Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Циклодекстрин глюканотрансферазы с альфа- и бета-специфичностями и сравнительный анализ их структуры

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Циклодекстрин глюканотрансферазы с альфа- и бета-специфичностями и сравнительный анализ их структуры"

; Г 6 од

11а правах рукописи

/ и ШОП шз

БИКБУЛАТОВА Светлана Магнитовна

ЦИКЛОДЕКСТРИН ГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ С АЛЬФА- И БЕТА-СПЕЦИФИЧНОСТЯМИ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИХ СТРУКТУРЫ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 1998

Работа выполнена в Отделе биохимии и цитохимии Уфимского научного центра Российской Академии Паук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, академик АН РБ В.А.Вахитов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.В.Чемерис

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р.Р.Ахметов, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Т.В.Маркушева

в_часов на заседании диссертациониого совета Д 084. 35. 01

при Башкирском государственном медицинском университете (450000, Уфа, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета (450000, Уфа, ул. Ленина, 3).

Ведущая организация-Институт биологии гена РАН, Москва

Защита диссертации состоится «_

1998 г.

Автореферат разослан <<_» мая 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент АН РБ

Э.Г.Давлстов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза; 1,4-а-ппоканотрансфераза, циклизующая, КФ 2.4.1.19) - это фермент, катализирующий реакцию превращения линейных цепей крахмала в особые соединения, так называемые циклические декстрины, представляющие собой замкнутые в кольца остатки глюкозы. Известны три типа циклодекстринов: а-, ß- и у-, состоящие из 6-ти, 7-ми и 8-ми остатков глюкозы, соответственно (Villiers, 1881). Практическая ценность их заключается в способности образовывать комплексы включения с широким рядом органических молекул, что существенно улучшает физико-химические и другие характеристики последних (Saenger, 1980). В связи с этим циклодекстрины широко применяются в фармацевтической, пищевой, парфюмерной, химической промышленности, в сельском хозяйстве, биотехнологии и в других отраслях (Кестнер, Пальм, 1988). ЦГТазы обнаружены в почвенных микроорганизмах, преимущественно рода Bacillus (Wilson et al., 1943), причем у разных штаммов они несколько отличаются специфичностью своего действия, превращая крахмал в смесь всех трех циклодекстринов в различных пропорциях.

Химический синтез циклодекстринов сложен, поэтому их получают исключительно конверсией крахмала под действием ЦГТаз, однако стоимость получаемых циклодекстринов пока еще достаточно высока. По этой причине ведется активный поиск штаммов-продуцентов ЦГТаз, а также клонирование и секвенирование их генов с тем, чтобы в будущем с помощью генной и белковой инженерии получить во-первых, штаммы-суперпродуценты ЦГТаз, во-вторых, сконструировать высокоспецифичные по отношению к конечному продукту ферменты.

ЦГТазы выделены из большого числа различных микроорганизмов, однако, клонировано всего 19 генов ЦГТаз. Для них определены последовательности нуклеотидов и на их основе предсказаны аминокислотные последовательности ЦГТаз (Takano et al., 1986; Binder et al., 1986; Kato, Kimura et al., 1987; Schmid et al., 1987; Kaneko et a!„ 1988; Hill et al., 1990; Nitschke et al., 1990; Sin et al., 1991; Fujiwara et al., 1992; Starnes et al., 1992; Kim, 1998). С помощью рентгеноструктурного анализа для некоторых ЦГТаз построены

модели их третичной -структуры. Показано, что эти ферменты имеют характерную доменную организацию (Hofmann et al., 1989). Предпринимаются также попытки создать химерные конструкции ЦГТаз для выявления доменов и отдельных аминокислот, ответственных за специфичность действия фермента (Kaneko et al., 1989; Lawson et al., 1994).

Однако, в настоящее время имеющиеся сведения еще не позволяют приступить к целенаправленному созданию ЦГТаз с желаемыми свойствами. В связи с этим необходимо дальнейшее изучение этих уникальных ферментов. Таким образом, клонирование и секвенирование генов ЦГТаз, а также подробный сравнительный анализ кодируемых ими белков является актуальной научной проблемой.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении структурных различий бациллярных ферментов а- и ß-ЦГТаз для выявления особенностей их организации и влияния последней на специфичность действия изучаемых ферментов.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание геномных библиотек штаммов микроорганизмов Paenibacillus macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. в векторах на основе фага лямбда и идентификация в них функционально-активных генов а- и ß-ЦГТаз.

2. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК и выведение на их основе аминокислотных последовательностей а- и ß-ЦГТаз.

3. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов ЦГТаз и аминокислотных последовательностей кодируемых ими ферментов, обладающих различной специфичностью действия, с привлечением данных по некоторым другим ЦГТазам для выявления консервативных и дивергировавших участков в молекулах ЦГТаз.

4. Выявление особенностей эволюционирования структуры ЦГГаз и их генов у микроорганизмов, продуцирующих данные ферменты.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые клонированы фрагменты ДНК, содержащие гены а- и ß-ЦГТаз, продуцирующих следующее соотношение a-, ß- и у-циклодекстринов (в %): для а-ЦГТазы 65:25:10, для ß-ЦГТазы 6:83:11, что отличает их от ранее клонированных генов ЦГТаз.

Впервые выявлены различия в структуре а-и ß-ЦГТаз, выражающиеся в. заменах и инсерциях отдельных аминокислот в высококонсервативных функционально-значимых участках молекулы ферментов.

На основе гомологии аминокислотных последовательностей всех известных ЦГТаз построено филогенетическое древо, демонстрирующее существование достаточно обособленных групп микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз. Показано, что все сравниваемые a-, ß- и у-ЦГТазы из микроорганизмов родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus и Thermoanaerobacter имеют одного общего предка и являются результатом дивергенции, тогда как происхождение ЦГТазы Klebsiella pneumoniae имеет независимый и в то же время конвергентный характер.

Полученные нами результаты расширяют представление об организации и эволюции структуры генов ЦГТаз, а также способствуют более полному пониманию различий в функционировании данных ферментов. Они могут быть использованы в исследованиях по конструированию ферментов ЦГТаз с заданными свойствами.

Положения, выносимые на защиту

1. ЦГТазы с одинаковой специфичностью действия, относящиеся к одной ipynne, имеют высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей; ферменты с a-, ß- и у-епецифичностями имеют между собой гомологию аминокислотных последовательностей на уровне 50-65%.

2. Лидерный пептид ЦГТаз может служить критерием внутривидового родства микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз.

3. Наиболее существенные различия между а- и ß-специфичными ЦГТазами наблюдаются в А-домене.

4. Большинство известных ЦГТаз имеют общего предка и являются результатом дивергенции.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной конференции биохимического общества РАН, посвященной памяти академика А.Е. Браунштейна (С.-Петербург, 1992); на конференции молодых ученых УНЦ РАН (Уфа, 1994) и Международной конференции

«Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в трех печатных ■ работах, а также депонированы в международных банках данных The EMBL : Nucleotide Sequence DataBase, GenBank и SWISS PROT. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов , исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающей 165 названий, в том числе 152 работы иностранных авторов, i Работа изложена на 146 страницах и содержит 40 рисунков и 9 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В данной работе использованы микроорганизмы видов Paenibacillus macerans ИБ-7, а также Bacillus sp. 6.6.3., выделенные из почв Башкортостана и предоставленные нам для исследований сотрудниками Института биологии УНЦ ! РАН Мелентьевым А.И., Усановым Н.Г. и Логиновым О.Н. Необходимо отметить, что группа бактерий Bacillus macerans с 1997 года выделена в отдельный самостоятельный род Paenibacillus.

В работе использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК проводили по Грэхэму (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, субклонирование генов а- и ß-ЦГТаз в векторе pBluescript И SK(-), подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы проводили по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Рсстриктазное картирование рекомбинантных ДНК, содержащих гены а- и ß-ЦГТаз, проводили с использованием преимущественно гексануклеотидных рестриктаз. Одноцепочечные матрицы для секвснирования клонированных фрагментов ДНК нарабатывали при помощи хелперных фагов М13К07 или R408. Секвенирование проводили с помощью секвеназы ферментативным дидезокси-методом Сэнгсра (Sanger et al., 1977). Анализ нуклеотидных последовательностей генов ЦГТаз и выведенных на их основе аминокислотных последовательностей проводили с

к

помощью компьютерных программ DNASIS, PROSIS (Японпя), а также пакета компьютерных программ LaserGene (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание геномных библиотек микроорганизмов P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. Разработка стратегии секвенирования. определение иуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК, содержащих гены а- и ß-ЦГТаз, и их анализ.

