Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток

Каменек, Дмитрий Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток"

00346 1 177

На правах рукописи

КАМЕНЕК ДМИТРИЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS НА ПЕРЕВИВАЕМЫЕ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань, 2009

1 2 &ЕЗ ^сд

003461177

Работа выполнена на кафедре общей и биологической химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

член-корр. АН Татарстана Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Алимова Фарида Кашифовна (зав. кафедрой биохимии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина, г. Казань)

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич (зав. кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ветеринарно-сани-тарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии)

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Саратовский государственный

университет им. Н.Г. Чернышевского

Защита диссертации состоится ^Ье^оО.2009 года в /Запасов на заседании диссертационного совет/ Д' 212.081.08 при ГОУ Казанский государственный университет имени В.И. Ульянова-Ленина, по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлёвская, 18, аудитория 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Bacillus thuringiensis является широко распространенной в природе кристаллофорной спорообразующей бактерией. Известны ее энтомопатогенные свойства и промышленные препараты на основе бактерии являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.

Известно, что основным действующим началом В. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта - эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов В. thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003; Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки НеР, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что В. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.

Создание и применение средств на основе дельта-эндотоксина позволило бы не только обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, но и, возможно, решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Прежде всего, разработать препаративные формы, обладающие антимикробной и противораковой активностью и не токсичные для нормальных клеток. Их разработке должны предшествовать исследования, выполненные на культурах клеток.

В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматнческих мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТРаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002). Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования - охарактеризовать по морфологическим и биохимическим параметрам этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto и выявить особенности механизма его действия на клетки перевиваемых линий HeLa, В16 и L1210.

Основные задачи исследования:

1. Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий HeLa, В16 и LI210.

2. Определить влияние дельта-эндотоксина на ионный гомеостаз клеточных линий, установив факт нарушения транспорта основных неорганических ионов (К+, Na+, Са2+ и Mg2) вследствие изменения активности основного ионного транспортера - К+, Na+- АТФазы.

3. Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур

4. Проанализировать влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза в клетках HeLa согласно показателям активности основных ферментов гликолиза - 3-фосфоглицерат-дегидрогеназы и лактат-дегидрогеназы.

5. Охарактеризовать ранние и поздние этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto

Научная новизна результатов исследований. Впервые проведено изучение влияния дельта-эндотоксина В. thuringiensis на клетки перевиваемых культур {HeLa, L1210, В16). Показано, что изученные культуры отличаются по чувствительности к токсину. Установлена прямо пропорциональная зависимость их чувствительности от времени контакта с токсином и его концентрации.

Показано, что действие дельта-эндотоксина на культуры раковых клеток, аналогично таковому для клеток кишечника и культур насекомых. Установлено нарушение работы ион транспортирующей Mg2+-3aBnciiMoü АТФазной системы, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Показана первичность активирования фермента (в течение первых 10 мин) по отношению к изменению концентраций ионов, которое начиналось только через 10-15 мин.

Установлено, усиление клеточного дыхания в течение первых 10 минут воздействия дельта-эндотоксина на фоне резкого снижения синтеза АТР, которое, вероятно, связано с разобщением окислительного фосфорилирования и дыхания, приводящего к деэнергизации митохондрий и клеток в целом.

Установлено начальное усиление гликолиза, очевидно связанное с необходимостью компенсации снижения синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования, за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза. Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицерат дегидро-геназы и лактат-дегидрогеназы, ферментов катализирующих из ключевых стадий гликолитического процесса.

Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактатдегидрогеназы во внеклеточную жидкость и значительное повышение содержания лактата в ней.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы при разработке препаративных форм для лечения различных форм онкологических заболеваний человека и домашних животных, а так же при оценке безопасности применения эндотоксинсодержащих пестицидов. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе как вносящие вклад в представления о механизмах действия бактериальных токсинов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Цитопатический эффект дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. sotto связан с изменением структуры клеток (нарастающая вакуолизация с последующим разрушением), пропорционален его концентрации и времени контакта с клетками перевиваемых культур. Эффективность действия токсина различается по силе для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток В16 и L1210.

2. Действие дельта-эндотоксина характеризуется нарушением транспорта ионов К\ Na+, Са2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток, которому предшествует значительная (до 6,8 раз) активация Mg^-зависимой К+, Na+- АТФазы.

3. Дельта-эндотоксин угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.

4. Проявлением действия дельта-эндотоксина является интенсификация гликолиза в клетках HeLa на начальном этапе и активация 3-фосфоглицерат дегидрогеназы с последующим ее угнетением, сменяемым активацией характерного для анаэробного режима гликолиза фермента - лактат дегидрогеназы.

5. Разрушению клеток под действием дельта-эндотоксина предшествует, деэнергизация митохондрий, снижение потребления кислорода, активациея анаэробного пути гликолиза, нарушение целостности мембран и выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (Ульяновск, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); Всероссийской школе-семинаре молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004-2006); Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов (Москва, МГУ, 2007); Регионального научного семинара Министерства образования РФ « Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в

биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госуниверситета (2003-2008).

Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 14 работах.

Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного набора, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований результаты исследований и их обсуждение с учетом существующих в литературе данных, заключения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы содержит 270 источников, в том числе 91 - на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методики исследований

В соответствии с поставленной задачей нами были изучено действие дельта-эндотоксинов различных штаммов В. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki, thuringiensis, sotto, dendrolimus, (Cry IA класса), на клетки lie La, LI210, B16 и SCLd-135.

Кристаллы растворяли 0,04 M NaOH, затем рН снижали до 7,8 осторожным титрованием 0,1 М HCI. Кристаллы предварительно отделяли от спор в двухфазной системе: хлороформ - водный раствор Na2S04 (Cooksey, 1968). Разделение полипептидов проводили методом хроматографии на колонке Sephadex-G-200 размером 2,54x10 см. Уровень белка определяли по методике. Для дальнейшей работы собирали фракции с Mr выше 60000 Д. Очистку дельта-эндотоксинов завершали микрофильтрацией через бактериальные фильтры, которая являлась одновременно и стерилизацией.

Для световой микроскопии препараты фиксировали в фиксаторе Карнуа и окрашивали кристаллическим фиолетовым (Пирс, 1962). Содержание неорганического фосфата определяли по методу Самнера (1989).

Концентрацию ионов измеряли с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра марки С-115. Поглощение кислорода изучали микроманометрическим методом (Travers et al., 1976).

Активность ферментов определяли спектрофотометрически после экстракции 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,3 (лактат дегидрогеназа) или 0,1М карбонатным буфером, рН 9,8 (3-фосфоглицерат дегидрогеназа) при -4°С в течение 30 мин (Клунова и Банников, 1980). Активность М§2+-зависимой АТФазы устанавливали по выделению неорганического фосфата (Ф„) из АТФ в результате реакции ферментативного гидролиза (Писарева, 1968).

Достоверность всех полученных результатов оценивали методами математической статистики с помощью электронных таблиц Microsoft Excel.

2. Результаты и их обсуждение

2.1. Цитопатическая активность дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis

Согласно данным литературы, оптимальными концентрациями, позволяющими выявить различия в действии токсина, являются 5-15 мкг/мл. Нами была выбрана минимальная из указанных концентрация, заведомо не приводящая к полному разрушению клеток. Инкубацию в присутствие токсина осуществляли в течение 60 мин.

Как показали результаты, растворы дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. galleriae, alesti, kurstaki. thuringiensis, sotto, dendrolimus в концентрации 5 мкг/мл оказывают воздействие на клетки HeLa, L1210, В16 и SCLd-135. При этом существенных различий в способности токсинов различного происхождения разрушать клетки не было отмечено. В результате для дальнейших исследований была выбрана культура, обладающая максимальной продукцией дельта-эндотоксина. Количественный анализ способности штаммов продуцировать дельта-эндотоксин показал, что в наибольшей степени она выражена у штаммов sotto 617 (129,7 мг/г сухой массы культуры).

dendrolimus alesti 204 galleriae 59- sotto 617 kurstaki Z-52 thompsoni 502 (!V1) (1111) 6(V1) (IV2) (III2) (XII)

Штаммы Bacillus thuringiensis

OB 16 OL 1210 ra He La aLCLd-135

Рис. 1. Цитонатическое действие различных концентраций дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. Sotto

Сравнение цитопатической активности дельта-эндотоксина на изучаемые культуры показало, что наблюдается выраженная зависимость ее от концентрации токсина (рис. 1). Концентрация 20 мкг/мл не оказывала действия на клетки меланомы мышей - В 16 и лимфоидной лейкемии кроликов - L 1210 и приводила к разрушению 17-20% клеток рака шейки матки человека - HeLa и клетки кишечного эпителия непарного шелкопряда - SCLd-135.

Концентрация 100 мкг/мл вызывала разрушение несколько более половины клеток В16 и L1210 (57 и 69% соответственно) и большей части

клеток HeLa и БСЬс/-/35 (90-95%, соответственно) Полное разрушение клеток первых двух культур наблюдали только в случае действия 200 мкг/мл токсина.

Полученные данные показывают не только выраженную зависимость цитопатического эффекта от концентрации дельта-эндотоксина, но и существенные различия в чувствительности изучаемых культур к нему.

На рисунках 2 и 3 представлены результаты изучения влияния продолжительности времени инкубации на цитопатическое действие дельта-эндотоксина в двух концентрациях: 50 и 100 мкг/мл. При действии эндотоксина в концентрации 50 мкг/мл (рис. 2) разрушение клеток 11210 начиналось через 10 мин (3,2%) и через 120 мин достигало максимальной величины в 64,6%. В случае В16 разрушение. 12,5% отмечено через 15 мин. Для НеЬа и SCLd-135 отмечен значительный цитопатический эффект уже после 5 мин инкубации с токсином (17,0 и 18,1%, соответственно). Через 120 мин оказались разрушенными 86,6 и 84,0% клеток, соответственно.

100

5 10 15 30 60 90 120

Время инкубации, мин

И L 1210 ОВ 16 DSCLd-135 □ HeLa

Рис. 2. Влияние времени инкубации на цитопатическое действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. solio (концентрация 50 мкг/мл)

Действие дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл приводило к более значительному цитолитическому действию (рис. 3). Уже в первые 5 мин во всех изученных образцах отмечено наличие разрушенных клеток, достигавшее 8,6% для L 1210; 5,0 для В 16;27, 5 для SCLd-135 и 27,1 для HeLa. Через 30 мин количество лизированных клеток составило 57,0; 69,1; 90,9 и 94,9%, соответственно. Через 60 мин клетки SCLd-135 и HeLa оказались полностью разрушены, и в случае В16 аналогичный эффект наблюдали только через 120 мин. Для клеток L 1210 через 120 мин инкубации отмечено 91,2% разрушенных клеток.

□ L 1210 а В 16 0 SCLd-135 ш HeLa

Рис. 3. Влияние времени инкубации на цитоиатическое действие дельта-эндотоксина В. чиЬ.чр. ¡опо (концентрация, 100 мкг/мл)

100

90 80

S5 60

!¿

О 50

i 40

20 40 80 100 150

Концентрация эндотоксина, мкг/мл

Таким образом, полученные результаты указывают на способность дельта-эндотоксинов В. thuringiensis subsp. sotto, штамм 617 оказывать цитолитическое действие на клетки исследованных культур. При этом отмечена выраженная прямо пропорциональная зависимость оказываемого эффекта от концентрации дельта-эндотоксина. Цитотоксическое действие было тем более значительным, чем продолжительнее была инкубация. Следует отметить, что изученные культуры различаются по степени чувствительности к данному токсину: для SCLd-135 и HeLa ее можно характеризовать как высокую, тогда как для L J2J0; и В16 - среднюю. Для сравнения была использована культура клеток кишечного эпителия непарного шелкопряда - SCLd-135, высокая чувствительность которой к токсину subsp. galleriae была отмечена ранее (Каменек, 1989).

2.2. Микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры

В ходе исследования, проведенного на клетках культуры HeLa, было установлено, что первые изменения клеток по сравнению с нормой наблюдались уже через одну минуту после начала инкубации с раствором дельта-эндотоксина (рис. 4.2). Клетки начинали вакуолизировагься через этот промежуток времени, причем степень вакуолизации возрастала с увеличением продолжительности инкубации и была пропорциональна концентрации дельта-эндотоксина. Так, если при использовании концентрации 100 мкг/мл через 1 мин было вакуолизировано до 90% всех клеток и появились первые разрушенные, то при 50 мкг/мл до 50%.

Рис. 4. Действие дельта-эндотоксина на культуру клеток Яе£а: 1 - нормальные клетки

(контроль), 2 - вакуолизация через 1 мин инкубации (100 мкг/мл), 3 - вакуолизация и признаки разрушения клеток через 15 мин, 4 - разрушение клеток (через 30 мин инкубации

при концентрации 100мкг/мл или через 2 ч - 50 мкг/мл), световая микроскопия, увеличение в 400 раз.

