Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti"

0030554Б7

На правах рукописи

Дронина Мария Алексеевна

Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров

Anopheles stephensi и Aedes aegypti

03.00.09 - энтомология; 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва

2007

003055467

Работа выполнена в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» и на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

кандидат химических наук И.А. Залунин

доктор биологических наук, профессор

С.Ю. Чайка

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

С.А. Рославцева

кандидат биологических наук E.H. Элпидина

Ведущая организация:

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Защита состоится 23 апреля 2007 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501 001.20 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. Ломоносова

Автореферат разослан 23 марта 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ' ^ / Л.И. Барсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства нецелевых объектов. В частности, токсины, продуцируемые Bacillus thuringiensis ssp. is-raelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов.

В основе биологического эффекта 5-эндотоксинов В. thuringiensis лежит их цито-патологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, локализованными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия 8-эндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов важны для понимания механизма действия и специфичности энтомоцидных белков, а также выяснения путей возникновения у насекомых-мишеней резистентности к препаратам В. thuringiensis. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов В thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых необыкновенно актуальны.

До настоящего времени основная масса исследований, посвященных решению указанных проблем, была проведена для токсинов, активных против гусениц чешуекрылых (лепидоцидных белков). Москитоцидные токсины, например Сгу4В и CryllA из подвида Bacillus thuringiensis ssp. israelensis изучены значительно меньше.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы было комплексное изучение энтомоцидного действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti (Culicidae; Díptera). Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Ае. aegypti) под действием москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых В thuringiensis ssp. israelensis;

- идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров;

выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов кишечным эпителием личинок An. stephensi.

Научная новизна. В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Сгу4В и CryllA на эпителиальные клетки личинок Ае aegypti; с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi; высказано предположение, что наряду с выделенными ранее в лаборатории химии белка ГосНИИгенетика токсинсвязывающими белками из Ае. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов Bacillus thurmgiensis.

Практическая ценность работы. Полученные данные о действии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов определяют направления дальнейших исследований механизма москитоцидного эффекта и возможные пути возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых.

Апробация работы, публикации. Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на XXVII Межвузовской научно-практической конференции по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященной памяти акад. E.H. Павловского (С.-Пб., 2000).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах, 3 из которых - в изданиях перечня ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Список цитированной литературы содержит 179 названий, из которых 7 - на русском языке.

Благодарности. За содействие в выполнении данной работы выражаю свою искреннюю благодарность: моим научным руководителям И.А. Залунину и С.Ю. Чайке за чуткое научное руководство, дбн Д.П. Жужикову за рецензирование рукописи, всем сотрудникам Лаборатории химии белка ГосНИИгенетика и сотрудникам кафедры энтомологии МГУ, а также сотрудникам Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического факультета за всестороннюю помощь в работе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная струшура и механизм действия (обзор литературы)

Д-эндотоксины В. thurmgiensis широко изучаются с 50-х годов 20-го века, и к настоящему времени накоплена большая научная литература, посвященная особенностям структуры, функции, химических свойств и биологической активности этих белков, клонированы гены большого числа 5-эндотоксинов. В обзоре литературы подробно проанализированы современные данные, касающиеся молекулярной организации Сгу-белков, механизма их действия, взаимодействия структуры и функции в молекулах 8-эндотоксинов. Особое внимание уделено освещению взаимодействия Сгу-белков с рецеп-торными белками из кишечного эпителия гусениц — аминопептцдазам и кадгериннопо-добным белкам. В обзоре приводятся также сведения о наиболее изученных москитоцид-ных токсинах В. thuringiensis. Представленные данные проиллюстрированы рисунками и схемами.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Получение и модификация 5-эндотоксинов В. thuringiensis. Москитоцидные белки Cry4B, CryllA и CytlA выделяли из энтомоцидных кристаллов штамма 2395 (В t. ssp. israelensis) сочетанием методов избирательной экстракции и анионообменной хроматографии на колонке MonoQ в системе FPLC. Эндотоксины Cryl А и СгуЗА получали растворением кристаллов штамма В-9032 ssp. kurstaki и ssp. tenebrioms, соответственно. Чистоту выделенных белков определяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях и двойной иммунодиффузии с использованием специфических антисывороток на выделяемые Сгу-белки.

Для получения фрагментов эндотоксина Сгу4В с молекулярной массой 64, 50 и 4948 кДа исходный белок обрабатывали, соответственно, химотрипсином, трипсином, или кишечным соком личинок Ае. aegypti. Полученные гидролизаты далее в тексте обозначаются: Cry4B-tox, Cry4B-tr и Сгу4В-Аа.

Протеолиз эндотоксина Cryl 1А с образованием фрагментов 33 и 36 кДа (этот гид-ролизат далее обозначается Cryl lA-tr) и эндотоксинов CiylA с образованием фрагментов Cryl A-tox (65 кДа) проводили трипсином.

Биотшшлирование белков осуществляли N-сукцинимидным эфиром биотина.

2.2. Определение биологической активности. Биологическое тестирование было выполнено на личинках Ае aegypti второго возраста Для проведения биотестов с эндотоксинами Cryl 1А и Сгу4В последние осаждали из растворов с известной концентрацией, добавляя лимонную кислоту до рН 4,5. Насекомых помещали по 10 особей в контейнеры, содержащие суспензию кристаллов В t ssp. israelensis (в диапазоне концентраций 0,19 - 12 нг/мл) или эндотоксинов Cry 11А (1 - 250 нг/мл), либо Сгу4В (0,25 - 60 нг/мл) в цитрат-ном буфере. В качестве контроля использовали цитратный буфер. Каждый опыт проводили в 4 вариантах. Погибших насекомых подсчитывали через 24 часа.

По данным этих опытов для последующих экспериментов были выбраны концентрации токсинов, вызывавших как низкий, так и высокий уровень смертности личинок.

2.3. Методика электронно-микроскопического исследования. Изучение влияния кристаллов эндотоксина, а также эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В на ультраструктуру кишечника проводили на личинках второго возраста комаров Ае. aegypti

После инкубации личинок с отобранными концентрациями токсинов в течение указанных интервалов времени их последовательно фиксировали 2,5%-ным раствором глутарового альдегида и 1%-ным раствором четырехоксида осмия, затем контрастировали уранилацетатом и заливали в смесь смол ЭПОН. Ультратонкие срезы окрашивали по методу Рейнольдса и исследовали в трансмиссионном электронном микроскопе JEM-100В.

2.4. Проведение иммуноцитохимических и цитохимических исследований. Для

выявления мест связывания москитоцидных токсинов с кишечным эпителием чувствительного насекомого использовали гистологические срезы средней кишки личинок второго возраста комара Ае. aegypti. Для этого отпрепарированные кишечники фиксировали в растворе Буэна, заливали их в парафин и готовили срезы толщиной 6 мкм, которые помещали на предметные стекла. Для проведения реакции срезы депарафиниро-вали в ксилоле и проводили гистохимическое исследование.

В случае иммуногистохимической реакции срезы кишечника насекомого последовательно инкубировали с токсинами (30 мкг/мл), раствором антител, специфических к соответствующему токсину, конъюгатом вторичных антител с одним из ферментов -пероксидазой или щелочной фосфатазой и хромогенными субстратами указанных ферментов. При этом окрашенные продукты энзиматической реакции откладывались рядом с местом нахождения комплекса рецептор - токсин - антитела к токсину -конъюгат и позволяли увидеть под микроскопом те участки клетки, в которых локализованы молекулы рецептора.

Для гистохимической реакции срезы последовательно инкубировали с биотинили-рованными токсинами и коньюгатом стрептавидина с пероксидазой или щелочной фос-фатазой. Дальнейшую обработку срезов проводили по предыдущей схеме. После завершения процедуры окрашивания препараты обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Изучение препаратов проводили в световом микроскопе МБИ-3. Фотографирование осуществляли с помощью цифровой фотокамеры Olimpus 3030, соединенной с компьютером

2.5. Получение препаратов апикальных мембран (brush border membranes, ВВМ) кишечного эпителия личинок An. stephensi. ВВМ получали из гомогената средней кишки личинок третьего возраста An. stephensi комбинацией методов осаждения хлористым магнием и дифференциального центрифугирования В ходе проведенного выделения апикальные мембраны были очищены в 6 раз, что было показано по возрастанию удельной активности маркерного фермента - лейцинаминопептидазы. Белковый состав полученных экстрактов определяли с помощью электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия.

2.6. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков An. stephensi.

Аффинные сорбенты CryllA- и Сгу4В-сефароза синтезировали с использованием сефаро-зы 4В, активированной бромцианом Мембранные белки экстрагировали, обрабатывая ВВМ 1%-ным раствором детергента NONIDET Р40 в карбонатном буфере, pH 9,5 в присутствии коктейля ингибиторов протеиназ, и наносили на колонку с CryllA- или Сгу4В-сефарозой. Фракции, элюнрованные с помощью 1,0 М NaCl, хранили при температуре -80 'С.

2.7. Лиганд-блоттинг. В экспериментах по лиганд-блотгингу фракции, полученные в ходе аффинной хроматографии, подвергали электрофорезу по методу Лэммли с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. Для предотвращения неспецифического связывания нитроцеллюлозные реплики инкубировали с PBS буфером, содержащим 1 % яичный альбумин и 0,3 % твин, а затем последовательно обрабатывали одним из биотинилированных белков (8 или 4 мкг/мл) и коньюгатом стрептавидина и пе-роксидазы («Amersham Biosciences»), взятым в разведении 1:1000 Проявление полос, обладающих способностью связывать биотинилированные токсины, осуществляли с помощью ECL-Western blotting analysis system («Amersham Biosciences).

