Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro

Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro"

МИНГАЗЕТДИНОВА СВЕТЛАНА РАФАИЛЬЕВНА

ИСКУССТВЕННАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ЦИКЛОДЕКСТРИН ГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗ И ИХ ПРОДУЦЕНТОВ IN VITRO

03.00.03 -молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УФА-2004

Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и в Институте биологии Уфимского научного центра РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

кандидат биологических наук, с.н.с. Усанов Николай Глебович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

доктор технических наук, профессор Ягафарова Гузель Габдулловна

Ведущая организация: Башкирский государственный университет

Защита состоится «21» декабря 2004 г. в часов на заседании

Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 69. e-mail: dissovibg@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан

«Ло»

ноября 2004 г.

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета:

Гималов Ф.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Искусственная (направленная) эволюция белков как новое течение в биотехнологии возникла в качестве инструментария для осуществления белковой инженерии. По сути, искусственная эволюция, в отличие от эволюции естественной, является более избирательной, имеет определенную цель, ограничена во времени, и, главное, контролируется экспериментатором, хотя ее ключевые процессы (мутации, рекомбинация и скрининг) в целом имитируют естественно протекающие в природе процессы.

Работы по направленной эволюции белков, а именно по химическому и радиационному мутагенезу, начали проводиться с начала 80-х гг., тогда как начало 90-х гг. знаменует собой наступление промышленной эры молекулярной биотехнологии, которое диктует необходимость получения, в частности, новых, безопасных для здоровья человека биокатализаторов естественного происхождения. В 1994 г. появился принципиально новый подход в молекулярной эволюции - ДНК шаффлинг (от англ. "shuffling" — перетасовка), который указал перспективу перехода от работ по мутагенезу к использованию рекомбиноген-ных методов или, иначе, от простой асексуальной репродукции к сексу-

альной. С момента опубликования первых данных о результативном осуществлении экспериментов по ДНК шаффлингу (Stemmer, 1994a; 1994b) эта техника получила очень широкое распространение и практическое применение. На его основе было создано множество методов (Zhao et al., 1998; Ostermeier, 1999; Abecassis et al., 2000; Gibbs et al., 2001; Ness et al., 2002; Zha et al., 2003). Еще одним толчком к развитию методов направленной эволюции послужил переход от работ на уровне субгеномных фрагментов к целым микробным геномам с целью аккумуляции и комбинирования полезных мутаций от двух и более искусственно выбранных «родителей» в одном организме (Zhang et al., 2002; Dai et al., 2004).

В качестве модели для наших экспериментов по искусственной эволюции был выбран промышленно важный фермент циклодекстрин глюка-нотрансфераза (ЦГТаза) и его штаммы-продуценты. ЦГТаза обладает уникаль-

ным свойством превращать крахмал в циклодекстрины (ЦЦ), широко применяемые в различных отраслях промышленности. Способность к синтезу этого фермента встречается среди прокариот очень редко, что позволяет использовать этот признак в качестве маркерного и проводить селекцию с большой точностью.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение возможности осуществления in vitro ДНК шаффлинга между ранее секвенированными генами а- и Р-ЦГТаз, клонированными в плазмиде pBluescript SK(-), и имеющими в среднем около 60% гомологии на нуклеотид-ном уровне; изучение возможности получения in vitro химерных циклодекстри-ногенных штаммов при помощи ДНК/геномного шаффлинга. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Выделение одноцепочечных (оц) и двуцепочечных (дц) ДНК а- и Р-ЦГТаз, клонированных ранее в плазмидном векторе pBluescript SK(-) и получение их фрагментов размером 150-300 пар нуклеотидов;

2. Проведение двухраундового ДНК шаффлинга путем рекомбинации взятых в разных пропорциях оц и дц ДНК генов а- и Р-ЦГТаз для получения случайным образом восстановленного полноразмерного химерного гена;

3. Скрининг и селекция кандидатов для ДНК/геномного шаффлинга среди ЦГТазных штаммов и почвенных изолятов;

4. Проведение ДНК/геномного шаффлинга посредством трансформации протопластов алкалофильного штамма тотальной ДНК ЦГТазного штамма и осуществление трансформации протопластов ЦГТазного штамма тотальной ДНК галоалкалофильного бациллярного штамма;

5. Скрининг и селекция клонов, обладающих амилолитической и ЦГТазной активностью, полученных в результате ДНК/шаффлинга; сравнительный анализ отобранных и исходных штаммов методом RAPD.

Научная новизна работы. Впервые проведен ассиметричный ДНК шаф-флинг генов и -ЦГТаз с использованием исходных матричных ДНК, представленных разными формами этой молекулы, взятыми в различных пропорци-

ях для преимущественного отжига 5'—>3'-цепи ДНК от одной ЦГТазы и 3'—>5'-цепи другой. Проведен межвидовой однонаправленный перенос генов in vitro путем индуцированной полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформации регенерирующих протопластов одного бациллярного штамма с помощью тотальной ДНК другого и впервые получены жизнеспособные химерные конструкции, обладающие наряду с сохранением прежних (ЦГТазной активности) и новыми свойствами (способностью к анаэробному росту в присутствии нитрата и/или нитрита, рН толерантностью и солеустойчивостью). Таким образом, была показана возможность осуществления искусственной эволюции применительно к нашей модели исследования и разработаны соответствующие методы.

Практическая значимость работы. Разработан метод ассиметричного ДНК шаффлинга, позволяющий повысить выход химерных конструкций, состоящих из фрагментов родительских генов, и предложен метод однонаправленного переноса генетического материала при помощи межвидовой высокоэффективной трансформации бактериальных протопластов тотальной ДНК другого организма. В результате ДНК/геномного шаффлинга получены штаммы рН- и галотолерантных рекомбинантов, обладающие ЦГТазной активностью и способные к росту в анаэробных условиях на среде с нитратом и нитритом. Полученные химерные культуры могут быть использованы в качестве модели для дальнейших исследований, а также для создания промышленных продуцентов ЦГТаз.

2002); на 11-м Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Базель, Швейцария,

2003); на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ (Уфа, 2003); на XVI зимней молодежной научной школе (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования; главы, посвященной результатам собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 6 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 240 зарубежных источников литературы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения ДНК шаффлинга были использованы клонированные и сек-венированные ранее в нашей лаборатории гены а- и ß-ЦГТаз штаммов Paeniba-cillus macerans ИБ 3K-I (ВКМ В-1794), Bacillus species 6.6.3 (ВКМ В-1973Д) (рис. 1). Фрагменты ДНК, содержащие ЦГТазные гены, размером 3025 п.н. и 2489 п.н. (а- И ß-ЦГТаза, соответственно), были субклонированы ранее в фаг-мидном векторе pBluescript SK(-) в микроорганизме Е. coli.

Рис. 1. Микрофотография комплекса кристаллов ЦД с йодом, подтверждающая наличие у Е. coli ЦГТазной активности, кодируемой геном о> ЦГТазы в составе плазмиды pBluescript SK(-).

В работе по ДНК/геномному шаффлингу были использованы штаммы Bacillus sp. 12, Bacillus sp. 9, выделенные нами из почв парковой зоны г. Уфы; штамм IB-256 и ЦГТазные штаммы 1069,

1005, 839 были взяты из коллекции микроорга-

низмов Института биологии УНЦ РАН.

В работе были использованы следующие методы. Выделение плазмидных дц и оц ДНК проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989). ДНК шаффлинг осуществляли по модифицированным нами методам Stemmer (1994)

и Kikuchi et al. (2000). Тотальную ДНК выделяли модифицированными методами Грехема (1978) и Wilson (1994). ДНК/геномный шаффлинг проводили посредством ПЭГ-индуцированной трансформации бациллярных протопластов тотальной ДНК. Протопласты выделяли по методике, описанной Гловером (1988). ЦГТазную активность детектировали по методу Тильдена и Хадсона (1942) с некоторыми модификациями. Полученные трансформанты и родительские штаммы анализировали методом RAPD. Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0.8-1.5% агарозном и 6% полиакриламидном геле (ПААГ) как описано Sambrook et al. (1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Проведение ассиметричного ДНК шаффлинга (с одно- и двуцепочечны-ми ДНК). Анализ in silico нуклеотидных последовательностей генов а-ЦГТазы

клонированных ранее в лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИБГ УНЦ РАН, продемонстрировал, что они в целом гомологичны друг другу на 60%, хотя и имеют достаточно протяженные участки с 86 - 100%-ной гомологией. Последние потенциально могут служить в качестве остовообразующих во время первого раунда шаффлинга. Учитывая то, что минимальный требуемый уровень нуклеотидной гомологии для успешного осуществления шаффлинга составляет не менее 50%, и для повышения эффективности данной процедуры можно использовать более точные ДНК полимеразы (например, Taq-SE), которые за счет своей экзонуклеазной активности удаляют неспаренные нуклеотиды на 3'-концах ге-терологичных двуцепочечных структур, (давая тем самым возможность вести удлинение соответствующих не полностью гомологичных цепей ДНК), потенциальная возможность проведения ДНК шаффлинга генов и -ЦГТаз была оценена a priori.

Для осуществления ДНК шаффлинга генов а- и ß-ЦГТаз проводились следующие процедуры: а) случайная фрагментация с помощью ДНКазы I нара-

ботанных в составе фагмидных векторов pBluescгipt SK(-) оц и дц форм генов ЦГТаз; б) последующее электрофоретическое разделение и элюция фрагментов ДНК размером 100 - 300 п.н.; в) смешивание элюированных фрагментов оц и дц форм ДНК разных ЦГТаз в пропорции 100:1, соответственно; г) двухраундовая амплификация, где в первом раунде ПНР (без праймеров) подготовленные фрагменты подвергались удлинению с использованием Taq-SE полимеразы, в ходе которого происходило восстановление полноразмерных преимущественно химерных генов а/р-ЦГТаз. Реконструированные гены амплифицировали во втором раунде ПНР со стандартными праймерами Т7 и ТЗ, гомологичными последовательностям промоторов соответствующих фагов и фланкирующими гены обеих ЦГТаз в использованных фагмидных векторах, что, таким образом, давало возможность нарабатываться полноразмерным химерным генам.

На первый этап шаффлинга в реакционную смесь брали фрагменты обеих ЦГТаз: оц ДНК Р-ЦГТазы + дц а-ЦГТазы, оц ДНК а-ЦГТазы + дц ДНК (3-ЦГТазы, взятых в соотношении 100:1, и проводили их перетасовку при помощи ПЦР без праймеров. При этом комплементарные участки мелких фрагментов генов ЦГТаз почти случайным образом отжигались друг на друга согласно их нуклеотидной гомологии, образуя гетеродуплексы - дц структуры, в которых каждая из цепей была представлена попеременно разными родительскими ДНК. В результате был получен «трек» случайным образом образовавшихся фрагментов ДНК размером от 700 до 5000 и более п.н. (рис. 2, поз. 2). На второй этап брали аликвоту ДНК продукта из реакционной смеси первого раунда. В результате двухраундового шаффлинга по второму варианту был получен набор фрагментов ДНК около 2500-3000 п.н., соответствующих полноразмерным генам а-и Р- ЦГТаз (3025 п.н. и 2489 п.н.) (рис. 2, поз. 4). Основная наработка продукта наблюдалась в районе 3000 п.н., что и следовало ожидать, исходя из превалирующей концентрации а-ЦГТазы в реакционной смеси.

Рис. 2. Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных в результате ДНК шаффлинга.

1) I этап шаффлинга

(оц ДНК а-ЦГТазы+дц Р-ЦГТазы);

2) I этап шаффлинга

(оцДНК р-ЦГТазы+дц а-ЦГТазы);

3) II этап шаффлинга

(оцДНК [5-ЦГТазы+дц а-ЦГТазы);

4) II этап шаффлинга

(оц ДНК а-ЦГТазы+дц Р-ЦГТазы);

5) ДНК фага X, расщепленная рест-риктазой 2&{Е11.

Затем была проведена проверка, исключающая вариант, что получившийся фрагмент является либо результатом возможного восстановления исходной дц ДНК Р-ЦГТазы в ходе ПЦР, либо следствием наличия примесей дц ДНК в оц матрице а-ЦГТазы. Проверка заключалась в проведении 2 раундов шаффлинга с оц ДНК а-ЦГТазы в качестве единственного источника генетического материала (рис. 3А), а также в проведении сразу же второго раунда ДНК шаффлинга с образцами фрагментов оц ДНК гена а-ЦГТазы и дц ДНК гена Р-ЦГТазы, обработанными ДНКазой I, которые служили в качестве матрицы при проведении

Рис. 3. Контрольная проверка достоверности эксперимента.

1) ДНК фага расщепленная рестрик-тазой

2) II раунд шаффлинга только с оц ДНК ЦГТазы;

3) II раунд шаффлинга (оцДНК а+дц ДНК Р ЦГТазы):ДНКаза 1,100:1;

4) ДНК фага X, расщепленная рестрик-тазой

Ампликоны в интересующей нас области 2500-3000 п.н. отсутствуют.

ДНК шаффлинга (рис. ЗБ). Проведенные дополнительные контрольные эксперименты с заведомо увеличенным числом циклов не привели к образованию фрагментов ДНК, которые можно было бы рассматривать как ампликоны в интересующей нас области 2500-3000 п.н.

Разработанные ранее методики ДНК шаффлинга на дц матрицах (Stemmer, 1994а, b; Zhao, Arnold, 1997a) оперируют с клонированными в плазмидах генами нужных белков. При этом высокий выход химер не может быть обеспечен, так как высока вероятность того, что после процедуры денатурации во время ПЦР родительские последовательности будут преимущественно отжигаться сами на себя, т.к. являются 100% комплементарнымии. Проведение шаффлинга осложняется, если матричные ДНК, используемые в качестве пула рекомбини-руемых генов, не являются высокогомологичными, при этом число кроссоверов и, следовательно, степень перетасовки фрагментов будут ограничены. При проведении ДНК шаффлинга с использованием оц ДНК по Kikuchi et al. (2001) выход химер значительно повышается, но при этом и усложняется процедура его проведения: так как оц формы ДНК от каждой из «родительских» последовательностей должны быть разнонаправленными, т.е. должны быть представлены лидирующей цепью одного «родителя» и отстающей цепью

второго для их комплементарного отжига и повышения процента гетеродуплек-сов в пуле рекомбинантов. Использование модифицированного нами метода ДНК шаффлинга освобождает экспериментатора от необходимости проведения этапа дополнительного субклонирования, часто затруднительного, и снижает вероятность появления исходных нехимерных форм генов в пуле рекомбинан-тов: 100-кратная разница в концентрациях оц и дц матриц обеспечивает отжиг нужной цепи ДНК дц матрицы одного родителя на превалирующей оц матрице другой родительской ДНК.

2. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1. С учетом того, что способность к деструкции крахмала и алкалофильность являются удобными маркерными признаками, нами был проведен первоначальный скрининг большого числа бациллярных алкалофильных штаммов среди отобранных

образцов почвы и выделены подходящие чистые культуры бацилл, не обладающие способностью к росту и потреблению крахмала на твердой среде при рН 7. По результатам дальнейшей проверки способности отобранных штаммов расти на жидкой среде с 0.2-1% глюкозы в качестве единственного источника углерода был отобран бациллярный алкалофильный штамм-акцептор генетического материала (культура № 4 на рис. 4), способный нарабатывать биомассу на среде с глюкозой в 10 раз эффективней, чем на среде с 0.2-1% (}- ЦД (рис. 5).

Рис. 4. Значения СШбоо» культу-ральной жидкости, показываемые алкалофильными штаммами на средах с глюкозой и {-ЦД (рН 10).

Рис. 5. Отношение значений ООбоо культуральных жидкостей, показываемых алкалофильными штаммами на средах с ЦД и глюкозой (рН 10).

3. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 9 и ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 1005. Метод ДНК/геномного шаффлинга, заключающийся в трансформации протопластов микроорганизма-акцептора тотальной ДНК микроорганизма-донора, с последующим скринингом организмов, приобретших желаемые свойства, является стратегией быстрой селекции, позволяющей в короткие сроки получить штамм, обладающий (дополнительно к имеющимся у него полезным свойствам) еще одним или несколькими желаемыми признаками, по которым можно вести

дальнейший скрининг. ДНК/геномный шаффлинг был проведен при помощи трансформации протопластов алкалофильного штамма-реципиента тотальной ДНК ЦГТазного штамма, которая специально не фрагментировалась и имела размер около 30 - 50 т.п.н. Полученная смесь с разведениями была высеяна на чашки Петри с богатой средой с крахмалом (рН 10).

Среди образовавшихся клонов было получено около 80% рекомбинантов с крахмалгидролизующей активностью (рис. 6), в том числе, один клон с ЦГТазной активностью, которая детектировалась специальным тестом с фенолфталеином (37.5 мг/л) на среде с крахмалом (рН 10). Необходимо отметить, что такой высокий выход рекомбинантов явился следствием применения строгих условий отбора.

Анализ тотальной ДНК отобранных и родительских клонов методом RAPD показал существование различий в спектре образующихся фрагментов в районе от 1264 п.н. и выше, и 700 п.н. и ниже (рис. 7), в том числе между ре-комбинантными штаммами, названными нами (способным к

деструкции крахмала) и (показывающим ЦГТазную актив-

ность). Наиболее значительные различия наблюдаются в районе примерно от 1000 п.н. до 1929 п.н., от 1929 п.н. до 2323 п.н., и в области 3675 п.н. (рис. 8).

Второй раунд ДНК/геномного шаффлинга проводили при помощи трансформации протопластов алкалофила 9 (родитель 2 из предыдущего раунда) тотальной ДНК рекомбинантного штамма Bacillus sp. Cgt 10, полученного после первого раунда. Были получены схожие результаты, выразившиеся в высоком выходе рекомбинантов с крахмалгидролизующей активностью при рН 10.

Рис. 6. Рост рекомбинантов на среде с крахмалом, рН 10. Зоны деструкции крахмала (А) выявлены 10-ти минутной экспозицией с кристаллическим йодом.

Рис. 7. Анализ рекомбинантных образцов методом RAPD с праймером Ора-1 в агарозном геле.

1) ДНК фага X, расщепленная рест-риктазой

2) изолят ЦГТазного штамма Раепг-bacillussp 1005 - родитель 1;

3) изолят алкалофильного штамма Bacillus sp 9 - родитель 2;

4) изолят рекомбинантного штамма Bacillus sp gm 10;

5) изолят рекомбинантного штамма

10.

Ора-1 - 10-ти звенный праймер.

Рис. 8. Анализ рекомбинантных образцов методом RAPD с праймером Eric-1 в агарозном геле.

1) изолят рекомбинантного штамма 1

10;

2) изолят рекомбинантного штамма 2

10;

3) ДНК фага "к, расщепленная рест-риктазой

Eric-1 - 22-х звенный праймер.

4. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2. В качестве источника генетического материала был выбран галоалкалофильный штамм-денитрификатор Bacillus nitritophilus IB-256 (номер последовательности 16S РНК в NCBI AJ309562), хорошо развивающийся на средах с 4-7% NaCl, pH 99.5 (Гильванова, 2003), восстанавливающий нитраты и нитриты до газообразных продуктов. Нитритредуктазную активность детектировали по образованию пузырьков азота в глубинном посеве колоний микроорганизма в полужидкий

0.8% агар - средний слой безуглеводной среды, содержащей пептон и нитрит (рис. 9).

Выделенная и очищенная от белков ДНК штамма Bacillus nitritophilus IB-256, которая также как и в случае ДНК/геномного шаффлинга по схеме 1 никак специально не фрагментировалась и имела размер в среднем от 30 до 50 т.п.н., была взята в качестве донорного материала.

При помощи теста на способность расти в анаэробных условиях на среде с нитратом (рН 7.5) было проанализировано свыше 20-ти а- и ß-ЦГТазных штаммов. В качестве наиболее подходящего акцептора генетического материала был отобран штамм Paenibacillus species 839, не показывающий роста на тестовой среде и, соответственно, нитратредуктазной активности. 5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 839 и алкалофильным денитрификатором Bacillus nitritophilus IB-256. Состав питательных, накопительных, селективных сред и буферов, был модифицирован таким образом, чтобы в них не было углеводных источников. Это позволило исключить возможность ошибочно идентифицировать рост в анаэробных условиях, который мог возникнуть в результате переключения бактерий с дыхательного метаболизма на бродильный, за приобретенную способность к денитрификации или нитратному дыханию.

ДНК/геномный шаффлинг проводили посредством трансформации протопластов клеток реципиента - ЦГТазного штамма Paenibacillus sp. 839 тотальной ДНК галоалкалофильного штамма Bacillus nitritophilus IB-256. Смесь протопластов была анаэробно инкубирована в накопительной жидкой среде с нитратом, рН 7.9. На следующие сутки уже был заметен рост в нижней и средней части

Рис. 9. Образование пузырьков газа (N2) в глубинном 0.8% агаре на среде с 2% NaN02 у Bacillus nitritophilus IB-256.

анаэробного сосуда, который через двое суток наблюдался во всем объеме, тогда же был сделан первый пассаж: полученная взвесь высевалась на среду с крахмалом, рН 7.7. Так были получены первичные трансформанты и среди них был проведен клональный анализ Из 100 мкл суспензии выросло 26 колоний, обладающих крахмалгидролизующей активностью: 3 из них имели родительский морфотип 8 - выпуклые слизистые колонии, 23 - рекомбинантный, Я. Из последних: 14 колоний образовывали шероховатые колонии с неровными краями, а 9 имели схожую колониальную морфологию, но их особенностью можно считать частичное врастание колоний в среду. Среди полученных первичных рекомбинантов для дальнейших пассажей в жидкой среде с нитратом были отобраны по одной колонии типа 8 и Я (рис. 10А, Б)

Рис.10 Трансформанты с различной морфологией 8 (А) и Я (Б) типы колоний

Через 3-е суток были осуществлены первые анаэробные пассажи бактериальной суспензии из верхней части сосуда в жидкую среду с 0 2% и 0.5% №N03 (рН 7.8). При этом лучший рост в анаэробных пробирках наблюдался на среде с 0.5% нитрата. В процессе пассажирования проводили высев рекомби-нантов на среду с крахмалом (рН 7 5-7 8) Единичными колониями вторичных трансформантов инокулировали среду с нитратом и/или нитритом Из анаэробной культуры делали высев на твердые среды (рис. 11)

Рис. 11 Анаэробный рост на безуглеводной среде с нитратом: родительский штамм РаетЬаыИш ¡р 839 (1) не показывает роста, среда прозрачная, рекомбинантный штамм, вариант 8 839Ъ^ (2), рекомбинантный штамм 2, вариант Я 8396Ь (3) - заметен рост во всем объеме среды.

Спустя 6 суток из исходного анаэробного сосуда был сделан высев на твердую среду с крахмалом (рН 7.5) так называемых «поздних» трансформантов - колонии типа R, которые показывали очень высокую скорость роста и интенсивное потребление крахмала (рис. 12). Анализ полученных колоний продемонстрировал, что клоны, имеющие морфотип S, проявляют невысокую стабильность при пересевах. Клоны, обладающие R морфотипом, сильно отличаются по своим физиолого-биохимическим характеристикам, как от родительского штамма, так и от трансформантов типа S.

Рис. 12. Рост «поздних» рекомбинан-тов на тестовой среде с крахмалом (16-ти часовая культура). 10-ти минутная экспозиция с кристаллическим йодом.

Обобщая данную часть работы, можно заключить, что в результате ДНК/геномного шаффлинга произошел перенос генетического материала от донора алкалофильной денитрифицирующей культуры

256 к циклодектриногенному акцептору Paenibacillus sp. 839, что выразилось в приобретении потомством способности расти в анаэробных условиях в присутствии NaNOj в концентрации 0.2-1%. Причем, некоторые штаммы активно восстанавливали и NaNOj в концентрации 0.2-0.5%, а также приобрели способность расти в щелочной области рН (рН 9-9.5) на среде с 5-7% содержанием NaCl, т.е. в результате эксперимента была повышена гало- и рН-толерантность штамма-акцептора генетического материала (табл. 1), наряду с сохранением ЦГТазной активности (рис. 13).

На заключительном этапе ДНК/геномного шаффлинга были созданы селективные условия, в которых из суспензии регенерировавших протопластов родительского штамма могли дать рост лишь те трансформанты, которые приобрели необходимые для выживания в данной среде свойства, что позволило уже на первых этапах скрининга работать с рекомбинантами. Возможность

возникновения среди потомства нетрансформированных клеток штамма-акцептора генетического материала, сводилась к минимуму, благодаря тому, что на этапе первоначального скрининга была подтверждена неспособность ЦГТазного штамма к анаэробному росту на нитратсодержащей среде.

Табл. 1.

Физиолого-биохимические свойства родительского и полученных рекомбинантных штаммов

признак родительский штамм 839 рекомбинантный штамм 839 в рекомбинантный штамм 839 Ы

размер и форма клеток подвижные среднего размера палочки подвижные среднего размера палочки подвижные крупные палочки

изменчивость колониальной морфологии расщепление не наблюдается расщепление на 2 типа колоний: мелких 839згаа11 и крупных 8391^ расщепление на аспорогенные 8396а колонии и колонии с нормальной споруля-цией 8396Ь

скорость роста на твердых средах средняя Средняя очень высокая

способность к анаэробному росту в присутствии: 0.5% нитрата 1% нитрата 0.5% нитрита - +/- + + +

способность к росту на среде с рН 9-9.5 5% КаС1 7% КаС1 - - + + +

крахмалгадроли-зукяцая активность + + +

ЦГТазная активность + + +

отрицательная реакция + положительная реакция

+/- слабый или нестабильный рост при тестировании

А Б

Рис. 13. Микрофотография кристаллов ЦД, образуемых рекомбинантными штаммами 839$та11 на среде с крахмалом (А), 8396Ь на среде с крахмалом и 3% №С1. 10-ти минутная экспозиция с йодом.

Чтобы исключить контаминацию клетками или спорами штамма-донора в процессе выделения ДНК для трансформации, раствор ДНК выдерживали 16 часов с фенолом, а затем после удаления следов фенола осуществляли контроль на бактериальное загрязнение высевом аликвоты ДНК на питательную среду.

Полученные нестабильные формы трансформантов, которые после нескольких пересевов теряли способность к анаэробному росту на среде с нитратом, скорее всего являлись промежуточными рекомбинантами, приобретшими лишь часть генетического материала, необходимого для полного и стабильного проявления нужного фенотипического признака. Учитывая, что для обнаружения новых свойств необходимо определенное количество времени с момента включения соответствующего гена в хромосому (и чем больше времени пройдет, тем сильнее этот признак закрепится, а в популяции начнут преобладать штаммы, обладающие этим признаком), то можно предположить, что колонии, полученные в результате высева суспензии через 6 суток, являются «поздними» и более полными рекомбинантами. На основании схожести морфологических и биохимических свойств трансформантов, полученных в результате позднего высева из исходной анаэробной среды, и свойств штамма Я 8396, был сделан вывод, что отобранные клоны представляют собой одну и ту же культуру.

То обстоятельство, что в результате эксперимента были получены реком-бинанты двух типов, может быть объяснено не только спонтанным возникнове-

нием морфологических мутаций, влияющих на форму, консистенцию и, отчасти, величину колоний, но и передачей при трансформации генов, влияющих на морфологию. В большинстве случаев у мутантов меняются свойства поверхностных слоев клетки, что в конечном итоге приводит к изменению морфологии колонии. Кроме того, морфологию колоний часто меняют мутации, влияющие на спорообразование.

В результате проделанной работы было показано, что чистые линии штаммов-потомков S и R типов обладали одновременно «новыми» и «старыми» свойствами, что позволяет предположить возможность встраивания части генетического материала донора в организм акцептора. Наше предположение подтверждается как рядом проведенных морфолого-биохимических анализов культур трансформантов, а также и данными анализов тотальных ДНК клонов методом RAPD с различными праймерами, из которых видны легко обнаруживаемые различия в профилях ДНК родительских штаммов и созданных в ходе выполнения данной работы (рис. 14, 15) В реакции были использованы прай-меры, специально подобранные для Bacillus (Hsueh, 1999) и синтезированные в нашей лаборатории. Разная длина этих олигонуклеотидов (праймер Ора-1 10-ти звенник, праймер Епс-1 22-х звенник) позволила получить различные наборы фрагментов ДНК в различных областях.

Рис. 14. Анализ тотальной ДНК родительских и рекомбинантных клонов типа S методом RAPD в 6% ПААГ.

1) Вас mtritophilus 256, праймер Ора-1;

2) 839big, праймер Ора-1;

3) 839small, праймер Ора-1;

4) Paembacillus sp 839, праймер Ора-1;

5) Вас mtritophilus 256, праймер Епс-1;

6) 839big, праймер Eric-1;

7) 839small, праймер Eric-1;

8) 839, праймер Епс-1.

Рис. 15. Анализ тотальной ДНК родительских и рекомбинантных клонов типа R методом RAPD в 6% ПААГ.

1) Paembacillus sp 839, праймер Eric-1;

2) 8396а, праймер Eric-1;

3) 8396b, праймер Eriс-1; 4}_256, праймер Eric-1 ;

Вас mtritophilus

5) Paembacillus sp 839, праймер Ора-1;

6) 8396а, праймер Ора-1;

7) 8396b, праймер Ора-1;

8) Вас nitritophilus 25 6, праймер Ора-1.

При использовании более короткого олигонуклеотида Ора-1 (рис. 14, поз. 1-4; рис. 15, поз. 5-8) получающийся набор полос соответствовал высокомолекулярным фрагментам ДНК, тогда как при работе с 22-х звенным праймером распределение полос было более равномерным (рис. 14, поз. 5-8; рис. 15, поз.1-4). Общей особенностью проведенных RAPD анализов с клонами R и S типов является то, что они выявляют генетическое сродство рекомбинантных клонов всех типов с акцептором генетического материала - родительским ЦГТазным штаммом Paembacillus sp 839 в большей или меньшей степени, в зависимости от набора приобретенных свойств, не свойственных реципиенту. Следует также отметить, что разделение на субтипы внутри химерных клонов S и R типов, сделанное нами на основе их морфологической изменчивости, подтверждается данными их генетического анализа (рис. 14, поз. 2-3; рис. 15, поз. 2-3,6-7).

Таким образом, проведенный анализ электрофоретических профилей ДНК, образовавшихся в результате амплификации с двумя типами произвольных праймеров различной длины, показал наличие у них как общих, так и отличающихся полос ДНК, что свидетельствует о частичном переносе генетического материала от организма донора в организм акцептора. Причем, использование двух праймеров в параллельных реакциях позволило нам получить более полную картину и провести более точный анализ.

ВЫВОДЫ

1) Впервые апробирован вариант ДНК шаффлинга с использованием в качестве исходного генетического материала обработанных ДНКазой I генов а- и ß-ЦГТаз, взятых соответственно в виде оц и дц ДНК в существенно различающихся пропорциях (100:1), и показана принципиальная возможность его проведения.

2) Впервые осуществлен межвидовой ДНК/геномный шаффлинг между бациллярными алкалофильным (в одном эксперименте) и галоалкалофильным (в другом эксперименте) и ЦГТазными штаммами путем индуцированной поли-этиленгликолем трансформации их протопластов тотальной ДНК.

3) Показано, что микроорганизмы-продуценты ЦГТаз могут выступать как в качестве донора, так и в качестве акцептора генетического материала, поскольку в экспериментах по двунаправленному горизонтальному переносу генов (от бациллярного штамма - ЦГТазному и, наоборот, - от ЦГТазного штамма - бациллярному) получены жизнеспособные химерные конструкции, обладающие новыми свойствами.

4) Анализ полученных в результате ДНК/геномного шаффлинга дочерних клонов и исходных родительских штаммов с помощью RAPD показал, что произошел однонаправленный перенос генетического материала от донорного микроорганизма к акцепторному.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мингазетдинова С.Р., Бикбулатова С.М., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Искусственная эволюция ферментов а- и ß- циклодекстринглюкантрансфераз in vitro IIМатериалы 52-й конф. студ., аспир. и мол. ученых. УГНТУ, Уфа, 2001. Т. 2. С. 34.

2. Мингазетдинова С.Р. Исследование in vitro ферментов а- и (3- цикло-декстринглюкантрансфераз // Материалы IV Республиканского конкурса научных работ студентов РБ. УГАТУ. Уфа, 2002. С. 64.

3. Мингазетдинова С.Р., Бикбулатова С.М., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Конструирование химерных генов циклодекстринглюканотранфераз методом ДНК-шаффлинга // Материалы III Съезда Биохимического Общества. Санкт-Петербург, 2002. С. 28.

4. Мингазетдинова С.Р., Бикбулатова С.М., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Использование ДНК-шаффлинга для получения химерных конструкций генов альфа- и бета-ЦГТаз // Материалы 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2002. Т. 1. С 282.

5. Мингазетдинова С.Р., Бикбулатова С.М., Чемерис А.В., Вахитов В.А. Искусственная эволюция генов циклодекстрин глюканотрансфераз in vitro // Материалы XIV зимней международной молодежной научной школы. Москва, 2002. С 44.

6. S. Mingazetdinova, A. Chemeris, N. Usanov, V. Vakhitov. Directed evolution of cyclodextrin glucanotransferases by DNA/genome shuffling // 11th European Congress on Biotechnology. Switzerland, 2003. P. 116.

7. Мингазетдинова С.Р. ДНК/геномный шаффлинг циклодекстрин глюка-нотрансфераз // Материалы II конкурса научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ. Уфа, 2003. С. 55-57.

8. Мингазетдинова С.Р., Усанов Н.Г. ДНК/геномный шаффлинг - новый метод направленной эволюции // Материалы XVI зимней молодежной научной школы. Москва, 2004. С. 91.

9. Мингазетдинова С.Р. ДНК/геномный шаффлинг - новый подход в направленной эволюции // Материалы первой Всероссийской научной конференции «Исследование человека и объектов живой природы». Нижний Новгород, 2004. С. 12-14.

Мингазетдинова Светлана Рафаильевна

Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуценторв in vitro

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 18.11.2004 Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 V|6. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. 1,7. Тираж 100 экз. Заказ № 322.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Обзор методов искусственной эволюции in vitro.

1.1.1. Классификация методов.

1.1.2. Методы, основанные на мутагенезе.

1.1.3. Методы, основанные на рекомбинации.

1.1.4. Методы скрининга и селекции.

1.1.5. Применение ДНК шаффлинга.

1.1.6. Искусственная эволюция in silico (компьютерное моделирование).

1.1.7. Дальнейшие перспективы развития методов искусственной эволюции.

1.2. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза), ее продуценты и продукты реакции

1.2.1. Микроорганизмы - продуценты ЦГТаз.

1.2.2. Механизм действия и свойства ЦГТаз.

1.2.3. Свойства и применение циклодекстринов.

1.2.4. Поиск и получение новых ЦГТазных штаммов.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследований.

2.2. Микробиологические методы

2.2.1. Питательные среды.

2.2.2. Селективные среды и буферы.

2.2.3. Условия культивирования и инокуляции.

2.2.4. Отбор почвенных образцов, получение чистых линий, микроскопия.

2.3. Биохимические методы

2.3.1. Определение оптической плотности биомассы.

2.3.2. Определение циклодекстрин глюканотрансферазной активности.

2.4. Молекулярно-биологические методы исследований

2.4.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

2.4.2. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в полиакриламидном геле.

2.4.4. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.4.5. Очистка ДНК хроматографией с ДЭАЭ-целлюлозой.

2.4.6. Расщепление ДНК рестриктазами.

2.4.7. Выделение векторной ДНК «медленным» способом.

2.4.8. Лигирование фрагментов ДНК с векторной ДНК.

2.4.9. Подготовка компетентных клеток.

2.4.10. Трансформация компетентных клеток Е.coli плазмидной ДНК.

2.4.11. Получение одноцепочечной ДНК.

2.4.12. Фрагментирование ДНК при помощи ДНКазы I и ультразвука.

2.4.13. ДНК шаффлинг.

2.4.14. Выделение и очистка тотальной ДНК.

2.4.15. Геномный шаффлинг.

2.4.16. ДНК/геномный шаффлинг.

2.4.17. Анализ тотальных ДНК при помощи метода RAPD.

2.5. Реактивы и материалы.

2.6. Составы использованных стандартных растворов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Проведение асимметричного ДНК шаффлинга с одно и двуцепочечными ДНК).

3.2. Скрининг и отбор штаммов для геномного шаффлинга.

3.3 Проведение геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 12 и

ЦГТазным штаммом Bacillus sp. 1069.

3.4. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 1.

3.5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между алкалофильным штаммом Bacillus sp. 9 и

ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 1005.

3.6. Скрининг и отбор штаммов для ДНК/геномного шаффлинга 2.

3.7. Проведение ДНК/геномного шаффлинга между ЦГТазным штаммом Paenibacillus sp. 839 и алкалофильным денитрификатором Bacillus nitritophilus IB-256.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro"

Актуальность темы. Искусственная (направленная) эволюция белков как новое течение в биотехнологии возникла в качестве инструментария для осуществления белковой инженерии. По сути, искусственная эволюция, в отличие от эволюции естественной, является более избирательной, имеет определенную специфическую цель, ограничена во времени, и, главное, контролируется экспериментатором, хотя ее ключевые процессы (мутации, рекомбинация и скрининг) в общем имитируют естественно протекающие в природе процессы.

Работы по направленной эволюции белков, а именно по химическому и радиационному мутагенезу, начали проводиться с начала 80-х гг. Начало 90-х гг. знаменует собой наступление промышленной эры молекулярной биотехнологии. Бурное развитие этой отрасли, рост числа предприятий диктует необходимость получения новых, безопасных для здоровья человека биокатализаторов естественного происхождения. В 1994 г. появляется принципиально новый подход в молекулярной эволюции - ДНК шаффлинг (от английского слова "shuffling" - перетасовка), который указал перспективу перехода от работ по мутагенезу к использованию рекомбиногенных методов или, иначе, от простой асексуальной репродукции in vitro к сексуальной. С момента опубликования первых данных об удачном осуществлении экспериментов по ДНК шаффлингу (Stemmer, 1994а; 1994b) эта техника получила широкое распространение и практическое применение. На его основе было создано множество методов (Zhao et al., 1998; Ostermeier, 1999; Abecassis et al., 2000; Gibbs et al., 2001; Ness et al., 2002; Zha et al., 2003). Еще одним толчком к развитию методов направленной эволюции послужил переход от работ на уровне субгеномных фрагментов к целым микробным геномам с целью аккумуляции и комбинирования полезных мутаций от двух и более искусственно выбранных «родителей» в одном организме.

В качестве модели для наших экспериментов по искусственной эволюции in vitro был выбран промышленно важный фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза) и его продуценты. ЦГТаза обладает уникальным свойством превращать крахмал в циклодекстрины (ЦД), широко применяемые в различных отраслях промышленности. Способность к синтезу этого фермента встречается среди прокариот очень редко, что позволяет использовать этот признак в качестве маркерного и проводить селекцию с большой точностью.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение возможности осуществления in vitro ДНК шаффлинга между ранее секвенированными генами а- и (3- ЦГТаз, клонированными в плазмиде pBluescript SK(-), и имеющими около 60% гомологии на нуклеотидном уровне; изучение возможности получения in vitro химерных циклодекстриногенных штаммов при помощи геномного и ДНК/геномного шаффлинга. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Выделение одноцепочечных и двуцепочечных ДНК а- и (3- ЦГТаз, клонированных ранее в плазмидном векторе pBluescript SK(-) и получение их фрагментов размером 150-300 пар нуклеотидов;

2. Проведение двухраундового ДНК шаффлинга путем рекомбинации одноцепочечных и двухцепочечных ДНК, взятых в разных пропорциях, для получения случайным образом восстановленного полноразмерного гена;

3. Скрининг и селекция кандидатов для геномного и ДНК/геномного шаффлинга среди ЦГТазных штаммов и почвенных изолятов;

4. Проведение геномного шаффлинга при помощи слияния протопластов между циклодекстриногенным и алкалофильным бациллярными штаммами;

5. Проведение ДНК/геномного шаффлинга посредством трансформации протопластов алкалофильного штамма тотальной ДНК ЦГТазного штамма (схема 1) и осуществление трансформации протопластов ЦГТазного штамма тотальной ДНК галоалкалофильного бациллярного штамма (схема 2);

6. Скрининг и селекция клонов, обладающих амилолитической и ЦГТазной активностью, полученных в результате геномного и ДНК/шаффлинга; сравнительный анализ отобранных и исходных штаммов методом RAPD. Научная новизна работы. Впервые проведен асимметричный ДНК шаффлинг генов ос- и (3- ЦГТаз с использованием исходных матричных ДНК, представленных разными формами этой молекулы, взятыми в различных пропорциях для преимущественного отжига 5'—»3'-цепи ДНК от одной ЦГТазы и 3' —>5'-цепи другой. Проведен межвидовой однонаправленный перенос генов in vitro путем индуцированной полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформации регенерирующих протопластов одного бациллярного штамма с помощью тотальной ДНК другого и впервые получены жизнеспособные химерные конструкции, обладающие наряду с сохранением прежних (ЦГТазной активности) и новыми свойствами (способностью к анаэробному росту в присутствии нитрата и/или нитрита, рН-толерантностью и солеустойчивостью). Таким образом была показана возможность осуществления искусственной эволюции in vitro применительно к нашей модели исследования и разработаны соответствующие методы.

Практическая значимость работы. Разработан метод асимметричного ДНК шаффлинга, позволяющий повысить выход химерных конструкций, состоящих из фрагментов родительских генов, и предложен метод однонаправленного переноса генетического материала при помощи межвидовой высокоэффективной трансформации бактериальных протопластов тотальной ДНК другого организма. В результате ДНК/геномного шаффлинга получены штаммы рН- и галотолерантных рекомбинантов, обладающие ЦГТазной активностью и способные к росту в анаэробных условиях на среде с нитратом и нитритом. Полученные химерные культуры могут быть использованы в качестве модели для дальнейших исследований, а также для создания промышленных продуцентов ЦГТаз.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 52-й конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2001); на IV республиканском конкурсе научных работ студентов РБ (Уфа, 2002); на III Съезде Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 2002); на 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002); на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002); на 11-том Европейском Конгрессе по Биотехнологии (Базель, Швейцария, 2003); на II конкурсе научных работ молодых ученых и аспирантов УНЦ РАН и АН РБ (Уфа, 2003); на XVI зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна

ВЫВОДЫ

1) Впервые апробирован вариант ДНК шаффлинга с использованием в качестве исходного генетического материала обработанных ДНКазой I генов а- и p-циклодекстрин глюканотрансфераз, взятых соответственно в виде одноцепочечной и двуцепочечной ДНК в существенно различающихся пропорциях (100:1), и показана принципиальная возможность его проведения.

2) Впервые осуществлен межвидовой ДНК/геномный шаффлинг между циклодекстрин глюканотрансферазным и алкалофильным штаммом (в одном эксперименте), и галоалкалофильным и циклодекстрин глюканотрансферазным штаммом (в другом эксперименте) путем индуцированной полиэтиленгликолем трансформации протопластов тотальной ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С середины прошлого столетия множество улучшенных вариантов микроорганизмов и растений было создано при помощи радиационного и химического мутагенеза, заключающихся во введении ряда случайных замен в те или иные гены. И хотя такие способы мутагенеза широко применялись ранее, однако они практически всегда оказывали побочные, в том числе и вредные, эффекты на организмы, а применение полученных таким образом мутантных микроорганизмов в таких отраслях промышленности как пищевая, медицинская или фармацевтическая было лимитировано по соображениям безопасности для здоровья человека. ДНК шаффлинг представляет собой некую альтернативу, так как рекомбинирует естественно существующие конкретные природные гены. К настоящему времени при непосредственном использовании этой технологии выполнено уже более сотни проектов по улучшению тех или иных свойств организмов. При этом тщательный подбор исходного материала (генов или целых организмов) для искусственной эволюции обеспечивает половину успеха. Были получены варианты ферментов с увеличенной активностью, измененной энантиоселективностью, усиленной рН-толерантностью, термостабильностью, улучшенным взаимодействием с кофакторами, уменьшенной токсичностью и имунногенностью и так далее, причем многие из «прошаффленных» гибридов показывают улучшение того или иного признака в диапазоне от 3 до 30000 раз.

Несмотря на то, что циклодекстрин глюканотрансфераза безусловно является интересным объектом для исследования (а продукты ее энзиматического синтеза - циклодекстрины - очень востребованными), на данный момент изменение свойств этого фермента было достигнуто лишь при помощи радиационного и химического мутагенеза естественных ЦГТазных штаммов, а также в результате клонирования генов ЦГТаз в разных микроорганизмах-хозяевах и помещения их под контроль сильных индуцибельных промоторов. Однако сведений о применении современных методов направленной эволюции in vitro, таких как ДНК шаффлинг, геномный либо ДНК/геномный шаффлинг, предложенных нами в этой работе, нет.

Процесс ДНК шаффлинга проводится с использованием либо двуцепочечных форм матричных ДНК (Stemmer, 1994а, Ь), либо на одноцепочечных матрицах (Kikuchi et al., 2000) целенаправленно выбранных генов, обладающих средним уровнем гомологии на нуклеотидном уровне не менее 50%, ниже которого проведение ДНК шаффлинга не представляется эффективным. Главным условием общепринятых процедур является то, что два или более гена интересующих экспериментаторов ферментов должны быть клонированы в плазмиде, несущей места для отжига общих «гнездовых» праймеров для того, чтобы из пула разнообразных по размеру фрагментов, получившихся в результате первого раунда шаффлинга, амплифицировать при помощи праймеров во втором раунде последовательности, соответствующие полноразмерным формам исходных генов. Причем, для осуществления ДНК шаффлинга на одноцепочечных матрицах одноцепочечные формы ДНК от каждой из «родительских» последовательностей должны быть разнонаправленными, то есть должны быть представлены лидирующей цепью (5'—>3') одного «родителя» и отстающей цепью (3'—>5') второго для их комплементарного отжига и повышения выхода химер. Это может быть достигнуто путем клонирования фрагментов ДНК, несущих гены белков, таким образом, что выделенные одноцепочечные формы будут представлены разными цепями: 5'—>3' и 3'—>5'. Это может быть достигнуто клонированием в фагмидных векторах, имеющих противоположно направленный полилинкер, например, pBluescript SK(-)h pBluescript KS(-), или в векторах, способствующих наработке (+)- и (-)-цепей, например, pBluescript SK(-) и pBluescript SK(+).

Разработанная и апробированная в данной работе модификация метода ДНК шаффлинга позволяет избежать трудностей, связанных с клонированием нужных генов в определенной ориентации или, если в наличии уже имеются нужные гены в составе плазмид, то с наработкой и очисткой их разнонаправленных одноцепочечных форм. В качестве матрицы для данного метода могут быть использованы фрагменты одноцепочечной ДНК одного клонированного гена (причем неважно (+) или (-) цепи), и фрагменты двуцепочечной ДНК другого гена, взятые в значительно отличающихся соотношениях. Причем этот второй ген может быть как клонированным, так и находиться в составе тотальной ДНК несущего его штамма, что открывает широкие перспективы по вовлечению в искусственную эволюцию гораздо большего числа штаммов-продуцентов. Превалирующая концентрация одноцепочечной ДНК одного гена обеспечивает преимущественный отжиг на нем частично комплементарной цепи двуцепочечной формы другого гена, служащей затравками для ДНК-полимеразы, что приводит повышенному уровню выхода химер. Так, в реакционную смесь была взята одна часть двуцепочечной ДНК (3-циклодекстрин глюканотрансферазы и 100 частей одноцепочечной ДНК гена а-циклодекстрин глюканотрансферазы. Это позволило в результате двух раундов шаффлинга получить амплификат размером около 3000 п.н., соответствующий по длине полноразмерному гену а-ЦГТазы (3025 п.н.), что является логичным, исходя из его превалирующей концентрации, но образование которого не могло произойти без участия фрагментов гена (3-ЦГТазы.

В рамках исследования возможности осуществления искусственной эволюции продуцентов ЦГТазных штаммов был применен новый метод для быстрого манипулирования комплексными фенотипами организмов -геномный шаффлинг. Этот метод основан на индуцированном полиэтиленгликолем слиянии клеток микроорганизмов, лишенных при помощи лизоцима своих стенок, в результате чего между ними может произойти обмен генетическим материалом. В результате межвидового слияния протопластов между ЦГТазным штаммом Bacillus species 1069 и алкалофильным почвенным изолятом Bacillus species 12 полученные клоны, обладающие крахмалгидролизующей активностью на селективной среде с рН 10, были, скорее всего, все же артефактами, так как не сохранили таковую активность при повторном пересеве. В то же время можно предположить, что полученные трансформанты являлись нестабильными гетерогенотами, наследующими обе родительские хромосомы, которые при повторном пересеве расщеплялись на клоны с родительскими генотипами. Вероятно, использованные в нашем эксперименте микроорганизмы не обладали значительной степенью нуклеотидной гомологии, достаточной для осуществления межвидового обмена участками ДНК путем слияния протопластов.

Не вызывает сомнения, что трансформация является одним из основных путей обмена генетическим материалом в природных популяциях бактерий. Вместе с тем, в лабораторных условиях разработан целый ряд искусственных способов введения чужеродной ДНК в бактерии: трансформация регенерирующих протопластов, введение ДНК в состав липосом, трансформация, индуцированная полиэтиленгликолем или электрическими разрядами. Однако до сих пор наибольшее прикладное значение имеет плазмидная трансформация как способ введения молекул-векторов или переносчиков, несущих участки чужеродной ДНК, в бактериальные клетки.

Разработанный нами метод ДНК/геномного шаффлинга является, по сути, быстрым методом селекции, позволяющим при правильно разработанной стратегии и направленных условиях отбора по приобретенному фенотипическому признаку получить рекомбинантные микроорганизмы в достаточно короткий срок. Этот новый вид горизонтального трансфера генов был апробирован нами на алкалофильных и ЦГТазных штаммах. В первом эксперименте была проведена ПЭГ-индуцированная трансформация протопластов почвенного алкалофильного штамма Bacillus sp. 9 (оптимум роста рН 10), не способного гидролизировать крахмал, тотальной ДНК нормофильного ЦГТазного штамма Paenibacillus sp. 1005, выразившаяся в приобретении рекомбинантами нового свойства - способности к деструкции крахмала при рН 10. Эксперимент был проведен повторно, а с рекомбинантами, полученными на первом этапе, был проведен второй раунд ДНК/геномного шаффлинга. Во всех случаях эффективность трансформации достигала 80%. В другом эксперименте в качестве донора генетического материала был выбран галоалкалофильный штамм Bacillus nitritophilus IB-256 (оптимум роста рН 99.5, NaCl 4-7%), обладающий способностью к денитрификации (восстановлению нитратов и нитритов в анаэробных условиях), а в качестве акцептора - нормофильный ЦГТазный штамм Paenibacillus sp. 839. В результате были получены стабильные рекомбинанты с измененным морфотипом, обладающие рядом новых свойств: способностью к нитратному дыханию и восстановлению нитритов (0.2-1% NaNC>3, 0.2-0.5% NaNC^), повышенной рН-устойчивостью и галотолерантностью (рН 9-9.5, NaCl 5-7%), наряду с сохранением циклодекстрин глюканотрансферазной активности.

Таким образом, на нашей модели исследования - клонированных в фагмидном векторе pBluescript SK(-) в микроорганизме E.coli генах а- и (3-циклодекстрин глюканотрансфераз штаммов Paenibacillus macerans ИБ 3K-I (ВКМ В-1794), Bacillus species 6.6.3 (ВКМ В-1973Д) и ЦГТазных штаммах Bacillus species 1069, Paenibacillus species 1005, Paenibacillus species 839 была показана возможность осуществления их искусственного эволюционирования, используя современные методы молекулярной эволюции, что является безусловным шагом в направлении по дальнейшему улучшению промышленных характеристик ферментов циклодекстрин глюканотрансфераз и возможного дальнейшего использования их в прикладном аспекте.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна, Уфа

1. Абелян В. А. Цикл о декстрины: получение и применение.- Ереван, Институт микробиологии Национальной Академии Наук, 2001.- 526 с.

2. Бикбулатова С.М. Циклодекстрин глюканотрансферазы с альфа- и бета-специфичностями и сравнительный анализ их структуры // Дисс.канд. биол. наук: 03.00.04.- Уфа.- 1997.- 146 с.

3. Воробьева И.П., Хмель И.А., Альфельди Л. Индуцированная полиэтиленгликолем трансформация протопластов Bacillus meganterium плазмидной ДНК // Доклады Академии Наук СССР.- 1980.- Т. 251.- №4.- С. 977-980.

4. Гильванова Е.А. Скрининг и изучение новых экстремофильных микроорганизмов, устойчивых к повышенным концентрациям солей натрия с биоцидными свойствами // Дйсс. .канд. биол. наук,- Уфа. 2003.

5. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. Пер. с англ. -М.: Мир.- 1988.- 538 с.

6. Григорьева Т.М., Азизбекян P.P. Слияние протопластов у Bacillus thuringiensis //Генетика.- 1980.- Т. XVI.- №10.- С. 1786-1792.

7. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование (практическое руководство).- М.: Мир, 1984.-425 с.

8. Мишустин Е.Н., Емцев В.Г. Микробиология. 3-е издание.- М.: Агропромиздат, 1987.- 368 с.

9. Прозоров А.А. Трансформация у бактерий.- М.: Наука, 1988.- 255 с.

10. Ю.Усанов Н.Г., Логинов О.Н. Синтез внеклеточной ЦГТ-азы бактериямигруппы Bacillus macerans II Сборник: Актуальные вопросы битехнологии.-Уфа, 1990.- С. 22-30.

11. Циклодекстрины // Сборник статей под ред. Егорова Н.С.- Итоги науки и техники. Микробиология.- М.: ВИНИТИ, 1988. Т. 20, часть 1.-180 с.

12. Циклодекстирны // Сборник статей под ред. Егорова Н.С.- Итоги науки и техники. Микробиология.- М.: ВИНИТИ, 1988. Т. 21, часть 2.- 158 с.

13. Яковенко К.Н., Троицкий Н.А. Протопласты микроорганизмов.- АН Белорусской ССР, Институт генетики и цитологии, Белорусское общество генетиков и селекционеров, Минск, Наука и Техника, 1985.- 256 с.

14. Allantaz F., Lee M. DNA shuffling // Literature assignment, Course in protein structure and function.- 2001.

15. Altamirano M., Blackburn J. Directed evolution of new catalyc activity using a/p-barrel scaffold //Nature.- 2000.- V. 403.- P. 617-622.

16. Ando Т., Dawn I., Kusugami K., Blaser M. HP0333, a member of the drpA family, is involved in natural transformation in Helicobacter pylori II J. Bacterid.-1999,- V. 181.- №18.- P. 5572-5580.

17. Aras R., Small A., Ando Т., Blaser M. Helibacter pylori interstrain restriction-modification diversity prevents genome subversion by chromosomal DNA from competing strains // Nucl. Acids Res.- 2002,- V. 30.- №24.- P. 5391-5397.

18. Arkin A.P., Youvan D.C. An Algorithm for Protein Engineering: Simulations of Recursive Ensemble Mutagenesis // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 1992.- V. 89.-№16.-P. 7811-7815.

19. Arnold F. Design by directed evolution// Accounts of Chemical Research.- 1998.-V. 31.-P. 125-131.

20. Arnold F. Combinatorial and computational challenges for biocatalyst design // Nature.- 2001.- V. 409.- P. 253-257.

21. Ashikaga S., Nanamiya H., Ohashi Y., Kawamura F. Natural genomic competence in Bacillus subtilis Natto OK2 11 J. Bacteriol.- 2000.- V. 182.- №9.- P. 2411-2415.

22. Bacher J., Reiss B. Anticipatory evolution and DNA shuffling // Genome Biology.-2002.-V. 3.-№8.

23. Baltz R.H. Genetic recombination in Streptomyces fradiae by protoplast fusion and cell regeneration // Journal Gen. Microbiol.- 1978.- V. 107.- P. 93-102.

24. Barriault D., Plante M.M., Sylvestre M. Family shuffling of a targeted bhpA region to engineer biphenyl dioxygenase // J. Bacterid.- 2002.- V. 184.- №4.- P. 3794-3800.

25. Berndt C., Meier P., Wackernagel W. DNA restriction is a barrier to natural transformation in Pseudomonas slutzeri JM300 // Microbiol.- 2003.- V. 149.- P. 895-901.

26. Bittker J., Le В., Liu D. Nucleic acid evolution and minimization by nongomologous random recombination // Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.- №10.-P. 1024-1029.

27. Bogarad D., Demm M. A hierachical approach to protein molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- V. 96.- P. 2591-2595.

28. Boles E., Miosga T. A rapid and highly efficient method for PCR-based site-directed mutagenesis using only one new primer // Curr. Genet.- 1995.- V. 28.-№2.-P. 197-198.

29. Bornscheuer U., Pohl M. Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design // Curr. Opin. Chem. Biol.- 2001.- V. 5.- P. 137-143.

30. Buckling A., Wills M., Colegrave N. Adaptation limits diversification of experimental bacterial populations // Science.- 2003.- V. 302.- P. 2107-2109.

31. Burton G., Cowan D. The search for the ideal biocatalyst // Nat. Biotechnol.-2002.-V. 20.-P. 37-44.

32. Chang S., Cohen S.N. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA // Mol. Gen. Genet.- 1979.- V. 168.- №1.- P. 111115.

33. Chang H.Y., Irwin P.M. Effects of mutations in the starch-binding domain of Bacillus macerans cyclodextrin glycosyltransferase // J. Biotechnol.- 1998.- V. 65.-№2,3.- P. 192-202.

34. Chang С., Chen Т. Evolution of cytokine using DNA shuffling //Nat. Biotechnol.-1999.-V. 17.-P. 793-797.

35. Chen K., Arnold F. Tuning the activity of an enzyme of unusual environment: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993.- V. 90.- P. 5618-5622.

36. Cherry J.R., Lamsa M.H., Vind J. Directed evolution of fungal peroxidase // Nat. Biotechnol.- 1999.- V. 17,- №4.- P. 379-384.

37. Cherry J.R. Directed evolution of microbial oxidative enzymes // Curr. Opin. Biotechnol.- 2000.- V. 11.- №3.- P. 250-254.

38. Chibbar R., Chen H. From gene shuffling to the restoration of riparian ecosystems

39. Trends in Plant Science.- 1999.- V. 4.- №9.- P. 337-338.

40. Chinoin, Pharmaceutical and Chemical Works Ltd. Chinodex, Cyclodextrines.-Budapest, 1989,- 40 p.

41. Christinans F., Scapozza L. Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling // Nat. Biotechnol.- 1999.- V. 17.-№3.-P. 259-264.

42. Chung H.J., Yoon S.H. Characterization of thermostable cyclodextrin glucanotransferase isolated from Bacillus stearothermophilus ET1 // Journal of Agricultural and Food Chemistry.- 1998.- V. 3.- P. 952-959.

43. Coco W.H., Levinson W.E., Crist M.J., Hektorr H.J., Darzins A., Pienkos P.T., Squires C.H., Monticello D.J. DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes // Nat. Biotechnol.- 2001.- V. 19.- №4.-P. 314-315.

44. Coco W., Encell L., Levinson W. Growth factor engineering by degenerate homoduplex gene family recombination // Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.- P. 1246-1250.

45. Cohen J. How DNA shuffling works // Science.- 2001.- V. 293.- P. 237.

46. Crameri A., Stemmer W.P.C. Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype sequences // Biotechniques.- 1996a.-V. 2.-P. 549-553.

47. Crameri A., Whitehorn E., Tate E. Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling // Nat. Biotechnol.- 1996b.- V. 14.-№3.- P. 315-319.

48. Crameri A., Dawes G., Rodriguez E. Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling // Nat. Biotechnol.- 1997.- V. 15.- №5.-P. 436-438.

49. Crameri A., Raillard S., Bermudez E. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution // Nature.- 1998.- V. 391.- P. 288291.

50. Dai M.H., Zhu Y.M., Jiang G.P. Progress in vitro artificial evolution of protein // Progress in Biochemistry and Biophysics.- 2000.- V. 27.- №4.- P. 360-362.

51. Dai M., Copley S.D. Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide pentachlorophenol by Sphingobium chlorophenolicum ATCC 397223 // Appl. Environ. Microbiol.- 2004,- V. 70.- № 4.- P. 2391-2397.

52. Dalby P.A. Optimizing enzyme function by directed evolution // Curr. Opin. Struct. Biol.- 2003.- V. 13.- P. 1-6.

53. D'Souza V., Lipkowitz K. Chemical Reviews. Thematic issue: Cyclodextrins.-1998.- V. 98.-№5.

54. Dupuy D., Duperat V.G., Arveiler B. SCAN domain-containing 2 gene (SCAN2) is a novel nuclear protein derived from the zing finger family by exon shuffling // Gene.- 2002.- V. 289.- №1, 2.- P. 1-6.

55. Elena S., Sanjuan R. Climb every mountain? // Science.- 2003.- V. 302.- P. 20742075.

56. Farinas E.T., Bulter Т., Arnold F.H. Directed enzyme evolution // Curr. Opin. Biotech.- 2001a.- V. 12.-P. 545-551.

57. Farinas E.T., Schwaneberg U., Glieder A. Directed evolution of cytochrome P450 monooxygenase for alkane oxidation // Advanced Synthesis and Catalysis.-2001b.- V. 343.-P. 601-606.

58. Fodor K., Hadlaczky G., Alfoldi L. Reversion of Bacillus meganterium protoplasts to the Bacillary form // J. Bacteriol.- 1975.- V. 121.- № p. 390-391.

59. Fodor K., Alfoldi L. Fusion of protoplasts of Bacillus meganterium II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976.-V. 37.-№6.-P. 2147-2150.

60. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L. Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence // FEBS Lett.- 2000.- V. 479.-№3.- P. 127-130.

61. Frehel C., Lheritier A., Sanchez-Rivas C., Schaeffer P. Electron microscopic study of Bacillus subtilis protoplasts fusion // J. Bacteriol.- 1979.- V. 137.- №3.- P. 1354-1361.

62. Georganta G., Kaneko Т., Kudo Т., Horikoshi K. Expression of gene of cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilic Bacillus species № 38-2 in different hosts // Starch-Starke.- 1991.- V. 3.- P. 142-146.

63. Gibbs M.D., Nevalainen K.M.H., Bergquist P.L. Degenerate oligonucleotide gene shuffling (DOGS): a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling //Gene.- 2001.- V. 271.- P. 13-20.

64. Gilbert W., Sandro J.S., Long M. Origin of genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1997,-V. 94.- P. 7698-7703.

65. Giver L., Arnold F. Combinatorial protein design by in vitro recombination // Curr. Opin. Chem. Biol.- 1998a.- V. 2.- P. 335-338.

66. Giver L., Gershenson A., Freskgard P. Directed evolution of a thermostable esterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998b.- V. 95.- P. 12809-12813.

67. Glieder A., Farinas E. Laboratory evolution of a soluble, self-sufficient, highly active alkane hydroxylase // Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.- №11,- P. 1135-1139.

68. Graham D.E. The isolation of high molecular weight DNA from whole organisms of large tissue masses // Anal. Biochem.- 1978.- V. 78.- P. 673-678.

69. Hall B.G. Towards an understanding of evolutionary potential // FEBS Lett> 1999.-V. 178.-№1.- P. 1-6.

70. Hall B.G. Predicting evolution by in vitro evolution requires determination evolutionary pathways // Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V. 46.- №9.- P. 3035-3038.

71. Hanes J., Pluckthun H. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V. 94.- P. 49374942.

72. Hansson L.O., Bolton-Grob R., Massoud Т., Mannervik B. Evolution of differential substrate specifities in vitro Mu class glutathione transferases probed by DNA shuffling // J. Mol. Biol.- 1999.- V. 287.- P. 265-276.

73. Harayama S. Artificial evolution by DNA shuffling // Trends Biotechnol.- 1998.-V. 16.-P. 76-82.

74. Hashimoto Y., Yamamoto T. Extracellular synthesis, specific recognition, and intracellular degradation of cyclomaltodextrins by Hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. strain В1001 // Journal of Bacteriology.- 2001.- V. 183.- №17.-P. 5050-5057.

75. Hayes R., Bentzien J. Combining computational and experimental screening for rapid optimization of protein properties // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2002.- V. 99.-№25.-P. 15926-15931.

76. Hellinga H.W. Rational protein design: combining theory and experiment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.- V. 94.- P. 10015-10017.

77. Hermes J.D., Blacklow S.C., Knowles J.R. Searching sequence space by definably random mutagenesis: improving the catalytic potency of an enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1990.- V. 87.- P. 696-700.

78. Ho N.S., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction // Gene.-1998.- V. 77.- P. 51-59.

79. Hopfiner K., Kopetzki E., Krebe G., Bode W., Huber R., Richard A. New enzyme lineages by subdomain shuffling // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1998.- V. 95.- P. 9813-9818.

80. Hopwood D., Wright H. Bacterial protoplasts fusion: recombination in fused protoplasts // Molec. Gen. Genet.- 1978.- V. 162.- P. 307-317.

81. Horton R.M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes // Mol. Biotechnol.- 1995.- V. 3.- №2.- P. 93-99.

82. Hotchkiss R.D., Gabor M.H. Biparental products of bacterial fusion showing unequal parental chromosome expression // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1980.- V. 77.-№6.-P. 3553-3557.

83. Hsueh P. Nosocomial pseudoepidemic caused by Bacillus cereus traced to contaminated Ethyl Alcohol from a liquor factory // Journal of Clinical Microbiology.- 1999.- V. 37.- №7,- P. 2230-2235.

84. Janecek S. Tracing the evolutionary lineages among alpha-amylases and cyclodextrin glucanotransferases: The question of so-called "intermediary" enzymes // Biologia.- 1995a.- V. 12.- P. 515-552.

85. Janecek S. Characteristic differences in the primary structure allow discrimination of cyclodextrin glucanotransferases from alpha-amylases // Biochemical Journal.-1995b.-V. 2.-№1.-P. 685-686.

86. Janecek S., Svesson В., MacGregor A. Relation between domain evolution, specifity, and taxonomy of the a-amylase family members containing a C-terminal starch-binding domain // Eur. J. Biochem.- 2003.- V. 270.- P. 635-645.

87. Jermutus L., Honegger A., Schwesinger F. Tailoring in vitro evolution for protein affinity or stability // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2001.- V. 98.- №1.- P. 75-80.

88. Joern J.M., Meinhold P., Arnold F.H. Analysis of shuffled gene libraries // J. Mol. Biol.- 2002.- V. 316.- P. 643-656.

89. Jones D.H., Howard B.H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using PCR // Biotechniques.-1991.-V. 10.-№1,-P. 62-66.

90. Jones D.H., Rilley A.N., Winistorfer S.C. Production of a vector to facilate DNA mutagenesis and recombination // Biotechniques.- 1994.- V. 16.- №4.- P. 694-701.

91. Joo H., Lin Z., Arnold F. Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydroxylation //Nature.- 1999.- V. 399.- P. 670-673.

92. Kaneko Т., Hamamoto Т., Horikoshi K. Molecular cloning and nucleotide sequence of the cyclomaltodextrin glycanotransferase gene from an of alkalophilic Bacillus sp. Strain No. 38-2 // J. Gen. Microbiol.- 1988.- V. 134.- P. 97-105.

93. Kaneko Т., Song K., Hamamoto T. Construction of a chimeric series of Bacillus cyclomaltodextrin glucanotransferases and analysis of the terminal stabilities and pH optima of the enzymes // Journal of General Microbiology.-1989.-V. 135.-P. 3447-3457.

94. Kaneko S., Iwamatsu S., Kuno A. Module shuffling of a family F/10 xylanase: replacement of modules M4 and M5 of FXYN of Streptomyces olivaceoviridis E-86 with those of the Cex of Cellulomonas fimi II Protein Eng.- 2000.- V. 13.-№12.-P. 873-879.

95. Kikuchi M., Ohnini K., Harayama S. Novel family shuffling methods for in vitro evolution of enzymes // Gene.- 1999.- V. 236.- P. 159-167.

96. Kikuchi M., Ohnini K., Harayama S. An effective shuffling method using single-stranded DNA // Gene.- 2001.- V. 243.- P. 133-137.

97. Kim M.J., Park W.S., Lee H.S. Kinetics and inhibition of cyclomaltodextrinase from alkalophilic Bacillus sp. 1-5 // Arch. Biochem. Biophys.- 2000а,- V. 373.-№1.-P. 110-115.

98. Kitamoto N., Kimura Т., Kito Т., Ohmiya K. Cloning and sequencing the gene encoding cyclodextrin glucanotransferase of Bacillus species KC20 // Journal of Fermentation and Bioengineering.- 1992.- V. 4.- P. 336-340.

99. Kitamura K., Kinoschita Y., Narasaki S. Construction of block-shuffled libraries off DNA for evolutionary protein engineering: Y-ligation-based block shuffling // Protein Eng.- 2002.- V. 15.- №10,- P. 843-853.

100. Kitano H. Computational systems biology // Nature.- 2002.- V. 420.- P. 206210.

101. Kolkman J.A., Stemmer W.P.C. Directed evolution of proteins by exon shuffling // Nat. Biotechnol.- 2001.- V. 19.- №5.- P. 423-428.

102. Kong X., Liu Y., Gou X. Directed evolution of operon of threhalose-6-phosphate synthase/phosphatase from E. coli II Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2001.- V. 280,- №1.- P. 396-400.

103. Koonin V., Wolf Y. The structure of the protein universe and genome evolution // Nature.- 2002.- V. 420,- P. 218-223.

104. Kuchner O., Arnold F. Directed evolution of enzyme catalysts // Trends in Biotechnology.- 1997.- V. 15.- P. 523-530.

105. Kuriki Т., Imanaka T. The concept of alfa-amylase family: Structural similarity and common catalitic mechanism // Journal of Bioscience and Bioengineering.-1999.- V. 5.-P. 557-565.

106. Kurtzman AL., Covindarajan S., Vahle K. Advances in directed evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins // Curr. Opin. Biotechnol.- 2001.- V. 12.- №4.- P. 361-370.

107. Lakshminarayan M., Koonin E., Aravind L. Extensive domain shuffling on transcription regulators of DNA viruses and implications for the origin of fungal APSES transcription factors // Genome Biol.- 2002.- V. 3.- №3.

108. Lassner M., Bedbrook J. Directed molecular evolution in plant improvement // Curr. Opin. Plant Biol.- 2001.- V. 4.- P. 152-156.

109. Lee K.C., Tao B.Y. High level of expression of cyclodextrin glucanotransferases in E. coli under control of T7 promoter /I Starch-Starke.-1994.- V. 2.-P. 83-85.

110. Lee H., Kim M., Cho H. Cyclomaltodextrinase, neopullulanase, and maltogenic amylase are nearly indistinguishable from each other // The Journal of Biological Chemistry.- 2002.- V. 277.- №24.- P. 21891-21897.

111. Leong S.R., Chang J.C., Ong R., Dawes G., Stemmer W.P., Punnonen J. Optimized expression and specific activity of IL-12 by directed molecular evolution // Discovery Medicine.- 2003.- V. 3.- №14.- P. 18-19.

112. Leung D., Chen E., Goeddel D. A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction // Technique.- 1989.-V. l.-P. 11-15.

113. Light J., Lerner R. Random mutagenesis of staphylococcal nuclease and phage display selection // Biorg. Med. Chem.- 1995.- V. 3.- №7.- P. 955-967.

114. Long M. Evolution of novel genes // Curr. Opin. Gen. Develop.- 2001.- V. 11.-P. 673-680.

115. Lutz S., Benkovic S.J. Homology-independent protein engineering // Curr. Opin. Biotechnol.- 2000.- V. 11.- P. 319-324.

116. Lutz S., Ostermeier M. Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using a-phosphothioate // Nucleic Acids Research.- 2001a.-V. 29(4el6).

117. Lutz S., Ostermeier M., Moore GL. Creating multiple-crossover DNA libraries independent of sequence identity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001b.- V. 98.-№20.-P. 11428-11453.

118. Mahershi N., Schaffer D. Computational and experimental analysis of DNA shuffling // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2003.- V. 100.- №6.- P. 3071-3076.

119. Majewski J., Cohan F.M. DNA sequence similarity requirements for interspecific recombination in Bacillus II Genetics.- 1999.-V. 153.-P. 1525-1533.

120. Materials of 11-th International cyclodextrin Symposium, CD 2002, 5-8 May, Reykjavik, Island.

121. Matioli G., Zanin G., de Moraes F.F. Enhancement of selectivity for producing gamma-cyclodextrin // Appl. Biochem. Biotechnol.- 2000,- №84-86.- P. 955-962.

122. Mattsson P. The structure-function relationships of cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus circulans var. alkalophilus // Ser. A. I. Astronomica Chemica - Physica - Mathematica.- Turku, 1994.- 40 p.

123. Maxygen's whole genome shuffling technologies open new product areas in fermentation and vaccines // PR Newswire, 2002.

124. May O., Nguyen Т., Arnold F. Inverting enantioselectivity by directed evolution of hydantoinase for improved production of L-methionine // Nat. Biotechnol.- 2000.- V. 18,- P. 317-320.

125. Michnick S.W., Arnold F.H. "Itching" for new strategies in protein engineering//Nat. Biotechnol.- 1999.- V. 17.-P. 1159-1160.

126. Minshull J., Stemmer W.P.C. Protein evolution by molecular breeding // Curr. Opin. Chem. Biol.- 1999.- V. 3.- P. 284-290.

127. Miyazaki K., Arnold F. Exploring nonnatural evolutionary pathways by saturation mutagenesis: rapid improvement of protein function// J. Mol. Evol.1999.- V. 49.-P. 716-720.

128. Miyzaki K., Wintrode P., Grayling R. Directed evolution study of temperature adaptation in psychrophilic enzyme // J. Molecular Biology.- 2000.- V. 297.- P. 1015-1026.

129. Miyazaki K. Random DNA fragmentation with endonuclease V: application to DNA shuffling // Nucleic Acids Res.- 2002.- V. 30.- №24(el39).- P. 1-3.

130. Moore J., Arnold F. Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents //Nat. Biotechnol.- 1996.- V. 14.- P. 458-467.

131. Moore J.C., Jin H., Kuchner O., Arnold H.F. Strategies for in vitro evolution of protein function: enzyme evolution by random recombination of improved sequences //J. Mol. Biol.-1997.- V. 272.- P. 336-347.

132. Moore G.L., Maranas C.D. Modeling DNA mutation and recombination for directed evolution experiments // J. Theor. Biol.- 2000a.- V. 205.- P. 483-503.

133. Moore G.L., Maranas C.D., Gutshall K. Modeling and optimization of DNA recombination // Computers & Chemical Engineering.- 000 (2000 b) 000-000.- P. 1-7.

134. Moore G., Maranas C., Lutz S. Predicting crossover generation in DNA shuffling // Proc. Natl. Acad. Sci USA.- 2001.- V. 98.- №6.- P. 3226-3231.

135. Moore G., Maranas C. EcodonOpt: a systematic computational framework for optimizing codon usage in directed evolution experiments // Nucl. Acids Research.- 2002.- V. 11.- №3.- P. 2407-2416.

136. Morawski В., Lin Z., Cirino P. Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris II Protein Eng.2000.- V. 13.- №5.- P. 377-384.

137. Morawski В., Quan S., Arnold F. Functional expression and stabilization of horseradish peroxidase by directed evolution in Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol. Bioeng.- 2001.- V. 76.- P. 99-107.

138. Mossner E., Pluckthun A. Directed evolution with fast and efficient selection technologies // Chem. Biol. / Biol. Chem.- 2001.- V. 55.- №4.- P. 324-328.

139. Nakamura N., Horikoshi K. Purification and properties of cyclodextrin glycanotransferase of alkalophilic Bacillus sp. II Agric. Biol. Chem 1976.- V. 40.-P. 1647-1648.

140. Nakamura A. Functional correlation between cyclodextrin glucanotransferases and a-amylases: site-directed mutagenesis of 2 residues of Asp and 1 Gin // FEBS Letters.- 1992,- V. 6.- P. 42-47.

141. Ness J., Welch M. DNA shuffling of subgenomic sequences of subtilisin // Nat. Biotechnol.- 1999.- V. 17.- P. 893-896.

142. Ness J., Kim S. Synthetic shuffling expands functional protein diversity by allowing amino acids to recombine independently // Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.-P. 1251-1255.

143. Nielsen K., van Elvas J., Smalla K. Transformation of Acinetobacter sp. Strain BD413 with transgenic plant DNA in soil microcosms and effects of kanamycin on selection of transfomants // Appl. Environ. Microbiol.- 2000b.- V. 66.- №3.- P. 1237-1242.

144. Nishida Т., Nakamura A., Masaki H., Uozumi T. Regulation of cyclodextrin glucanotransferase synthesis in Bacillus ohbensis // Fems Microbiology Letters.-1997.-V. 149.-№2.-P. 221-226.

145. Nishida Т., Nakamura A., Masaki H., Uozumi T. Transcriptional regulation of Bacillus ohbensis cyclodextrin glucanotransferase gene in Bacillus subtilis II Biosci. Biotechnol. Biochem.- 1999.- V. 63.- №11.- P. 1902-1909.

146. Nishigaki K., Kinoshita Y., Kyono H. Restriction-enzyme-nondependent recombination and rearrangement of DNA (RRR) // Chemistry Lett.- 1995.- V. 2.-P. 131-132.

147. Niu S., Bittkler J. Nonhomologous Random Recombination of Nucleic Acids (Nucleic Acid Shuffling) // American Journal of Human Genetics.- 2002.- V. 70.-P. 157-169.

148. Ohdan K., Kuriki Т., Takata H., Okada S. Cloning of the cyclodextrin glucanotransferase gene from alkalophilic Bacillus sp. A2-5a and analysis of the raw starch-binding domain // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2000a.- V. 53.- №4.-P. 430-434.

149. Ohdan K., Kuriki T. An approach for introducing a different function to an industrial enzyme // Trends Glucosci. Glucotechnol.- 2000b.- V. 12.- P. 403-410.

150. Ohdan K., Kuriki T. Introduction of raw starch-binding domains into Bacillus subtilis a-amylase by fusion with the starch-binding domain of Bacillus cyclomaltodextrin glucanotransferase // Appl. Environ. Microbiol.- 2000c.- V. 66.-№7.-P. 3058-3064.

151. O'Mailie P.E., Bakhtina M., Tsai M.D. Structure-based combinatorial protein engineering (SCOPE) // J. Mol. Biol.- 2002.- V. 321.- P. 677-691.

152. O'Neil K., Hoess R. Phage display: protein engineering by directed evolution // Curr. Opin. Struct. Biol.- 1995.- V. 5.- P. 443-449.

153. Ostermeier M., Nixon A.E., Benkovic J. Incremental truncation as a strategy in the engineering of novel biocatalysts // Bioorg. Med. Chem.- 1999a.- V. 7.- P. 2139-2144.

154. Ostermeier M., Shim J.H., Benkovic J. A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology // Nat. Biotechnol.- 1999b.- V. 17.-№12.-P. 1205-1209.

155. Ostermeier M., Benkovic J. Construction of hybrid gene libraries involving the circular permutation of DNA // Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- P. 303-310.

156. Park Т.Н., Shin H.D., Lee Y.H. Characterization of beta-cyclodextrin glucanotransferase gene of Bacillus firmus var. alkalophilus and its expression in E. coli II J. Microbiol. Biotechnol.- 1999.- V. 12.- P. 811-819.

157. Parsiegla G., Schmidt A., Schulz G.E. Substrate binding to a cyclodextrin glycosyltransferase and mutations increasing the g -cyclodextrin production // Eur. J. Biochem.- 1998.- V. 255.- P. 710-717.

158. Patnaik R., Louie S., Gavrilovic V. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance //Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.- № 7.- P. 707-712.

159. Patten P.A., Howard R.J., Stemmer W.P.C. Application of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines // Curr. Opin. Biotechnol.- 1997.- V. 8.- P. 724-733.

160. Patthy L. Genome evolution and the evolution of exon-shuffling- a review // Gene.- 1999.- V. 238.- P. 103-114.

161. Pedersen H., Holder S. A method for directed evolution and functional cloning //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- V. 95.- P. 10523-10528.

162. Pelletier J. A RACHITT for our toolbox // Nat. Biotechnol.- 2001.- V. 19.- P. 314-315.

163. Powell S.K., Kallos M.A., Pinkstaff A. Breeding of retroviruses for improved stability and processing yields // Nat. Biotechnol.- 2000.- V. 18.- №12.- P. 12791282.

164. Railland S., Krebber A. Novel enzyme activities and functional plasticity revealed by recombining highly homologous enzymes // Chem. Biol.- 2001.- V. 8.-№9.- P. 891-898.

165. Riechmann L., Winter G. Novel folded protein domains generated by combinatorial shuffling of polypeptide segments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2000.- V. 97.- №18.- P. 10068-10073.

166. Reid A.J. DNA shuffling: modifying the hand nature dealt // In vitro Cell. Develop. Biol. Plant.- 2000.- V. 36.- №5.- P. 331-337.

167. Reidhaar-Olson J.F., Sauer R.T. Combinatorial Cassette Mutagenesis as a Probe of the Informational Content of Protein Sequences // Science.- 1988.- V. 241.-P. 53-57.

168. Rose Т., Schultz E. Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences // Nucleic Acids Res.- 1998.- V. 26.-№7.-P. 1628-1635.

169. Rossi I. Physiological and ecological characteristics of bacterial cyclodextrin glucanotransferase // Biologia.- 1999.- V. 10.- P. 478-482.

170. Ryu D., Nam D. Biomolecular engineering: a new frontier in biotechnology // J. Mol. Catal. B: Enzymatic.- 2000.- V. 10.- P. 23-37.

171. Sakamoto Т., Joern JM., Arisawa A. Laboratory evolution of toluene dioxygenase to accept 4-picoline as a substrate // Appl. Environ. Microbiol.2001.-V. 67.-P. 3882-3887.

172. Salamone P.R., Kavakli I.H., Slattery C.J. Directed molecular evolution of ADP-glucose pyrophosphorylase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.- V. 99.-№2.-P. 1070-1075.

173. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Cold Spring Harbor, 1989.- 425 p.

174. Samuelson J., Xu S. Directed evolution of restriction endonuclease BstYI to achieve increased substrate specificity // J. Mol. Biol.- 2002.- V. 319.- P. 637-683.

175. Schaeffer P., Cami В., Hotchkiss D. Fusion of bacterial protoplasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976.- V. 73.- №6.- P. 2151-2155.

176. Schardinger F. Bacillus macerans, ein Aceton bildender Rottebacillus // Zbl. Bacteriol. Parasitenkunde.- 1904.- V. 14.- P. 772.

177. Schmidt-Dannert C., Umeno D., Arnold F. Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways //Nat. Biotechnol.- 2000,- V. 18.- P. 750-753.

178. Schmitz H.P., Jocket J., Block C. Domain shuffling as a tool for investigation of protein function: substitution of the cysteine-rich region of Raf kinase and PKC eta for that of yeast Pkclp // J. Mol. Biol.- 2001.- V. 311.- №1.- P. 1-7.

179. Scopes R.K. Longer is better random elongation mutagenesis // Nat. Biotechnol.- 1999.- V. 17.- P. 21.

180. Shanklin J. Exploring the possibilities presented by protein engineering // Curr. Opin. Plant Biol.- 2000.- V. 3.- P. 243-248.

181. Shao Z., Zhao H., Giver L., Arnold F.H. Random priming in vitro recombination: en effective tool for directed evolution //Nucleic Acids Research.-1998.-V. 26.- P. 681-683.

182. Shiba K., Hatada T. Guide oligonucleotide-dependent DNA linkage that facilitates controllable polymerization of microgene blocks // J. Biochem.- 2002.-V. 132,-№5.-P. 689-696.

183. Shibuya H., Kaneko S., Hayashi K. Enhancement of the thermostability and hydrolytic activity of xylanase by random gene shuffling // Biochem. J.- 2000.- V. 349.- P. 651-656.

184. Searls D. The language of genes // Nature.- 2002.- V. 420.- P. 211-217.

185. Sieber V., Martinez C.A., Arnold F.H. Libraries of hybrid proteins from distantly related sequences // Nat. Biotechnol.- 2001.- V. 19.- №5.- P. 456-460.

186. Song J.K., Rhee J.S. Enhancement of stability and activity of phospholipase A(l) in organic solvents by directed evolution // Biochem. Biophys. Acta.- 2001.-V. 1547.- №2.- P. 370-378.

187. Soong N., Nomura L., Pekrun K. Molecular breeding of viruses // Nat. Genet.-2000.- V. 25.- №4.- P. 436-439.

188. Stemmer W.P.C. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature.- 1994a.- V. 8,- P. 389-391.

189. Stemmer W.P.C. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1994b.-V. 91.-P. 10747-10751.

190. Stemmer W.P. Methods for in vitro recombination // US patent № 5,605,793, 1997.

191. Stephanopoulos G. Metabolic engineering by genome shuffling // Nat. Biotechnol.- 2002.- V. 20.- P. 666-668.

192. Sun L., Petrounia I.P. Expression ans stabilization of galactose oxidase in Escherichia coli by directed evolution // Protein Eng.- 2001V. 14.- №9.- P. 699704.

193. Sutherband J. Evolutionary optimisation of enzymes // Curr. Opin. Chem. Biol.- 2000,- V. 4,- P. 263-269.

194. Suenaga H., Mitsuoka M., Ura Y. Directed evolution of biphenyl dioxygenase: emergance of enhanced degradation capacity for benzene, toluene, and alkylbenzenes // J. Bacterid.- 2001.- V. 183.- №18.- P. 5441-5444.

195. Suenaga H., Watanabe Т., Sato M. Alteration of regiospecificity in biphenyl dioxygenase by active-site engineering // J. Bacterid.- 2002.- V. 184.- №13.- P. 3682-3688.

196. Sun F. Modeling DNA shuffling // J. Comput. Biol.- 1999.- V. 6.- №1.- P. 7790.

197. Surridge C. Computational biology // Nature.- 2001.- V. 420.- P. 1.

198. Tachibana Y. Purification and characterization of an extremely thermostable cyclodextrin glucanotransferase from a newly isolated hyperthermophilic archaeon, a Termococcus species II Appl. Environ. Microbiol.- 1999.- V. 5.- P. 1991-1997.

199. Terada Y., Sanbe H., Takaha T. Comparative study of the cyclization reactions of three bacterial cyclomaltodextrin glucanotransferases // Appl. Environ. Microbiol.- 2001.- V. 67.- P. 1453-1460.

200. Tilden E.B., Hudson C.S. Preparation and properties of the amylases produced by Bacillus macerans and Bacillus polymyxa II J. Bacterid 1942.- V. 43.- №2.-P. 527-544.

201. Tobin M., Gustafsson C. Directed evolution: the "rational basis" for "irrational" design II Curr. Opin. Struct. Biol.- 2000.- V. 10.- P. 421-427.

202. Toth R.L., Pogue G.P., Chapman S. Improvement of the movement and host range properties of a plant virus vector through DNA shuffling // Plant J.- 2002.-V. 30.-№5.- P. 593-600.

203. Triverdi В. "Genome shuffling" may speed production of antibiotics // National Geographic Today.- 2000.- V. 2.

204. Tsuge K., Itaya M. Recombinational transfer of 100-kilobase genomic DNA to plasmid in Bacillus subtilis II Journal of Bacteriology.- 2001.-V. 183,- №18.- P. 5453-5458.

205. Villiers A. //Compt Rendu.- 1891.- V. 112.- P. 536.

206. Voigt C., Mayo S., Arnold F. Computational method to reduce the search space for directed protein evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- V. 98,-P. 3778-3783.

207. Volkov A., Shao Z., Arnold F. Recombination by in vitro heteroduplex formation and in vivo repair // Nucleic Acids Res.- 1999.- V. 27(el8).

208. Wackett L.P. Directed evolution of new enzymes and pathways for environmental biocatalysis // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1998.- V. 864.- P. 142-152.

209. Wang L.J., Xong X.D., Zhang H.Y. Enhancement of the activity of 1-aspartase from E. coli W by directed evolution // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2000.-V. 276.-№1.-P. 346-349.

210. Wang P.L. Creating hybrid genes by homologous recombination // Dis. Markers.- 2000.- V. 16.- №1, 2.- P. 3-13.

211. Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria // In Current protocols in molecular biology. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.K., Struhl K. (eds). John Wiley& Sons. New York, USA. 1994. P. 2.4.1-2.4.2.

212. Wintrode P., Miyazaki K., Arnold F. Patterns of adaptation in a laboratory evolved thermophilic enzyme // Biochemica et Boiphysica Acta.- 2001.- V. 1549.-P. 1-8.

213. Woodyer R., Chen W., Zhao H. Outrunning Nature: Directed evolution of superior biocatalysts // Journal of Chemical Education.- 2004.- V. 18.- №1.- P. 126-133.

214. Zha D., Eipper A. Assembly of designed oligonucleotides as an efficient method for gene recombination: a new tool in directed evolution // Chembiochem.- 2003.- V. 4.- №1.- P. 34-39.

215. Zhang J., Dawes G., Stemmer W.P.C. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1997.- V. 94.- P. 45504-4509.

216. Zhang Y., Buchholz F. A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli II Nat. Genet.- 1998.- V. 20.- P. 123-128.

217. Zhang H., Kong X., Zhang J. New strategies of protein engineering-directed evolution of enzyme in vitro II Chinese Science Bulletin.- 1999.- V. 44.- №18.- P. 328-330.

218. Zhang N., Stewart B. Moore J. Directed evolution of toluene dioxygenase from Pseudomonas putida for improved selectivity toward cis-indanoil during indene bioconversion // Metab. Eng.- 2000,- V. 2.- №4.- P. 339-348.

219. Zhang Y., Perry K., Vinci A.V., Stemmer W.P.C. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria // Nature.- 2002.- V. 415.- P. 644-646.

220. Zhao H.M., Arnold F.H. Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination//Nucleic Acids Research.- 1997а,- V. 25.- P. 1307-1308.

221. Zhao H.M., Arnold F.H. Functional and non-functional mutations distinguished by random recombination of homologous genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997b.- V. 94.- P. 7997-8000.

222. Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J.A., Arnold F.H. Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination // Nat. Biotechnol.-1998.-V. 16.-№3.-P. 258-261.

223. Zhao H., Arnold F. Directed evolution converts subtilisin E into functional equivalent of thermitase // Protein Eng.- 1999.- V. 12.- P. 47-53.

224. Zhou J.H., Chen H.B. A facile DNA shuffling protocol // Progress in Biochemistry and Biophysics.- 2000,- V. 27.- №6.- P. 655-657.

225. Zivanovic Y., Lopez P., Philippe H., Forterre P. Pyroccocus genome comparison evidences chromosome shuffling-driven evolution // Nucleic Acids Research.- 2002.- V. 30.- №9.- P. 1902-1910.

226. Yamamoto Т., Fujiwara S., Tachibana Y. Alteration of product specificity of cyclodextrin glucanotransferase from Thermococcus sp. В1001 by site-directed mutagenesis // J. Biosci. Bioeng.- 2000a.- V. 89.- №2.- P. 206-209.

227. Yamamoto К., Zhang Z.Z., Kobayashi S. Cycloamylose (cyclodextrin) glucanotransferase degrades intact granules of popato raw starch // J. Agric. Food Chem.- 2000b.- V. 48.- №3.- P. 962-966.

228. Yang J.K., Park M.S., Waldo G.S., Suh S.W. Directed evolution approach to the structural genomics project: RV2002 from Mycobacterium tuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003.- V. 100.- P. 455-460.

229. Yano Т., Kagamiyama H. Directed evolution of ampicillin-resistant from a functionary unrelated DNA fragment: A laboratory model of molecular evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001.- V. 98.- №3.- P. 903-907.

230. Yoon S.H., Robyt J.F. Bacillus macerans cyclomaltodextrin glucanotransferase transglycosylation reactions with different molar ratios of D-glucose and cyclomaltohexaose // Carbohydr. Res.- 2002.- V. 337.- №21-23.- P. 2245-2254.

231. You L., Arnold F. Directed evolution of subtilisin E in Bacillus to enhance total activity in aqueous dimethylformamide // Protein Eng.- 1996.- V. 9.- P. 7783.

Информация о работе

Мингазетдинова, Светлана Рафаильевна
кандидата биологических наук
Уфа, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Искусственная эволюция циклодекстрин глюканотрансфераз и их продуцентов in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы