Характеристика штаммов Brevibacillus laterosporus и продуцируемых ими биологически активных соединений

Зубашева, Маргарита Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика штаммов Brevibacillus laterosporus и продуцируемых ими биологически активных соединений
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика штаммов Brevibacillus laterosporus и продуцируемых ими биологически активных соединений"

005042533

ЗУБАШБВА Маргарита Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВНЕУШАа^иЭЬЛТЕЯОЯРОЯиЗ И ПРОДУЦИРУЕМЫХ ИМИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность 03.02.03. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 п [.;;.!; ш

Москва - 2012

005042533

Работа выполнена в лаборатории биологически активных соединений ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Руководитель лаборатории - доктор биологических наук, профессор Азизбекян Рудольф Рубенович.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Азизбекян Рудольф Рубенович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Цыганков Юрий Дмитриевич ФГУП ГосНИИ генетика, заведующий лабораторией метилотрофных бактерий

кандидат биологических наук Данилова Ирина Валентиновна

МГУ имени М.ВЛомоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии, старший научный сотрудник.

Ведущая организация - Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоится « 29 » мая 2012 г. в «15.30» часов на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, корп. 12, биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.501.001.21, к.б.н.

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аетуальность проблемы. В последние годы в связи с бурным развитием биотехнологии и задачами обеспечения экологических условий жизни и производства усиливается интерес к спорообразующим бактериям. Главными объектами фундаментальных и прикладных исследований на протяжении многих лет были бактерии Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis. Штаммы В. subtilis используются как продуценты ферментов и как пробиотики, бактерии В. thuringiensis являются практически уникальными продуцентами биологических средств защиты растений. Между тем, исследования последних лет свидетельствуют, что имеются бациллы, обладающие рядом ценных в прикладном смысле характеристик. Среди них важное место занимают бактерии Brevibacillus laterosporus (прежнее название - Bacillus laterosporus). Показано, что бациллы В. laterosporus (BL) способны к синтезу инсектицидных факторов, ферментов, ■продуцируют целый спектр антагонистических факторов, в том числе, обладающих антибактериальным эффектом, фунгицидной и цианолитической активностями, их применяют в качестве эффективных пробиотиков.

Одной из актуальных задач биотехнологии и экологии является развитие эффективных и экологически безопасных биологических методов борьбы с вредными насекомыми отрядаDiptera. Биологические методы борьбы включают использование в качестве промышленных продуцентов биоинсектицидов энто-мопатогенных бактерий В. thuringiensis ssp. israelensis и Bacillus sphaericus, характеризующихся избирательностью москитоцидного действия. Основными факторами патогенности этих бактерий являются кристаллические и не кристаллические токсины белковой природы. Однако, существующие в настоящее время препараты на основе В. thuringiensis и В. sphaericus не полностью перекрывают спектр вредных насекомых. Отсутствие штаммов с более широким спектром энтомоцидного действия и развивающаяся устойчивость в популяциях целевых насекомых к действию некоторых бактериальных препаратов диктует поиск новых видов бактерий-продуцентов инсектицидных токсинов, отличающихся по структуре и способу действия от известных.

В отличие от хорошо изученных энтомопатогенных видов В. thuringiensis ssp. israelensis и В. sphaericus энтомоцидные свойства и другие биологические особенности В. laterosporus изучены недостаточно. Это препятствует созданию инсектицидных препаратов на основе данного вида бактерий, а также широкому использованию В. laterosporus в различных областях биотехнологии. Вместе с тем, ограниченные сведения о наличии у В. laterosporus токсичности по отношению к личинкам комаров Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culexpipiens и другим представителям Diptera позволяет считать вид Я laterosporus потенциальным кандидатом для биологической борьбы с двукрылыми насекомыми-вредителями.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью нашей работы являлось изучение инсектицидных и антагонистических свойств штаммов В. laterosporus и характеристика факторов их биоцидной активности. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг коллекции штаммов В. laterosporus, выделенных из различных географических областей с целью поиска кристаллоносных штаммов;

- дать физиолого-биохимическую характеристику исследуемых штаммов В. laterosporus',

- охарактеризовать морфологические особенности штаммов В. laterosporus',

- определить спектр и оценить уровень инсектицидной активности исследуемых штаммов В. laterosporus с использованием личинок насекомых, представителей отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera-,

- подобрать условия для эффективного споро- и кристаллообразования штаммов В. laterosporus',

- выделить и охарактеризовать свойства ларвицидных кристаллов штаммов В. laterosporus'. определить уровень активности, молекулярный вес белков;

- изучить возможность усиления ларвицидного действия эндотоксинов (спор и кристаллов) В. laterosporus с использованием простейших Tetrahymena pyriformis и Entamoeba moshkovskii

- оценить биоцидную активность (антибактериальную, фунгицидную, циано-литическую) штаммов В. laterosporus на микроорганизмах разных таксономических групп;

- оценить гемолитическую активность штаммов В. laterosporus.

Научная новизна работы:

- впервые выделены четыре кристаллообразующих штамма В. laterosporus, активные в отношении личинок комаров разных видов, охарактеризованы их физиолого-биохимические свойства и свойства кристаллов этих штаммов. Установлено, что кристаллические включения В. laterosporus различаются по форме и размерам;

- подобраны условия споро- и кристаллообразования штаммов В. laterosporus, обеспечивающие максимальный выход целевого продукта (продуктивность, образование спор, образование кристаллов, уровень ларвицидной активности);

- показано, что штаммы В. laterosporus специфически активны для личинок различных видов двукрылых. Установлено, что нативная культуральная жидкость кристаллообразующих штаммов В. laterosporus, а также осадок, содержащий споры и кристаллы, обладают ларвицидной активностью против комаров Art. stephensi и Ае. aegypti;

- установлена белковая природа кристаллов. Показано, что кристаллы являются монокомпонентными системами, содержащими белки от 68 кДа до 130 кДа;

- разработаны оптимальные условия биоинкапсуляции эндотоксинов В. laterosporus с использованием простейших Т. pyriformis и Е. moshkovskii. Показано увеличение ларвицидного эффекта бактерий: снижение эффективных концентраций и сокращение времени гибели 50% личинок комаров An. stephensi по сравнению с не инкапсулированными факторами В. laterosporus. Установлено, что фракции очищенных спор и кристаллов, а также исходной споро-кристаллической массы LAT 006 не оказывают токсического действия на клетки простейших;

- показано, что большинство исследованных штаммов В. laterosporus продуцируют вещества типа бактериоцинов, антибактериальное действие которых проявляется в отношении представителей этого же вида бактерий. Электронно-микроскопическое исследование очищенных препаратов бактериоцинов показало, что все они содержат частицы, напоминающие по морфологии структурные элементы бактериофагов;

- из культуры штамма В. laterosporus BL 16-52 выделен комплекс антибиотиков, определены спектр антагонистической активности и минимальные ингибирую-щие концентрации (МИК) выделенных антибиотиков;

- установлено, что большинство исследованных штаммов В. laterosporus проявляет гемолитическую активностью против эритроцитов разных видов (крысы и человека). Показано, что осмопротектанты с гидродинамическим радиусом молекул более 2 нм ингибируют лизис эритроцитов человека (5 %), вызываемый действием гемолизинов В. laterosporus. Это косвенно указывает на порообразующие свойства гемолизинов В. laterosporus.

Практическая значимость работы:

- выделены кристаллообразующие штаммы В. laterosporus, активные против личинок комаров;

- высокий уровень ларвицидной активности кристаллов штамма В. laterosporus LAT 006 для комаров Ае. aegypti и An. stephensi (Leso 3,0 нг/мл и 5,0 нг/мл, соответственно), сопоставимый с активностью высок'отоксичных штаммов В. thurirtgiensis и В. sphaericus, позволяет рекомендовать Я laterosporus в качестве продуцента биологических инсектицидов;

- разработаны условия биоинкапсуляции эндотоксинов В. laterosporus простейшими Т. pyriformis и Е. moshkovskii, которые могут быть использованы для повышения эффективности инсектицидов, создаваемых на основе В. laterosporus и других видов бактерий;

- высокий биоцидный эффект (антибактериальный, фунгицидный, цианолити-ческий) позволяет рекомендовать штаммы В. laterosporus в качестве продуцентов биологических средств защиты растений от болезней и борьбы с токсическими микроскопическими водорослями (сине-зелеными бактериями).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части (пяти глав собственных исследований и обсуждения результатов), заключения и выводов. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 25 таблиц и 20 рисунков. Библиография состоит из 200 наименований.

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены и доложены на IV-ой конференции молодых ученых «Новые направления биотехнологии» (Пущино-на-Оке, 1994), 9-ой конференции ГосНИИ генетика (Москва, 1995), 10-ой Международной конференции по глобальным аспектам прикладной микробиологии и биотехнологии (Эльсинор, Дания, 1995), 11-ой конференции ГосНИИ генетика (Москва, 1997), на 1-ой Международной школе-семинаре «Кровососущие насекомые-переносчики трансмиссивных заболеваний

и проблемы генетической безопасности» (Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (Москва, 2002).

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Азизбекяну Р. Р. за внимание и помощь при проведении работы и подготовке рукописи диссертационной работы. Искреннюю признательность автор приносит всем сотрудникам лаборатории биологически активных соединений ФГУП ГосНИИ генетика за помощь в освоении методик, содействие в процессе работы и дружескую поддержку. Автор выражает особую признательность д.б.н. Смирновой Т. А (ФГБУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), д.б.н., проф. Ганушкиной Л. А. (ИМПиТМ им. Е. И. Марциновского ММ А им. И.М. Сеченова), д.м.н. Диденко JI.B. (ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), к.б.н. Запунину И.А. (ФГУП ГосНИИ генетика) за помощь на отдельных этапах работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе исследовали пять штаммов В. latero-sporus BL 16-92, BL 16-13, BL 16-931, BL 16-932, BL 16-52, выделенные в лаборатории биологически активных соединений ГосНИИ генетика из природных образцов (почвы, погибших насекомых) на селективных средах с полимиксином (100 мкг/мл) (Смирнова и др., 1993) и одиннадцать штаммов В. laterosporus LAT 001-011, полученные из коллекции энтомопатогенных бактерий IEBC (Институт Пастера, Париж).

Питательные среды. Для поддержания и выращивания чистых культур штаммов В. laterosporus использовали агаризованную среду NBY. Для исследования морфологических особенностей штаммы В. laterosporus выращивали на среде Хотгингера. Рост, споро- и кристаллообразование и уровень ларвицидной активности штаммов В. laterosporus оценивали на жидких и плотных (1,8% агар «Difco») средах: Хотгингера, ДПС, картофельно-сахарозной, J-среде для капризных энтомопатогенных бактерий, богатой органической среде Luria-Bertani (LB), среде NB, синтетической среде Никкерсона и Буллы с добавлением ростовых факторов тиамина (10 мкг/мл) и L-метионина (20 мкг/мл), среде NB YS, полноценной среде BP для энтомопатогенных бактерий (Lecadet, 1980), питательных средах на основе NBY с добавлением различных солей, глюкозы (1%) и ростовых факторов: тиамина (10 мкг/мл) и метионина (20 мкг/мл).

В биохимических тестах использовали дифференциально-диагностические среды для представителей рода Bacillus.

Для оценки антибактериальной активности штаммы В. laterosporus культивировали в жидкой среде NBY. Для оценки фунгицидной активности штаммы В. laterosporus выращивали в жидкой среде ДПС. Фитопатогенные грибы выращивали на агаризованной картофельно-сахарозной среде (сахароза - 2,0%, картофельный отвар - до 1 л, pH 7,0). Дрожжи С. albicans и S. cerevisiae выращивали на богатой среде Сабуро (пептон - 1 %, мальтоза - 4 %, агар - 2 %, вода до 1 л, pH

5,6). Для качественной оценки гемолитической активности штаммов В. laterosporus использовали кровяной агар, приготовленный на основе кровяной агаровой среды ("Difco") с добавлением 5% (по объему) стерильной дефибринированной крови человека.

Условия культивирования. В жидких питательных средах культуры штаммов В. laterosporus и тест-микроорганизмов выращивали от 8 до 96 ч в зависимости от целей эксперимента. Температура инкубации составляла: для В. laterosporus - 30-37°С, для других видов бацилл - 28-30°С, для фитопатогенных бактерий родов Erwinia, Xanthomonas, Pseudomonas - 30°С, для бактерий родов Brevibacterium, Corynebacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Mycobacterium, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella - 37°C. Фитопатогенные грибы родов Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Phoma, Phomopsis, Phytophthora, Rhizoctonia, Sclerotinia выращивали при 37°C. Дрожжи выращивали при 32°С. На плотных питательных средах штаммы В. laterosporus культивировали при 30°С или 37°С в течение 18-120 ч в зависимости от целей эксперимента.

Для приготовления препаратов спор культуры штаммов В. laterosporus рассевали на агар Хоттингера и инкубировали 5 суток при 37°С. Завершение споро- и кристаллообразования контролировали с помощью светового микроскопа. Материал смывали стерильной дистиллированной водой, отмывали три раза и после прогревания при 80°С 30 мин споровый материал хранили в дистиллированной воде при 4°С.

В качестве посевного материала использовали споровые суспензии штаммов В. laterosporus (ОП540 = 1,0 ед.), приготовленные в стерильной дистиллированной воде. Для получения синхронных культур В. laterosporus жидкие питательные среды засевали посевным материалом, предварительно прогретым при температуре 75°С в течение 15 мин. Конечная концентрация посевного материала в среде составляла 0,1 ед. ОП540.

Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и жизнеспособных спор в 1 мл исследуемого образца определяли по стандартным методикам.

Фракции культурального супернатанта и клеток получали по стандартным методикам.

Антагонистическую активность образцов исследуемых штаммов определяли методом капель с нанесением верхнего агара и методом диффузии из лунок в агаре с использованием набора тест-организмов: родственных и таксономически отдаленных бактерий, фитопатогенных бактерий и грибов. Для анализа антагонистической активности использовали культуральную жидкость штаммов В. laterosporus, содержащую 1-4x107 кл/мл. Эффективность антагонистического действия исследованных штаммов В. laterosporus определяли по диаметру зон отсутствия роста тест-микроорганизмов вокруг лунки в агаре или на газоне. В качестве единицы активности принимали диаметр зоны отсутствия роста бактерий вокруг лунки, равный 1 мм, и грибов, равный 4-НЗ мм.

Выявление антагонистической активности В. laterosporus при совместном культивировании осуществляли, как описано (Gram et al., 1999) с использованием штаммов BL 16-52 и В. cereus 569 Strr.

Очистка антибактериального фактора в градиенте плотности хлористого цезия. Выделение и очистку антибактериальных факторов В. laterosporus осуществляли из супернатантов 48-ч бульонных культур штаммов LAT 002, LAT 003, LAT 004, LAT 006, BL 16-92, BL 16-13, BL 16-932 и BL 16-52 в преформированном градиенте плотности хлористого цезия (р 1,33; 1,4; 1,5 и 1,6 г/см3) при 120000 g, 2,5 ч и 4°С на ультрацентрифуге High Speed-25 бакет-ротор SW-41. Образованные в градиенте плотности CsCl видимые полосы диализовали против фагового буфера (рН 7,2). В образцах полос определяли антибактериальную активность методом капель и проводили электронно-микроскопический анализ структурированных элементов.

Светооптическое и электронно-микроскопическое исследования. Для световой микроскопии образцы окрашивали по методу Смирнова (1962). Электронно-микроскопическое исследование проводили методами трансмиссивной и сканирующей микроскопии. Клетки, споры и кристаллы исследовали в ТЭМ методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. Изучение структурированных элементов, очищенных в градиенте плотности CsCl проводили методом негативного контрастирования. Для негативного контрастирования образцы наносили на сетки, покрытые формваровой пленкой и окрашивали 1%-ным водным раствором уранилацетата. Ультратонкие срезы готовили по стандартной методике, описанной Смирновой с соав. (1993). Микроскопию всех образцов проводили на электронном микроскопе JEM-100 В (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV.

Нативные споры и кристаллы исследовали в электронно-ионном сканирующем микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, USA). Образцы нативных спор и кристаллов помещали на кремниевую подложку, которую с помощью углеродного скотча фиксировали к алюминиевым столикам. Все препараты исследовали в режиме низкого и высокого вакуума, в отдельных случаях напыляли золотом (4 нм). Поверхность образцов сканировали при ускоряющем напряжении 5-30 kV.

Чувствительность антибактериальных факторов к протеолитическим ферментам и нагреванию. Сконцентрированные и очищенные антибактериальные факторы штаммов В. laterosporus инкубировали с трипсином (1 мг/мл) или проназой (1 мг/мл) при 37°С, рН 8,0 в течение 18 ч. Нагревание концентрата проводили при 100°С в течение 5 мин.

Выделение и очистка пептидных антибиотиков. Комплекс антибиотиков, состоящий из трех пептидов, был выделен из 48 ч бульонной культуры штамма В. laterosporus BL 16-52. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) выделенных антибиотиков определяли стандартным методом серийных двукратных разведений исходного раствора антибиотика.

Очистка кристаллических белков В. laterosporus. Очищение кристаллов В. laterosporus проводили путем центрифугирования споро-кристаллической суспензии в нелинейном градиенте плотности 20, 30, 40 и 50%-ного бромида натрия (150000 g, 2 ч, +4°С). Полученные фракции отмывали от бромида натрия трехкратным центрифугированием (15000 g, 15 мин) в дистиллированной воде, ресуспендировали в исходном объеме дистиллированной воды и

микроскопировапи. Степень очистки кристаллов от спор контролировали фазово-контрастной микроскопией мазков, окрашенных по методу Смирнова (1962).

Для определения молекулярных масс белков, входящих в состав кристаллов очищенные кристаллы штаммов В. laterosporus анализировали с помощью различных дезагрегирующих агентов. Предварительно кристаллы отмывали от протеиназ в 1 M NaCl в течение 30 мин при 20° С. Растворение кристаллов штаммов В. laterosporus проводили: 1) при одновременном воздействии на них денатурирующих и восстанавливающих агентов, в частности 8 M мочевины и 0,01 M дитиоэритрита, рН 8,5 при нагревании до 100° С в течение 5 мин; 2) в сильно щелочной среде (рН 12 и выше): в 0,01 M NaOH при рН 12,5 в течение 60 мин.

Концентрацию белка в образцах определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (Serva). Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия проводили в плоском слое полиакриламидного геля 7,5 % по Лэммли.

Инсектицидную активность исследованных образцов оценивали на личинках комаров видов An. stephensi (Liston), Ае. aegypti (L.) и Cx. pipiens (L.), непарного шелкопряда Lymanthria dispar и колорадского жука Leptinotarsa decemlineata по стандартным методикам биотестирования бактериальных штаммов на насекомых.

Антипротозойную активность образцов оценивали на клетках инфузории T. pyriformis и амебы Е. moshkovskii по стандартным методикам биотестирования бактериальных штаммов на простейших.

Для биоинкапсуляции эндотоксинов (спор и кристаллов) В. laterosporus простейшими Т. pyriformis и Е. moshkovskii рассчитывали LC50 (концентрацию образца, вызывающую гибель 50% личинок) и LT50 (время, в течение которого гибель личинок достигает 50%). Величину LT50 использовали для оценки скорости гибели личинок комаров до и после контакта с инкапсулированными и не инкапсулированными образцами В. laterosporus.

Для определения цианолитической активности использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых микроскопических водорослей: Anabaena sp. 5781, Nostoc sp. А-10, штаммы нефиксирующих азот одноклеточных микроводорослей Microcystis aeruginosa 562 и 905. Цианолитическую активность оценивали по падению оптической плотности через 24 часа совместной инкубации жидких культур В. laterosporus с двухнедельными культурами различных микроводорослей.

Выявление гемолитической активности штаммов В. laterosporus и наблюдение феномена тепло-холодового гемолиза осуществляли на кровяном агаре с использованием стерильных дефибринированных эритроцитов человека (5%). Гемолитические штаммы выявляли по появлению характерных зон гемолиза вокруг штриха.

Недифибринированные эритроциты человека или крысы сохраняли в растворе Олсвера (цитрат натрия - 20 г/л, глюкоза - 30 г/л, рН 7,2). Перед использованием в опытах эритроциты несколько раз отмывали в буфере PBS (рН

7,2) для удаления лизированных клеток путем центрифугирования (1 ООО g, 10 мин, 4°С). 5%-ную суспензию недифибринированных эритроцитов человека использовали для количественной оценки степени гемолиза и в экспериментах по осмотическому ингибированию гемолиза, вызываемого В. ¡aterosporus.

Количественную оценку гемолитической активности бактериальных фракций штаммов В. ¡aterosporus проводили микрометодом с помощью спектрофотометрической регистрации гемоглобина, высвобождающегося при лизисе эритроцитов (Bernheimer, 1988). Эксперименты по осмотическому ингибированию гемолиза выполняли, как описано у Beecher и Wong (1997).

При изучении динамики накопления антагонистических факторов культуральную жидкость В. Iaterosporus на разных сроках инкубации испытывали соответствующими методами биотестирования. За динамикой роста культур следили по изменению оптической плотности среды при длине волны 590 нм, по динамике накопления продуктов культивирования и снижению рН среды.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе отсутствуют сведения о комплексной оценке представительной коллекции штаммов В. ¡aterosporus, выделенных из различных географических областей, продуцировать биологически активные соединения. У 16 природных изолятов В. ¡aterosporus были исследованы инсектицидная активность, антагонистическая активность, способность вызывать гемолиз, а также свойства отдельных факторов биологической активности. В качестве индикаторных объектов были использованы насекомые различных отрядов, грам (+) и грам (-) бактерии, грибы, водоросли и разные виды эритроцитов.

Характеристика штаммов В. ¡aterosporus. Изучаемые штаммы В. ¡aterosporus были выделены из природных образцов (почва, погибшие насекомые) в различных климато-географических районах. Исследование морфологических особенностей штаммов В. ¡aterosporus с помощью светового микроскопа выявило у них признаки, характерные для данного вида бактерий. Вегетативные клетки В. ¡aterosporus имеют палочковидную форму. Размер клеток составляет (0,7-г0,9 мкм)х(3,0ч-5,0 мкм). При споруляции наблюдается раздувание спорангия. Споры В. ¡aterosporus имеют каноэвидное включение (каноэ). Параспоральные каноэвидные включения прикреплены к одной стороне споры. По данным световой микроскопии споры исследованных штаммов В. ¡aterosporus различаются по форме и размерам, по толщине и общему виду каноэ. При высеве на агаризованную среду Хоттингера исследованные штаммы В. ¡aterosporus образуют плоские, гладкие, ровные колонии белого, бежевого или коричневого цвета. Со временем гладкие колонии видоизменяются в морщинистые.

Впервые выделены штаммы В. ¡aterosporus, способные образовывать параспоральные кристаллы. У четырех исследованных штаммов В. ¡aterosporus (BL 16-92, BL 16-13, LAT 006 и LAT 011), помимо каноэвидных включений, обнаружены кристаллические включения, различающиеся по форме и размерам,

подобные тем, что описаны для энтомопатогенных бактерий В. thuringiensis и В. sphaericus. Кристаллы штаммов BL 16-92, BL 16-13, LAT 006 и LAT 011 при лизисе спорангия высвобождаются раздельно от споры. Способность к кристаллообразованию у бактерий вида В. laterosporus до настоящего момента не была установлена.

Инсектицидная активность В. laterosporus. В связи с немногочисленными данными об энтомопатогенной активности В. laterosporus представляло интерес исследовать токсичность этих бактерий для насекомых разных видов. Мы проанализировали инсектицидную активность 16 штаммов В. laterosporus в отношении личинок насекомых отрядов Lepidoptera, Coleóptera и Díptera. Для тестирования энтомоцидной активности В. laterosporus использовали клетки штаммов, полученные после 72-х ч культивирования в жидкой среде NBY. Уровень спорообразования культур исследованных штаммов В. laterosporus в данной среде составлял от 80 до 90 %.

Установлено, что исследованные штаммы-ß. laterosporus были наиболее токсичны для личинок комаров An. stephensi {Díptera), менее токсичны для личинок колорадского жука L. decemlineata (Coleóptera) и вообще не токсичны для личинок непарного шелкопряда L. dispar (Lepidoptera). Полученные нами результаты согласуются с данными других авторов, подтверждающими наличие у штаммов В. laterosporus выраженной активности в отношении представителей Díptera и Coleóptera и отсутствие активности в отношении представителей Lepidoptera (Favret and Yousten (1985), Rivers et al. (1991), Singer (1981), Chang et al. (1984). Все исследованные ранее штаммы были некристаллообразующими.

Ларвицидный эффект В. laterosporus. Сравнительный анализ актив-ности 16 штаммов В. laterosporus в отношении двукрылых насекомых показал, что почти все они были токсичны для личинок П-ой стадии комаров трех видов: An. stephensi (Liston), Ае. aegypti (L.) и Cx. pipiens (L.). Для большинства исследованных бактериальных культур В. laterosporus в зависимости от штамма и вида мишеней LC5o составляла от 10"2 до 10~3, или в пересчете на клетки - от 106 до 104 КОЕ/мл. По уровню токсичности штаммы В. laterosporus напоминали слабоактивные штаммы В. thuringiensis и В. sphaericus (de Barjac, H. 1990). Токсичность всех штаммов В. laterosporus для личинок An. stephensi и Ае. aegypti была несколько выше, чем для Cx. pipiens. Спектр ларвицидной активности штаммов В. laterosporus отличался от спектра активности, проявляемого штаммами В. thuringiensis и В. sphaericus (табл. 1).

Таблица 1

Спектр ларвицидной активности штаммов В. laterosporus

Bacillus thuringiensis Bacillus Brevibacillus

ssp. israelensis sphaericus laterosporus

Aedes aegypti +++ -/+ ++

Anopheles stephensi ++ ++ ++

Culex pipiens +++ +++ +

Однако, после соответствующей работы по подбору оптимальных условий для споро- и кристаллообразования, ларвицидная активность кристаллообразую-щего штамма LAT 006 достигла уровня, сравнимого с Bti на личинках Комаровой. stephensi и Ае. aegypti. Для других кристаллообразующих штаммов эти показатели улучшились, но незначительно.

Ларвицидная активность кристаллообразующих штаммов В. latero-sporus. Наибольший интерес среди взятых в работу штаммов В. laterosporus представляли четыре Сгу+-штамма LAT 006, LAT 011, BL 16-92 и BL 16-13. До настоящего времени при исследовании ларвицидной активности В. laterosporus авторы использовали только а-кристаллические штаммы. Ранее способность к кристаллообразованию у бактерий вида В. laterosporus не была установлена. До недавнего времени В. thuringiensis и В. sphaericus считались единственными видами Bacillus, продуцирующими кристаллические белковые токсины.

В настоящей работе кристашюобразующие штаммы В. laterosporus были изучены детально - дана морфологическая характеристика штаммов, проведен анализ влияния различных факторов культивирования на способность к споро- и кристаллообразованию, определены динамика синтеза и локализация ларвицидных факторов, оценена токсичность параспоральных кристаллов штаммов В. laterosporus для комаров разных видов, установлены молекулярные массы белков, входящих в состав кристаллов.

Морфологическая характеристика кристаллообразующих штаммов. Спорый параспоральные включения. Штаммы В. laterosporus BL 16-92,BL 16-13, LAT 006 и LAT 011 образуют эллипсовидные споры с прикрепленным к споре каноэвидным включением (рис. 1,2). Исследованные нами штаммы В. laterosporus помимо каноэ образуют параспоральные кристаллические включения (рис. 3). Во время лизиса спорангия каноэ остается обычно связанным со спорой (рис. 4), а кристаллы освобождаются раздельно от споры (рис. 5). Размеры и форма кристаллов у штаммов различаются. Штамм BL 16-92 образует мелкие ромбические кристаллы с четко очерченными углами размером 0,4 х 0,3 мкм (рис. 6). Электронно-микроскопический анализ показал, что свободные кристаллы 16-92 и кристаллы внутри спорангиев окружены оболочкой, как правило, равномерной толщины (рис. 7, 8). Оболочка имеет сетчатую структуру, сходную с оболочкой кристаллов В. thuringiensis ssp. israelensis. Штамм LAT 006 образует прямоугольные кристаллические включения размером 0,2 х 0,7 мкм или квадратные со сглаженными углами кристаллы размером 0,4 х 0,4 мкм и меньше (рис. 9, 10). Кристаллы штамма BL 16-13 крупные (0,7 х 0,5 мкм), ромбоидной формы (рис 3, 8, 11). Кристаллы штамма LAT 006 отличаются от кристаллов В. laterosporus BL 16-92 формой и большей электронной плотностью, но сходны с кристаллами BL 16-92 наличием оболочки, изолирующей их от воздействия факторов внешней среды. Штамм LAT 011 образует мелкие ромбические с четко очерченными углами кристаллы размером 0,5 х 0,2 мкм (рис. 12, 13).

Влияние условий культивирования на способность В. laterosporus к росту, споро- и кристаллообразованию и величину ларвицидной активности. Для выяснения условий, влияющих на способность штаммов В. laterosporus к

Рис. 1. Спора с каноэ (-*). Штамм В. Шеговрогиэ ВЬ 16-92. Ультратонкий срез.

Рис. 2. Спора с каноэ (-*■). Штамм В. Ыегоярогш ЬАТ 006. Ультратонкий срез.

Рис. 3. Спора с каноэ (-*■) и кристаллом (<=) в спорангии. Штамм В. Шегоьроги*

ВЬ 16-13. Ультратонкий срез.

Рис. 4. Споровая оболочка с прикрепленным каноэ (-►). Штамм В. Шего$рогж ВЬ 1613. Ультратонкий срез.

Рис. 5. Свободные кристаллы (<г=) и спора О-) после лизиса спорангия. Штамм В.

ШегозрогиБ ВЬ 16-13. Ультратонкий срез.

Рис. 6. Спора и кристаллы штамма В. Шегоэрогш 16-92. Негативное контрастирование.

Рис. 7. Спора (-«-) и кристаллы (<=■) в спорангии. Штамм В. Шеговрогш ВЬ 16-92.

Ультратонкий срез.

Рис. 8. Спора (-«-■) и кристалл (<=) штамма В. Шегозрогш 16-13. Ультратонкий срез.

Рис. 9. Спора (-«-) и кристаллы ) штамма В. Шеговропи ЬАТ 006. Негативное

контрастирование.

Рис. 10. Спора (-*-) и кристалл (<=) в спорангии. Штамм В. Шегозрогиз ЬАТ 006.

Ультратонкий срез.

Рис. 11. Кристаллические включения, штамма В. Шегозрогш 16-13. Ультратонкий срез.

Рис. 12. Спора (-«-), кристаллы штамма ЬАТ 011. Негативное контрастирование.

Рис. 13. Спора (<-) и кристалл (<==) в спорангии. Штамм В. Шегозрогт ЬАТ 011.

Ультратонкий срез.

споро- и кристаллообразованию в качестве модельного штамма использовали штамм ЬАТ 006. Известно, что уровень споро- и кристаллообразования В. 1кигт%1е№1$ и В. зрНаепсиэ в значительной мере зависит от состава используемой для культивирования среды.

Для определения оптимальных условий споро- и кристаллообразования В. ¡ШегоБрогиБ использовали ряд питательных сред. Штамм ЬАТ 006 выращивали в средах, содержащих в различных сочетаниях пептон, триптон, мясной экстракт, глюкозу, дрожжевой экстракт, минеральные соли, варьировали температуру культивирования (30°С и 37°С). В некоторые среды вносили тиамин и Ь-метионин, поскольку бактерии В. Шегоэрогив являются ауксотрофами по этим факторам роста.

По анализированным показателям — продуктивность, образование спор, образование кристаллов и ларвицидная активность - оптимальными оказались следующие условия культивирования штамма ЬАТ 006 - среды Мскегеоп и ВР, продолжительность инкубации - 96 часов, температура инкубации - 37°С. Отметим, однако, что продуктивность (титр спор/мл) для некоторых штаммов оказалась выше при культивировании при 30° С, но значение ЬС50 снизилось (табл. 3). Метод культивирования - жидкая среда или плотная не имели значения. В таблице 2 представлены показатели изученных характеристик штамма ЬАТ 006 в оптимальных условиях культивирования.

Таблица 2

Показатели роста ЬАТ 006 в оптимальных условиях культивирования

Характеристика Показатель

Условия культивирования Питательная среда Среда ВР, ЬПскегеоп

Время инкубации 96 час

Температура инкубации 37° С

Показатели роста Титр >108 КОЕ/мл

Частота спорообразования 90-95%

Образование кристаллов Соотношение спора: кристалл-1,0-1,5

Содержание общего белка 400 мкг/мл

Ларвицидная активность ЬС5о < 1x104 КОЕ/мл или < 9,0 х 10'5(8,0х 10"5-2,4х 10"4) 0,006-0,045 мкг общего белка/мл

Как известно, отношение спора/кристалл позволяет судить о стадии культивирования. Так, для В. ¡Ьиг^'^пъгь зэр. на заключительном этапе культивирования эта величина составляет < 1.

Таким образом, питательная среды ВР и Мскегэоп обеспечивают достижение культурой штамма ЬАТ 006 наибольшей ларвицидной активности против личинок А. ае%урИ. Оптимизация условий культивирования позволила увеличить выход спор и кристаллов и уровень токсичности исследуемых штаммов В. ШегоБрогш ЬАТ 006 и ВЬ 16-92 для комаров. Эти показатели для штамма ЬАТ 006 (титр спор и ЬС50 для личинок Ае. ае&рИ) составили, соответственно,

2x108 спор/мл и 0,025 мкг общего белка/мл, а для штамма ВЬ 16-92 - 1х108 спор/мл и 0,94 мкг общего белка/мл.

Таблица 3

Влияние температуры культивирования на рост и ларвицидную активность

штаммов В. \aterosporus ЬАТ 006 и ВЬ 16-92_

Показатели роста и активности ЬАТ 006 ВЬ 16-92

30°С 37°С 30°С 37°С

Споры/мл 2,0х107 2,0x108 4,0х108 1,0х108

ЬС50 (споры/мл и разведение) 6,0x104 (З,0х10"3) (1,2х10""'-6,8х10"3) 1,6x10" (8,0х10~5) (8,0х10"5-3,6х10'4) 2,0х106 (5,0x10°) (4,0х10"3-1,ЗхЮ"2) 2,35х105 (2,35x10°) (2,35 "3-4,2х10"3)

Общий белок, м кг/мл 150 320 340 400

ЬС50, (общ. бел, м кг/мл) 0,45 0,025 1,7 0,94

Изучение динамики синтеза и локализации ларвицидного фактора кристаллообразующих штаммов В. Шеговрогив. Для выявления связи между ларвицидной активностью и циклом бактериального роста кристаллообразующих штаммов В. ¡сИегоярогиз сравнивали токсичность штамма ЬАТ 006 для личинок комаров А п. х1ерНеп.й на разных стадиях роста (вегетативная, спорообразования, стадия синтеза кристаллического токсина). Для расчета величины, характеризующей токсичность штамма, принимали минимальную концентрацию образца (КОЕ/спор в мл), вызывающую 50% гибели личинок тест-насекомых через 48 ч. Результаты представлены на рис. 14.

Изучение динамики роста штамма ЬАТ 006 в жидкой среде ВР показало, что экспоненциальная фаза изучаемой культуры наблюдается между 8 и 20 ч после посева (рис. 14 ). Однако, во время ранней экспоненциальной фазы роста (8 ч) культура не обладала никакой детектируемой токсичностью для насекомых. Вегетативная (18 ч) культура ЬАТ 006 с титром более 107 КОЕ/мл и количеством спор менее 0,3 % обладала наименьшей токсичностью для комаров Ап. Величина ЬС50 18-часовой культуры составляла 2,0х105 КОЕ/мл. Ларвицидная активность 96-часовой культуры была примерно на два порядка выше, чем у 18-часовой культуры ЬАТ 006, что могло быть обусловлено увеличением количества спор и кристаллов. Так, через 96 ч культивирования титр культуры ЬАТ 006 составлял >108 КОЕ/мл, а уровень спорообразования достигал 80%, значение ЬС50 составляло <1,0x10 КОЕ/мл.

Таким образом, в результате исследования динамики ларвицидной активности у кристаллообразующего штамма ЬАТ 006 установлено, что наибольшей токсичностью обладала культура на стадии спорообразования (96 ч), продуцирующая термостабильные споры и кристаллы.

Рис.14. Рост и ларвицидная активность штамма В. \aterosporus ЬАТООбв отношении личинок комаров Ап. згерЪетг.

Показано, что почти вся ларвицидная активность штамма В. Шегозрогив Ь АТ 006 против Ап. stephensi на стадии оптимума - на стадии спорообразования -была связана с фракцией осадка, т. е. кристаллами и спорами (табл. 4).

Таблица 4

Ларвицидная активность фракций споровой культуры В. laterosporus _для личинок Anopheles slephensi _

Образец LAT 006 BL 16-13

КОЕ/мл LCso, КОЕ/мл КОЕ/мл LCso, КОЕ/мл

Культуральная жидкость 2,2 х 108 8,0 х 103 (4,0 х 10"5) 1,0 х 108 2,35 х 105 (4,7 х 10"3)

Супернатант" н.о. 1,0x10"2 н.о. 4,0 х 10"2

Осадок 2,2 х 108 8,0 х 103 (4,2 х 10"5) 9,8 х 107 2,4х 105 (4,7 х 10°)

ан.о. - спор не обнаружено.

Аналогичный результат был получен при анализе штамма ВЬ 16-13. Культуральная жидкость и осадок споровых культур штаммов ВЬ 16-13 и ЬАТ 006 имели одинаковый уровень токсичности для личинок Ли. ягерИети Значения ЬС5о культурального супернатанта были приблизительно в 10 раз меньше, чем значения ЬС50 для культуральной жидкости и осадка (табл. 4).

Ларвицидная активность кристаллов В. Шегоьрогиь. Споры и кристаллические включения штамма 5. Шегозрогш ЬАТ 006 были разделены при центрифугировании в нелинейном градиенте плотности бромида натрия. В результате была получена фракция, содержащая только кристаллы. Фракция очищенных кристаллов обладала токсичностью для личинок комаров Ае. ае^урй и Ап. $ХерЬет\ (табл. 5).

Молекулярный вес белков, входящих в состав кристаллов штаммов В. \aterosporus. Определение молекулярной массы белков, входящих в состав очищенных кристаллов штаммов В. ШегоБрогия в условиях, исключающих протеолиз, выявило наличие в кристаллах штаммов В. ШегоБрогш ВЬ 16-92 и ЬАТ 006 одного мажорного пептида с молекулярной массой 68 кДа, а в кристаллах штамма ЬАТ 011 одного белка 128 кДа.

Суммарные данные о физико-химических и ларвицидных свойствах кристаллов В. ¡шегоэрогиз представлены в таблице 5.

Таблица 5

Характеристика кристаллов ВгеугЬасШт Шегоярогт*_

Штамм Вид кристаллов на плоскости Размер кристаллов, мкм х мкм ЬС50 очищенных кристаллов, мкг/мл Молекулярный вес белков, кДа

АпорИе/ея $1ер1\ет1 /\edes ае®>рП

ЬАТ 006 □ ЕЗ 0,2 х 0,7 0,4 х 0,4 0,005 0,003 68

ВЬ 16-92 О 0,4 х 0,3 2,0 4,0 68

ВЬ 16-13 о 0,7 х 0,5 Н.д.6 Н.д. Н.д.

ЬАТ 011 о 0,5 х 0,2 0,5 Н.д. 130

а - штаммы культивировали: ЬАТ 006 - среда Мскегеоп, 37°С, 96 ч; ВЬ 16-92, ВЬ 16-13 - среда ВР, 30°С, 96 ч; ЬАТ 011 - среда ВР, 37°С, 96 ч;6 - нет данных.

Представленные данные свидетельствуют, что удельная ларвицидная активность кристаллов штамма В. Шеговрогт (3-5 нг/мл) сравнима с активностью кристаллов B.thuringiensis и В. вркаепсш, что позволяет рекомендовать В. Шегозрогиз в качестве потенциальных продуцентов биологических средств борьбы с комарами.

Биоинкапсуляция кристаллов и спор В. Ыегозрогиз в простейшие организмы. Одним из недостатков биологических средств борьбы с комарами является их относительно непродолжительное остаточное действие вследствие

оседания активных компонентов на дно водоёма, адсорбцией частицами ила, органическими веществами и рядом других факторов. Ранее было показано, что инкапсуляция инфузорией Т. руг'фгт'к бактерий В. 1кигт&еюг* (ВП) и В. врЪаепст усиливает их ларвицидный эффект. Исходя из этого, в настоящей работе было изучено взаимодействие простейших Т. руп/огт^э и Е. то$Ико\\<;ки с бактериями В. Шегоърогт.

Для выполнения работы был выбран кристаллообразующий штамм В. \aterosporus ЬАТ 006. Фракции очищенных спор и кристаллов, атакже исходную споро-кристаллическую массу ЬАТ 006 (среда ВР, 37°С, 96 ч) использовали для экспериментов. Предварительно было установлено, что фракции очищенных спор и кристаллов, а также исходной споро-кристаллической массы ЬАТ 006 не оказывали токсического действия на клетки Т. руг'^огт'и и Е. тояИкохэки (табл. 6).

Таблица 6

Действие фракций культуры штамма ЬАТ 006 на клетки простейших

Время, часы Выживаемость простейших, %

Контроль Водная суспензия спор и кристаллов Очищенные кристаллы Очищенные споры

Т* т4 Е** Т Е** Т* Е**

0 100 100 100 100 100 100 100 100

2 110 104 103 107 97 103 93 106

24 150 112 163 111 195 107 117 113

48 160 121 130 118 200 125 113 120

*Т. руп/огтгз; **Е. товИкохвкП.

Далее мы использовали метод биоинкапсуляции для оценки ларвицидного действия В. Шегоярогиз (табл. 7). Споро-кристаллическая масса В. Шегоэрогт для биоинкапсуляции содержала в 1 мл 1-ЗхЮ6 спор ЬАТ 006 (1,0-1,2 мкгобщего белка) и 1,5-2,0х104 клеток Т. руп^гт'и. Смесь для биоинкапсуляции очищенных спор В. ШегоБрогт содержала в 1 мл 1-ЗхЮ7 спор ЬАТ 006 и 1,3-1,5х104 клеток Т. руп}отйБ. Смесь для биоинкапсуляции очищенных кристаллов ЬАТ 006 содержала в 1 мл 0,9-1,0 мкг общего белка и 1,5-2,0x104 клеток Т. руг1/огт1.1. В опытах по биоинкапсуляции смеси споро-кристаллической массы, очищенных спор и кристаллов ЬАТ 006 с инфузорией инкубировали в течение 2 ч при температуре 25°С и перемешивании. После этого смеси В. \aterosporus - Т. руг'^отш добавляли в тест-сосуды с личинками III возраста Комаровой. ьгеркепы. В контрольные сосуды с личинками Ап. з1ерЪет\ добавляли не инкапсулированные образцы В. \aterosporus. Гибель личинок Ап. ¿¡ерИеп.^ подсчитывали через 2 ч, 5 ч, 18 ч, 24 ч и 48 ч после обработки образцами В. Шего^рогт.

Как следует из табл. 7, биоинкапсуляция споро-кристаллической суспензии ЬАТ 006 в клетки Т. руг'фгтЬ значительно повышала ее ларвицидную активность по сравнению с не инкапсулированным образцом (ЬС50- 0,012 мкг общего белка/мл и 0,040 мкг общего белка/мл, соответственно, после 48 ч

контакта с личинками комаров). Аналогичное усиление наблюдалось при биоинкапсуляции очищенных кристаллов по сравнению с не инкапсулированным образцом (ЬС50 - 0,003 мкг общего белка/мл и 0,022 мкг общего белка/мл, соответственно). Очищенные споры штамма ЬАТ 006 как в отдельности, так и после инкапсуляции не оказывали ларвицидного эффекта на Ап. ¿/ер/гегш.

Таблица 7

Действие разных фракций ЬАТ 006, инкапсулированных в Т.руг'фгт'к

Образец ЬС50а

24 ч 48 ч

Разведение исследуемого образца ЬАТ 006 Белок в образце ЬАТ 006, мкг/мл Разведение исследуемого образца ЬАТ 006 Белок в образце ЬАТ 006, мкг/мл

Споро- кристаллическая суспензия (СКС) СКС+ инфузория 3,1х10"2 (1,8х10"2-6,0х10"2) 2,4x10"3 (1,8х10"3-4,9х103) 3,090 0,237 4,3x101.. (2,Зх10-4-9,0х10-4) 1,0х10"4 (ихКГ'-г^хЮ-4) 0,040 0,012

Очищенные кристаллы Очищенные кристаллы + инфузория 1,2x10"2 (4,4х10"3-8,1х10"2) 2,4x10"4 (1,3x10 "4-1,6х10"4) 1,163 0,024 2,4x10"4 (1,Зх10"4-5,6х10"4) 1,9x10-5 (1,4х10"5-2,6х105) 0,024 0,003

Очищенные споры Очищенные споры + инфузория _ь - - -

а- значения ЬС50 рассчитаны с помощью программы РгоЬк (в скобках указаны значения 95%-ного доверительного интервала); ь- нет гибели.

Аналогичные эксперименты были поставлены с клетками Е. тозИкоуэкИ (табл. 8). Смесь для биоинкапсуляции споро-кристаллической массы В. Шего$рогт содержала в 1 мл 1-ЗхЮ6 спор ЬАТ 006 (1,0-1,2 мкг общего белка) и 1,0-1,3x104 клеток Е. тозИкоуякИ. Смесь для биоинкапсуляции очищенных спор В. 1а1еговрогт содержала в 1 мл 1-ЗхЮ7 спор ЬАТ 006 и 1,0-1,Зх104 клеток Е. тоьк^зкп. Смесь для биоинкапсуляции очищенных кристаллов ЬАТ 006 содержала в 1 мл 0,9-1,0 мкг общего белка и 1,0-1,Зх104 клеток Е. тоъЬког.чкИ. инкубацию споро-кристаллической массы, очищенных спор и кристаллов ЬАТ 006 с амебой проводили так же, как с Т. руп/огтк.

Как следует из табл. 8, биоинкапсуляция в клетки Е. тохИкоувки споро-кристаллической суспензии и очищенных кристаллов усиливала ларвицидное действие на личинки комаров. Очищенные споры штамма ЬАТ 006 как до, так и после инкапсуляции в клетки Т. руг^огт'гя и Е. тохИко\'.чкИ не обладали ларви-цидной активностью против личинок комаров Ап. ьгерЪет'х.

Таблица 8

Действие разных фракций ЬАТ 006, инкапсулированных в ЕмюзИкох^ки

Образец

ЬС50а

24 ч

Разведение исследуемого образца ЬАТ 006

Белок в образце ЬАТ 006, мкг/мл

48 ч

Разведение исследуемого образца ЬАТ 006

Белок в образце ЬАТ 006, мкг/мл

Споро-

кристаллическая суспензия (СКС) СКС + Амеба

Очищенные кристаллы Очищенные кристаллы + амеба

Очищенные споры Очищенные споры + амеба

2,6x10

)

6,Зх10"3

(1,1х10"2-5,2х10"2)

(1,5х10"3-1,0х10"2)

2,560 0,626

3,8x10 (г.зхкГЧохкг4)

2,6x10"4 (ибхЮ^-З^хЮ"4)

1,1x10 (в.ЗхЮ-'-ивхЮ-4)

1.8Х10-4 (8,6х10-'-4,7х10"4)

1,130 0,018

2,9x10 (в.вхЮ-'-ЗЛх^14)

5,1х10"5 (1,6х10"5-2,4х105)

0,045

0,026

0,028 0,005

У11У ^ м " I | ■ ----

- значения ЬС5о рассчитаны с помощью программы РгоЬк (в скобках указаны значения 95%-ного доверительного интервала); - нет гибели.

Время, необходимое для гибели 50 % личинок до и после инкапсуляции образцов В. 1а1его.чрогш амебой Е. то.чкко\'кИ и инфузорией Т. руфгтЬ составляло для споро-кристаллической смеси - 18, 7 и 5 часов; для суспензии очищенных кристаллов также 18, 7 и 5 часов, соответственно (табл. 9).

Таблица 9

Время, необходимое для 50%-ной гибели (ЬТ50) личинок Ап. я?ер/»еи5ч"

Простейшие

Т. руг1(огтЬ

ЬТ50, ч

споро-кристаллическая

суспензия ЬАТ 006

без

инкапсуляции

инкапсуляция

очищенные кристаллы ЬАТ 006

без

инкапсуляции

инкапсуляция

Е. тоьЪкоуки

Таким образом, показано, что при инкапсуляции токсинов В. 1а1его$рогш в простейшие - инфузории и амёбы - помимо сокращения времени гибели личинок комаров в 2,5-3,5 раза, происходит снижение летальных концентраций споро-кристаллической массы и кристаллов В. Ыегозрогш для личинок комаров (в 2-3 раза и 6-8 раз, соответственно). По всей вероятности, в инфузориях скапливается

значительное количество спор и кристаллов В. laterosporus, что приводит к усилению ларвицидного эффекта этих бактерий. Метод биоинкапсуляции может использоваться для повышения эффективности инсектицидов, создаваемых на основе В. laterosporus и других видов энтомопатогенных бактерий.

Антимикробная активность В. laterosporus. Известно, что наличие антагонистических свойств обеспечивает микроорганизмам селективные преимущества во взаимоотношениях с другими представителями окружающей микрофлоры. Учитывая экологическую нишу В. laterosporus (почва, вода, насекомые), возможно проявление антагонизма этих бактерий в отношении других бактерий, занимающих ту же самую нишу. Сведения об антагонистических свойствах штаммов В. laterosporus в отношении представителей своего вида в литературе отсутствуют, а в отношении других видов микроорганизмов немногочисленны. В связи с этим представляло интерес исследовать антимикробную активность 16 природных изолятов В. Igterosporus в отношении представителей своего вида бактерий, других видов Bacillus, ряда грамположительных и грамотрицательных фито-патогенных бактерий, цианобактерий и эукариотических организмов (грибов).

Были использованы 48-ч жидкие культуры штаммов В. laterosporus, полученные на среде NBY. Активность исследованных штаммов В. laterosporus определяли методом капель и методом диффузии из лунок в агаре. При оценке антимикробной активности штаммов В. laterosporus у них был выявлен широкий спектр действия, распространяющийся на бактерии своего вида, другие виды Bacillus, таксономически отдаленные грам (+) и грам (-) бактерии {Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Sarcina, Brevibacterium, Corynebacterium), грам (-) фитопатогенные бактерии Xanthomonas ssp. и Envinia herbicola, грам (-) бактерии Pseudomonas, Escherichia, Klebsiella; цианобактерии (Anabena, Nostoc, Microcystis aeruginosa), эукариотические микроорганизмы (дрожжи С. albicans, S. cerevisiae), фитопатогенные грибы. Шесть штаммов В. laterosporus - LAT 002,003,004,006, 16-92 и 16-52 - обладали наиболее широким спектром антагонистического действия в отношении как родственных, так и не родственных микроорганизмов.

Антагонистическая активность В. laterosporus в смешанной культуре. Антагонистическая активность сообщает клеткам селективное преимущество, которое может проявиться и иметь биологическое значение при совместном культивировании микроорганизмов, например, при колонизации кишечника. Так, некоторые штаммы В. laterosporus используют для получения препаратов пробиотиков, которые применяют при лечении заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника человека (U.S.Pat.No. 5,455,021 ;1995). В связи с этим представляло интерес определить антагонистическую активность штамма В. laterosporus BL 16-52 по отношению условно-патогенным бактериям В. cereus Strr при смешанном культивировании в жидкой среде. С этой целью обе культуры смешивали в различных соотношениях и культивировали в жидкой среде. На разных сроках совместной инкубации определяли соотношение бактерий путем высева разведений смешанной культуры на агар без антибиотика и агар с антибиотиком. Результаты совместного культивирования штаммов В. laterosporus BL16-52 и В. cereus 569 Strr представлены в табл. 10.

Таблица 10

Селективное преимущество штамма ВЬ 16-52 при смешанном культивировании в жидкой среде_

Соотношение ВС: В. сегет В. сегеш, КОЕ/мл

0ч 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч

0:1 1.6х105 1.0x108 8.0x10' 7.5x10' 6.0x10'

200:1 1.6x10' 5.0x10' 5.8х107 2.7x10' 8.0х106

20:1 1.6х105 2.0х104 1.0x10' - -

2:1 1.6x105 - - - -

Показана способность штамма В. \aterosporus ВЬ 16-52 ингибировать рост бактерий В.сегет 569 при смешанном культивировании. Максимальное ингибирующее действие В. \aterosporus ВЬ 16-52 против бактерий В.сегеиэ 569 во время совместного культивирования наблюдается при соотношение антагонист: патоген, равном 1:2. В этом случае происходит полное подавление роста бактерий В. сегеш штаммом ВЬ 16-52 через 24 ч совместной инкубации и в смеси присутствуют только клетки В. \aterosporus (1x107 КОЕ/мл). То есть, обнаружено селективное вытеснение из смеси бактерий культуры В. сегеш 569 штаммом ВЬ 16-52 в ходе совместного культивирования, обусловленное антагонистическим действием В. \aterosporus. При соотношении ВЫ6-52\B.cereus 569 20:1 наблюдается постоянное с начала инкубации снижение титра В. сегеиэ, а через 72 ч со-культивирования происходит полное ингибирование роста. Более низкое соотношение ВЫ6-52:В.ст?г« 569 (1:200) незначительно снижает ростВ.сега«, но количество клеток 569 не достигает уровня контроля в процессе культивирования (с 24 по 96 ч). Бактерии В. сегет не оказывают подавления роста ВЬ 16-52 при совместном культивировании.

Характеристика антагонистических факторов В. Шегозрогш. Широкий спектр антимикробной активности, выявленный у исследованных штаммов В. Шеговрогт, может быть обусловлен действием факторов различной природы. Ингибирующая активность В. \aterosporus против своего вида бактерий может быть связана с продукцией веществ типа бактериоцинов, умеренными фагами, индуцируемыми спонтанно из лизогенной культуры, дефектными фагами. Антагонистическая активность штаммов В. \aterosporus в отношении таксономи-чески отдаленных грам (+) бактерий, грам (-) бактерий и эукариотических микроорганизмов может быть связана с синтезом антибиотика. Таким образом, наблюдаемый спектр антагонистической активности штаммов В. ШегоБрогш может быть результатом суммарного эффекта бактериоцина(ов) или бактериоциноподобных веществ и антибиотика(ов).

Бактериоциногенный фактор В. ШегоБрогиэ. При выявлении природы ингибирующих факторов штаммов В. \aterosporus было показано, что материал, экстрагированный из зон подавления чувствительных культур, не перевивается на этих культурах и при конечных разведениях отдельные негативные колонии, характерные для фагов, не выявляются. Эти данные свидетельствовали против возможности действия вирулентного фага(ов) в качестве антагонистического фактора исследованных штаммов В. 1мего$рогт. Электронно-микроскопический

анализ материала из зон лизиса нескольких штаммов В. laterosporus показал наличие фагоподобных структурированных элементов различной морфологии.

В результате очистки и концентрирования структурированных элементов штамма 16-92 в градиенте плотности хлористого цезия была получена одна видимая полоса. При электронно-микроскопическом исследовании в образце обнаружены структурные элементы фагов. Проверка антагонистической активности концентрированного препарата показала, что он образует зоны ингибирования только на газонах индикаторных культур В. laterosporus и других видов Bacillus (В. megaterium, В. thuringiensis ssp. tohvorthi, В. thuringiensis ssp. israelensis 1-5, В. thuringiensis ssp. galleriae 69-6, B. sphaericus).

Под действием трипсина (1 мг/мл) или проназы (1 мг/мл) в течение 18 ч при 37°С, ингибирующий фактор BL 16-92 инактивировался на 50% и 70%, а при прогревании при 100°С в течение 5 мин полностью утратил активность в отношении индикаторной культуры, LAT 011 (была выбрана как наиболее чувствительная) (табл. 11). Полученные данные позволяют предположить белковую природу антибактериального фактора.

Таблица 11

Чувствительность антибактериального фактора штамма BL 16-92

к обработке протеазами и нагреванию

Образец Ингибирующая активность

Общая, ед Выход Инактивация

Сконцентрированный и очищенный 15000 100 % -

препарат

Обработка протеолитическими

ферментами:

трипсин (1 мг/мл, 18 ч, 37°С) 5000 50% 50%

проназа(1 мг/мл, 18 ч, 37°С) 7000 30% 70%

Термическая обработка (100°С, 5 мин) 0 0% 100 %

Электронно-микроскопическое исследование семи других очищенных препаратов антагонистических факторов, продуцируемых штаммами LAT 001, LAT 002, LAT 003, LAT 006, LAT 011, BL 16-13 и BL 16-932 показали, что все они содержат морфологические частицы, напоминающие какие-либо структурные элементы фагов. Факторы этих штаммов образуют зоны ингибирования на газонах индикаторных культур В. laterosporus. Вероятнее всего, обнаруженные структуры являются продуктами морфогенеза дефектных фагов, проявляющими свойства бактериоцинов. Это, однако, не исключает продуцирование штаммами В. laterosporus простых полипептидных бактериоцинов.

Антибиотический комплекс Я laterosporus, выделенный из штаммаBL 1652 обладал антагонистической активностью в отношении представителей видов Bacillus и грам (+) бактерий 5. aureus, Е. faecium и Streptococcus ssp. в концентрации 15 мкг/мл и не был активен в отношении грам (-) бактерий Pseudomonas, Xanthomonas и Е. coli. Антибиотический комплекс не обладал активностью в отношении указанных грам (-) бактерий даже в концентрации 400 мкг/мл.

В выделенном комплексе присутствуют три антибиотика, из которых два идентифицированы. Первый представляет собой ранее запатентованный антибиотик лолоатин А (и.Б.РаЮгП N0.5,962,407; 1999), второй - новый антибиотик. Латероцидин представляет собой белое аморфное твердое вещество, имеющее формулу [цикло-(Ь-вал-Ь-орн-Ь-лей-П-тир-Ь-про-Ь-фен-0-фен-Ь-асн-Ь-асп-Ь-лей)] и молекулярную массу 1224,4 Д. Латероцидин растворяется в метаноле, этаноле, других высших спиртах, не растворяется в воде. Природа третьего антибиотика не установлена. Минимальные ингибирующие концентрации латероцидина и лолоатина для некоторых грам (+) и грам (-) бактерий представлены в табл. 12.

Таблица 12

Минимальные ингибирующие концентрации латероцидина и лолоатина

Тест-микроорганизмы_Латероцидин_Лолоатин А (12)

Грам (+) бактерии:

Staphylococcus ssp. 4 2-4

Staphylococcus aureus 13-15 2-4

Streptococcus ssp. 0,2 <1

Enterococcus ssp. 2 2-4

Enterococcus faecium 2 2-4

Грам (-) бактерии:

Pseudomonas aeruginosa >100 >100

Pseudomonas mendocina >100 >100

Xanthomonas ssp. >100 >100

Escherichia coli >100 >100

Данные, приведенные в таблице 12, показывают, что латероцидин обладает высокой антагонистической активностью по отношению к бактериям групп стрептококков, стафиллококков и энтерококков. Величины МИК латероцидина близки значениям МИК лолоатина А. Значения МИК выделенного нами лолоатина А полностью совпадают со значениями, определенными ранее для этого антибиотика (U.S.Patent No.5,962,407, 1999).

Таким образом, штамм В. laterosporus BL 16-52 продуцирует комплекс из трех пептидных антибиотиков, один из которых - латероцидин - является новым циклодекапептидом, обладающим высокой активностью в отношении грам (+) бактерий S. aureus, E.faecium и Streptococcus ssp.

Оценка гемолитической активности В. laterosporus. Для бацилл характерна способность к синтезу гемолизинов. Гемолизины обнаружены у ряда бацилл В. cereus, В. thuringiensis, В. subtilis (Alouf, 1980; Billington et al., 2000). Гемолизины В. thuringiensis могут действовать как факторы, усиливающие энтомоцидный эффект этих бактерий. У В. laterosporus обнаружен тиолактиви-руемый цитолизин (гемолизин) - латероспоролизин, который образует поры в мембранах эукариотических клеток и приводит их к лизису (Billington et al., 2000). Иногда наличие гемолитической активности может лимитировать использование штаммов в прикладных целях. Для полной характеристики энтомопатогенных

штаммов В. laterosporus, наряду с другими свойствами, представлялось необходимым определить их гемолитическую активность.

Показано,, что все исследованные штаммы В. laterosporus при росте на кровяном агаре, содержащем эритроциты человека (5 %) образуют зоны лизиса зеленоватого цвета (табл. 13). Такая окраска при гемолизе характерна для действия гемолизинов а-типа у В. cereus, S, aureus и других видов микроорганизмов. Удалось наблюдать феномен тепло-холодового гемолиза, т.е. зоны стали четче и стала более явной зеленая окраска. Возможно, что гемолизин BL напоминает сфингомиелиназу.

Таблица 13

Гемолитическая активность штаммов В. laterosporus_

Штамм Окрашивание агара Тип гемолиза3 Гемолитическая активность6'", ГЕ/мл

Эритроциты человека (5%) Эритроциты крысы (5%)

L AT 001 Зелено-коричневое а 4 6

LAT 002 Зелено-коричневое а 3 6

LAT 003 Зелено-коричневое а 20 48

LAT 004 Окрашивания нет Р 3 32

LAT 005 Зелено-коричневое а 12 5

LAT 006 Зелено-коричневое а 2 2

LAT 007 Окрашивания нет Р - 2

LAT 008 Зелено-коричневое а 1 4

LAT 009 Окрашивания нет Р 6 40

LAT 010 Зелено-коричневое а - 1

LAT 011 Зелено-коричневое а 30 32

BL 16-92 Зелено-коричневое а 24 16

BL 16-13 Зелено-коричневое а 24 8

BL 16-52 Зелено-коричневое а 32 64

BL 16-931 Зелено-коричневое а 12 24

BL 16-932 Зелено-коричневое а 16 32

"Определяли на кровяном агаре, содержащем эритроциты человека (5%); бШтаммы культивировали в жидкой среде ИВУ 72 ч при 30 °С; "Использовали метод спектрофотометрической регистрации гемоглобина.

Штаммы различались по гемолитической активности (оценивалась по титрам гемолизина) и были разделены на 3 группы - высокая гемолитическая активность 64-32 ГЕ (LAT 003, LAT 004, LAT 009, LAT 011, BL 16-52, BL 16-932), средняя 16-24 ГЕ (BL 16-92, BL 16-13, BL 16-931) и низкая 1-12 ГЕ (LAT 001, LAT 002, LAT 005, LAT 008, LAT 007, LAT 010) (табл. 12). Наиболее многочисленная группа штаммов с низкой активностью.

Было показано, что эритроциты крысы (5%) обладают большей чувствительностью к гемолизу, чем эритроциты человека (5%). Различия в гемолизе

эритроцитов крысы и человека могут быть обусловлены различиями (качественными или количественными) в химическом составе мембран (Кагава, 1985; Финеан с соав., 1977). Известно, что в мембранах эритроцитов крысы содержится больше фосфотидилхолина, чем в мембранах эритроцитов человека. В то же время в мембранах эритроцитов человека имеется больше сфингомиелина, чем в мембранах эритроцитов крысы. Таким образом, различная чувствительность эритроцитов двух видов может косвенно свидетельствовать о различном наборе гемолизинов в исследованных штаммах В. 1а1егоэроги8.

Осмотическая протекция гемолитической активности. Для выявления механизма действия гемолизинов, продуцируемых штаммами В. 1сИегозроги$ ВЬ 16-52 и ЬАТ 003, было проведено исследование зависимости гемолиза, вызываемого этими штаммами, от присутствия в среде осмопротектантов с различными гидродинамическими радиусами молекул (гс). Были использованы два вида осмопротектантов: углеводороды (г0 от 0,31 до 0,48 нм) и гликоли и поли-гликоли (г0 от 0,46 до 2,83 нм). Установлено, что добавление осмопротектантов с г0 от 0,31 до 1,2 нм к смеси эритроцитов человека (5 %) и 96-ч культур ВЬ 16-52 или ЬАТ 003 (16 усл. ед. ГА) не ингибирует гемолитическую активность исследованных штаммов В. Ыегозрогиь. Добавление ПЭГ-4000 и ПЭГ-6000 к смеси эритроцитов человека (5%) и 96-ч культур ВЬ 16-52 или ЬАТ 003 (16 усл.ед ГА) ингибирует гемолитическую активность этих штаммов (рис. 15).

100% 1 90% -80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

эритроштычеловека (5%)+ сапошш(0.04%)

культура ВЬ 52 (1/1б)и эрнтрошпы человека (5%)

культура В1-52 (1.16). эритроциты человека (5%) и осмспрогектанга (глнкош и политликоли (3 0 мМ)

—— спонтанный гемолиз

Осмопротекганты и радиусы их молекул(нм)

Рис. 15. Зависимость гемолиза эритроцитов человека, вызываемого действием штамма В. \aterosporus ВЬ 16-52 от действия осмопротектантов.

Таким образом, исследованные штаммы В. laterosporus обладают гемолитической активностью in vitro в разной степени. Гемолиз эритроцитов, вызываемый В. laterosporus in vitro может быть ингибирован действием осмопротектантов с гидродинамическими радиусами молекул более 2 нм.

Исследованные штаммы В. laterosporus имеют широкий спектр антагонистического действия. Чувствительность к В. laterosporus различных тест-объектов указывает на высокую биоцидную активность этой группы бацилл. Антагонистическое действие Я laterosporus является многофакторным и включает участие антибиотиков, бактериоцинов, ферментов.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные штаммы В. laterosporus по своим культурально-биохими-.. ческим свойствам соответствуют группе Bacillus, относящихся к Brevibacillus laterosporus.

2. Впервые показана способность некоторых из исследованных штаммов В. laterosporus к синтезу кристаллов.

3. Впервые дана морфологическая характеристика кристаллообразующих штаммов В. laterosporus.

4. Очищенные кристаллы В. laterosporus обладают москитоцидной активностью.

5. Впервые определены молекулярные массы белков, входящих в состав кристаллов В. laterosporus.

6. Исследованные штаммы В. laterosporus обладают широким спектром антагонистического действия за счет синтеза антибиотиков и бактериоцинов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Орлова М.В., Смирнова Т. А., Шамшина Т.Н., Константинова Г.Е., Азизбекян P.P. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus. - IV Конференция Российской Федерации. Новые направления биотехнологии. - Пущино. -1994. -С.35.

2. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н., Коваленко H.A., Азизбекян P.P. Антибактериальная активность Bacillus laterosporus. Биотехнология. -1995. - N. 12, с. 22-26.

3. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Григорьева Т. М., Шамшина Т.Н., Николаенко М. А., Азизбекян P.P. Антагонистические факторы Bacillus laterosporus. Конференция ГНИИгенетика. 1995.

4. Orlova M.V., Smirnova Т.А., Т. N. Shamshina, N. A. Kovalenko, Azizbekyan R.R. Plural biological activity of Bacillus laterosporus. 10-th International Conference on Global Impacts of Applied Microbiology and Biotechnology. Elsinore, Denmark. 1995.

5. Smirnova T.A., Minenkova I.B., Orlova M.V., Lecadet M.-M. and Azizbekyan R.R. The crystalforming strains of Bacillus laterosporus. 1996. Res. microbiol. 147,343-350.

6. Смирнова Т. А., Поглазова М.Н., Орлова М.В., Азизбекян P.P. Ультраструкгура спор и кристаллов Bacillus laterosporus. 1997. Биотехнология. - № 1, с. 29-36.

7. Орлова М. В., Смирнова Т. А., Ганушкина JI. А., Азизбекян Р. Р. Инсектицидная активность кристаллообразующих штаммов Bacillus laterosporus. Конференция ГНИИгенетика. 1997.

8. Orlova М. V., Т. A. Smirnova, L. A. Ganyshkina, V. Y. Yacubovich, R. R. Azizbekyan. Insecticidal activity of Bacillus laterosporus. 1998. Appl. Environ. Microbiol. 64:2723-2725.

9. Azizbekyan R. R., Orlova M. V., Ganyshkina L. A., Lebedeva N. N. Larvicidal activity of non-crystalforming strains of Bacillus laterosporus. The 10th International Conference on Bacilli. Baveno, Italy. 1999.

10. Азизбекян P.P., Смирнова Т. А., Николаенко M. А., Кузин А.И., Шамшина Т.Н., Орлова М.В., Глез В.М., Деревягина М.К., Свентицкий Е.Н., Дронова Н.В. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus, обладающий широким спектром фунгицидного действия и биологический препарат для защиты клубней-картофеля от грибных заболеваний в период хранения. Патент РФ №2242125, 2001.

11. Орлова М.В., Смирнова Т.А., Азизбекян P.P. Штаммы Bacillus, обладающие антагонистической активностью в отношении дрожжеподобных грибов Candida albicans. Успехи медицинской микологии, Москва, 2003, том 1, с. 104-105

12. Азизбекян P.P., Овчинникова Т.В., Шамшина Т.Н., Тагаев А.А., Смирнова Т.А., Якименко З.А., Кузнецова Н.И., Арсеньев А.С., Кузин А.И., Соболь А.Г., Юрлова М.В. Циклодекапептидный антибиотик широкого спектра антагонистического действия латероцидин, штамм бактерий Brevibacillus laterosporus, обладающий широким спектром антагонистического действия - продуцент латероцидина. Патент РФ № 2229520 (2004.05.27).

13. М. V. Zubasheva, L. A. Ganushkina, Т. A. Smirnova, and R. R. Azizbekyan. Larvicidal activity of crystal-forming strains of Brevibacillus laterosporus. Applied Biochemistry and Microbiology, 2010, Vol. 46, No. 8, pp. 755-762.

14. M. V. Zubasheva, L. A. Ganushkina, T. A. Smirnova, and R. R. Azizbekyan. Enhancement of larvicidal activity of Brevibacillus laterosporus by bioincapsulation in protozoa Tetrahymenapyriformis and Entamoeba moshkovskii. Applied Biochemistry and Microbiology, 2011, Vol. 47, No. 8, pp. 762-766.

15. Смирнова T.A., Шевлягина H.B., Николаенко M.A., Сорокин В.В., Зубашева М.В., Ганушкина JI.A., Азизбекян P.P. Характеристика спор и кристаллов Brevibacillus laterosporus. Биотехнология, 2011, № 6, с. 29-37.

* - 12.11.2003 года сменила фамилию на Зубашеву в связи с регистрацией брака.

Подписано в печать: 23.04.2012 Тираж: 100 экз. Заказ №806 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.74, корп.1 (495) 790-47-77; vvww.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зубашева, Маргарита Владимировна, Москва

61 12-3/928

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Зубашева Маргарита Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВПЕУШАСШт ЬАТЕКОЗРОШЗ

И ПРОДУЦИРУЕМЫХ ИМИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальность 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Азизбекян Рудольф Рубенович

Москва - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Энтомопатогенные бациллы, активные против представителей Díptera.......9

1.2. Brevibacillus laterosporus..................................................................9

1.2.1. История открытия и таксономия...................................................9

1.2.2. Дифференциально-диагностические признаки.................................14

1.2.3. Энтомопатогенные свойства.......................................................16

1.2.4. Биологически активные соединения и факторы патогенности.............19

1.2.5. Генетическое разнообразие внутри вида........................................25

1.3. Bacillus thuringiensis

1.3.1. Таксономическая характеристика и классификация Bacillus

thuringiensis.....................................................................................27

1.3.2. Токсинообразование Bacillus thuringiensis.....................................32

1.3.2.1. Характеристика и классификация ларвицидных 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis.............................................................33

1.3.2.2. Молекулярная организация и способ биологического действия 5-эндотоксинов...................................................................40

1.3.2.3. Характеристика Vip-токсинов Bacillus thuringiensis..................46

1.4. Энтомопатогенные бациллы Bacillus sphaericus....................................47

1.4.1. Таксономия, классификация и дифференциально-диагностические признаки ларвицидных штаммов Bacillus sphaericus.........................47

1.4.2. Токсинообразование Bacillus sphaericus.........................................56

1.4.2.1. Mtx-токсины Bacillus sphaericus............................................57

1.4.2.2. Кристаллические токсины Bacillus sphaericus..........................62

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................................74

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................87

3.1. Характеристика энтомопатогенных штаммов В. laterosporus

3.1.1. Культурально-биохимические свойства.............................................88

3.1.2. Морфологическая харатеристика...................................................90

3.2. Инсектицидная активность штаммов В. \aterosporus..............................106

3.3. Ларвицидая активность кристаллообрзующих штаммов В. Шегоярогш.... 110

3.3.1. Оптимизация условий споро- и кристаллообразования ВЬ..................110

3.3.2. Динамика синтеза и локализация ларвицидного фактора...................113

3.3.3. Характеристика ларвицидных кристаллов В. Шегозрогт..................115

3.3.4. Биоинкапсуляция ларвицидных токсинов В. Шгегоярогт..................118

3.4. Антагонистическая активность штаммов В. Шеговрогш.........................123

3.4.1. Спектр антагонистической активности........................................124

3.4.2. Антагонистическая активность в смешанной культуре.....................124

3.4.3. Характеристика антагонистических факторов ВЬ............................126

3.4.3.1. Бактериоциногенный фактор..............................................127

3.4.3.2. Антибиотический комплекс..............................................130

3.5. Оценка гемолитической активности штаммов В. Шего$рогт.................132

3.6. Осмотическая протекция гемолитической активности..........................134

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................................................136

ВЫВОДЫ..............................................................................................138

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................139

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы в связи с бурным развитием биотехнологии и задачами обеспечения экологических условий жизни и производства усиливается интерес к спорообразующим бактериям. Главными объектами фундаментальных и прикладных исследований на протяжении многих лет были бактерии Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis. Штаммы В. subtilis используются как продуценты ферментов и как пробиотики, бактерии В. thuringiensis и В. sphaericus являются практически уникальными продуцентами биологических средств защиты растений. Между тем, исследования последних лет свидетельствуют, что имеются бациллы, обладающие рядом ценных в прикладном смысле характеристик. Среди них важное место занимают бактерии Brevibacillus laterosporus (прежнее название - Bacillus laterosporus). Показано, что бациллы В. laterosporus (BL) способны к синтезу ферментов, инсектицидных факторов (Favret and Yousten, 1985; Rivers et al., 1991; Ruiu et al., 2006), продуцируют целый спектр антагонистических факторов, в том числе, обладающих антибактериальным эффектом (Gerard et al., 1999), фунгицидной и цианолитической активностями (Barsby et al., 2002), активностью против фито- и зоонематод и моллюсков (Singer at al., 1997; de Olivera et al., 2004; Huang et al., 2005; Bayon et al., 2007), применяют в качестве эффективных пробиотиков (Sanders et al., 2002; Desjardine et al., 2007; Сорокулова и др., 2007), в медицине (Youshida et al., 1991).

Одной из актуальных задач биотехнологии и экологии является развитие эффективных и экологически безопасных биологических методов борьбы с вредными насекомыми отряда Díptera. Насекомые отряда Díptera (комары родов Aedes, Anopheles, Culex и черные мушки Simulium vittatum) представляют собой существенную угрозу для здоровья людей во многих частях мира вследствие их способности переносить возбудителей серьезных инфекционных заболеваний, таких как малярия и лимфатический филяриоз, а также ряда вирусных инфекций (энцефалит, денге, онкоцерциоз и др.). Эти насекомые угрожают более чем трем миллиардам человек в тропических и субтропических регионах.

Малярия, переносимая комарами Anopheles, встречается в 100 странах, где проживает около 40 процентов населения планеты. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает малярию одной из наиболее серьезных медицинских проблем. Ежегодно 500 млн. человек заболевают малярией и приблизительно 3 млн. из них умирает. Помимо этого, каждый год 250 млн. человек инфицируется филярийными паразитами (переносится москитами Culex), и около 100 млн. человек инфицируется вирусом денге (переносится комарами Aedes). Несмотря на немалые государственные и международные усилия, направленные на борьбу с заболеваниями, вызываемыми насекомыми-переносчиками, они до сих пор представляют угрозу для здоровья населения и препятствуют социо-экономическому развитию во многих тропических странах.

Снизить заболеваемость малярией во многих тропических регионах мира позволило осуществление программ векторного контроля, основанных на использовании химических инсектицидов. Однако химические препараты отрицательно влияют на окружающую среду, загрязняют воду и продукты питания, оказывают неблагоприятное воздействие на многие нецелевые организмы и вызывают устойчивость в векторных популяциях-мишенях. Этих недостатков лишены биологические средства борьбы с насекомыми-вредителями.

По этим причинам ВОЗ поддерживает развитие более совместимых с окружающей средой биологических методов векторного контроля, включающих использование энтомопатогенных бацилл, обладающих узким спектром токсического действия и характеризующихся высокой избирательностью по отношению к насекомым-мишеням. К ним относятся два вида грамположительных почвенных бактерий Bacillus thuringiensis ssp. israelensis (Bti) и Bacillus sphaericus (Bs% которые продуцируют мощные москитоцидные белковые токсины (эндотоксины). Эти бактерии используются как промышленные продуценты для производства инсектицидных препаратов. В настоящий момент несколько продуктов на основе Bti и один продукт на основе Bs нашли применение в программах оперативного контроля переносчиков в странах с наибольшей заболеваемостью малярией (в Западной Африке, Китае, Индии, Бразилии и многих тропических странах). Кроме того,

эффективность этих продуктов привела к ежегодному увеличению их использования в США, Канаде, Азии и Европе.

Однако разработке биопестицидов на основе Bti и Bs и их коммерческому успеху по сравнению с химическими инсектицидами во многих странах препятствуют высокие эксплуатационные расходы, низкая стабильность некоторых токсинов, являющихся активными ингредиентами инсектицидов, а также низкая эффективность этих препаратов против некоторых видов переносчиков, обусловленная неодинаковой чувствительностью насекомых разных видов к специфично действующим белковым токсинам. Кроме того, за последние несколько лет появилась информация о развивающейся устойчивости в популяциях москитов к действию некоторых бактериальных токсинов. В лабораторных и полевых условиях многим исследователям удалось получить популяции комаров Culex, высоко устойчивые к различным штаммам В. sphaericus. И хотя пока не зафиксирована устойчивость комаров к В. thuringiensis ssp. israelensis в полевых условиях, уже имеются ограниченные сведения об очень низкой, медленно развивающейся устойчивости к В. thuringiensis ssp. israelensis популяций Culex и Aedes, полученных в результате лабораторной селекции с использованием клонированных Bti токсинов. При этом развитие устойчивости обратно коррелирует с числом токсинов, используемых для селекции.

Таким образом, в настоящий момент обозначилась потребность в новых, более эффективных и менее дорогостоящих бактериальных инсектицидах. Эффективность существующих энтомопатогенных бактерий может быть увеличена путем комбинации различных токсинов (из В. thuringiensis ssp. israelensis и/или новых москитоцидных бактерий) в одном организме {В. sphaericus, например). Для решения этих проблем необходим поиск бактериальных штаммов и идентификация других москитоцидных токсинов, отличающихся по структуре и способу действия от продуцируемых В. thuringiensis ssp. israelensis и В. sphaericus, а также поиск альтернативных Bti и Bs хозяев для продукции и доставки одного или нескольких ларвицидных токсинов насекомым-мишеням.

Так, недавно были открыты новые москитоцидные штаммы В. thuringiensis ssp. medellin и В. thuringiensis ssp. jegathesan, продуцирующие более активные по

сравнению с кристаллами Bti белковые эндотоксины. Это указывает на то, что велика вероятность обнаружения подобных штаммов и токсинов в природе. Кроме того, в качестве альтернативных Bti и Bs хозяев для продукции ларвицидных токсинов исследователями уже предложены несколько новых кандидатов, которые включают грамотрицательные бактерии, цианобактерии, простейшие и другие организмы. Будущие лабораторные и полевые испытания помогут установить ларвицидный потенциал новых штаммов. Кроме того, новые технологии рекомбинантных ДНК и новые трансформационные системы обеспечат отличные возможности для генетических манипуляций москитоцидными белками с целью создания бактериальных инсектицидов с улучшенными качествами. Это поможет увеличить их использование в программах векторного контроля.

В отличие от хорошо изученных энтомопатогенных видов В. thuringiensis ssp. israelensis и В. sphaericus энтомоцидные свойства и другие биологические особенности бактерий В. laterosporus изучены недостаточно. Это препятствует созданию инсектицидных препаратов на основе данного вида бактерий, а также широкому использованию В. laterosporus в различных областях биотехнологии. Вместе с тем, ограниченные сведения о наличии у В. laterosporus токсичности по отношению к представителям Diptera (личинкам комаров Anopheles stephensi, Aedes aegypti и Culex pipiens) позволяет считать вид В. laterosporus потенциальным кандидатом для биологической борьбы с двукрылыми насекомыми-вредителями.

- провести скрининг коллекции штаммов В. laterosporus, выделенных из различных географических областей с целью поиска энтомоцидных штаммов;

- дать физиолого-биохимическую характеристику исследуемых штаммов В. laterosporus;

- охарактеризовать морфологические особенности штаммов В. laterosporus;

- подобрать условия для эффективного споро- и кристаллообразования штаммов В. laterosporus;

- выделить и охарактеризовать свойства ларвицидных кристаллов штаммов В. laterosporus: определить уровень активности, молекулярные массы белков, входящих в состав кристаллов;

- оценить гемолитическую активность штаммов В. laterosporus.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Энтомопатогенные бактерии

Энтомопатогенные бактерии представляют собой группу микроорганизмов, которые встречаются в организме насекомых (Гулий и др., 1982). При этом бактерии являются основным компонентом микрофлоры кишечника насекомых. С другой стороны, они способны вызывать различные заболевания, часто сопровождающиеся септицемией. Бактериозы насекомых могут вызывать как грамотрицательные бактерии, так и грамположительные. Практически все патогенные для насекомых бактерии относятся к порядкам Bacillales, Clostridiales, Eubacteriales и Pseudomonodales. Из рода Bacillus наиболее изучены энтомопатогенные бактерии В. thuringiensis, В. sphaericus, В. popilliae, В. lentimorbus, В. firmus, В. cereus. Ведущая роль среди энтомопатогенных бактерий принадлежит В. thuringiensis (Глупов. 2001). Инсектицидные свойства Brevibacillus laterosporus изучены недостаточно.

1.2. Brevibacillus laterosporus

1.2.1. История открытия и таксономия

Brevibacillus laterosporus - аэробные, спорообразующие бактерии, впервые выделенные Уайтом (White, 1912) из больных пчел в 1912 г. и названные Bacillus orpheus. В 1916 г. эти бактерии были выделены из воды, но представлены Laubach как Bacillus laterosporus (Laubach, 1916). В 1917 г. McCray опубликовал документальное описание Bacillus orpheus, а в 1920 г. White обратил внимание на сходство спорообразующих организмов В. laterosporus и В. orpheus (White, 1920). Однако, только в 1952 г. (Smith et al., 1952) было признано, что эти два организма являются идентичными и В. orpheus присвоили название В. laterosporus. Впервые как вид В. laterosporus был представлен Smith и Gordon в 1957 г. в 7-ом издании "Руководства Берджи по определению бактерий" (Smith and Gordon, 1957). С 1964 г. типовая культура В. laterosporus именовалась Bacillus laterosporus Laubach и имела коллекционные номера АТСС 64, NCIB 9367, NCTC 6357 (Smith et al, 1964).

Поскольку описание вида В. laterosporus основывалось на небольшом числе признаков, происходило постоянное уточнение систематического положения этих

бактерий в результате более глубокого и тщательного изучения. В 1988 г. Priest et al. опубликовали полную характеристику рода Bacillus, различив у бацилл шесть кластер-групп и расположив В. laterosporus (вместе с В. cereus и В. thuringiensis) во второй из них на основе анализа по нумерической таксономии (Priest et al., 1988). Аэробные или факультативно аэробные бактерии этой кластер-группы образовывали кислоту из различных Сахаров, разлагали казеин, не усваивали крахмал и формировали овальные споры, не раздувающие спорангий (за исключением В. laterosporus). Priest et al. (1988) отметили тесное сходство основных физиолого-биохимических признаков В. laterosporus и В. cereus наряду с различием в морфологии спор этих организмов.

К 1991 г. в роду Bacillus было идентифицировано, по крайней мере, восемь филогенетических групп на основании результатов анализа последовательности гена 16S-pPHK (Ash et al., 1991-a; Farrow et al., 1992). B. laterosporus отнесли к группе "Bacillus brems" или четвертой рРНК-группе вместе с видами В. brevis, В. agri, В. centrosporus, В. choshinensis, В. parabrevis, В. reuszeri, B.formosus, В. borstelensis и В. thermoruber (Ash et al., 1991-6; Farrow et al., 1992; Rainey et al., 1994; Rössler et al., 1991, Shida et al., 1996-July). Представители этой группы обладали сходством фенотипических характеристик, хемосистематических профилей и уникальным серологическим родством консервативных специфических белков S-слоя.

В 1996 г. Shida et al. предложили переименовать кластер "Bacillus brevis" в Brevibacillus gen. nov. на основании явного филогенетического отличия представителей этого кластера от других видов аэробных спорообразующих организмов (Shida et al., 1996а). Было показано, что сходство нуклеотидных последовательностей генов 16S-pPHK типовых штаммов 10 видов бактерий из группы "Bacillus brevis" между собой составляет более 93,2 %, а с типовыми штаммами других видов из рода Bacillus - менее 91,3 %. Описание Brevibacillus laterosporus осталось идентичным описанию В. laterosporus, сделанному Claus and Berkeley (1986). Типовой штамм Brevibacillus laterosporus (Laubach 1905) comb. nov. стал именоваться JCM 2496 (= ATCC 64 - CCM 2116 = CIP 52.83 = DSMZ 25 = IFO 15654 = IAM 12455 - LMG 6931 = NCIMB 9367).

Reva et al. предложили упрощенный ключ для быстрой фенотипической идентификации природных изолятов бактерий, принадлежащих к Brevibacillus laterosporus, основанный лишь на нескольких биохимических тестах (Reva et al.,2001).

Основные характеристики кластеров Bacillus и Brevibacillus gen. nov. представлены в табл. 1.1.

Таблица 1.1

Основные характеристики кластера Bacillus и Brevibacillus gen. nov.a'6

Характеристики Brevibacillus gen. nov. Bacillus

Количество видов, входящих в кластер 10 —

Палочки: ширина, мкм длина, мкм 0,7-0,9 3,0-5,0

Форма споры Овальная Овальная или сф�

Информация о работе