Через 15 мин во всех сериях опытов вакуолизация достигала 100 % , и размеры клеток значительно увеличились (рис. 4.3). В это же время нарастают признаки разрушения клеток. Через 30 мин инкубации с токсином в концентрации 100 мкг/мл не обнаруживается ни одной целой клетки (рис. 4.4).

На представленных микрографиях видно, что кроме появления большого числа вакуолей, наблюдаются и такие признаки нарушения структуры клеток, как истончение клеточной мембраны и зернистость ядер.

В контроле, где клетки инкубировались в том же растворе, что и в опытах, только в отсутствие дельта-эндотоксина, каких-либо изменений в структуре клеток обнаружено не было (рис. 4.1).

Столь значительная вакуолизация клеток, вероятнее всего, является следствием нарушения активного транспорта ионов, и прежде всего натрия, концентрация которого в норме во внутриклеточной среде должна быть ниже, чем во внеклеточной.

2.3. Действие дельта-эндотоксина на содержание ионов в клетках

Для получения более полной картины действия дельта-эндотоксина было проведено изучение концентраций ионов в различные моменты времени. Данные, представленные на рисунках 4 и 5, показывают, что, начиная с 15 минут после добавления токсина, значительно изменялась концентрация всех

определяемых ионов в клетках Hela. Наибольшие отклонения от нормы наблюдали в концентрации ионов Na\ причем степень повышения уровня зависела от количества токсина.

{S о

' 1

§ 5

i ?

я ^ &

180 160 140 120 100 80 60 40 20

[Ь [1 rí

т Id

30 60

Время после обработки, мин

ü К+ и Na+ и Са2+ а Мд2+

180

Рис. 4. Влияние дельта-эндотоксина (50 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках HeLa

Максимальное увеличение составляло 203% через 30 мин для 100 мкг/мл токсина и 182% через 1 ч для 50 мкг/мл. Существенно снижалась концентрация ионов К+, достигая 61% от исходного значения через 30 мин для 100 мкг/мл и 60% через 1 ч для 50 мкг/мл.

Для Mg2+ отмечено снижение до 78% через 30 мин для 100 мкг/мл и 71% через 1 ч для 50 мкг/мл, соответственно. Концентрация ионов Са2+, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130 и 136%, соответственно.

Изменение концентраций ионов, хотя и менее значительное, отмечено и в случае менее чувствительных к дельта-эндотоксину культур и Максимальное увеличение концентрации ионов Na+ при использовании 100 мкг/мл токсина составляло через 1 час 179% для L12J0 и 167% для В16. Существенно снижалась концентрация ионов К+, достигая 76 и 72%, соответственно, от исходного значения через 30 мин. Для Mg2+ отмечено снижение до 78 и 83% через 30 мин. Концентрация ионов Са2т, наоборот, повышалась через тот же период времени до 130% в обоих случаях.

Поддержание постоянства концентраций ионов Са1' и Mg2 чрезвычайно важно из-за высокой их биологической активности. Са2+ в основном находится в органеллах - митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, кальцисомах, а не в цитозоле.

I ю о < к о

160 140 120 100 80 60 40 20 о

гЬ

5 10 15

Время после обработки, мин

□ к+

□ N8+

И Са2+

|Мд2+

Рис. 5. Влияние дсльта-эндотоксина (100 мкг/мл) на концентрацию ионов в клетках культуры НеЬа

Полученные результаты согласуются с ранее приведенными по вакуолизации клеток. В период (от 15 мин и далее) происходит нарастание вакуолизации, связанной с нарушением транспорта ионов через цитоплазматическую мембрану, и в первую очередь это относится к ионам Ыа^, транспорт которого неразрывно связан с транспортом воды.

Результаты, представленные на рисунке 6, показывают значительное активирование К+, Ка+-АТРазы культур клеток 11210 и НеЬа. Активирование начиналось уже через 1 мин после добавления токсина и составляло 47 и 59%, соответственно. Максимальных значений активность фермента достигала через 15 мин и сосгавляла 638 и 213%, соответственно.

'т 0,45

га 0.4

с; £ 0,35

0,3

± 0,25

Ж 0,2

0,15

ь 0,1

г ю 0,05

Ё 0

исходная

Время после обработки, мин □ 1.1210 аНеЬа

Рис. 6. Влияние дельта-эндотоксина В. 1Иипп§1ет1.ч (50 мкг/мл) на М|Г'-зависимую К+, \а'-АТФазу культур клеток

Изменение активности данного фермента наблюдается как при нарушении целостности мембраны, так и при действии веществ, разобщающих процессы дыхания и окислительного фосфорилирования.

Поскольку активность фермента характеризует его способность гидролизовать субстрат (АТФ), и известно, что эта способность резко повышается как в условиях разобщения окислительного фосфорилирования и дыхания, так и при нарушении целостности мембраны, активирование данной ферментной системы фактически отражает степень деэнергизации клетки. Торможение транспортной функции приводит к накоплению промежуточных продуктов реакции: АДФ и Ф„, что и регистрируется в наших экспериментах, как усиление гидролитической активности АТФазы.

Было показано, что способность гидролизовать АТФ не является свойством самого эндотоксина катализировать гидролиз АТФ с высвобождением фосфата. Он также не может являться поставщиком свободного (неорганического) фосфата в реакционную среду.

2.4. Действие дельта-эндотоксина на дыхательную активность и синтез АТФ в клетках

Нами было выполнено изучение влияния дельта-эндотоксина на дыхание и окислительное фосфорилирование в клетках наиболее чувствительной культуры HeLa.

Полученные данные (рис. 7) демонстрируют стимулирование поглощения кислорода клетками HeLa на 74% через 1 мин инкубации с токсином в концентрации 150 мкг/мл. Далее следовало быстрое снижение дыхательной активности до величины ниже контрольной (67%).

При концентрации токсина 100 мкг/мл начальное стимулирование дыхания на 51% далее снижалось, достигая к 5 мин 38%. Очевидно, что при концентрациях, превышающих 150 мкг/мл, поглощение 02 усиливается в более ранние периоды, что мы не можем зарегистрировать, используя имеющиеся в распоряжении методики.

Концентрация дельта-эндотоксина, мг/мл

□ 1 мин 0 5 мин

Рис. 7. Действие дельта-эндотоксина на потребление кислорода клетками

При небольшой концентрации токсина 50 мкг/мл нами зарегистрирован незначительно нарастающий во времени эффект 4 и 15 % через 1 и 5 мин, соответственно. В случае 20 мкг/мл вообще не удалось зарегистрировать эффекта.

Полученные данные указывают на зависимость действия дельта-эндотоксина от его концентрации и времени воздействия на респираторную активность клеток. При этом, чем больше концентрация токсина, тем раньше наблюдается начальное стимулирование и последующее угнетение потребления клетками кислорода.

Был проведен анализ временной последовательности описанных выше явлений, с целью дальнейшей конкретизации механизма. Для этого были выбраны две концентрации эндотоксина (100 и 50 мкг/мл), которые вызывают умеренный разобщающий эффект, а, следовательно, позволяют охватить более значительный промежуток времени при наблюдении эффекта. Параллельно измеряли уровень продукции АТФ и рассчитывали коэффициент фосфорилирования (Р/О). Известно, что в дышащих митохондриях скорость переноса электронов в дыхательной цепи, а следовательно, и скорость синтеза АТФ, определяется в первую очередь относительными концентрациями АДФ, АТФ и Ф„ (неорганического фосфата) в окружающей среде, а не концентрациями субстратов дыхания, например, пирувата. тем выше, чем выше концентрация АДФ и Фн и ниже - АТФ. Это явление носит название дыхательного (акцепторного) контроля. Математически это выражается отношением Р/О, где Р представляет концентрацию АДФ. В условиях эксперимента на интактных митохондриях при постоянстве начальных концентраций АДФ и Ф„ в окружающей среде убыль концентрации АДФ пропорциональна приросту Ф„, что и будет являться мерой скорости синтеза АТФ в митохондрии.

Эффект начального стимулирования поглощения кислорода в течение первых 10 мин воздействия дельта-эндотоксина утрачивается к 15 мин его воздействия (рис. 8). При этом как стимулирование, так и угнетение потребления кислорода митохондриями пропорциональны концентрации токсина.

1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Время, мин

|-100 мкг/мл-50 мкг/мп |

Рис. 8. Изменение потребления кислорола клетками под действием дельта-эндотоксина

Начальное стимулирование под действием концентрации 100 мкг/мл составляет через 1 мин около 51 % от исходной, тогда как 50 мкг/мл стимулирования не вызывала. Скорость же снижения поглощения кислорода более значительна в случае концентрации 100 мкг/мл по сравнению с 50. Так, уже через 10 мин воздействия она практически возвращается к норме, тогда как для 50 мкг/мл остается на 6 % выше нормы. В конечный момент эксперимента (60 мин) эти значения составляют 4 и 48 % от контроля, соответственно. Уровень поглощения Ог митохондриями в норме, при этом составлял 15-16 мкМ/106 клеток в 1 мин.

Уже в первую минуту воздействия эндотоксина происходит резкое снижение потребления АДФ и Ф„, а, следовательно, и синтеза АТФ (рис. 9). Так концентрация 100 мкг/мл снижает этот показатель почти в 5,4, а 50 мкг/мл - в 2,9 раза.

Время, мин

|-100 мкг/мл —«— 50 мкг/мл~|

Рис. 9. Влияние дельта-эндотоксина на синтез АТФ в клетках НеЬа

В течение первых 10 мин синтез АТФ постепенно снижается в 7,2 и 4 раза, соответственно, а затем резко падает через 15 мин в 22 и 11,4 раза, соответственно. Через 60 мин инкубации потребление АДР составляет только 0% (100 мкг/мл) и 0,4% от нормы.

Результаты показывают, что наряду с первоначальным стимулированием поглощения кислорода (рис. 9) наблюдается значительное снижение синтеза АТФ. Наиболее полно этот эффект выражается в изменении коэффициента фосфорилирования Р/О (табл. 1). Значение Р/О заметно снижается в 10,5-38 раза в случае использования дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и в 2-9,5 раза — 50 мкг/мл. С учетом того, что дыхание в первые 10 мин остается даже более интенсивным, чем в норме, следует констатировать, что произошло разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания. Причем наиболее вероятно его действие как переносчика протонов.

Таблица 1

Влияние дельта-эндотоксина на интенсивность дыхания и синтез АТФ клетками HeLa

Концентрация токсина, мкг/мл Эффект 1 МИМ 5 мин 10 мин 15 мин 30 мин 60 мин Норма (в отсутствие токсина)

100 потребление о2 2,28 + 0,26 1,88 + 0,25 1,60 ± 0,0В 1,20 ± 0,16 *** 0,40 ± 0,09 *** 0,06 ± 0,02 *** 1,70 ±0,27

синтез АТР . 0,53 ± 0,07 *** 0,43 ± 0,06 ♦*+ 0,40 ± 0,08 *** 0,13 0,03 *** 0,05 ± 0,02 0 2,86 ± 0,08

Р/О 0,23 ± 0,03 «** 0,23 ± 0,03 ***. 0,25 ± 0,03 *+* 0,11 ± 0,01 *** 0,13 ± 0,02 *** 0 1,68

50 потребление ог 1,69 + 0,08 1,88 ± 0,19 1,80 ± 0,21 1,40 ± 0,15 1,10 ± 0,26 0,82 ± 0,12 ** 1,70 ±0,27

синтез АТР 1,67 ± 0,17 1.29 ± 0,06 *** 0,77 ± 0,08 *** 0,25 ± 0,09 *** 0,22 ± 0,03 *** 0,08 ± 0,03 **« 2,86 ± 0,08

Р/О 0,99± 0,06 **+ 0,661 0,04 4** 0,43± 0,03 0,18± 0,01 *** 0,20± 0,01 0,10+ 0,01 1,68

Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 при п = 20 (п - число пар измерений)

Эффект начального стимулирования дыхания является компенсаторной реакцией, связанной с разобщением. Очевидно, этот процесс заканчивается уже в первые 10 мин воздействия токсина, что в дальнейшем вызывает деэнерги-зацию митохондрий, а, следовательно, и клетки, и всю последующую цепь событий, важнейшим из которых является нарушение транспорта ионов и неэлектролитов в клетке.

2.5 Влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза

В условиях повышенного потребления кислорода увеличивается и потребность митохондрии в восстановительных эквивалентах, поставляемых субстратами дыхательной цепи. Это должно привести к ускорению гликолиза в цитозоле. Однако, поскольку процессы дыхания и окислительного фосфори-лирования в митохондрии разобщены, прекращается синтез АТФ, происходит деэнергизация митохондрии, что приводит к торможению работы дыхательной цепи и снижению потребности в субстратах - продуктах гликолиза. В результате прекращается приток в митохондрии метаболитов глюкозы. Вероятно, вследствие дальнейшего снижения дыхательной активности гликолиз переключается на анаэробный режим, приводя к повышению активности лактат-дегидрогеназы и концентрации лактата в цитозоле.