В результате проведенных экспериментов были созданы геномные библиотеки микроорганизмов P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. Из них с помощью йодного теста на крахмалгидролизующую активность было отобрано несколько клонов для дальнейшей работы. Фрагменты ДНК, несущие полноразмерные гены а- и ß-ЦГТаз, были субклонированы в фагмидном векторе pBluescript II SK(-).

Рис.1. Поиск среди рекомбинантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК Р.тасегат ИБ-7, субклонов с крахмалгидролизующей активностью (выявляемых по светлому ореолу вокруг колоний, свидетельствующему о деструкции крахмала) с помощью теста с кристаллическим йодом. (Аналогичный тест был проведен также с плазмидами, несущими фрагменты ДНК ВасШш 5р. 6.6.3.)-

Для определения иуклеотидных последовательностей вставок, содержащих гены а- и р-ЦГТаз, было проведено широкомасштабное рестриктазное картирование, что позволило разработать стратегию секвенирования этих генов. Наряду с традиционной стратегией, нами была применена новая прогрессивная тетра/окта стратегия секвенирования,

основанная на использовании специально сконструированного в нашей лаборатории фагмидного вектора pSequoiaT12 (Чемерис и др., 1996).

В результате нами определены нуклеотидные последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген а-ЦГТазы, протяженностью 3025 пн и фрагмента ДНК, содержащего ген ß-ЦГТазы, протяженностью 2489 пн. Компьютерным анализом в секвенированных фрагментах ДНК, содержащих гены а- и ß-ЦГТаз, была обнаружена открытая рамка считывания для а-ЦГТазы протяженностью 2142 пн, достаточная для кодирования 714 аминокислотных остатков, для ß-ЦГТазы - протяженностью 2154 пн (718 аминокислотных остатков). Сравнительный анализ данных нуклеотидных последовательностей с известными последовательностями генов ЦГТаз позволил выявить- старт трансляции и расположенные на расстоянии -10 пн до него участки связывания с рибосомой: для а-ЦГТазы - GAGGAG, для ß-ЦГТазы - GAAGG. Определены также размеры лвдерного пептида, протяженность и молекулярные массы зрелых ферментов. Специфичность действия ферментов, продуцируемых рекомбинантными плазмидами, по сравнению с ЦГТазами из природных штаммов не изменилась (табл. 1.).

Таблица1.

Характеристика а- и ß-ЦГТаз P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. и кодирующих их генов

Показатели а-ЦГТаза P.macerans ИБ-7 ß-ЦГТаза Bacillus sp. 6.6.3.

Длина клонированного и секвенированного фрагмента ДНК 3025 пн 2489 пи

Протяженность открытой рамки считывания 2142 пн 714 а.к.о. 2154 пн 718 а.к.о.

Длина лидерного пеитида 27 а.к.о. 34 а.к.о.

Длина зрелого белка 687 а.к.о. 684 а.к.о.

Молекулярная масса 74 кДа 74,5 кДа

Специфичность действия фермента а:р:у 65:25:10 6:83:11

»703 ГтАТСТСССССАТТТСТССААССААСССАССССССДССТСАТСАСССАААТТСТСАЛСТТССаТСТСААССССС

-630 ТСТАСТТСССССАТТТОАСССССвАССАСААААТССТССАССТССССААААТСГСССТССССАСССССАТбСАССАССбТСОСТССТТСТ -54 0 АСААССАСАСССАОТССААССТСТСССАСАССТАТТАССАССГ.СССЙАСССССТСССАТСТССТСААССАаСССТСАТТСТГСССАСТСА -4 5 0 ААССССССАТСАТССТТАТАТСТАСТТАССТАТСТАТССССАТССАТТТААТТТАТАТТСАСАССССАТТСТСТССТССАТСААТСТАТС -3 60 АСТСАСССААОСАСААГ»ОТСТТАТТТАТТС6САААААТАСАААААСАСССССТССССТАССТСАТТССАААТСАСАССССССЗССТТТТТА -27 0 ССТТСТССССТААСССТТАСТАСТСАТААСССТТАТТСЙСССТСТАТСЛСССТСТТТСТТТТТСТАССТСТТССААЛАТТССАААГТТАС -180 ТСАСТТСТССТСАТССССаАТПСТАТТТТТАССАААСАААССССГТТССТТСААТТСТАТТЗТААСССТТГТАТТСТТСССТСТСССАТТ

-90 стсастсссссссттссссассссссттатсассттаоссасостссастсссааасатссссасаасатттсасаосаоасстассаса

1 MezLysSerArqTyгLysAгglelJThrSerlet)AlaLevSerLeuSetHetAlзlellGlyIleSerLeuPгofiIaTrpAlaSe■t РгоАвр

1 атсааатссс'сстасааасстттсасстссстссссстттссстсастатсссстгссссагттсастссссссатссссатсассссат

31 ТЬг5егУа1А5рАзп1у5Уа1А«пРЬе5егТНгА8рУа111еТусС1п!1еУа1тпгАзрАгдРЬеА1аАзр61уАзрАсдТКсАзпАзп

91 АСОАСССТССАСААСААССТСААТТТСАСТАСССАССТСАТСГАТСАСАТТСТСАСССАССССТТСССССАСССаОАСАССАССААСААТ

61 PгoAlaGlyAspAlaPheSerGIyA5pArgSerAsnleuLysLeuTyrPheGlyGlyAspTгpGlnGlyIleIleAsplysIleAsnAsp 181 CCGGCGf5GGGATGCGTTCAGCGGCGACCGATCCAATTTGAAGCTCTATTTCGGGGGAGACTGGCAGGGGATtATCGACAAGAtTAACGAC

91 С1уТу гЬеиТЬгС1 уМесС!у^з1ТЬгА1а1.еиТгр11е5е гС1пРгоУа 1С1иАзп11еТЬ гвегУа! ПеЬувТу г5егС1 уУа1Азп 271 ССТТАТТТСАСССОСАТСССССТСЛССССССТСТССАТАТСССАСССТСТССААААТАТСАССТСССТСАТСЛАСТАТТССССССТТААС

121 АзпТЬгЗегТугН1$С1уТусТгрА1аАсдА5рРЬе1-у5С1г1ТлгАзг.А5рМар^еС1уА5рРП%А1аАврР^еС1пА8п1<е»111еАзр 361 ААТАССТСТТАТСАСССТТАСТСССССАСССАТТТТААССАААССААССАС5СТТТСССЗСАТТТТ0СССАТТ1ТСААААТСТСАТТ6АТ

151 ТНгА1аН1зА1аН18Аьп11е1у5Уа1Уа111еА8рРЬеА1аРгоА5пН1зТЬг5егРгоА1аА5рАгдА8рА8пРгоС1уРЬеА1аС1о 4 51 АСС^СТСАСССТСАТААСАТСААССТССТСАТССАСТТСССССССААССАСАССТСТСССССССАСАСССАСАЛ.СССССССТТСССССАС

181 АзпС1уА1а ЬеиГугАзрА5п61 у5ег1.еи1.еи51уА1 аТугЗегАзпАврГГи А{аС1у1еиРЬеН15Н1зА5пС1у51уТЬгА5рРЬе 541 ААСаСтССаСТСТАТСАТААСССТТСССТССТСССССССТАСАСС.ЧАТСАТАСССССССССТТТТССАТСАТААСССССООАСССАТТТТ

211 ЗегТЬг11еС1иА5рС1у11еТугЬу5АзпЬе^угА5рЬеиА1аАзрПеАзпН1зАзпА5пАзг1А1аМе1АзрА1аТугРЬе1уз5ег 631 ТССАССАТТСААСАСССТАТТТАСААСААССТСТАССАССТСССССАСАТСААССАТААСААСААСОСТАТССАСССТТАТТТТААААСС

241 А1а11еА5рЬеиТгрЬеоС2уМеСС1уУа1Азр5]у11еАгдРЛвАзрА1а^а2LysHisNetProPheGlyГtpGínLys5erPhвVaI 721 ССТАТССАССТТТСЕСТССССАТСССТСТССАССССАТТССТТТТСАСССССТбААССАТАТСССТТТССССТбССААААААССТТССТТ