2.8. Изучение связывания 65 и 57 кДа белков An. stephensi с токсинами В. Лиг-ingiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москито-цидных белков CryllA и Сгу4В. Нитроцеллюлозные реплики обрабатывали вышеописанным методом, используя в качестве предполагаемых лигандов следующие биотинюш-

рованные токсины. CryllA (4 мкг/мл), Cry4B-tox (4 мкг/мл), CytA (8 мкг/мл), CrylA-tox (8 мкг /мл) и Cry ЗА (8 мкг/мл), а также продукты их ограниченного протеолиза: Cry 1 lA-tr (4 мкг суммарного белка на 1 мл), Cry4B-tr (4 мкг/мл), Сгу4В-Аа (4 мкг суммарного белка на 1 мл).

2.9. Эксперименты по гомологической в гетерологической конкуренции. Нит-роцеллюлозные фильтры с перенесенными на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотинилированным вариантом одного из изучаемых москитоцидных токсинов (Cry 11А или Cry4B-tox) (4 мкг/мл) непосредственно или в смеси с 10-кратным избытком небио-тинилированного варианта того же белка (гомологическая конкуренция) или предполагаемого конкурента (соответственно, Cry4B-tox или Cry IIA) (гетерологическая конкуренция). Дальнейшую обработку фильтров проводили, как описано выше.

2.10. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков Нитроцеллю-лозные фильтры с содержавшимися на них 65 и 57 кДа белками инкубировали с биотини-лированными Cry4B-tox (4 мкг/мл), как описано ранее, отмывали пятью сменами буфера инкубации, а затем обрабатывали в течение часа 10-кратныи избытком небиотинилиро-ванного варианта того же токсина

2.11. Определение N-концевой аминокислотной последовательности. 5 мл фракции, элюированной с помощью 1 М NaCl с сорбента Сгу4В-сефароза, сконцентрировали в 200 раз посредством ультрафильтрации и осаждения трихлоруксусной кислотой и подвергли электрофорезу в присутствии додецилсульфата натрия и электропереносу на мембрану Immobilon-PS(' N-концевую аминокислотную последовательность для полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам, определяли с помощью автоматического газофазного секвенатора «Applied Biosystems», США, модель 470А

Поиск последовательностей, ортологичных установленным экспериментально, осуществляли с помощью программы BLAST Search for short, nearly exact matches, используя базу данных NCBI GenBank

2.12. Определение активности щелочной фосфатазы. По 2 мкл следующих препаратов: (а) экстракт белков ВВМ, полученный, как описано выше и разведенный в 100 раз 0,05 М натрий-карбонатным буфером, pH 9,5; (б) фракция, элюированная 1 М NaCl с сорбента Сгу4В-сефароза, сконцентрированная в 10 раз с помощью ультрафильтрации; (в) 0,02 %-ный БСА, были нанесены в виде дотов на нитроцеллюлозный фильтр Фильтр тщательно отмыли вышеупомянутым буфером и инкубировали с субстратами фосфатаз-ной реакции (NBT/BCIP, «Promega», США). При такой постановке эксперимента о наличии в образце активности щелочной фосфатазы должно свидетельствовать появление сиреневой окраски в соответствующем доте.

Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов В. thuringiensis ssp. israelensis, а также индивидуальных эндотоксинов CryllA и Сгу4В на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti

Наиболее ранние изменения кишечного эпителия при воздействии кристаллов В t ssp. israelensis происходят в апикальной части клеток. Если в контроле (рис. 1, 2) поверхность клеток покрыта микроворсинками, внутри которых обнаруживаются тонкие продольно ориентированные филаменты, а с наружным слоем клеточной мембраны связан гликокаликс, то уже через 20 мин инкубации микроворсинки утолщаются и укорачиваются, а целостность эпителиального слоя нарушается. При последующей инкубации эти процессы усугубляются: во многих местах можно наблюдать разрывы между соседними клетками (рис. 3), а также деградацию микроворсинок и утрату ими гликока-ликса (рис. 3,4).

Похожие изменения происходят при воздействии отдельных токсинов. Уже через 15 минут инкубации с CryllA в концентрации 100 нг/мл, микроворсинки укорачиваются и утолщаются, их мембрана лишается гликокаликса (рис 5) При действии эндотоксина Сгу4В микроворсинки также укорачиваются, и их размещение становится беспорядочным, а через 3 часа большая их часть достаточно сильно редуцирована (рис 6, 7). В то же время, в отличие от действия кристаллов не наблюдается полной потери микроворсинок, а также разрывов между клетками

В норме у личинок комаров вблизи от апикальной поверхности эпителиальных клеток расположена перитрофическая оболочка. Как видно на рисунке 8, она состоит из нескольких слоев, различающихся электронной плотностью. При воздействии отдельных токсинов расстояние между перитрофической оболочкой и эпителием увеличивается, но ее внутренняя структура практически остается без изменений (рис. 5, 6) Однако при воздействии кристаллов электронная плотность перитрофической оболочки уменьшается, и ее структура разрушается (рис. 9).

Нормальный вид цитоплазмы эпителиальных клеток и их органелл представлен на рисунках 10 и 11. При обработке кристаллами в цитоплазме клеток средней кишки наблюдаются следующие изменения: цитоплазма клеток достаточно быстро подвергается значительной дезинтеграции. В митохондриях происходит расширение крист, образуются пустоты (рис. 12) Меняется структура эндоплазматического ретикулума и лизосом (рис. 13). Сходные изменения происходят после инкубации личинок с отдельными белками. Среди митохондрий много вздутых, с разной степенью редукции крист: от незначительной до почти полной (рис. 14-16).

11 12 13

Рис. 1-25. Ультраструктурные [вменения, происходящие и кишечном эпителии личинок комара /к. aegypti под действием энтомоцидных кристаллов Д thuringiemis ssp is гае tens й- и индивидуальных токсинов Cry 4 В и Ciy! (А. В подписи к каждому рисунку указаны действующий препарат, концентрация белка и время инкубации с ним. Рис 1-7. Апикальный от лея столбчатой клетки эпителия. 1,2- норма; 3 - кристаллы, I нгЛ(& 2,5 ч.; 4 - кристаллы 0,2 иг/мл, Зч.;5-СгуПА, I ООнг/мл. 15 м ин.; б - Cry 4В, 10 Ш'/м л, Зч.; 7-Cry 4В, 10 hi mji, 3 ч. Рис. 8, 9. Псригрофическая оболочка 8- норма; 9- кристаллы, 3 иг/мл, 20 мин. Рис 10-17. Цитоплазм? околоядерной области клетки и клеточные органе ллы. 10,11- норма; 12- кристаллы, 1 Нг&л, 2.5 ч; 13 - кристаллы, 0,2 игАгл, 3 ч.;

14- Сгу1'; А, 25нг/мл. Зч ; 15- Сгу ПА, 100нг/мл, Зч.; 1б-Сгу 4В, 40 нг/мл, Зч.; 17- Сгу 4 В, 40нг/мл, 55мин. Рис. 18- 25. Базальная область эпителия. 18,19- норма; 20- СгуПА, 100иг/мл, Зч.; 21 - Сгу 413 40 иг/мл, Зч. Рис. 22,23. Мышцы, окружающие среднюю кишку. 22- норма; 23- кристаллы, 0.2 нг/мл, 3 ч. Рис. 24,25. Ре1 операционные клетки. 24- кристаллы, 1 нг/мл. 2,5 ч., 2:- Сгу 4В, Юнг/мл, !ч Увеличения: рнс. I, 10, 12, 14, 16 - х20 000; рис. 2- *60 000; рис. 3, 5, 15, 18, 21- хЮООО; рис 4, 13- хЗО 000; рис. 6, 17, 24, 25-\8000; рис. 7, 8- хЮО ООО; рис. 9- N40 ООО; рис. П, 19, 20, 23- ч!5 ООО; рис. 22- \25 ООО. Обозначения: МВ - микроворсинки, ПО - перигрофическая оболочка, М - митохондрия, Л - лизосома, В - вакуоль, 51 - ядро, БЛ - базаяьный лабиринт, МП - Мышцы, Р - регене-рационная клетка.

В околоядерной зоне обнаруживаются удлиненные крупные вакуоли (рис. 14). Образование достаточно крупных вакуолей можно наблюдать в клетках эпителия уже через 15 минут (рис. 17). В цитоплазме встречаются большие тела, похожие на сильно деградировавшие лизосомы.

Для базальной части эпителиальных клеток личинок комаров характерно наличие ба-зального лабиринта, в цитоплазматических тяжах которого содержатся митохондрии (рис. 18,19). При воздействии как кристаллов B.t ssp. israelertsis, так и индивидуальных токсинов, в этом районе клетки также можно видеть сильную вакуолизацию цитоплазмы и деградацию митохондрий, хотя базальный лабиринт сохраняет свое ячеистое строение (рис. 20, 21).

При воздействии кристаллов мышцы, окружающие среднюю кишку (в норме показаны на рис. 22), теряют свою правильную структуру, в мышечных тканях появляются разрывы (рис. 23). Регенерационные клетки, расположенные в основании эпителиального пласта средней кишки, после обработки кристаллами отслаиваются от соседних клеток и сжимаются (рис. 24). После инкубации с отдельными белками, регенерационные клетки сохраняют нормальный вид и строение (рис. 25).

Подводя итог, можно сказать, что действие индивидуальных токсинов сходно с действием кристаллов по своим проявлениям, а также тем, что они оказывают значительный эффект уже в первые минуты экспозиции. Но при длительной экспозиции, в отличие от кристаллов, отдельные токсины не вызывают таких глубоких патологических изменений, какие наблюдаются при действии кристаллов за сходный период времени. Возможно, это связано как с синергическим эффектом действия токсинов, так и с тем, что в составе кристаллов присутствует ещё и белок Cytl А, в данном исследовании не изучавшийся.

