Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем"

На правах рукописи

КАЛМЫКОВА ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

!, ■ I

БИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS ИЗ ЕСТЕСТВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск 2003

Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Института Систематики и Экологии Животных СО РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Бурцева Людмила Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.В.Дрюккер

кандидат биологических наук, доцент Г.Б.Талалаева

Ведущая организация: Государственный научный центр прикладной

микробиологии

Защита состоится «47 »вг/ии&ЬЗ- 2003 г. в час. на заседании

диссертационного совета д2(2.074.07 в Иркутском государственном университете по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Биолого-почвенный факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан « » исЯ&иЬ- 2003 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета Дгц-ц^ Е.С.Купчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) широко используются для регуляции численности насекомых отрядов Lepidoptera, Díptera, Coleóptera. Несомненным преимуществом их применения является безопасность для здоровья человека, животных и растений.

С 80-х годов для регулирования численности насекомых во всем мире применяются препараты на основе Bt ssp.kurstaki. Вероятно, их широкое использование может приводить к неконтролируемому распространению Bt ssp.kurstaki в экосистемах. Показано, что штаммы этого подвида являются одними из часто встречающихся в природе [Martin, Travers, 1989; Kaelin et al., 1994]. Основным фактором специфичности и эффективности действия Bt на насекомых является белковый кристаллический S-эндотоксин, который синтезируется во время спорообразования. Внимание большинства исследователей направлено на изучение свойств, регуляции синтеза и механизма действия этого токсина [Hofte, Whiteley, 1989; Gill et al., 1992; Rukmini et al., 2000]. Во время вегетативного роста и на ранней стадии споруляции Bt продуцирует и другие биологически активные вещества: ß-экзотоксин, гидролитические ферменты, вегетативные инсектицидные белки, антибиотические вещества, которые, как полагают, могут вносить вклад в вирулентность, а также способствовать адаптации бактерий к жизни в различных экосистемах [Нетыкса и др., 1979; Смирнова и др., 1991; Bingeron, de Baijac, 1967; Edlund et al., 1976; Smirnoff, Valero, 1977; Luthy, 1980; Favret, Yousten, 1989; Lovgren et al., 1990; Zhang et al., 1993; Donovan et al., 2001]. Важным условием приспособления к окружающей среде у прокариот является генетическое разнообразие внутри популяции. Однако вопросу гетерогенности культур Bt ssp.kurstaki, их способности продуцировать метаболиты, отличные от 5-эндотоксина, уделено необоснованно мало внимания. Кроме того, многочисленные скрйнинговые программы по Bt направлены на выделение штаммов с новой специфичностью и не затрагивают вопросов, связанных с разнообразием этих бактерий в природных экосистемах.

Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение разнообразия вариантов внутри Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki по морфологическим и биохимическим свойствам и роли биологически активных веществ, синтезируемых ими, в энтомопатогенной активности и сохранении в природе.

Задачи исследования.

1. Оценить морфологическую неоднородность и биохимическое разнообразие штаммов Bt ssp.kurstaki.

2. Выявить возможные связи между колониально-морфологическими признаками и рядом физиолого-биохимических, инсектицидных, антибиотических свойств и адгезивностъю у культур Вг йзр.китаМ.

3. ОхфёйЬлить вклад спор, кристаллического 5-эндотоксина и других секретируемых белков в инсектицидную активность (на примере Скошгопеига оссп<ЬпгаШ (Ъер1<1ор1ега: Тойггадае)).

4. Изучить колониально-морфологическое разнообразие штаммов Вг, выделенных из природных экосистем, а также штаммов Вг, являющихся контамин антами питательных сред.

- Научная новизна. Впервые в результате изучения колониально-морфологической неоднородности штаммов Вг выявлено 6

"'^морфологических вариантов (морфоваров). Фенотипические различия, выраженные в характерном внешнем виде колоний на агаризованной среде, затрагивали и базисные особенности метаболической организации клеток: морфовары различались по синтезу метаболитов (6-эндотоксина, вегетативного инсектицидного белка, бактериоцинов, адгезинов) и внеклеточных ферментов (уреазы; протеазы, лециТиназы).

Впервые было показано, что из естественных экосистем, в том числе из мест, где использовали лепидоцид (биоинсектицид на основе Вг ¡зр.кигягаИ, кристовар К-1, морфовар И.), преимущественно выделялись штаммы Вг язр.кигвгакл кристовара К-73 морфоваров г и т.

Практическая значимость. Выявленные особенности бактерий Вг ¡хр.кигягаИ могут послужить основой для изучения роли Вг в окружающей среде.

Результаты, полученные в ходе исследований, убедительно доказывают необходимость включения спор в биопрепараты для регулирования численности Скопзгопеига оссгс1епгаШ (Ьер}<1ор1ега: Тойпиёае), поскольку в их присутствии активность кристаллов повышалось в 100 - 500 раз.

Предложен метод отбора штаммов Вг, выделенных из естественных экосистем, для биотестирования, который позволяет значительно сократить количество проверок на насекомых.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на IV Всесоюзной научной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Пущино, январь, 1992); на конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Москва, октябрь, 1993); на Всероссийском научно-производственном совещании «Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции» (Краснодар, автуст, 1994); на конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду» (Москва, май, 1994); на XIII Международном конгрессе по защите растений (Нидерланды, июль, 1995); на Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы окружающей среды" (Томск, сентябрь, 1995); на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий" (Курган, март, 1998);

на XI Съезде Русского энтомологического общества (С.-Петербург, 1998); на Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В.- Талалаева "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" ( Иркутск, март, 2002), на отчетной сессии ИСиЭЖ СО РАН (апрель, 1994), на заседании микробиологического общества (декабрь, 2002). По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста; состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 244 работы, из них 191 на иностранных языках. В приложении приведена подробная характеристика штаммов Bt, относящихся к различным подвидам.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Штаммы Bt ssp.kurstaki гетерогенны по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам.

2. Из естественных экосистем чаще выделяются штаммы морфоваров Bt ssp.kurstaki, которые не используются для производства биопрепаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были более 200 штаммов Bt, выделенных из природы и контаминанты питательных сред; 67 штаммов, представляющих 43 подвида Bt, из коллекции лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных (ИСиЭЖ) СО РАН. Кроме того, в работе использовали 12 штаммов Bt ssp.kurstaki и 96 клонов этого подвида, а также штаммы HD-1 и HD-73 Bt ssp.kurstaki из коллекции культур Лесного Центра на Великих Озерах (Канада) (Great Lakes Forestry Center, Canada).

Культурально-морфологические свойства бактерий изучали на плотных питательных средах различного состава, выращивая их до полной споруляции в течение 6 суток при 28° С. Для оценки инсектицидной активности культуры выращивали на жидких средах [van Frankenhuyzen et al., 1997].

Способность штаммов Bt продуцировать параспоровые включения, форму и размер 1фисталлов оценивали с помощью светового микроскопа в фиксированных, окрашенных карболовым эозином препаратах, а также с помощью фазово-контрастного и сканирующего электронного микроскопов. Для морфометрической оценки кристаллов использовали Данные измерений 100 кристаллов. Объем кристаллов определяли, основываясь на полученных результатах линейных размеров, условно считая, что кристаллы имеют бипирамидальную форму, по формуле V = Ш2 х Дл / 6 (мкм 3), где Щ -ширина кристалла, мкм; Дл - длин£ кристалла, мкм.

Внутривидовую идентификацию бактерий Bt проводили по схеме де Баржак и Фраконе [de Barjac, Frachon, 1990].

Относительную гидрофобность спор бактериальных штаммов оценивали по методу Розенберга [Rosenberg М. et al., 1980]. Способность штаммов продуцировать бактериоцины была проверена методом Кекеси и Пике [Kekessy, Piquet, 1970].

Препараты частично очищенных спор и кристаллов получали разделением в градиенте плотности Ludox HS-40 [Zhu et al., 1989]. Споры без кристаллов были получены, обработкой частично очищенных препаратов спор в 0,05% NaOH (pH 12). Концентрацию спор определяли методом серийных разведений на среде «А» и подсчетом выросших на ней колоний через 24 ч при 28°С. Растворы кристаллического белка, свободные от спор, были получены инкубацией частично очищенных препаратов кристаллов в 0,2 М CAPS (pH 10,5). Оставшиеся споры удалялись фильтрацией через фильтр Syringe.

Препараты секретируемых белков были получены при выращивании культур Bt ssp.kurstaM до ранней стационарной фазы по Донован с соавторами [Donovan et al., 2001].

Белковый состав спорокристаллических смесей изучали методом электрофореза в 7,5% PAGE-SDS; очищенных кристаллов - в 12 % геле, а белков, секретируемых во время вегетативного роста - в 15 % геле [Laemmli, 1970]. Гель окрашивали 0,1% Кумасси синим R-250. Количество белка измеряли с использованием белкового теста «Bio-Rad». Количество Vip3A белка (89 kDa) в препаратах секретируемых белков и количество протоксина в препаратах чистых кристаллов определяли денсиометрированием белковых полос, окрашенных Кумасси синим R-250.

Качественное биотестирование штаммов Bt проводили методом свободного скармливания на лабораторных линиях насекомых 2-3 возраста: сверчках Gryllns bimaculatus (Orthoptera: Gryllidae), кровососущих комарах Aedes aegypti L. (Díptera: Culicidae), большой пчелиной огневке Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae), луговом мотыльке Pyrausta sticticalis L. (Lepidoptera: Pyralidae), непарном шелкопряде Lymantria dispar L. (Lepidoptera: Orgyidae), еловой листовертке-почкоеде (4-го возраста) Choristoneura occidentals (Lepidoptera: Tortricidae).

Гусениц С. occidentalis заражали методом принудительного скармливания дозы препарата, как описано ван Франкенхьюзеном с соавторами [van Frankenhuyzen et al., 1997].

Для определения 50% летальной дозы (LDso) или 50% летальной концентрации (LK») готовили шесть 3-кратных разведений для каждого препарата. Данные смертности были проанализированы с помощью программы PO-LO-PC [Rasseil et al., 1977].

Препараты чистых спор и кристаллов, препараты секретируемых белков Bt ssp.kurstaki были получены, охарактеризованы и протестированы на гусеницах С. occidentalis в лаборатории Лесного Центра на Великих Озерах (Канада).

РЕЗУЛЬТАТЫ ÍTOB СУЖДЕНИЕ

1. Характеристика биологическизрбсобеиностей штаммов B.thuringiensis

67 музейных штаммов Bt, относящихся к 43 подвидам, были охарактеризованы серологическими, биохимическими, микроскопическими и электрофоретическими методами, а также биотестами на насекомых -представителях трех отрядов Orthoptera (Grillus bimaculatus), Díptera (Aedes aegypti), Lepidoptera (Galleriae mellonellä). В результате работы было установлено, что наиболее изменчивыми свойствами внутри штаммов одного подвида были продукция лецитиназы, образование кислоты из Сахаров, гидролиз эскулина, способность синтезировать кристаллы, специфичность их действия. Эти характеристики и были выбраны для оценки разнообразия штаммов Bt, изолированных из естественных экосистем.

2. Характеристика штаммов Bt ssp.kurstaki

В 1978 г. в этом подвиде на основе серологии кристаллических белков и специфичности токсинов было обнаружено два кристовара, обозначенные как К-1 и К-73 [Krywienczyk et al., 1978].

Для изучения гетерогенности штаммов Bt ssp.kurstaki мы выбрали 12 модельных культур, которые различались по световой микроскопии и морфологии колоний на ряде сред. Модельные штаммы были подробно охарактеризованы по морфологии, размерам и белковому составу кристаллов, по физиолого-биохимическим свойствам, антибактериальной активности, адгезивной способности, культурально-морфологическим и инсектицидным свойствам.

2.1. Кристаллы дельта-эндотоксинов штаммов Bt ssp.kurstaki

По световой микроскопии штаммы разделили на две группы: штаммы первой группы продуцировали вытянутые ромбовидные с заостренными концами, крупные по сравнению со спорой кристаллы и с дополнительными бесформенными включениями; штаммы второй группы - правильные ромбовидные кристаллы, по величине равные споре без включений; штамм 1БХЗ был без кристаллов. Это разделение было подтверждено сканирующей микроскопией (рис. 1а, б, в).

Морфометрический анализ четырех штаммов, относящихся к двум кристоварам - 5м, Зк (кристовар К-1) и БИ-17, 8к (кристовар К-73), выявил, что средний объем кристаллов К-73 типа примерно в три раза меньше объема К-1 кристаллов.

Электрофорез спорокристаллических смесей штаммов Bt ssp.kurstaki показал, что штаммы кристовара К-1 имели два главных белковых компонента с молекулярной массой 130 и 68 кДа. У штаммов кристовара К-73 присутствовал только один основной белковый компонент с молекулярной массой 130 кДа. Белковые профили штаммов кристовара К-73 полностью совпадали даже по минорным компонентам.

б ■

Рис.1. Вид в сканирующем электронном микроскопе кристаллов Вг ssp.kursta.ki-. а - кристовар К-1; б - кристовар К-73; в - акристаллофорный вариант

2.2. Физиолого-биохимические свойства культур Й? вьр.ки^акл

Проверка физиолого-биохимических свойств выбранных штаммов Bt ssp.kurstaki показала, что все исследованные культуры продуцировали ацетилметилкарбинол, проявляли уреазную, ДНКазную, амилазную, протеазную активности; на кровяном агаре давали нечеткую зону частично разрушенных эритроцитов; не сбраживали маннозу, сахарозу с образованием кислоты; не давали пленку на бульоне и не продуцировали пигмент на желтковых средах. Все штаммы, кроме п17, давали положительную лецито-вителлиновую реакцию. При росте штамма п17 на плотной желтковой среде просветления вокруг колонии не наблюдали. Ни один из штаммов не продуцировал /3-экзотоксин.

Штаммы различались отношением к салицину, эскулину, по уреазной активности. Многократная проверка этих свойств показала, что для штаммов кристовара К-1 характерна высокая уреазная активность, выражена способность сбраживать салицин и гидролизовать' эсКулйн. У штаммов, относящихся к кристовару К-73, отмечена пониженная по сравнению с К-1 культурами активность уреазы, они не гидролизовали эскулин и не сбраживали салицин с образованием кислоты.

Сравнительное изучение ферментативных активностей № ssp киШаИ при росте бактерий на плотных средах позволило выявить различия штаммов по интенсивности синтеза лецитиназ (фосфолипаз) и протеаз.

Среди штаммов с высокой гидролитической активностью преобладали культуры кристовара К-73. В эту же группу входил и акристаллофорный мутант. У него была зарегистрирована самая высокая лецитиназная активность. Штамм п17 кристовара К-1 не проявлял лецито-вителиновую реакцию.

Рис. 2. Динамика синтеза экзопротеазы на дрожжеполисахаридной среде различными штаммами Bt ssp.kurstaki: 1-штамм 5м; 2-штамм 4о; 3 - штамм 273; 4 - штамм 1БХЗ; 5 - штамм 532. , л

Динамика синтеза нейтральных протеаз штаммами Bt ssp kurstaki была оценена на дрожжеполисахаридной среде (рис.2). К началу споруляции (на 48 ч роста) культуральные жидкости штаммов 273, 1БХЗ, 532 имели высокую протеолитическую активность. Установлено, что мутант 5м отличался низким уровнем синтеза ripen еачы на всех стадиях роста. Другой исследованный штамм 4о в противоположность остальным штаммам снижал продуктивность синтеза фермента при переходе культуры к спорообразованию. Этот же мутант терял способность синтезировать не только кристаллы, но и споры на среде с высоким содержанием аминного азота (120 мг %), что ЭД^гло быть связано с синтезом на богатИГ' аминшм азотом среде фактора, подавляющего собственную споруляцию [Шамшина и др., 1994].

2.3. Антибактериальна£.акти^вность штаммов Bt ssp.kurstaki

Известно, что штаммы Bt проявляют антйЛЭвЕКЙ'4 ко ^'многим грамположительным бактериям [Favret, Yousten, 1989 ]. Антибактериальные вещества, которые имеют спектр активности ограниченный штаммами родственных видов, принято называть бахтериоцинами [Jack et al., 1995].

Проверка штаммов Bt ■ssp.kurstaki на продукцию бактериоциноподобных веществ показала, что штаммы кристовара К-73 не проявляли антагонизма в отношении культур своего подвида. Штаммы кристовара К-1 различались по антибактериальной активности. Штамм 532, как и культуры кристовара К- 73, не проявлял антибактериальной активности. Спектры активности акристаллофорного штамма 1БХЗ и штаммов п17 и Зк кристовара К-1 совпадали; они подавляли рост штаммов кристовара К-73. Культура 5м обладала самым широким спектром бактериоциногенного действия, задерживая рост штаммов обоих кристоваров.

2.4. Морфологическая неоднородность штаммов Bt зэр.киЫаЫ

На средах, отличающихся по содержанию аминного азота, выявлена морфологическая неоднородность штаммов зйр^аЛегше и 1?/ мр./ягае/епям [Бурцева и др., 1973; Бурлак и др., 1995].

На эмпирически подобранной дифференциальной среде с добавкой дрожжевого экстракта и глюкозы (ЛАГ) штаммы Вг з¡р. киШаЫ отчетливо различались по морфологии колоний. При рассеве этих культур было обнаружено 6 морфологических типов или вариантов. Их внешний вид представлен на рисунках 3 а,б,в,г,д,е.

в

Рис. 3. Внешний вид морфологических вариантов ир.ЛмгайАг. Морфовары: а - Л; б - Х\ в - М\ г - г; д - т; е - т].

2.4.1. Некоторые особенности морфологических вариантов В( хьр.кигьшк'г

Проверка 96 клонов различных морфоваров В( ззр.киШаИ выявила, что для морфовариантов г, т, т1 было характерно образование правильных ромбовидных параспоровых включений, по величине равных споре, т.е. кристаллов типа К-73. Но клетки г и т - вариантов образовывали много мелких бесформенных кристаллов. Кроме того, культуры т - варианта на рыбном агаре (среда с высоким содержанием аминного азота) не

и

спорулирулировали и не образовывали. кристаллы. Потерю кристаллообразования у морфовариантов г, т и т1 мы не наблюдали..

Штаммы морфовара X и Я продуцировали кристаллы К-1 типа; штаммы морфовара М были акристаллофорными. Исследования показали, что культуры морфовара Я часто теряли способность продуцировать кристаллы, но их морфология сохранялась.

Проверка физиолого-биохимических свойств показала, что морфоварианты различались отношением к салицину, эскулину, по протеолитяческой активности. Дифференциальные свойства морфоваров представлены в таблице 1. Для культур морфологических ариантов К» X, М отмечалась способность гидролизовать эскулин, сбраживать салицин, что было, не характерно для морфоваров г, т, т1. Пониженной протеолитической активностью характеризовались типы X, М. У морфовара т1 эта активность зависела от концентрации молока в среде. На среде с низким содержанием молока протеолиз не отмечался, с увеличением концентрации молока протеолитическая активность появлялась. Остальные морфоварианты проявляли высокую протеазную активность.

Таблица 1. Дифференциальные свойства морфологических вариантов Вг зйр.кигзшШ

Морфо-вар Кристо-вар Количество проверенных клонов Гидролиз эскулина Образование кислоты из салицина Протеолиз

К К-1 Сгу- - 34 + + +

X 1 К-1 17 + +

м Сгу- 5 + +

г К-73 17 +

т К-73 17 +

т1 К-73 6 ±

Примечание: - отсутствие реакции; "+" - положительная реакция; "±" -проявление реакции зависит от концентрации субстрата

Результаты проверки антагонистических отношений между морфологическими вариантами показала, что самым широким спектром

активности характеризовались культуры морфовара X. Не продуцировали бактериоцины и были чувствительны к антибиотическим веществам культур морфологических вариантов X и R культуры морфоваров г, m, ml, М.

2.4.2. Гидрофильно-гидрофобные свойства морфологических вариантов Bt ssp.kurstaki

Гидрофобные ' свойства микроорганизмов связаны с различными составными компонентами их оболочек. Считается, что у морфологических мутантов бактерий это проявляется особенно наглядно.

Л Результаты сравнения гидрофильно-гидрофобных свойств основных <

морфологических вариантов показали, что гидрофильными были культуры с морщинистой, сухой по консистенции поверхностью варианта R, образующие и необразующие кристаллы. Несколько большей гидрофобностью обладали культуры типа X. Индекс гидрофобности выше 50 % показали культуры Морфоваров гит.

Значительные различия в гидрофобности могли быть связаны с различиями в строении споровых оболочек культур разных морфоваров. Хачисука с соавторами разделил споры видов-Bacillus на 4 группы на основе присутствия или отсутствия экзоспориума и выростов на спорах [Hachisuka et al., 1984]. Согласно их классификации споры морфоваров гит могли иметь либо экзоспориум, либо вЬгросты, а возможно и то, и другое. Скорее всего, экзоспориум и выросты отсутствуют на спорах морфовара R.

2.5. Инсектицидность штаммов Bt ssp.kurstaki

Штаммы Bt ssp.kurstaki разделились по специфичности к личинкам комаров Aedes aegypti: только культуры К-1 кристовара были токсичны для этих насекомых. Чешуекрылые насекомые были чувствительны к культурам обоих кристоваров. Однако восприимчивость гусениц лугового мотылька была ниже, чем восприимчивость гусениц непарного шелкопряда. Концентрация спорокристаллического комплекса в культуральной жидкости, необходимая для 50%-ной смертности тест-насекомых, варьировала у разных штаммов Bt ssp.kurstaki в , 7 раз для непарного шелкопряда и в 15 раз - для лугового мотылька. Акристаллофорный штамм 1БХЗ не проявлял инсектицидной активности ни к одному из тест-насекомых. . '

3. Вирулентность спор Bt ssp.kurstaki

Предположения о том, что кроме дельта-эндотоксина, другие вещества, синтезируемые Bt, вносят свой вклад в инсектицидность, высказывались в целом ряде работ [Ивинскене, 1987; Иванов и др., 1990; Dalhammar, Steiner , 1984; Favret, Yousten, 1989]. Хемпель и Ангус еще в 1959 г. показали, что «поры могут играть важную роль в инсектицидной активности для некоторых видов чешуекрылых [Heimpel, Angus, 1959].

Протоксины (20 п§/личинку) различных штаммов кристовара К-1 (НЕ>-1, п17, 5м) в отсутствии спор вызывали гибель не более 20% насекомых. Однако, уже в первые дни после заражения отмечалось нарушение питания. Кроме того, протоксины значительно задерживали рост оставшихся в живых гусениц и почти полностью ингибировали окукливание через 10 дней после заражения. Напротив, споры тех же самых штаммов, а также споры' 'пггаьша' Нр-73 (кристовара К-73) и акристаллофорного мутанта 1БХЗ были нетоксичны'и не влияли на рост и окукливание гусениц.

3.1. Синергизм меаду спорами н дельта-эндотоксином

Добавление спор приводило к уменьшению ЦЭ50 в 100 и более раз, в зависимости от спор, которые добавляли к протоксину ^табл.2).

4. Влияние биологически активных веществ Ъг язр.ки^а/а на инсектицидн ость , _

Считается, что синергетическое действие спор на токсичность кристаллических белков может происходить за счет синтеза других^'отличных от 8-эндотоксина, вирулентных факторов.

Таблица 2. Инсектицидная активность очищенных кристаллов и смеси спор'1и кристаллов для гусениц СИоги^пеига осс1<1ешаИ$.

я споры 1Ао 95% протоксин споры ,1^50 95%

протокси доверительный интервал пробит довери- * тельный интервал'' пробит

ГО-1 - 170 п17 - 568

НО-1 3.24 1.2-10.6 1.89 НО-1 3.78 1.6-15.5 1.65

п17 1.31 0.6-2.8 1.61 п17 1.94 1.4-2.7 1.40

5м 2.37 1.8-3.2 1.84 5м 2.33 1.8-3.0 2.07

1БХЗ 6.61 2.9-28.8 " 1.80 1БХЗ 5.66 2.8-15.4 1:14

г - НЕ>-73 1.18 0.6-2.5 1.55 Н1>73 0.64 0.3*1.2 1.80

Примечание: "-" - споры к протоксину не добавлялись

4.1. Инсектицидность кулыуральных жидкостей Ъ1 йвр.кшъШЫ

В результате оценки инсектицидности было установлено, что культуральвая жидкость, содержащая споры, кристаллы и другие метаболиты, продуцируемые во время вегетативного роста, была более активна, чем смесь очищенных спор и кристаллов. Спекулирующие культуры кристовара К -1 содержали (0,5-4,5)х103 спор на нг кристаллического белка, \ что

соответствовало соотношению спор и протоксина в смеси очищенных спор и кристаллов. Поэтому мы заключили, что различия в инсектицидной активности культуральной жидкости и смеси очищенных спор и кристаллов могли быть из-за секретируемых вегетативных белков, находящихся в культуральной жидкости.

42. Инсектицидная активность штаммов В1, несвязанная с дельта-эндотоксином н спорами

4.2.1. Характеристика секретируемых белков штаммов В( ^р.кигБгаИ

В препаратах секретируемых белков был определен общий белок, фосфолипазная, протеолитическая активности, а также наличие вегетативного инсектицидного белка У1р ЗА (~89-90 кДа) (табл. 3).

4.2.2. Действие секретируемых белков на СкогШопеига оссЫеМаЛЫ

В ходе данных исследований было выявлено, что все личинки, зараженные препаратами секретируемых белков из штаммов К-73 кристовара, оставались живыми, однако их масса была в среднем аа 20% ниже, и окукливание личинок наступало позднее, чем в контроле. Все проверенные штаммы кристовара К-73, а также акристаллофорный штамм 1БХЗ имели сходное влияние на гусениц. Как видно из таблицы 3, все препарата этих штаммов имели фосфолипазную и протеазную активности. Результаты биотестов показали, что эти ферменты способны вносить вклад в установлении инфекционного процесса у гусениц С.оссхйегйаНх. . .

Таблица 3. Состав белков, секретируемых штаммами Вг ¿ярЛитягаИ

Штамм Кристо- Морфо- Общий Л Гемо- Протеолити- Наличие

вар вар белок, В лиз ческая акт., белка с

mg/ml Р ед-вкт.трип- Мм90кДа

сина

HD-1 К-1 3.304 + + 0.747

Р17 К-1 R 0.906 - + 0.469 +

Зк К-1 R 0.504 + и.о. 0.500 +

5м К-1 X 1.356 + + 0.402 +

HD-73 К-73 0.959 + - 0.598 -

273 К-73 г 2.243 + - 0.652 -

4о К-73 ш 2.139 + - 0.685 -

1БХЗ Сгу- R 0.511 + + 1.055 -

Примечание: "-" - реакция отсутствовала; "+" - положительная реакция; "и.о."— свойство не определяли

Препарат штамма НЕ)-1 кристовара К-Г Ьызывал гибель более 60% гусениц, значительно ингибировал рост оставшихся в живых гусениц и полностью ингибировал окукливание. Секрётируемые белки других штаммов

кристовара ТС-1 имели похожее (штамм Зк) или несколько меньшее (штаммы п17; 5м) влияние на инсектицидность. Относительно высокая токсичность препаратов штаммов кристовара К-1 скорее всего определялась способностью штаммов только этого кристовара продуцировать вегетативный инсектицидный белок Vip ЗА (табл.3). При биотестировании количество белка Vip ЗА в препаратах штаммов HD-1 и п17 было примерно равным (3,8 нг/личинку), но несмотря на это штамм HD-1 вызывал в 2 раза большую смертность, чем препарат штамма п17 (68% гибели против 31,7%). Это могло быть связано с отсутствием фосфолипазной активности и невысокой протеолитической активностью в последнем препарате (табл. 3).

Добавление к препаратам секретируемых белков одинакового количества протоксина HD-1 в разной степени повышало их активность.

5. Оценка колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt ssp.kurstaki

В 1987 - 1990 г.г. на предмет встречаемости бактерий группы Bac.cereus - Bac.thuringiensis было исследовано 760 проб (почва, насекомые, места их обитания), собранных в Новосибирской области, Алтайском крае и на о-ве Кунашир, и выделено более 200 изолятов Bt. В этот же период в лаборатории была собрана коллекция штаммов Bt, являющихся контаминантами питательных сред.

В результате идентификации полученных изолятов было установлено, что более 50 % природных образцов и контаминантов содержали культуры подвида kurstaki. Возможно, столь широкое распространение штаммов этого подвида было связано с применением биоинсектицидов на основе Bt ssp.kurstaki для регулирования численности чешуекрылых насекомых.

Мы оценили качественный состав популяции Bt ssp.kurstaki по кристо- и морфоварам (табл. 4). Предварительно мы определили, что продуцентом коммерческого биоинсектицида лепидоцида являются культуры кристовара К-1 морфовара R. Однако изоляты кристовара К-1, выделенные из насекомых и

Таблица 4. Распределение контаминантов и природных изолятов Bt ssp.kurstaki по кристо- и морфоварам

Источник Количество % клонов % клонов морфовара

выделения проб/клонов кристовара

К-1 К-73 R X г m

Контаминанты 28/28 100 0 100 0 0 0

Насекомые 11/17 12 88 12 0 0 88

Р.Шигарка 14/22 22,5 77,5 10,5 12 38,5 39

Пастбище 4/5 20 80 20 0 60 20

Скотный двор 3/8 50 50 37,5 12,5 20 30

мест их обитания, присутствовали в небольшом количестве проб. Большинство же природных изолятов относилось к кристовару К - 73 (табл.4). Аналогичные результаты были получены Келин с соавторами [КаеНп ег а1., 1994] при исследовании сухих остатков табака и мертвых табачных жуков, собранных в 15 странах мира.

Повсеместное распространение штаммов В( ssp.kursta.ki кристовара К - 73, даже в тех местах, где никогда не использовались биоинсектициды (во всех пробах с острова Кунашир мы обнаружили штаммы В1 ¿¡-р. киШаИ только кристовара К - 73), указывало на их адаптацию к жизни в микробных сообществах из-за высокой гидролитической активности, повышенной гидрофобности спор, способствующей прикреплению к питательному субстрату. При работе с модельными штаммами нами была замечена разница в скорости прорастания спор двух кристоваров. Споры кристовара К - 73 прорастали на среде с дрожжевым экстрактом и глюкозой на сутки раньше, чем споры кристовара К - 1. Выживание спор кристовара К -73 в условиях окружающей среды могло определяться способностью этих спор к быстрому прорастанию.

Результаты изучения морфологии колоний природных изолятов Вг Бзр.ки^аИ показали, что из насекомых культуры морфовара К (продуцента лепидоцида) выделялись редко (один образец - погибшая гусеница). Изоляты кристовара К- 1 морфовара К чаще выделялись из почвы; культуры морфовара X кристовара К - 1 были обнаружены только в образцах, взятых у реки Шигарки (Новосибирской области), (табл.4).

Из таблицы 3 видно, что все изоляты кристовара К - 73, выделенные из насекомых, относятся к морфовару т. Как отмечалось выше, штаммы этого морфовара (гл.2.4.1.) не дают спор и кристаллов на средах, богатых аминным азотом. Возможно, содержимое кишечника насекомого при благоприятных условиях является той средой, на которой эти культуры не образуют спор и кристаллов и способны размножаться, находясь в симбиозе с насекомым -хозяином.

Было установлено, что в одном образце могли присутствовать клоны разных морфоваров. Это указывало на то, что в природных условиях, вероятно, происходит расщепление популяции Бг на варианты. Возможно, при расщеплении популяции Вг яяр. ku.rsta.ki кристовара К - 73 возникли морфовары X и И. кристовара К - 1 с более токсичными кристаллами 5-эндотоксина и со свойствами, затрудняющими их адаптацию к жизни в микробных сообществах Вероятно поэтому, изоляты кристовара К-1. а особенно морфовара X, довольно редко встречались в верхних слоте почвы.

Таким образом, в результате исследований выявилось, что природные популяции Вг хяр.киШаМ разделяются на несколько основных морфологических групп. Хотя во всем мире и давно применяются препараты на основе Bt ^.¿мгага^' кристовара К - 1, из природных источников выделяется большое количество культур кристовара К - 73.

6. Отбор штаммов для биотестирования

Результаты биохимических и серологических исследований показали, что кроме культур Вг ¡хр.кигБШк1 в природных популяциях и контаминантах присутствовали изоляты 5/ ssp.israelensis, мр.дояо; в природных популяциях встречались штаммы Вг ¡хр^аНепае, ¿зр.Жигт&етгз; а в контаминантах -штаммы В1 .ч.чр еМотоЫ(1ш.

Спорокристаллические смеси штаммов с крупными и средними по сравнению со спорой кристаллами были проанализированы электрофорезом в ЗОБ-РАвЕ. Было обнаружено большое число полипептидных соединений для разных штаммов. Изоляты с идентичными полипептидными профилями объединялись в одну группу. Таким образом, 67 изолятов разделились на 15 групп или 15 электрофореваров.

Штаммы, входящие в один электрофоревар продуцировали сходные по форме и размеру кристаллы, обладали одинаковыми физиолого-биохимическими свойствами, имели одинаковое строение жгутикового антигена. Штаммы одного подвида могли относиться к разным электрофореварам. Проверка изолятов на выбранных тест-насекомых показала, штаммы одного электрофоревара имеют одинаковый спектр чувствительных к ним насекомых. При определении москитоцидальной активности штаммов трех электрофореваров было установлено, что. изоляты, входящие в один электрофоревар, обладают близкими значениями биологической активности. Не было корреляции между полипептидным профилем и местом сбора образцов.

Таким образом, изучение изолятов из почвы, насекомых, контаминантов по физиолого-биохимическим свойствам, по морфологическим свойствам кристаллов, по их белковому составу, по инсектицидной активности показало, что из природы часто выделяются одинаковые штаммы. Электрофорез спорокристаллических смесей В/ в БОБ-РАвЕ наряду с биохимической и морфологической характеристикой позволяет быстро дифференцировать большое число изолятов по белковому составу и сократить в несколько раз количество штаммов для биотестирования. Предварительный отбор штаммов для биотестов с помощью электрофореза исключает проверку одинаковых изолятов на насекомых, что значительно упрощает сложный и длительный процесс биотестирования.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена гетерогенность штаммов В! ззр.киШаЫ по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам. Выделено 6 групп морфовариантов: Я, X, М, г, т, т1. Выявлены связи между морфологическими особенностями (характер роста колоний на агаризованной среде) и физиолого-биохимическими характеристиками (синтез параспоровых включений,

продукция протеаз, лецитиназы, уреазы, вегетативного инсектицидного белка, антибиотических веществ) в популяции штаммов Bt ssp.hirstaki.

2. Наработаны препараты секретируемых белков штаммов различных морфоваров, которые были проверены на гусеницах Choristonewa occidentalis (Lepidoptera: Tortricidae). Установлено, что секретируемые белки различались по энтомопатогенному эффекту: вызывали гибель гусениц, ингибирование роста оставшихся в живых личинок, задержку окукливания. Показан синергетический эффект между дельта-эндотоксином и белками, секретируемыми штаммами Bt ssp.kurstaki.

3. При изучении влияния спор штаммов Bt ssp.kurstaki разных морфоваров на инсекитцидность было обнаружено, что в присутствии бактериальных спор любого морфовара инсектицидная активность кристаллических белков Bt ssp kurstaki к еловой листовертке-почкоеду Choristoneura occidentalis увеличивается в 100-500 раз.

4. Проведена оценка адгезивных свойств спор различных морфоваров Bt ssp.kurstaki по индексу гидрофобности. Выявлено, что споры морфовара R обладают гидрофильными свойствами (индекс гдрофобности равен 0); споры морфоваров ram - гидрофобны (индекс гидрофобности > 50%).

5. Изучение колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt показало, что в основном из естественных экосистем выделяются штаммы Bt ssp kurstaki кристовара К-73 морфоваров т и г , обладающие повышенной метаболической активностью и гидрофобностью спор. Из насекомых преимущественно были изолированы культуры морфовара т, неспособные спорулировать и образовывать кристаллы на богатых аминным азотом средах.

6. Установлено, что анализ с помощью электрофореза в SDS-PAGE спорокристаллических смесей штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из естественных экосистем, значительно облегчает отбор энтомопатогенных штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Калмыкова Г.В. Экологическая оценка морфологических мутантов Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова, Т.Ф.Ломовская, Н.И.Шашкина // Тез. докл. IV Всесоюзной научной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве». Пущино, 20-24 января, 1992. - С.22-23.

2.Калмыкова Г.В. Изучение гидрофильно-гидрофобных свойств морфологических мутантов Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki / Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева// Там же - С.80.

3.Калмыкова Г.В. Протеолитическая активность мутантов Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki l Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева, Н.А.Громова, Т.Ф.Ломовская

// Тез. докл. конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами». Москва, 26-27 октября, 1993. - С.71.

4.Калмыкова Г.В. Критерии отбора эффективных штаммов для производства энтомопатогенного препарата «Лепидоцид» / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова // Материалы Всероссийского научно-производственного совещания «Экологически безопасные и беспесгицидные технологии получения растениеводческой продукции». Краснодар, 24-26 августа, 1994. - Пущино, 1994. - С.202-204.

5.Калмыкова Г.В. Экология и распространение бактерий группы Bacillus cereus-Bacillus thuringiensis / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова // Тез. докл. конференции «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду». Москва, 17-19 мая, 1994.-С.19.

6.Kalmikova G.V. Bacillus thuringiensis novosibirsk (serovar H24a24c), a new subspecies from the West Siberian Plain / L.I.Burtseva, V.AJBurlak, G.VJfialmikova, H. de Barjac, M.-M. Lecadet // J. Invert. Pathol. - 1995. - V.66. - P.92-93.

7.Калмыкова Г.В. Сравнительная характеристика мутантов Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki / Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева, Т.Г.Юдина // Микробиология. - 1995. - Т. 64. - № 4. - С.461-468.

8.Kalmikova G.V. Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki as a microbial biocontrol agent / L.I.Burtzeva, G.V.Kalmikova If European Journal of Plant Pathology. - Abstracts, ХП1 International Plant" Protection Congress, The Hague -The Netherlands, 2-7 July, 1995. - N.583.

9.Kalmikova G.V. Bacteriocinogeny and hydrophobicity of Bacillus thuringiensis morphovariants as protective factors in nature / G.V.Kalmikova, L.LBurtzeva //Ibit.-N.584.

10.Kalmikova G.V. Ecologically safe methods for plant protection / N.I.Ermakova, G.V.Kalmikova, L.I.Burtzeva // Book of Abstracts, International conference " Fundamental and applied problems of environmental protection". Tomsk, September 12-16,1995.-P.171.

П.Калмыкова Г.В. Колониально-морфологическое разнообразие природных популяций Bacillus thuringiensis / Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева // Сблауч.тр. «Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов». Новосибирск, 1997. — С.52-59.

12.Калмыкова Г.В .К вопросу о специфичности действия энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis/ Г.В.Калмыкова, Л.И.Бурцева, И.Н.Наумова,

B.В.Глупов // Материалы всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий". Курган, 1998. -

C.172-174.

1 З.Калмыкова Г.В. Новый подход к селекции штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis / Л.И.Бурцева, Г.В.Калмыкова, В.В.Глупов, А.М.Лысенко // Сб.научлр."Проблемы энтомологии в России". С.-

Петербург, 1998. - С.54-55.

Н.Калмыкова Г.В., Чувствительность гусениц лугового мотылька Loxostega sticticalis L.(Lepidoptera, Pyralidae) к морфологическим мутантам Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki II Там же. - С. 176-177.

15.Калмыкова Г.В.Идентификация и паспортизация штаммов Bacillus thuringiensis методом геномной дактилоскопии с использованием биотиншшрованной ДНК фага М13/ С.Ф.Орешкова, Л.И.Бурцева, О.В.Манохина, Л.И.Пучкова, Г.В.Калмыкова, В.М.Михайлова, В.Е.Репин, А.А.Ипьичев // Генетика. - 1999. - Т.35. - № 6. - С.751-755.

16.Калмыкова Г.В. Бактериальные болезни насекомых / Л.И.Бурцева, М.В.Штерншис, Г.В.Калмыкова // Патогены насекомых: структурно-функциональные аспекты (Под ред. В.В.Глупова) - М.: Круглый год, 2001. -С. 189-245.

17.Калмыкова Г.В .Систематика бактерий Bacillus thuringiensis / Л.И.Бурцева, Г.В .Калмыкова, А.М.Лысенко, Т.Г.Юдина // Материалы российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Талалаева "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе". Иркутск, 11-13 марта, 2002. - С.47-48.

18.Калмыкова Г.В .Дифференциация штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis по продукции вторичных метаболитов / Г.В.Калмыкова, И.В.Наумова, Я.Л.Лозинская, Л.И.Бурцева, В.В.Глупов// Там же. - С.59-61.

/

Подписано в печать 11.11.2003 Формат 60x84 1/16

Заказ № 193 Бумага офсетная, 80 гр/м1

Печл. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

►2022t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калмыкова, Галина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Распространение Bacillus thuringiensis в природе.

1\2. Специфичность действия Bacillus thuringiensis на насекомых.

1.2.1. Кристаллический дельта-эндотоксин.

1.2.2. Роль насекомых в специфичности действия дельта-эндотоксина . 15 1.2.3. Биологическая активность дельта-эндотоксина.

1.3. Роль спор Bacillus thuringiensis в инсектицидности.

1.4. Биологически активные вещества, синтезируемые Bacillus thuringiensis.

1.4.1. Гидролитические ферменты.

1.4.1.1. Фосфолипаза С.

1.4.1.2. Протеолитические ферменты.

1.4.1.3. Вегетативный инсектицидный белок Vip3A.

1.4.1.4. Хитиназа.

1.4.2. Другие вирулентные факторы.

1.4.2.1. Термостабильный ß-экзотоксин.

1.4.2.2. Антибактериальные вещества.

1.4.2.3. Адгезивные свойства.

1.5. Сохранение Bacillus thuringiensis в природе.

1.6. Изменчивость свойств у культур Bacillus thuringiensis.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Насекомые.

2.3. Характеристика бактериальных штаммов.

2.3.1.Среды и условия культивирования бактерий.

2.3.2. Характеристика штаммов B.thuringicnsis по микроскопии, физиологобиохимическим и серологическим свойствам.

2.3.3 .Определение относительной гидрофобности спор бактериальных штаммов.

2.3.4.Тестирование бактериоциногенпой активности.

2.4. Получение препаратов чистых спор и кристаллов.

2.4.1. Определение количества спор и кристаллического белка.

2.5. .Получение препаратов секретируемых белков.

2.6. Анализ белков методом электрофореза в БОБ-РАСЕ.

2.7. Биотестирование штаммов.*.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Характеристика биологических особенностей штаммов Влкипп^ш^з

3.2. Характеристика штаммов В1 58р.кигя1ак'1.

3.2.1. Кристаллы дельта-эндотоксинов штаммов ¿-¿ухки^аМ.

3.2.2. Физиолого-биохимические свойства культур Я/ язр.киМаМ. 3.2.3. Антибактериальная активность штаммов аар.ки^аЫ.

3.2.4. Морфологическая неоднородность штаммов Вг ььр.кги^аЫ.

3.2.4.1. Некоторые особенности морфологических вариантов

В1 ББр.киМаИ.

3.2.4.2. Гидрофильно-гидрофобные свойства морфологических вариантов В( х$р.киг51ак'1.

3.2.5. Инсектицидность штаммов Я/ хБр.кигзшШ.

3.3. Вируленьность спор В1^р.кигз1ак1.

3.3.1. Синергизм между спорами и дельта-эндотоксином.

3.4.Влияние биологически активных веществ $хр.кш"81ак' на инсектицидность.

3.4.1. Инсектицидность культу рал ьных жидкостей В( щэ.киг^аЫ.

3.4.2. Инсектицидная активность штаммов £/, несвязанная с дельта-эндотоксином и спорами.

3.4.2.1. Характеристика секретируемых белков штаммов В( язр.кигх/ак!.

3.4.2.2. Действие секретируемых белков на СИог'Шоипеига оссМеп1а\к . 85 3.5. Оценка колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt 88р.кш^1ак'1.

3.6. Отбор штаммов для биотестирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическое разнообразие бактерий Bacillus thuringiensis из естественных экосистем"

Бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) используются для регуляции численности насекомых начиная с 60-х годов XX века. Биопестицидами на основе Bt контролируют численность насекомых - вредителей сельского и лесного хозяйства, переносчиков болезней из отрядов Lepidoptera, Coleóptera, Díptera. Несомненным преимуществом их применения является безопасность для здоровья человека, животных и расиений [Feitelson, 1993].

Многочисленные скрининговые программы по выделению штаммов Bt со специфичностью к насекомым различных отрядов показали, что эти культуры изолируются из самых разных источников по всему миру [Миненкова и др., 1996; Aptosoglou et al., 1997; Bernhard et al., 1997; Bravo et al., 1998; Chak et al., 1994; Chilcott, Wigley, 1993; DeLucca et al., 1981; Forsyth, Logan, 2000; Hansen et al., 1998; Hastowo et al., 1992; Kim et al., 1998; Mizuki et al., 1999; Vasquez et al., 1995; Wasano et al., 1999].

С 80-х годов для регулирования численности насекомых во всем мире применяются препараты на основе Bt ssp.kurstaki. Вероятно, их широкое использование может приводить к неконтролируемому распространению Bt ssp.kurstaki в экосистемах. Показано, что штаммы этого подвида являются одними из часто встречающихся в природе [Martin, Travers, 1989; Kaelin et al., 1994].

Важным условием приспособления к окружающей среде у прокариот является их генетическое разнообразие. Однако вопросу гетерогенности культур Bt ssp.kurstaki уделено необоснованно мало внимания, хотя известно о способности клеток Bt ssp. thuringiensis, dendrolimus, galleriae образовывать морфологически отличные колонии [Бурцева и др., 1973; Барайщук, 1983; Блохина и др., 1984; Абросимова и др., 1985; Ягудин и др., 1986]. Как правило, описывают два основных типа колоний R и S [Кашкова, 1978; Абросимова и др., 1985;]. На специально подобранных эмпирически средах возможно выявить наиболее полный ряд спонтанной изменчивости [Браун, 1968], и это позволяет найти коррелятивные связи между морфологическими и биохимическими свойствами [Милько, 1990; Милько, Егоров, 1991]. У морфологических вариантов Bt ssp.tlmringiensis, dendrolimus, galhriae обнаружены значительные различия по инсектицидной активности [Бурцева и др., 1973; Каткова, 1979], спорообразованию [Ягудин и др., 1983], синтезу термостабильного экзотоксина [Абросимова и др., 1985], способности усваивать сахарозу [Карабеков и др.', 1982], фагочувствительности [Азизбекян, Нетыкса, 1978 ].

Bt продуцирует целый ряд внеклеточных компонентов, которые могу т вносить вклад в вирулентность. Основным фактором специфичности и эффективности действия Bt является белковый кристаллический токсин, который синтезируется во время спорообразования. Внимание большинства исследователей направлено на изучение свойств, регуляции синтеза и механизма действия этого токсина [Somerville, 1971; Stahly et al., 1978; . Knowles et al., 1984; Jarrett, 1985; Haider et al., 1986; Jaquet et al., 1987; Holte, Whiteley, 1989; Gill et al., 1992; Ellar, 1994; Wright et al., 1997; Oppert, 1999; Riikmini et al., 2000]. Однако во время вегетативного роста и на ранней стадии споруляции Bt продуцирует и другие менее специфичные биологически активные вещества: ß-экзотоксип, гидролитические ферменты, вегетативные инсектицидные белки, антибиотические вещества, поверхностные структуры [Нетыкса и др., 1979; Смирнова и др., 1991; Burgeron, de Barjac, 1967; Edlund et al., 1976; Smirnoff, Valero, 1977; Luthy, 1980; Favret, Yousten, 1989; Lovgren et al., 1990; Zhang et al., 1993; Donovan et al., 2001]. Данные литературы о продукции этих веществ имеют фрагментарный характер и в основном касаются отдельных штаммов некоторых подвидов. Предполагают, что эти вещества способствуют адаптации бактерий к жизни в естественных экосистемах, а также могут отражаться на способности насекомых переваривать пищу, на их чувствительности к инсектицидам. Однако продемонстрировано, что только ß-экзотоксин и вегетативный инсектицидный белок Vip ЗА вносят вклад в инсектицидную активность [Levinson et al., 1990; Estruch et al., 1996; Yu et al., 1997]. Вклад других дополнительных факторов остается определить, так как известно, что для ряда личинок насекомых споры не требуются и трансгенные растения эффективно действуют против личинок [Гулина и др., 1994; Barstonetal., 1987].

В связи с вышеперечисленным была поставлена цель и определены задачи исследования.

Цель исследования. Целью данной работы явилось изучение разнообразия вариантов внутри Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki по морфологическим и биохимическим свойствам и роли биологически активных веществ, синтезируемых ими, в энтомопатогенной активности и сохранении в природе.

Задачи исследования.

1. Оценить морфологическую неоднородность и биохимическое разнообразие штаммов Bt ssp.kurstaki.

2. Выявить возможные связи между колониально-морфологическими признаками и рядом физиолого-биохимических, инсектицидных, антибиотических свойств и адгезивностью у культур Bt ssp.kurstaki.

3. Определить вклад спор, кристаллического 8-эндотоксина и других секретируемых белков в инсектицидную активность (на примере Choristoneura occidentalis (Lepidoptera: Tortricidae)).

4. Изучить колониально-морфологическое разнообразие штаммов Bt, выделенных из природных экосистем, а также штаммов Bt, являющихся контаминантами питательных сред.

Научная новизна. Впервые в результате изучения колониально-морфологической неоднородности штаммов В1 ьхр.киМак'! выявлено 6 морфологических вариантов (морфоваров). Фенотипические различия, выраженные в характерном внешнем виде колоний на агаризоваппой среде, затрагивали и базисные особенности метаболической организации клеток: морфовары различались по синтезу метаболитов (дельта-эндотоксина, вегетативного инсектицидного белка, бактериоцинов, адгезинов) и внеклеточных ферментов (уреазы, протеазы, лецитиназы).

Впервые было показано, что из естественных экосистем, в том числе из мест, где использовали лепидоцид (биоинсектицид на основе В1 ■ яхр.кигМакк кристовар К-1, морфовар К), преимущественно выделялись штаммы В1 жр.киШа/а кристовара К-73 морфоваров г и т.

Практическая значимость. Выявленные особенности бактерий В( язр.киШаШ могут послужить основой для изучения роли В1 в окружающей среде.

Результаты, полученные в ходе исследований, убедительно доказывают необходимость включения спор в биопрепараты для регулирования численности СкошШгеига осскХаПаИэ (Ьер1с1ор1ега: Тойпс1с1ае), поскольку в их присутствии активность кристаллов повышалась в 100-500 раз.

Для биотестирования предложен метод отбора штаммов В1, выделенных из естественных экосистем, который позволяет значительно сократить количество проверок на насекомых.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены па IV Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, январь, 1992); на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, октябрь, 1993); на Всероссийском научно-производственном совещании "Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции" (Краснодар, август, 1994); на конференции "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, май, 1994); на XIII Международном конгрессе по защите растений (Нидерланды, июль, 1995); на Международной конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы окружающей среды" (Томск, сентябрь, 1995); на Всероссийской конференции "Беспозвоночные животные Южного Зауралья и сопредельных территорий" (Курган, март, 1998); на XI Съезде Русского энтомологическою общества (С.-Петербург, 1998); на Российской научно-практической конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе", посвященной 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Талалаева (Иркутск, март, 2002), на отчетной сессии ИСиЭЖ СО РАН (апрель, 1994), на заседании микробиологического общества (декабрь, 2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста; состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 244 работы, из них 191 на иностранных языках. В приложении приведена подробная характеристика штаммов Б/, относящихся к различным подвидам.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Калмыкова, Галина Васильевна

выводы

1. Обнаружена гетерогенность штаммов Вь ББр.киШаМ по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам. Выделено 6 групп морфовариантов: К, X, М, г, т, т1. Выявлены связи между морфологическими особенностями (характер роста колоний на агаризованной среде) и физиолого-биохимическими характеристиками (синтез параспоровых включений, продукция протеаз, лецитиназы, уреазы, вегетативного инсектицидного белка, антибиотических веществ) в популяции штаммов В1 ББр.киШаЫ.

2. Получены и проверены на гусеницах Скоп$1опеига оса'с/епГаНя (Ьер1с1ор1ега: То11пЫс1ае) препараты секретируемых белков штаммов различных морфоваров. Установлено, что препараты секретируемых белков проявляли различный энтомопатогенный эффект: вызывали гибель гусениц, ингибирование роста оставшихся в живых личинок, задержку окукливания. Показан синергетический эффект между дельта-эндотоксином и белками, секретируемыми штаммами ББр.кги^аИ.

3. При изучении влияния спор штаммов Вг 88р.киг$1ак1 разных морфоваров на инсекитцидность было обнаружено, что в присутствии бактериальных спор инсектицидная активность кристаллических белков Я/ Бхр.кигяшЫ к еловой листовертке-почкоеду СИог'Шопеига осйс\еп1аИ$ увеличивается в 100-500 раз.

4. Проведена оценка адгезивных свойств спор различных морфоваров Вг яБр.киШаИ по индексу гидрофобности. Выявлено, что споры морфовара К обладают гидрофильными свойствами (индекс гдрофобности равен 0); споры морфоваров г и т - гидрофобны (индекс гидрофобности > 50%).

5. Изучение колониально-морфологического разнообразия природных популяций Вг показало, что в основном из естественных экосистем выделяются штаммы В1 88р.киг51ак1 кристовара К-73 морфоваров т и г , обладающие повышенной метаболической активностью и гидрофобностыо спор. Из насекомых преимущественно были изолированы культуры морфовара т, неспособные спорулировать и образовывать кристаллы на богатых аминным азотом средах.

6. Установлено, что анализ с помощью электрофореза в SDS-PAGE спорокристаллических смесей штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из естественных экосистем, значительно облегчает обнаружение энтомопатогенных штаммов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования морфологических, физиолого-биохимических, инсектицидных свойств коллекционных штаммов и природных изолятов показали, что штаммы одного подвида проявляют широкую вариабельность этих свойств. Однако такое фенотипическое многообразие можно было охарактеризовать таким термином как «метастабильность фенотипа», т. е. «стабильность путем нестабильности» [Головлев, 1998]. При рассеве штаммов 5/ яяр.ки^аИ на специально подобранной эмпирически среде было выявлено 6 морфологических вариантов. В результате исследований были установлены связи между морфологическими особенностями и рядом физиолого-биохимических свойств: отношением к салицину, эскулину, уреазной, лецитиназной, протеолитической активностям, гидрофобности спор, способности к синтезу бактериоциноподобных веществ, а также инсектицидностью и специфичностью к насекомым. Наши исследования г показали, что культуры морфоваров Я и X продуцировали кристаллы, типичные для кристовара К-1, а культуры морфоваров г, т,т! - К-73.

Как правило, регулирование численности насекомых осуществляют препаратами, содержащими не только кристаллы, но и споры. Широкое использование спорокристаллических препаратов Вг обусловлено тем, что споры значительно усиливают летальное действие кристаллического токсина в большинстве чешуекрылых насекомых. В частности, мы отметили многократное увеличение инсектицидной активности для личинок еловой листовертки-почкоеда при добавлении очищенных спор к очищенным кристаллам. Считается, что споровый эффект проявляется за счет синтеза во время септицемии хозяина других вирулентных факторов, отличных от дельта-эндотоксина. Известно, что ВС является членом группы В.сегеш, включающей В.сегет, ВлЬиг^1ет{з, В.тусо'к1ез и В.аШИгаЫз. Тесная связь

B.thuringiensis с B.cereus, сходство их характеристик при вегетативном росте указывают на то, что во время прорастания Bt продуцирует многие из тех вирулентных факторов, которые присутствуют в условно патогенных штаммах B.cereus, включая различные ферменты, цитотоксичные белки и другие вторичные метаболиты [Carison et al., 1994; Titball, 1998; Helgason et al., 2000]. Некоторые из этих веществ (диарей ные энтеротоксины, гемолизины, фосфолипазы) играют важную роль в установлении бактериальной инфекции у человека. Поэтому в последние годы растет число работ, в которых исследователи стремятся установить, способны ли бактерии Bt влиять на организм человека, вызывая диарею, рвоту, иммунодепрессию и другие заболевания [Damgaard, 1995; Asano et al., 1997; Perani et al., 1998; Hernandez et al., 1999]. Роль тех же самых вирулентных факторов Bt в патогенезе насекомых практически не изучена. Проведенные нами исследования по сравнению инсектицидной активности культуральной жидкости с очищенными спорокристаллическими смесями, а также определение биологической активности в препаратах секретируемых белков Bt продемонстрировали, что биологически активные вещества, продуцируемые Bt во время вегетативного роста и на ранней стадии споруляции, являются важными факторами вирулентности штаммов Bt ssp.kurstaki. Например, повышенная биологическая активность штаммов кристовара К-1, по-видимому, связана с продукцией вегетативного инсектицидного белка Vip ЗА штаммами этого кристовара. Кроме того, можно утверждать, что на уровень патогенного действия на насекомых сказываются не только отдельные факторы типа Vip ЗА, но целый комплекс различных веществ, в том числе и ферментов. Об участии фосфолипаз и протеаз в патогенезе насекомых свидетельствует зарегистрированный нами ингибирующий эффект на рост гусениц еловой листовертки-почкоеда при инфицировании их препаратами секретируемых белков штаммов, которые не синтезировали Vip ЗА. Ранее неоднократно отмечался синергетический эффект между дельта-эндотоксином и р-экзотоксином [Dubois, 1986; Tsuchiya et al., 2002]. Нами установлен синергизм между дельта-эндотоксином Bt и другими ее . метаболитами, отличными от р-экзотоксина, что также подтверждает роль секретируемых белков в инсектицидности.

Разнообразие внутри популяции является важным фактором приспособления бактерий к нестабильным условиям окружающей среды. Существует мнение, что широкое использование в сельском и лесном хозяйстве инсектицидов на основе бактерий Bt ssp.fcurstaki должно приводить к неконтролируемому распространению этих микроорганизмов в экосистемах. Одним из основных продуцентов коммерческих биоинсектицидов во всем мире являются культуры Bt ssp.kurstaki кристовара K-l. Однако оценка колониально-морфологического разнообразия природных популяций Bt ssp.kurstaki показала, что в основном из природы, в том числе и в тех местах, где использовались биоинсектициды на основе штаммов кристовара К-1, выделяются штаммы кристовара К-73. По-видимому, это связано с высокой гидролитической активностью этих штаммов, повышенной гидрофоб!юстыо их спор, способствующей прикреплению к субстрату, т.е. эти культуры обладают большей адаптивной пластичностью и способностью к существованию в природных условиях.

Изучение разнообразия природных изолятов, проведенное нами, а также данные литературы [Carozzi et al., 1991; Kaelin et al., 1994] свидетельствуют о том, что из природы очень часто выделяются одинаковые штаммы. Их можно объединить в группы по идентичности серологических, морфологических, физиолого-биохимических, электрофоретических, инсектицидных свойств и специфичности. Для того чтобы избежать длительного и трудоемкого процесса биотестирования одинаковых изолятов, для анализа специфичности и инсектицидной активности из группы одинаковых штаммов можно выбирать морфологически однородные, а значит наименее склонные к диссоциации, культуры, которые способны образовывать кристаллы па разных средах.

Таким образом, в популяции бактерий ЕН щхкиМаШ выявлено 6 морфологических вариантов и установлены коррелятивные связи между морфологической изменчивостью культур и их физиолого-биохимическими, антибактериальными свойствами, гидрофобностью и инсектицидностыо. Биологически активные вещества, синтезируемые штаммами во время вегетативного роста и на ранней стадии спорообразования, вносят определенный вклад в инсектицидность, а также способствуют адаптации этих культур к жизни в микробных сообществах. Для биотестирования достаточно выбрать один штамм из группы с идентичными серологическими, морфологическими, физиолого-биохимическими, электрофоретическими свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калмыкова, Галина Васильевна, Иркутск

1. Абросимова Л.И. Возможные пути увеличения синтеза экзотоксина культурой Bacillus thuringiensis-продуцентом битоксибациллина /Лескова А.Я., Бабаева П.В. и др. // Микробиология. 1985. - Т.54. - Вып.5. - С.770-7-73.

2. Азизбекян P.P., Нетыкса Е.М. Сравнительная фагочувствительность S-и R-щтаммов Bacillus thuringiensis И Микробиология. 1978. — Т.67. - №3. -С.527-532.

3. Азизбекян P.P., Смирнова Т.А. Споро- и кристаллообразование у Bacillus thuringiensis II Успехи микробиологии. 1988. - Т.22. - С.82-108.

4. Алексеев А.Н. Активаторы и ингибиторы прорастания спор Bacillus thuringiensis / Карабанова Л.Н., Шевцов В.В. // Микробиология. 1982. -Т.51. - С.780-783.

5. Алешкин Г.И. Генерализованная трансдукция у Bacillus thuringiensis / Бурцева Л .И., Скавронская А.Г. // Генетика. 1979. - №7. - С .1186-1190.

6. Барайщук Г.В. Естественная изменчивость энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis продуцентов энтомоцидных токсинов // Микроорганизмы в защите растений. - Иркутск, 1983. - С.42-57.

7. Барбашова Н.М., Владимирова Г.А. Антагонистические свойства и продуцирование экзотоксина Bacillus thuringiensis II Тр. ВНИИСХМ. 1981. - Т.51. - С.151-158.

8. Безбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. М., 1984.-394 с.

9. Беттхер К. Значение лецитин-вителлиновой реакции для дифференциации видов споровых бактерий // Микробиология. 1961. — Т.30. -С.673-678.

10. Блохина Т.П. Изменчивость Bacillus thuringiensis при разных условиях выращивания / Сахарова З.В., Игнатенко Ю.Н. и др. // Микробиология. -1984. -Т.53. Вып.З. - С.427-431.

11. Браун В. Генетика бактерий. М.: Наука, 1968. - 446 с.

12. Бурцева Л.И. Селекция Bac.thuringiensis : изменчивость патогенных свойств // Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений: Сб. науч. тр./ВАСХНИЛ. Сиб.отд-ние. Новосибирск, 1987. - С.22-31.

13. Бурцева Л.И. Селекция промышленных штаммов кристаллообразующих бактерий для производства энтомопатогенных препаратов // Biotechnol.& BioE. 1991. - N 4-5. - Р.43-45.

14. Бурцева Л.И. Формы и размеры кристаллов дельта-эндотоксина как критерии инсектицидности в селекции Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki / Бурлак В.А., Власенко Н.Г. и др. // Микробиолог, исслед. в Запад. Сибири. -Новосибирск, 1989. С.64-68.

15. Бурцева Л.И. О выборе штаммов Bac.thuringiensis v.galleriae для производства энтобактерина / Скворцова М.М., Шашкина H.H. // Сиб. вестн. с.-х. науки. -1973. №2. - С.33-38.

16. Глупов В.В., Штерншис М.В. Приложение 1. Разведение насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты. М., 2001. -С.692-694.

17. Головлев Е.Л. Метастабилыюсть фенотипа у бактерий // Микробиология. 1998. - Т.67. - С. 149-155.

18. Гулина И.В. Экспрессия частично модифицированного гена 5-эндотоксина из Bacillus thuringiensis var. tenebrionis в трансгенных растениях картофеля / Шульга O.A., Миронов М.В. и др. // Мол.биология. 1994. -Т.28.-Вып.5.-С.1166-1174.

19. Егоров Н.С. О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis / Юдина Т.Г., Баранов АЛО. // Микробиология. 1990. - Т.59. - С.448-452.

20. Иванов А. Фосфолипаза С Bacillus thuringiensis: субстратная специфичность, гидролиз п-нитрофенилфосфорилхолина и энтомопатогенность / Кузманова И., Камберов Е // Биотехнология. 1990. -№5. - С.69-72.

21. Иванов Г.М. Сравнение турицинов по интенсивности антагонизма в различных трофических условиях // Микроорганизмы в защите растений. -Новосибирск, 1981. С.53-72.

22. Ивинскене B.J1. Фосфолипаза и термолабильный экзотоксин Bacillus thur'mgiensis И Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений: Сб. науч. тр. /ВАСХНИЛ. Сиб.отд-ние. Новосибирск, 1987. - С.57-75.

23. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми. М.: Агропромиздат, 1989. - 175 с.

24. Карабеков Б.П. Трансмиссивные генетические факторы у Bacillus thur'mgiensis / Чахмахчян А.Г., Оганесян М.Г. // Генетика. 1982. - Т. 18. -С.1062-1066.

25. Кашкова Г.Г. О вирулентности S- и R-диссоциантов Bacillus thur'mgiensis v.dendrolimus Tal. // Использ. микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесн. хозяйстве. Иркутск, 1979. - С.ЗЗ-41.

26. Кашкова Г.Г. Культуральная характеристика S- и R-диссоциантов штаммов бацилл группы thur'mgiensis II Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых. Иркутск, 1978. - С. 13-17.

27. Кузина J1.B. Изучение природы детерминант синтеза 5-эндотоксина и ß-экзотоксина в штаммах Bacillus thuringiensis subsp. thuringiensis продуцентах битоксибациллина / Андреева А.Л., Асланян Е.М. и др // Молекул, генетика. 1993. - № 1. - С.20-24.

28. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394с.

29. Лескова А.Я. Действие ß-экзотоксина Bacillus thuringiensis на насекомых / Рыбина Л.М., Чумакова А.Я. // Бактериальные средства и методы борьбы с насекомыми и грызунами. 1972. - С.52-57.

30. Лескова А.Я., Рыбина Л.М. Термостабильный экзотоксин Bacillus thuringiensis II Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений: Сб. науч. тр./ ВАСХНИЛ. Сиб.отд-ние. Новосибирск, 1987. - С.31-42.

31. Милько Е.С. Нестабильность синтеза практически ценных веществ бактериями и процесс диссоциации // Прикл. биохимия и микробиология. —1990. Т. 26. - Вып.6. - С.732-742.

32. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобные). М.: Изд-во МГУ,1991.- 144 с.

33. Миненкова И.Б. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных в провинции Фуджуан в Китае / Акимова М.И., Фу Л. и др. // Биотехнология. 1996. - № 1. - С. 17-22.

34. Михайлова А.Л. Метод определения активности энтомопатогенного кристаллообразующего белка Bacillus thuringiensis / Клепикова Ф.С., Честухина Г.Г. и др. // Прикл. биохимия и микробиология. 1984. - Т. 20. -Вып.5. - С.682-687.

35. Нетыкса Е.М. Бактериоцино-подобный фактор Bacillus thuringiensis / Смирнова Т.А., Миненкова И.Б. и др. // Микробиология. 1979. - Т.48. -Вып.4.-С.716-723.

36. Неудачина Э.И. Пассаж диссоциантов культур Bacillus thuringiensis и его влияние на продуцирование ß-экзотоксина // Микроорганизмы в защите растений. Иркутск, 1983. - С.57-70.

37. Половинко Г.П., Жирякова М.А. Серологические и физиолого-биохимические особенности кристаллообразующих бактерий вида Bacillus thuringiensis, выделенных из почв Западной Сибири и Казахстана // Сиб.биол.журн. 1991. - Вып.4. - С.48-53.

38. Рябченко Н.Ф., Алиханян С.Н. Бактериоциногенные плазмиды Bacillus thuringiensis II Генетика. 1984. - T.20. - №7. - С. 1067-1070.

39. Славнова B.C. Химический мутагенез и использование косвенных энзиматическихх критериев для отбора вирулентных клонов культуры Bacillus thuringiensis / Чигалейчик А.Д., Мазанов A.JI. и др. // Прикл.биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - С. 543-548.

40. Смирнова Т.А. Морфологические особенности и адгезивные свойства выростов на спорах Bacillus thuringiensis / Кулинич Л.И., Гальперин М.Ю. и др. // Микробиология. 1989. - Т.58. - Вып.5. - С.835- 840.

41. Смирнова Т.А. Исследование адгезивных свойств спор Bacillus thuringiensis подвидов galleriae и dendrolimus / Поглазова М.Н., Машковцева A.B. и др. // Микробиология. 1991. - Т.60. - №6. - С.697-703.

42. Смирнова Т.А. Адгезивные свойства Bacillus thuringiensis / Поглазова М.Н., Николаенко М.Н. и др. // Биотехнология. 2000. - №3. - С. 16-26.

43. СмирноваТ.А. Ультраструктура спор и кристаллов бактерий различных серотипов Bacillus thuringiensis / Михайлов A.M., Тюрин B.C. и др. // Микробиология. 1984. - Т.53. - С.455-462.

44. Соломин A.A. Две формы ß-экзотоксина Bacillus thuringiensis / Буров Г.П., Онацкий Н.М. и др. // Биотехнология. 1989. - №6. - С.792-795.

45. Солонцев И.Л., Юдина Т.Г. Сканирующая туннельная и электронная микроскопия параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis II Микробиология. 1996. - Т.65. - С.235-240.

46. Троицкая E.H. Сравнение методов хранения культур штаммов Bacillus thuringiensis var. galleriae // Прикл. биохимия и микробиология. 1979. - Т. 15. - Вып.З. - С.402-408.

47. Честухина Г.Г. Протеиназы, связанные с кристаллами Bacillus thuringiensis / Залунин И.А., Костина и др. // Биохимия. 1978. - Т.43. -Вып.5. - С.857-864.

48. Шамшина Т.Н. Внеклеточный фактор Bacillus thuringiensis, подавляющий спорообразование / Константинова Г.Е., Кузнецова Н.И. и др. //Биотехнология. 1994. - №5. - С. 11-13.i

49. Шевцов В.В. К использованию показателей гидролитической » активности для отбора вирулентных клонов Bacillus thuringiensis / Щелокова Е.В., Славнова B.C. и др. // С.-х. биология. 1985. - № 12. - С.52-55.

50. Юдина Т.Г. Сравнение антибактериальной активности параспоральных включений различных бацилл // Изв.АН СССР. Сер. биолог. 1996. - №5. -С.535-541.

51. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. Действие 5-эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот // Микробиология. 1997. — Т.66.-С.30-36.

52. Ягудин В.Д. Жизнеспособность и прорастаемость спор энтомопатогенных бактерий в зависимости от способов высушивания и условий регидратации / Фрейман В.Б., Никифорова JI.C. // С.-х. биология. — . 1983. №9. - С.56-59.

53. Ягудин В.Д. Морфологические особенности спорообразующихэнтомопатогенных бактерий / Фрейман В.Б., Соколова Г.Н. и др. // С.-х. биология. 1986. - №6. - С. 102-106.

54. А1у С. Sporulation and toxin production by Bacillus thuringiensis var. israelensis in cadavers of mosquito larvae (Diptera: Culicidae) / Mulla M.S., Federici B.A. //J. Invertebr. Pathol. 1985. - V.46. - P.251-258.

55. Andersson A. The adhesion of Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism / Granum P.E., Ronner U. // Int.J.Food Microbiol. 1998. - V. 39. - P. 93-99.

56. Andrews R.E. Protease activation of the entomocidal protoxin of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki / Bibilos M.M., Bulla L.A. // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V.50. - P.737-742.

57. Angus T.A. Comparative toxicity of the parasporal inclusions of three entomogenous bacteria // J. Invertebr. Pathol. 1967. - V.9. - P.256-260.

58. Aptosoglou S.G. Distribution and characterization of Bacillus thuringiensis in the environment of the olive in Greece / Sivropoulou A., Koliais S.I. // Microbiologica. 1997. - V.20. - P.69-76.

59. Aronson A. Bacillus thuringiensis and related insect pathogens / Beckman W., Dunn P. // Microbiol. Rev. 1986. - V.50. - P. 1 -24.

60. Aronson A.J. Relationship of the synthesis of spore coat protein and parasporal crystal protein in Bacillus thuringiensis /Tyrell D.J., Fitz-James P.C. et al. II J.Bacterid. 1982. - V. 151. - P.399-410.

61. Asano Sh.-I. Cloning of novel enterotoxin genes from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis / Nukumizu Y., Bando H. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V.63. - P. 1054-1057.

62. Barrit M.M. The intensification of the Voges-Proskauer reaction by the addition of a-naphtol // J. Pathol. Bacterid. 1936. - V.42. - P.441.

63. Barston K.A. Bacillus thuringiensis 8-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tobacum provides resistance to lepidopteran insects / Whiteley H.R., Yang N.S. // Plant Physiol.- 1987.-V.85.-P.1103-1109.

64. Beebee T. Differential inhibition of mammalian ribonucleic acid polymerases by an exotoxin from Bacillus thuringiensis / Korner A., Bond R.P.M. // Biochem. J. 1972. - V.227. - P.619-625.

65. Ben-Dov E. Extended screening by PCR for seven cry-group genes from field-collected strains of Bacillus thuringiensis / Zaritsky A., Dahan E. et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V.63. - P.4883-4890.

66. Benoit T.G. Correlation between alkaline activation of Bacillus thuringiensis var. kurstaki spores and crystal production / Newnam K.A., Wilson G.R. // Curr.Microbiol. 1995. - V.31.-P.301 -303.

67. Bernhard K. Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests / Jarrett P., Meadows M. et al. II J. Invertebr. Pathol. 1997. - V.70. - P.59-68.

68. Bielton H.P.L. Characterization of the cysteine residues and disulphide linkages in the protein crystal of Bacillus thuringiensis . / Vishnubhalta I., Carey P.R. et al. // Biochem. J. 1990. - V.267. - P.309-315.

69. Bravo A. Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis straia collection / Sarabia S., Lopez L. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V.64. - P.4965-4972.

70. Bravo A. Immunocytochemical analysis of specific binding of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins to lepidopteran and coleopteran midgut membranes / Koen H., Jansens S. et al. II J. Invertebr. Pathol. 1992. - V.60. - P. 247-253. ■

71. Burgeron A., de Barjac H. Another serotype (4:4a, 4c) of Bacillus thuringiensis which produces thermostable toxin // J. Invertebr. Pathol. — 1967. -. V.9.-P.574-577.

72. Burges H.D. Importancce of spores and 8-endotoxin protein crystals of Bacillus thuringiensis in Galleria mellonella / Thomson E.M., Latchford R.A. // J. Invertebr. Pathol. 1976. - V.27. - P.87-94.

73. Burges H.D. Teratogenicity of the thermostable beta exotoxin of Bacillus thuringiensis in Galleria mellonella // J. Invertebr. Pathol. 1975. - V.26. - P.419-420.

74. Calabrese D.M., Nickerson K.W. A comparison of protein crystal subunits in Bacillus thuringiensis // Canad. J. Microbiol. 1980. - V.26. - P.1006-1010.

75. Carison C.R. Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains / Caugant D.A., Kolsto A.-B. // Appl. Environ. Microbiol. — 1994.-V.60.-P.1719-1725.

76. Carozzi N.B. Prediction of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles / Kramer V.C., Warren G.W. etal.il Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V.57. - P.3057-3061.

77. Carroll J. Proteolytic processing of a coleopteran-specific 5-endotoxin produced by Bacillus thuringiensis var. tenehrionis / Li J., Ellar D.J. // Biochem. J. 1989. - V.261. - P.99-105.

78. Chak K.-F. Determination and distribution of cry-type genes of Bacillus thuringiensis isolates from Taiwan / Chao D.-C., Tseng M.-Y. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1994. - V.60. - P.2415-2420.

79. Cheng P. Subspecies dependent regulation of Bacillus thuringiensis protoxin genes / Wu L., Ziniu Y. et al. II Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - V.65. -P.1849-1853.

80. Chestukhina G.G. Production of multiple delta-endotoxins by Bacillus thuringiensis: delta-endotoxins produced by strains of the subspecies galleriae and wuhanensis / Kostina L.I., Zalunin I.A. et al. // Can. J. Microbiol. 1994. - V.40.- P.1026-1034.

81. Chestukhina G.G. Bacillus thuringiensis subspecies galleriae simultaneously produces two delta-endotoxins strongly different in their primary structure and entomocidal activity / Kostina L.I., Zalunin I.A. et al. // FEBS Lett.- 1988.- V.232.-P.159-162.

82. Chilcott C.N., Wigley P.J. Isolation and toxicity of Bacillus thuringiensis from soil and insect habitats in New Zealand // J. Invertebr. Pathol. 1993. - V.61.- P.244-247.

83. Crickmore N. The diversity of Bacillus thuringiensis ^-endotoxins // Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Kluwer Academic Publishers, 2000. - P.65-78.

84. Crickmore N. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins / Zeigler D.R., Feitelson J. et al. // Microbiol. Molec. Biology Rev. 1998. - V.62. - P.807-813.

85. Dalhammar G., Steiner H. Characterization of inhibitor A, a protease from Bacillus thuringiensis which degrades attacins and cecropins, two classes of antibacterial proteins in insect // EurJ.Biochem. 1984. - V. 139. — P.247-252.

86. Damgaard P.H. Natural occurrence of B. thuringiensis on cabbage foliage and in insect associated with cabbage crops / Hansen B.M., Pedersen J.C. et al. H J. Appl. Bacteriol. 1997. - V.82. - P.253-258.

87. Damgaard P.H. Degradation of Bacillus thuringiensis serovar kurstaki after aeriall application to a Polish pine stand / Malinowski H., Glowacka B. et al. H IOBC/WPRS Bulletin. 1996.- V.19.-P.61-65.

88. Damgaard P.H. Diarrhoeal enterotoxin production by strains of Bacillus thuringiensis isolated from commercial Bacillus thuringiensis -based insecticides // FEMS Immun. Med. Microbiol. 1995. - V.12. - P.245-250.

89. De Baijac H., Bonnefoi A. Essai de classification biochimiqus et serologique de type Bac. thuringiensis I I Entomophaga. 1962. - V.7. - P.5-31.

90. De Barjac H., Frachon E. Classification of Bacillus thuringiensis strains // Entomophaga. 1990. - V.35. - P.233-240.

91. De la Rosa M.C. Resistance to the antimicrobial agents of bacteria isolated from non-sterile pharmaceuticals / Mosso M.A., Garcia M.L. et al. II J. Appl. Bacteriol. 1993.-V. 74.-P. 570-577.

92. DeLucca A J. Bacillus thuringiensis distribution in soils of the United States / Simonson J.G., Larson A.D. // Can. J. Microbiol. 1981. - V.27. - P.865-870.

93. Donovan W.P. Gene knockout demonstrates that vip3A contributes to the pathogenesis of Bacillus thuringiensis toward Agrotis ipsilon and Spodoptera exigua / Donovan J.C., Engleman J.T. // J. Invertebr. Pathol. 2001. - V.78 -P.37-43

94. F., Singh J.S. //Curr. Microbiol. 1984.-V.10. - P.329-332.

95. Du Ch., Nickerson K.W. Bacillus thuringiensis HD-73 spores have surface-localized Cry 1 Ac toxin: physiological and pathogenic consequences // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62. - P.3722-3726.

96. Dubois N.R. Synergism between p-exotoxin and Bacillus thuringiensis subspecies kurstaki (HD-1) in gypsy moth, Lymantria clispar, larvae // J. Invertebr. Pathol. 1986. - V.48. - P. 146-151.

97. Dulmage H.T. Production of 5-endotoxin of eighteen isolates of Bacillus thuringiensis serotype 3, in 3 fermentation media // J. Invertebr. Pathol. 1971. — V.18. - P.353-358.

98. Edlund T. Evidence for two immune inhibitors from Bacillus thuringiensis interfering with the humoral defense system of saturniid pupae / Siden 1., Boman H.G. // Infect. Immun. -1976. V. 14. - P.934-941.

99. Ellar D.J. Structure and mechanism of action of Bacillus thuringiensis endotoxin and their receptors // Biocontrol Sci.Technol. 1994. - V.4. - P.445-447.

100. Estruch J.J. Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects / Warren

101. G.W., Mullins M.A. et al. H Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. -P.5389-5394.

102. Faruki S.I., Khan A.R. The pathogenicity of Bacillus thuringiensis to y-irradiated Cadra cautella (Waiker) (Lepidoptera: Phycitidae) // J. Invertebr. Pathol.- 2001. V.77. - P.92-98.

103. Fast P.G. Bacillus thuringiensis 8-endotoxin: on the relative roles of spores and crystals in toxicity to spruce budworm (Lepidoptera: Toilricidae) // The Can. Entomol. 1977. - V. 109. - P. 1515-1518.

104. Favret M.E., Yousten A.A. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis II J. Invertebr. Pathol. 1989. - V.53. - P.206-216.

105. Feng K.-C. Morphology of a spectrum of Bacillus thuringiensis parasporal endotoxin crystals from cultures of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki isolate A3-4 / Liu B.-L., Chan H.-S. et al. II World J. Microbiol. & Biotechnol. 2001. -V.17. -P.l 19-123.

106. Feitelson J.S. The Bacillus thuringiensis family tree // Advanced engineered pesticides. New York, Marsel Dekker, 1993. - P.63-71.

107. Forcada C. Differences in the midgut proteolytic activity of two Heliothis virescens strains, one susceptible and one resistant to Bacillus thuringiensis toxin / Alcacer E., Garcera M.D. et al. II Arch. Insect Biochem. Physiol. 1996. - V.31.- P.257-272.

108. Forsyth G., Logan N.A. Isolation of Bacillus thuringiensis from Northern Victoria Land, Antarctica // Lett. Appl. Microbiol. -2000. V.30. - P.263-266.

109. Gill S.S. The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins / Cowles E.A., Pietrantonio P.V. 11 Ann.Rev.Entomol. 1992. - V.37. - P.615-636.

110. Glare T.R., O'Callaghan M. Bacillus thuringiensis: biology, ecology and safety. Chichester, New York: John Wiley & Sons, 2000. - 403p.

111. Gonzalez J.M. Correlation between specific pasmids and 5-endotoxin production in Bacillus thuringiensis / Dulmage H.T., Carlton B.C. // Plasmid. -1981. V.5. - P.351-365.

112. Haider M.Z., Ellar D.J. Analysis of the molecular basis of insecticidal specificity of Bacillus thuringiensis crystal 5-endotoxin // Biochem. J. — 1987. — V.248.-P. 197-201.

113. Haider M.Z. Specificity of Bacillus thuringiensis var. colmeri insecticidal 5-endotoxin is determined by different proteolytic processing of the protoxin by larval gut proteases / Knowles B.H., Ellar D.J. // Eur. J. Biochem. 1986. - V. 156. -P.531-540.

114. Hansen B.M. Molecular and phenotypic characterization of Bacillus thuringiensis isolated from leaves and insects / Damgaard P.H., Eilenberg J. et al. Hi. Invertebr. Pathol. 1998. - V.71. - P. 106-114.

115. Hashisuka Y. Exosporia and appendages of spores of Bacillus species / Kozuka S., Tsujikawa M. //Microbiol. Immunol. 1984. - V.28. - P.619-624.

116. Hastowo S. Naturally occurring Bacillus thuringiensis in Indonesia / Lay B.W., Ohba M. IIS. Appl. Bacterid. 1992. - V.73. - P. 108-113.

117. Heierson A. Bacteriophage-resistant mutants of Bacillus thuringiensis with decreased virulence in pupae of Hyalophora cecropia / Siden I., Kivaisi A. et al. II J. Bacteriol. 1986. - V. 167. - P. 18-24.

118. Heimpel A.M. The pH in the gut and blood of the larch sawfly, Pristiphora erichsonii (Htg) and other insects with reference to the pathogenicity of Bac.cereus Fr. et Fr. // Canad.J.Zool. 1955. - V.33. - P.99-106.

119. Heimpel A.M., Angus T.A. Bacterial insecticides // Bacterial. Rev. 1960. - V.24.-P.266-288.

120. Heimpel A.M., Angus T.A. The site of action of crystalliferous bacteria in Lepidoptera larvae // J. Insect. Pathol. 1959. - V. 1. - P. 152-170.

121. Helgason E. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis -one species on the basis of genetic evidence / Okstad O.A., Caugant D.A. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V.66. - P.2627-2630.

122. Herbert D.A., Harper J.D. Bioassay of a beta-exotoxin of Bacillus thuringiensis against Geocoris punctipes (Hemiptera: Lygaedae) // J. Econ. Entomol. 1986. - V.79. - P.592-595.

123. Herrnstadt C. A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects / Soares G.G., Wilcox E.R. et al. II Bio/Technology. 1986. -V.4. - P.305-308.

124. Hofte H., Whitely H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis II Microbiol.Rev. 1989. - V.53. - P.242-258.

125. Jaoua S. Study of the 5-endotoxins produced by three recently isolated strains of Bacillus thuringiensis / Zouari N., Tounsi S. el al. //FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V.145. - P.349-354.

126. Jaquet F. Specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin / Hutter R., Luthy P. // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - V.53. - P.500-504.

127. Jarrett P. Potency factors in the delta-endotoxin of Bacillus thuringiensis var. aizawi and the significance of plasmids in their control // J. Appl. Biotechnol.- 1985.- V.58. P.437-448.

128. Johnson D.E., McGaughey W.H. Contribution of Bacillus thuringiensis spores to toxicity of purified Cry protein towards indianmeal moth larvae // Curr. Microbiol. 1996. - V.33. - P. 54-59.

129. Johnson D.E. Spore coat synergizes Bacillus thuringiensis crystal toxicity for the Indianmeal moth / Oppert B., Mc Gaughey W.H. // Curr. Microbiol. -1998.-V. 36.-P. 278-282.

130. Johnson D.E. Parasporal crystals produced by oligosporogenous mutants of Bacillus thuringiensis (Spo-Cr+) / Niezgodski D.M., Twaddle G.M. // J. Can. Micribiol. 1980. - V.26. - P.486-491.

131. Kaelin P. Isolation of Bacillus thuringiensis from stored tobacco and Lasioderma serricorne (F) / Morel P., Gadani F. // Appl. Environ. Microbiol. -1994.-V.60.-P. 19-25.

132. Kekessy D., Piquet J. New method for detecting bacteriocin production // Appl. Microbiol. 1970. - V.20. - P.282-283.

133. Keller M. Digestion of 5-endotoxin by gut proteases may explain reduced sensitivity of advanced instar larvae of Spoclopterci littoralis to CryIC / Sneh B., Strizhov N. et al. II Insect Biochem. Molec. Biol. 1996. - V.26. - P.365-373.

134. Khawaled K. The fate of Bacillus thuringiensis var. israelensis killed pupae of Aedes aegypti / Ben-Dov E., Zaritsky A. et al. II J. Invertebr. Pathol. -1990.-V. 56. - P. 312-316.

135. Kim H.-S. Isolation and characterization of mutants of Bacillus thuringiensis var. israelensis / Cote J.-C., Frechette S. et al. II J. Appl. Bacteriol. 1994. - V.76. - P.234-239.

136. Kim H.S. Distribution, serological identification, and PCR analysis of Bacillus thuringiensis isolated from soils of Korea / Lee D.W., Woo S.D. et al. II Gurr. Microbiol. 1998. - V.37. - P. 195-200.

137. Kim Y.T., HuangH.T. The ß-exotoxin of Bacillus thuringiensis . I. Isolation and characterization // J. Invcrtebr. Pathol. 1970. - V. 15. - P. 100-108.

138. Knowles B.H., Ellar D.J. Different specificity of two insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis var. aizaxva II Mol. Microbiol. 1988. - V.2. - P. 153157.

139. Knowles B.H. Lectin-like binding of Bacillus thuringiensis var. kurstaki lepidopteran-specific toxin is an initial step in insecticidal action / Thomas W.E., Ellar D.J. //FEBS Lett.- 1984.-V. 168.-P. 197-202.

140. Koshikawa T. Surface hydrophobicity of spores of Bacillus ssp. / Yamazaki . M., Yoshimi M. etal. II J. Gen. Microbiol. 1989. - V.135. - P.2717-2722.

141. Kramer K.J., Muthukrishnan S. Insect chitinases: molecular biology and potential use as biopesticides // Insect Biochem.Molec.Biol. 1997. - V.27. - P. 887-900.

142. Krieg A. Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, strain BI 256-82: a third pathotype within the H-serotype 8a8b / Schnetter W., Huger A.M. et al. II System. Appl. Microbiol. 1987.- V.9. - P.138-141.

143. Macintosh S.C. Specificity and efficacy of purified Bacillus thuringiensis proteins against agronomically important insects / Stone T.B., Sims S.R. et al. // J. Invertebr. Pathol. 1990. - V.56. - P.258-266.

144. Martin P.A.W., Travers R.S. Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V.55. — P.243 7-2442.

145. Masson L. A holistic approach for determining the entomopathogenic potential of Bacillus thuringiensis strains / Erlandson M., Puzstai-Carey M. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - P.4782-4788.

146. Milne R. Bacillus thuringiensis ô-endotoxin: an improved technique for the separation of crystals from spores / Murphy D., Fast P.G. // J. Invertebr. Pathol. — 1977.-V.29.-P.230-231.

147. Mizuki E. Ubiquity of Bacillus thuringiensis on phylloplanes of arboreous and herbaceous plants in Japan / Ichimatsu T., Hwang S.-H. et al. Il J.Appl. Microbiol. 1999. - V.86. - P.979-984.

148. Moar W.J. Development of Bacillus thuringiensis CrylC resistance by Spodoptera exigua (Hubner) (Lepidoptera: Noctuidae) / Pusztai-Carey M., Van Faasen H. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V.61. - P.2086-2092.

149. Muller-Jaquet F. On the specificity of delta-endotoxins of Bacillus thuringiensis II Dissertation ETH No.8474. 1987. - Swiss Federal Institute of Technology. - 8092 Zurich, Switzerland.

150. Nishiitsutsuji-Uwo J. Sporeless mutants of Bacillus thuringiensis / Wakisaka Y., Eda M. //J. Invertebr. Pathol. 1975. - V.25. - P.355-361.

151. Nishiitsutsuji-Uwo J., Endo Y. Mode of action of Bacillus thuringicnsis h-endotoxin: relative roles of spores and crystals in toxicity to Pieris, Lymantria and Ephestia larvae // Appl.Entomol.Zool. 1980. - V. 15. - P. 416-424.

152. Nyouki F.F.R. Spore-toxin interactions and sublethal effects of Bacillus thuringicnsis in Spodoptera frugiperda and Pseudoplusia includcns (Lepidoptera: Noctuidae) / Fuxa J.R., Richter A.R. // J. Entomol. Sci. 1996. - V.31. - P.52-62.

153. Obukowitz M.G. Integration of the 5-endotoxin gene of Bacillus * thuringicnsis into the chromosome of root-colonizing strains of Pseudomonas using Tn5 / Perlak F.T., Kusamo-Kretzner K. et al. II Gene. 1986. - V.45. -P.327-331.

154. Ohba M. Bacillus thuringicnsis populations naturally occurring on mulberry leaves: a possible source of the populations associated with silkworm-rearing insectaries // J. Appl. Bacteriol. 1996. - V.80. - P.56-64.

155. Ohba M. Production of heatstable exotoxin by Bacillus thuringicnsis and related bacteria / Tantichobok A., Aizawa K. // J. Invertebr. Pathol. 1981. - V.38.- P.26-32.

156. Ohba M., Aizawa K. Occurrence of two pathotypes in Bacillus thuringicnsis subsp.fukuokaensis (flagella serotype 3a:3d:3e) // J. Invertebr. Pathol.- 1990.-V.55.-P.293-294.

157. Ohba M., Aizawa K. Frequency of acrystalliferous spore-forming bacteria possessing flagellar antigens of Bacillus thuringicnsis II J.Basic. Microbiol. -1986.-V.26.-P.185-188.

158. Ohba M., Aizawai K. Insect toxicity of Bacillus thuringicnsis isolated from soils of Japan // J. Invertebr. Pathol. 1986. - V.47. - P. 12-20.

159. Ohba M. Occurrence of non-insecticidal Bacillus thuringicnsis flagellar serotype 14 in the soil of Japan / Yu Y.M., Aizawa K. // Syst. Apll. Microbiol. -1988. V.l 1. - P.85-89.

160. Okstad O.A. Sequence analysis of three Bacillus cercus loci carrying PicR-regulated genes encoding degradative enzymes and enterotoxin / Gominet M., Purnelle B. et al. // Microbiology. 1999.-V. 145. - P. 3129-3138.

161. Oppert B. Protease interaction with Bacillus thuringiensis insecticidal toxins // Arch.Insect Biochem. Physiol. 1999. - V.42. - P. 1 -12.

162. Padua L. Isolation of a Bacillus thuringiensis strain (serotype 8a:8b) highly and selectively toxic against mosquito larvae / Ohba M., Aizawa K. // J. Invertebr. Pathol.-1984.-V.44.-P.12-17.

163. Pedersen J.C. Dispersal of Bacillus thuringiensis var. kurstaki in an experimental cabbage field / Damgaard P.H., Eilenberg J. et al. II Can. J. Microbiol. 1995. - V.41. - P. 118-125.

164. Pendleton T.R. Comparative toxicities of crystal serotypes of Bacillus thuringiensis for larvae of Philosamia cynthia var. ricini II J. Invertebr. Pathol. -1969. V.13. - P.423-428.

165. Perani M. Prevalence of p-exotoxin, diarrhoeal toxin and specific 8-endotoxin in natural isolates of Bacillus thuringiensis / Bishop H., Vaid A. 11 FEMS Microbiol. Lett. -1998. V.160. - P.55-60.

166. Raffel S.J. Genotypic and phenotypic analysis of zwittermicin A -producing strains of Bacillus cereus / Stabb E.V., Milner J.L. et al. II Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 3425-3436.

167. Ramoska W.A., Pasey C. Food availability and period of exposure as factors of Bacills sphaericus efficacy on mosquito larvae // J. Econ. Entomol. -1979. V.72. - P.523-525.

168. Rassel R.M. POLO: a new computer program for probit analysis / Robertson J.L., Savin S.E. // Bull. Entomol. Soc. Am. 1977. - V.23. - P.209-213.

169. Regev A. Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spocloptera littoralis larvae / Keler M., Strizhov N. et al. II Appl.Env.Microbiol. 1996. - V. 62. - P. 3581-3586.

170. Rice W.C. Specific primers for the detection of vip3A insecticidal gene within a Bacillus thuringiensis collection // Lett. Appl. Microbiol. -1999. V.28. -P.378-382.

171. Rodriguez-Padilla C. Bacillus thuringiensis subsp. neoleonensis serotype H-24, a new subspecies which produces a triangular crystal / Galan-Wong L., de Barjac H. et al. // J. Invertebr. Pathol. 1990. - V.56. - P.280-282.

172. Rogoff M.H. Insecticidal activity of thirty-one strains of Bacillus against five insect species / Ignoffo C.M., Singer S. et al. II J. Invertebr. Pathol. 1969. -V.14. - P.122-129.

173. Rosenberg M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity / Gutnick D., Rosenberg E. // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V.9. - P.29-33.

174. Rowlands R.T., Normansell I.D. Current strategies in industrial strain selection // Bioactive Microbial Products Academ.Press, London-NewYork, 1983 - P. 1-18.

175. Rukmini V. Bacillus thuringiensis crystal-endotoxin: role of proteases in the conversion of protoxin to toxin / Reddy C.Y., Venkateswerlu G. // Biochimia. — 2000.-V.82.-P.109-116.

176. Saleh S.M. Method for determining Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner in soil / Harris R.F., Allen O.N. // Can.J.Microbiol. 1969. - V.15. -P. 1101-1104.

177. Sampson M.N., Gooday G.W. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects // Microbiology. 1998. - V. 144. — P. 2189-2194.

178. Sashidanandham R., Jayaraman K. Formation of spontaneous asporogenic variants of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae in continuous cultures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. - V.40 - P.504-507.

179. Schncpf E. Bacillus thuringiensis and its pcsticidal crystal proteins / Crickmorre N., Van Rie J. et al. II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62. -P.775-806.

180. Sebesta K., Horska K. Mechanism of inhibition of DNA-dependent RNA polymerase by exotoxin of Bacillus thuringiensis II Biochem.Biophys.Acta. -1970.-V. 209.-P. 357-376.

181. Sebesta K. Thuriengiensin, the beta-exotoxin of Bacillus thuringiensis / Farcas J., Horska K. et al. II Microbial control of pests and plant diseases 19701980. Acad.Press, New York, 1981. - P.263-276.

182. Shang H. C. Behavior of Pythium torulosum zoospores during their interaction with tobacco roots and Bacillus cereus / Handelsman J., Goodman R.M. // Curr. Microbiol. 1999. - V. 38. - P. 199-204.

183. Shao Z. Cui Y. Processing of 5-endotoxin of Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki HD-1 in Heliothis armigera midgut juice and the effects of protease inhibitors / Yi H., Ji J. et al. //J. Invertebr. Pathol. 1998. - V.72. - P.73-81.

184. Sharpe E.S., Baker F.L. Ultrastructure of the unusual crystal of HD-1 isolate of Bacillus thuringiensis var. kurstaki II J. Invertebr. Pathol. 1979. - V.34. — P.320-322.

185. Siden I. Virulence factors in Bacillus thuringiensis: purification and properties of a protein inhibitor of immunity in insects / Dalhammar G., Telander B. et al. IIL Gen. Microbiol. 1979. - V.l 14. - P.45-52.

186. Sierecka J.K. Purification and partial characterization of a neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus II Int. J. Biochem. Cell. Biol. 1998. - V. 30.-P. 579-595.

187. Smirnoff W.A. Field test of the effectiveness of chitinase additive to Bacillus thuringiensis Berliner against Choristoneura fumiferana / Randall A.P., Martineau R. et al. II Can. J. For. Res. 1973. - V. 3. - P. 226-236.

188. Smirnoff W.A., Valero J. Determination of the chitinolytic activity of nine subspecies of Bacillus thuringiensis ¡1 J. Invertebr. Pathol. 1977. - V.30. - P.265-266.

189. Smirnova T.A. Subspecies specific haemagglutination patterns of fimbriated Bacillus thuringiensis spores / Kulinnich L.I., Galperin M.Y. et al. II FEMS Microbiol. Lett. 1991. - V. 90. - P. 1 -4.

190. Smith R.A., Couche G.A. The phylloplane as a source of Bacillus thuringiensis variants // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V.57. - P.311-315.

191. Somerville H.J. Formation of the parasporal inclusion of Bacillus thuringiensis II Eur. J. Biochem. 1971. - V. 18. - P.226-237.

192. Somerville H.J. Lethal effect of purified spore and crystalline endotoxin preparations of Bacillus thuringiensis on several lepidopterous insects / Tanada Y., Omi E.M.II J. Invertebr. Pathol. 1970. - V.16. - P.241-248.

193. Stabb E.V. ZwittermicinA-producing strains of Bacillus cereus from diverse soils / Jacobson A., Handelsman J. I I Appl. Envir. Microbiol. 1994. - V. 60. — P. 4404-4412.

194. Stahly D.P. Possible origin and function of the parasporal crystals in Bacillus thuringiensis / Dingman D.W., Bulla L.A. et al. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978. - V.84. - P.581-588.

195. Tan Y., Donovan W.P. Deletion of aprA and nprA genes for alkaline protease A and neutral protease A from Bacillus thuringiensis: effect on insecticidal crystal proteins // J. Biotechnol. 2000. - V.84. - P.67-72.

196. Tang J.D. Toxicity of Bacillus thuringiensis spore and crystal protein to resistant diamondback moth (Plutella xylostella) / Shelton A.M., Van Rie J. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62. - P.564-569.

197. Thamthiankul S. Chitinase from Bacillus thuringiensis subsp. pakistani / Suan-Ngay S., Tantimavanich S. et al. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 56. - P.395-401.

198. Titball R.W. Bactcrial phospholipases // J. Appl. Microbiol. Symp. Suppl. -1998. V.84. - P.127S-137S.

199. Titball R.W. Bactcrial phospholipases C // Microbiol. Rev. 1993. - V.57. -P.347-366.

200. Tsuchiya S. Assessment of the efficacy of Japanese Bacillus thuringiensis isolates against the cigarette beetle, Lasioderma " serricorne (Coleoptera: Anobiidae) / Kasaishi Y., Ilarada II. et al. // J. Invertebr. Pathol. 2002. - V.80. -P.81-88.

201. Tyrell D.J. Characterization of spore coat proteins of Bacillus thuringiensis and Bacillus ceretis / Bulla L.A.,Jr., Davidson L.I. // Comp. Biochem. Physiol. -1981.-V.70.-P.535-539.

202. Van Frankenhuyzen K. Effect of temperature on the pathogenesis oi'Bacillus t/mriugiensis Berliner in larvae of the spruce budworm, Choristoneura fumiferana Clem. (Lepidoptera:Tortricidae) // The Canad. Entomologist. 1994. - V.126. -P.1061-1065.

203. Van Loosdrecht M. The role of bactcrial cell wall hydrophobicity in adhesion / Lyklema J., Norde W. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1987. -V.53. - P.1893-1897

204. Van Rie J. Specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. Importance of specific receptors on the brush border membrane of the midgut of target insects / Jansens S., Hofte H. et al. // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 186. - P. 239-247.

205. Vasqucz M. Specificity and insecticidal activity of Chilean strains of Bacillus thuringiensis / Parra C., Hubert E. at al. II J. Invertebr. Pathol. 1995. -V.66. - P.143-148.

206. Wasano N. Failure to recover Bacillus thuringiensis from the Lutzow-Holm Bay region of Antarctica / Imura S., Ohba M. I I Lett. Appl. Microbiol. 1999. -V.28. - P.49-51.

207. Wasano N. Delta-endotoxin proteins associated with spherical parasporal inclusions of the four Lepidoptera -specific Bacillus thuringiensis strains / Kim K.-H., Ohba M. //J. Appl. Microbiol. 1998. - V.84. - P.501-508.

208. West A.W., Burges H.D. Persistence of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in soil supplemented with grass or manure // Plant Soil. — 1985. V.83. — P.389-398.

209. Wilson G.R., Benoit T.G. Alkaline pH activates Bacillus thuringiensis spores // J. Invertebr. Pathol. 1993. - V.62. - P.87-89.

210. Wraight S.P. Effect of temperature and instar on the efficacy of Bacillus thuringiensis var. israelensis and Bacillus sphaericus strain 1593 against Aedes stimulans larvae / Molloy D., Jamnback H. et al. II J. Invertebr. Pathol. 1981. -V.38. - P.78-87.

211. Yamamoto T., Iizuka T. Two types of entomocidal toxins in the parasporal crystals of Bacillus thuringiensis kurstaki II Arch. Biochem. Biophys. 1983. -V.227.- 233-241.

212. Yamamoto T., McLaughlin G. Isolation of a protein from the parasporal crystal of Bacillus thuringiensis var. kurstaki toxic to the mosquito larva Aedes taenuorhynchus II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1981. - V. 103. - P.414-421.

213. Yamvrias C. Contribution a l'tude du mode d'actiion de Bacillus thuringiensis vis-a-vis de la teigne de la farine, Anagasta kuhniella Zell.(Lepidoptera) Il Entomophaga. 1962. - V.7. - P. 101-159.

214. Yousten A. A. A method for the isolation of asporogenic mutants of Bacillus thuringiensis II Canad. J. Microbiol. 1978. - V.24. - P.492-497.

215. Yu C.-G. The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects / Mullins M.A., Warren G.W. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V.63. - P.532-536.

216. Zhang H. Composition and ecological distribution of Cry proteins and their genotypes of Bacillus thuringiensis isolates from warehouses in China / Yu Z., Deng W. // J. Invertebr. Pathol. 2000. - V.76. - P. 191 -197.

217. Zhang M.-Y., Lovgren A. Cloning and sequencing of a |}-lactamase-encoding gene from the insect pathogen Bacillus thuringiensis II Gene. 1995. -V. 158.-P. 83-86.

218. Zhang M.-Y. Adhesion and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis to cultured Spodoptera and Drosophila cells / Lovgren A., Landen R. // J. Invertebr. Pathol. -1995. V.66. - P.46-51.

219. Zhang M.-Y. Characterization of an avirulent pleiotropic mutant of the insect pathogen Bacillus thuringiensis: reduced expression of flagellin and phospholipases / Lovgren A., Low M.G. et al. II Infect. Immun. -1993. V.61. -P.4947-4954.

220. Zhu Y.S. Separation of protein crystals from spores of Bacillus thuringiensis by Ludox gradient centrifugation / Brookes A., Carlson K. et al. II Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V.55. - P.1279-1281.

221. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis с бипирамидальными кристаллами

222. Зас акБЙ правильные ромбовидные 1,0 130 0 0 +++

223. ЗаЬс кш^аМ правильные ромбовидные 1,0 130 0 0 ++56 4аЪ Боио ромбовидные разных размеров 1,0 130 0 0 ++

224. Характеристика штаммов с бесформенными параспоровыми включениями

225. Рв-14 8аЬ тогпБот 135,133,130,72,28 0 100 .++1125 14 ¡Бгаекг^Б 130,72,42,28 0 100 ++9419 33 1еез1з 72,68,50,29 0 100 084.1-1-13 Зас1е Шкиокаег^Б 250,90,50,29,28 0 100 0

226. Е-10-2 ЮаЬ darmstadiensis 135,90,52,47,29,28 0 100 +

227. Р-51-46 Зас1 5ит1уозЫеп815 135,130,90,52,47,29,28 0 80

228. Примечание: «+» вызывает ингибирование роста гусениц менее, чем на 20% «++»- вызывает ингибирование роста гусениц более, чем на 50% •

229. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis с нетипичными кристаллами