Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и изучение свойств высокоочищеннойциклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных вета-циклодекстринов икомплексов включения на их основе.

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение и изучение свойств высокоочищеннойциклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных вета-циклодекстринов икомплексов включения на их основе."

РГв од

t з дек гт

На правах рукописи

ВОЛКОВА Дарья Александровна

Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглкжанотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных ß-циклодекстринов и комплексов включения на их основе.

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2000

Работа выполнена на кафедре 'Биотехнология, экология и сертификация пищевых продуктов" в Московском Государственном Университете пищевых производств и лаборатории "Инженерия ферментов" Центра "Биоинженерия", РАН.

Научные руководители: * доктор биологических наук, профессор

Грачева Ирина Михайловна • доктор химических наук Варламов Валерий Петрович

Официальные оппоненты: • доктор биологических наук

Эль-Регистан Галина Ивановна • кандидат технических наук, доцент Карпенко Дмитрий Валерьевич

Ведущая организация: • Институт биохимии им. А.И. Баха, РАН

Защита состоится декабря 2000 г. в ^З-ЗР часов в конференц-зале на заседании Совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, Москва, А-47, Миусская площадь, Д.9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ¿-¿У И.И. ГУСЕВА

^ои.бЫ.МЬ) О, ля^о.^о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТ-аза, 1,4-а-0-глгокан-4-а-(1,4-сс-глюкано)-трансфераза, К.Ф. 2.4.1.19) представляет собой уникальный фермент микробного происхождения, катализирующий одновременно такие реакции, как циклизация (превращение крахмала и родственных а-1,4-глюканов в циклодекстрины путем реакции трансгликозилирования), объединение (присоединение коротких а-1,4-глюкопиранозных цепочек к раскрытому кольцу циклодекстрина), дисп-ропорционирование и гидролиз крахмала и образуемых циклодекстри-нов (ЦД) до мальтоолигосахаридов. Образующиеся макроциклические олигосахаридные гомологи различаются по количеству остатков a-D-глю-копиранозы (6, 7 и 8) и, соответственно, обозначаются как а-, 0- и т-ЦД. Благодаря исключительной способности к образованию комплексов включений с органическими и неорганическими соединениями ЦД широко используются в различных областях практической деятельности человека, в частности, в медицине и фармакологии, пищевой промышленности, косметологии и экологии. Этот факт обусловливает повышенный интерес к вопросам их многотоннажного производства. Наибольший интерес представляет [3-ЦД, проявляющий самые высокие и универсальные комплек-сообразующие свойства.

В целом, технология получения ЦД состоит из следующих этапов:

1. Культивирование микроорганизма, продуцирующего ЦГТ-азу;

2. Выделение и очистка фермента;

3. Ферментативная конверсия крахмала до ЦД;

4. Очистка индивидуальных ЦД (а-, р- и у-) до кристаллического состояния из реакционной среды.

В настоящее время промышленным способом получения ЦЦ является энзи-матическнй гидролиз а-1,4-шюканов и родственных полисахаридов ЦГТ-азой. Большинство ЦГТ-аз катализируют образование всех трех ЦД одновременно, сщнако они различаются по количеству и типу продуцируемых циклических молекул. В соответствии с преобладанием какого-либо одного гомолога ЦГТ-азы подразделяются на (а-), (Р-) и (у-) специфичные.

В связи с тем, что в настоящее время целый ряд ферментных предприятий оказался за рубежом (Эстония, Литва, Украина, Армения), суммировать научные достижения в области производства ЦГТ-аз и технологии ЦД оказалось достаточно сложным. Поэтому продолжение исследований в этой области является актуальной проблемой для России не только в теоретическом плане, но имеет также и большое практическое значение.

Для решения этих задач необходимо продолжать активный поиск новых продуцентов ЦГТ-аз, разрабатывать рациональные схемы выделе-

ния и очистки специфических ЦГТ-аз, определять их физико-химические параметры, а также работать над совершенствованием технологии получения ЦД. Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков совокупность хроматографических методов представляет собой наиболее эффективные и перспективные приемы получения высокоочищенных биологических препаратов, в том числе и ферментов.

Также, в связи с тем, что с каждым годом области применения цикло-декстринов расширяются, актуальным представляется поиск возможностей создания с этими циклическими молекулами новых комплексов включения, в частности с лекарственными препаратами стероидной природы.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка рациональной схемы выделения и очистки циклодекстринглкжа-нотрансферазы, изучение ее свойств, получение модифицированных ß-циклодекстринов и комплексов включения на их основе.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

• скрининг микроорганизмов рода Bacillus с целью отбора штамма, обладающего максимальной активностью ß-ЦГТазы;

• разработка способов выделения и очистки ß-ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070.

• определение физико-химических свойств очищенного фермента;

• гидролиз крахмала очищенной ß-ЦГТ-азой с целью получения ß-ЦД;

• получение комплексов включения с модифицированным ß-ЦД.

Научная новизна. Разработана оригинальная схема выделения и очистки ß-специфичной ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070 с помощью новейших хроматографических методов, включающих аффинную и металлохелат аффинную хроматографию. Определены основные физико-химические характеристики ее ферментативной активности.

Разработана модельная схема получения ß-ЦД с помощью выделенного фермента ß-ЦГТ-азы и впервые продемонстрировано, что содержание целевого продукта (ß-ЦД) при гидролизе субстрата очищенной ЦГТ-азой в отсутствии других амилолитических ферментов (а- и ß-амилазы, пуллулана-зы, глюкоамилазы) составляет около 90%. Причем общая степень конверсии субстрата оказалась не ниже 95%.

Синтезированы полимерные производные ß-ЦД, полученного по предложенной схеме: сополимер ß-ЦД с эпихлоргццрином и коньюгат ß-ЦД с низкомолекулярным хитозаном. Показано улучшение растворимости лекарственных препаратов стероидной природы в присутствии этих производных по сравнению с не модифицированным ß-ЦД. Возможно применение этих производных для интенсификации процесса биотрансформации стероидов.

Практическая ценность работы. Установлено, что разработанные хро-матографические схемы очистки ß-ЦГТ-азы просты в исполнении и эффективны, поскольку исключают некоторые нетехнологичные стадии, часто используемые при ее получении. Чистота выделенного фермента составляет не менее 95% по данным электрофореза в денатурирующих условиях.

Для выделенной ЦГТ-азы определены основные физико-химические характеристики ее ферментативной активности и подобраны оптимальные условия проведения гидролиза крахмала с целью получения ß-ЦД.

Получен акт о наработке в лабораторных условиях очищенного фермента циклодекстринглкжанотрансферазы из Bacillus sp 1070, модифицированных ß-циклодекстринов и получении комплексов включения на их основе.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на:

• Международной конференции "Биокатализ-98" (Пущино, 1998);

• Школе молодых ученых "Биосенсоры" (Marciana Marina, Italy, 1999);

• V Международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина ихитозана" (Москва-Щелково, 1999);

• Межотраслевой конференции "Продукты питания - третье тысячелетие" (Москва, 1999);

• Международной конференции "Биокатализ-2000" (Москва, 2000).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 2 тезиса и

3 статьи, в которых отражены основные положения диссертации.

Структура и объем работы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждения и выводов; содержит 11 таблиц, 23 рисунка и библиографический список из 162 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ВВЕДЕНИЕ.

Во введении изложена общая характеристика работы и краткий перечень основных положений, которые выносятся на защиту.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Проведен анализ литературных данных по продуцентам бактериальных ЦГТ-аз, свойствам и механизму действия этих ферментов. Представлен ретроспективный анализ эффективности различных методов очистки бактериальных ЦГТ-аз. Рассмотрены возможные способы модификации и использования производных ß-циклодекстрина в качестве эффективной добавки в процессе биотрансформации стероидов.

3. ОБЪКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты.

В качестве продуцента ß-ЦГТ-азы в работе использовали штамм культуры Bacillus sp. 1070, отобранный путем скрининга из коллекции культур микроорганизмов, предоставленных кафедрой "Биотехнология, экология и сертификация пищевых продуктов" МГУПП.

Процесс биотрансформации стероидов (гидроксилирование кортексо-лона и дегидрирование гидрокортизона) проводился с использованием культур Arthrobacter globiformis 193 и Cutvularía Innata совместно с лабораторией "Биотрансформации стероидов" Центра Биоинженерии, РАН.

3.2. Материалы.

В работе использовали соли и реактивы квалификации Ч. Д. А. и Х.Ч. в качестве субстрата для измерения ЦГТ-азной активности - растворимый картофельный крахмал. Для приготовления сред пользовались агаром, пептоном и кукурузным экстрактом ("Difco"), дрожжевым экстрактом ("Pronadisa", Испания). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах силуфол UV-254 (Чехия). Хроматографические носители: TSK-гель, бутил-тойоперп (Тоуо Soda Co., Япония), агароза, сефадекеG-100 и сефароза 4В (Pharmacia Biotech, Швеция).

3.3. Методы исследования.

Очистка ЦГТ-азы. В работе использовали такие методы очистки ЦГТ-азы, как гидрофобную хроматографию (ГХ) на бутил-тойоперле, ионообменную на ДЭАЭ-сефацеле (ИОХ), аффинную на а- и ß-ЦЦ сефарозе 4В (сорбенты синтезированы нами) и металлохелат аффинную хроматографию (МХАХ) на Си(И)-ИДК агарозе.

Циклизующую активность ЦГТ-азы определяли фенолфталеиновым методом. Количество образовавшегося ß-ЦЦ определяли по убыли поглощения индикаторного раствора из-за включения его в полость ß-ЦД при длине волны 550 нм по калибровочному графику. За единицу цикпи-зующей активности принято такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ ß-ЦД при pH 7,2, 60 °С за 1ч.

Декстринирующую активность ЦГТ-азы измеряли по йодному методу. Поглощение раствора измеряли при длине волны 700 нм. За единицу декстринирующей активности принято такое количество фермента, которое в течение 1 минуты вызывает 10% снижение оптической плотности амилозо-йодного комплекса при pH 7,2 и 60 °С.

Протеолитическая активность. В качестве субстрата использовали 0,5% раствор азоказеина в Tris-HCI буфере (pH 8,0), к которому добавляли определенное количество раствора фермента. Поглощение раствора

измеряли при длине волны 440 нм. За единицу протеолитеческой активности принято такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ свободных аминокислот за 1 мин при pH 8,0 и 37 °С.

Гидролиз крахмала проводили на 6%- и 15%-ном водорастворимом клейстеризованном картофельном крахмале с добавлением 1% и 1,5% изооктана, соответственно, при постоянном перемешивании в течение 7 суток и t = 25 °С. В реакцию брали эквивалентное по активности количество очищенного фермента и КЖ-40 ед/мл. Пробы отбирали каждые 12 ч и количество образовавшегося ß-ЦД определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Gilson используя колонку Separan SGNxNH2,5 мкм, (3x150 мм), в подвижной фазе CH3CN:H20 - 70:30.

Модификация ß-ЦД. В работе были получены следующие производные ß-циклодекстрина: водорастворимый сополимер ß-ЦД получен реакцией поликонденсации ß-ЦД с эпихлоргидрином (ß-ЦД-Э); диальдегид- и полиапьдегид-р-ЦД получены окислением циклодекстрина эквимолярным количеством и избытком периодата натрия соответственно.

Альдегидные производные ß-ЦД использовали для прививки ß-ЦД к хитозану.

Комплексы включений с модифицированным ß-ЦЦ. Получены комплексы включения полимерных производных ß-ЦД со стероидами (ß-ЦД-хи-тозан/гидрокортизон и ß-ЦД-Э/кортексолон) и исследовано влияние комп-лексообразования на растворимость стероидов.

3.4. Математическая обработка результатов измерения активности ЦГТ-азы.

Обработку результатов измерения циклизующей, декстринирующей активностей ЦГТ-азы, а также концентрации ß-ЦД, кортексолона и гидрокортизона проводили математическими методами планирования эксперимента. В частности, для вычисления ошибки при определении циклизующей активности осуществляли ряд повторных измерений и значение активности определяли как разность оптических плотностей исследуемого и контрольного растворов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Скрининг микроорганизмов рода Bacillus с целью отбора штамма, обладающего максимальной активностью ß-ЦГТазы.

С целью отбора активного продуцента циклодекстринглюкано-транс-феразы методом глубинного культивирования было исследовано более 20 бактериальных культур из коллекции микроорганизмов, предоставлен-

ных кафедрой "Биотехнология, экология и сертификация пищевых про-д у кто в" МГУПП. Отбор проводился по максимальной циклизующей активности, которая у различных штаммов оказалась сопоставима и находилась в диапазоне от 320 до 570 ед/мл. В качестве наиболее активного продуцента ЦГТ-азы был выбран штамм культуры Bacillus sp. 1070.

4.2. Разработка способов выделения и очистки циклодекстрин-глюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070.

4.2.1. Подбор условий первичной очистки ЦГТ-азы.

Культуральная жидкость, полученная при выращивании Bacillus sp. 1070 подвергалась центрифугированию на центрифуге Beckman J-21C при 15 000 об/мин, t = 10 °С, в течение 20 мин. Далее культуральную жидкость, содержащую ЦГТ-азу подвергали микрофильтрации (0,2 мкм), в результате которой удельная активность фермента повышалась ~ в 2 раза по сравнению с исходной.

В качестве условий длительного хранения очищенной ЦГТ-азы предложена лиофильная сушка (в вакууме, создаваемом масляным насосом), так как она не вызывает инактивации фермента. Для концентрирования фермента перед его хроматографической очисткой лучше применять более доступный способ вакуум-упаривания (водяная баня, температура 3035 °С в вакууме водоструйного насоса), при использовании которого фермент практически не инактивируется.

4.2.2. Разработка хроматографических приемов очистки ЦГТ-азы.

В данной работе были разработаны две хроматографические схемы получения высокоочищенной ЦГТ-азы из культуральной жидкости Bacillus sp. 1070 с использованием: а) гидрофобной и ионообменной хроматографии и Ь) аффинной и металлохелат аффинной хроматографии. Для очищенной ЦГТ-азы определялась циклизующая, декстринирующая и протеоли-тическая активности.

Получение высокоочищенной ЦГТ-азы с использованием гидрофобной и ионообменной хроматографии.

Сорбцию ЦГТ-азы на бутил-тойоперле при гидрофобной хроматогрфии проводили в буфере, содержащем Na2S04 от 1М до 0,ЗМ. Было показано, что максимальная очистка достигается при содержании Na2SO„ в концентрации 0,35 М. В этих условиях удельная активность фермента возрастает в 5раз.

В качестве второго этапа очистки использовали ионообменную хрома-тографиию на ДЭАЭ-сефацеле. Для оптимизации этой стадии проверялась возможность сорбции ЦГТ-азы при различных значениях pH. Подбор условий ИОХ был направлен на максимальную сорбцию балластных белков и

Таблица 1. Очистка ЦГТазы из Bacillus sp. 1070 с использованием гидрофобной и ионообменной хроматографии.

Стадии очистки V, (мл) Белок ' ЦА (иг) ; (ед^мг) ДА (ед/мг) Очистка, ЦА Выход ЦА(%) Очистка, ДА Выход ДА(%)

Фильтрат КЖ 30 4,80 + 0,2 3782 + 13 240 + 10 1 100 i 100

Гидрофобная хроматография набутил тойоперлв 16 1,20+0.2 1 »966+13 1157+ 10 5 125 4,7 118

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-сефацело ! 20 ! 0,42+0,2 [ 50451±13 2352т10 13,5 117 12 104

ЦА-циклизующая активность ДА-декстринирующая активность

минимальную - выделяемого белка. Показано, что при pH 8,0 степень очистки фермента наивысшая и составляет 13,5 раз (табл.1).

Так как изданных литературы известно, что многие бактериальные ЦГТ-азы имеют молекулярный вес 70 -75 кДа, с большой степенью вероятности можно предположить, что появление белковой зоны в очищенной фракции фермента на электрофореграмме (рис.1) в этой области свидетельствует о наличии ЦГТ-азы, причем степень ее чистоты при такой схеме не менее 90%.

Известно, что большинство бактериальных культур, помимо ЦГТ-аз, синтезируют и другие ферменты амилолитического комплекса. Однако в КЖ Bacillus sp. 1070 не удалось обнаружить других белков, имеющих декст-ринирующую активность. Как видно из таблицы 1 на всех стадиях очистки декстринирующая активность распределяется аналогично циклизующей.

66,0

45,0 36,0

29,0

24.0

20.1 14,2

Ti

1

РШ « 1

Г 1 »

-tu

2

3

1 - Белки-маркеры молекулярной массы -

14,2 кДа, 20,1 кДа, 24,0 кДа, 29,0 кДа, 36,0 кДа, 45,0 кДа, 66,0 кДа (Sigma);

2 - Очищенная ЦГТаза;

3 - Фильтрат исходной КЖ.

Pua 1. Электрофореграмма очищенной ЦГТ-азы после ГХ и ИОХ в денатурирующих условиях.

Этот факт позволяет предположить, что обе активности принадлежат одному и тому же ферменту, а именно ЦГТ-азе.

Для исходной КЖ и очищенной ЦГТ-азы проводилось определение про-теолитической активности, поскольку известно, что наличие протеаз препятствует хранению, проведению хроматографической очистки фермента и может разрушать его даже при проведении длительного гидролиза полисахаридов. В КЖ отмечалось содержание нейтральных и щелочных протеаз, в то время как их содержание в очищенной ЦГТ-азе не наблюдалось.

Одностадийная очистка ЦГТ-азы с использованием аффинной хроматографии.

В качестве второго направления очистки ЦГТ-азы использовали аффинную хроматографию. В работе проводилось сравнение эффективности очистки р-ЦГТ-азы на р-ЦД- и а-ЦД-сефарозе 4В. В первом случае оказалось, что удельная активность (5-ЦГТазы возрасла примерно в 3 раза (табл. 2), тогда как на а-ЦД-сефарозе 4В очистка фермента была в 1,5 раза ниже. Такие результаты, вероятно, объясняются низкой емкостью сорбента по белку.

Удельная активность фермента после этой стадии возрасла примерно в 3 раза. Для выделения циклодекстринов из аффинного комплекса с р-ЦГТ-азой использовали металлохелат аффинную хроматографию (МХАХ) на Си(Н)-ИДК-агарозе в режиме on-line.

Было показано, что ЦГТ-аза сорбируется на иммобилизованных ионах меди даже в присутствии ЦД. Такая сорбция объясняется образованием координационных связей между имидазольными группами остатков гис-тидина в молекуле фермента с ионами переходных металлов. Использование этого вида хроматографии позволило полностью удалить ЦД и повысить удельную активность фермента в 15 раз (табл. 2).

По сравнению с рисунком 1 (ГХ и ИОХ) в очищенной фракции ЦГТ-азы

Таблица 2. Очистка ЦГГ-азы из Bacillus species 1070 с использованием

аффинной хроматографии.

Стадии очистки V (мл) Белок (мг) ЦА (ед/мг) ДА (ед'мг) Очистка, ЦА Выход ЦА{%) Очистка, ДА Выход ДА(У.)

Фильтрат ЮК 50 3+ 0,2 4560± 13 2708± 10 1 100 1 100

Аффинная хроматография на^ЦД-сефарозе 4В 10,г 1,3+ОД 13542t 13 7210t±l0 3,0 130 2,7 116

Металлохелат аффинная хроматография на Си (II) ИДК-а га розе 10,5 0,15+0.2 68673+ 13 39780+ 10 15,0 75 14,7 73

66,0 vs4 ^Gi'

45,0 36,0

29,0

24.0

20.1 14,2

14»

1

-ЛГ

r jgr*

f't

1 - Белки-маркеры молекулярной массы -

14,2 кДа, 20,1 кДа, 24,0 кДа, 29,0 кДа, 36,0 «Да, 45,0 Kfla, 66,0 кДа (Sigma);

2 - Очищенная ЦГТаза;

3 - Фильтрат исходной КЖ.

Рис. 2. Электрофсреграмма очищенной ЦГТ-азы с помощью аффинной хроматографии и МХАХ в денатурирующих условиях,

на рисунке 2, при использовании аффинной хроматографии и МХАХ, отмечается отсутствие белковой полосы в области 40 кДа. Таким образом использование последней схемы очистки позволяет выделять фермент со степенью чистоты 90-95% по данным электрофореза в денатурирующих условиях.

При сравнении двух процессов очистки ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070 следует отметить, что использование схемы, включающей аффинную хроматографию и МХАХ, позволяет максимально очистить фермент практически до гомогенного состояния. Однако, этот способ является достаточно дорогостоящим, в силу того, что элюция ЦГТ-аз осуществляется в присутствии циклодекстринов. Кроме того, в этом процессе появляется еще одна стадия - удаление ЦД из аффинного комплекса с ЦГТ-азой. Сочетание ГХ и ИОХ позволяет но намного хуже очищать ЦГТ-азу - в 13,5, причем степень чистоты в результате такой схемы не менее 90%. Таким образом, в промышленных условиях при масштабировании процесса выделения и очистки бактериальных ЦГТ-аз данный способ представляется более экономически приемлемым.

4.3. Определение физико-химических свойств очищенного фермента.

4.3.1. Определение изоэлектрической точки ЦГТ-азы.

При проведении диск-электрофореза (денатурирующие условия, 12%-ный полиакриламидный гель) выделенной ЦГТ-азы как после первой схемы очистки (ГХ и ИОХ ), так и после второй (аффинной и МХАХ) удалось обнаружить одну белковую зону со степенью чистоты ß-ЦГТ-азы ~ 90% (рис. 1) и 90-95% (рис. 2). При изоэлсктрофокусировании в обоих случаях было отмечено появление двух белковых зон со значениями pl 5,1 и 5,3. Принад-

к

лежность этих белковых зон ЦГТ-азе была показана путем экстракции их из геля с последующим определением циклизующей и декстринирующей активностей, которые коррелировали между собой. Полученные результаты свидетельствуют о наличии двух изоформ фермента.

4.3.2. Определение рН-оптимума ЦГТ-азы.

При определении рН оптимума было показано, что ЦГТ-аза обнаруживает два максимума с сопоставимой активностью ЦА и ДА при рН 7,2 и 8,6, что подтверждает наличие двух изоформ фермента (рис. 3). Измерения проводились как для ЦА, так и для ДА, причем при рН 7,2 обе активности оказались несколько выше, чем при 8,6. В качестве буферных смесей использовали №-ацетатный буфер рН 3,0-6,0 и Трис-НС1 - рН 7,0-9,0.

0

1

ю

5

Ё

я с га

I

а s н

п

1

ш

2

а ®

6

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

РН

Рис. 3. pH-оптимум действия ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070. ЦА — 1, ДА — 2

4.3.3. Определение рН-стабильности ЦГТ-азы.

При изучении рН-стабильности фермента раствор ЦГТ-азы выдерживали при 20 °С в течение1 ч при различных значениях рН (3,0-9,0). Измерение ферментатитивной активности проводили в оптимальных условиях: рН 7,2,30 мин, 60 °С. Фермент оказался стабилен в широком диапазоне рН 5,0 - 9,0 (рис. 4).

Рис. 4. pH-стабильность действия ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070, при pH 7,2.

4.3.4. Определение температурного оптимума ЦГТ-азы.

Для определения температурного оптимума действия ЦГТ-азы проводили ферментативный гидролиз 6%-нопо растворимого крахмала в интервале температур от 20 °С до 70 °С в течение 30 мин, затем определяли ЦА и ДА.

Рис. 5. Температурный оптимум действия ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070 1 —ЦА pH 7,2; 2 — ЦА pH 8,6; 3—ДАрН7,2; 4—ДАрН8,6.

Оказалось, что температурный оптимум действия фермента как для ЦА, так и для ДА находится при 60 °С. Дальнейшее повышение температуры вызывает потерю ферментативной активности (рис. 5).

4.3.5. Определение температурной стабильности ЦГТ-азы.

Исследование кинетики термоинактивации очищенной ЦГТ-азы проводили в диапазоне температур от 20 °С до 70 °С, рН 7,2 в течение 1 ч (рис. 6). Как видно из этого рисунка фермент проявляет максимальную активность в диапазоне от 20 до 40 °С, при 60 °С его активность минимальна. В соответствии с этими данными гидролиз крахмала проводили при 25 °С. Данная температура была выбрана для создания менее энергоемких условий и, следовательно, более дешевого аппаратурного оформления при масштабировании процесса гидролиза.

Рис. 6. Температурная стабильность ЦГТ-азы Bacillus sp. 1070, при pH 7,2.

4.3.6. Влияние ионов металлов и ЭДТА на активность ЦГТ-азы.

Изучение влияния ионов металлов и ЭДТА на активность ферментов позволяет сделать некоторые выводы относительно структуры активного центра.

Сохранение активности ЦГТ-азы на 76% с сильным комплексообразовате-лем ЭДТА свидетельствуют о том, что фермент, по-видимому, не содержит иона металла в активном центре. Сильное падение активности фермента в присутствии ионов 2х\г* и Си2* предполагает наличие в активном центре остатков гистидина, а с Ре3' - тирозина. Сохранение активности фермента примерно на 70% в присутствии соли ртути возможно свидетельствует об отсутствии серосодержащих аминокислот, таких как цистеин и метионин в активном центре. Ионы Мд2\ Са2* и Мп2* практически не ингибируют фермент (рис. 7).

' ЦА, (%) 100

Zn*2 Mi *Z Mn*2 Mo+2 Ca*2 Fe+3 Co« Cif* Но*2 ЭДТЛ

M<T, f 10 v.v.onb]

Рис. 7. Влияние ионов металлов и ЭДТА на активность ЦГТ-азы из Bacillus sp. 1070.

4.4. Ферментативное получение ß-ЦД.

Проведено сравнительное исследование ферментативной (циклизую-щей) активности очищенной ЦГТ-азы и КЖ в реакции образования цикло-декстринов при гидролизе крахмала. При конверсии субстрата в обоих случаях равновесие достигается за одно и то же время, через - 60-70 ч (2,5-3 суток) (рис. 8). Показано, что степень конверсии крахмала (суммарный выход ЦД) для очищенной ЦГТ-азы существенно выше, чем соответствующая

Таблица 3. Конверсия крахмала.

Гидролизующий агент Крахмал, (%) Содержание циклодекстринов, (%) £ выход, (%)

ос-ВД ß-ЦД г-цд

Культуральная жидкость Bacillus sp. 1070 6 6,0 57,0 6,3 69,3

Очищенная ЦГТ-аза 6,0 90Д нет 96,2

Культуральная жидкость Bacillus sp. 1070 15 7,8 29,1 8,4 45,3

Очищенная ЦГТ-аза 10,2 33,7 11,8 55,7

Длительность гидролиза Т, [ч]

Рис. 8. Гидролиз крахмала КЖ и очищенной ЦП"-азой из Bacillus sp. 1070

1 — Очищенная ЦГТ-аза, крахмал 6%;

2 — КЖ Bacillus $р. 1070, крахмал 6%;

3 — Очищенная ЦГТ-аза, крахмал 15%;

4— КЖ Bacillus sp. 1070, крахмал 15%;

величина для КЖ (табл. 3). Для направленного выделения ß-ЦД в реакционную смесь вводили изооктан (1-1,5%), избирательно реагирующий с ß-ЦД с образованием комплекса включения. Насколько нам известно, данные по конверсии субстрата с выходом более 90% при гидролизе очищенной ЦГТ-азой в отсутствии других ферментов амилолитического комплекса (амилазы, поллуланазы, изоамилазы) в литературе отсутствуют.

Наработанный ß-ЦД использовался для получения его полимерных производных (коньюгат ß-ЦД с низкомолекулярным хитозаном и сополимер ß-ЦД с эпихлоргидрином).

4.5. Получение комплексов включения с ß-циклодекстрином.

Сополимер ß-ЦД с эпихлоргидрином (ß-ЦД-Э) получали путем реакции поликонденсации ß-ЦД с эпихлоргидрином в щелочной среде. Растворимость ß-ЦД-Э в воде (- 200 г/л) более, чем в 10 раз превышает растворимость не модифицированного ß-ЦД.

Коньюгат ß-ЦД с хитозаном синтезировали путем реакции ди- и полиальдегидных производных ß-ЦД с низкомолекулярным хитозаном, который был получен ферментативным гидролизом высокомолекулярного хитозана с использованием гидролаз внеклеточного хитинолитического комплекса Streptomyces kursanovii в лаборатории "Инженерия ферментов" Центра "Биоинженерия", РАН.

Альдегидные производные р-ЦД получали путем его окисления периодатом натрия. Для подтверждения их образования были сняты ИК-спектры, представленные на рисунке 9. Интенсивность С-0 валентных колебаний спиртовых групп при 1150 см-1 при переходе от спектра р-ЦД к его окисленной форме резко снижается. В спектре полиальдегида 3-ЦД эта полоса проявляется лишь в виде плеча. Этот факт, наряду с появлением С=0 валентных колебаний альдегидных групп при 1730см-' свидетельствует о разрыве С2 - С3 связей и превращении спиртовых ОН групп в альдегидные.

Рис. 9. ИК-спектры: I- полиальдегид Ц-ЦД; II ~ диальдегид р-ЦД;

ш-р-цц.

Полученные производные Р-ЦД использовали для создания комплексов включения с лекарственными препаратми стероидной природы (кор-тексолон и гидрокортизон).

4.5.1. Изучение влияния сополимера р-циклодекстрина с эпихлор-гидрином на растворимость кортсксолона.

В работе показано, что в присутствии р-ЦЦ-Э растворимость кортексолона в

т 1100 1300 1500 1700 1900

Y см

-1

воде резко возрастает (рис. 10) и выходит на плато при концентрации Р-ЦЦ-Э ~ 2%. В области плато концентрация кортексолона составляет- 3,0 г/л, что в -46 раз превышает растворимость самого кортексолона в воде в отсутствии какоп> либо комплексообразователя. Такой рост растворимости стероида обусловлен образованием комплекса включения Р-ЦД/кортексолон.

Кривая растворимости кортексолона в присутствии ¡З-ЦЦ имеет максимум при 0,13%-ном содержании Р-ЦЦ, Рост растворимости стероида в растворе с р-ЦЦ-Э в 10 раз превышает соответствующую величину для р-ЦЦ.

2,0 2,5 3,0 3,5

Концентрация (5-ЦД и р-ЦД-Э, (%)

Рис. 10. Влияние концентрации р-ЦД-Э (1) и &-ЦД (2) на растворимость кортексолона

Наличие максимума и снижение растворимости кортексолона при содержании Э-ЦД более 0,13%, на наш взгляд, обусловлено образованием ассоциатов р-ЦД друг с другом по механизму водородных связей. Образование таких ассоциатов при высокой концентрации р-ЦЦ в растворе препятствует вхождению молекул стероида в полость этой циклической молекулы. Резкое увеличение содержания кортексолона в растворе в присутствии р-ЦД-Э, по сравнению с исходным Р-ЦД, может быть обусловлено значительным снижением степени асооцииации циклодекстриновых фрагментов, входящих в достаточно жесткую полимерную цепь.

Для подтверждения образования комплекса включения кортексолон/р-ЦД-Э были сняты ИК-спектры исходных соединений, их механической смеси и предполагаемого комплекса. Соотношение исходных компонент в механической смеси соответствовало их содержанию в комплексе.

Как видно из рисунка 11 в спектре комплекса присутствует полоса валентных колебаний С=0 1712 см-1, что соответствует поглощению карбонильной группы кортексолона и подтверждает его наличие в комплексе. Небольшой сдвиг полосы от 1662 до 1650 см-1 и некоторое изменение интенсивности полосы С=0 (1712 см-1) при переходе от механичес-

Рис. 11. ИК-спектры: I - кортексолон; II - р-ЦД-Э; III - механичес-каяческая смесь Р-ЦД-Э и кортексолона; IV- комплекс р-ЦД-Э/ кортексолон.

кой смеси к комплексу, на наш взгляд, также подтверждает факт образования комплекса включения р-ЦД-Э/кортексолон.

Для определения проэкстрагированного из комплекса (J-ЦД-Э/кортек-солон гидрокортизона была использована ВЖЭХ. Показано, что уже на первой стадии экстракции выход гидрокортизона составил 77,3%, на второй - 6,1%, на третьей - 2,1%, при четвертой экстракции гидрокортизон выходит в следовых количествах. Суммарный выход гидрокортизона за четыре стадии составил 86 + 4%.

т

1500 1700 1909

V, см

4.5.2. Исследование влияния коньюгата р-циклодекстрин/хитозан на растворимость гидрокортизона.

В данной работе использовался хитозан со средневязкостной молекулярной массой 6 кДа. С учетом степени дезацетилирования (0,8) такой хитозан содержит в макромолекуле около 20 свободных аминогрупп.

Нами было получено два типа коньюгатов Р-ЦД/хитозан с резко отличающимся содержанием циклодекстриновых колец. Один из коньюгатов (Д) содержал эквимолярное количество циклодекстриновых колец по отношению к амино группам хитозана. Другой коньюгат (С) содержал лишь одну молекулу Р-ЦД на полимерную цепь хитозана (на 20 аминогрупп).

Проводилось сравнительное исследование влияния полимерных коньюгатов 3-ЦД/хитозан и чистого р-ЦЦ на растворимость гидрокортизона в воде (рис. 12). Была проведена сравнительная оценка растворяющей способности циклодекстриновых колец в коньюгатах С, Д и чистом Р-ЦД по отношению к гидрокортизону. Поскольку содержаниие ЦД-колец в

X ф

г

X

3 га а

о с.

го

I

о

§ 2 ь

0,5-

2,5 ■

0,1

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Концентрация хитозана, коньюгатов С, Д и р-ЦЦ, (%)

Рис. 12. Влияние концентрации Р-ЦЦ(1), коньюгатов Д(2), С(3) и хитозана (4) и на растворимость гидрокортизона.

коньюгате Д в 1,14 раза (по массе) меньше, чем в исходном ß-ЦД, то в пересчете на ЦД-кольца этот коньюгат (при концентрации 0,4 мас.%) переводит в раствор 1,7 г/л х 1,14 = 1,9 г/л гидрокортизона. Содержание ЦД-колец в коньюгате С в 4,5 раза (по массе) меньше, чем в исходном ß-ЦД. Следовательно, он переводит в раствор 1,45 (г/л) х 6 = 8,7 г/л гидрокортизона (при концентрации 0,4 мас.%). Таким образом, при сравнении растворяющей способности коньюгатов С и Д с ß-ЦД оказывается, что преимуществом обладает С, один моль циклодекстриновых колец которого переводит в раствор ~ в 3 раза больше гидрокортизона, чем один моль ß-ЦД. Увеличение растворяющей способности циклодекстрина в коньюгате С по сравнению с Д и чистым ß-ЦД, по-видимому, обусловлено снижением степени ассоциации циклодекстриновых колец при низкой их концентрации в полимерной цепи хитозана.

ВЫВОДЫ

1. Путем скрининга микроорганизмов рода Bacillus отобран штамм Bacillus sp. 1070, обладающий максимальной активностью ß-ЦГГ-азы.

2. Разработаны две схемы выделения и очистки циклодекстрин-глюка-нотрансферазы (ЦГТ-азы) из культуральной жидкости Bacillus sp. 1070.

a) гидрофобная и ионообменная хроматография, в результате которой удельная активность фермента возросла в 13,5 раз по сравнению с КЖ;

b) аффинная и металлохелат аффинная хроматография, в результате которой удалось очистить фермент в 15 раз по сравнению с КЖ.

3. Для очищенной ß-ЦГТ-азы определен ряд основных физико-химических характеристик:

• изозлектрическая точка р! 5,1 и 5,3

• два pH-оптимума 7,2 и 8,6 (для ЦА и для ДА)

• температурный оптимум 60 °С(для ЦА и для ДА)

• pH-стабильность 5,0-9,0 (для ЦА)

• температурная стабильность 20 - 40 °С (для ЦА).

Изучено влияние ионов металлов и ЭДТА на активность ЦГТ-азы. Отмечается, что фермент возможно не содержит иона металла в активном центре, падение активности фермента в присутствии ионов Zn2\ Cu2+ предполагает наличие в активном центре остатков гистидина, a Fe3+ — тирозина, ионы Mg2*, Са2+ и Мп2* практически не ингибируют фермент.

4. Разработана модельная схема получения ß-ЦД, включающая гидролиз 6%-ного крахмала очищенной ЦГТ-азой с добавлением 1% изоокта-на. Показано, что суммарная степень конверсии субстрата оказалась бо-

лее 95% при гидролизе крахмала только очищенной ЦГТ-азой в отсутствии других ферментов амилсшитического комплекса. Содержание целевого продукта (ß-ЦД) при этом не менее 90%.

5. Получены и охарактеризованы полимерные производные ß-ЦД: сополимер ß-ЦЦ с эпихлоргидрином и коньюгат ß-ЦД с низкомолекулярным хитозаном. Показано преимущество использования этих производных в биотрансформации лекарственных препаратов стероидной природы в связи с увеличением растворимости стероидов в воде при образовании комплексов включения. Растворимость кортексолона в воде в присутствии ß-ЦД-Э превышает собственную растворимость ~ в 46 раз и в 10 раз превышает свою растворимость при комплексооб-разовании с ß-ЦД. Один моль циклодекстриновых колец коньюгата ß-ЦД с низкомолекулярным хитозаном (С) переводит в раствор ~ в 3 раза больше гидрокортизона, чем один моль чистого ß-ЦД.

6. Разработана технология высокоочищенной ß-ЦГТ-азы, ß-ЦД и соединений включения на их основе. Проведена апробация этой технологии и получен акт о наработке в лабораторных условиях очищенной ß-ЦГТ-азы из Bacillus sp 1070, модифицированных ß-ЦД и получении комплексов включения на их основе, который показал, что апробация эффективна и может быть положена в основу разработки лабораторного регламента.

Приношу глубокую благодарность своим научным руководителям д.б.н., проф. Грачевой И.М. и д.х.н. Варламову В.П. за предоставленную возможность проведения интересной и актуальной научно-исследовательской работы, соответствующей современному направлению биотехнологии на сегодняшний день.

Также приношу благодарность сотруднику лаборатории "Инженерия ферментов" Центра "Биоинженерия", РАН Лопатину С.А. за ценные научные консультации по хроматографическим методам очистки белков, позволившим выполнить работу на современном теоретическом и экспериментальном уровне.

Результаты работы были бы недостоверны при отсутствии таких методов анализа обработки экспериментальных данных, как высоко эффективная жидкостная хроматография (возможность предоставлена Ильиным М.М. - Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова), инфракрасная спектроскопия (возможность предоставлена Волковым A.B. - МГУ им. М.В. Ломоносова).

Я также благодарна к.х.н. Андрюшиной В.А. и к.б.н. Габинской К.Н. и к.х.н. Савиной T.C. - сотрудникам лаборатории "Биотрансформация стероидов" Центра "Биоинженерия", РАН за совместное творчество в создании комплексов включения лекарственных препаратов стероидной природы с модифицированным ß-циклодекстрином.

Моральную поддержку при выполнении работы оказали сотрудники лаборатории "Инженерия ферментов" Центра "Биоинженерия", РАН и кафедры "Биотехнология, экология и сертификация пищевых продуктов" Московского государственного университета пищевых производств.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. "Cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus sp. - screening, investigation and application", Volkova D.A., Ryabchenko N.F., llyin M.M., Lopatin S.A., Vartamov V.P., Grachyeva I.M. / Proc. in Int. Conf. "Biocatalysis 1998", 1998, p. 58-59.

2. "Получение комплексов хитозанф-циклодекстрин и возможность их использования в микробиологическом дегидрировании стероидов", Банникова Г. Е„ Волкова Д. А., Лопатин C.A., Габинская К. H.., Андрюшина В. А., Ильин М. М., Варламов В. П. / В материалах V международной конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана", 1999, р.12-15.

3. "Изучение влияния сополимера ß-циклодекстрина с эпихлоргидри-ном на растворимость кортексолона", Волкова Д.А., Банникова Г.Е., Лопатин C.A., Ильин М.М., Габинская К.Н., Андрюшина В.А., Грачева И.М., Варламов В.П. /Хим.-фарм. журнал, 1999, Т. 33 (11), с. 30-32.

4. "Получение высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070", Волкова Д.А., Лопатин С.А., Ильин М.М., Грачева И.М., Варламов В.П. / Прикладная биохимия и микробиология, 2001, Т. 37(2), в печати.

5. "Одностадийная очистка циклодекстринглюканотрансферазы Bacillus sp. 1070. Аффинная хроматография", Волкова Д.А., Лопатин C.A., Варламов В.П. / Вестник МГУ, 2000, в печати.

SUMMARY

Bacillussp. 1070 strain with greatactrvity of p-cyclodextringlucosyltransferase (P-CGT) was isolated by screening from microorganisms collection of Bacillus genus.

For the p-CGT-ase Bacillus sp. 1070 purification two chromatografic processes have been developed:

a) hydrophobic (butyl-toyoperl) and ion exchange chromatography (DEAE-Sephacell)—specific enzyme activity increased into 13,5 times, enzyme purity is - 90% by SDS-Electroforesis data;

b) affinity (fi-cyclodextrin-Sepharose 4B) and immobilised metal ion affinity chromatography (Cu(ll)-IDA-Agarose) — specific enzyme activity has increased into 15 times, enzyme purity is not less than 90-95% by SDS-Electroforesis data.

For purified P-CGT-ase we have defined main physical chemical properties:

• pi 5,1 and 5,3

• pH-opt, 7,2; pH-opt2 8,6

• t-opt 60 0 C

• pH stability 5,0-9,0

• t stability 20 -40 °C

It was shown that Zn2\ Cu2* and Fe3* strongly inhibit enzyme activity and Mg2*, Ca2* and Mrv^almost do not influence the enzyme activity.

0-CD production process have been developed including hydrolysis of 6% potato starch with 1 % isooctane addition by purified p-CGT-ase. In this case (without addition of any amylolitic enzymes) a starch hydrolysis conversion extent was more than 95%.

We have synthesized following polymeric derivatives with obtained P-CD: co-polymer p-CD with epichlorohydrin and conugate P-CD with low molecular weight chitosan. I n our work the advantage of these derivatives in intensification of steroids biotransformation was shown.