Следует заметить, что, поскольку используемые концентрации сравниваемых препаратов близки по уровню своей биологической активности, уровень патологических изменений, вызываемых отдельными токсинами, достаточен для гибели насекомых.

Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина CryllA и активированного токсина Сгу4В с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара Aedes aegypti

Как было показано выше, одной из основных мишеней москитоцидных белков Сгу4В и Ciyl 1А являются микроворсинки столбчатого эпителия средней кишки личинок комаров. Мы попытались доказать, что эти токсины связываются с апикальной мембраной кишечного эпителия насекомого. Одним из способов выявления структур пищеварительного тракта насекомого, обладающих аффишюстью по отношению к токсинам, является

инкубация гистологических срезов кишечника с этими белками и визуализация связавшегося токсина с помощью гистохимических и иммуногистохимических реакций. При этом эндотоксин Сгу4В (130 кДа), являющийся протоксином, предварительно подвергали про-теолизу с образованием активированного токсина (Cry4B-tox) (65 кДа). В экспериментах, описанных в предыдущей главе, этого делать не требовалось, поскольку аналогичная активация происходит в кишечнике личинки. Эндотоксин CryllA (70 кДа) в активации не нуждается.

В результате проведенных экспериментов мы показали, что эндотоксин CryllA и активированный токсин Cry4B (Cry4B-tox) связываются с апикальной мембраной столбчатых клеток кишечного эпителия (рис. 26, 28, 29, 30). Причём это связывание визуализировалось в ходе как гистохимической (рис. 26), так и иммуногистохимической (рис. 28, 29, 30) реакций. Под большим увеличением хорошо видно (рис. 29), что токсины откладываются по всей длине микроворсинок. Окраска щеточной каймы клеток при изучении обоих москитоцидных белков была очень интенсивной.

Для доказательства специфичности связывания, мы проинкубировали срезы с активированным токсином CrylAb, не эффективным против личинок А е. aegypti. При обоих методах постановки гистохимической реакции окрашивания щёточной каёмки не наблюдалось (рис. 27, 31). Однако при аналогичной постановке опыта происходит связывание активированного токсина CrylAb со срезами кишечника Lymantria dispar (Lepidoptera), насекомого, чувствительного к этому белку. Полученные результаты позволяют предположить, что рецепторы москитоцидных белков экспонированы в апикальной мембране столбчатых клеток эпителия, и их расположение по всей прослеженной длине средней кишки довольно равномерное.

Второй структурой, хорошо прокрашиваемой в наших экспериментах (при инкубации как с CryllA, так и с Cry4B-tox), является перитрофическая оболочка(рис 26,28). Интенсивность окраски перитрофической оболочки не зависела от того, на каком расстоянии от эпителия она располагалась - тесно примыкала или находилась на некотором от него удалении (рис. 28). Связывание перитрофической оболочки с токсинами CryllA и Cry4B-tox тоже специфическое. Оно отсутствует у токсина CrylAb.

Наши данные свидетельствуют о том, что ни внутриклеточные структуры, ни ба-зальные и латеральные мембраны эпителиальных клеток, ни мышечные клетки не связывают токсинов, и, по-видимому, лишены рецепторов связывания.

« s т .с

1 *

Рис. 25—-i I. Визуализация Mecí a связывания CryllA и Сгу4В токсинов с эпителием средней кишки личинок комара/íe. aegypti гистохимическими и имmyiюшстохимичсскими методами Стрелки указывают место связывания токсина Увеличение Х400. Рис 26, 27 Гистохимический метод. Срезы последовательно обработаны биотиыилированными токсинами; коиьюгатом cipei танидииа с перойетшзой или щелочной фосфатазой и хромогеннымя субстратами соответствующей энзиматической реакции- 13 подписи к каждому рисунку указаны токсин, с которым инкубировали срез и коньюгат, используемый для визуализации связавшегося токсина. 26 - биотиншшровакный Cry 11 А. фосфатазный коньюгат. 27 - биоти нилир овал ный CrylAb, пероксидазный коньюгат (контроль). Рис. 28-31. Иммуногистохимичеекий метод. Срезы последовательно обработаны токсинами, специфическими антителами к токсинам, коиъюгатом вторичных антител с пероксидазой или щелочной фосфататой и хромогенными субстратами соответствующей энзиматической реакции. 28, 29 - CryllA , фосфатазный коньюгат. 30 - Сгу4В, фосфатазный коньюгат 31 -Ср. 1АЬ, фосфатазный коньюгат (контроль).

Глава 5. Выделение токсинсвязывающих белков (рецепторов) из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi

В настоящее время достаточно хорошо описаны рецепторы эцдотоксинов класса Ciyl из кишечного эпителия гусениц К ним относятся аминопепгидазы N и кадгеринпо-добные белки. Однако очень мало известно о рецгпгорах москигоцвдных белков в мембранах кишечного эпителия двукрылых (Diptera) Недавно в нашей лаборатории были выделены токсинсвязывающие белки из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Ае. aegypti. Нашей задачей было выделение белков, ответственных за связывание токсинов CiyllA и Ciy4B с мембранами кишечного эпителия личинок комаров An. Stephens i

Нами был получен препарат апикальных мембран кишечного эпителия (ВВМ) личинок An. stephensi Экстракт, полученный при обработке этих мембран детергентом NON1DETP40, судя по данным электрофореза, содержал более сорока белков с молекулярной массой от 27 до 100 кДа (рис. 32)

В то же время, если перенести эти полосы на нитроцеллюлозную пленку и проинкубировать с биотинилированным и токсинами CiyllA и Cry4B-tox (лигапд-блоттшг), то с помощью биотин-стрепгавидиновой системы проявляются главным образом полоса с молекулярной массой около 65 кДа и менее выраженная полоса с массой 57 кДа. На треках можно также видеть минорные компоненты с меньшей молекулярной массой (рис. 33). Указанные полосы отсутствуют в контроле, в котором реплики обрабатывали биотинилированным бычьим сывороточным альбумином. Полученные данные позволяют предположить, что полосы 65 кДа и, возможно, 57 кДа соответствуют токсинсвязывающим белкам из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара An. stephensi.

Для выделения токсинсвязывающих белков мы синтезировали сорбенты Сгу4В- и Ciyl 1А-сефароза. При их использовании для хроматографии белков ВВМ An. stephensi большая часть последних не связывалась с сорбентами и выходила в проскоке (рис 34, а) В то же время 1М NaCl в обоих случаях элюировал два белка с молекулярной массой 65 и 57 кДа, реагирующих с биотинилированным токсином CiyllA в условиях лиганд-блоттинга (рис 34, б) Способность связываться с токсинами, «пришитыми» к аффинным сорбентам, подтверждает наше предположение о том, что 65 и 57 кДа белки могут служить рецгпгорамимоскигоцидных токсинов у личинок An stephensi

Рис, 32. Белковый состав экстракта, полученного при обработке ВВМ Ап stephensi доде-цнлсульфатом натр,;я. На 10% подиакриламидныв гель нанесен экстракт (]), в лунку (2) помещены стандарты молекулярной массы. Рис. 33. Идентификация то кс и i ¡связывающего белка из ВВМ Ап. stephensi с помощью лиганд-блотгинга. Белки, экстрагированные из ВВМ Ап. stephensi, 5tuui подвергнуты электрофорезу в денатурирующих условиях и Электропереносу Полученные нитроцеллюлозные реплики инкубировали с бнотинилирован-нмми белками: (a) C'ry4B-tox; (б) Сгу 11А, (в) бычий сывороточный альбумин

Рецепторы токсинов, выделенные из различных видов насекомых, как правило, не связываются с Сгу-белками, к которым данное насекомое устойчиво. Поэтому изучение специфичности связывания является важным этапом в доказательстве участия данного токсин связывают е о белка в выполнении рецепторной функции in vivo.

2 4 5 Рис. 34. Электрофоре! ический анализ

кДа | ^ кДа фракций, полученных в ходе аффинной

хроматографии белков ВВМ Ап. stephensi.

^^ | " ' ^ - 65 Электрофорезу подвергли следующие

образцы: экстракт мембранных белков

^" (Я (дорожка 2}; белки, не связавшиеся с

36

Сгу4В-сефарозой (дорожка 3); фракции, 29 - рм элюиро ванные I М N301 с Сгу 11А-

, сефзрозы (дорожка 4) или с Сгу4В-

34 еефарозы (дорожка 5), Дорожка 1 содержит

стандарты молеку; ярной массы. Гели проявляли с помощью Кумаееи К.-250 (а), или методом лиганд-блотгинга с использованием в качестве л и ганда биотинилпрованного эндотоксина Сгу] 1Л (б).

В условиях лигацд-блоттинга белки, элгаируемые как с СтуПА-, гак и с Сгу4В-сефарозы, одинаково реагируют и е Сгу4ЕНох и с эндотоксином Сгу] 1А (рис, 35, 36). В то же время, они практически не взаимодействуют с биотинилированными Сгу1А-1ох, обладающими лепидоцидпон активностью, и СгуЗА, действующим на личинок жуков, используемыми в два раза большей концентрации (в случае СгуЗА это иллюстрируется рис. 35). Эндотоксин Су11А также не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками из Ли. $&ркеп11. Этому токси |у свойственна высокая мосыггоцидная активность, однако известно, что при осуществлении своего токсического эффекта он не нуждается во взаимодействии с рецептором. Все эти результаты доказывают высокую специфичность, проявляемую 65 и 57 кДа белками из Ап. Шркет! при взаимодействии с токсинами В. ¡киг-

С помощью лиганд-блоттинга мы изучили некоторые особенности взаимодействия москитоцидных токсинов: Сгу4В-1ох и Сгу 11А с выделенными мембранными белками. В частности, если низроцеллюлозные реплики, содержащие белки, элюируемые с СгуПА-или с Сгу4В-сефарозы, проинкубировать с биотииилированным Сгу4В-1ох, а затем с избытком небиотинилированного вариа!гга этого же токсина, то используемая система детекции не выявляет полос, соответствующих 65 и 57 кДа белкам, Это говорит об обратимости связывания Сгу4В-1сх с изучаемыми мембранными белками.

