Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Левитин, Евгений Ильич, Москва

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

Левитин Евгений Ильич

Характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. fmitimus

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.Г.Честухина

Специальность - 03.00.03 Молекулярная биология

Москва -1999

Содержание

Введение.................................4

Обзор литературы: Регуляция синтеза дельта-эндотоксинов и формирование энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis.........................7

I Общая характеристика Bacillus thuringiensis..................................7

II Факторы, ответственные за энтомоцидную активность В. thuringiensis................................8

III Структурная организация Cry

белков.........................................10

IV Мобильные генетические элементы Bacillus thuringiensis..................................18

V Регуляция экспрессии cry

генов..........................................21

1. Транскрипционные механизмы регуляции экспрессии cry генов: а) Экспрессия cry генов, зависимая от споруляции.....................................21

б) Экспрессия cry генов, независимая от споруляции..............................24

2. Механизмы посттранскрипционной регуляции экспрессии дельта-эндотоксинов.................26

3. Механизмы посттрансляционной регуляции синтеза дельта-эндотоксинов............................30

4. -Влияние белок-белковых взаимодействий и шаперон-подобных белков на фолдинг дельта-эндотоксинов..31

5. Пространственная организация экспрессии генов дельта-эндотоксинов и механизмы, принимающие участие в

кристаллообразовании............................34

Материалы и методы.......................40

Результаты...............................61

I. Морфологическое исследование штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM и получение сегрегантов, отличающихся расположением кристаллических тел включения....................................61

1) Микроскопическое изучение морфологии штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM.............................................61

2) Получение сегрегантов штамма штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM............................................62

II. Изучение белкового состава кристаллов исходного штамма...............................................64

III. Определение N-концевой аминокислотной последовательности истинных токсинов.................68

IV. Изучение белкового состава кристаллов сегрегантов со свободными и сцепленными кристаллами.................70

V. Исследование генома штамма В-1166 VKPM Bacillus thuringiensis ssp. finitimus при помощи универсальных праймеров

для выявления cry генов...............................74

VI. Конструирование геномного банка и клонирование гена cry26Aal..............................................77

VII. Анализ последовательности клонированного фрагмента и структура геномного локуса гена сгу26Аа...............78

VIII. Определение уникальности геномного окружения гена cry26Aal......................... . ....................84

IX. Экспрессия гена cry26Aal в E.coli...........87

Обсуждение результатов............................87

Выводы..............................................93

Заключение.....................—..................93

БЛАГОДАРНОСТИ.........................................94

Список литературы.............................95

ВВЕДЕНИЕ

Род Bacillus и близкие группы грамположительных бактерий широко распространены в природе. Эти микроорганизмы используются в производстве антибиотиков, ферментов и других биологически активных веществ. Изучение регуляции процессов роста и

споруляции представителей рода Bacillus (в частности Bacillus

]

subtilis) стало основой выявления механизма долговременного переключения системы промоторов, представляющего собой первый детально изученный на молекулярном уровне случай необратимой дифференциации клетки. Некоторые бациллы (такие как Bacillus antracis) могут вызывать инфекционные заболевания человека и животных. Один из видов бацилл, Bacillus thuringiensis, известен -своими энтомоцидными свойствами и широко используется^ для создания биопестицидов с высокой избирательностью в отношении различных видов насекомых.

Среди энтомоцидных факторов, вырабатываемых клетками В.thuringiensis, наиболее важную роль играет группа родственных белков, называемых Cry белками или дельта- эндотоксинами. В ходе споруляции или, как в случае белков CryЗА, в поздней стадии вегетативного роста дельта- эндотоксины формируют видимые в световой микроскоп кристаллические тела включения, расположенные обычно рядом со спорой внутри материнской клетки. После лизиса материнской клетки смесь кристаллических включений и спор ■высвобождается во внешнюю среду.

Кристаллические включения В.thuringiensis, могут составлять ... более 25% от сухого веса спорулирующей клетки В. thuringiensis. Подобный синтез требует участия в нем значительной доли клеточных ресурсов и, тем не менее, споруляция и связанные с ней клеточные процессы проходят параллельно с синтезом дельта-эндотоксинов (Aronson,1993). Высокая продукция Cry- белков является уникальным случаем природной суперэкспрессии. Механизм, обеспечивающий столь высокий уровень устойчивой продукции интересен с точки зрения разработки эффективных систем гетерологической экспрессии.

Несмотря на интенсивное изучение регуляции синтеза дельта-эндотоксинов, механизм формирования кристалла все еще не ясен. Экспрессия cry генов в гетерологичных системах хотя и дает кристаллоподобные тела включения, тем не менее не приводит к образованию столь упорядоченной структуры, как кристаллы, образующиеся в результате экспрессии cry генов в штаммах В.thuringiensis (Baum and Malvar1995). Формирование

энтомоцидных кристаллов у бацилл, не воспроизводит

кристаллизацию белков in vitro, так как на всем протяжении процесса роста кристаллов концентрация находящегося в растворе эндотоксина ничтожно мала (Baum and Malvar1995). В ряде

работ (Sramervilie et al.,1971, Somerville, 1971) показано, что в самом н/ачале своего образования кристалл связан с мембраной экзоспориума, хотя впоследствии утрачивает эту связь и свободно располагается в цитоплазме материнской клетки. Эти и некоторые другие данные позволяют предположить существование структуры, выполняющей роль инициатора образования кристаллов эндотоксинов.

В настоящее время клонировано и секвенировано большое количество cry генов (см.ниже таблицу!.), в результате чего появилась реальная возможность создавать штаммы В.thuringiensis с комбинированными энтомоцидными свойствами. Для создания таких штаммов необходимо обеспечивать эффективную продукцию рекомбинантных белков в спорулирующих клетках В.thuringiensis. Это важная практическая задача,, вызывающая повышенный интерес исследователей к проблемам регуляции синтеза дельта-эндотоксинов В. thuringiensis.

У большинства представителей вида В. thuringiensis белковые •..-кристаллы образуются только с внешней стороны экзоспориальной оболочки и освобождаются в среду при автолизе спорангиев (Aronson and Fitz-James, 1976 ). Тем не менее, существуют подвиды В.thuringiensis, образующие кристаллические включения как снаружи, так и внутри экзоспориума. Кристаллы, сформированные с внутренней стороны экзоспориума, после лизиса материнской клетки остаются связанными со спорой, в то время как кристаллы с обычным местом закладки остаются «свободными». Такой способ закладки кристаллов встречается у В.thuringiensis ssp.

finitimvs, у B.thuringiensis ssp. lewin и у некоторых других (Debro et al.,1986).

В работе Debro et al.1986) указывалось на связь локализации кристаллов внутри экзоспориума с наличием 98-МДа плазмиды. В этой же работе сообщалось о том, что эндотоксины, образующие свободные и связанные кристаллы, обладают уникальными антигенными свойствами, отличаясь при этом друг от друга. Влияние плазмидной ¡локализации' гена на характер распределения токсина в клетке предполагается также в некоторых новых работах (Srinivas et al.,

Целью настоящей работы сравнительная характеристика белкового состава сцепленных (закладывающихся под экзоспориумом) и сво/бодных (образующихся вне экзоспориальных оболочек) кристаллических включений в штамме Bacillus thuringiensis подвида finitimus ВКПМ В-1166, а также характеристика особенностей организации геномного локуса одного из cry генов, изучаемого штамма с точки зрения возможных причин специфики локализации его продукта в клетке.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляция синтеза дельта-эндотоксинов и формирование энтомоцидыых кристаллов Bacillus thuringiensis

I I. Общая характеристика Bacillus thuringiensis

¡

Bacillus thuringiensis характерна для многих природных местообитаний. Штаммы Bacillus thuringiensis были изолированы пыли продуктовых складов, хвои и листьев деревьев, почвы, насекомых, листового опада. В соответствии с каталогом Коллекции

Пастеровского Института (Institut Pasteur) выделяются 63 группы

\

изолятов В. thuringiensis. Среди них различают -55 форм, отличающихся жгутиковыми антигенами (Н-антигенами). Обычно данным группам (биотипам) придается ранг подвида. Имеется также 8 не имеющих жгутиков групп (Schnepf, 1998). Существующие данные не позволяют сделать вывод о предпочтительной экологической нише В.thuringiensis - является ли она в массе энтомопатогенным организмом или же в основном это обитатель поверхности листьев и подстилки (Meadows, 1993). Тем не менее, есть данные, что В.thuringiensis чаще выделяется из трупов насекомых и пыли продуктовых складов, чем из почвы (Bernhard, 1997, Bravo г~ - et al.,1998).

'Размер генома Bacillus thuringiensis составляет от 2.4 до 5.7 миллионов пар нуклеотидов (Lovgren i et al. 1998). Физическая карта построена для двух штаммов Bacillus thuringiensis. Сравнение построенной карты с картами геномов штаммов Bacillus cereus показало сходство в пределах половины хромосомой ДНК, прилегающей к участку ориджина репликации. В области наиболее далеко отстоящей от ориджина наблюдается большая изменчивость физической и генетической карты (Carlson 1996). Большинство

изолятов несут несколько экстрахромосомных элементов, среди которых встречаются как кольцевые, так и линейные. В большинстве случаев белки, образующие параспоральные кристаллические тела

включения, кодируются генами, располагающимися на больших прлазмидах(Carlson, 1996). Последовательности, гибридизующиеся с ДНК-пробами cry генов, встречаются также и на хромосоме, хотя до сих пор неизвестно в какой степени они могут участвовать в контроле синтеза белка, откладывающегося в кристалле (Dodd et al.,1987).

II. Факторы, ответственные за энтомоцидную активность

В. thuringiensis.

Предположительно наиболее типичная экологическая стратегия В.thuringiensis - это размножение в личинках насекомых, погибших или погибающих в результате контакта с токсичными продуктами, продуцируемыми бациллами (Schnepf, 1998). Как правило, В.thuringiensis попадают в кишечник личинки при питании и вызывают перфорацию эпителиальных клеток и общую интоксикацию а также, проникая в гемоцель насекомого, размножается там, вызывая септемию. Для нескольких штаммов B.cereus также показаны энтомопатогенные свойства (Heierson, 1986).

Дельта-эндотоксины - не единственный энтомоцидный агент, найденный у В. thuringiensis. Было показано, что энтомоцидными свойствами могут также обладать фосфолипазы В.thuringiensis (Zhang, 1993), протеазы (Kumar, 1998а, Kumar, 1998b, Lovgren, 1990), хитиназы (Schnepf, 1998), так называемые бета-экзотоксины - низкомолекулярные ингибиторы транскрипции эукариот (Levinson, ■1990) и секретируемые на вегетативной стадии Vip белки (Estruch, -1996) .

До недавнего времени считалось, что способность синтезировать дельта-эндотоксины свойственна только

В.thuringiensis. В настоящее время Cry-белки обнаружены в нескольких других микроорганизмах: Bacillus popiliae (Zhang et al) и Clostridium bifermentum, (Barloy • et al.1997) также характерных своей энтомопатогенностью.

Почти все известные дельта-эндотоксины в спорулирующих клетках В.thuringiensis формируют кристаллические включения, видимые в световой микроскоп..После лизиса спорангиев кристаллы

высвобождаются во внешнюю среду и вместе со спорами могут заглатываться личинками насекомых. В состав кристаллических включений входят предшественники активных белков (протоксины). При попадании в кишечник насекомого происходит растворение кристаллов и процессинг протоксинов протеолитическими ферментами кишечного сока, в результате чего формируется устойчивый к протеолизу «истинный токсин» - активная форма дельта-эндотоксина с молекулярной массой от 55 до 65кДа (Aronson,1995).

Протоксины могут сильно различаться по молекулярной массе, обычно это белки двух типов - 1) с молекулярной массой 60-7ОкДа или 2) с молекулярной массой 130-140кДа. Во втором случае С-концевая половина молекулы не существенна для токсического действия и полностью расщепляется при формировании «истинного токсина», а N-концевая половина соответствует бОкДа варианту протоксина. Предполагается, что С- концевая половина 130кДа белков необходима для правильного формирования кристаллов. Есть данные, что для образования кристаллов из бОкДа протоксинов необходимы шапирон-подобные белки (Crickmore et al., 1992).

Уровень сходства первичных последовательностей дельта-эндотоксинов достаточно высок: две белковых последовательности содержат обычно не менее 30% идентичных аминокислотных остатков. Консервативные положения аминокислотных остатков распределены в Cry- белках неравномерно, формируя Интересно, что действие

секретируемых на вегетативной стадии белков, называемых Vip, по внешним проявлениям сходно с действием белков Cry: Vip белки также вызвают лизис эпителиальных клеток кишечника насекомых и приводят к параличу (Yu, 1997). К настоящему времени клонировано , по крайней мере три ' гена vip: viplA, vip2A и vip3A. Соответствующие им белки не родственны белкам Cry, не образуют кристаллических структур и секретируются на стадии вегетативного роста. Похоже, что генами класса vip3A обладают как B.thuringiensis так и B.cereus (Estruch, 1996).

Из всех разнообразных энтомоцидных агентов B.thuringiensis Cry-белки принято считать наиболее важными агентами из-за высокой степени их токсического действия. Кроме того, синтез дельта-эндотоксинов в клетках бацилл имеет ярко выраженное

внешнее проявление. Морфологический признак - образование энтомоцидных кристаллов при споруляции - послужил поводом для разделения двух видов бактерий - B.thuringiensis и B.cereus. Тем не менее, современные исследования не поддерживают гипотезу о принадлежности B.thuringiensis и .B.cereus к разным видам (Schnepf et al. 1998) Сравнение проводили многими современными •молекулярными методами, включающими гибридизацию хромосомной ДНК,; анализ жирных кислот и фосфолипидов, анализ длины амплифицирующихся фрагментов (Keim, 1997), рестриктный анализ геномной ДНК (Carlson, 1994), сравнение последовательностей 16S рибосомной РНК (Schnepf, 1998).

Таким образом, способность синтезировать параспоральные кристаллические включения является недостаточным критерием для таксономического разграничения. Действительно, было обнаружено, что геномная ДНК некоторых штаммов B.cereus гибридизуется с crylА-специфическими ДНК-зондами (Carlson et al., 1994, Dodd et al.,1987 Prefontaine et al., 1987). Несмотря на то, что современные молекулярные исследования подтверждают гипотезу о принадлежности обоих организмов к одному таксономическому виду (B.cereus sensu lato), в современной научной литературе продолжают использоваться два различных видовых названия, что представляется более удобным для практических целей (Schnepf, 1998),.

B.thuringiensis - не единственный вид бацилл, обладающих энтомопатогенными свойствами: уже сравнительно давно выявлены ■энтомопатогенные свойства B.popiliae и В.sphaericus. (Schnepf, 1998),

III. Структурная организация Cry белков.

Cry белки или дельта- эндотоксины семейство родственных белков, проявляющих токсическое действие на личинках многих насекомых, причем спектр видов насекомых-мишеней для разных Cry белков различен. В настоящее время имеются также сведения о возможной токсичности дельта-эндотоксинов для некоторых других

групп беспозвоночных, а также на культурах клеток млекопитающих (Potvin et al., 1998, Thomas et al., 1983),. Экологическая значимость дельта-эндотоксинов остается недоказанной в прямых экспериментах.

вариабельные и консервативные участки. В настоящее время принято выделять 8 консервативных районов (блоков): 5 в N-концевой «половине» и 3 - в С-концевой (Hofte, 1989, Schnepf, 1998).

Первая предложенная классификация дельта- эндотоксинов практически не учитывала степени сходства аминокислотных последовательностей, основываясь только на различиях в энтомоцидных свойствах Cry белков (Hofte, 1986). По типу специфичности белки Cry разбивались на четыре класса: класс Cryl включал/ токсины, специфичные только для отряда Lepidoptera, CryII 4 Lepidoptera и Díptera, CryIII - только для Coleóptera, CryIV - только для Díptera. В первое время это деление до некоторой степени соответствовало сходству аминокислотных последовательностей. Но с увеличением числа известных дельта-эндотоксинов стало ясно, что близкородственные белки могут иметь сильно отличающиеся спектры насекомых-мишеней, а некоторые новые токсины не укладываются в существующую систему классификации (Bradley, 1995, Schnepf, 1998). В результате старая классификация была пересмотрена и предложена новая система, построенная на анализе аминокислотных последовательностей Сгу-белков (Crickmore 1997).

За основу новой классификации была выбрана методика, •использованная при создании номенклатуры цитохромов Р-450. В соответствии с этой системой белки объединяются в семейства на .. осн