotovora, штаммы 72, 115, 216; Pseudomonas syringae pv. tomato, штамм 1; Xanthomonas campestris var. campestris, штамм 8169; Corynebacterium sepedonicum, пггамм 24; Corynebacterium michiganence, штамм 7; Corynebacterium insidiosum, штамм 14; Pseudomonas syringae pv. striarasience, пггамм 9; pv. lachiymans, штамм 23; pv. pisi, штамм 1; полученные из коллекций кафедры фитопатологии Московской ! сельскохозяйственной академии им. Тимирязева и Всероссийского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин).

Культивирование осуществляли поверхностно в чашках Петри на агаризованной питательной среде №14. Культивировали в термостатах при

температуре 27° С Оценку кристаллообразования проводили согласно принятой методике (Лескова и соавт, 1984, Кольчевсхий и соавт, 1987)

Численность клеток подсчитывали в камере Горяева или на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 400 и 500 нм (Штерншис, 1976)

Кристаллы В ЛиппрепБ« ¡зиЬБр кигйак1, штамм Ъ - 52 отделяли от спор, используя модифицированный метод (Каменек, 1980), с последующим гидролизом разбавленной щелочью (ЫлОН) Щеточной гидролиз осуществляли по методике Кукси (Соосэеу, 1968) Концентрацию кристаллов в суспекции определяли (.пекгрофото.мстрически (Штерншис, 1976)

Антибиотическую активность б штаммов В Цшт^шпш по отношению к фнтопатогенам определяли стандартным чашечным методом перпендикулярных штрихов (Егоров, 1965) в 10 повторностях, размер зон подавления роста бакгерии-фитопатогенов выражали в см Использовали несколько питательных сред каргофельно-глюкозный агар (КГА), рыбо-пептонный агар (РПА), агаризованную ацетатную среду (АС), агаризованную дрожжеполисахаридную среду (ДПС)

Чувствительность фитопатогенов к дельта-эндотоксину В Шиппдгешхз оценивали методом бумажных дисков НС Егорова (1965) в 12 повторностях при разных температурах инкубации, размер зон лизиса выражали в см от края диска Удетьную антибиотическую активность (отн.ед) дельта-эндотоксина рассчитывали по формуле (Юдина и Бурцева, 1997) Размер зоны чизиса (мм1) концентрация дельта-эндотоксина мг/мл

Изучение цитотоксического действия дельта-эндотоксина на клетки бактерий -фитопатогенов проводили на 2- суточных культурах Е сагоюуога \'аг сагоЮУога, штамм 115 и А. пипейклеш, штадш 8628, через различные промежутки инкубации Окраску выполняли по методу Грама

Влияние токсина на дыхательную активность клеток оценивали манометрическим методом Варбурга (Наумова, 1980)

Действие дельта-эндотоксина на фитопатогенные микроорганизмы в лабораторных (т уп'о) и палевых условиях проверяли на растениях капусты сорта «Слава» В лабораторных условиях рассаду выращивали в растильнях по 50 семян в 4-ч повторностях, в полевых условиях - на делянках площадью 40 м: в 3-кратной повторносги. Растения заражали внесением в почву бактериальной суспензии Е сагоЮуога \аг сагоюуога штамм 115 и погружением, корней в суспензию, содержащей ту же культуру Е сагоЮуога, обрабатывали внесением раствора дельта-эндотоксина в почву в разные периоды вегетации растении Для оценки эффективности обработки капусты дельта-эндотоксином использовали биометрические показатели роста и развития растении на

опытных и контрольных делянках. Учитывали высоту стебля, количество листьев рассады на каждой делянке в отдельности в шахматном порядке, количество здоровых растений, сформировавших недоразвитый кочан, заболевших и погибших растений, проводили учет урожайности, определяли среднюю массу кочанов в кг.

Данные обрабатывали с применением общепринятых методов математической статистики. '

3. Антибактериальная активность штаммов Bacillus thuringiensis 11 продуцируемых ими дельта-эндотоксинов в отношении некоторых

фнтопатогенных бактерий -В результате проведенных исследований установлено, что В. thuringiensis subsp. thuringiensis, штаммы 202, 585 и В. thuringiensis subsp. gaMeriae ппамм 69 — 6 не оказывали антибиотического действия ни на один из штаммов фитопатогенов, зон задержки роста не возникало.

Подвиды В. thuringiensis subsp. thuringiensis, штамм 555 и В. thuringiensis subsp. dendrolimus штамм РСП-18 не влияли на развитие культур Е. carotovora var. carotovora, штамм 216 и X. campestris var. campestris, ппамм 8169 и сравнительно слабо подавляли рост A. tumefaciens штамм 8628, Ps. syringae pv. tomato, штамм 1 и С. sepedonicum, штамм 1, размер зон лизиса составил 0,10 -0,11 см. Более активно данные подвиды В. thuringiensis действовали на Е. carotovora var. carotovora, штаммы 72 и 115, размеры зон подавления роста патогена составили соответственно 0,23 и 0,33 см. (табл.1).

В. thuringiensis subsp. kurstaki штамм Z-52 не влиял на рост Ps.-syringae pv. striarasience, штамм 9, pv. lachiymans, ппамм 23 и pv. pisi, ппамм 16 и сравнительно слабо подавлял развитие A. tumefaciens штамм 8628, Ps. syringae pv. tomato, штамм 1; С. Sepedonicum, штамм 1; С. Michiganence, штамм 7 и С. insidiosum, штамм 14, размер зон лизиса составил от 0,1 до 0,13см.

Сильнее антибиотическое действие этого подвида проявлялось по отношению к культуре X. campestris var. campestris, штамм 8169 - размер зоны подавления развития' составил 0,33- см. Антибиотическая активность В. thuringiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52 ко всем испытанным штаммам культуры Е. carotovora оказалась максимальной, размеры зон лизиса составили от 0,53 до 0,70 см.

Как видно из данных табл. 1, антибиотическое действие В. thuringiensis на бакгерии-фитопатогены зависело от индивидуальных особенностей штамма-антагониста и тест-организма.

Таблица 1

Антимикробная активность штаммов Bacillus thuringiensis но отношению к бактериям - фитопатогенам ( накГА)

Штаммы бактерий-фитопатогенов Размеры зон тизиса (см), образовавшиеся в зависимости от анткмикробнои активности различных штаммов Bacillub thurmaiensib

subsp thunngiensis subsp kurstaki Z-52 iubsp gdllenae 69-6 s>ubsp dendrolimus РСП-18

202 555 585

1 2 3 4 5 6 7

A. tumefaciens, штамм 8628 0 0,1±0,03 0 0,1±0,05 0 0,1±0,10

Е. carotovora var Carotinora. штамм 72 0 0 0 0,63±0,Ш 0 0,23±0,10

Е uurotovora var uirotovora пгтамм 115 0 i,33±0,10 0 0,70±0,10 0 0

E carotovora var caroto\ora, штамм 216 0 0 0 0,53±0,10 0 0

X. campesins pv ^ampestns штамм S169 0 0 0 o,33±o,io 0 0

Ps synngae pv tomato, штамм 1 0 0,1±0,Q3 0 0,]3±0,10 0 У 0,11±0,03

С sepeüomcum, штамм 1 0 0,1*0,05 0 0,1±0,04 0 0,l±n,03

С michiganence, штамм 7 0 0 0 0,Ь0,05 0 0

С insjdiosum. штамм 14 0 (1 0 0,1±0,03 0 0

Ps synngae pv stnarasience, штамм 9 0 0 0 0 0 0

Ps synngae pv lachrymans, штамм 23 0 0 0 0 0 0

Ps synngae p\ pisi пттамм 16 ü 0 0 0 0 0

При п = 10 где п - число повторностсй

Тигр подвидов В. йтплфишз — 105 -10® микробных клеток/мл; титр бакгерий-фитопатогенов - 104 -10® микробных клеток/мл.

Изучение показало, что наибольшая антимикробная активность В. Шиш^епяв 5иЬ5р. кшшй шталш 2-52 ко всем испытанным штаммам Е. сапЛоуога ру. сагоЬУога проявилась в случае совместного их развития на ацетатной среде (АС). Размер зон подавления развития фитопатогенов варьировал от 0,60 до 0,68 см (табл.2).

По отношению к культурам А. инпе£айеп5, пгтамм 8628 и X сатревшв ру. сатрезШз, пггамм 8169 - наибольшая активность В. Шигл^епаз внЬир. киг^М также проявлялась при культивировании на ацетатной среде - размеры зон лизиса составили соответственно 0,30 и 0,34 см. При совместном росте тех же культур на РПА и ДПС величины зон подавления развития фитопатогенов не превысили 0,2 см.

По отношению к коринебактериям активность бацилл при совместном культивировании на различных питательных средах проявилась незначительно (размеры зон подавления развития варьировали от 0,1...0,2 см), а при совместном культивировании с псевдомонадами зон лизиса не образовывалось.

Таблица 2

Антимикробная активность Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki штамм

Z-52 по отношению к бактериям-фитопатогенам при совместном __культивировании на разных питательных средах

Штаммы бакгерий-фитопатогенов Размеры зон лизиса, см

РПА АС ДПС ^

A. tumefaciens, штамм 8628 0,10±0,03 0,30±0,10 0,10±0,03

Е. carotovora var. carotovora, штамм 72 0,43±0,Ю 0,62±0,20 0,40±0,10

Е. carotovora var. carotovora, штамм 115 0,68±0,10 0,68±0,20 0,44±0,10

E. carotovora var. carotovora, штамм 216 0,62±0,20 0,60±0,30 0,41±0,20

X. campestris pv. campestris, пггамм 8169 0,20±0,10 0,34±0Д0 0,20±0,10

Ps. syringae pv. tomato, штамм 1 ■ 0 0 0

С. sepedonicum, штамм 1 0,10±0,06 0,20±0,10 0,11 ±0,0 8

С. michiganence, штамм 7 0Л0±0,08 0,10±0.08 0.20±0,10

С. insidiosum, штамм 14 0,10±0,07" 0,20±0,10 0,18±0,10

Ps. syringae pv. striarasience, штамм 9 0 0 О

Ps. syringae pv. lachrymans, штамм 23 0 0 0

Ps. syringae pv. pisi, пгтамм 16 0 ■ • 0 0

п = 10, где п - число повторностей

Титр подвидов В. Ишгш^ег^Б - 105 - 106 микробных клеток/мл; титр бактерий-фигопатогенов - 104 - 10б микробных клеток/мл

Наибольшая антибиотическая активность В. Шигн^епБй шЬвр. кшшЫ при росте на ацетатной среде (АС), содержащей в качестве источника углерода

для питания бактерий как крахмач, гак и ацетат кальция, по мнению ряда авторов (Юдина и соавт, 1992) объясняется тем, что на АС В thunngiensis образуют параспоральные кристаллы на одну треть большего размера и в большем количестве, чем при культивировании на других средах, где в качестве источника углерода - только крахмал (в ДПС) или белок (в РПА)

При оценке антимикробной активности дельта-эндотоксина методом дисков (Егоров, 1965) концентрацию токсина варьировали от 0,075 до 1,5 мг/мл (в пересчете на 1 диск это составило от 0,5 до 10,5 мкг) Эффект подавления роста культур бактерий-фитопатоген о в проявлялся очень незначительно при концентрации дельта-эндотоксина 0,5 и 0,70 мкг на 1 диск (размеры зон лизиса составили менее 0,1 см) При концентрации дельта-эндотоксина не менее 1,8 мкг на 1 диск растворы дельта-эндотоксина оказывали антибиотическое действие различной интенсивности на рост клеток всех испытываемых культур фнтопатогенов (табл 3)

Наибольшую чувствительность проявил штамм Е caiotovora var. carotovora 115 Уже при минимальном количестве токсина размер зоны подавления роста клеток данного штамма составил 0,83 см Штамм Е carotovora var carotovora 216 проявил наименьшую чувствительность к концентрации дельта-эндотоксина 1, 8 мкг на 1 диск (0,30 см), но достаточно сильно подавлялся концентрацией 3,5 мкг на I диск, размеры зоны лизиса составили в среднем 0,62 см Культуры X. campestns var campestns, штамм 8169 и Е carotovora var carotovora, штамм 72 проявили чувствительной ко всем концентрациям дельта-эндотоксина примерно на одном уровне, размеры зон подав теши- развития варьировали соответственно от 0,38 0,50 см и от 0,58 0,88 см

Результаты проведенного дисперсионного анализа показали, что в опыте есть существенные различия на 5% -ном уровне значимости

Почти для всех испытываемых бактернй-фитопатогенов наибольший эффект подавления роста клеток при совместном культивировании с дельта-эндотоскином проявился при действии концентрации 5,3 мкг ка 1 диск, размеры зон лизиса варьировали от 0,52 до 0,90 см

Следует отметить, что наиболее высокой удельной антибиотической активностью по отношению к штамму Е carotovora var carotovora 115 обладала концентрация дельта-эндотоксина 1,5 мкг на 1 диск - 21,9 отнед Примерно вдвое слабее влияла концентрация 3,5 мкг на 1 диск - 11,1 отяед. По мере повышения количества эндотоксина относительная антибиотическая активность

Таблица 3

Зависимость размеров зон лизиса от концентрации дельта-эндотоксииа1

Штаммы фигопа-тогенов Размеры зон лизиса (см), в зависимости от концентрации дельта-эвдотоксина, мкг/1 диск Результаты дисперсионного анализа

0,5 0,70 1,8 3,5 5,3 7,0 8,8 10,5 Число повто риост ей Рфакт Р*05 НСР05

Е.саго1шога 72 Менее 0,1 Менее 0,1 0,58± 0,13 0,58± 0,19 0,88± 0,23 0,81± 0,26 0,80± 0,24 0,79± 0,18 12 71,4 2,29 0,15

Е.сагоЮуога 115 Менее 0,1 Менее 0,1 0,83± 0,28 0,83± 0,27 0,90± 0,27 0,82± 0,17 0,79± 0,25 0,79± 0,17 12 4,3 2,29 0,14

Е.саго1о\'ога 216 Менее 0,1 Менее 0,1 0,30± 0,17 0,62± 0,28 0,77± 0,16 0,70± 0,16 0,71± 0,14 0,70± 0,15 12 36,0 2,29 0,12

X сатревШз 8169 Менее 0,1 _ Менее' 0,1 0,38± 0,18 0,50± 0,17 0,52± 0,28 0,58± 0,14 0,52± 0,16 0,50± 0,18 12 4,3 2,29 0,10

снижалась и была наименьшей при концентрации 10,5 мкг на 1 диск (3 5 отн.ед), т е различалась более чем в б раз.

Исследования зависимости антибиотической активности детьта-эндотоксина при различных температурах инкубации показали, что при температуре +25сС эффект подавления роста клеток бактерий-фитопатогенов оказался наибольшим, размеры зон лизиса составили ü 77 - 0,90 см (табт 4)

При более низкой (+20° С) и более высокой (+35и С) температуре активность токсина была несколько меньше

Результаты проведенного дисперсионного анализа показали, что в опыте нет существенных различий по вариантам на 5% -ном уровне значимости, следовательно, антибиотическая активность дельта-эндотоксина не зависела от варьирование температур его инкубации с фитопатогенными бактериями

Таблица 4

Зависимость размеров зон лизиса клеток бактерий-фитопатогенов под действием дельта-эндотоксина Bacillus thunngiensis в условиях различных

температур инкубации

Штаммы фитопатогенов Размеры зон тизиса, см

+2Ü u С +25 0 С +35° С

Е carotovora 72 0.63±0.10 0.88*0 09 0.68±0 18

Е carotovora 115 0,78±0 09 0 90±0,07 0,82±0 13

Е carotovora 216 0 58±0 05 0 77±0 08 0,70±0 21

X campestns 8169 0 72±0 03 0 80±0 07 0 74±0 08

F факт = 1,79, Fos - 4,12 при Р>0,05, п=10, где п - число повторностей

Таким образом, проведенные исследования подтвердили наличие антибиотического действия различных подвидов В thunngiensis на широко распространенные фитопатогенные бактерии родов Envinia и Xanthomonas, вызывающих заболевания капусты Полученный эффект зависел от количества дельта-эндотоксина, продуцируемого различными подвидами В thunngiensis, от микроорганизма - объекта воздействия, от состава питательных сред на которых проводили совместное культивирования

Нашими исследованиями установлено, что дельта-эндотоксин В thunngiensis subsp kurstaki штамм Z-52 оказывает бактерицидное действие на рост клеток бактерий - фитопатогенов и величина этого эффекта зависит от тестируемого микроорганизма и от концентрации эндотоксина

4. Цитотоксическое действие дельга-эндотокаша Bacillus thuringiensis на клетки бактерий-фитопатогенов В чоде исследования было установлено, что при инкубации клтьтлфы А tumefaciens, штамм 852S с дельта-эндотоксином В thunngiensis

яіЬбр кшзгакі штамм ¿-52 всех концентраций вакуолизированные и разрушенные клетки в мазках не наблюдались л^лбтуоп 6 аягъТ&югг?;

у#г. Са/~с~*оггп?, первые ва*уолтированные клетки в мазках наблюдались уже через одну минуту после начала инкубации клеток с использованием раствора эндотоксина концентрации 0,50 мг/мл. Через 2 мин инкубации число вакуолизированных клеток достигло 17,8%, через 4 мин этот показатель составил 30,4%, а число разрушенных клеток достигло 9,2% Степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации с дельта-эндотоксином и была пропорциональна его концентрации При концентрации токсина 1,5 мг/мл через 1 мин вакуолизироваными оказалось 32,2% и было полностью разрушено 6,9% клеток. Через 5 мин было вакл отизяровано уже36 % все\ клеток и 45, 5% разрушено

Через 30 мин инкубации с дельта-эндотоксином в концентрации 0,5 мг/мл в поле зрения микроскопа не обнаруживалось ни одной целой клетки Такая же картина наблюдалась через 20 мин инк\бации с токсином в концентращш 0,75 мг/мл и через 15 мин - 1,5 мг/мл (рис 1)

^исунсжі щипмтигд разрушения МНфООНЫ! кядгок Под дцкіииом Тд-ЛчдиТ^уИНЬ

Наиболее вероятно, что наблюдаемые эффекты связаны с разобщением процессов дыхания и окислительного фосфорилирования под на воздействием дельта-эндотоксина, в резучьтате чего происходит деэнергизахпш клетки которая неизменно приводит к нарушению транспорта ионов и, следовательно вакуолизации, набуханию и тизису клеток

Полученные данные согласуются с подобными исследованиями на клеточных культурах тканей насекомых (Каменек, 1998)

При контрольных посевах на питательную среду в чашки Петри суспензии культуры Е. carotovora var. carotovora, штамм 115, проинкубированной с различными растворами дельта-эндотоксина, спустя 2-е суток на поверхности питательной- среды обнаруживались лишь единичные колонии эрвиний, что подтверждает данные светового микроскопирования о практически полном разрушении клеток бактерий-фитопатогенов под действием дельта-эндотоксина.

Результаты опыта позволяют сделать вывод о наличии прямопропорциональной • связи между количеством разрушенных бактериальных клеток и концентрацией дельта-эндотоксина и временем его инкубации с метками-мишенями.

5. Влияние дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki штамм Z-52 на дыхание клеток культуры Envinia carotovora subsp. carotovora,niTaMM \ 115.

Изучение влияния дельта-эндотоксина на динамику поглощения кислорода клетками бактерий показало, что в контрольном варианте (без применения дельта-эндотоксина) снижение потребления ■ кислорода происходило постепенно, эффекта стимулирования поглощения не было и через 1,5 часа снижалось до нерегистрируемого минимума.

При инкубации с дельта-эндотоксином степень усиления поглощения кислорода клетками эрвиний наступала тем быстрее, чем больше была концентрация токсина. Весьма вероятно, что увеличение вызвано стимуляцией в дыхательной^цепи переноса электронов (адаптивное усиление) в ответ на присутствие дельта-эндотоксина.

Динамика изменения интенсивности дыхания была исследована; через 2,5 и 7 мин инкубации ■•; представлена на рис. 2.

Рисуммга Ими IUI 1)11 потребления wenepw* НЩС1М1»ЧТ1ШШ1 гмад«йыаи«ы д«льп*

0.» 0.5 0.75 1 1.35 V«

компкграшя а«ЛЬП-9Пв«Т9КС*М ^i^M*1)

Эффект начального стимулирования поглощения кислорода в первые 2 мин инкубации с дельта-эндотоксином наблюдается при высоких его концентрациях, сменяется угнетением в период более 5 мин и постепенно затухает через 7 мин При более низких концентрациях эндотоксина эффект стимулирования поглощения кислорода наступает позднее - спустя 2,5 5 мин и сменяется угнетением поглощения спустя 7 мин

Через 15 мин дыхание бактериальных клеток во всех вариантах с использованием дельта-эндотоксина снижается до нерегисгриру смого минимума Динамика, когда кислородопотреблеяие в первые минуты быта боте с интенсивна чем в норме, характерна при обработке веществами -разобщитеиши окислительного фосфорилирования и дыхания, в результате чего нарушается синтез АТР, что приводит к деэнергизашш клеткии к нарушению энергопотребляющих процессов (транспорта ионов и неэлектролитов, синтезу белка и других) Разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования в микробных клетках в первые минуты действ!« дельта-эндотоксина приводит к усилению поглощения воды клетками, их набуханию и разрушению

6. Лабораторные и палевые испытания бактерицидного действия дельта-эидотоксипа В. thunngiensis против фитопатогенных микроорганизмов

При изучении влияния обработки семян дельта-эндотоксином на устойчивость капусты к слизистому бактериозу было установлено, что эта процедура повышала всхожесть семян и снижала послевсходовую гибель растений

Количество погибших растений при посеве обработанных семян в инфицированную почв\ было в 1,7 раз меньше, чем в варианте с посевом необработанными семенами (13,5 и 23 % соответственно) (табл 5) При выращивании обработанных семян в неинфшшрованнои почве количество погибших растений также было меньше, чем в варианте, где выращивались необработанные семена (соответственно 6,5 и 9,5 %)

В таблице 5 представлено влияние обработки семян капусты на послевсходовую гибель от слизистого бактериоза на 30-й день наблюдения

Результаты проведенного дисперсионного анализа показали, что в опыте есть существенные "различия по вариантам на 5% -ном уровне' значимости.

Таблица 5

Влияние обработки семян капусты на нослевсходовую гибель от слизистого бактериоза на 30-й день наблюдения

№ варианта Обработка семян дельта-эндотоксином Дополнительное инфицирование почвы Количество здоровых растений. Количество погибших растений % погибших растений от общего количества

1 2 3 4 5 . 6

1 181,411 19,8 ±6,7 9,5

- 2 + .187,4*16,7 13,2 ±3,2 • 6,5

3 + 154,7±14,9 46,8 ±9,9 23

4 173,9±13,8 27,3 ±7,6 13,5

Число повторностей =4 Р факт = 75,0 Р 05 =2,96 ' НСРМ - 1,08 !•" факт = 203,0 Р о? =2,96 НСРо! = 2.5

Применение дельта-эндотоксина положительно влияло на динамику развития рассады капусты. Так, в вариантах, где культивировали зараженную и не обработанную токсином рассаду капусты, её развитие значительно отставало от незаряженного контроля и от вариантов, где инфицированные растения обрабатывали дельта-эндотоксином: уменьшалось количество листьев и высота растений. , . ' ' *

Из данных таблицы 6 видно, что обработка растений дельта-эндотоксином положительно влияла на снижение поражаемости капуста слизистым бактериозом. Так, в вариантах 2 и 3, где культивировали заражённую капусту, к концу вегетации 7,6-10,0% растений оказались' пораженными слизистым бактериозом. В вариантах, где зараженные растения обрабатывались дельта-эндотоксином, этот показатель составил всего 0,9-3,8 %.

Таблица б

Влияние дельга-эндотокешга ВасШи!> ЙгаппрешЬ на поражаемость растений капусты слизистым бактериозом

Ва ри ли ты Методы гзразкемин ( погру-кевие корней рассады в бактериальную суспензию В-внесение и почву бактериальной счспензии) II зашиты Имеющие Нормальный кочан С недоразвитым кочаном Погибшие Растения поражённые слизистым бактериозом <"0 больных растений

I 2 3 4 5 6 7

1 Чистый контрочь 196,4± 164 3,6±2,1 1,8± 1,2 8,2±2,4 4,0

т А 155 6± 11,2 16 3± 4,5 14,5± 2,7 21,6±4,5 10,0

3 В 163,4± 12,6 14,2* 3,5 15,8±3, 3 16,6±;>,7 "6

4 А-^внесение в почву раствора д-эндотоксииа 1 кони 0 75 мг/чл 188,7± 14 2 8,4±2Д 4,6± 1,8 т1 8,3±2,4 3,8

5 А» внесение в почву раствора й-эндотоксина кони 1,5 мг м г 191,9± 13Д 6,3±1 4 5,7± 2,2 Ь,1±1,7 2,8

6 В+внесение в почву раствора 6-11шоток»-ина 0 75 мп мл 196,7* 1 эД 6,7±2,1 3,4± 1,3 ЗД±1,1 1,4

7 В+внесение б почл\ раитвора 6-эндотокслна I 5 чг мл 199,2± 10,1 4 2±1 Д 4 4± 1.5 2 2±1 7 09

Продолжение Табл. 6

1 2 3 4 5 6 7

8 В+обработка препаратом «Пяанриз». 191,3± 13,3 4,5±2,0 5,6± 1,7 8,6±3,8 3,8

Прип = 30 Гфакт=95,0; 1-о.о!=3,1; НСР = 7,8 Рфагг=1б1 Ро.о<=3,1; НСР = 1,5 Гфакт= 125,0; Ро.о5=3,1; НСР = 1,8 Рфакт=117,0; Го.о5=3,1; НСР = 2,3

Результаты проведенного дисперсионного анализа показали, что в опыте есть существенные различия по вариантам на 5% -ном уровне значимости. -V- '

В вариантах с обработкой инфицированных растений дельта-эндотоксином число, погибших и образовавших недоразвитый кочан растений также было значительно меньше, чем в тех вариантах, где инфицированные растения не обрабатывались (табл.6). -

Урожайность в вариантах 6 и 7, где культивировалась инфицированная и обработанная капуста, была на 8...22,4 % выше контрольной, в то время как необработанные варианты имели урожайность значительно (на 10,8...19,8%) ниже, чем в контроле. Варианты 5 и 8 не имеют существенных различий на 5 % уровне значимости.* • " •* * ' - •

Таблица7

Урожай капусты (в ц/га)

Варианты Урожай Отклонение от стандарта

Ц/га %

1 (контроль)- 474,3 - .

2 336,5 - 137,8 -28,2

3 380,6 -93,7 -19,8 т

4 423,7 -50,6 - 10,8

5 462,3 -12.0 -и

6 512,4 + 38,1 + 8,0

7 583,3 + 109,0 + 22,4

8 466,5 -8,2 -2,0

НСР 24,5 7.0

Результаты опытов в полевых условиях показали, что наилучшие показатели были достигнуты при обработке инфицированных растении раствором дельта-эндотоксина концентрации 1,5 мг/мл (вариант 7) Полученный в этом варианте урожай существенно, на 22,4% превышал контроль Хорошие результаты были достигнуты в случае применения раствора дельта-эндотоксина концентрации 0,75 мг/мл (вариант 6), где урожайность превысила контрольную на 8%

Таким образом обработка инфицированных растений дельта-эндотоксином оказывает оздоравливакшцш эффект на капусту, инфицированную культурой Е carotovora - улучшается всхожесть семян, снижается поражаемость растений слизистым бактериозом, повышается урожайность

Выводы

1 Различные подвиды Bacillus thunngiensis проявляют антимикробное действие в отношении фитопатогенных бактерий Erwmia carotovora vor carotovora, штаммы 72, 115, 216 и Xanthomonas campestns var campestns, штамм 8169 Эффект зависит от рода бактерий - объекта воздействия, подвида В tlranngiensis и от условий к\льтивирования Наиболее активное антибиотическое действие в отношении всех испытанных штаммов оказал подвид В thunngiensis subsp kurstaki, штамм Z-52 при совместном культивировании с фитопатогенными бактериями на ацетатной питательной среде

2 Наиболее чувствительными к дельта-эндотоксину В thunngiensis subsp kurstaki, штамм Z-52 оказались бактерии родов Erwima и Xanthomonas Степень бактерицидного действия зависела от штамма тестируемого микроорганизма и от концентрации дельта-эндотоксина. Литическии эффект дельта-эндотоксина постепенно затухал на 12-й день совместной инкубации клеток культуры фитопатогена с токсином Наиболее высокой удельной активностью по отношению к культуре Е carotovora var carotovora 115 обладала концентрация дельта-эндотоксина 1,8 мкгна 1 диск -21,9 отнед

3 Цитотоксический эффект дельта-эндотоксина В thunngiensis на клетки культуры Е carotovora проявляется в виде вакуолизации, наб\'\ания и завершается разрушением

4 В первые минуты инкубации (до 10 мин) суспензии клеток Е carotovora var carotovora, штамм 115 с дельта-эндотоксином происходит резкая стимуляция поглощения кислорода, которая прямо пропорциональна концентрации токсина Эффект начального стимулирования затем

сменяется угнетением и практически прекращается через 30 минут. Такая динамика потребления кислорода характерна при обработке клеток веществами - разобщителями окислительного фосфорилирования и дыхания.

В лабораторных и полевых испытаниях показано наличие оздоровительного эффекта при обработке раствором дельта-эндотоксина В. thuringiensis семян и рассады капусты, инфицированной суспензией бактерий Е. carotovora: улучшалась всхожесть семян, уменьшалось число заболевших и погибших растений, растений, образовавших • недоразвитый кочан, урожайность капусты повышалась не только по сравнению с . вариантами, где возделывались инфицированные и необработанные токсином растения, но и с чистым контролем.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Клименгова Е.Г. Проблемы и перспективы использования Bacillus • thuringiensis в борьбе с бактериальными болезнями растений // Труды молодых ученых УлГУ, Ульяновск. - 1998. - С.78-80.

2., Каменек Л.К, Клименгова Е.Г., Левина Т.А., Вязьмийа H.A. Антибиотическое действие Bacillus thuringiensis в отношении некоторых . аэробных бактерий-фитопатогенов / Материалы межрегиональной научно-практической конференции

«Экологические проблемы Среднего Поволжья», Ульяновск. -

1999,- С.221-224.' * ..

3. Каменек Л.К., Клименгова Е.Г., Тюльпинева A.A. Антимикробная активность Bacillus thuringiensis в отношении некоторых аэробных бактерий-фитопатогенов // Ученые записки УлГУ, Ульяновск. -

2000.-Вып. 1(2).-С. 11-15.

4. Каменек Л.К, Клименгова Е.Г., Тюльпинева A.A. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki на некоторые аэробные бакгер ии-ф итопато гены // Ученые записки УлГУ, Ульяновск - 2000. - Вып. 1(2). - С.78-82.

5. Клименгова Е.Г., Тюльпинева A.A. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как экологически безопасного агента на фитопатогенные грибы // Ученые записки УлГУ, Ульяновск. -2000. - Вып.1(2). - С.66 -67.

6. Клименгова Е.Г., Тюльпинева A.A. Перспективы использования безвредной для окружающей среды бактерии Bacillus thuringiensis в

защите растений от бактериозов / Тезисы докладов «Актуальные проблемы современной науки», Самара. - 2000 - С 93

7 Тюлыпшева А А, Климентова Е Г Дельта-эндотоксин Bacillus thunngiensis - экологически безопасный агент в борьбе против фитопатогенкьг\ грибов / Тезисы докладов «Актуальные проблемы современной науки», Самара - 2000 - С 98

8 Каменек Л К, Ктиментова Е Г Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thunngiensis в отношении фитопатогенных бактерий родов Envinia и Xanthomonas / Тезисы докладов Первого рабочего совешания микробиологов Поволжья «Фундаментальные аспекты микробиологии», Саратов - 2000 - Помещены на сайте Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

9 Каменек Л К, Климентова Е Г, Пантелеев С В Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thunngiensis subsp kurstakt, штамм Z-52 на дыхание клеток культуры Erwima carotovora / Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий», Ульяновск -2000 -С 98-100

10 Климентова Е Г, Тюлыпшева А А Перспективы использования безвредной для окружающей среды бактерии Bacillus tliunngiensis в защите растений от бактериозов / Тезисы докладов IV республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан», Казань - 2000-С 165

11 Каменек Л К., Тюльпинсва АА, Климентова Е Г, Демидова О А Дельта- эндотоксин Bacillus thunngiensis как агент биологического контроля болезней растений / Тезисы докладов V Путинской конференции молодых ученых 16-20 апреля 2001 года, г Пувдино -С 237

Подписано в печать 4.05.01. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №42/

Отпечатано с оригинал-макета в лаборатории оперативной полиграфии Ульяновского государственного университета 432700, г.Ульяновск, ул. Л.Толстого, 42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Климентова, Елена Георгиевна

Страница

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Глава 2. Объекты и методы исследований

Глава 3. Антибактериальная активность Bacillus thuringiensis и продуцируемых культурой дельта-эндотоксинов в отношении фитопатогенных бактерий

Глава 4. Цитотоксйческое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki, штамм Z-52 на клетки культуры Erwinia carotovora var. carotovora, штамм

Глава 5. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstalM»штамм Z-52 на дыхание клеток культуры Erwinialcafotovora var. carotovora, штамм

Глава 6. Лабораторные и полевые испытания бактерицидного действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis против фитопатогенных микроорганизмов

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий"

Актуальность темы. Интерес к изучению микробов-антагонистов и антибиотических веществ в области сельскохозяйственной микробиологии появился сравнительно недавно. Первые сообщения о литическом действии бактерий-антагонистов на фитопатогенные организмы сделал Я.П. Худяков (1935). Вслед за этим были изучены многие виды бактерий и грибов, обладающих антибиотическим действием на возбудителей главным образом грибковых заболеваний у растений.

Как показали результаты исследований, применение микроорганизмов как агентов биологического метода в борьбе с фитопатогенными организмами в сельскохозяйственной микробиологии и защите растений оказался весьма успешным.

В настоящее время в этой области применяется в основном химический метод борьбы с болезнями растений, который, несмотря на очевидные преимущества, такие, как быстрота достигаемого результата и высокая эффективность, имеет и ряд существенных недостатков, среди, которых токсичность пестицидов для флоры и фауны, медленная детоксикация в окружающей среде, приводящая к загрязнению биоценозов, развитие резистентности вредных организмов к применяемому препарату, что приводит к увеличению норм расхода и кратности обработок. В районах регулярного применения химикатов все активнее развиваются устойчивые штаммы возбудителей болезней наблюдается также появление более стойких видов, ранее не представлявших опасности. Многие пестициды обладают мутагенными терратогенными, эмбриотоксическими и канцерогенными свойствами. По данным Всемирной организации здравоохранения, ежегодно в мире более двух миллионов людей заболевает, а свыше сорока пяти тысяч умирает в результате отравления пестицидами (Вершинина и Алимова, 2000).

Один из наиболее эффективных путей сокращения объема примененш пестицидов в растениеводстве — разработка и внедрение биологически) методов регуляции численности вредителей, фитопатогенных микроорганизма и сорняков в рамках интегрированной системы. Преимуществами микробиологических средств защиты перед химическими являются: высокая биологическая эффективность микробных препаратов по отношению к восприимчивым видам вредителей и болезней, последействие, сопровождающееся гибелью вредителей на последующих фазах развития и в ряде поколений, избирательность действия, щадящее влияние на энтомофагов и насекомых — опылителей, малая вероятность возникновения устойчивости патогенов и вредителей к микроорганизмам, безвредность для теплокровных животных и человека, отсутствие фитотоксичности и влияния на вкусовые качества растительной продукции, возможность применения микробопрепаратов в любую фазу вегетации растений, отсутствие опасности накопления токсических веществ в окружающей среде. По данным Дебабова В.Г. (2000 г.), в 1999 г. в мире произведено средств защиты растений на основе микробной биотехнологии около 5 тыс.тонн на сумму порядка 40 млн. долл. США.

В настоящее время широко ведется поиск, выделение и идентификация i микроорганизмов, полезных для использования в защите растений, изучение механизмов их взаимодействия с вредными организмами, оценка перспектив практического использования.

Энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis - уникальная группа микроорганизмов обладающих способностью к синтезу белкового дельта -эндотоксина, обеспечивающих эффективное высокоспецифическое действие на различных насекомых, нематод и клещей - паразитов растений и животных (Егоров, Юдина, 1989; Edwards et al., 1990; Payne et al., 1994). В последнее время появились сообщения о том, что дельта-эндотоксины, продуцируемые такими подвидами В. thuringiensis, как finitimus, kurstaki, gallería, thuringiensis проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов (Юдина, Бурцева, 1997). Появились также данные об антибиотическом действии токсинов, вырабатываемых В. thuringiensis, на фитопатогенные грибы (Смирнов, 2000).

Препараты на основе В. thuringiensis широко используются в настоящее время во всем мире. Отсутствие патогенности у штаммов В. thuringiensis послужило основанием для присвоения им Управлением по контролю за качеством продовольствия и лекарственных средств США статуса GRAS (generally regarded as safe) — вполне безопасных организмов (Харвуд, 1992).

Известно, что дельта-эндотоксин является основным действующим началом В. thuringiensis в отношении некоторых чувствительных насекомых, остальные токсины и споры лишь усиливают вызванную им патологию (Aronson et al., 1986).

В мировой литературе накоплен большой материал, описывающий состав, строение, физико-химические свойства кристаллов, а также механизмы действия дельта-эндотоксина на чувствительные к нему организмы.

Установлено, что мишенью действия токсина являются клетки эпителия средней кишки чувствительных насекомых (Persy & Fast, 1983). Дельта-эндотоксин, прежде всего, взаимодействует с рецепторами мембран чувствительных клеток (Himeno et al., 1985), имеются указания на I лектинподобный характер такого взаимодействия по остаткам N-ацетилгалактозамина (Knowles et al., 1984). Дельта-эндотоксины большинства подвидов В. thuringiensis оказывают практически одинаковое действие на мембраны чувствительных насекомых, несмотря на некоторое различие по молекулярной массе (Himeno et al., 1985). Вместе с тем, подвиды В. thuringiensis различаются по спектру и силе инсектицидного действия их кристаллов (Thomas & Ellar, 1983; Wu & Chang, 1985). Изучению механизма действия дельта-эндотоксина ряда подвидов В. thuringiensis на клетки чувствительных насекомых посвящено много работ. Установлено нарушение транспорта ионов, а также зависящего от ионов К+ транспорта аминокислот, активирование АТРаз, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания, выражаемое в способности дельта-эндотоксина осуществлять протонодонорную функцию (Persy & Fast, 1983; Каменек и Штерншис, 1985; Sacci et al, 1986; Каменек, 1998).

Первые сообщения о возможностью антибиотического действия эндотоксина В. Лигш^егшв на микроорганизмы появились в 1982 г. (Егоров и соавт., 1982). Весьма перспективным представляется изучение антибиотических свойств дельта-эндотоксинов В. Лиш^епав в отношении различных фитопатогенных бактерий - аэробов, так как влияние этих токсинов на клетки прокариот и эукариот (в частности, насекомых) имеет общую природу (Егоров с соавт., 1990; Юдина с соавт., 1988).

Нами было проведено изучение чувствительности 12 штаммов различных родов фитопатогенных бактерий к четырем подвидам В. Липг^егшз и ее дельта-эндотоксину, позволившее сделать выводы, основные положения которых согласуются с результатами, полученными ранее различными авторами.

Сформулированные выводы можно рассматривать как перспективные для применения в биологическом методе защиты растений.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось выявление бактерицидного действия В. Липп§1еп818 и ее дельта-эндотоксинов на фитопатогенные бактерии, выяснение особенностей механизма их взаимодействия с дельта-эндотоксином и разработка практических приемов использования дельта-эндотоксина В. 11шгт§1еп818 борьбе в борьбе с бактериозами растений.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• изучить бактерицидное действие различны^}подвидов В. Шипг^егшз на

§ фитопатогенные бактерии;

• установить наиболее чувствительные к действию дельта-эндотоксина В. ^игт^еодв фитопатогенные бактерии;

• выявить особенности и механизм цитотоксического действия дельта-эндотоксина на клетки прокариот;

• изучить в условиях лабораторных и полевых испытаний бактерицидное действие наиболее активного дельта-эндотоксина В. Йндт^егшв БиЬБр kurstaki штамм Z-52 на фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora var. carotovora штамм 115, вызывающие слизистый бактериоз капусты.

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение бактерицидных свойств В. thuringiensis и дельта-эндотоксина в отношении 5 родов фитопатогенных бактерий.

Впервые было доказано (in vitro), что В. thuringiensis subsp. kurstaki и ее дельта-эндотоксины оказывают бактерицидное действие на бактерии -фитопатогены, вызывающие слизистый бактериоз капусты: Erwinia carotovora var. carotovora, штаммы 72, 115, 216. Показано, что величина этого эффекта зависит от рода тестируемого организма и концентрации дельта-эндотоксина. При совместном культивирование В. thuringiensis с бактериями -фитопатогенами на разных питательных средах наблюдалось изменение антибактериальной активности бацилл. Выявлены особенности цитотоксического действия дельта-эндотоксина на клетки культуры Е. carotovora. С помощью манометрических методов установлена способность дельта-эндотоксина резко стимулировать поглощение кислорода бактериальными клетками в первые минуты инкубации. В результате полевых испытаний выявилось наличие защитного эффекта при обработке раствором дельта-эндотоксина рассады капусты, инфицированной Е. саго^ога.

Практическая значимость работы. Результаты проведенной работы, показывающие бактерицидное действие В. thuringiensis и ее дельтасоздания новых экологически безопасных бактериальных препаратов на основе В. thuringiensis, направленных против бактериозов культурных растений.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых УлГУ (Ульяновск, 1998), Межрегиональной научно-практической конференции «Экологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 1999), Первой Международной научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара. 2000), Первом рабочем совещании микробиологов Поволжья эндотоксинов на фитопатогенные могут быть использованы для

Фундаментальные аспекты микробиологии» (Саратов, 2000), четвертой республиканской научной конференции «Актуальные экологические проблемы республики Татарстан» (Казань, 2000), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы мониторинга антропогенно-нарушенных территорий» (Ульяновск, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем диссертационной работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав и выводов общим объемом 100 страниц компьютерного набора. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 11 рисунками. Список литературы состоит из 158 наименования, в том числе 9S наименований на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Климентова, Елена Георгиевна

Выводы

1. Установлено, что различные подвиды В. thuringiensis проявляют антимикробное действие в отношении ряда широко распространенных аэробных бактерий-фитопатогенов. Полученный эффект зависел как от вида микроорганизма, объекта воздействия, так и от свойств самих подвидов В. thuringiensis. Наиболее активным оказался подвид В. thuringiensis subsp. kurstaki штамм Z-52, который в разной степени подавлял развитие культур фитопатогенных бактерий.

2. Выявлено бактерицидное действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki штамм Z-52 на представителей некоторых особо чувствительных к токсину аэробных бактерий родов Erwinia и Xanthomonas. Величина этого действия зависела как от вида тестируемого организма, так и от концентрации дельта-эндотоксина. Литическое действие дельта-эндотоксина оказалось достаточно продолжительным и постепенно затухало лишь на 12-й день инкубации клеток культуры-фитопатогена с дельта-эндотоксином. Наиболее высокой удельной активностью по отношению к культуре Е. carotovora var. carotovora 115 обладала концентрация дельта-эндотоксина 0,25 мг/мл - 21,9отн.ед.

3. С помощью световой микроскопии установлено, что дельта-эндотоксин В. thuringiensis оказывает цитотоксический эффект на клетки культуры Е. carotovora. Клетки вакуолизируются, набухают и разрушаются.

4. Установлено, что в первые минуты инкубации суспензии клеток с дельта-эндотоксином происходит резкая стимуляция поглощения кислорода, которая прямо пропорциональна концентрации токсина. Эффект начального стимулирования поглощения кислорода в течение первых минут сменяется угнетением в период более 10 минут и практически прекращается через 30 минут. Такая динамика потребления кислорода характерна при обработке клеток веществами-разобщителями окислительного фосфорилирования и дыхания.

5. Результаты лабораторных (in vivo) и полевых испытаний подтвердили наличие оздоровительного эффекта при обработке раствором дельта-эндотоксина инфицированной рассады капусты: уменьшалось число погибших и заболевших растений, растений, образовавших недоразвитый кочан, урожайность капусты повышалась.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климентова, Елена Георгиевна, Ульяновск

1. Азизбекян Р. Р., Смирнова Т. А., Миненкова И. Б., Ребектиш Б. А. Лизогения у Bacillus thuringiensis //Микробиология. 1980. - Т. 49. - с. 961-968.

2. Ануфриев Э. Ф. Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. dendrolimus //В: Энтомопатогенныебактерии и грибы в защите растений. 1985. - с. 135-145.п

3. Африкян Э. Энтомопатогенные бактерии. Успехи микробиологии., 1975, вып. 10; с. 148-172.

4. Билай В. И, Гвоздяк Р. И., Скрипаль И. Г. и др. Микроорганизмы -возбудители болезней растений. / Киев: «Наукова думка», 1988. 552с.

5. Бирюзова В. И., Лукоянова М. А., Гельман Н. С., Опарин А. И. Доклады АН СССР, 1964, 156, с. 198.

6. Бирюзова В. И., Мейсель М. Н. В кн.: «Молекулярная биология», М., «Наука», 1964, стр.316.

7. Бурдейная Т. В. Испытание бактериальных антагонистов в борьбе с бактериальным корневым раком малины. // Мол. ученые садоводам России: Тезисы докладов Всероссийского совещания, Москва, 20-21 июня, 1995.-М., 1995.-с. 225-227

8. Бурлак В. А. // Материалы Всес. конференции «Микроорганизмыстимуляторы и ингибиторы роста растений и животных». Ташкент, 1989.,з4.1, с. 34.

9. Вершинина В.И., Алимова Ф.К. Продукты на основе микробной биомассы / Микробная биотехнология.- Казань: Унипресс: ДАС, 2000.- с.368.

10. Гулий В. В., Иванов Г. М., Штерншис М. В. Микробиологическая борьба с вредными организмами. // М., «Колос», 1982, 270с.

11. Гулий В. В., Теплякова Т. В., Иванов Г. М. Микроорганизмы, полезные для биометода. Изд-во «Наука», Сибирское отделение., Новосибирск., 1981., 270с.

12. Далин М. В., Фиш Н. Г. Белковые токсины микробов. М.: Медицина, 1980, 224с.

13. Дебабов В. Г., Азизбекян Р. Р., Хлебалина О. Н. Выделение и предварительная характеристика экстрахромосомальных элементов ДНК Bacillus thuringiensis. Генетика, 1977, Т. 13, №3, С. 496-501.

14. Дебабов В.Г. I рабочее совещание микробиологов Поволжья, 3-5 октября 2000 года, Саратов.

15. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1979. - 416 с.

16. Егоров Н. С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: «Высшая школа», 1965., 212с.

17. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: «Высшая школа», 1986., 448 с.

18. Егоров Н. С., Лория Ж. К., Юдина Т. Г. Изучение свойств параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis. // Материалы Всесоюзного симпозиума по биологии клетки. Тбилиси., 1985., 4.1., с. 259.

19. Егоров Н. С., Юдина Т. Г. Производство и применение продуктов микробиологических производств. М.: ВНИИСЭНТИ Минмедбиопрома, 1989., вып. 6, 50 с.

20. Егоров Н. С., Юдина Т. Г., Баранов А. Ю. О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis. // Микробиология. 1990. - Т. 59. - Вып. 3. с. 448-452.

21. Ивинскене В. JI. Роль фосфолипазы и термостабильного экзотоксина в патогенности Bacillus thuringuensis. Автореф. дисс. . канд. биол. наук. JL, 1984.- 17 с.

22. Ивинскене В. JL, Заянчкаускас П. А. Патологические изменения гемоцитов у гусениц под воздействием фосфолипазы. // Труды АН Лит. ССР. Сер. В. -1986.1. Т. 2 (33). с. 64-72.

23. Ивинскене В. Л., Заянчкаускас П. А. Патологические изменения гемоцитов у гусениц под воздействием термолабильного экзотоксина. // Труды АН Лит. ССР. Сер. В. 1986. - Т. 3 (95). - с. 43-50.

24. Каменек Л. К. Автореф. на соиск. уч. степени докт. биол. наук., М., 1998., 345 с.

25. Каменек Л. К. Структура, свойства и механизм действия 8-эндотоксина Bacillus thuringiensis. / В кн.: Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. Новосибирск., 1987, с. 42-57.

26. Каменек Л. К., Штерншис М. В. Влияние 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis на активный транспорт ионов у насекомых. // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. 1984.-Вып. 3.-е. 113-117.

27. Каменек Л. К., Штерншис М. В. Разобщающее действие 8-эндотоксина Bacillus thuringiensis. // Интегрированная защита растений от болезней и вредителей в Сибири. Новосибирск., 1985. с. 148-154.

28. Кандыбин и соавт. «Актуальные проблемы биологической защиты растений» / Труды конференции, Минск, 1998, с. 62-63.

29. Кандыбин, Смирнов Агро XXI, 1999, № 9, с. 11.

30. Лиховидов В. Е., Китик В. С., Тихоняк П. А. Герпетобий полей овощных культур в связи с проблемами экотоксикации. / В кн.: Проблемы почвенной зоологии (тезисы докладов VIII Всес. Совещ.), Ашхабад, 1984, кн. 1, с. 184-185.

31. Лукин А. А., Пермогоров В. И. Роль пептидных антибиотиков в регуляции клеточной дифференциации у бактерий. // Антибиотики. 1983. № 6. с. 28. с. 406.

32. Макарюнайте Ю. П. Хроматографическое разделение комплекса фосфолипаз Bacillus cereus и характеристика индивидуальных ферментов: Автореф. дис. . канд. биол. наук.- Вильнюс, 1985, 19 с.

33. Новикова Л. М., Попов Ф. А., Вельская С. И., Шабашова Т. Г. Возможность использования штамма Bacillus myc. 683 для защиты картофеля и капусты от болезней. // Вести академии сельскохозяйственных наук Беларусии. 1994. -№ 1. - с. 89-92, 126.

34. Пидопличко В. Н., Гарагуля А. Д. Антагонистическое действие бактерий родов Pseudomonas и Bacillus на возбудителей картофельной гнили озимой пшеницы. Микология и фитопатология. Т. 13., 1979.

35. Плохинский H.A. Математические методы в биологии. М.: МГУ, 1978. -265 с.

36. Рябченко Н. Ф., Алиханян С. Н. Бактериоциногенные плазмиды Bacillus thuringiensis. // Генетика. 1984. - 20, № 7. - с. 1067-1070.

37. Сазыкин Ю. О. Антибиотики как химические реагенты. // ВИНИТИ. 1984. с. 3.

38. Скулачев В. П. Биоэнергетика. Мембранные преобразователи энергии. М., «Высшая школа», 1989,270с.

39. Смирнова М. А., Богданова Г. Л., Гальперин М. Ю. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1987., № 10, с. 23.

40. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в РТ.М.: Агрорус, 2000. 269с.

41. Степанов В. М., Честухина Г. Г. Структурные основы биологической специфичности эндотоксинов. // Материалы Всесоюзной Конференции «Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений». 1986., с. 207.

42. Харвуд К. Р. Бациллы. Генетика и биотехнология. М. "Мир". - 1992. - 530 с.

43. Хохряков М. К., Доброзракова Т. Л., Степанов^. М., Летова М. Ф. Определитель болезней растений. Изд. "Колос", Ленинград, 1966. 590 с.

44. Честухина Г. Г., Степанов В. М. Сравнительная биохимия 5-эндотоксинов и ферментов Bacillus thuringiensis. // Тез. Всесоюз. биохим. съезда. М.: Наука, 1985., Т. 1, с. 236.

45. Честухина Г. Г., Тюрин С. А., Остермах А. Л., Залунин И. А., Костина Л. И., Ходова О. П., Степанов В. М. Структурно-функциональные особенности энтомоцидного белка Bacillus thuringiensis. // Тез. Всесоюзн. биохим. съезда.

46. М.: "Наука", 1985. Т. 2. с. 20.

47. Шарга Б. М., Туряниц А. И. Микробы антагонисты возбудителей бактериального ожога плодов. // Защита растений, № 10, 1991.

48. Шарга Б. М., Туряниц А. И., Вьюницкая В. А. Антагонистическая активность споровых бактерий по отношению к некоторым представителям рода Erwinia. // Микробиологический журнал. 1994. - 56, № 1.-е. 1-25.

49. Штерншис М.В. Спектрофотометрический метод определения концентрации микроорганизмов в суспензии.// Бюлл.научно-техн.инф.- 1976. СибНИИЗХим. Новосибирск. - в. 16. - с. 44 -50.

50. Юдина Т. Г., Егоров Н. С., Лория Ж. К., Выборных С. Н. Биологическая активность параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1988. - № 3. - с. 427- 436.

51. Юдина Т. Г., Милько Е. С., Егоров Н. С. Чувствительность диссоциатов Micrococcus puteus к действию 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis. // Микробиология № 3. 1996. - Т. 65. - с. 365-369, 321-325.

52. Юдина Т. Г., Саламаха О. В., Олехнович Е. В., Рогатых Н. П., Егоров Н. С. Влияние источников углерода на биологическую активность и морфологию параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis. // Микробиология. 1992. -Т. 61.-е. 577-584.

53. Юдина, Т. Г., Бурцева Л. И. Действие 8-эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот. // Микробиология, 1997. Т. 66. № 1.-е. 25-31.

54. Abrams A., ftQ Namara P., Johnson F. J. Biol. Chem., 1960, 235, 3659.I

55. Adang Michael J., Rocheleu Thomas A., Merlo Donald Y., Murray Elisabeth E. Mycogen Plant Sciences, Ync. № 369835; Заявл. 0601. 95. Опубл. 22. 10. 96; НПК 536/23.71. synthetic incecticidal crystal protein gene. Пат. 5567600 США, МПК6с 12 № 15/32.

56. Angus Т. A. Association of toxility with protein crystalline inclusion of Bacillus sotto Ischiwata // Canad. J. Microbiol. - 1956. - V. 2 - p. 122-131.

57. Aronson A. I., Fitz-James P. C. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat. // Bacterid. Rev. 1976. - V. 40. - p. 360-402.

58. Aronson A. J., Dong W. // J. Cell. Biochem. 1989. Suppl. 13 A. p. 151.

59. Aronson A. L., Beckman W., Dunn P. // Microbiol. 1984. V. 11 № 3. p. 171.

60. Aronson A. L., Beckman W., Dunn P. //Microbiol. Rev. 1986. V. 50. № 1. P. 1.

61. Asnis R., Vely V., Glick M. // J. Bacterid., 1956, 72, 314.

62. Baquero F., Moreno F. The microcins // FEMS Microbiol. Wett. 1984. V. 23. № 2-3. P. 117.

63. Baijac H., Bonnefoi A. A classification of strains of Bacillus thuringiensis Berliner with a key their differentiation. J. Invertebr. Pathol., 1968, V. 11, p. 335-347.

64. Baumann L., Okamoto K., Unterman B. M., Lynch M.' Y., Baumann P. Phenotypic Characterization of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. // J. Invertebr. Pathol. 1984. - V. 44. - p.329-341.

65. Beeblee T. G. C., Bond R. P. M. Effect of an exotoxin from Bacillus thuringiensis on deoxyribonucleic acid depended ribonucleic acid polymerase in nuclei - from adult Sarcophaga bullata. // Biochem. J. - 1975. - V. 136.1. - p. 9-13.

66. Berliner E. Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenrouppe (Ephestia Kuhniella Zell.) und ihen Erreger Bacillus thuringiensis, n. sp. // Z. Angew. Entomol. -1915.-V. 2.-p. 29-56.

67. Berliner E. Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenrouppe. // L. Ges. Getreidew. -1911. -V. 3. -p. 63-70.

68. Bulla L. A., Kramer K. J., Bechtel O. B., Davidson L. I. Entomocidal proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis. // In: Microbiology, 1976. -Washington: D. C., 1976. p. 534-539.

69. Carlton B. C. Complex plasmid system of Bacillus megaterium. // Microbiology. 1976. - 24, № 1. - p. 394-405.

70. Chapman J. S., Carlton B. C. Conjugal plasmid transfer in Bacillus thuringiensis. // Plasmid Bacteria Conf. Urbana Inl. May 1984. N. Y.; L., 1985. P 453.

71. Chestukhina G. G., Kostina L. I., Mikhailova A. L., Yurin S. A., Klepikova F. S., Stepanov V. M. The main features of Bacillus thuringiensis S-endotoxin molecular structure. Arch, Microbiol., 1982, 132: 159-162.

72. Cooksey K. E. Purification of a protein from Bacillus thuringiensis toxic to a larvae of Lepidoptera.// Biochem.J. 1968. - V.106. - P.445-454.

73. Cooksey K. E., Donninger C., Norris J. R., Shankland D. Nerve-block effects of Bacillus thuringiensis protein toxin. // J. Invert. Pathol. 1969. - V. 13. - p. 461-452.

74. De Baijac H. Insect pathogens in the genus Bacillus, in: The Aerobic, Endospore-Forming Bacteria: Classification and Identification (R. C. W. Berkeley and M. Goodfellow, eds.), 1981, Academic Press, New York, pp. 241-250.

75. Egorov N. S., Yudina T. G. / Proc. 4th Europ. Congr. on Biotechnol. 1987 // Eds. by Nejissel O. M. et al. Amsterdam, 1987. V. 3, P. 550.

76. English L., Slatin S. L. Mode of action of delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis: comparison with other bacterial toxins. // Insect Biochem. and Mol. Biol. 1992. V. 2. № 1. P.l-7.

77. Farkas-Himsley H. Bacteriocins are they broad-spectrum antibiotics? // J. Antimicrob. agents and Chemother. 1980. V. 6. №-4. P. 424.

78. Faust R. M. Nature of pathogenic process of Bacillus thuringiensis. // Compar. Pathol. 1984. - V. 7. -p. 91-141.

79. Feiteison J. S., Payne J., Kim L. Bacillus thuringiensis: insects and beyond. // Biotechnology. 1992. - 10.№ 1. - p. 271-275.

80. Fitz-James P. / J. Biophys. and Biochem. Cytol. 1960, 8, 507.

81. Gingrich R.E. A flotation procedure for producing sporefree crystals from commercial formulation of Bacillus thuringiensis J.Invert. Pathol., 1968,Q/.10, pp.180- 184.

82. Gonzales J. M., Dulmage H. T., Carlton B. C. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding delta toxin among strains of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. - 79. - p. 6591-6595.

83. Hannay C. L. Crystalline inclusions in aerobic sporeforming bacteria. // Nature. -1953.-V. 172.-p. 1004.

84. Heimpel A. M. A critical review of Bacillus thuringiensis var. thur. Berliner and other crystalliferous bacteria. // Ann. Rev. Entomol. 1967. - V. 12. - p. 287-322.

85. Heimpel A. M. A strain of Bacillus -cereus Fr. and Fr. pathogenic for the larch sawfly, Pristiphora erichsonin (Htg) // Can. Entomol. 1954. - V. 86. - p. 73-77.

86. Heimpel A. M. The ph in the gut and blood of the larch sowfly, Pristiphora erichsonii Htg and other insects with reference to the pathogenicityof Bacillus cereus Fr. and Fr. // Canad. J. of Zoology. 1955. - V. 33, № 2. - p. 99-106.

87. Heimpel. A. M., Angus T. A. The site of action of ciystalliferous Bacteria in Lepidoptera larvae. // J. Insect. Pathol. 1959. - V. 1. - p. 152-170.

88. Herrnstandt C., Soares G. G., Wilcox E. R., Edwards P. 1. A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against Coleopterion insects. // Biotechnology, 1986, 4: 305-308.

89. Hill P. / Biochim. et Biophys. acta, 1962,27, 386.

90. Himeno M., Koyama N., Funato T., Komano T. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxin on insect cells in vitro. // Agric. and Biol. Chem. 1985. -V. 49. - № 5. - p. 1461.

91. Hofte H., Whiteley H. Insecticidae crystal proteins of Bacillus thuringiensis. // Microbiol. Rev. 1989. V. 53, № 3. - p. 242-260.

92. Hoolf van Iddekinge B. J. L., Meyer D., Zabel P., Vlak J. M. Detection of sequences in Autographa californica nuclear polyhedrosis virus DNA, that act as autonomous replication sequences (ARS) in yeasts. // Arch. Virol. 1986. - V. 88, №3-4.-p. 279.

93. Huber H. E., Luthy D. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin: composition and activation. / In: Q Davidson (ed.), Pathogenesis of enver tabrate microbial diseases, Allenheld, Osmun Fotowa, NJ, 1981, p. 2.

94. Huber H. E., Luthy D., Ebersold H.-R., Cordier J.-L. The subunits of the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis: sise, lineage and toxicity. //Arch. Microbiol. 1981, 129: 14-18.

95. Iizura T., Faust R. M., Travers R. S. Comparative profiles of exrtachromasomal DNA on single and multiple crystalliferous strains of Bacillus thuringiensis var. kurstaki. // J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. 1981b. - V. 60. - p. 143-151.

96. Ikezava H., Taquchi R. Phosphatidilinositolspecific phospholipase C. from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. // Methods in Enzymology. N. Y.: Acad. Press, 1981. - V. 71. - p. 731 -741.

97. Israil A. M. Recent data on the molecular biology Bacteriocins. // Arch. Roum. Pathol. Exptlet. Microbiol. 1984, № 1, p. 5.

98. Kawata T. / J. Gen. Appl. Microbiol., 1963, 9, 1.

99. Kim Y. T., Gregory B. G., Ignoffo C. M. The (3-exotoxin of Bacillus thuringiensis: effects of Bacillus thuringiensis of macromolecules in an insects cell line. // J. Invert. Pathol. 1972. - V. 20, 3. - p. 284-287.

100. Knowles B. H., Thomas W. E., Ellar D. J. Wectinlike binding of Bacillus thuringiensis var. kurstaki lepidoptera specific toxin is an initial step in insecticidal action. //FEBS Lett. 1984. V. 168. № 2. P. 197.

101. Krieg A. Concerning exotoxin produced by vegetative cells of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. // J. Invert. Pathol. 1971. - V. 17. - p. 134-135.

102. Krieg A. Transformatipns in the Bacillus cereus Bacillus thuringiensis group. Description of a new subspecies Bacillus thuringiensis var. toumanoffi. // J. Invert. Pathol. - 1969. - V. 17. P. 279-281.

103. Krieg A., de Baqac H., Bonnefoi A. A new serotype of Bacillus thuringiensis isolated in Germany: Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis. // J. Invert. Pathol. 1968. - V. 10. - p. 428-430.

104. Lagret I., de Baijac H. Specific et principe active de Bacillus thuringiensis var. israelensis. // Bull, de la Soc. Path. Exotique. -1981.-74 (2). p. 216-227.

105. Lana N. J., Maddrel S. H. P., Harrison J. B., Orectron J. A. // Cell. Biol. Sut. Repts. 1987. - V. 11. - № 3. - p.229.

106. Lecadet M.-M., Deconder R. Biogenesis of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis during sporulation. // Eur. J. Biochem. 1971. - V. 23. - p. 282-294.

107. Lereclus D., Lecadet M. M., Klier A., Riber J., Rapoport G., Dedonder R. Recent aspects of genetic manipulation in Bacillus thuringiensis. // Biochimie. -1985.-V. 67.-№ l.-p.91.

108. Luthy P. Insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis. I I FEMS Microbiology Letters. 1980. - V. 8. - p. 1-7.

109. Lysenko O. The taxonomy of entomogenous bacteria. // Insect. Pathol. V. 2, N. Y.: Academic Press, 1963, p. 1-20.

110. Mandi J., Paulus H. Effects of linear gramicidin on sporulation and intra cellular ATP pools of Bacillus brevis. // Arch. Microbiol. 1985. - V. 143 - № 3. -p. 248.

111. Marquis R., Gerhardt P. / J. Biol. Chem., 1964, 239, 3361.

112. Marr A. / Annual. Rev. Microbiol., 1960, 14, 253.

113. Mattes O. Parasitore Krankheiten der Mehlmotten larven und versuche über ihre Verwendbarkeit als bioloqiaches Becampyungsmittel. / Sitzunberg Ges. Befoerd. Gesamten Naturwiss. // Marburg, 1927. V. 62. - p. 381-417.

114. Mc Connel E., Richards A.G. The production by Bacillus thuringiensis Berliner of a heat-stable substance toxic for insects. // Canad. J. Microbiol. -1959.-V. 5 (2).-p. 161-168.

115. Minnich S. A., Aronson A. I. Regulation of prototoxin synthesis in Bacillus thuringiensis. // J. Bacterid. 1984. - V. 158. - № 2. - p. 447.

116. Mitchell P. / Annual Rev. Microhol., 1959, 13, 407. Q

117. Mitchell P. / Biochem. Soc. Sympos., 1959, 16, 73.

118. Mitchell P. / В кн.: "Cell Interface Reactio". H. Brown (ed.) N. Y., 1963.

119. Miteva V. I. Characteristics of there plasmids of Bacillus thuringiensis (В.) 1 secotype. Докл. Болг. АН, 1978,131, № 8, p. 1059-1062.

120. Mudd S, Kawata Т., Payne J., Sail Т., Takagi A. /Nature., 1961, 189, 79.

121. Nielsen L., Abrams A. Biochem. and Biophys. Res. Communs., 1964,17, 680.

122. Norris J. R., Burges H. D. The identification of Bacillus thuringiensis. // Entomophaga, 1965, V. 10, № 1, p. 41.

123. Oeda K., Inouye K., Ibuchl Y. // J. Bacterid. 1989. V. 171. № 6. P. 3568.

124. Ohba M., Aizawa K. Crystals of Bacillus thuringiensis subsp yunnanensis are produced only in asporogenous cells. // J. Invert. Pathol. 1986. - V. 48. - p. 254-256.

125. Ohye D., Murrell W. / J. Cell Biol., 1962,14, 111.

126. Pendleton I. R., Morrison R.B. Separation of the spores and crystals or Bacillus thuringiensis. Nature, 1966, V.212, pp.228 729.

127. Pendleton I. R., Bernheimer A. W., Grushoff P. Purification and partical characterization of hemolisins from Pendleton I. R.,. // J. Inverterb. Pathol. -1973.-V. 21.-p. 131-135.

128. Percy J., Fast P. G. Bacillus thuringiensis crystal toxin: ultrastructural stadies of its effect on silkworm midgut cells. // Invert. Pathol. 1983. V. 41. - № 1. - P. 86.

129. Prasad S. V., Shethna Y. I. Mode of action of a purified antitumor protein from the proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis on Yoshida ascites Carcoma cells. // Antimicrob. Agents and Chemother. 1976. - V. 10, № 2. - p. 293.

130. Rogers H. J. The bacterial surface where does it begin and ends? // Antibiot. Inhib. Bact. Cell Surface Assembly and Funct.: Conf., Philadelphia 17-20 May, 1987. Wash. D. C.; 1988. P. 639-641.

131. Sadoff Ph. D. The antibiotics of Bacillus species: their possible roles in sporulation. // Progress in industrial microbiol. / Ed. Hockenhull O. J. D. 1972. V. 11.P. 1.

132. Scherrer P. Molecular elastic gel network structure of the Bacillus megaterium cell wall. // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1986. 86th Annu. Meet., Wash. D. C., 23-28 March, 1986. Wash D. C. 1986. P. 191.

133. Scherrer P., Luthy P., Trumpi B. // Appl. Microobiol. 1973. V. 25. № 4. P. 644.

134. Schneft H. E., Wong H. C., Whiteley H. R. The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence. //J. Biol. Chem. 1985. V. 260. № 10. P. 6264.

135. Sebesta K., Horska K., Vankova J. Isolation and properties of the insecticidal exotoxin of Bacillus thuringiensis var. gelechiae. // Auct. Collection Czechoslov. Chem. Commun. 1969. - V. 34. - p. 891-900.

136. Shestukhina G. G., Kostina A. L., Mikhailova S. A. The main features of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin molecular structure. // Arch. Microbiol. -1982.-V. 132.-p. 159-162.

137. Shivakunar A. G. // J. Bacterid. 1986. V. 116. № 1. P. 194.

138. Singer S. Use of entomogenous bacteria against insects of public health importance. / Develop. Ind. Microbiol., Houston. Tex., 1978. Arlington, Va, 1979, p. 117-122.

139. Smith N. R., Gordon R. E., Clark F. E. Aerobic mesophilic spore forming bacteria. // US Department of Agriculture monograph Washington, 1952. - p. 16.

140. Somerville H. J., Jones M. L. DNA competition studies within the Bacillus cereus group of Bacilli. // J. Gen. Microbiol. 1972. - V. 73. - p. 257-265.

141. Thomas W. E., Ellar D. J. Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal 5-endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo. // J. Cell Sci. 1983. V. 60. №3. P. 181.

142. Thwaites J. J., Surana V. C., Jones A. M. Mechanical properties of Bacillus subtilis cell walls: effects of ions and lysozim. // J. Bacterid. 1991. V. 1*73. № 1. P. 204-210.

143. Tissieres A., Slater E. / Nature, 1955, 176, 736.

144. Toumanoff C. Etude comparative de la souche toxigene de Bacillus cereus var. sotto (Ischiwata) agent pathogene de la flacherie des vers a sole an Japon. // Ann. Inst. Pasteur. 1955. - V. 83 (3). - p. 384-387.

145. Travers R. S., Faust R. M., Reichelderfer C. F. Effects of Bacillus thuringiensis var. kurstaki delta-endotoxin on isolated lepidopteran mitochondria. // J. Invert. Pathol. 1976. - V. 28. - p. 351 -356.

146. Tyrell D. J., Bulla L. A., Andrews R. E., Kramer K. J., Davidson L. I., Nordin P. Comparative biochemistry of entomocidal parasporal crystals of selected Bacillus thuringiensis strains. // J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - p. 1052-1062.

147. Vidaver A. K. Bacteriocins: the fiture and reality. // Plant Disease: 1983. V. 67. №5. P. 471.

148. Weibull C., Greenawalt I., Low. H. / J. Biol. Chem. 1962, 237, 847.

149. Winder W. R., Whiteley H. R. // J. Bacteriol. 1989. V. 171. № 2. P. 965.

150. Wu D., Chang F. N. Cynergisn in mosquitocidal activity israelensis crystal. // FEBS Lett. 1985. V. 190. № 2. P. 232.