а 6 в г д е

Рис. 35. Связывание 65 и 57 кДа белков из ВВМ Лп, МерЬегг,г/ с различными эндотоксинами В. и продуктами их ограниченного нротеолиза. Нитроцеллюлозные реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюироваиные с Сгу4В-сефнрозы, инкубировали со следующими биитинилироваппыми белками; Сгу4РНох (а); СгуЗА (б); Сту4В-(г (в); Сгу4В-Аа (г); Сгу11А (.>); Сгу11А-1Г (е).

J 2

1 г

1 2

1 2

v ■

Г 1

Рис. 36 - Гомологическая и гетерологическая конкуренция и обратимость, выявляемые при изучении связывания Сгу4В-и>х с 65 и 57 кДа бачками из В ИМ Ап. ¡¡ерИетг Нитроцеллюлоз! гые реплики, содержавшие 65 и 57 кДа белки, элюированные с Сгу4В- сефаро-ЗЫ Ч) и с СгуПА- сефзрозы (2), инкубировали со следующими эндотоксинами или их смесями: (а) биотинииированным Сгу4В-1ох (4 мкг/мл); (б) смесью б иоти н илирован ного Сгу4В-1ох (4 мкг/мл) и небиотипилированно го Сгу4В-1ох (40 мкг/мл); (в) смесью биотини-лированного Сгу4В 1ох (4 мкг/мл) и неб иоти пил и ров а] того Сгу11А (40 мкг/мл). В случае (г) после обработки нитроцеллюлозного фильтра б нотиг ¡ял про сапным Сгу4В-1ох (4 мкг/мл) следовала его инкубация с десятикратным избытком небиотянилированного варианта этого же токсина.

Полосы 65 и 57 кДа не проявляются в условиях гомологической конкуренции, когда нитроцеллюлозные реплики инкубировали со смесью биоцшилированного CryllA или Cry4B-tox и 10-кратного избытка небиогинилированного варианта соответствующего токсина (для Cry4B -Юх это иллюстрируется на рис. 36), Полученные результаты говорят о том, что способность к связыванию с 65 и 57 кДа-белками не является следствием биоти-килирования моек и гоцидны х токсинов.

В условиях гстсрологической конкуренции, когда реплики обрабатывают смесью биотинилированною Cry4B-tox или Cry 11А и 10-кратного избытка нсбиотинилированно-го гетерологического белка (Cry НА или Cry4B-tox, соответственно) проявления полос также не наблюдается (для первого варианта показано на рис. 36). Это со всей очевидностью показывает, что Cry 11А и Cry4B-tox взаимодействуют с одними и теми же белками в мембранах этого насекомого. Более того, они либо связываются с одними и теми же сайтами на новерхност и этих белков, либо сайты связывания расположены близко друг к другу.

Ранее было показано, что ход ограниченного протеолиза эндотоксина Сгу4В зависит от специфичности используемого нротеолитического фермента Под действием хн-

мотрипсина образуется активированный токсин с молекулярной массой 64 кДа (Сгу4В-tox), с которым проводились вышеописанные эксперименты по связыванию. Однако при обработке рядом других протеолитических ферментов активированный токсин гидролизу-ется до фрагмента с молекулярной массой 50 кДа (обработка трипсином) (Cry4B-tr), или до смеси 48 и 49 кДа-фрагментов (обработка кишечным соком Ае. aegypti) (Сгу4В-Аа). В первом случае от него отщепляются пять а-спиралей N-концевого домена, тогда как во втором случае дополнительно к этому небольшую деградацию претерпевает С-конец третьего домена. По данным лиганд-блотгинга Cry4B-tr взаимодействует с 65 и 57 кДа белками столь же хорошо, как и Cry4B-tox (рис. 35). В то же время Сгу4В-Аа не обладает способностью связываться с 65 и 57 кДа белками (рис. 35). Это коррелирует с литератур-,ными данными по биологической активности, согласно которым Cry4B-tr обладает такой же токсичностью для личинок комаров, как и Cry4B-tox, но Сгу4В-Аа практически не токсичен. Можно предположить, что резкое уменьшение токсичности в последнем случае связано с потерей способности соответствующих фрагментов связываться с рецепторами.

В свою очередь, ограниченный протеолиз эндотоксина Cryl 1А до двух фрагментов с молекулярной массой 33 и 36 кДа не уменьшает его токсичность по отношению к личинкам Ае. aegypti, An stephensi и Culexpipiens (литературные данные) и не отражается на способности к связыванию с мембранными белками An. stephensi (рис. 35). Фракция, элюированная с колонки Сгу4В-сефароза 1 М NaCl, была сконцентрирована в 200 раз и нанесена на 10%-ный ПААГ. Из нитроцелшолозной реплики, полученной в ходе последующего электрофореза и электропереноса, были вырезаны полосы, соответствующие белкам с молекулярной массой 65 и 57 кДа и белковый материал, содержащийся в этих полосах, проанализирован автоматическим методом Эдмана.

Для компонента с молекулярной массой 65 кДа прочитать N-концевую последовательность не удалось. По всей видимости, концевая аминогруппа этого белка была модифицирована. Но для компонента с молекулярной массой 57 кДа была получена следующая последовательность: Ser-Leu-His-Gln-His-Ile-Phe-Ser-Asp-Leu.

Эта последовательность уникальна. Поиск её среди белковых последовательностей, содержащихся в NCBI GenBank, дал отрицательные результаты. В настоящее время установлен и опубликован полный геном Anopheles gambiae — вида, родственного An. stephensi. В составе соответствующего протеома мы также не нашли белковой последовательности, полностью совпадающей с последовательностью, установленной нами, однако там имеется рамка считывания, кодирующая первые шесть остатков прочитанного дека-пептида (Ser-Leu-His-Gln-His-Ile), но функции этого белка неизвестны.

Ранее в литературе было высказано предположение о возможной роли щелочной фосфатазы в связывании токсина Сгу1Ас с кишечником гусеницы НеПо1Ыа уггеясею. Мы исследовали возможность наличия фосфатазной активности у выделенных нами 65 и 57 кДа белков. В условиях дот-анализа в экстракте мембранных белков из кишечника личинок Ап з/ерйе/ш" выявляется высокая активность щелочной фосфатазы. Концентрат фракции, элюированной 1 М №С1 с колонки содержащей Сгу11 А-сефарозу, также демонстрирует активность щелочной фосфатазы. Интенсивность выявляемого сигнала не высока, но достоверна. Использованный в качестве отрицательного контроля бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,2 мг/мл в условиях дот-анализа никакого образования окраски не демонстрирует. В геноме Ап gamЫae имеются гены нескольких белков, предположительно обладающих активностью щелочной фосфатазы. Нам не удалось обнаружить какого-либо сходства между И-концевым фрагментом 57 кДа-белка и этими последовательностям. Однако активность щелочной фосфатазы может быть связана с 65 кДа-белком, Ы-концевую последовательность которого установить не удалось.

Сравнение полученных нами данных о токсинсвязывающих белках Ап. ¡¡ерИетг со свойствами ранее выделенных в нашей лаборатории токсинсвязывающих белков Ае. ае-рурй показывает их близость по большинству параметров. Это позволяет предположить, что выявленные нами токсинсвязывающие белки из двух видов комаров, Ап. «Герйеген' и Ае aegypti, родственны, хотя, возможно, и не идентичны и представляют собой новый класс (классы) рецепторов энтомоцидных белков.

Заключение

В данной работе мы провели комплексное изучение воздействия москитоцидных токсинов Сгу4В и Сгу11 А, продуцируемых В. Лигтрепя 'к Бяр. кгаектгя, на кишечный эпителий личинок комаров. Гистологические исследования продемонстрировали серьёзные изменения, происходящие под действием москитоцидных белков в эпителиальных клетках и перитрофической оболочке личинок комаров в средней кишке. Эти изменения включают деградацию микроворсинок, вакуолизацию цитоплазмы и разрушение клеточных органелл, и, в общем, близки тем, что показаны для гусениц, обработанных лепидо-цидными токсинами В. 1кигт£1ет1я. Гистохимические эксперименты показали, что, как и в случае лепидоцидных токсинов, эндотоксин Сгу11А и Сгу4В-Юх связываются с микроворсинками кишечного эпителия средней кишки чувствительного насекомого. Используя метод аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах Сгу11 А- и Сгу4В-сефароза, мы выделили белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные обратимо и специфично связывать указанные токсины. По всем изученным характеристикам эти бел-

ки близки 65 и 62 кДа токсинсвязывающим белкам, выделенным ранее в нашей лаборатории из апикальных мембран кишечного эпителия личинок А е. aegypti. В то же время, по молекулярной массе и энзиматической активности, указанные токсинсвязывающие белки существенно отличаются от белков, выполняющих аналогичную функцию у гусениц (аминопептидазы N и кадгериноподобные белки). Тот факт, что связывание москитоцид-ных и лепидоцидных токсинов В. thuringiensis с разными рецепторными белками приводит к однотипным гистопатологическим изменениям эпителия у личинок комаров и у гусениц чешуекрылых, обусловлено особенностями Cry-белков. Общая принципиальная схема организации вторичной и третичной структуры белков сочетается у них с существенными различиями первичной структуры в тех районах молекулы, которые ответственны за связывание с рецептором или внутримолекулярные перестройки. Именно такая стратегия позволяет токсинам В. thuringiensis приспособиться к физиологическим и биохимическим особенностям, характерным для различных видов насекомых.