271 SerSecIleTyгGlyGlyAspKlsProValPheГhtPheGlyGluTrpTyrLeuGlyAlaAspGinT^lrAspGlyAspAsnIleLysPhe

811 тсстссатттассссссссатсатсссстатттассттсссссаатсстатсттсссссссатсааассоасссасасаасаттаааттс

301 А1аА5лС1и5егС2 уМесАзп1еиЬеиАзрРЛеС2иТ>тА1.зС1 иУа1 АгдС! иУэ2 РЛ'еАгдАзрЬугТЬгС! иГЛгНе С ЬувАяр 501 СССААССАААСССССЛТСААССТССТСбАСТТТСААТАСССССАССААСТСССССААСТСТТСССССАСЛАААСбСАААССАТСААССАТ

331 ЬеиТугС1иУа1ЬеиА1а5ес7ЬгС1и5егС1г>ТугАзрТуг 11еА&г\А5пМе^а1ТМ РН<г11еАЗрА»пН1зА5рМесА5рАгдРЬе

991 стстатсасстсстссссассасссастсссаатасбастасатсаасаататсстсассттсатссасаассатсататссассссттс

361 С1пУа1А1аС1у5егС1уТЬгАгдЛ1аТЬгС1иС1лА1а1еиАи1еиТЛг1.вцТЬг5вгАгдС1уУа]РгоА1а11еТугТугС1уТЬг 1081 САССТТСССССТТССССТАССССССССАСССАССААОССТТСССССТСАСССТСАСТТСССССССССТСССАСССАТСТАСТАССССАСС

391 С1иС1 лТугМвС ТИгС1уАэрС1уА5рРгоАзпАзпАгдА1аМе ГМе 5егР^еАзпТГ>гС1уТЬгТЬгА1аТугЬузУа 111еС1п 1171 САССАСТАСАТСАССССССАТ^СССАССССААСААССССаССАТСАТСАССТСОТТТААТАСССССАССАССССХТАТАААСТСАТТСАС

421 А1а^иА1аРгоЬеиАгд1уз5вгА5пРгоА1а11еА1аТугС1уТЬгТЬгТЬгС1иАгдТгрУа1АзпА5пА5р\Га1Ьеи11е11еС1о 1261 ССАТТССССССССТСССТАААТССААТССССССАТСССТТАТСССАСбАССАСАСАССССТСаСТТААСААССАТСТСТТСАТТАТТСАА

4 51 АгдЬу8РЬеС1уЗег5егА1аА1аЬеиУа1Ма11еА8пАгдАзп5егЗегА1аА1аТугРго11е8егС1уЬеи1еи5егЗегЬеиРго 1351 СССАААТТССССАССАбССССССТТТбСТССССАТТААТССАААСТССТСССССССТТАТСССАТТТССОСТСТСТТСАСТТСССТСССЙ

491 А1аС1уТЬгТуг5егАзр,/а11.еиА8пС1уЬви1еиА5п61уА8п5ег11еТЬг,/а1С1у5егС1уС1уА1аУа1ТЛгА5пРЛеТ^гЬеи 14 41 ССССССАСТТАТТСССАТСТАТТСААСССАСТСТТАААССССААСТССАТТАСССТСОССАСССССбССССССТСАССААСТТТАСССТ»;

511 А1аА1аС1уб1уТЬгА1аУа1Тгрс1пТугТНгА1аРгоС1иТЬс5егРгоА1а11еС1уАгпУа1С1уРгоТЬгМвсС1уС1пРгоС!у 1531 ОССССССОСГ,ССЛССаСОСТА1СССАа1АСАСАСССССССАААССТССССССССАТССССААТСТССаТСССАССАГСССССАССССССС

541 Азп11еУа1ТГ1г11еА£рС1уАгдС1уРКеС1уС1уТЬгА1аС1уТЬгУа1Ту гРЬеС1уТЬгТ1чсА1аУа1ТЬсС1у5^гС1уХ1ет/а1 1621 ААТАТАОТСАССАТТСАССССССССССТТТССССССАССССССССАСССТТТАТТТССССАССАССССССТСАСССССТСССССАТССТА

571 5егТгрС1иА5рТЬгС1пПе^узА1аУа111еРгоЬу5Уа1А1аА1аС1уЬу8ТЬгС1уУа13егУа1ЬузТЬг5ег5егС1уТНгА1а 1711 АССТСССАССАСАСССАСАТГААСССССТСАТАССбААССТССССССССССААААССССССТАТСССТСААААССТССТСССССАССССС

601 SerЛsnThrPЬeLysSerPheAsnValLeuThrGlyAspGlnValThrValArgP^■eLeuValAsnGlnAlaAsnThrAsnTyrGlyThr 1801 ассаатасаттсаааассттсаатстастсасссссоатсасстсассстссстттсстсстсаатсаасссаатассааттасссааса

631 АзпУа1Туг1еиУа 1С1уА5пА1аА1аС1иЬеиС1уЗегТгрА5рРгоА5пЬузА1а11еС1уРгоМе1ТугА5ПС1пУаШ€А1аЬуз 1891 ААТСТТТАТСТТСТССССААС(ЗССССССАССТССССТССТСССАССССААСАААСССАТТССССССАГСТАСААТСАССТСАТССССААС

661 ТугРго5егТгрТу гТу гАврУаХЗегУа 1РгоА1а01уТЪг ЪузЬеиАзрРЬеЬуэРЬе! 1еЪуз1,у5С1уС1уС1уТЬгУа1ТЬгТгр 1981 ТАССССТССТССТАТТАССАТСТСАСССТССССССССССАСАААССТССЛТТТТАААТТТАТТАААААСССССССССТАСССТСАСТТСС

691 С1иС1у01уС 1 уАзпШзТЬгТугТЬгТЬгРгоА! айегС! уУа1С1 уТЬгУа1ТЬгУа1АзрТгрС1 гАяп + 714 2071 СААССССС,ССССААССАТАССТАСАССАССССССССАССС6ССТАГ,ССАСССТСАСССТССАСТСССААААТТААСССССТААСССССС6 2181 ПССТСЛАССАСАСССАТСССССЛЛААААСТСССССССССАСТТАЛАСТССЛССТССАААССТСССССССАССАТТСТСАААТАСАСбТСС 2271 АССАТСТСТССТСССССАССССААССбСАСЛТССССССТТТТСТТТСТАТССССТТЛААТТТССАССТТГТС

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность гена а-ЦГТазы Р.тасегаю ИБ-7 и предсказанная аминокислотная последовательность фермента. Предполагаемый участок связывания с рибосомой выделен жирным шрифтом. Лидерный пептид обозначен курсивом. Терминирующий кодон показан звездочкой. Нуклеотиды, формирующие потенциальную терминирующую шпильку, подчеркнуты.

-211 gatcataactcgagggctatgctttttaaac

-180 cccagtggtttaggacaaccccggtaactccccaaggagataccggggttgtctgcgtttacgcccgaaaggaggaatccaaacaarrca -60 gtgaatcaacctgcactattgtaagcgctacaattcaaagccaattggttgtttatcaaaaactactacattcacgaagggtggattäcc 1 axgtttcaaatggccaaacgcgcattcctcagcaccacactgaccctcggcttgcttgccggcagcgccci gccgttcttgccagcttct 1 MetPheGlnMezAlaLysArgAlaPheLeuSerThrThrLeuThrLeuCl yLeuLeuAlaGlySerAlaLüuProP'neLQiiProAJaSer

91 GCTGCATACGCCGACCCGGACATTGCTGTCACCAACAAACAAAGCTTCAGTACAGATGTAATCTACCAAGTGTTCACACACCGCTTtTTG 31 AläAiaTyrAl aAspProAspI leAlaVa IThtAsnl-ysGlnSe rPheserthrAspVa 11 leTyrGlnVs lPheThc-AspArgPheLeu

181 gacggcaatccctccaacaatccaacaggagcggcttatgatgcgacatgtagcaatctgaaactgtattgcggtggagactggcaagga 61 AspGlyAsnProSe rAsnAsnProThrGlyAlaAlaTyrAspAlaThrCysSetAsnLeuLysLeuTyrCysGlyGlyAspTrpGlnGly

271 TTAATCAACAAAATCAATGATAACTATTTCAGTGATCTGGGTGTCACAGCGTTGTGGATCTCCCAGCCTGTCGAAAATATnTTGCGÄCG 91 LeuHeAsnLysIleAsrkAspAsnTyrPheS«cAspLeuGlyValThrAlaLeuTrpIleSerGlnProValGluAstillePheAlaThr

361 ATCAACTACAGCGGTGTAACCÄATACGGCCTACCATGGCTACTGGGCCCGGGACTTCAAAAAGACAAATCCGTACTTCGGCACAATGGCC 121 I leAsnTyrSerGlyValThrAsnThcAlaTy tHisGlyTycTcpAlaAi:gAspPhel.YsLy8ThrAsfvProTyf Ph^GlyThrMetAla

451 GACTTCCAAAACCTGATTACGACGGCCCATGCCAAGGGCATCAAGATTATTATTGACrTTGCCCCGAACCACACCTCTCCTGCCATGGAA 151 AspPheGlnAsnLeul i eTh rThrAlaH isAlaLysGly HeLysIlel letleAspPheAlaProAsnHisThrSerProAlaMetGlu

541 ACGGACACTTCTTTTGCCGAGAArGGAAAATTGTACGATAACGGCACACTGGTAGGCGGTTACACTAATGATACCAATGGClATTTCCAT 181 ThrAspThrSecPheAlaGiuAsnGlyl.ysLeuTyrAspAanGlyThrbeuValGlyGlyTytThrAsrvAspThrAsfiGlyTyrfheHis

631 cacaacggcggttccgacttctcttccctggagaacggcatctacaaaaacttgtatgacctggcggatttcaaccacaacaacgcaacc

211 HisAsnGlyGlySerAspPheSerSerLeuGluAsnGlyIleTyrLysAsnLeuTyrA5pLeuAlaAspPheA«nKisAsnAsnAlaThr 721 ATCGACAAGTACTTCAAAGACGCCATTAAACTGTGGCTCGATATGGGCGTTGACGGCATTCGGGTAGATGCGGTGAAGCATATGCCTCTC 241 U.eAspLysTyrPheLysAspAlaIleLy3LeuTrpLeuAspHetGlyValAspGlyIleArgValAspAlaValLysHisMetProl.eu

811 ggctggcaaaagagctggatgtcttccatttacgtacacaaaccggtgttcacttttggtgaatggttcctgggatcagctgcatctgat 271 GiyTrpGlnLysSerTrpMetSerSerlieTyrValH isLysProValPheThrPheGlyGluTrpPheLeoGlySerAlaAlaSerAsp

901 GCAGATAACACGGATTTTGCTAACAAGTCTGGTATCAGCCTGCTCGACTTCCGCTTTAACTCTGCGGTGCGTAA.TGTGTTCCGTGATAAC 301 AlaAspAsnThrAspPheAlaAsnLysSerGlyMetSerI.euLeuAspPheArgPheAsnSerAlaValArgAsnValPheArgAspAsn

991 ACCTCCAACATGTACGCTCTGGATTCCATCATrAACAGTACCGCTACGGATTACAACCAAGTCAATGATCAGGTGACGTTCATCGACAAT 331 ThrSerAanMetTyrAiaLeuAspSerMetI leAsnSecThrAlaThrAspTyrAsnGlnValAsnAspGlnValThrPhelleAspAsri

10$ 1 CATGATATGGATCGTTTCAAAACAAGTGCGGTCAACAATCGCCGCCTGGAGCAGGCTCrGGCCTTTACGTTGACTTCACGTGG7,GrGCCr 361 HisAspMecAspAcgPheLysThxSerAl aValAsnAsnArgArgLeuGluGlnAlaLeuAlaPheThrLeuThrSftrArgGlyValPrо

П71 GCCATTTACTACGGCACAGAACAGTATCTGACAGGTAATGGTGATCCGGATAACCGAGCCAAAATGCCTTCGTTCTCCAAATCCACAACG 391 Alal leTycTyr Gl yThrGluGlnTy r LeoThrGl yAsnGlyAspProAspAsnArgAl aLysMet ProSerPheSerLysSerThrThr

1261 gcgtttaacgtcattagcaaactggcacctctgcgcaaatccaatccggccattgcctacggctccacgcagcagcgctggattaacaat

421 AlaPheAsnVallieSetLysLeuAlaProLeuArgLysSerAsnPcoAlalleAlaTyrGlySerThrGlnGlnArqTrpIleAsnAsn

1351 GATGTTTATGTTTATGAGCGAAAATTTGGCAAGAGCGTAGCCGTTGTTGCGGTAAACCGCAÄTCTGTCCACACCAGCGAAT'ATTACAGGG 4 51 AspValTyrValTyrGluAJrgLysPheGlyLysSerValAlaValVaiAlaValAsnAcgAsnLeuSerThrProAlaAsnlleThrGly

14 41 CTGAGCACTTCTCTGCCTACAGGCTCATACACGGATGTCCTTGGCGGTGTACTGAACGGAAACAACATCACGTCCAGTAATGGCAGCGTT 481 LeuSerThrSerLeuProThrGlySerryrThrAspValLeuGlyGiyVaJLeuAsnGIyAsnAsnlJeTÄr^erSerAs^GlySerVal

1531 aactcctttacccttgctgcgggtgcaacggcagtatggcagtatacagoagccgaaacgacaccaaccatcggacatgtcggtccggtc 511 "AsnS6rPheThrLeuAlaAlaGlyAlaThrAlaValTrpGlnTyrThtAlaAlaGluThrThrProThrIleGlyHisVal.GlyProVal

1621 ATGGGCAAACCAGGCAATGTTGTGACGATTGATGGTCGCGGATTCGGCTnCACTAAAGGCACGGTATACTTCGGCACTACAGCTGTTACC 541 HeCGiy LysPxoG.1 yAsnVelValThrlleAspGlyArgGlyPheGlySecThrLysGlyThrVaiTycFheGlyThrThrAlaValThr

1711 GCAGCACCGATCACATCTTGGGAAGATACACAGATTAAAGTAACGATTCCATCCGTGGCTGCTGGTAACTATGCTGtCAAAGTAGCTGCG 571 GlyAlaAlai leThrSerTrpGluAapThrGlnlleLysValThcIleProSerValAlaAIaGlyAsnTyrAlaValLysVaiAIaAla

1801 AACGGGGTAAACAGCAATGCATATAACCATTTCACCATCCTGACCGGCGATCAGGTTACCG7ACGCTTTGTCATTAACAATGCTTCCACA 601 AsnGlyValAsnSprAsnAlaTyr AsnH isPheThrl leleuTfirGlyAspGlnVa IThrValArgPheVa llleAsnAsnAlaSerthr

1891 acgcttggacagaacatatatctgacaggcaacgtagctgagcttggcaactggagcacaggttccactgccattggaccagcattcaat

631 ThrLeuGLyGlnAsr»Xl»»TyrL€uThrGlyAsnValAlaGluLeuGlyAsnTrp3ecThrGlySerThrAlalleGlyProAlaPheAsn

1981 caggtgattcatcaatacccaacctggtactatgatgtcagcgtaccggcaggtaaagaacttgaattcaagttcttcaagaaaaacggt 661 GlnVal I leH i sGlnTy i ProThrTrpTyrTytAspValSetValProAl aGlyl.ysGluLeuGlu PfieLysPhePheLysLysAsnGly

2071 tcaacgattacatgc;gaaggcggttctaaccacaagttcaccacaccagcaagcggaacagcaacggttacggtgaactggcagtaagag

691 SerTh rl leTf»rT i pGluG). yGlySerAsnH isLysPheThrThrProAlaSerGlyThrAlaThrValThrVa lAsnTrpGln * 718

2161 cctcacatacttgattcacaagttaacccggagcacgcgaatgaaaaatgcagcgtaatccgggtttttgctgtgtgattcgaattttgc 2251 tatgtggttc6aattttgctgtatgatc

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность гена ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. и предсказанная аминокислотная последовательность фермента. Предполагаемый участок связывания с рибосомой выделен жирным шрифтом. Лидерный пептид обозначен курсивом. Терминирующий кодон показан звездочкой. Нуклеотиды, формирующие потенциальную терминирующую шпильку, подчеркнуты.

1 г\

Нуклеотидная последовательность гена а-ЦГТазы P.macerans ИБ-7 и соответствующая ей аминокислотная последовательность (рис.2.) депонированы в международном банке данных в 105 выпуске GenBank под регистрационным номером AF047363. Нуклеотидная последовательность гена ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. и соответствующая ей аминокислотная последовательность (рис.3.) депонированы в 32 выпуске The EMBL Nucleotide Sequence DataBase под номером Х66106 и в 26 выпуске SWISS PROT под номером РЗ1747.

2. Сравнительный анализ кодирующей области генов ЦГТаз С целью выявления структурных особенностей генов а-ЦГТазы P.macerans ИБ-7 и ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. был проведен сравнительный анализ их иуклеотидных последовательностей с известными последовательностями генов ß-ЦГТазы B.circulans 8 (Nitschke et al., 1990) и а-ЦГТазы B.macerans (Fujiwara et al., 1992). Результаты анализа представлены в таблице 2., из которой видно, что гены а-специфичных ЦГТаз имеют между собой очень высокий уровень гомологии - 99,6%. У генов ß-специфичных ЦГТаз он несколько ниже - 91,0%. Между генами а- и ß-ЦГТаз гомология составляет 62-64%.

Таблица 2.

Гомология иуклеотидных последовательностей генов ЦГТаз из различных штаммов микроорганизмов рода Bacillus и Paenibacillus (в %)

Bacillus sp. 6.6.3. (Р) B.circulans 8 (ß) P.macerans ИБ-7 (а)

Bacillus 5р. 6.6.3. (ß) -

B.circulans 8 (ß) 91,0 - -

P.macerans ИБ-7 (а) 62,3 64,3 -

B.macerans IF03490 (а) 63,5 62,9 99,6

Потриплетный анализ замен нуклеотидов, приводящих к замене аминокислотных остатков (табл.3.), показывает, что у гена ß-ЦГТазы B.circulans 8 по сравнению с геном ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. число замен невысокое. При сравнении генов а- и ß-ЦГТаз число замен в любой комбинации существенно возрастает и наибольшее их количество приходится на первый-

третий нуклеотиды кодонов (67), а также на первый-второй-трстий одновременно (68).

Таблица 3.

Анализ замен отдельных нуклеотидов в различных положениях кодонов генов ЦГТаз, приводящих к замене аминокислот, по сравнению с геном ß-ЦГГазы Bacillus sp. 6.6.3.

Штаммы бактерий Положения кодонов Всего измененных кодонов

I II III I+II WH JI+Ш I+II+III

B.circulans 8 (ß) 3 6 1 1 7 3 I 22

P.macerans ИБ-7 (а) 23 14 10 29 67 39 68 250

Таким образом, замена первого-третьего, а также всех нуклеотидов кодона для генов ЦГТаз с различной специфичностью является весьма частой и на долю таких замен приходится более половины всех измененных кодонов.

3. Анализ аминокислотного состава а- и 8-ЦГТаз P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3.

Анализ аминокислотного состава а- и ß-ЦГТаз P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. (рис. 4.) выявил следующие закономерности: обе ЦГТазы отличаются повышенным содержанием глицина, треонина, аспарагиновой кислоты, аспарагина, аланина, серина и валина. Обращает на себя внимание крайне низкое содержание цистеиновых остатков. В состав ß-ЦГТазы входит всего 2 остатка цистеина, тогда как у а-ЦГТазы их нет совсем.

g л v l 1stcmdneqrkh fywp

Аминокислотные остатки

Рис. 4. Аминокислотный состав а- и ß-ЦГ'Газ P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3.

4. Анализ лидерных пептидов НГТаз Значительный интерес представлял анализ лидерного пептида ЦГТаз, поскольку из-за меньшей консервативности, он может служить достаточно строгим критерием внутривидового родства микроорганизмов. С целью обнаружения каких-либо закономерностей их организации, был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей лидерных пептидов ЦГТаз микроорганизмов родов Bacillus и Paenibacillus. По уровню их гомологии они были разделены на ряд условных групп (рис.5.).

(34 а.к.о.)

1 MFQMAKRAFLSTTLTLGLIAGSALPFLPASAAYA Bacillus sp. 6.6.3.

2 B.circulans д

3 В.licheniformis

4 Bacillus.sp. ckl04

(27 а.к.о.)

5 MKRFMKLTAVWTLWLSLTLGLLSPVHA. Bacillus sp. 1011

6 Bacillus sp. 33-2

7 ..KIS...TAIA.S...A.S..G.A.. Bacillus sp. 17-1

в . .K.L.S. .A1A.G..........AQ. B.circulans 251

(29 а.к.о.)

9 LNDLNDFLKTILLSFIFFLLLSLPTVAEA Bacillus.sp. 1-1

10 .KN.TVL. . .'.P.ALU..I......A.Q. B.ohbensis

(31 и 28 а.к.о.)

11 MRRWLSLVLSMSFVFSAIFIVSOTQKVTVEA B.stearothermophilus

12 . I.R.. FS. WL.LI. FLV. .-NPEY-.-. . Bacillus sp. DSM5850

(27 а.к.О.)

13 MKSRYKRLTSLALS LSMALG1S LPAWA Р.тасегал5 ИБ-7

14 B.macerans IAM1243

15 B.macerans IF03490

16 . .KQV.W. . .VSM.VGI. . -АА. .V.. B.macerans

Рис. 5. Сравнение предсказанной аминокислотной последовательности лидерных пептидов ЦГТаз. Точками обозначены совпадающие аминокислоты. Дефис показывает делению аминокислоты.

1. Х66106; 2. Nitschke et al„ 1990; 3. Hill et al„ 1990; 4. Chung et al.s 1993; 5. Kimura et al„ 1987; 6. Kaneko et al., 1988; 7. Kaneko et al., 1989; 8. Lawson et al., 1994; 9. Schmid et al., 1988; 10. Sin et a!., 1991,11. Fujiwara et al, 1992; 12. Patent WO 9114770-A/l; 13. AF047363; 14. Takano et al., 1986; 15. Fujiwara et al., 1992; 16. Sugimotoetal., 1993.

В первой группе рассматриваемых ЦГТаз лидерный пептид имеет размер 34 аминокислоты. Гомология лидерного пептида здесь варьирует от 97 до 82%. Следующую группу составляют ЦГТазы алкалофильных' штаммов, имеющие более короткий лидерный пептид - 27 аминокислотных остатков. Его гомология между этими видами и штаммами составляет от 100 до 55%. Протяженность лидерного пептида в 29 аминокислот характерна для Bacillus sp. 1-1 и B.ohbensis, имеющих к тому же одинаковый стартовый кодон TTG. Длина лидерного

пептида B.stearothermophilus составляет 31 аминокислотный остаток и по своей сгруктуре он больше соответствует более короткому (28) лидерному пептиду уникальной у-специфичной ЦГТазы Bacillus sp. штамма DSM5850.

Отдельный интерес представляет группа а-ЦГТаз Р. (B.)macerans. ЦГТазы трех штаммов из четырех, включая изученную нами, имеют одинаковые лидерные пептиды, тогда как один штамм хараетеризуется большим количеством замен. Какой-либо гомологии лидерных пептидов между разными группами бациллярных ЦГТаз не обнаруживается. Из вышеизложенного можно сделать вывод, что лидерный пептид ЦГТаз в силу своей низкой консервативности, вероятно, может служить критерием внутривидового родства различных штаммов микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз.

5. Анализ доменов ЦГТаз

ЦГТазы относятся к большой группе крахмалгидролизующих ферментов, к которой принадлежат, в частности, а-амилаза, глюкоамилаза, пуллуланаза и др. (Svensson et al., 1989). С помощью реттеноструктуркого анализа установлены третичные структуры ряда этих ферментов. Показано, что они представляют собой сложно организованные белки и имеют доменную организацию (Hofman et al., 1989; Haga et al., 1994). Установлено, что ЦГТазы состоят из 5 доменов (А, В, С, D и Е), причем самый протяженный А-домен разделен доменом В на две неравные части - Al и А2-субдомены (рис. 6.).

138 202

407

496

583

687

¡. Al ¡ В • 1'; ♦'-лV* "Л* штш-ш-Á

138 64 205 89 8.7 104

138 202 406 494 580 684

¡ AI | В ¡ А2 -'•■ С D | Е |

138

64

204

86

104

Рис. 6. Схема доменной структуры зрелых ферментов а-ЦГТазы P.macerans ИБ-7 (1) и ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. (2). Цифры наверху указывают на номер аминокислотного остатка, приходящегося на конец домена. Нижние цифры соответствуют протяженности каждого домена (субдомена).

Ввиду разной функциональной нагрузки, эволюционная консервативность доменов различна. В связи с этим представлял интерес сравнительный подоменный анализ аминокислотных последовательностей исследуемых а- и ß-ЦГТаз с известными последовательностями других ЦГТаз.

Протяженность субдомена Al у разных ЦГТаз составляет 131-139 аминокислотных остатков (P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. - 138). Для различных групп ЦГТаз характерны специфичные замены отдельных аминокислот. В то же время, в основном, в средней части субдомена с высоким уровнем гомологии встречаются 32 инвариантные аминокислоты, присущие всем известным ЦГТазам, что составляет около 23% всех аминокислот данного субдомена. Среди них наиболее часто встречаются остатки глицина, аспарагиновой кислоты, тирозина и аспарагина.

Домен В является самым коротким и почти для всех ферментов характерна протяженность в 64 аминокислотных остатка. Исключение составляют ЦГТаза K.pneumoniae и "/-специфичная ЦГТаза, у которой отсутствуют 6 аминокислот в довольно вариабельной области домена. ЦГТаза K.pneumoniae имеет аналогичную делецию длиной 5 аминокислотных остатков в этом же месте, хотя остальная часть домена у этих ферментов сильно различается. B-домен характеризуется 12-ю инвариантными аминокислотами, из которых на долго глицина приходится наибольшее число остатков.

Субдомен А2 является наиболее протяженным и равен 203-205 аминокислотным остаткам (P.macerans ИБ-7 - 205, Bacillus sp. 6.6.3. - 204). Исключением является а-ЦГТаза K.pneumoniae (244) за счет четырех вставок от 4 до 21 аминокислот. А2-субдомен содержит около 21% инвариантных аминокислот, и к его отличительным особенностям можно отнести локализацию данных аминокислот в нескольких участках домена, выполняющих, по-видимому, важную функциональную роль. А2-субдомен характеризуется также значительным числом каталитически активных аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, аргинин и аспарагин.

Если для А- и В-доменов характерно чередование участков с высокой гомологией и сильно дивергировавших, то у С-домена можно отметить более консервативный N- и С-концы. Протяженность этого домена у большинства

ЦГГаз - 88-89 аминокислотных остатков (P.macerans ИБ-7 - 89, Bacillus sp. 6.6.3. - 88). Исключение составляют ЦГТаза K.pneumoniae (86) и у-спсцифичпая ЦГТаза (90) за счет дополнительной аминокислоты на С-конце.

D-домен имеется не у всех крахмалгидролизующих ферментов и его нет у а-амилазы (Jespersen et al., 1991), неожиданным является также его отсутствие у ЦГТазы K.pneumoniae. Размер этого домена довольно вариабелен: от 83 до 87 аминокислотных остатков (P.macerans ИБ-7 - 87, Bacillus sp. 6.6.3. - 86). Заметное уменьшение гомологии можно наблюдать по мере приближения к С-концу D-домена.

При сравнительном анализе Е-домена ЦГТаз отмечается более высокая гомология, чем при сравнении С- и D-доменов. Это можно объяснить возможными каталитическими функциями, которые, вероятно, выполняет данный домен. Уровень гомологии незначительно уменьшается к С-концу Е-домена, а для ЦГТазы K.pneumoniae (длина 98 аминокислот) она практически исчезает. У других ЦГТаз Е-домен варьирует от 101 до 105 аминокислотных остатков 0P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. - 104). 11 инвариантных аминокислот, три из которых представлены глицином, локализованы в первой половине Е-домена.

Проведенный анализ уровня гомологии различных ЦГТаз и их отдельных доменов позволил выявить некоторые закономерности. Так, для всего зрелого фермента характерно наличие 118 инвариантных аминокислот, присущих всем сравниваемым ЦГТазам. При этом на долю глицина из них приходится около 20%. Наиболее высокой гомологией характеризуются А- и В-домены. В группе р-специфичных ЦГТаз уровень гомологии всей длины молекулы варьирует от 97,7 до 59,8 %, тогда как а-ЦГТаза P.macerans имеет даже несколько более высокий уровень гомологии (66,4%) по сравнению с ß-ЦГТазой Bacillus sp. 6.6.3. Менее гомологична из них у-ЦГТаза Bacillus sp. DSM5850. Крайне низкий общий уровень гомологии характерен для ЦГТазы K.pneumoniae, однако, у нее все же имеются определенные участки с достаточно высоким уровнем гомологии. Эволюционную консервативность доменов ЦГТаз можно видеть из таблицы 4., где приведен уровень гомологии аминокислотных

последовательностей некоторых зрелых белков ЦГТаз . по сравнению с ß-ЩТазой Bacillus sp. 6.6.3.

Таблица 4.

Уровень гомологии аминокислотных последовательностей доменов некоторых ЦГТаз в сравнении с ß-ЦГТазой Bacillus sp. 6.6.3. (в %)

Штаммы Домены ЦГТаза

AI В Л2 С D E

В. circulons 8 (ß) 98,5 98,4 99,0 93,2 97,7 95,2 97,7

B.licheniformis (ß) 94,9 95,3 94,1 85,2 93,0 84,6 91,5

Bacillus sp. 38-2 (ß) 76,0 75,0 66,2 67,0 53,5 75,0 68,8

Thermoanaerobacter sp. (et) 66,6 71,8 72,0 64,8 50,0 73,8 67,4

P.macerans ИБ-7 (a) 70,3 70,3 65,2 61,4 65,1 49,0 66,4

Bacillus sp. 1-1 (ß) 62,3 60,9 61,3 51,1 41,8 55,7 59,8

Brevibacillus brevis (ß) 64,5 64,0 60,3 53,4 51,1 58,6 59,2

Bacillus sp. (y) 50,0 60,9 55,9 44,3 38,4 55,7 50,4

K.pneumoniae (a) 39,1 28,1 23,0 19,3 - 25,0 _ ♦

* Примечание: Ввиду отсутствия О-домена у К.рпеитоп'ше, рассчитать общую гомологию всей ЦГТазы у этого вида не представляется возможным.

Из проведенного сравнительного анализа аминокислотных последовательностей зрелых ЦГТаз следует, что ныне известные ЦГТазы можно подразделить на несколько групп, что видно из построенного филогенетического древа (рис. 7.). Так, наиболее удаленной от всех бациллярных ЦГТаз является у-специфичная ЦГТаза. ЦГТаза Thermoanaerobacter sp. оказывается ближе к ЦГТазе вида B.stearothermophilus. ЦГТаза Brevibacillus brevis довольно близка к группе ЦГТаз Bacillus sp. 1-1 и B.ohbertsis. а-ЦГТазы трех штаммов B.(P.)macerans, два из которых практически идентичны, а третий характеризуется большим числом замен, формируют обособленную группу, состоящую из двух подгрупп. Что касается а-ЦГТазы К.pneumoniae, то она стоит особняком, что позволяет сделать вывод о существовании иного предка у этой ЦГТазы по сравнению с ЦГТазами из других видов микроорганизмов.

.Bacillus sp.IOII Bacillus sp.SS-2 Baciihis i" 17-1 B.circulans 251 B.circulans 3 Bacillus sp. 6.6.5. Bacillus ¡p. cU04 B.hck*ntformis P.mactrans A'i" 7 B.rnaetrans IFO34S0 В.таагйти S. slcwelhtrxiefilus Thtrm^anatrobaatj sp. Brtvibacillus br&vis Bacillus sp.1-1 B.ohbtnsis

Bacillus sp. DSM5850 X.pmumatiias

Рис. 7. Филогенетическое древо различных видов и штаммов микроорганизмов родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Thermoanaerobacter и Klebsiella на основе гомологии аминокислотных последовательностей зрелых ЦГТаз.

: 6. Особенности аминокислотных последовательностей а- и ß-ЦГТаз

. Каждая ЦГТаза по-своему является уникальной, поскольку продуцирует

определенное, присущее только этому конкретному ферменту, соотношение а-, ß- и у-циклодекстринов. Тем не менее, все же существуют две группы ферментов с ярко выраженными а- или ß-специфичностями, к которым относятся и исследуемые в данной работе ЦГТазы. Было интересно выявить специфические различия между ними на основе их подоменного сравнения (рис. 8.-10.).