Для проверки этих предположений нами было предпринято экспериментальное исследование, включающее анализ активности ключевых ферментов гликолиза клеток Яе£а: 3-фосфоглицерат дегидрогеназы (3-ФГДГ) и лактат дегидрогеназы (ЛДГ). В течение первых 10 мин действия эндотоксина активность 3-ФГДГ превышает ее уровень в интактных клетках (норма). При этом в случае концентрации токсина 100 мкг/мл активирование на 25% начиналось уже через 1 мин и достигало максимума (60%) через 5 мин. Через 10 мин активность фермента оставалась высокой и составляла 46% от нормы. Затем начиналось снижение активности, которая достигла через 15 мин 80% исходной. Снижение активности продолжалось до конца опыта, и через 60 мин ее значение составило 15% от нормы.

В случае концентрации 50 мкг/мл активирование было менее значительным и максимум (32%) отмечали через 10 мин. Также более медленно происходило и снижение активности, достигая через 60 мин 32% исходной.

Эти данные согласуются с представленными на рисунке 8, демонстрирующими динамику изменения потребления кислорода клетками под действием тех же концентраций дельта-эндотоксина. Сопоставление этих результатов показывает, что начальное стимулирование дыхания приводит к ускорению катаболизма глюкозы с образованием пирувата и 3 - фосфогли-церата, и как следствие, субстратов дыхательной цепи. Однако в периоды времени более 10 мин для концентрации 100 мкг/мл и 15 мин для 50 мкг/мл происходит снижение интенсивности дыхания, и вслед за этим угнетается гликолиз. Фактически происходит затухание процесса в течение 60 мин. Это связано не только с практически полным прекращением синтеза АТФ в митохондриях, но и с тем, что к этому времени происходит достаточно интенсивное разрушение клеток с освобождением их содержимого в культура-льную среду. Как видно из данных, представленных на рисунке 8 и 9, через 15 мин действия дельта-эндотоксина начинается нарастающее снижение интенсивности дыхания и синтеза АТФ. Однако к этому времени остается еще много не разрушенных клеток. Возможно, что в таких анаэробных условиях клетки переключаются на преимущественное образование в ходе гликолиза лактата.

Время, мин.

|-100 мкг/мл —»— 50 мкг/мл

Рис. 10. Изменение активности 3-фосфоглицерат дегидрогеназы в цитозоле клеток под действием дельта-эндотоксина в концентрации 100 мкг/мл и 50 мкг/мл

Было отмечено активирование ЛДГ в клетках Hela (рис. 11) в период времени от 15 до 30 мин, то есть в условиях наблюдаемого уменьшения потребления кислорода. Через 5-15 мин, напротив, отмечено практическое отсутствие активности ЛДГ. Это объясняется подавлением образования лактата в условиях повышенной аэробности.

Время, мин

-100 мкг/мл ■ 50 мкг/мл

Рис. 11. Изменение активности лактат легидрогеназы в клетках НеЬа в результате действия дельта-эндотоксина

В период времени после 15 мин, когда резко снижается поглощение кислорода, гликолиз переключается на анаэробный режим с образованием лактата, о чем свидетельствует увеличение активности ЛДГ.

Время, мин

|-100 мкг/мл —■—50 мкг/мл |

Рис. 12. Изменение активности лактат дегидрогеназы в супернатанте в результате действия на клетки НеЬа дельта-эндотоксина

Нами регистрировалась активность ЛДГ во внеклеточной (культу-ральной) среде через разные промежутки времени действия токсина. Выход ЛДГ в культуральную среду под действием дельта-эндотоксином (рис. 12) регистрировался уже спустя 5 мин после начала инкубации. При этом

активность фермента была выше при концентрации токсина 100 мкг/мл (21% общей активности) по сравнению с 50 мкг/мл (8%). Далее активность ЛДГ возрастала практически линейно при обеих концентрациях и достигала 100% (100 мкг/мл) и 79% (50 мкг/мл) через 60 мин инкубации.

Таким образом, усиление клеточного дыхания приводит к ускорению процесса гликолиза в клетках культуры в течение всего периода усиленного дыхания (1-15 мин). Это связано с возросшими потребностями митохондрий в субстратах цепи переноса электронов (дыхательной цепи). Синтез АТФ в то же время значительно снижается в результате разобщения, что приводит к деэнергизации митохондрии и нарушению транспорта веществ через ее мембрану. В результате происходит снижение интенсивности дыхания, по-видимому, в результате резкого снижения поступления в митохондрии субстратов для цитратного цикла и прекращения вследствие этого наработки восстановительных эквивалентов. Далее, как следует из представленных выше данных, происходит переключение гликолиза преимущественно на анаэробный механизм с образованием лактата и активированием ЛДГ (через 10 мин инкубации). Однако в этот же период появляются нарушения в проницаемости цитоплазматической мембраны, которые проявляются в наибольшей степени после 15 мин инкубации. Результатом этого является нарастающий во времени и зависящий от концентрации токсина выход ЛДГ во внеклеточную среду.

Следует отметить, что, по-видимому, определение уровня ЛДГ в культуральной жидкости может служить удовлетворительным и простым тестом для установления чувствительности клеток к дельта-эндотоксину.

Разобщающая способность дельта-эндотоксина подтверждена методами ИК- и ЯМР-спектроскопии. Показано, что он обладает лабильными протонами, которые способен легко отдавать после растворения. Большое количество «кислых» протонов обусловлено доминирующим содержанием в составе белкового дельта-эндотоксина аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Вещества природного или синтетического происхождения, обладающие лабильными протонами, могут являться разобщителями процессов окислительного фосфорилирования (синтеза АТР), происходящего в митохондриях, если они обладают способностью проникать через биологические мембраны. Возможность этого подтверждает действие дельта-эндотоксина, полученного методом щелочного гидролиза, на искусственную азолектиновую мембрану, который в концентрации 50 и 100 мкг/мл вызывал падение ее сопротивления в 2-5 раз.

ВЫВОДЫ

1. Цитопатическое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto пропорционально его концентрации и времени контакта с клетками; связано с изменением структуры клеток, проявляющимся как нарастающая вакуолизация с последующим разрушением клеток, и различается по силе

эффекта для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток В16 и L1210.

2. При действии дельта-эндотоксина после 15 мин выявлено нарушение транспорта ионов К+, Na+, Са2+ и Mg2' через цитоплазматическую мембрану клеток Hela, В16 и L1210 вслед за ранней активацией Mg^-зависимой К+, Na+-АТФазы. Обнаружена общая для всех типов клеток закономерность уменьшения внутриклеточной концентрации К+, и Mg2+ при возрастающей концентрации Na+ и Са2+.

3. Установлено, что дельта-эндотоксин в первые минуты действия угнетает синтез АТФ на фоне активации дыхания, действуя на культуры клеток аналогично разобщителям процессов окислительного фосфорилирования и дыхания.

4. Дельта-эндотоксин на первых этапах действия (до 15 мин) вызывает интенсификацию процесса гликолиза в клетках HeLa, повышая активность 3-фосфоглицерат-дегидрогеназы; затем ее уровень постепенно снижается, уступая место активации лактат-дегидрогеназы - фермента, характерного для анаэробного режима гликолиза.

5. Финальные этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotlo, предшествующие разрушению клеток, связаны с деэнергизацией митохондрий, снижением потребления кислорода, активацией анаэробного пути гликолиза, нарушением целостности мембран и выходом лактат-дегидрогеназы во внеклеточную среду.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Каменек, Д. В. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis как природный ионофор: анализ методами ИК- и ЯМР-спектроскопии / Д. В. Каменек, О. Н. Ильинская, Л. М. Цофина, Л. К.Каменек // Ученые записки Казанского государственного университета. Сер. Есгеств. Науки. - 2008 - Т. 150. - Кн. 1. - С. 69-76.

2. Каменек, Д. В. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sollo на процесс гликолиза в перевиваемых линиях клеток / Д. В. Каменек, М. С. Феклина, Л. К. Каменек, УлГУ. - Ульяновск, 2008,- 17 с. - Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №406-В2008.

3. Фекпина, М. С. Действие дельта-эндотоксина на активность клеток периферической крови in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, Э. К. Юнусова, Л. К. Каменек, УлГУ. - Ульяновск, 2008 - 17 с. - Деп. в ВИНИТИ 12.05.08 №407-В2008.

4. Морозова, Е. П. Действие экологически-безопасного дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на интенсивность поглощения кислорода фитопатогенными бактериями / Е. П. Морозова, Д. В. Каменек, Т. А. Луковенко // Материалы симпозиума с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциапьным условиям среды», Ульяновск, 24-26 сентября 2002 г. - Ульяновск, 2002. - С. 81-83.

5. Каменек, Л. К. Действие дельта эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуру раковых клеток / Л. К. Каменек, Д. В. Каменек // Сборник тезисов 8-й Путинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - Пущино, 2004. - С. 114-115.

6. Каменек, Л. К. Органеллы клетки /Учебно-методическое пособие // Л. К. Каменек, О. Ю. Шроль, А. А. Тюльпинева, Д. В. Каменек - Ульяновск: Изд-во УлГУ, 2001. - 42 с.

7. Каменек, Д. В. Действие дельта-эндотоксииа Bacillus ihuringiensis на дыхательную активность раковых клеток в культуре / Д. В. Каменек, J1. К. Каменек // Материалы XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение». - Казань, 2005. - С. 40.

8. Каменек, Д. В. Действие дельта эндотоксина Bacillus Ihuringiensis на культуры раковых клеток. / Д. В. Каменек, JI. К. Каменек // Сборник тезисов 9-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - Пущино, 2005. - С. 114.

9. Каменек, Д. В. Действие дельта-эндотоксина Bacillus ihuringiensis на ионный транспорт в клетках Hela и НеР / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек, О. Н. Ильинская // Сборник тезисов 9-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА». - Пущино, 2006. - С. 374.

10. Каменек, Д. В. Особенности действия дельта-эндотоксина Bacillus ihuringiensis на раковые культуры клеток / Д. В. Каменек, М. А. Горшкова // Сборник материалов Международной конференции молодых ученых «Ломоносов - 2007». - Москва: Изд-во МГУ, 2007. - С. 77.

11. . Феклина, М. С. Влияние дельта-эндотоксина на клетки периферической крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, С. В. Куркин, Л. Д. Терехина, Д. А. Терехин // Сборник тезисов 11-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - Пущино, 2007. -С. 116.

12. Феклина, М. С. Оценка влияния дельта-эндотоксина Bacillus ihuringiensis на нейтрофилы крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Д. В. Каменек, С. В. Куркин, Л. Д. Терехина, Д. А. Терехин // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека». -Ульяновск, 2007. - С. 269.

13. Феклина, М. С. Оценка влияния дельта-эндотоксина Bacillus ihuringiensis на неМтрофмлы крови мышей in vivo и in vitro / М. С. Феклина, Л. К. Каменек, О. В. Столбовская, Д. В. Каменек, С. В. Куркин, Л. Д. Терехина // Материалы IV Всероссийской научно-технической конференции «Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения». -Ульяновск: УлГУ, 2007. - С. 102-105.

14. Каменек, Д. В. Действие дельта-эндотоксина Bacillus Ihuringiensis на культуры раковых клеток / Д. В. Каменек, Л. К. Каменек // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». - Казань: КГУ, 2008. - С. 47-48.

Просьба отзывы отправлять почтой на имя Ученого секретаря диссертационного совета, а также по факсу: (843)238-71-21 или на e-mail: Zina.abramova@mail.ru.

Подписано в печать 21.01.2009 Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 6//6

Отпечатано с оригинал-макета в Издательском центре Ульяновского государственного университета 432000, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каменек, Дмитрий Валерьевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. bacillus thuringiensis как объект биотехнологии.

1.2. систематика и экология В. THURINGIENSIS.

1.3. факторы патогенности BACILLUS THURINGIENSIS.

1.4. кристаллические дельта-эндотоксины.

1.5. действие дельта-эндотоксинов на целевые объекты.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. культивирование и идентификация микроорганизма.

2.2. клеточные культуры.

2.3. получение препаратов дельта-эндотоксина.

2.4. спектральное изучение дельта-эндотоксина.

2.5. методы световой микроскопии.

2.6. биохимические методы исследования.'

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. цитопатическая активность дельта-эндотоксина bacillus thuringiensis.

3.2. микроскопическое изучение действия дельта-эндотоксина на клеточные культуры тканей.

3.3. действие дельта-эндотоксина на содержание ионов в клетках перевиваемых линий.

3.4. действие дельта-эндотоксина на дыхательную активность и синтез атф в клетка.

3.5. влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза.

3.6. подтверждение разобщающего действия дельта-эндотоксина BACILLUS THURINGIENSIS методами ик- и ямр-спектроскопии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток"

Известно, что основным действующим началом В. thuringiensis, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является дельта — эндотоксин, продуцируемый ею. Показана также антимикробная активность дельта-эндотоксинов В. thuringiensis для различных бактерий и микроскопических грибов (Юдина и Бурцева, 1997; Климентова, 2001; Тюльпинева, 2003; Каменек и соавт., 2005). Отмечали кроме того селективное ингибирующее действие белков кристаллов subsp. thuringiensis на развитие опухолевых клеток млекопитающих, в том числе человека (Prasad & Shethna, 1976; Ito et al., 2004). Эндотоксины предпочтительно убивали раковые клетки НеР, не оказывая влияния на развитие нормальных клеток. Все это дает основание предположить, что В. thuringiensis и её кристаллический дельта-эндотоксин являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности самых различных организмов.

В мировой литературе накоплен обширный материал, описывающий строение, состав, физико-химические свойства кристаллов. Установлено, что дельта-эндотоксины способны связываться с чувствительными рецепторами на цитоплазматических мембранах клеток кишечного эпителия, а затем проникать в них, формируя каналы-поры (Hodgman & Ellar, 1990; Smith & Ellar, 1994). Изучены особенности механизма действия на насекомых, включая клеточные культуры. Отмечается нарушение транспорта ионов, активирование АТРаз, снижение синтеза АТФ на фоне усиления потребления кислорода, разобщение процессов окислительного фосфорилирования и дыхания (Heimpel, 1977; Faust, 1984; Aronson et al., 1986; Gill et al., 1992; Himeno et al., 1985; Каменек, 1998). Проведены также исследования влияния на млекопитающих кристаллов белкового дельта-эндотоксина, которые подтвердили, что эти белки и продукты их расщепления не токсичны и не аллергенны для теплокровных организмов (Киль и Надыкта, 2002). Вышесказанное позволило определить цель и задачи исследования.

Основные задачи исследования:

1. Выявить общее цитопатическое действие дельта-эндотоксина и охарактеризовать силу его эффекта по отношению к клеткам перевиваемых линий HeLa, В16 и L1210.

3. Установить возможность действия дельта-эндотоксина как агента, разобщающего дыхание и фосфорилирование в клетках перевиваемых культур.

4. Проанализировать влияние дельта-эндотоксина на процесс гликолиза в клетках HeLa согласно показателям активности основных ферментов гликолиза — 3-фосфоглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы.

5. Охарактеризовать ранние и поздние этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto.

Показано, что действие дельта-эндотоксина на культуры раковых клеток, аналогично таковому для клеток кишечника и культур насекомых. Установлено

•у | нарушение работы ион транспортирующей Mg~ -зависимой АТРазной системы, результатом которого является пассивный нерегулируемый приток ионов натрия и воды в клетку и, как следствие, вакуолизация мембранных структур. Показана первичность активирования фермента (в течение первых 10 мин) по отношению к изменению концентраций ионов, которое начиналось только через 10-15 мин.

Установлено начальное усиление гликолиза, очевидно связанное с необходимостью компенсации снижения синтеза АТР в ходе окислительного фосфорилирования, за счет аэробной, а при дальнейшей деэнергизации клетки, и снижении потребления кислорода анаэробной стадии гликолиза. Это подтверждает динамика изменения активности 3-фосфорглицерат дегидрогеназы и лактат дегидрогеназы, ферментов катализирующих из ключевых стадий гликолитического процесса.

Установлено, что нарушение транспортных функций клеточных мембран и, вслед за этим, их целостности вызывает выход лактат дегидрогеназы во внеклеточную жидкость и значительное повышение содержания лактата в ней.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 .Цитопатический эффект дельта-эндотоксина В. thuringiensis subsp. sotto связан с изменением структуры клеток (нарастающая вакуолизация с последующим разрушением), пропорционален его концентрации и времени контакта с клетками перевиваемых культур. Эффективность действия токсина различается по силе для разных клеточных линий: чувствительность клеток HeLa значительно выше, чем клеток В16 и L1210.

2. Действие дельта-эндотоксина характеризуется нарушением транспорта ионов К+, Na+, Са2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану клеток, которому предшествует значительная(до 6,8 раз) активация Mg~ -зависимой К , Na+- АТФазы.

4. Проявлением действия дельта-эндотоксина является интенсификация гликолиза в клетах HeLa на начальном этапе и активация 3-фосфоглицерат дегидрогеназы с последующим ее угнетением, сменяемым активацией характерного для анаэробного режима гликолиза фермента — лактат дегидрогеназы.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на симпозиуме с международным участием «Актуальные проблемы адаптации к природным и экосоциальным условиям среды» (Ульяновск, 2002), XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); Всероссийской школе-семинаре молодых ученых и специалистов по актуальным проблемам «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2004 - 2006); Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов (Москва, МГУ, 2007); Регионального научного семинара Министерства образования РФ «Геоэкологические проблемы Среднего Поволжья» (Ульяновск, 2008), Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), межкафедральных семинарах экологического факультета Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского госуниверситета (2003 — 2008).

Публикации результатов исследований. Основные положения опубликованы в 14 работах.

Объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного набора, включает 12 таблиц и 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалов и методов исследований, результаты исследований и их

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каменек, Дмитрий Валерьевич

ВЫВОДЫ

2. При действии дельта-эндотоксина после 15 мин выявлено нарушение транспорта ионов К+, Na+, Са2+ и Mg2+ через цитоплазматическую мембрану л I | | клеток HeLa, В16 и LI210 вслед за ранней активацией Mg" -зависимой К , Na -АТФазы. Обнаружена общая для всех типов клеток закономерность уменьшения внутриклеточной концентрации К , и Mg при возрастающей концентрации Na+ и Са2+.

4. Дельта-эндотоксин на первых этапах действия (до 15 мин) вызывает интенсификацию процесса гликолиза в клетах HeLa, повышая активность 3-фосфоглицерат дегидрогеназы; затем ее уровень постепенно снижается, уступая место активации лактат дегидрогеназы - фермента, характерного для анаэробного режима гликолиза.

5. Финальные этапы действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. sotto, предшествующие разрушению клеток, связаны с деэнергизациен митохондрий, снижением потребления кислорода, активацией анаэробного пути гликолиза, нарушением целостности мембран и выходом лактат дегидрогеназы во внеклеточную среду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что после связывания с рецепторами клеток-мишеней, дельта-эндотоксин, встраивается в клеточную мембрану (Нойпапп е1 а1., 1995). Образовавшиеся в результате каналы, вероятнее всего, предназначены для транспорта самих токсических полипептидов, так как обладают высоким сродством к ним. Процесс их переноса в клетку 20-30 раз быстрее, чем воды и глюкозы (Кагава, 1985).

Исследования, выполненные на клеточных культурах методами световой микроскопии, показали, что вакуолизация клеток НеЬа начиналась уже через 1 мин инкубации, нарастала во времени и прямо пропорционально зависела от концентрации эндотоксина (табл. 3.2.1). Характер и динамика изменений были идентичными для токсина всех изученных штаммов. Аналогичные данные были получены ранее для культуры клеток непарного шелкопряда БСЬс1-135 и подвида galleriae (Каменек и Харина, 1982).

Известно, что действие дельта-эндотоксина приводит к нарушению транспорта ионов в клетках кишечного эпителия насекомых (Каменек, 1998). Нашими исследованиями установлено, что концентрации неорганических ионов значительно изменялись, начиная с 15 мин после начала инкубации с токсином (табл. 3.3.1-3.3.6). Максимальные изменения наблюдали через 60 мин действия патогена. Уровень натрия и кальция увеличивался в 2-2,2 и 1,3 раза, соответственно, а калия и магния снижался до 56-60% и 71—75% от исходного. Интенсивное нарастание вакуолизации клеток (табл. 3.2.1) связанно с нарушением транспорта ионов, и в первую очередь Ыа+, через цитоплазматическую мембрану. Повышение концентрации последнего в клетке приводит к усилению пассивного притока воды в нее, что и является непосредственной причиной вакуолизации. Нарушение активного транспорта ионов приводит к соответствующему влиянию на зависимый от него вторичный транспорт аминокислот и Сахаров. Это в свою очередь, наряду с деэнергизацией, влечет за собой снижение скорости синтетических процессов, в том числе синтеза белка и нуклеиновых кислот, что проявляется уменьшением количества хроматина в ядре и рибосом (рис. 3.2.3).

Нормальные концентрации ионов в клетках и межклеточных жидкостях поддерживают мембранные транспортные системы, важнейшим звеном которых являются высокоспецифичные транспортные АТФазы. В литературе есть данные о стимулировании активности М§2+-зависимой K+,Na +-АТФазы дельта-эндотоксином клеток непарного шелкопряда TN -368 (Himeno et al., 1985).

Полученные нами данные показывают, что действие дельта-эндотоксина проявлялось в значительном стимулировании Mg2+ — зависимой К+, Na+-АТФазы (до 6,7 раза). Активирование фермента отмечалось уже через 1 мин действия токсина и предшествовало нарушениям ионного транспорта, которые возникали только спустя 15 мин (табл.3.3.7.). Ранее отмечено, что подобный эффект сопровождает разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания в митохондриях всех известных типов клеток (МсМштау and Begg, 1969).

Дальнейшим доказательством разобщающего действия дельта-эндотоксина является его влияние на продукцию АТФ в митохондриях и интенсивность их дыхания. Синтез АТФ снижался при любых используемых концентрациях токсина от 17 до 280 мкг/мл даже на фоне усиления поглощения кислорода, которое начинается в течение первой минуты (рис. 3.4.1). При этом, чем выше была концентрация токсина, тем значительнее усиливалось потребление 02 (рис. 3.4.2). Наиболее полно эффект начального стимулирования кислородопотребления с последующим его угнетением при общем снижении синтеза АТФ демонстрирует коэффициент фосфорилирования (дыхательный контроль) Р/О, служащий мерой эффективности сопряжения синтеза АТФ и дыхания в митохондриях (табл. 3.4.1), который во всех случаях оказывался ниже нормы от 5,5 до 32 раз.

Согласно существующим представлениям (Скулачев, 1974), синтезируемый в митохондриях АТФ обменивается на цитоплазматический

АДФ в результате активного трансмембранного антипорта. Следовательно, разобщающее действие дельта-эндотоксина полностью лишает клетку энергии, обеспечиваемой окислителным митохондриальным синтезом АТФ, что приводит к значительной ее деэнергизации вцелом.

Катаболизм глюкозы в цитоплазме клетки, не только сопровождается синтезом некоторого (незначительного) количества АТФ, но в аэробных условиях в основном является поставщиком предшественников субстратов дыхательной цепи, легко проникающих в митохондрии. Известно, что в клетках при гликолизе в аэробных условиях в равных количествах образуются пируват и 3-фосфоглицерат, которые способны переноситься в матрикс митохондрий и вступать в цикл Кребса, синтезирующий субстраты дыхательной цепи. В условиях усиленного дыхания митохондрий увеличивается и их потребность в восстановительных эквивалентах, что должно привести к усилению гликолиза в цитозоле. Ранее отмечалось стимулирование поглощения глюкозы клетками кишечника насекомого при пероральном введении им дельта-эндотоксина в течение первых 10 мин (Murphy et. al., 1976). Установлено, что это не является прямым следствием общего нарушения транспорта ионов и неэлектролитов, которое наблюдается не ранее, чем через 15 мин (Fast and Donaqhue, 1971).

При изучении влияния дельта-эндотоксина на интенсивность гликолиза удобными моделями оказались 3-фосфоглицерат дегидрогеназа, активность которой тем выше, чем выше степень аэробности условий, и лактат дегидрогеназа, для которой характерно обратное. Активирование 3-фосфоглицерат дегидрогеназы наблюдали в течение первых 10 мин действия токсина, что соответствует максимуму потребления глюкозы (рис. 3.5.1). Скорость и величина активирования были значительнее для более высоких концентраций дельта-эндотоксина. После 10 мин действия токсина активность фермента постепенно снижалась практически до полного его инактивирования через 30 мин. Это связано с прекращением окислительного синтеза АТФ в митохондриях в результате разобщающего влияния дельта-эндотоксина, то есть их деэнергизации. Результатом деэнергизации является торможение дыхательной цепи, наступающее вслед за начальным ее стимулированием, и нарушение транспортных функций митохондриальных мембран в отношении метаболитов гликолиза.

Снижение потребления кислорода приводит к переключению гликолиза на анаэробный режим. Об этом свидетельствует характер изменения активности лактат-дегидрогеназы в цитозоле клеток, которая приближалась к нулевому значению в период максимального потребления кислорода в первые 5 мин (рис. 3.5.2), и резко повышалась при торможении дыхания через 10-15 мин. Однако гликолиз не может обеспечить энергетических потребностей клетки, так как при гликолизе синтезируется всего 2 молекулы АТФ, тогда как в ходе окислительного фосфорилирования до 20 молекул на каждую расщепляемую молекулу глюкозы.

Снижение активности внутриклеточной лактат дегидрогеназы, наблюдавшееся во всех случаях после 30 мин действия дельта-эндотоксина (рис. 3.5.2), представляется связанным с выходом фермента из клеток в результате нарушения целостности их мембран. Известно, что подобное явление имеет место при любых деструкциях цитоплазматических мембран (Хиггинс, 1990). Это подтверждают результаты изучения изменения активности лактат дегидрогеназы в культуральной жидкости (рис. 3.5.3), которая начинала повышаться уже через 5 мин, возрастала с увеличением времени воздействия дельта-эндотоксина, и была тем значительнее, чем больше была концентрация токсина.

Наконец, методами ИК- и ЯМР-спектроскопии показано, что дельта-эндотоксин обладает лабильными протонами, которые он способен легко отдавать после растворения (рис. 3.6.1 и 3.6.2). Большое количество «кислых» протонов обусловлено доминирующим содержанием в составе белкового дельта-эндотоксина аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Вещества природного или синтетического происхождения, обладающие лабильными протонами, могут являться разобщителями процессов окислительного фосфорилирования (синтеза АТР), происходящего в митохондриях, если они обладают способностью проникать через биологические мембраны. Возможность этого подтверждает действие дельта-эндотоксина, полученного методом щелочного гидролиза, на искусственную азолектиновую мембрану, который в концентрации 50 и 100 мкг/мл вызывал падение ее сопротивления в 2-5 раз (таблица 3.6.1).

Подводя итог, можно предположить следующие этапы действия дельта-эндотоксина на клетки:

1. Связывание токсина с клеточными рецепторами, встраивание его в мембрану и формирование пор.

2. Нарушение активного транспорта ионов, вызывающее компенсаторное стимулирование ион транспортирующих АТФаз, и связанное с ним снижение синтеза АТФ.

3. Деэнергизация митохондрий, а затем клеток в результате прекращения синтеза АТФ на фоне начального стимулирования дыхания. Стимулирование гликолиза по аэробному типу.

4. Нарастающая вакуолизация клеток в результате нерегулируемого притока ионов натрия и воды. Усиление недостатка кислорода в клетках и связанное с этим активирование лактат дегидрогеназы.

5. Нарушение целостности клеточных мембран и выход из них растворимых веществ, например, лактат дегидрогеназы и лактата. Разрушение клеток в результате лизиса мембран.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каменек, Дмитрий Валерьевич, Казань

1. Азизбекян P.P., Смирнова Т.А. Споро- и кристаллообразование у В. thuringiensis II Успехи микробиологии. — 1988. — Вып. 22. — С. 83-107.

2. Ануфриев Э.Ф. Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. dendrolimus И В: Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений. 1985. - С. 135-145.

3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Медгиз, 1962. — 180 с.

4. Блохина Т.П., Сахарова З.В., Игнатенко Ю.Н., Работнова И.Л., Раутенштейн Я.И. Изменчивость В. thuringiensis при разных условиях выращивания//Микробиология. 1984.-Т. 53.-Вып.3. - С. 427-431.

5. Бриан Л.Е. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам: Пер. с англ. — М.: Медицина, 1984. — 272 с.

6. Бурцева Л.И., Штерншис М.В., Калмыкова Г.В. Бактериальные болезни насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. М.: Круглый год, 2001. — С. 167-245.

7. Вершинина В.И., Алимова Ф.К. Продукты на основе микробной биомассы // Микробная биотехнология. Казань: Унипресс: ДАС, 2000 - С.125-200.

8. Владимиров Ю.А. Кальциевые насосы живой клетки // Соросовский образовательный журнал. 1998. - №3. - с. 20-27.

9. Галушка Ф.П., Азизбекян P.P. Изучение плазмид линий раз-личных разновидностей Bacillus thuringiensis Berliner // Докл. Акад. наук СССР. — 1977. Т. 236. - С. 1233-1235.

10. Гейл Э., Кандлифф Э., Рейнолдс П., Ричмонд М., Уоринг М. Молекулярные основы действия антибиотиков. М.: Мир, 1975. - 500 с.

11. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

12. Головко А.Э., Голышин П.Н., Рябченко Н.Ф. Роль В. thuringiensis в природных биоценозах // Микробиологический журнал. 1993. — Т. 55. -№3. - С. 104-109.

13. Гулий В.В., Теплякова Т.В., Иванов Г.М. Микроорганизмы, полезные для биометода. Новосибирск: Наука, 1981. -270 с.

14. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М.: Медицина, 1980.-224 с.

15. Дебабов В.Г., Азизбекян.P.P., Хлебалина О.И., Дьяченко В.В., Галушка Ф.П., Белиш P.A. Выделение и предварительная характеристика хромосомных элементов ДНК Bacillus thuringiensis П Генетика. — 1977. — Т. 13. -№3. С. 496-501.

16. Долиба Н.М., Бабский A.M., Верли С.Л., Долиба Н.М., Иваниш Т.М., Фридман М.Ф., Осбаккен М.Д. Метаболический контроль транспорта натрия в кардиомиоцитах крысы при диабете // Биохимия. 2000. - Т. 65. — Вып.4. - С. 590-597

17. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. — М.: Колос, 1979. 416 с.

18. Егоров Н.С., Юдина Т.Г., Баранов А.Ю. О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями параспоральных кристаллов В. thuringiensis II Микробиология. 1990. - Т. 59. — №3. - С. 448-452.

19. Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. СПб.: ФОЛИАНТ, 2003. - 432 с.

20. Залунин И.А., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Белковый состав кристаллов дельта-эндотоксина различных серотипов Bacillus thuringiensis II Биохимия. 1979.-Т. 44.-С. 693-698.

21. Залунин И.А., Левин Е.Д., Тимохина Е.А., Честухина Г.Г., Степанов В.М. О различии первичных структур дельта-эндотоксинов, образуемых разными серотипами В. thuringiensis II Биохимия. — 1982. — Т. 47. — Вьтп.9. -С. 1570-1576.

22. Захаренко В.А. Развитие защиты растений и её научного обеспечения // Сельскохозяйственная биология. 2003. - №1. — С. 93-107.

23. Ивинскене В.Л. Роль фосфолипазы и термолабильного экзо-токсина в патогенности Bacillus thuringiensis // Автореф. дис. канд. биол.наук. Л., 1984. - 17 с.

24. Ивинскене В.Л. Фосфолипаза и термолабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis // Сб.:Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. 1987. - С. 57-75.

25. Ионин Б.И., Ершов Б.А. ЯМР-спектроскопия в органической химии. Л.: Химия. 1967.-32

26. Кагава Я. Биомембраны. — М.: Высшая школа, 1985. — 303 с.

27. Каменек Л.К. Выделение и очистка кристаллов Bacillus thuringiensis II Сб.: Бюллетень научно-технической информации СибНИИЗХим. -Новосибирск, 1980. № 2 (3). - С. 14-15.

28. Каменек Л.К. Влияние эндотоксина Bacillus thuringiensis на Mg2+-зависимую АТФазу некоторых видов насекомых // Кн.: Микро-организмы в защите растений. — Новосибирск, 1981. С. 72-77.

29. Каменек JI.K. Структура, свойства и механизм действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis II Сб.: Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. — Новосибирск, 1987. — С. 42-57.

30. Каменёк JI.K. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений. Дисс. докт. биол. наук. — М., 1998. -345с.

31. Каменек JI.K. Механизмы действия белковых бактериальных токсинов // Морфофункциональные взаимосвязи и адаптация: Ученые записки УлГУ. Сер. Биология и медицина. Ульяновск: СВНЦ, 2000. - Вып. 1(4). - С. 2230.

32. Каменек JI.K., Климентова Е.Г., Тюльпинева A.A. Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki на некоторые аэробные бактерии-фитопатогены // Ученые записки УлГУ. Сер. Экология. -Ульяновск: УлГУ, 2000. Вып. 1(2). - С. 76-80.

33. Каменек Л.К., Левина Т.А. Роль сукцинатдегидрогеназы в резистентности бактерий к дельта-эндотоксинам Bacillus thuringiensis II Микробиология. -2005.-Т. 74.-№5.-С. 711-713.

34. Каменек Л.К., Левина Т.А., Терехин Д.А., Миначева Л.Д. Антибактериальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений // Биотехнология. 2005. — №1. -С. 59-67.

35. Каменек Л.К., Харина Н.И. Действие эндотоксина Bacillus thuringiensis на культуру клеток непарного шелкопряда // Сб.: Актуальные проблемы земледелия химизации и защиты растений в Сибири. — Новосибирск, 1981.-С. 40.

36. Каменек Л.К., Харина Н.И. Цитотоксическое действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var. galleriae на культуру клеток Lymantria dispar L. //

37. Сб.: Использование микроорганизмов в сельском хозяйстве и промышленности. Новосибирск, 1982. - С. 72-79.

38. Каменек JI.K., Штерншис М.В. Влияние дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на активный транспорт ионов у насекомых. // Изв. СО АН СССР, сер. Биол. 1984. - В. 3. - б - С. 113-117.

39. Каменек Л.К., Штерншис М.В. Разобщающее действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis II Сб.: Интегрированная защита растений от болезней и вредителей в Сибири. — Новосибирск, 1986. С. 80-85.

40. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М.: Агропромиздат, 1989. - 172 с.

41. Кандыбин Н.В. Для активации микробиометода //Защита и карантин растений.-2003.-№7.-С. 13-14.

42. Катуха С.П., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Химическая характеристика белков кристаллов Bacillus thuringiensis. II Химия природн. соедин. -1980.-№3.-С. 384-386.

43. Киль В.И., Надыкта В.Д. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку // Arpo XXI. 2002. - №1. - С. 12-15.

44. Климентова Е.Г. Антимикробное действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий: автореф. дис. . к.б.н.-М., 2001.-21 с.

45. Кольчевский А.Г., Лескова А .Я. Изменчивость физио лого-биохимических свойств В. thuringiensis subsp. thuringiensis после пребывания в почве // Микробиология. Т. 54.- 1985.-Вып. 6.-С. 1019-1020.

46. Кольчевский А.Г., Рыбина Л.М., Коломиец В.Я. Выделение и отбор высоковирулентных культур Bacillus thuringiensis var. galleriae. II Методические рекомендации. Л., 1987. -21 с.

47. Коробко А.П. Новые возможности микробиометода // Защита и карантин растений. 1997. - №5. - С. 8-9.

48. Кузнецов Л.Е., Ховрычев М.П. Оптимизация синтетической питательной среды для культивирования В. thuringiensis II Микробиология. 1984. - Т. 53.-Вып. 1.-С. 54-57.

49. Кукси К.Э. Кристаллический белковый токсин В. thuringiensis: биохимия и механизм действия // Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М.: Колос, 1976. - С. 198-218.

50. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Шарафутдинова A.M., Силищев H.H. Биопрепараты для томатов в защищенном грунте // Аграрная наука. 2004. - №5. - С. 7-8.

51. Коробко А.П. Новые возможности микробиометода // Защита и карантин растений. 1997. - №5. - С. 8-9.

52. Крутецкая З.И., Лебедев O.E. Механизмы Ca сигнализации в клетках // Цитология.-2001.-Т. 43.-№1.-С. 5-26.

53. Кузин А.И., Шамшина Т.Н., Миненкова И.Б., Шагов Е.М., Азизбекян P.P. Влияние условий культивирования на продукцию дельта-эндотоксина у В. thuringiensis subsp. morrisoni II Биотехнология. 1994. - С. 23-25.

54. Кузнецов Л.Е., Ховрычев М.П. Оптимизация синтетической питательной среды для культивирования В. thuringiensis И Микробиология. — 1984. Т. 53.-Вып. 1.-С. 54-57.

55. Кукси К.Э. Кристаллический белковый токсин В. thuringiensis: биохимия pi механизм действия // Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. -М.: Колос, 1976. С. 198-218.

56. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Пугачева Е.Г., Шарафутдинова A.M., Силищев H.H. Биопрепараты для томатов в защищённом грунте // Аграрная наука. 2004. - №5. - С. 7-8.

57. Левин A.C., Завезенова Т.В., Левина И.И. Фракционный состав белка эндотоксинов и биохимическая характеристика энтомопатогенных бацилл группы thuringiensis // Сб.: Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск. 1978. — С. 37-44.

58. Лескова А.Я., Рыбина Л.М. Термостабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis // Сб: Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. — Новосибирск, 1987. — С. 31-42.

59. Лескова А.Я., Рыбина Л.М., Строева И.А. Идентификация культур Bacillus thuringiensis и оценка их патогенных свойств // Методические указания. -Л., 1984.- 19 с.

60. Майгалит Й., Бен-Дов Э. Биологические методы контроля численности двукрылых насекомых с помощью Bacillus thuringiensis sitbsp. israelensis // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. М.: Круглый год, 2001. - С. 246-270.

61. Макарюнайте Ю.П. Хроматографическое разделение комплекса фосфолипаз С Bacillus cereus и характеристика индивидуальных ферментов: автореф. дис. . канд. биол. наук. — Вильнюс, 1985. 19 с.

62. Методические указания по определению микроэлементов в почвах, кормах и растениях методом атомно-абсорбционной спектроскопии. М.: ЦИНАО, 1985.-96 с.

63. Пирс Э. Гистохимия. — М.: Иностр. лит., 1962. 962 с.

64. Писарева JI.H. Активируемая Na+ и К+ аденозинтрифосфатаза из коры почек морской свинки. Получение, взаимодействие с ионами и ферментными ядами // Цитология. - 1968. - № 10. - С. 988-994.

65. Плохинский H.A. Математические методы в биологии. М.: МГУ, 1978. -265 с.

66. Ролан Ж.-К., Селоши А., Селоши Д. Атлас по биологии клетки. — М.: Мир, 1978.- 118 с.

67. Сахарова З.В., Игнатенко Ю.Н., Шульц Ф., Ховрычев М.П., Работнова И.Л. Кинетика роста и развития В. thuringiensis при периодическом культивировании // Микробиология. 1985. - Т. 54. - Вып. 4. - С. 604-608.

68. Сахарова З.В., Работнова И.Л., Ховрычев М.П. Рост и спорообразование В. thuringiensis при высоких концентрациях субстратов // Микробиология. — 1988.-Т. 57.-Вып. 6.-С. 992-995.

69. Сахарова З.В., Игнатенко Ю.Н., Ховрычев М.П., Лыков В.П., Работнова И.Л., Шевцов В.В. Споруляция и кристаллообразование у В. thuringiensis при лимитации роста источниками питания // Микробиология. — 1984. Т. 53.-Вып. 2.-С. 279-284.

70. Скулачёв В.П. Трансформация энергии в биомембранах. — М.: Наука, 1972.-203 с.

71. Скулачев В.П. Механизм окислительного фосфорилирования и некоторые общие принципы биоэнергетики // Успехи соврем, биологии. 1974. - Т. 77. - В. 2.-С. 125-154.

72. Слободянюк Г.А., Игнатьева Т.Н., Пилипюк В.Н. Биологическая защита овощных культур в закрытом грунте курортной зоны г. Сочи //Защита растений. 1995. - №6. - С. 12-13.

73. Смирнова Т.А., Михайлова A.M., Тюрин B.C., Азизбекян P.P. Ультраструктура спор и кристаллов бактерий различных серотипов В. thuringiensis II Микробиология. 1984. — Т. 53. - Вып. 3. — С. 455-462.

74. Степанова Т.В., Барышникова З.Ф., Чирков М.В., Жимерикин В.Н., Рябченко Н.Ф. Штаммы В. thuringiensis, проявляющие множественную активность против широкого круга насекомых // Биотехнология. — 1996. — №12.-С. 17-22.

75. Тюльпинева A.A. Антифунгальное действие дельта-эндотоксина В. thuringiensis как экологически безопасного агента защиты растений: дис. . к.б.н. Ульяновск, 2003. - 123 с.

76. Умбрейт В.В., Буррис Р.Х., Штауффер Дж.Ф. Манометрические методы изучения тканевого обмена. — М.: Изд-во И.Л., 1951. — 359 с.

77. Хеймпел A.M. Безопасность энтомопатогенных микроорганизмов для человека и позвоночных животных // Микроорганизмы в борьбе с вредными насекомыми и клещами. М.: Колос, 1976. - С. 373-390.

78. Хужамшукуров H.A., Юсупов Т.Ю., Халалов И.М., Гузалова А.Г., Мурадов М.М., Давранов К.Д. Энтомоцидная активность бактериальных клеток В. thuringiensis // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. — Т. 37. -№6.-С. 698-701.

79. Честухина Г.Г., Залунин И.А., Костина Л.И., Котова Т.С., Катруха С.П., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Протеолитические ферменты, связанные с кристаллами Bacillus thuringiensis II Биохимия. 1978. — Т. 43. — С. 857864.

80. Честухина Г.Г., Степанов В.М. Сравнительная биохимия 8-эндотоксинов и ферментов Bacillus thuringiensi. II Тезисы V Всесоюзного биохимического съезда. -М., 1985.-Т. 1.-С. 236-237.

81. Честухина Г.Г., Тюрин С.А., Остерман A.JL, Залунин И.А., Костина Л.И., Ходова О.П., Степанов В.М. Структурно-функциональные особенности энтомоцидного белка В. thuringiensis II Тезисы V Всесоюзного биохимического съезда. — М., 1986. Т. 2. - С. 20.

82. Честухина Г.Г., Костина Л.И., Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха С.П., Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. Белки кристаллов дельта-эндотоксина В. thuringiensis П Биохимия. 1977. - Т. 42. - Вып. 9. - С. 1660-1667.

83. Честухина Г.Г. Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ Bacillus thuringiensis: автореф. дис. . д.б.н. -М., 1990. 53 с.

84. Чиргадзе Ю.Н. Инфракрасные спектры и структура полипептидов и белков. -М.: Наука, 1965. 135 с.

85. Штерншис М.В., Каменек Л.К. Усиление действия дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis II Сб.: Интегрированная защита с.-х. культур от болезней и вредителей в Сибири. Новосибирск, 1986. - С. 80-85.

86. Юдина Т.Г., Егоров Н.С. Антимикробная активность белковых включений различных бактерий // Доклады Академии Наук. 1996. — Т.349. — №2. - С. 283-286.

87. Юдина Т.Г., Егоров Н.С., Лория Ж.К., Выборных С.Н. Биологическая активность параспоральных кристаллов В.thuringiensis // Изв. АНСССР. -1988. Сер. биологическая. - №3. - С. 427-436.

88. Юдина Т.Г., Бурцева JI.И. Действие дельта-эндотоксинов четырёх подвидов В. thuringiensis на различных прокариот // Микробиология. — 1997.-Т. 66.-№1.-С. 25-31.

89. Akimenko V.K., Golovchenko N.P., Medentsev A.G. The absence of energy conservation with electron transfer via the alternative pathway in cyanide-resistant yeast mitochondria // Biohim. Et Biophys. Acta. — 1979. V. 585. - P. 398-403.

90. Aronson A., Fitz-James P.C. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat // Bacteriol.Revs. 1976. - V. 40. - P. 360-402.

91. Aronson A.I., Beckman W., Dunn P. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens // Microbiol. Rev. 1986. - V. 50. - P. 1-24.

92. Akihiko F. Mode of action of bipyramidal 8-endotoxin of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD 1 //Appl. Environ. Microbiol. - 1986. - V. 51. - P. 630633.

93. Angus T.A. A bacterial toxin paralysing silkworm larvae // Nature. 1954. - V. 173.-P. 545-546.

94. Aronson A.I., Fitz-James P.C. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat // Bacterid. Rev. 1976. - V. 40. - P. 360-402.

95. De Barjac H., Bonnefoi A. Essai de classification biochimique et serologicue de 24 souches de Bacillus du type B. thuriniensis II Entomophaga. — 1962. — V. 7. — P. 5-31.i

96. De Barjac H., Bonnefoi A. Classification des souches de Bacillus thuringiensis.

97. C.R. Acad. Sei. Paris. 1967. - V. 264. - P. 1811-1813.

98. De Barjac H., Bonnefoi A. A classification of strains of Bacillus thuringiensis Berliner with a key to their differentiation // J. Invert. Pathol. 1968. - V. 11.— P. 335-347.

99. De Barjac H., Frachon E. Classification of Bacillus thuringiensis: insect and beyond II Biotechnol. 1992. - V. 10. - P. 271 -275.

100. Bateson J.B., Stainsby G. Analysis of the active principle in the biological insecticide Bacillus thuringiensis Berliner // J.Food Technol. 1970. — V.5. — P. 403-415.

101. Beeblee T.G.C., Bond R.P.M. Effect of an exotoxin from Bacillus thuringiensis on deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in nuclei from adult Sarcophaga bullata // Biochem. J. 1975. - V.136. - P. 9-13.

102. Berliner E. Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenrouppe (Ephestia kuhniella Zell.) und ihen Erreger Bacillus thuringiensis, n. sp. // Z. Angew. Entomol. — 1915. V. 2.-P. 29-56.

103. Bonnefoi A., de Bariac H. Classification des souches du groupe Bacillus thuringiensis par la determination de l,antignee flagellaire II Entomophuga. -1963.-V. 8.-P. 223-229.

104. O.Bosch D., Schipper B., van der Kleij H., de Maagd R.A., Stiekema J. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance management // Bio/Technology. 1994. — №12. - P. 915-918.

105. Bravo A., Sanchez J., Kouskoura T., Crickmore N. N-terminal Activation Is an Essential Early Step in the Mechanism of Action of the Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac Insecticidal Toxin // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P.23985-23987.

106. Bravo A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis d-endotoxin family proteins and their functional domains // Jour. of. Bacteriol. 1997. - V. 179.-№9.-P. 2793-2801.

107. Bulla L.A., Bechtel D.E., Kramer J.K.J., Shethna J.I., Aronson A.I., Fitz-James P.C. Ultrastructure, physiology and biochemistry of Bacillus thuringiensis II Crut. Rev. Microbiol. 1980. - V. 8. - P. 147-204.

108. Bulla L.A., Davidson L.I.,Kramer K.J., Jones B.L. Purification of the insecticidal toxin from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1979. - V.91: 1123-1126.

109. Bulla L.A., Kramer K.J., Bechtel D.B., Davidson L.I. Entomocidal proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis II In: Microbiology, 1976. -Washington: D.C., 1976.-P. 534-539.

110. Bulla L.A., Kramer K.J., Cox D.J., Jones B.L., Davidson I., Lookhart C.L. / Purification and characterization of the entomocidal protoxin of Bacillus thuringiensis II J. Biol. Chem. 1981. - V. 256. - P. 3000-3004.

111. Bulla L.A., Kramer J.J., Davidson L.I. Characterization of the entomocidal parasporal crystal of Bacillus thuringiensis II J. Bacteriol. — 1977. — V. 130. — P. 375-383.

112. Burges H.D., Thomson E.M., Latchford R.A. Importance of spores and 5-endotoxin protein crystals of Bacillus thuringiensis in Galleria mellonella // J. Invertebr. Pathol. 1976. - V. 27. - P. 87- 94.

113. Butko P. Cytolytic Toxin CytlA and Its Mechanism of Membrane Damage: Data and Hypotheses // Appl. and Env. Microbiology. 2003. - V. 69. - №5. -P. 2415-2422.

114. Butko P., Huang F., Pusztai-Carey M., Surewicz W.K. Membrane permeabilization induced by cytolytic delta-endotoxin CytA from Bacillus thuringiensis var. israelensis U Biochemistry. 1996. — V. 35. — P. 1135511360.

115. Carroll J., Ellar D.J. An analysis of Bacillus thuringiensis endotoxic action on insect midgut membrane permeability using a light scattering assay // Eur. J. Biochem. 1993. -V. 214. - P. 771-778.

116. Carrol J., Ellar D.J., Analisis of the large aqueons pores produced bu a Bacillus thuringiensis protein insecticide in Manduca sexta midgut brush - border -membrane vesicles // Eur. J. Biochem. - 1997. - V. 245. - P. 797-804.

117. Carrol J., Wolfersberger M., Ellar D.J. The Bacillus thuringiensis Cry I A toxic-induced permeability change in Manduca sexta midgut brush border membrane versicles proceeds by more them one mechanism // J. Cell. Sci. —1997. — V. 15. — P. 83-87.

118. Chestukhina G.C., Kostina L.I., Michailova A.L., Tyurin S.A., Klepikova F.S., Stepanov V.M. The main features of Bacillus thringiensis molecular structure // Arch. Microbiol.- 1982.-V. 132.-P. 159-162.

119. Chungjatupornhai W., Hofte H., Seurinck J., Angsuthanasombat Ch., Vaeck M. Common features of Bacillus thuringiensis toxins specific for Diptera and Lepidoptera// Europ. J. Biochem. 1988. - V. 173. - P. 9-16.

120. Cooksey K.E. Purification of a protein from Bacillus thuringiensis toxic to a larvae of Lepidoptera // Biochem. J. 1968. - V. 106. - P. 445-454.

121. Crichmore N., Nicholls C.N., Eaps D.J., Hodgman T.C., Ellar D.J. The construction of Bacillus thuringiensis strains expressing delta-endotoxin combinations // Biochem. J. 1990. - V. 270. - P. 133-141.

122. Delafield F.P., Somerville H.J., Rittenberg S.C. Immunologocal homology between crystal and spore protein of Bacillus thuringiensis II J. Bacteriol. -1968.-V. 96.-P. 713-720.

123. De Maagd R.A., Vanderklei H., Bakker R.L., Stiekema W.J., Bosch D. Different domains of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin can bind to insect midgut membrane proteins on ligand blots // Apple. Anviromn. Microbiol. 1966. - V. 62.-P. 2753-2757.