ВЫВОДЫ

1. С помощью электронной микроскопии показано, что под действием москито-цидных белков Bacillus thuringiensis ssp. israelensis в средней кишке личинок комара Aedes aegypti происходят ультраструктурные изменения клеток столбчатого эпителия, включающие дезинтеграцию цитоплазмы, образование удлинённых лакун, деградацию клеточных органелл и разрушение микроворсинок. Перитрофическая оболочка смещается в полость средней кишки. В ультраструктуре клеток эпителия передней и задней кишки каких-либо изменений не отмечено.

2. Сравнение влияния энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Сгу4В и Cryl 1А показывает, что эффект всех трёх препаратов однотипен, хотя наиболее сильные разрушения происходят под действием кристаллов.

3. С помощью цитохимических методов установлено, что специфическое связывание эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Cry4B (Cry4B-tox) с тканями личинок комара Aedes aegypti происходит только в области микроворсинок эпителия средней кишки и перитрофической оболочки.

4. Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles ste-phensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные специфически связываться с эндотоксином Cryl 1А и Cry4B-tox в условиях лиганд-блоттинга, причем оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание.

5. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов CryllA и Сгу4В к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBIGenBank.

6. По большинству изученных свойств 65 и 57 кДа белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegypti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов дельта-эндотоксинов.

Список публикаций по теме диссертации

Дронина М.А., Чайка С.Ю., Ревина Л.П., Костина Л.И., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Визуализация связывания эндотоксинов Сгу4В и CryllA Bacillus thuringiensis с кишечным эпителием личинок Aedes aegypti Н Биотехнология. 2002. № 3. С. 8084.

Залунин И.А., Чайка С.Ю., Дронина М.А., Ревина Л.П. Цитопатологическое влияние эндотоксинов Bacillus thuringiensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti II Паразитология. 2002. Т. 36. Вып. 5. С. 337-344. Дронина М.А., Ревина Л.П., Костина Л.И., Ганушкина Л.А., Залунин И.А., Честухина Г.Г. Токсинсвязывающие белки из мембран кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 2. С. 173-181. Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis var. israelensis на ультраструктуру кишечника личинок комаров Aedes aegypti // XXVII Межвузовская научно-практическая конференция по проблемам биологии и медицинской паразитологии, посвященная памяти акад. Е.Н. Павловского / Материалы конференции. С.-Пб., 2000. С. 24-25. Чайка С.Ю., Залунин И.А., Дронина М.А. Цитопатологическое влияние кристаллов эндотоксина Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечник личинок комаров Aedes aegypti II Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России. Великий Новгород, 2000. С. 29-33. Чайка С.Ю., Дронина М.А., Залунин И.А., Ревина Л.П., Костина Л.И. Использование гистохимических методов для визуализации места связывания эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1A Bacillus thuringiensis с кишечным эпителием личинок Aedes aegypti II Экология, биоразнообразие и значение кровососущих насекомых и клещей экосистем России: Сборник научных работ по материалам II Республиканской научной конференции 27-29 мая 2002 г. Великий Новгород: НовГУ, 2002. С. 5861.

Подписано в печать 16.03.2007 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 650 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дронина, Мария Алексеевна

Введение.

Глава 1. Cry-белки Bacillus thuringiensis: молекулярная структура и механизм действия (обзор литературы).

1.1. Молекулярная организация Cry-белков.

1.1.1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура.

1.1.2. Пространствнная организация молекулы

Cry-белков.

1.1.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков.

1.2. Механизм действия Cry-белков.

1.2.1. Специфичность инсектицидной активности.

1.2.2. Общая схема патогенеза.

1.2.3. Ещё раз об активации протоксинов.

1.2.4. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых.

1.2.5. Токсины В. thuringiensis способны образовывать поры или ионные каналы в искусственных и плазматических мембранах.

1.2.6. Факторы, вызывающие гибель насекомых.

1.3. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Cry-белков.

1.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых.

1.4.1. Кадгериноподобный рецептор Cryl-белков.

1.4.2. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков.

1.4.3. Элементы структуры Cry-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором.

1.4.4. Доказательства участия кадгериноподобных рецепторов в токсическом эффекте Cry-белков in vivo.

1.4.5. Токсин-связывающие свойства аминопептидазы N.

1.4.6. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N.

1.4.7. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Cry-белков.

1.4.8. Другие кандидаты на роль рецептора

Cry-белков.

1.5. Москитоцидные токсины В. thuringiensis.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Выделение дельта-эндотоксинов.

2.2. Определение концентрации белка.

2.3. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков.

2.4. Выращивание личинок комаров.

2.5. Определение биологической активности.

2.6. Методика электронно-микроскопического исследования.

2.7. Приготовление гистологических препаратов для иммуноцитохимических и цитохимических исследований.

2.8. Биотинилирование энтомоцидных белков.

2.9. Проведение гистохимической реакции.

2.10. Проведение иммуногистохимической реакции.

2.11. Получение препаратов апикальных мембран

ВВМ) кишечного эпителия личинок Anopheles stephensi.

2.12. Синтез аффинных сорбентов.

2.13. Изучение белкового состава экстрактов мембранных белков, полученных с помощью различных детергентов.

2.14. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Ли. stephensi.

2.15. Электрофорез.

2.16. Лиганд-блоттинг.

2.17. Изучение связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков

An. stephensi с токсинами В. thuringiensis разной специфичности и продуктами ограниченного протеолиза москитоцидных белков CryllA и Сгу4В.

2.18. Эксперименты по гомологической и гетерологической конкуренции.

2.19. Изучение обратимости связывания москитоцидных белков.

2.20. Определение N-концевой аминокислотной последовательности.

2.21. Определение активности щелочной фосфатазы.

Глава 3. Влияние энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на кишечный эпителий личинок комаров Aedes aegypti.

3.1. Цели и объекты исследования.

3.2. Определение диапазона эффективных концентраций кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А.

3.3. Влияние кристаллов эндотоксина на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti.

3.4. Влияние индивидуальных токсинов на ультраструктуру кишечного эпителия личинок комара A. aegypti.Ill

Глава 4. Гистохимическое изучение связывания эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В с эпителиальными клетками средней кишки личинок комара A. aegypti.

4.1. Схема эксперимента.

4.2. Визуализация связывания москитоцидных белков с кишечным эпителием личинок A. aegypti.

Глава 5. Выделение токсин-связывающих белков из мембран кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.1. Белковый состав ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.2. Использование лиганд-блоттинга для обнаружения токсин-связывающего белка в экстракте ВВМ An. stephensi.

5.3. Аффинная хроматография белков ВВМ кишечного эпителия личинок An. stephensi.

5.4. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ

An. stephensi с токсинами Bacillus thuringiensis, обладающими различной специфичностью энтомоцидного эффекта.

5.5. Обратимость связывания 65 кДа- и 57 кДа-белков из ВВМ An. stephensi с Cry4B-tox.

5.6. Гомологическая и гетерологическая конкуренция при взаимодействии эндотоксина Cryl 1А и Cry4B-tox с 65 кДа- и 57 кДа-белками.

5.7. Взаимодействие 65 кДа- и 57 кДа-белков с продуктами ограниченного протеолиза эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А.

5.8. Определение N-концевой последовательности 57 кДа-белка из ВВМ An. stephensi.

5.9. Определение фосфатазной активности в элюате, содержащем 65 кДа- и 57 кДа-белки из ВВМЛи. stephensi.

5.10. Растворимая форма 65 кДа- и 57 кДа-белков из

ВВМ An. stephensi.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Воздействие эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti"

Актуальность проблемы.

Одними из самых перспективных биоинсектицидов являются препараты, полученные на основе микроорганизма Bacillus thuringiensis. Для различных подвидов В. thuringiensis характерно образование инсектицидных белков (8-эндотоксинов), отличающихся высокой специфичностью биологического эффекта. Как правило, эти токсины активны против личинок насекомых из отрядов Lepidoptera, Coleoptera и Diptera, а также нематод. В то же время, они абсолютно безвредны для большинства видов животных и человека. В частности, токсины, продуцируемые ssp. israelensis, убивают личинок многих видов комаров и мошек, но безвредны для всей остальной фауны водоёмов.

В основе биологического эффекта 8-эндотоксинов В. thuringiensis лежит их цитопатологическое действие на эпителиальные клетки кишечника насекомых. В свою очередь, специфичность этих белков определяется их взаимодействием с рецепторами, экспонированными в апикальной мембране эпителиальных клеток. Изучение воздействия 8-эндотоксинов на кишечный эпителий, поиск и характеристика соответствующих рецепторов необыкновенно важны для понимания механизма действия и специфичности энтомо-цидных белков, основ патогенного эффекта В. thuringiensis.

Идентификация рецепторов эндотоксинов важна также для понимания путей возникновения резистентности у насекомых - мишеней, поскольку часто этот эффект связан именно с ухудшением связывания энтомоцидных белков со стенкой кишечника. Вследствие этого работы по изучению взаимодействия эндотоксинов В. thuringiensis с кишечным эпителием чувствительных насекомых по- прежнему необыкновенно актуальны. Цели и задачи исследования.

Целью работы было изучение энтомоцидного действия эндотоксинов

Bacillus thuringiensis ssp. israelensis на кишечный эпителий личинок комаров Anopheles stephensi и Aedes aegypti.

Для ее достижения были определены следующие задачи:

- изучение цитопатологических изменений, происходящих в эпителиальных клетках личинок комаров (на примере личинок Aedes aegypti) под действием москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых Bacillus thuringiensis ssp. israelensis;

- идентификация сайтов связывания токсинов со стенкой кишечника личинок комаров;

- выделение специфического рецептора (ов), ответственного за связывание токсинов кишечным эпителием личинок Anopheles stephensi.

Научная новизна.

В работе впервые: всесторонне изучено воздействие эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на эпителиальные клетки личинок Ае. aegypti, с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов визуализировано место связывания этих белков с кишечным эпителием насекомого; выделены 65 и 57 кДа токсинсвязывающие белки из апикальных мембран эпителиальных клеток личинок An. stephensi', высказано предположение, что наряду с выделенными ранее токсинсвязывающими белками из Ае. aegypti, эти два белка образуют не описанный ранее класс рецепторов эндотоксинов В. thuringiensis.

Практическая ценность работы.

Полученные данные о воздействии москитоцидных токсинов на кишечный эпителий личинок комаров и о природе рецепторов этих токсинов указывают точки приложения для дальнейших исследований механизма мос-китоцидного эффекта и возможных путей возникновения резистентных линий комаров. В свою очередь, эти исследования позволят в дальнейшем создать биоинсектициды нового поколения с существенно повышенной эффективностью биологического эффекта и уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм насекомых. Апробация работы, публикации.

Основные положения диссертации представлены на конференции «Роль кровососущих насекомых и клещей в лесных экосистемах России» (Великий Новгород, 2000), II Республиканской научной конференции (Великий Новгород: НовГУ, 2002), на XXVII Межвузовской н.-практ. конфер. по проблемам биологии и мед. паразитологии, посвященной памяти акад. Е.Н.Павловского (С.-Пб, 2000).

Материалы диссертации опубликованы в 6 научных работах: 4 статьях и 2 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 198 страницах машинописного текста, содержит 136 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, 5 - ти глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Последний содержит 179 названий, из которых 7 - на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Дронина, Мария Алексеевна

выводы

1. С помощью электронной микроскопии показано, что под действием москитоцидных белков Bacillus thuringiensis ssp. israelensis в средней кишке личинок комара Aedes aegypti происходят ультраструктурные изменения клеток столбчатого эпителия, включающие дезинтеграцию цитоплазмы, образование удлинённых лакун, деградацию клеточных органелл и разрушение микроворсинок. Перитрофическая оболочка смещается в полость средней кишки. В ультраструктуре клеток эпителия передней и задней кишки каких-либо изменений не отмечено.

2. Сравнение влияния энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp. israelensis и индивидуальных токсинов Сгу4В и Cryl 1А показывает, что эффект всех трёх препаратов однотипен, хотя наиболее сильные разрушения происходят под действием кристаллов.

3. С помощью цитохимических методов установлено, что специфическое связывание эндотоксина Cryl 1А и активированного токсина Сгу4В (Cry4B-tox) с тканями личинок комара Aedes aegypti происходит только в области микроворсинок эпителия средней кишки и перитрофической оболочки.

4. Из апикальных мембран кишечного эпителия личинок комара Anopheles stephensi методом аффинной хроматографии выделены белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные специфически связываться с эндотоксином Cryl 1А и Cry4B-tox в условиях лиганд-блоттинга, причём оба Cry-белка конкурируют друг с другом за это связывание.

5. Способность продуктов ограниченного протеолиза эндотоксинов Cryl 1А и Сгу4В к связыванию с 65 и 57 кДа белками коррелирует с их активностью для личинок комаров. N-концевая аминокислотная последовательность 57 кДа белка уникальна и отсутствует в NCBI GenBank.

6. По большинству изученных свойств 65 и 57 к Да белки сходны с токсинсвязывающими белками Aedes aegypti и, возможно, образуют вместе с ними новый класс (классы) рецепторов дельта-эндотоксинов.

Заключение

Суммируя полученные данные можно сказать, что как место приложения действия эндотоксинов Сгу4В и Cryl 1А на ткани кишечника личинок комаров, так и основные нарушения ультраструктуры эпителиальных клеток, происходящие в результате этого воздействия, похожи и мало отличаются от тех, которые наблюдаются при действии токсинов В. thuringiensis на представителей других отрядов насекомых. В то же время, белки, связывающие токсины Сгу4В и Cryl 1А на апикальной мембране эпителиальных клеток, существенно отличаются от описанных рецепторов Cry-белков из кишечника гусениц.

В данной работе мы провели комплексное исследование воздействия москитоцидных токсинов Сгу4В и Cryl 1 А, продуцируемых подвидом israel-ensis ВТ, на кишечный эпителий личинок комаров. Были изучены гистопа-тологические изменения эпителия личинок A. aegypti, наступающие после проглатывания насекомым токсинов. Связывание этих белков с клетками эпителия было прослежено с помощью гистохимических и иммуногистохи-мических методов. Наконец, из апикальных мембран эпителиальных клеток An. stephensi был выделен токсинсвязывающий белок, по нашему предположению являющийся рецептором токсинов Сгу4В и Cryl 1 А.

Проведённые исследования продемонстрировали серьёзные изменения, происходящие под действием москитоцидных белков в эпителиальных клетках и перитрофической мембране личинок комаров в средней кишке. Эти изменения, в общем, близки тем, что показаны для гусениц, обработанных ле-пидоцидными токсинами В. thuringiensis, и включают деградацию микроворсинок, вакуолизацию цитоплазмы и разрушение клеточных органелл. В то же время в клетках передней и задней кишки никаких изменений не зафиксировано.

Было показано, что эндотоксин Cryl 1А и активированный токсин Сгу4В связываются с микроворсинками кишечного эпителия средней кишки.

Используя метод аффинной хроматографии на синтезированных нами сорбентах CiyllA- и Сгу4В-сефароза, мы выделили белки с молекулярной массой 65 и 57 кДа, способные обратимо и специфично связывать указанные токсины. По всем изученным характеристикам эти белки близки 65- и 62 кДа токсинсвязывающим белкам, выделенным ранее в нашей лаборатории из апикальных мембран кишечного эпителия личинок A. aegypti. В то же время, по молекулярной массе и энзиматической активности, указанные токсинсвя-зывающие белки существенно отличаются от белков, выполняющих аналогичную функцию у гусениц. По всей видимости, мы обнаружили новый класс мембранных белков насекомых, способных связывать токсины В. thuringiensis.

Тот факт, что связывание москитоцидных и лепидоцидных токсинов В. thuringiensis с разными рецепторными белками приводит к однотипным гис-топатологическим изменениям эпителия у личинок комаров и у гусениц, обусловлено описанными нами (см. «Обзор литературы») особенностями Ciy-белков: общая принципиальная схема организации вторичной и третичной структуры сочетается у них с существенными различиями первичной структуры в тех районах молекулы, которые ответственны за связывание с рецептором, или внутримолекулярные перестройки. Именно такая стратегия позволяет токсинам В. thuringiensis приспособиться к физиологическим и биохимическим особенностям, характерным для различных видов насекомых.

Интересно, что москитоцидный белок CytlA, также продуцируемый В. thuringiensis ssp. israelensis, не связывается с выделенными нами 65 и 57 кДа белками. По всей видимости, наличие разных молекулярных сайтов связывания Ciy4B и Ciyl 1А с одной стороны, и CytlA - с другой у одного и того же насекомого важно, как для объяснения синергизма, продемонстрированного для действия москитоцидный белков подвида israelensis на личинок комаров, так и для предотвращения возникновения устойчивости к В. thuringiensis у этих насекомых.

Полученные данные о взаимодействии токсинов В. thuringiensis ssp. israelensis с кишечным эпителием личинок комаров имеют громадное значение как для понимания механизма действия этих белков, так и для создания новых биоинсектицидов, обладающих высокой эффективностью и более широкой видовой специфичностью.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дронина, Мария Алексеевна, Москва

1. Жужиков, Д.П. Изучение перитрофической оболочки некоторых двукрылых в поляризованном свете // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол., почв. 1966. №1. С. 37-41.

2. Жужиков Д. П. Строение перитрофической оболочки двукрылых // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол., почв. 1963. №1. С. 24-35.

3. Кригер И.В., Ревина Л.П., Костина Л.И., Буздин А.А., Залунин И.А., Честу-хина Г.Г., Степанов В.М. // Биохимия, 1999. Т. 64. С.1377-1384.

4. Кузнецова Л.А. Кутикулярная выстилка кардиального отдела кишечника личинок Chironomus plumosus L. и Aedes aegypti L. (Diptera: Chi-ronomidae, Culicidae) и ее связь с перитрофической оболочкой // Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол. 1979. №. С. 9-13.

5. Роскин Г.И., Левинсон Л.Б. Микроскопическая техника. М., 1957.

6. Честухина Г.Г., Костина Л.И-, Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха С.П., Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. // Биохимия, 1977. Т. 42. С. 1660-1667.

7. Agrawal, N., Malhotra, P., and Bhatnagar, R.K. Interaction of gene-cloned and insect cell-expressed aminopeptidase N of Spodoptera litura with insecticidal crystal protein Cry 1С // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 45834592.

8. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo II FEMS Microb. Lett. 1992. Vol. 94. P. 63-68.

9. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. Effects on toxicity of eliminating a cleavage site in a predicted interhelical loop in Bacillus thuringiensis CrylVB 8-endotoxin//FEMS Microb. Lett. 1993. Vol. 111. P. 255-262.

10. Angus, Т.A. A bacterial toxin paralysing silkworm larvae // Nature, 1954. Vol. 173. P. 545-546.

11. Angus, T.A. Extraction, purification and properties of Bacillus sotto toxin // Can. J. Microbiol. 1956a. Vol. 2. P. 416-426.

12. Angus, T.A. Association of toxicity with protein-crystalline inclusions of Bacillus sotto Ishiwata I I Can. J. Microbiol. 1956b. Vol. 2. P. 122-131.

13. Aronson, A.I., and Shai, Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action // FEMS Microbiol.1.tters, 2001. Vol. 195. P. 1-8.

14. Banks, D.J., Hua, G., and Adang, J. Cloning of a Heliothis virescens 110 kDa aminopeptidase N and expression in Drosophila S2 cells // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 499-508.

15. Barbehenn, R.V. Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species // J. Chem. Ecol. 2003. Vol. 29. P. 683-702.

16. Barton, K.A., Whiteley, H.R., and Yang, N.-S. Bacillus thuringiensis 8-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteraninsects // Plant Physiol. 1987. Vol. 85. P. 1103-1109.

17. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 348. P. 3.

18. Borovsky, D., and Meola, S.M. Biochemical and cytoimmunological evidence for the control of Aedes aegypti larval trypsin with Aea-TMOF // Arch. Insect Biochem. Physiol. 2004. Vol. 55. P. 124-139.

19. Bravo, A. Phylogenetic relationships of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin family proteins and their functional domains // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179 P. 27932801.

20. Bradford, M.M.//Analyt. Biochem. 1976. Vol.72. P. 248-254.

21. Bottjer, K.P., Bone, L.W., and Gill, S.S. Nematoda: susceptibility of the egg to Bacillus thuringiensis toxins // Exp. Parasitol. 1985. Vol. 60. P. 239-244.

22. Bravo A., Jansens S., Peferoen M. Immunocytochemical localization of Bacillus thuringiensis insecticidal proteins in intoxicated insects // J. Invertebr. Pathol. Vol. 60. P. 237-246.

23. BtToxin Specificity Database: http://www.glfc.cfs.nrcan.gc.ca

24. Candas, M., Francis,. B.R., Griko, N.B., Midboe, E.G., and Bulla, L.A. Proteolytic cleavage of the developmentally important cadherin BT-Ri in the midgut epithelium of Manduca sexta II Biochermistiy, 2002. Vol. 41. P. 13717-13724.

25. Carroll, J., Li, J., and Ellar, D.J. Proteolytic processing of a coleopteran-specific 5-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var tenebrionis // Biochem. J. 1989. Vol. 261. P. 99-105.

26. Charles, J.F., and de Barjac, H. pH variations in the midgut of Aedes aegypti in relation to Bacillus thuringiensis var. israelensis (serotype HI4) crystal intoxication// Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales, 1981. Vol. 74. P. 91-95.

27. Choma C.T., Surewicz W.K., Carey P.R., Pozsgay M., Raynor Т., Kaplan H. Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillus thuringiensis structural implications // Eur. J, Biochem. 1990. Vol. 189. P. 523-527.

28. Chungjatupornchai, W.P., Hoefte, H., Seurinck, J., Angsuthanasombat, C., and Vaeck, M. Common features of Bacillus thuringiensis toxins specific for Dip-tera and Lepidoptera//Eur. J. Biochem. 1988. Vol. 173. P. 9-16.

29. Clark T.M., Koch A., Moffett D.F. The anterior and posterior 'stomach' regions of larval Aedes aegypti midgat // J. Exp. Biol. 1999. Vol. 202. N 3. P. 247-252.

30. Clements A.N. The physiology of mosquitoes // Oxford a.o., Pergamon Press, 1963.

31. Cooper, M.A., Carroll, J., Travis, E.R., Williams, D.H., and Ellar, D.J. Bacillus thuringiensis Cryl Ac toxin interaction with Manduca sexta aminopeptidase N in a model membrane environment // Biochem. J. 1998. Vol. 333. P. 677-683.index.html

32. Crickmore, Full list of delta-endotoxins //http://www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/

33. Crickmore, N., Zeigler, D.R., Feitelson, J., Schnepf, E., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Dean, D.H. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. P. 807-813.

34. Dadd R.H. Alkalinity within the midgut of mosquito larvae with alkaline-aktive digestive enzymes // J. Insect Physiol. 1975. Vol. 21. N 11. P. 1847-1853.

35. Derbyshire, D.J., Ellar, D.J., and Li, J. Crystalization of the Bacillus thuringiensis toxin Cryl Ac and its complex with the receptor ligand N-acetyl-D-galactosamine // Acta Crystallog. 2001 sect. D. Vol. 57. P. 1938-1944.

36. Detra R.L., Romoser W.S. Permeability of Aedes aegypti larval peritrophic membrane to proteolytic enzyme // Mosquito News. 1979. Vol. 39. N 3. P. 582585.

37. English, L.H., Readdy, T.R., and Bastian, A.E. Delta-endotoxin phospholipid vesicles is catalysed by reconstituted midgut membrane // Insect Biochem. 1991. Vol. 21. P. 177-184.

38. Endo Y., Nishiitsutsuji-Uwo J. Mode of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin: histopathological changes in the silkworm midgut // J. Invertebr. Pathol. 1980. Vol. 36. N1. P. 90-103.

39. Fernandez L.E., Aimanova K.G., Gill S.S., Bravo A., Soberon M. A GPI- anchored alkaline phosphatase is a functional midgut receptor of Cry llAa toxin in Aedes aegypti larvae // Biochem J. 2006. Vol. 394. P. 77-84.

40. Fitz-James, P.C., Toumanoff, C., and Yong, I.E. Localization of a toxicity for silkworm larvae in the parasporal inclusion of Bacillus cereus var. alesti II Can. J. Microbiol. 1958. Vol. 4. P. 385- 192.

41. Gazit, E., and Shai, Y. Structural and functional characterization of the a5 segment of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin // Biochemistry, 1993. Vol. 32. P. 3429-3436.

42. Gill, S.S., Cowles, E.A., and Francis, V. Identification, isolation, and cloning of a Bacillus thuringiensis CrylAc toxin-binding protein from the midgut of the lepidopteran insect Heliothis virescens II J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 27277-27282.

43. Gomez, I., Oltean, D.I., Gill, S.S., Bravo, A., and Soberon, M.

44. Mapping the epitope in cadherin-like receptors involved in Bacillus thuringiensis

45. Cryl A toxin interaction using phage display // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 31. P. 28906-28912.

46. Gonzalez, J.M., Jr., Dulmage, H.T., and Carlton, B.C. Carlton, B.C. Correlation between specific plasmids and 5-endotoxin production in Bacillus thuringiensis // Plasmid, 1981. Vol. 5. P. 351-365.

47. Griffitts, J.S., Haslam, S.M., Yang, Т., Garczynski, S.F., Mulloy, ., Morris, H., Cremer, P.S., Dell, A., Adang, M.J., and Aroian, R.V. Glycolipids as receptors for Bacillus thuringiensis crystal toxin // Science, 2005. Vol. 307. P. 922925.

48. Grochulski, P., Masson, L., Borisova, S., Pusztai-Carey, M., Schwartz, J.-L., Brousseau, R., Cygler, M. Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin -crystal structure and channel formation // J. Mol. Biol. 1995. Vol. 254. P. 447-464.

49. Haider, M.Z., and Ellar, D.J. Functional mapping of an entomocidal delta-endotoxin. Single amino acid changes produced by site-directed mutagenesis influence toxicity and specificity of the protein // J. Mol. Biol. 1989. Vol. 208. P. 183-194.

50. Hannay, C.L. Crystalline inclusions in aerobic spore forming // Nature, 1953. Vol. 172. P. 1004.

51. Hannay, C.L., and Fitz-James, P.I. The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner // Can. J. Microbiol. 1955. Vol. 1. P. 694-710.

52. Ho Beng G., Khoo H.G.N., Chew L.-M., Wong K.P., Ewert A. Food ingestion and digestive enzymes in larval Aedes aegypti and Ae. albopictus (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol. 1992. Vol. 29. N 6. P. 960-964.

53. Hodgman, T.C. & Ellar, DJ. Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis 8-endotoxins determined by compilation analysis //

54. DNA Seq. 1990. Vol. 1. P. 97-106.

55. Hoefte, H., Whiteley, H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus

56. Thuringiensis II Microbiol. Rev. 1989. Vol. 53. P. 242-255.

57. Hofmann, C., Liithy, P. Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to vertebrate cells // Arch. Microbiol. 1986. Vol. 146. P. 7-11.

58. Hua, G., Tsukamoto, K., Rasilo, M.L., and Ikezawa, H. Molecular cloning of a GPI-anchored aminopeptidase N from Bombyx mori midgut: a putative receptor for Bacillus thuringiensis CrylA toxin // Gene, 1998. Vol. 214. P. 177185.

59. Hua, G., Jurat-Fuentes, J.L., and Adang, M.J. Bt-Rla extracellular cadherinrepeat 12 mediates Bacillus thuringiensis CrylAb binding and cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 28051-28056.

60. Jenkins, J.L., Lee, M.K., Sangadala, S., Adang, M.J., and Dean, D.H. Binding of Bacillus thuringiensis CryiAc toxin to Manduca sexta aminopeptidase-N receptor is not directly related to toxicity // FEBS Lett. 1999. Vol. 462. P. 373376.

61. Jenkins, J.L., Lee, M.K., Valaitis, A.P., Curtiss, A., and Dean, D.H. Bivalent sequential binding model of a Bacillus thuringiensis toxin to gypsi moth amin-opeptidase N receptor // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 14423-14431.

62. Jenkins, J.L., and Dean, D.H. Binding specificity of Bacillus thuringiensis CrylAa for purified, native Bombyx mori aminopeptidase N and cadherin-like receptors // BMC Biochem. 2001. Vol. 2. P. 12.

63. Johnson, D.E. Cellular toxicities and membrane binding characteristics of insecti-cidal crystal proteins from Bacillus thuringiensis toward cultured insect cells //J. Invertebrate Pathol. 1994. Vol. 63. P. 123-129.

64. Jurat-Fuentes, J.L. and Adang, M.J. Characterization of a Cryl Ac-receptor alkaline phosphatase in susceptible and resistant Heliothis virescens larvae // Eur. J. Biochem. 2004. Vol. 271. P. 3127-3125.

65. Knight, P.J., Crickmore, N., and Ellar, D.J. The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase N // Mol. Microbiol. 1994. Vol. 11. P. 429436.

66. Knight, P.J.K., Knowles, B.H., and Ellar, D. J. Molecular cloning of an insect aminopeptidase N that serves as a receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 17765-17770.

67. Knowles, B.H., and Ellar, D.J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins with different insect specificity // Biochim. Biophys. Acta, 1987. Vol. 924. P. 509-518.

68. Krieg, A., Schnetter, W., Huger, A.M., and Langenbruch, G.A. Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis strain В1 256-82: a third pathotype within the H-serotype 8a8b // System. Appl. Microbiol. 1987. Vol. 9. P. 138-141.

69. Krywienczyk, J., and Angus, T.A. A serological comparison of the parasporal bodies of three insect pathogenes // J. Insect Pathol. 1960. Vol. 2. P. 411-417.

70. Kumar, A.S.M., and Aronson, A.I. Analysis of mutations in the pore-forming region essential for insecticidal activity of a Bacillusthuringiensis 5-endotoxin // J. Bacteriol. 1999. Vol. 181. P. 6103-6107.

71. Kunz P.A. Resolution and properties of the proreinases in the larva of the mosquito Aedes aegypti II Insect Biochem. 1978. Vol. 8. N 1. P. 43-51.

72. Masson, L., Mazza, A., Sandagala, S., Adang, M.J., and Brousseau, R. Polydisper-sity of Bacillus thuringiensis Cryl toxins in solution and its effect on receptor binding kinetics // Biochim. Biophys. Acta. 2002. Vol. 1594. P. 266-275.

73. Masson, L., Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Brousseau, R., and Schwartz, J.L. Helix 4 of the Bacillus thuringiensis CrylAa toxin lines the lumen of the ion channel //J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 31996-32000.

74. Masson, L., Lu, Y.J., Mazza, A., Brousseau, R, and Adang, M.J. The CrylA(c) receptor purified from Manduca sexta displays multiple specificities // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 20309-20315.

75. McNall, R.J., and Adang, M.J. Identification of novel Bacillus thuringiensis Cryl Ac binding proteins in Manduca sexta midgut through proteomic analysis // Insect Biochem. Mol. Biol. 2003. Vol. 33. P. 999-1010.

76. Morse, R.J., Yamamoto, Т., and Stroud, R.M. Structure of Cry2Aa suggests an unexpected receptor binding epitope // Structure, 2001. Vol. 9. P. 409-417.

77. Nagamatsu, Y., Toda, S., Yamaguchi, F., Ogo, M., Kogure, M., Nakamura, M.,

78. Shibata, Y., and Katsumoto, T. Identification of Bombyx mori midgut receptor for Bacillus thuringiensis insecticidal CrylA(a) toxin // Bio-sci.Biotechnol.Biochem. 1998. Vol. 62. P. 718-726.

79. Nagamatsu, Y., Itai, Y., Hatanaka, G., Funatsu,G., Hayashi K. A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis II Agric. Biol. Chem. 1984. Vol. 48. P. 611-619.

80. Nicholls, C.N., Ahmad, W., and Ellar, D.J. Evidence for two different types of insecticidal P2 toxins with dual specificity in Bacillus thuringiensis subspecies //J. Bacterriol. 1989. Vol.-171. P. 5141-5147.

81. Nicolas L., Lecroisey A., Charles J.-F. Role of the gut proteinases from mosquito larvae in the mechanism of action the specificity of the Bacillus sphaeri-cus toxin 11 Can. J. Microbiol. 1990. Vol. 36. N 11. P. 804-807.

82. Percy J., Fast P.G. Bacillus thuringiensis crystal toxin: ultrastructural studies of its effect on silkworm midgut cells // J. Invertebr. Pathol. 1982. Vol. 40. P/ 90103.

83. Peters W. The fine structure of peritrophic membranes of mosquito and blackfly larvae of the genera Aedes, Anopheles, Culex, and Odagmia (Diptera: Culicidae/Simuliidae) //Entomol. Gen. 1979. Vol. 5. N 4. P. 289-299.

84. Peyronnet, O., Vachon, V., Brousseau, R., Baines, D., Schwartz, J.L. and Laprade, R. Effect of Bacillus thuringiensis toxins on the membrane potential of lepi-dopteran insect midgut cells // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 1679-1684.

85. Rajamohan, F., Hussain, S.R., Cotrill, J.A., Gould, F., and Dean, D.H.

86. Report of the WHO Informal Consultation on the evaluation and testing of insecticides // WHO, Geneva, 1996. P. 38-40.

87. Richards A.G., Richards P.A. Origin and composition of the peritrophic membrane of the mosquito, Aedes aegypti II J. Insect Physiol. 1971. Vol. 17. N 11. P. 2253-2275.

88. Schnepf, H.E., and Whiteley, H.R. Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981. Vol. 78. P. 2893-2897.

89. Schnepf, H.E., Wong, H.C., and Whiteley, H.R. The amino acid sequence of a crystal protein from Bacillus thuringiensis deduced from the DNA base sequence // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 6264-6272.

90. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R., Dean, D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. Vol. 62. P. 775-806.

91. Singh G.J.P., Gill S.S. An electron microscope study of the toxic action of Bacillus sphaericus in Culex quiquefasciatus larvae // J. Invertebr. Pathol. 1988. Vol. 52. N. 2. P. 237-247.

92. Singh, G.J.P., and Gill, S.S. Myotoxic and neurotoxic activity of Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal toxin // Pest. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 26. P. 406-414.

93. Singh,G.J.,Schouest, L.P.Jr, Giil, S.S. Action of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis delta-endotoxin on the ultrastructure of the house fly larva neuromuscular system in vitro // J Invertebr Pathol. 1986. Vol. 47. N. 2. P. 155-66.

94. Smith, G.P., and Ellar, D.J. Mutagenesis of two surface exposed loops of the Bacillus thuringiensis Cry 1С 5-endotoxin affects insecticidal specificity // Biochem J. 1994. Vol.302. P. 611-616.

95. Spiro-Kern A., Chen P.S. Uber die Proteasen der Steckmucke Culexpipiens //Rev. SuisseZool. 1972. Vol. 79. P. 1151-1159.

96. Sur В., Bihari V. Microbial control of mosguitoes // Everyman's Sci., 1997. Vol. 32. N3. P. 105-108.

97. Thomas, W.E., and Ellar, D.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal a- endotoxin: effects on insect and mammalian cells in vitro and in vivo II J. Cell Sci. 1983. Vol. 60. P. 181-197.

98. Valdamudi, R.K., Ji, Т.Н., and Bulla, L.A.,Jr. A specific binding protein from Manduca sexta for the insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis subspecies berlinerll J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 12334-12340.

99. Valdamudi, R.K., Weber, E., Ji, I., Ji, Т.Н., and Bulla, L.A.,Jr. Cloning and expression of a receptor for an insecticidal toxin of Bacillus thuringiensis // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 5490-5499.

100. Volkmann A., Peters W. Investigation on the midgut caeca of mosquito larvae. I.

101. Wolfersberger, M.G. V-ATPase-energized epithelia and biological insect control //

102. Wolfersberger, M.G. Enzymology of plasma membranes of insect intestinal cells // Am. Zool. 1984. Vol. 24. P. 187-197.

103. Wu, D., and Aronson, A.I. (1992) Localized mutagenesis defines regions of the Bacillus thuringiensis 8-endotoxin involved in toxicity and specificity. J. Biol. Chem. 267: 2311-2317.

104. Wu,, S.-J., and Dean, D.H. (1996). Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylllA 8-endotoxin. J. Mol. Biol. 255: 628-640.

105. Wu, S.-J., Koller, C.N., Miller, D.L., Bauer, L.S. and Dean, D.H. (2000) Enhanced toxicity of Bacillus thuringiensis СгуЗА 8-endotoxin in coleopterans by mutagenesis in a receptor binding loop. FEBS Letters 473: 227-232.

106. Xie, R., Zhuang, M., Ross, L.S., Gomez, I., Oltean, D.I., Bravo, A., Soberon, M., and, Gill, S.S. (2005). Single amino acid mutations in the cadgerin receptor from Heliothis virescens affect its toxin binding ability to CrylA toxins. JBC, 280:8416-8425.

107. Yang Y.J., Davies D.M. Digestive enzymes in the excreta of Aedes aegypti larvae //J. Insect Physiol. 1971. Vol. 17. N 11, P. 2129-2123.

108. Yang Y.J., Davies D.M. The effect of cations on chymotrypsin from Aedes aegypti larvae // J. Insect Physiol. 1972. Vol. 18. N 4. P. 747-755.

109. Yaoi, K., Kadotani, Т., Kuwana, H., Shinkawa, A., Takahashi, Т., Iwahana, H., and Sato, R. Aminopeptidase N from Bombyx mori as a candidate for the receptor of Bacillus thuringiensis CrylAa toxin // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 246. P. 652-657. :

110. Yaoi, K., Nakanishi, K., Kadotani, Т., Imamura, M., Koizumi, N., Iwahana, H., and Sato, R. Bacillus thuringiensis CrylAa toxin-binding region of Bombyx mori aminopeptidase N // FEBS Lett. 1999. Vol. 463. P. 221-224.

111. Yong, I.E., and Fitz-James, P.C. Chemical and morphological studies of bacterial spore formation. II. Spore and parasporal protein formulation in Bacillus cer-eus var. alestill J. Biophys. Biochim. Cytol. 1959. Vol. 6. P. 483-486.

112. Zalunin, I.A., Revina, L.P., Kostina, L.I., and Chestukhina, G.G. Peculiarities of Cry proteins to be taken into account during their in vivo and in vitro study // IOBC Wrps Bulletin, 2004. Vol. 27. P. 177-185.

113. Zhu, Y.C., Kramer, K.J., Oppert, В., and Dowdy, A.K. cDNAs of aminopeptidase-like protein genes from Plodia interpunctella strains with different susceptibilities to Bacillus thuringiensis toxins // Insect. Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 30. P. 215-224.