1. 43 CSMLKLYCGGDWOG

2. 43.....

3. 43 .T..R <3 . 43.....

5. 43 .Т..R

6. 43 .T..R

7. 43 .Т. .R

8. 43 .Т..R

9. 39 .ID.НК.

10. 39 ..D.HK.

11. 40 .Т..RK.

12. 39 ..D.HK.

13. 40 .LD.TK. 14 . 43 R......F

15. 43 R......F

16. 43 R......F

17. 43 Н......F

18. 41 PN...К.Т...LR

19. 43 НТ5..К.F

Bacillus sp. 6.6.3. ß B.circulans 8 ß Bacillus sp. ck 104 ß B.ltchenifarmis ß Bacillus sp. 1011 ß Bacillus sp. 38-2 ß Bacillus sp. 17-1 ß. B.circulans 251 ß Bacillus sp. 1-1 ß B.ohbensis ß B.slearothermophilus ß Brevibacillus brevis Bacillus sp. y DSM5850 Paenibacillus macerans HE-7 et B.tnacerans IAM1243 a B.macerans 1F03490 a B.macerans a Klebsiella pneumoniae a Thermoanaerobacter sp. a

X6S106

Nitschke et al, 1990 Chung et al, 1993 Hill et al., 1990 Kimura et al., 19X7 • Kaneko et al., 1988 Kaneko et al., 1989 Lawsonetal, 1994 Schmid et al., 1988 Sin et ai„ 1991 Fuj iwara et al., 1992 Kimetal.,1998 Patent WO 9114770-A/l AF047363; Takano et al-, 1986 Fujiwara et al, 1992 Sugimoto et al., 1993 Binder et al, 1986 Joergensen et al, 1997.

Рис. 8. Сравнение аминокислотных последовательностей участка Л1-домена ЦГТаз. Аминокислоты приведены в однобуквенном коде. Цифры, выделенные курсивом, указывают на номер первого в данном участке аминокислотного остатка. Точками обозначены совпадающие аминокислоты. Жирным шрифтом показаны аминокислоты, специфичные для а-ЦГТаз.

Для всех сравниваемых р-ЦГТаз в А1-субдомене (рис. 8.) характерно наличие двух остатков цистеица, тогда как у а-ЦГТаз они заменены, в первом случае, на аргинин, гистидин или пролин. Во втором случае, у всех

I

а-специфичных ферментов цистеин заменен на фенилаланин и только у К.рпеитомае вместо цистеина присутствует треонин.

Различия В-домеиов а- и (3-ЦГТаз, не столь существенны (рис. 9.). Так, в двух довольно вариабельных участках для группы а-ЦГТаз В.(Р.) тасегаю, характерны остатки аланина, не встречающиеся у других ферментов. У К.рпеитотае в этом месте находится подобный аланину треонин. Во втором участке В-домена той же группы ЦГТаз В.(Р.)тасегат присутствует изолейцин, но у некоторых ЦГТаз, включая р-специфичиые, вместо изолейцина может находится подобный ему лейпин.

1. 172 NGYFHHNGG 19 7 LADFNH Bacillus sp. 6.6.3. ¡1 Х66106

2. 112..................197............В.circulars 8 ¡3 Nitschkcetal., 1990

3. 172 ..................197 ...L.. Bacillus sp. ck 104 [) Chung et at., [993

4. 172 ..................197 ...L.. B.licheniformis (3 Hill etal., 1990

5. 172 QNL. ..Г.. 197...L.. Bacillussp. 1011 P Kimura etal., 1987

6. 172 QNL. . . У.. 197 . . .L.. Bacillus sp. 38-2 ¡1 Kaneko eta)., 1988

7. 171 HNL............196... h.. Bacillussp. 17-1 Kaneko et a!., 1989

8. 172 QNL............2S7...L.. B.circulans 25\ p Lawson etaL, 1994

9. 166 QNL............191 ...YDL Bacillussp. 1-1 (3 Schmid et al., 1988

10. 165 .NL............190 ...YDL B.ohbemis$ Sin et al., 1991

11. 168 .M..............193 ...I.. B.stearotkermophilus P Fujiwara et al., 1992

12. 165 .KL............190 ...YDL Brevibacillus brevisP Kimetal.,t998

13. 159 ED.. YT... 191 ..Sb.Q Bacillussp. у DSM5850 Patent WO 9H4770-A/1

14. 172 A. L............197 ...I.. P.macerans ИБ-7 oc AF047363;

15. 172 A. L............197 ...I.. B.macerans IAM1243 a Takano et al, 1986

16. 172 A.L............197 ...I.. B.macerans IF03490a Fujiwaraetal., 1992

17. 172 A.L............197 ...I.Q B.macerans a Sugimoto etal., 1993

18. 170 T.Wf..........196 .S.b.Q Klebsiella pneumoniae a Binder etal., 1986

19. 173......Y.. 198 . ■. LDQ Thermoanaerobaciersp.a Joergensen et al., 1997.

1 II

Рис. 9. Сравнение аминокислотных последовательностей отдельных участков В-домена ЦГТаз. Аминокислоты приведены в однобуквенном коде. Цифры, выделенные курсивом, указывают на номер первого в данном участке аминокислотного остатка. Точками обозначены совпадающие аминокислоты. Жирным шрифтом показаны аминокислоты, специфичные для а-ЦГТаз.

А2-субдомен, наряду с А1-субдоменом, имеет, вероятно, весьма значимые замены аминокислот у а-ЦГТаз (рис. 10.), большинство из которых локализованы в консервативных областях, принимающих участие в каталитическом процессе. Так, в первой области А2-субдомеиа для а-ЦГТаз В.(Р.)тасегапз характерно присутствие фенилаланина, которого нет в этом месте

у других ЦГТаз. Второй сравниваемый участок большинства бациллярных а-ЦГТаз содержит характерный блок дополнительных аминокислот ссбн. Первый остаток глицина из этого блока является инсерцией по сравнению с (3-специфичными ферментами. У двух других ферментов В.тасегаю и К.рпеитотае дополнительными аминокислотами являются серии и изолейцин. В этом же участке в его консервативной области для трех а-ЦГТаз В.(Р.)тасегат, а также ЦГТазы ТИегтоапаегоЬаШг ¿р. характерна замена фенилаланина на близкий ему тирозин. В третьем, довольно консервативном участке, аминокислота серии заменена у а-ЦГТаз на остаток аспарагина или гистидина, или аланина (у К.рпеитотае). Более существенные различия сосредоточены в четвертой области А2-субдомена всех а-ЦГТаз. Для них характерен блок аминокислот У1ЫЫК но у ТИегтоапасгоЬаШг ар. он выглядит несколько иначе - Р1Ы0М. У а-ЦГТазы К.рпеитотае этот участок не имеет

практически ничего общего с остальными а-ЦГТазами.

1. 224 rciRVttWKHM

2. 224 ...........

3 . 224 ...........

4. 224 ...........

5 . 224 ...........

6. 224 ...........

7. 223 ....М......

-М.

•А.

8. 224

9. 218......

10. 217......

11. 220 ....М.

12. 216 ......

13. 212......

14. 224 ____F......

15. 224 ____F____QY

16. 224 ....F......

17. 224 ____F......

18 . 223 .A. .I..I... 19. 226 ____М......

I

-VHKPVFTrcEWiL 279 SUDF

-А........................279 .....

-А........................279.....

-А........................279 .....

-NY......................279 .....

-t«....N............279 ..-..

-Mi......................278 .....

-№Г......................279.....

-S........................273 .....

-А.Е....................272 .....

-NYR....................275 .....

-TY......................271.....

-DYN.........Т 267 .А...

248 GSM........Y. 280 N....

248 СОМ........V. 280 П....

248 GGDH........V. 280 N----

248 SSftN....................280 Н....

252 IGH3GF.F.....G 288 А....

-ЭЖ........Y. 281.....

318 QVND2VTETCMHDM

318 ..............

318..............

318 ..............

318 ..............

315 ..............

315

316

II

III

ME...........

..D...........

310 E.I...........

309 E.I...........

312 E.L...........

308 E.I...........

304 KPQ..........I

317 XI .Ш.........

317 Yl.tW.........

317 И.Ж.........

317 YI.Ж.........

326 SCOW. .V.M.....

318 Yt.JA.........

IV

£craAis8 (5 BariSiespckKMP Rlkto$rmi> (3 BaAssp 1011 P Badhtssp 38-2 p BaMesp 17-1 p B.araiars 251 p BaHesp 1-1 (3 Rdixnsis P ВлехгЫкгто/Ме p ВтЬхЛеЬюЬ^ BaAesp. DSM585Qy r'jncocnns НГ>-7 a Bsnaxrcrs 1AM1243 о йшотишоа Rmaxixns a Кргатаже a Thmioaxavbacterspa

Рис. 10. Сравнение аминокислотных последовательностей отдельных участков А2-домена ЦГТаз. Аминокислоты приведены в однобуквенном коде. Цифры, выделенные курсивом, указывают на номер первого в данном участке аминокислотного остатка. Точками обозначены совпадающие аминокислоты, дефисом - делеции аминокислот. Жирным шрифтом показаны специфичные для

а-ЦГТаз аминокислоты. ___ , „.,. t , ,oon.

1.Х66106; 2. Nitschke et al., 1990; 3. Chung et al„ 1993; 4. Hill ct aL, 1990, 5. Kimura et al., 1987; 6. Kaneko et al., 1988; 7. Kaneko et al., 1989; 8- ^^m et ai 1994; 9. Schmid et al., 1988; 10. Sin et al., 1991, 11. Fujiwara et al., 1992; 12 Rimet al.,1998; 13. Patent WO 9114770-A/l; 14 AF047363; 15. Takanoetal l986; 16 Fujiwara et al., 1992; 17. Sugimoto et al., 1993; 18. Binder ct al., 1986; 19. Jocrgensen et al., 1997.

а-ЦГТазы в С-домене в одном участке характеризуются заменой изолейцина на подобный ему валин. Другой участок, приходящийся на весьма вариабельную область, содержит у а-ЦГТаз блок аминокислот aayp. Можно предположить, что имеющиеся отличия а- и ß-ЦГТаз в С-домене, а также в D- и Е-доменах а- и ß-ЦГТаз не носят функционального характера и не определяют специфичность действия фермента.

Таким образом, проведенный сравнительный анализ особенностей первичной структуры а- и ß-ЦГТаз позволил выявить их специфические различия, наиболее существенные из которых обнаруживаются в А-домене. В AI-субдомене ß-ЦГТазы Bacillus sp. 6.6.3. и остальных ß-ЦГТазах локализованы два остатка цистеина, тогда как у а-ЦГТазы P.macerans ИБ-7, как и у большинства прочих а-ЦГТаз, они заменены в одном случае на аргинин и в другом - на фенилаланин. Поскольку цистеин участвует в образовании дисульфидных мостиков, то его отсутствие может привести к отличающейся конформации данной области молекул а-ЦГТаз. Большинство специфичных замен ряда аминокислот выявляются в высококонсервативных функционально-важных участках А2-субдомена. В то же время в довольно вариабельных участках, но прилегающих к высококонсервативным (что может косвенно свидетельствовать об их влиянии на специфичность действия фермента), обнаруживаются характерные блоки аминокислот ggdh (где первый глицин является инсерцией) и YINNM.

ВЫВОДЫ:

1. В векторах на основе фага лямбда в бактерии E.coli созданы геномные библиотеки двух видов бацилл - Paenibacillus macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3.; в них идентифицированы полноразмерные функционально-активные гены ЦГТаз , характеризующихся а- и ß-специфичностью, и проведено их субклонироваиие в плазмидных векторах.

2. Показано, что специфичность действия ферментов, продуцируемых рекомбинантными плазмидами, несущими полноразмерные функционалыю-

активные гены а- и Р-ЦГТаз P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3., по сравнению с выделенными из природных штаммов, не меняется.

3. Установлено, что полные нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов ДНК, содержащих гены а- и Р-ЦГТаз P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3., вместе с фланкирующими участками имеют протяженность 3025 и 2489 пи, соответственно.

4. В секвенированных фрагментах ДНК P.macerans ИБ-7 и Bacillus sp. 6.6.3. обнаружены открытые рамки считывания: для гена а-ЦГТазы -протяженностью 2142 пн, кодирующая полипептид размером 714 аминокислотных остатков; для гена р-ЦГТазы - 2154 пн, кодирующая полипептид размером 718 аминокислотных остатков.

5. Идентифицированы участки, кодирующие лидерные пептиды, длиной 27 аминокислотных остатков для а-ЦГТазы и 34 аминокислотных остатка для Р-ЦГГазы. Размер зрелой а-ЦГТазы составляет 687 аминокислотных остатков с молекулярной массой около 74 кДа. Размер зрелой Р-ЦГТазы составляет 684 аминокислотных остатка с молекулярной массой около 74,5 кДа.

6. Показано, что уровень гомологии аминокислотных последовательностей

• лидерных пептидов ЦГТаз может служить критерием внутривидового

родства сравниваемых групп микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз.

7. Показано существование обособленных групп микроорганизмов-продуцентов ЦГТаз. Все сравниваемые а-, (5- и у-ЦГТазы из микроорганизмов родов Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus и Thermoanaerobacter имеют одного общего предка и являются результатом дивергенции, тогда как происхождение а-ЦГТазы Klebsiella pneumoniae имеет независимый и конвергентный характер.

8. Наиболее существенные отличия аминокислотных последовательностей между а- и р-специфичными ЦГТазами выявлены в А1- и А2-субдоменах. В А1-субдомене а-ЦГТаз, по сравнению со сходной областью Р-ЦГТаз, характерна замена двух остатков цистеина на аргинин и на фенилаланин. В А2-субдомсие а-ЦГТаз выявлены специфичные замены ряда аминокислот иУили их блоков в высококонсервативных функционально-важных участках.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Akhmetzjanov A.A., Bikbulatova S.M., Chemeris A.V., Vakhitov V.A. P-cyclodextrin glucanotransferase gene from Bacillus sp. II The EMBL Nucleotide Sequence DataBase. - 1992. - Release 32. - Accession number X66106. (деп.)

2. Akhmetzjanov A.A., Bikbulatova S.M.. Chemeris A.V., Vakhitov V.A. P-cyclodextrin glucanotransferase gene from Bacillus sp. 6.6.3. // SWISS PROT. Protein Sequence DataBase. - 1993. - Release 26. - Accession Number P31747. (деп.)

3. Чемерис A.B., Бикбулатова C.M.. Усанов Н.Г., Вахитов В.А. Использование анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей отдельных генов и кодируемых ими белков для определения эволюционной близости видов микроорганизмов рода Bacillus И Международная конференция: Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы. - Тезисы докладов. - Пермь. - 1996. - С. 121.

4. Chemeris A.V., Bikbulatova S.M.. Vakhitov V.A. Nucleotide sequence of a-cyclodextrin glucanotransferase gene from Paenibacillus macerans // GenBank. - 1998. - Release 105. - Accession number AF047363. (деп.)

5. Вахитов B.A., Ахметзянов A.A., Бикбулатова С.М., Усанов Н.Г., Чемерис А.В. Молекулярное клонирование, определение нуклеотидной последовательности гена Р-циклодекстрин глюканотрансферазы Bacillus sp. штамма 6.6.3. и ее сравнительный анализ. // Биотехнология. - (В печати).

6. Chemeris A.V., Bikbulatova S.M., Vakhitov V.A. Comparative analysis of primary structure of CGTases with a- and P-specifities from P.macerans and Bacillus sp. H Applied and Microbiology Biotechnology. - (In press).

Бикбулатова Светлана Магнитовна

ЦИКЛО ДЕКСТРИН ГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ

С АЛЬФА- И БЕТА-СПЕЦИФИЧНОСТЯМИ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИХ СТРУКТУРЫ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0225 от 10.06.97 г.

Подписано в печать 25.05.98 г. Формат 60x84/16. Бумага типографская № 1. Компьютерный набор. Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л. 1,39 . Уч.-изд.л. 1,26. Тираж 100 экз. Заказ 36а.

Редащиоино-издателъский центр Башкирского университета Множительный участок Башкирского университета 450074. Уфа, ул.Фрунзе, 32. Тел.: (3472)236-710