124. Dulmage H.T. Insecticidal activity of isolates of Bacillus thuringiensis and their potential for pest control // In: Microbial, control of pests and plant diseases (Burges H.D) Acad. Press: London, 1981. - P. 193-222.

125. Ellar D.J. Structure and mechanizm of action of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins and theirs receptors // Biochem. Sci. Biotechnol. — 1994. — V. 4. — P. 445-447.

126. Fast P.G. The crystal toxin of Bacillus thuringiensis. I I In: Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980. London - New York: Acad. Press, 1981. -P. 223-248.

127. Fast P.G., Milne R. The 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis. 4. The effect of 5-endotoxin on ion regulation by midgut tissue of Bombyx mori larvae // J.Invert. Pathol. 1979.-V. 34. - P. 319.

128. Fast P.G., Morrison I.K. The 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis. 4. The effect of 5-endotoxin on ion regulation by midgut tissue of Bombyx mori larvae // J. Invert. Pathol. 1972. - V. 20. - P. 208-211.

129. Fast P.G., Murphy D.W., Sohi S.S. Bacillus thuringiensis 5-endotoxin: evidence that toxin acts at the surface of susceptible cells // Experientia. — 1978. V. 34. -P. 762-763.

130. Faust R.M. Nature of pathogenig process of Bacillus thuringiensis II Compar. Pathol. 1984.-V. 7.-P. 91-141.

131. Faust R.M., Adams J.R., Abe K., Iizzuka T., Bulla L.A. Comparative morphology and size distribution of the parasporal crystals from various strains of Bacillus thuringiensis II J. Sericult. Sci. Jap. 1982. - V.51. - P. 316-324.

132. Faust R., Hallam G., Travers R. Degradation of the parasporal crystal produced by Bacillus thuringiensis var. kurstaki I I J. Invertebr. Pathol. — 1974 a. V. 24. -P. 365-373.

133. Faust R., Travers R., Hallam G. Preliminary investigations on the molecular mode of action of the 8-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var. alesti. //J. Invertebr. Pathol. 1974 b. - V. 23. - P. 259-261.

134. Fedhila S., Nel P., Lereclus D. The InhA2 Metalloprotease of Bacillus thuringiensis Strain 407 Is Required for Pathogenicity in Insects Infected via the Oral Route // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 3296-3304.

135. Gill S.S., Cowlest E.A., Francis V. Identification, isolation and cloning of a Bacillus thuringiensis CrylAc toxin-binding protein from midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 27277-27282.

136. Conzales J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. Correlation between specific plasmids and 8-endotoxin production in Bacillus thuringiensis II Plasmid. -1981.-V. 5.-P. 351-365.

137. Gonzales J., Brown B., Carlton B. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for 5-endotoxin among strains of B. thuringiensis and B. cereus II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. -V.7 9. -P.6951-6955.

138. Grigorova R.E., Kantardgieva E., Pashov N. On the shape and structure of the crystal in two strains of Bacillus thuringiensis II J. Invert. Pathol. 1967. — V. 9.-P. 503-509.

139. Grochulski P., Masson L., Borisova S., Pusztai-Carey M., Schwartz J.L., Brousseau R., Cygler M. Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation // J. Mol. Biol. 1995. - V. 254. - P. 447-464.

140. Guerchicoff A., Delecluse A., Rubinstein C.P. The Bacillus thuringiensis cyt Genes for Hemolytic Endotoxins Constitute a Gene Family // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 1090-1096.

141. Haider M.Z., Ellar D.J. Specific membrane receptors for 8-endotoxin on the midgut insect target cells II Biochem. J. 1987. - V. 248. - P. 197-201.

142. Haider M.Z., Ellar D.J. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal 5-endotoxin: interaction with phospholipid vesicles // Biochim. Biophys. Acta. 1989,-V. 978.-P. 216-222.

143. Hannay C.L. Crystalline inclusions in aerobic sporeforming bacteria //Nature. — 1953.-V. 172.-P. 1004.

144. Hannay C.L. Inclusions in bacteria // In: Bacterial Anatomy. Spooner E. and Stocker B. (eds.), 1956. - P. 318-340.

145. Hannay C.L., Fitz-James P. The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner // Can. J. Microbiol. 1955. - V. 1. - P. 694-710.

146. Harvey W.R., Wolfersberger M.G. Mechanism of inhibition of active potassium transport in isolated midgut of Manduca sexta by Bacillus thuringiensis endotoxin // J. Exp. Biol. 1979. - V. 83. - P. 293-304.

147. Hedman R., Suranyi E.M., Luft R., Ernster L. Oxidation of external DPNFI by mitochondria from human and rat sceletal muscle // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1962. - V. 8. - P. 314-320.

148. Heimpel A.M. A critical review of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner and other crystalliferous bacteria // Ann. Rev. Entomol. 1967. - V. 12.-P. 287-322.

149. Heimpel A.M., Angus T.A. Bacterial insecticides // Bacteriol. Rev. 1960. - V. 24.-P. 266-288.

150. Herbert B.N., Gould H.J. Biosynthesis of the crystal protein of Bacillus thuringiensis var. tolworthi: 1.Kinetics of formation of the polypeptide components of the crystal protein in vivo // Eur. Biochem. — 1973. — V. 37. P. 441-448.

151. Himeno M., Koyama N., Funato T., Komano T. Mechanism of action Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxin on insect cells in vivo // Agr. Biol. Chem. 1985. - V. 49. - P. 1461-1468.

152. Hodgman T.C., Ellar D.J. Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis delta-endotoxins determined by compilation analysis // J. DNA Sequens.' Mapp. 1990. -V. 1. - P. 97-106.

153. Hofmann C., Luthy P., Hutter R., Pliska V., Binding of the delta endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae) // Eur. J. Biochem. 1988. - V. 173. - P. 85-91.

154. Hofmann C., Wolfersberger M.J., Luthu P. Visualisation of binding of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells // In: Proc. 2nd Europ. Workshop on bact. toxins. 1985. - P. 70-72.

155. Hofte H., Whiteley H.R. Insecticidal Crystal Proteins of Bacilllus thuringiensis //Microbiol.Rev. 1989. -V. 53. -№2. - P. 242-255.

156. Hofte H., Whiteley H. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins determined by compilation analysis // J. DNA Sequens. Mapp. 1990. - V. 1. - P. 97-106.

157. Holmes K.C., Monro R.E. Studies on the structure of parasporal inclusions from Bacillus thuringiensis // J. Mol. Biol. 1965. - V. 14. - P. 572-581.

158. Huber H.E., Luthy P. Bacillus thuringiensis 5-endotoxin: composition and activation // In: Pathogenesis of invertebrate microbial diseases. Allanheld: N.Y., 1981.-P. 209-234.

159. Huber H.E., Luthy P., Ebersold H.R., Goldier J.L. The subunits of the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis: size, linkage and toxicity // Arch. Microbiol. -1981.-V. 129.-P. 14-18.

160. Ito A., Sasaguri Y., Kitada S., Kusaka Y., Kuwano K., Masutomi K., Mizuki E., Akao T., Ohba M. A Bacillus thuringiensis Crystal Protein with Selective Cytocidal Action to Human Cell // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. - №20. - P. 21282-21286.

161. Kim Y.T., Gregory B.G., Ignoffo C.M. The 5-exotoxin of Bacillus thuringiensis: IV . Effects of Bacillus thuringiensis of macromolecules in an insects cell line // J. Invert. Pathol. 1972. - V.20. - P. 284 - 287.

162. Kimmich G.A. Active sugar accumilation by isolated intestinal epithelial cells. A new model for sodium-dependent metabolite transort // Biochem. — 1970. — V.9.-P. 3669-3677.

163. Klier A., Fargette F., Ribier F., Ribier J., Rapoport G. Cloning and expression of the crystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain Berliner 1715 // EMBO Joum. — 1982. — V. 1. P.791-799.

164. Knowles B.H. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxins // Adv. Insect. Phys. 1994. - V. 24. - P. 275-303.

165. Knowles B.H., Ellar D.J. Colloid-osmotic lysisis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin with different insect specificity // Biochem. Biophys. Acta. 1987. - V. 924. - P. 509-518.

166. Knowles B.H., Ellar D.J. Characterization and partial purification of a plasma membrane receptor for Bacillus thuringiensis var. kurstaki lepidopteran-specific 5-endotoxin//J. Cell. Sci. 1986.- V. 83.-P. 89-101.

167. Koni P.A., Ellar D.J. Cloning and characterization of a novel Bacillus thuringiensis cytolitic delta-endotoxin // J. Mol. Biol. 1993. - V. 229. - P. 319327.

168. Krieg A., de Barjac H., Bonnefoi A. A new serotype of Bacillus thuringiensis isolated in Germany: Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis II J. Invert. Pathol. 1968. -V. 10. -P.428-430.

169. Krieg A., Huger A.M., Langenbruch G.A., Shnetter W. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis: a new pathotype effective against larvae of Coleoptera // Z. Angew. Entomol. 1983. - B. 96. - №.5. - P. 500-508.

170. Krieg A., Miltenburger H.G. Bioinsecticides: I. Bacillus thuringiensis II Advances in biotechnological processes. 1984. - V. 3. - P. 273-290.

171. Krywienczyk J., Dulmage H.T., Fast P.G. Occurrence of two serologically distinct groups within Bacillus thuringiensis serotype 3ab var. kurstaki II J. Invertebr. Pathol. 1978. -V. 31. - P. 372-375.

172. Labaw L.W. The structure of Bacillus thuringiensis Berliner crystals. // J. Ultrastruct. Res. 1964. - V. 10. - P. 66-75.

173. Le Binh T., Vachon V., Schwartz J.-L., Laprade R. Differential Effects of pH on the Pore-Forming Properties of Bacillus thuringiensis Insecticidal Crystal Toxins I I Appl.and Environment. Microb. 2001. - V. 67. - №10. - P. 44884494.

174. Lecadet M.-M. La toxine figuree de Bacillus thuringiensis. Fechnique de separation et composition en acides amines // Compt. Rend. Acad. Sci. — 1965. — V. 261.-P. 5693-5696.

175. Lecadet M.-M. Action comparee de l,uree et du thioglycolate sur la toxine figuree de Bacillus thuringiensis II Compt. Rend. Acad. Sci. — 1967. V. 264. -P. 2847-2850.

176. Lecadet M.-M., Dedonder R. Biogenesis of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis during sporulation // Eur. J. Biochem. — 1971. — V. 23. — P. 282294.

177. Lecadet M.-M., Chevrier G., Dedonder R. Analysis of a protein fraction in the spore coats of Bacillus thuringiensis I I Eur. J. Biochem. — 1972. — V. 25. — P. 349-358.

178. Lecadet M.M., Dedonder R. Enzymatic hydrolysis of the crystals of Bacillus thuringiensis by the proteases of Pieris brassicae. 1. Preparation and fractionation of the lysates // J. Invertebrate Path. 1967. - №9. - P. 310-321.

179. Lee S.G., Eckblad W., Bulla L.A. Diversity of protein inclusion bodies and identification of mosquitocidal protein in Bacillus thuringiensis subsp. israelensis II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. - V. 126. - P. 953-960.

180. Lereclus D., Mennou G., Lecadet M.M. Isolation of a DNA sequence related to several plasmids from Bacillus thuringiensis after a mating involving the Streptococcus faecalis plasmid pAM(31 // Mol and Gen. Genet. 1983. - V. 191.-P. 307-313.

181. Lereclus D., Lecadet M.M., Ribier J., Dedonder R. Molecular relationships among plasmids of Bacillus thuringiensis: conserved sequences through 11 crystalliferous strains // Mol. and Gen. Genet. 1982. - V. 186. - №3. - P. 391398.

182. Li J. Insecticidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis II In: Protein toxic structure. 1996. - P. 49-77.

183. Li J., Koni A.P., Ellar DJ. Structure of the mosqu-2itocidal delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis subsp. kyushvensis, and implication for membrane pore formation // J. Mol. Biol. 1996. - V. 257. - P. 129-152.

184. Li J., Carroll J., Ellar D.J. Crystal structure of insecticidal d-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution // Nature. 1991. - V.353. - P.815-821.

185. Li J., Derbyshire D.J., Promdonkoy B., Ellar D.J. Structural implications for the transformation of the Bacillus thuringiensis d-endotoxins from water-soluble to membrane-inserted forms // Biochem. Soc. Trans. 2001. - V.29. - P.571-577.

186. Li J., Koni P.A., Ellar D.J. Structure of the mosquitocidal delta-endotoxin CytB from Bacillus thuringiensis ssp.kyushuensis and implications for membrane pore formation // J. Mol. Biol. 1996. - V. 257. - №1. - P. 129-152.

187. Liang Y., Patel S.S., Dean D.H. Irreversible binding kinetics of Bacillus thuringiensis CrylA S-endotoxins to gypsy moth brush border membrane vesicles is directly con-elated to toxicity // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 24719-24724.

188. Lightwood D.J., Ellar D.J., Jarrett P. Role of proteolysis in determining potency of Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac S-endotoxin // Applied and Environmental Microbiology. -2000. V. 66.-№12.-P. 5174-5181.

189. Lilley M., Ruffel R.N., Somerville H.J. Purification of the insecticidal toxin in crystals of Bacillus thuringiensis IIJ. Gen. Microbiol. 1980. - V. 118. - P. 1-11.

190. Lorence A., Darszon A., Diaz C., Lievano A., Quintero R., Bravo A. 8-Endotoxins induce cation channels in Spodoptera frugiperda brush border membranes in suspension and in planar lipid bilayers // FEBS Lett. 1995. - V. 360.-P. 217-222.

191. Lu H.L., Rajamohan F., Dean D.H. Identification of amino acid residues of Bacillus thuringiensis d-endotoxin CrylAa associated with membrane binding and toxicity to Bombyx mori // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 5554-5559.

192. Luthy P. Insecticidal toxins of Bacillus thuringiensis II FEMS Microbiology Letters. 1980. - V. 8. - P. 1-7.

193. Luthy P., Wolfersberger M.G. The delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis. Structure and mode of action // Swiss Biotechn. 1986. -V. 4. - P. 11-14.

194. Marrone P.G., Heins S.D., Manker D.C., Jimenez D.R., Chilcott C.N., Wigley P., Broadwell A. Strain of Bacillus for controlling plant disease / Пат. 5919447. США, 1999. МПК6 AO IN 63/00, C12N 1/20.

195. Masson L., Lu Y.-J., Mazza A., Brousseau R., Adang M.J. The CrylA(c) receptor purified from Manduca sexta displays multiple specificities // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 20309-20315.

196. McCarthy W.J., Aronson J.N., Labenberg J. A 63 KDa toxic polypeptide from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki (HD-263): effect on several lepidopteran cell lines // In Vitro Cell. Development. Biol. 1988. - V. 24. - P. 59-64.

197. McMurray W.C., Begg R.W. Effect of valinomycin on oxydative phosphorilation. Arch. Biochem. Biophys. - 1969. -V. 84. - P. 546-550.

198. Molid-Salleh M.B., Leurs L.C. Toxic effects of spore/crystal ratios of Bacillus thuringiensis on european corn borer larvae. — J. Invertebr. Pathol. — 1982. V. 39.-P. 290-299.

199. Monro R.E. Protein turnover and the formation of protein inclusions during sporulation of Bacillus thuringiensis II Biochem. J. — 1961. — V. 81. — P. 225232.

200. Murphy D.W., Sohi S.S., Fast P.G. Bacillus thuringiensis enzym-digested delta-endotoxin: effect on cultured insect cells // Science. 1976. — V. 194. - P. 954956.

201. Nagamatsu Y., Itai Y., Hatanaka C., Funatsu G., Hayashi K. A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensi. II Agric. Biol. Chem. 1984.-V. 48.-P. 611-619.

202. Nishiitsutsuji-Uwo J., Endo Y., Himeno M. Mode of action of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin. Effect on TN-368 cells // J. Invertebr. Pathol. -1979.-V.34.-P. 267-275.

203. Norris J.R., Watson D.H. Electron Microscope study of sporulation and protein crystal formation in Bacillus cereus var. alesti // G. Gen. Microbiol. 1960. - V. 22. - P. 744-749.

204. Ohba M., Yu Y.M., Aizawa K. Non-toxic isolates of Bacillus thuringiensis producing parasporal inclusions with unusual protein components. // Lett. Appl. Microbiol. 1987. - V.5. - P. 29-32.

205. Pendleton I.R. Characterization of crystal protoxin and an activated toxin from Bacillus thuringiensis var. entomocidus // I. Invertebr. Pathol. — 1973. — V. 21. — P. 46-49.

206. Pendleton I.R., Bernheimer A.W., Grushoff P. Purification and partial characterization of hemolisins from Bacillus thuringiensis II J. Invertebr. Pathol. 1973.-V. 21.-P. 131-135.

207. Peyronnet O., Vachon V., Schwarz J.-L., Laprade R. Ion channel activity from the midgut brush-border membrane of Gypsy moth (Lymantria dispar) larvae // Jour, of Exp. Biol.- 2000. V. 203.-P. 1835-1844.

208. Prasad S.S., Shethna Y.I. Mode of action of a purified antitumor protein from the proteinaceous crystal of B. thuringiensis on Yoshida ascites Sarcoma cells // Antimicrob. Agents and Chemother. 1976. - V. 10. - №2. - P. 293.

209. Prasad S.S., Shethna Y.I. Biochemistry and biological activities of the proteinaceous crystal of Bacillus thuringiensis II J. Sci. Ind. Res. — 1976. V. 35.-P. 626-632.

210. Ravoahangimalala 0., Charles J.-F. In vitro binding of Bacillus thuringiensis var. israelensis individual toxins to midgut sells of Anopheles gambiae larvae (Diptera: Culicidae) // FEBS Letters. 1995. - V.362. - P. 111-115.

211. Ribier J. L inclusion parasporale du Bacillus thuringiensis var. berliner 1715: moment et site de son initiation, rapports avec 1,ADN sporangial // C.R. Acad. Sei.: Paris. 1971. - V. 273. - P. 1444-1447.

212. Ribier J., Lecadet M.M. Etude ultrastructurale et cinetique de la sporulation d Bacillus thuringiensis var. berliner 1715. Remarques sur la formation de 1,inclusion parasporale//Ann. Microbiol. Tnst. Pasteur. — 1973. V. 123 A. - P. 311-344.

213. Sayles V.B., Aronson J.N., Rosenthal A. Small polypeptide components of the Bacillus thuringiensis. Parasporal crystalline inclusion // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970. - V. 41. - P. 1126-1133

214. Scherrer P., Pillinger R.R., Somerville H.J. Toxicity to Lepidotera in the exosporium membrane spores of Bacillus thuringiensis II Proc. Soc. Gen. Microbiol. 1974. - V. 1. - P. 145.

215. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. - V. 62. - №3. - P. 775806.

216. Schnepf H.E., Whiteley H.R. Delineation of a toxin-encoding segment of a Bacillus thuringiensis crystal protein gene // J. Biol. Chem. — 1985. V. 260. -P. 6273-6280.

217. Schnepf H.E., Wong H.C., Whiteley H.R. The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence // Jour. Biologic. Chem. 1985. - V.260. -№10. - P.6264-6272.

218. Schwartz J.-L., Garneau L., Savaria D., Masson L., Brousseau R., Rousseau E. Lepidopteran-spQcific crystal toxins from Bacillus thuringiensis form cation-and anion-selective channels in planar lipid bilayers // J. Membr. Biol. 1993. -V. 132-P. 53-62.

219. Sebesta K., Horska K., Anova J. Isolation and properties of the insecticidal exotoxin of Bacillus thuringiensis var. galechiae II Collect. Czech. Chem. Commun. 1969 a. - V. 34. - P. 891-900.

220. Slatin S.L., Abrams C.K., English L. Delta-endotoxins form cation-selective channels in planar lipid bilayers // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. -V. 169.-P. 765-772.

221. Smirnoff W.A. Results of tests with Bacillus thuringiensis and chitinase on the entomopathogenic Bacillus cereus group // J. Invertebr. Pathol. 1973. - V. 21.-P. 116-118.

222. Smirnoff W.A., Valero J. Determination of the chitinolytic activity on nine subspecies of Bacillus thuringiensis I I J. Invertebr. Pathol. 1977. - V. 30. - P. 265-266.

223. Smirnoff W.A., Valero J. Metabolic exploration in insects: variations in potassium and calcium levels in insects during various infections // J. Invertebr. Pathol.- 1980.-V. 35.-P. 311-313.

224. Smith N.R., Ellar D J. Mutagenesis of two surface exposed loops of the Bacillus thuringiensis Cry I C delta-endotoxin affects insecticidal specifility // Biochem. J. - 1994 b. - V. 302. - P. 611-616.

225. Smith N.R., Ellar D.J Nucleotide sequence and analysis of an insertion sequence from Bacillus thuringiensis related to I. S I 50 // Plasmid. 1994 a. — V. 32. - P. 10-18.

226. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis II Citta del Vaticano. 1977. -V. 41. - P. 253-268.

227. Somerville H.J., James C.R. Association of the crystalline inclusion of Bacillus thuringiensis with the exosporium // J. Bacteriol. — 1970. — V. 102. — P. 580-583.

228. Somerville H.J., Pockett H.V. An insect toxin from spores of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus II J. Gen. Microbiol. 1975. - V. 87. — P. 359369.

229. Somerville H.J., Tanada Y., Omi E.M. Lethal effect of purified spores and crystalline endotoxin preparations of Bacillus thuringiensis on several lepidoterous insects II J. Invertebr. Pathol. 1970. - V. 16. - P. 241-248.

230. Spencer E.Y. Comparative amino acid composition of the parasporal inclusions of five entomogenous bacteria // J. Invertebr. Pathol. 1968. -V. 10. - P. 444-445.

231. Stahly D.P., Dingman D.W., Irgens R.L., Field C.C., Feiss M.G., Smith G.L. Multiple extrachromosomal deoxyribonucleic acid molecules in Bacillus thuringiensis IIFEMS Microbiol. Lett. 1978 a. - V. 3. - P. 139.

232. Stahly D.P., Dingman D.W., Bulla L.A., Aronson A.T. Possible origin and function of the parasporal crystals in Bacillus thuringiensis II Biochem. Biophys. Res. Communs. 1978 b. - V. 84. - P. 581-588.

233. Steinhaus E.A. Futher observations on Bacillus thuringiensis Berliner and other sporeforming bacteria // Hilgardia. 1954. - V. 23. - P. 1-21.

234. Thomas W.E., Ellar D.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal 5-endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo // J. Cell Sei.-1983.-V. 60.-P. 181-197.

235. Travers R., Faust R., Reichelderfer C.F. Effects of Bacillus thuringiensis var. kurstaki S-endotoxin on isolated lepidopteran mitochondria // J. Invertebr. Pathol. 1976 b. - V. 28. - P. 351-356.

236. Tyrell D.J., Bulla L.A., Andrews R.E., Kramer K.J., Davidson L.I., Nordin P. Comparative biochemictry of entomocidal parasporal crystals of selected Bacillus thuringiensis strains // J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - P. 1052-1062.

237. Vankova I., Kralik O. An electron microscope study of protein crystals in different strains of the Bacillus thuringiensis group // Ztbl. f. Bact. — 1966. — V. 199.-P. 380-386.

238. Vankova I. Bacillus thuringiensis in praktischer Anwendung Intern. Colloq. Insect Pathol // Entomophaga. 1962. - V. 2. - P. 271-291.

239. Van Rie J., Jansens S., Hofte H., Degheele D., Van Mellaert H. Receptors on the brush border membrane of the insect midgut as determinants of the specificity of

240. Bacillus thuringiensis Delta-Endotoxins // Appl. and Enviromental. Microbiol. -1990. V. 56.-№5.-P. 1378-1385.

241. Vidaver A.K. Bacteriocins: the future and reality // Plant Disease. 1983. - V. 67.-№5.-P. 471.

242. Wu S.J., Dean D.H. Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylllA d-endotoxin // J. Mol. Biol. 1996. -V. 255.-P. 628-640.

243. Yamamoto T., McLaughlin R.E. Isolation of a protein from parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var. kurstaki toxic to the mosquito larva, Aedes taeniorhynchus //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. -V. 103.- P. 414-421.

244. Yamamoto T., Garsia J.A., Dulmage H.T. Immunological properties of the entomocidal proteins of Bacillus thuringiensis and its insecticidal activity // J. Invertebr. Pathol. 1983. -V. 41. - P. 122-130.

245. Yousten A.A. Effect of the Bacillus thuringiensis 5-endotoxin on an insect predators wich has consumed intoxicated cabbage loper larvae // J. Invertebr. Pathol. 1973.-V. 21.-P. 312-314.

246. Yousten A.A., Rogoff M.F. Metabolism of Bacillus thuringiensis in relation to spore and crystal formation // J. Bacteriol. 1969. - V. 100. - P. 1229.

247. Zamola B., Karminski-Zamola G., Fuks Z., Kubovric M., Wrisher M. Enhacement of intrinsic antitumor activity of spore endotoxin Bacillus thuringiensis II Photochem. Photobiol. 1985. - V. 41. - P. 361-367.

248. Young J.E., Fitz-Jomes P.C. Chemical and morphological studies of bacterial spore formation. II. Spore and parasporal protein formation in Bacillus cereus var. alesti II J. Biophys. Biochem. Cytol. 1959. - V. 6. - P. 483-498.

Информация о работе

Каменек, Дмитрий Валерьевич
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каменек, Дмитрий Валерьевич

Введение Диссертация по биологии, на тему "Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Каменек, Дмитрий Валерьевич

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каменек, Дмитрий Валерьевич, Казань

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis на перевиваемые культуры клеток
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология