Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Колонизация сред разной плотности и хемотаксис у Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Колонизация сред разной плотности и хемотаксис у Bacillus thuringiensis"



Ha правах рукописи

КРАВЕЦ Елена Владимировна

КОЛОНИЗАЦИЯ СРЕД РАЗНОЙ ПЛОТНОСТИ И ХЕМОТАКСИС У BACILLUS TIIURINGIENSIS

Специальность 03 00 16 — экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 2007

2 4 МАЙ 2007

003060012

Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики ГОУ ВПО Иркутский государственный университет, г Иркутск

кандидат биологических наук, доцент

Валентина Ивановна Чемерилова

доктор биологических наук, профессор

Дргаккер Валентин Валерианович

кандидат биологических паук, доцент Ольга Федоровна Вятчина

Ведущая организация Иркутский государственный педагогический университет

Защита диссертации состоится «16» июня 2007 г в 13 00 часов на заседании диссертационного совета Д 212 074 07 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет», биолого-почвенпый факультет

Адрес 664003, г Иркутск, ул Сухэ-Батора, 5 тел (395-2) 24-18-70, (395-2) 24-18-55 тел /факс (395-2) 24-22-38 E-mail val@botdep isu iu

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет»

Автореферат разослан 16 мая 2007 г

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ученый секретарь диссертационного совет, к б п , доцент

ЕС Купчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Bacillus thurmgiensis (ВТ) - хорошо известный вид энтомопатогенных спорообразующих бактерий, которые являются одним из естественных регуляторов численности насекомых и используются во всем мире в качестве биологических инсектицидов на протяжении более тридцати лет Отличительной особенностью этого вида является формирование в бактериальной клетке в процессе споруляции белкового кристалла 5-эндотоксина Признание ведущей роли этого токсина в гибели насекомых сфокусировало внимание большинства исследователей на данном признаке и обеспечило детальную изученность его молекулярной биологии, генетического контроля и механизма действия на личинок насекомых [Патогены насекомых структурные и функциональные аспекты, 2001 ]

Намного меньше известно о других признаках этих бактерий, в частности, таких как подвижность и хемотаксис, имеющих первостепенное значение в обеспечении жизнеспособности и адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды Исследований хемотаксиса у ВТ ранее не проводилось, а сведения о системе подвижности клеток крайне бедны Только в последние годы отмечается повышение интереса к функционированию жгутикового аппарата клеток ВТ, несмотря на то, что его структура лежит в основе общепризнанной схемы внутривидовой идентификации штаммов данного вида [de Barjac, Franchón, 1990] Такой интерес вызван появлением работ, указывающих, что экспортный аппарат жгутиков может быть одним из факторов вирулентности представителей вида ВТ для личинок насекомых-хозяев [Ghelardi et al, 2002, Bouillaut et al, 2005, Ramarao, Lereclus, 2006]

Накопившиеся к настоящему времени сведения о том, что бактерии вида Bacillus thurmgiensis могут быть причиной серьезных оппортунистических инфекций человека и животных [Hernandez et al, 1998, Salamitou, 2000], a также молекулярно-генетические доказательства их близкого родства с таким патогенном как Bacillus anthracis [Helgason et al, 2000], выдвигают на первый план исследования поведения клеток ВТ при взаимодействии с компо-

нентами окружающей среды, которое обеспечивается системами подвижности и хемотаксиса Эти системы хорошо изучены у Escherichia coli и Salmonella enterica serovar Typhimurium, а для представителей вида Bacillus thuringiensis, невзирая па всю их экономическую важность, вопрос до сих пор остается открытым

Цель настоящего исследования - изучить особенности колонизации сред разной плотности и хемотаксические ответы на ряд химических соединений и смесей у диссоциативных S- и R-вариантов штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis

В задачи исследования входило- выявить особенности колонизации агаросодержащих сред разной плотности клетками штаммов 16-ти подвидов ВТ, исследовать хемотаксические реакции штаммов разных подвидов на химические соединения антропогенного и природного происхождения, изучить подвижность и хемотаксис у морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации исходных штаммов

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые экспериментально выявлена гетерогенность штаммов энтомопатогенного вида ВТ по способности колонизировать среды с разной плотностью и различия в стратегии колонизации этих сред, проявляющейся в дифференцировке разных типов клеток Впервые исследованы хемотаксические реакции на ряд эффекторов у клеток десяти штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ Обнаружены качественные изменения в хемоответах клеток морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации природных штаммов

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о разнообразии стратегий клеток Bacillus thuringiensis при колонизации сред с разной плотностью и возможном поведении их ири контакте с различными компонентами природного и антропогенного происхождения

Охарактеризованы коллекционные штаммы по подвижности на средах разной плотности и хемотаксису Получена коллекция диссоциантов и му-

тантов, которая может быть использована для изучения генетического контроля типов дифференцировки клеток бацилл и системы хемотаксиса

Защищаемые положения:

1 Клетки Bacillus thuringiensis различаются по способности и стратегии колонизации сред разной плотности

2 Клетки штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis обладают хемотаксисом Специфичность спектра аттрактантов и репеллентов для данных бацилл может отражать особенности их существования в природе

3 Возникновение морфологических вариантов в процессе диссоциации увеличивает гетерогенность популяций Bacillus thuringiensis по подвижности и способности к хемоответу

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийских конференциях «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 2001), «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), на Всероссийской школе по экологической генетике «Модификационная изменчивость в экологических взаимодействиях» (Санкт-Петербург, 2005), на III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 в журнале из перечня ВАК

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала, методов исследования, изложения и обсуждения результатов экспериментов, выводов и Приложения Результаты работы проиллюстрированы 15 таблицами и 25 рисунками Список использованной литературы включает 196 наименований, в том числе 141 на иностранных языках

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали типовые штаммы ВТ, полученные из коллекции Музея микробиологии Иркутского государственного университета Характеристика использованных в работе штаммов представлена в таблице 1

Таблица 1

Характеристика использованных в исследовании штаммов ВТ

№ Штамм Серовариант Серотип Н-антигеи Аббревиатура

i В-1010 кепуае 4a,4c KEN

2 В-1120 toumanoffi liai lb TOU

3 В-1000 gal 1er ме 5a, 5b GAL

4 В-1122 canadensis 5a,5c CAN

5 2-1 galleriae 5a,5b GAL

6 49 dendrolimus Tal 4a,4b SOT/DEN

7 В-1008 morrisoni 8a8b MOR

8 В-1007 tolworthi 9 TOL

9 В-1004 subtoxicus 6 SUB

10 4 КС alesti 3a,3c ALE

И В-805 caucasicus 10 CAU

12 В-1093 kurstaki 3a,3b,3c KUR

13 2002 thurmgiensis 1 THU

14 В-1003 entomocidus 6 ENT

15 В-1075 darmstadiensis 10a, 10b DAR

16 В-1009 aizawai 7 AIZ

17 В-738 fmitimus 2 FIN

18 5045 dendrolimus 4a,4b SOT/DEN

19 В-741 alesti 3a,3c ALE

Клетки исследованных штаммов нормально спорулировали и формиро-

вали кристаллы 5 - эндотоксина Культивирование бактерий и анализ колониально-морфологических признаков проводили на плотной питательной среде Луриа-Бертани (LB) с 1,5% содержанием агара при 28°С В качестве жидкой среды использовали ту же среду без добавления агара В экспериментальных средах варьировало только содержание агара от 0,3% до 1,0% Для выявления потребностей в факторах роста использовали с интетическую минимальную среду Никкерсона и Буллы [Nickerson, Bulla, 1974]

В качестве эффекторов при тестировании хемотаксиса использовали растворы химических соединений в концентрациях, указанных для Borrelia

burgdorferi [Shi et al, 1998] 7,5xl0~2M СаС12, 10"'М KCl, 10% NaOH и 60% NaHC03 (рН>9), 10"2М этанола, 10"2М растворы аминокислот триптофана, валина, аланина, леицина, растворы нефтепродуктов ортоксилола и

гексадекана (цет an), препарата «Гумат-80» Растворы инсектицидов готовили в концентрации, рекомендованной для обработки сельскохозяйственных культур 15 мкг/мл бетациперметрина (кинмикс), 5 мкг/мл дельтаметрина (децис) и циперметрина (арриво), 250 мкг/мл малатиона (карбофос)

В качестве эффекторов природного происхождения использовали водные вытяжки из хвои лиственницы {baux sibirica Ledeb ), сосны {Pinus sylvestris L ), кедра (Pinus sibirica Du Toui), пихты {Abies sibirica Ledeb), ели {Picea obovala Ledeb ) и туи {Thuja occidentalis L ) и листьев березы {Betula pendula Roth), тополя (Populus bahaminejera L ), яблони {Malus baccata (L ) Bakh), боярышника {Crataegus sanguínea Pall ), рябины {Sorbus sibiiica Held ), шиповника {Rosa rugosa Thunb ), черемухи {Padus avium Mill), ивы {Salix bebbiana Sarg ), ирги {Amelanchier ovalis Medik ), барбариса {Berbeiis vulgaris L ), черники {Vaccinmm myrtillus L ), жимолости {Lonicera edulis Turez ex Freyn), облепихи {Hippophae rhamnoides L ), малины {Rubus ilaens L ) Для изготовления вытяжек хвою и листву соответствующих пород измельчали и навеску в 2 г тщательно растирали в ступке с 4 мл хемотаксисного буфера Взвесь фильтровали через двойной слой марли

Метод исследования подвижности Клетки шестичасовой культуры, выросшей в жидкой среде LB, наносили уколом в центр чашки Петри с той же средой, но содержащей 0,4% или 1,0% агара Высеваемую суспензию и край зоны колонизации микроскопировали (СХ-41, Olympus) через 6, 18 и более часов культивирования при 26°С Измеряли зоны колонизации среды обычной линейкой, фотодокументировали с помощью цифровых камер Canon Power Shot A410, COOLPIX PI

Метод исследования хемотаксиса Для исследования хемотаксиса использовали модифицированный метод вставок [Tso, Adiei, 1974] Клетки двенадцатичасовой культуры, выращенной в жидкой среде LB при 28°С,

осаждали и отмывали от среды центрифугированием (5мии при 3000 об/мин), ресуспензировали в небольшом количестве хемотаксисного буфера (10 мМ NaH2P04 рН 7,6, Ю"'1 М ЁДТА). Суспензию смешивали с равным объемо:: предварительно разогретой до 45°С 0,4% агарозы (Serva) и выливали на чаш ку Петри, в центр которой предварительно помещали 5 мм вставку из 1,594 агарозы, содержащую тестируемое вещество. Реакцию клеток оценивали через 24 час инкубации при 28(1С. Образование прозрачной зоны вокруг вставкг свидетельствовало об отрицательной реакции клеток на тестируемое вещество, а образование более плотного кольца - о положительной реакции клето: (рис. I),

Рис.1. Позитивная (Л) и негативная (В) реакция клеток Bacillus thin ingiemis па вещество вставки

Вещество считали нейтральным, если плотность клеток вокруг вставк:: не менялась. Степень реакции оценивали по диаметру зоны, которую измг-i ряли под бинокуляром МБС-9 при увеличении 8x06 с помощью окуляр микрометра. Вставки изготовляли, смешивая тестируемые растворы с равным объем ом 1,5 % а га р о з ы.

Статистическую обработку результатов вели общепринятыми методам: [Роки цк ни, 1973],

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор условий для сравнительного изучении пиши движения \ штаммов Bacillus thuringiensis. На примере штамма 49 Bacillus thuringiens': ssp. dendrolirmts установлено, что степень колонизации среды клетками б? цилл в значительной степени зависит от ее плотности, не зависит от ее объс1 ма н возраста засеваемой культуры. Среда LB. с содержанием агара 0,4%, г

не с 0,5%, позволяла клеткам ВТ осуществлять движение но типу плавания. Скорость движения зоны колонизации данной срсды клетками в промежуток времени от 18 до 24 час была стабильна и могла служить для оценки различий исследуемых штаммов по признаку движения в полужидких средах.

Характер дни же и и я штаммов Bacillus thuringiensis в среде с 0,4% содержанием агара. Исследовали характер колонизации среды, содержащей 0,4% агара, клетками 5 53 клонов, принадлежащих к 19 штаммам различных подвидов ВТ. Опыт проводили □ шли повторностях для каждого клона. Результаты экспериментов показали, что клетки большинства из исследованных клонов были способны эффективно колонизировать среду LB и 0,4% содержанием агара после культивирования в жидкой среде, но их поведение и морфология зон колонизации (рис.2) различались.

Рис.2, Морфология зон колонизации среды с 0,4% содержанием агара штаммами Bacillus thuringiensis

Для выявления причин наблюдаемых различий н характере поведения клеток штаммов ВТ исследовали с помощью микроскопа выращиваемые в жидкой среде культуры и зоны колонизации ими полужидкой среды через 18 и более часов после инокуляции клеток.

Было установлено, что различия в колонизации сред связаны с разными типами дифференцировки клеток, как в жидкой среде, так и в среде с низкой плотностью. Е!се исследованные клоны можно было условно подразделить на 4 типа. Клоны первого типа были способны эффективно колонизировать среду за счет дифференцировки быстроплавающих коротких одиночных клеток, передвигающихся только в поверхностном слое среды. Такой тип колонизации был характерен для большинства клонов, принадлежащих к штаммам 10 ! 0 ssp. кепуае, 1000 и 2-1 ssp. galleriae, 49 ssp dertdrolimus, 1 ! 22 ssp. сапа-

densis и 1120 ssp toumanoffi Эти клоны отличались относительно высокой скоростью продвижения зоны колонизации (2-3 мм/час), значительным ее диаметром к 18 часу культивирования и формированием характерного ободка по краю (рис 2А, штамм 1000) Первый тип колонизации был характерен и для клеток штамма 805 ssp caucasicus, но в период с 18 до 24 часов все клоны этого штамма проявляли низкую скорость движения зоны Для второго типа клонов было характерно формирование длинных нитевидных клеток, способных только расти на поверхности среды с 0,4% агара, образуя вокруг плотной центральной зоны роста как бы «венец» из выступающих нитей В жидкой среде шестичасовая культура содержала неподвижные клетки нормального размера, а в 24-ти часовой культуре дополнительно появлялись длинные нитевидные клетки Такой тип был характерен для всех клонов штамма 1009 ssp aizawai, которые не были способны эффективно колонизировать среду с низкой плотностью

Клоны третьего и четвертого типов отличались от первых двух тем, что колонизировали эффективно толщу среды Клоны третьего типа (штаммов 1008 ssp morrisoni, 1007 ssp tolworthi, 2-1 ssp galleriae, 1093 ssp kurstaki, 2002 ssp thuringiensis) формировали зоны с характерным ободком, но более интенсивным ростом в точке посева (рис 2В, штамм 1007) На поверхности полужидкой среды по краю зоны наблюдали одиночные неподвижные клетки, а подвижные клетки чаще встречались в толще среды, что не было характерно для штаммов первой группы Также в глубине среды наблюдали отходящие от места укола и интенсивного роста одиночные длинные нитевидные клетки Клоны штаммов 4кс ssp alesti, 1075 ssp darmstadiensis, 1003 ssp en-tomocidus, 1004 ssp subtoxicus (четвертый тип) формировали зону колонизации иной морфологии (рис 2С, штамм 1003), которая отличалась отсутствием характерного ободка по краю К 18 часу для этих штаммов зона движения не была заметна или имела небольшой диаметр, увеличивающийся в последующие часы культивирования Микроскопический анализ показал, что этот тип клонов колонизирует толщу среды за счет одиночных слабо подвижных кле-

ток, которые по ходу своего перемещения оставляют расположенные на небольшом расстоянии друг от друга неподвижные микроколонии, состоящие из нескольких клеток, формирующих своеобразные «пучки», очень напоминающие начальные этапы развития колоний у В. тусоШея 11)] Г'гапсо е( а!., 2002).

Клоны штаммов: 738 рпШтиз, 741 sspale.sH, 5045 ххр, с1епс1гаИти$ и, как отмечалось, 1009 зяр. а'иач'Ш оказались неспособными к передвижению на среде с 0,4% агара в течение 48 час (рис,2Г), ш тамм 5045), но природа отсутствия видимых зон колонизации среды клетками этих штаммов различна. После длительного наблюдения клоны штаммов 738 хяр. /¡пШтия, 741 ллу; а!е$1 / были отнесены к четвертому типу, а клоны штамма 5045 л'лу> ёеп-с!гоИтш - к первому типу дифференцировки по характеру возникающих п о д в и ж и ы х му та [ [то в.

Характер движения штаммов ВасШи$ (1шги^1ет1Я на среде с (,0% содержанием агара. При исследовании колонизации сред с высокой плотностью клетками штаммов разных подвидов ВТ мы также столкнулись с многообразием типов дифференцировки клеток, определяющих стратегию освоения пространства. На среде с 1% содержанием агара у всех исследованных штаммов заметные различия по степени колонизации плотной среды клетками клонов можно было отметить только на 8 сутки культивирования.

Рис. 3. Морфология зон колонизации среды с 1.0% содержанием агара клетками штаммов Bacillus thuringiensis через 8 суток после посева (26°С)

Разные клоны даже одного и того же штамма формировали зоны неправильной формы, разной морфологии и размера (рис.3), наблюдали появление секторов с разным краем зоны движения. Только клетки клонов штамма 805 ssp. caucas i cus формировали на данной среде одинаковые и стабильные зоны.

Анализ под микроскопом края зоны движения клона на плотной среде, позволил объяснить характер колонизации плотной среды исследуемым:' штаммами. Всего было выявлено 3 основных типа края зоны движения культур ВТ на плотной среде. Примеры этих типов представлены на рис.4.

Рис.4. Края зон, формируемых штаммами Bacillus thuringiemis на средс с 1,0% содержанием агара. Объяснение в тексте.

Край зоны первого типа (рис.4А) содержал отдельные клетки небольшого размера, лежащие боком к поверхности зоны движения или в беспорядке выступающими из зоны. Продвижение по поверхности плотной среды у этик культур было, по-видимому, обусловлено не активным движением, а простс вытеснением крайних клеток размножающимися в центре зоны клетками. П: краю зоны с клетками расположенными боком наблюдали наличие тон ко г? ободка жидкости или слизи, которая, возможно, и облегчала продвижение: зоны.

Отличительной чертой края зон второго типа было наличие слоев тесн; или рыхло параллельно уложенных длинных пеней клеток, формирующие волны различного размера, или выступающих из колонии групп роящихся клеток-швармеров, иногда образующих причудливые узоры (рис.4В). Этс ' тип мы разделили на два подтипа 2а и 26. Для подтипа 2а характерно образе ваиие из плотных слоев длинных клеток небольших волн, не выступающи: сильно за пределы зон колонизации. Для подтипа 26 характерно более рых

лое расположение цепочек длинных клеток и интенсивное образование швармеров, активно выступающих за пределы зон колонизации Штаммы, формирующие край зоны колонизации второго типа, перемещались по среде с 1% содержанием агара за счет движения по типу «роение», только недавно описанному для штамма ВТ HI серотипа [Ghelardi et al , 2002]

Край зоны третьего типа (рис 4С) не был четко обозначен, а из массы клеток центральной зоны выступали нитевидные клетки, ветвящиеся и проникающие глубоко в среду Штаммы, имеющие край зоны третьего типа, не были способны передвигаться по плотной среде за счет движения отдельных клеток, и колонизировали среду за счет дифференцировки нитевидных клеток Мы не нашли в литературе описания данного типа колонизации плотных сред у ВТ, хотя у представителей рода Bacillus отмечается способность формировать длинные нитевидные клетки [Коротяев, 1998] Недавно у В cereus была обнаружена способность расти в почве благодаря формированию многоклеточных нитевидных структур [Vilain et al, 2006] Аналогичные формы были обнаружены и у В mycoides, близкого родственника исследуемого нами вида [Di Franco et al, 2002] Сигналом к дифференцировке таких клеток, возможно, служил недостаток кислорода, так как эти клетки формировались в толще среды

Большинство штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ, осуществляли колонизацию среды с 1,0% содержанием агара благодаря способности к дифференцировке клеток-швармеров, передвигающихся по поверхности плотной среды по типу роения Только клоны штамма 49 ssp dendrolwms характеризовались первым типом края зон колонизации, редко формируя сектора с 2а типом По-видимому, клетки данного штамма не способны были дифференцироваться в швармеры Только третий тип колонизации был характерен для всех исследованных клонов штаммов 1003 ssp entomocidiis, 4кс ssp alesti, а также некоторых клонов штамма 2-1 ssp galleriae Один клон с третьим типом зоны колонизации был встречен среди клонов штамма 1004 ssp snbtoxiciis С таким же типом края зоны колонизации были отмечены сек-

тора, образуемые при размножении некоторых клонов штаммов 1010 ssp кепуае, 1008 ssp morrisoni, 738 ssp finitimus и 1075 ssp darmstadiensis Лучшая способность к колонизации плотной среды была характерна для штаммов, формирующих края зон 26 и 3 типов

Следует отметить, что какая-либо классификация штаммов по способности колонизировать среды разной плотности оказывалась условной, так как для большинства исследованных штаммов вида характерна гетерогенность по анализируемому признаку, даже среди клонов одного и того же штамма можно встретить как разный тип дифференцировки, так и разную способность колонизировать среды той или иной плотности

Хемотаксис у Bacillus thuringiensis. У клеток штаммов 49 ssp den-drohmus и 2002 ssp thuringiensis исследовали хемоответ на присутствие 33 химических соединений и смесей, а у 8 штаммов, отличающихся по характеру движения в средах с разной плотностью, только реакции на экстракты из хвои и листьев 18 исследуемых видов растений Выбор хемоэффекторов не был случайным При выборе химических соединений и смесей руководствовались исследованиями, проведенными на других микроорганизмах [Shi, 1998, Mesibov, 1973], а также условиями, с которыми Bacillus thuringiensis может встречаться в природных биоценозах

В выбранных нами условиях изучения хемотаксиса клетки 12-ти часовых культур штаммов 49 ssp dendrolimus и 2002 ssp thuringiensis проявляли однозначную реакцию в 3-5 повторностях экспериментов Из неорганических соединений сильным репеллентом для клеток обоих штаммов ВТ был раствор бикарбоната натрия Это соединение использовали для изучения действия высокого значения pH среды, с которым Bacillus thuringiensis сталкивается в кишечнике насекомых [Falcon, 1971] Но отрицательную реакцию вызывало не повышенное значение pH, а именно раствор NaHCCh, т к такое же значение pH, установленное с помощью раствора NaOH, не вызывало отрицательной реакции у клеток По реакции на растворы KCl и СаСЬ клетки Bacillus thuringiensis отличались от патогенных спирохет В burgdorferi [Shi,

1998], а по отсутствию реакции на аминокислоты - от Е coli [Mesibov, 1973] Отсутствие реакции на использованные аминокислоты кажется удивительным, так как штаммы 49 и 2002, как было нами установлено, являются ауксо-трофами по аминокислотам валину и лейцину

Все соединения, имеющие антропогенное происхождение, в том числе ряд химических инсектицидов и ряд нефтепродуктов, не вызывали хемореак-ции у клеток обоих штаммов, даже при увеличении их концентрации во вставке в два или в три раза Отсутствие реакции, как было показано, не связано с нарушением хемочувствительности клеток, а, скорее всего, клетки бацилл не содержат соответствующих хеморецепторов В связи с тем, что основная масса исследуемых химических соединений и смесей оказалась для клеток ВТ веществами нейтральными, интересно было проверить характер хемореакции клеток данного вида бацилл на соединения - компоненты биоценоза

Характер хемоответа штаммов дикого типа на природные соединения. Клетки всех штаммов прореагировали на экстракты из листьев хвойных и лиственных растений Можно думать, что они встречались с данными компонентами в своем эволюционном развитии Так же как и раствор соды, экстракты из хвои оказались для всех исследованных штаммов репеллентами Самым сильным репеллентом для большинства штаммов является экстракт из хвои лиственницы, а самым слабым - экстракт из хвои туи Степень реакции хемотаксиса, оцененная по диаметру формируемой прозрачной зоны вокруг вставки, не зависела от подвижности штамма в среде LB с 0,4% агара Например, «неподвижный» на данной среде штамм 741 ssp alesti в ответ на экстракт из хвои лиственницы формировал зону реакции, равную 7,45+0,14 мм, которая достоверно не отличалась от зон подвижных штаммов 1008, 1010, 1120 (7,25±0,23 мм, 6,29±0,12 мм, 6,80±0,87 мм, соответственно) Отсюда следует, что у штамма 741 нарушена система движения по типу плавания, а движение типа роения и система хемотаксиса функционируют нормально

В отличие от экстрактов из хвойных растений экстракты лиственных видов растений вызывали не столь однозначный хемоответ (табл 2)

Таблица 2

Характер хемоотвста клеток штаммов разных подвидов ВТ на экстрак-

Экстракты из листьев Характер хемоответа штаммов

49 2002 2-1 4 кс 741 805 1008 1010 1120 5045

березы а а а Р а а а а а а

тополя а а а а Р а Р Р а а

яблони а а а Р Р Р Р Р Р а

боярышника а а а а а а Р Р а а

рябины Р Р Р Р Р Р Р Р Р а

шиповника Р Р а Р Р Р Р Р Р Р

черемухи Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

ивы Р Р Р Р а а Р Р а а

ирги а а а а а а а а а а

барбариса Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

жимолости а а а а а а а а Р а

облепихи Р Р а а Р Р Р Р Р Р

Примечание р - вещество репеллент, а - вещество аттрактант

Как следует из результатов, приведенных в табл 2, экстракт из листьев почти любого из исследованных растений мог вызывать у клеток одного штамма негативную реакцию, а у другого позитивную Одинаково все штаммы прореагировали лишь на экстракт из листьев ирги, который был для них аттрактантом, и экстракты из листьев барбариса и черемухи, которые были для всех штаммов репеллентами Можно предположить, что в природе наибольшее число клеток ВТ будут выделяться с листьев ирги, березы, жимолости, боярышника, экстракты из которых являются для большинства штаммов аттрактантами, а меньше всего их на листьях барбариса, черемухи, рябины и шиповника

Какой-либо связи характера хемоответа с типом подвида, определяемым по жгутиковому антигену, не наблюдали Так, штаммы 49 и 5045 относятся к подвиду с1епс1го11тш, но отличаются друг от друга по спектру реакций хемоответа на исследованные хемоэффекторы То же наблюдается и для штаммов 4кс и 741, которые относятся к подвиду ssp а1езП С другой стороны, штаммы, принадлежащие к разным подвидам, например, 1010 и/? кепуае и 1008

,Щ7, тот хот, обладают сходными реакциями, как и штаммы 49 ххр. с1еп-(¡гоИ/тт и 2002 ххр, 111ипп£1ет{я. Некоторая корреляция прослеживается между способностью клеток к роению и степенью хемочувствительности, как к экстрактам и;! хвои, так и из листьев растений, что заслуживает более тщательного исследования.

Взаимоотношения между клетками штаммов НасШчх (¡шпп^к'пхчх. Методику, использованную для изучения характера колонизации среды с 0,4% агара, применили для выявления взаимоотношений между штаммами, способными к плаванию. Для этого на чашку засевали по 4 штамма, располагая их крестообразно, на равном расстоянии друг от друга. Для контроля на одну и ту же чашку с одной стороны засевали клетки одного и того же штамма. Учет вели после того, как зоны колонизации каждого штамма соприкасались друг с другом. Тот штамм, который формировал выпуклую зону на границе соприкосновения штаммов, считали активным конкурентом в колонизации среды, а тот штамм, который формировал вогнутую поверхность зоны на границе соприкосновения штаммов — уступающим в конкуренции. Ровная граница между штаммами интерпретировалась как отсутствие конкуренции (рис. 5).

Рис. 5. Отсутствие конкуренции между клетками штаммов 100В ххр тотхот и 1007 ххр 1оЫюп1и (А) и наличие конкуренции между штаммами 1007 х.чр Iо1мог(Н\ и 1003 ххр. епЮтоскЫх (72 час, 2б"С)

Всего проанализировали взаимоотношения 14 подвижных на среде с 0,4% агара штаммов. Одновременно учитывали диаметр зоны колонизации, формируемый клетками через 18 часов культивирования после посева. Как показали результаты экспериментов, наименее конкурентоспособными оказались штаммы с быстрым продвижением зоны колонизации (49, I 122, 1120,

805) К штаммам, способным вытеснять, относятся штаммы, медленно двигающиеся и способные дифференцироваться в нитевидные формы 2002, 1003, 1004 и 1075 Штаммы 805 ssp caucasicus и 1000 ssp galleriae были по отношению друг к другу нейтральными, и между ними формировалась ровная граница, как и во всех случаях посева клеток одного и того же штамма Горизонтальная ровная граница формировалась также между штаммами 1008 ssp morrisom и 1007 ssp tolworthi, а также штаммами 1003 ssp entomocidus и 1004 ssp subtoxicus

Результаты этих предварительных экспериментов оставляют много для спекуляции, но заслуживают дальнейшего исследования, так как можно отметить, что штаммы подвида entomocidus способны синтезировать термосга-бильный бактериоцин, названный энтомоцином 9, который обладает широким спектром антибактериального действия [Cherif et al, 2003], штаммы 1003 ssp entomocidus и 1004 ssp subtoxicus, имеют сходные жгутиковые антигены

Особенности движения п хемотаксиса у диссоциативных R-вариантов Bacillus thurmgiensis. При клонировании у большинства исходных штаммов дикого типа наблюдали явление расщепления на морфологические варианты, которое исторически получило название «диссоциация» Так как многие авторы считают такой процесс у микроорганизмов адаптивным [Милько, Егоров, 1991], интересно выяснить влияние этого процесса на особенности движения и хемореакции у клеток исследуемых нами штаммов До этого такие исследования не проводились

Исследовали морфологические варианты, клетки которых в отличие от исходного типа формировали на плотной среде LB серые или прозрачные колонии и были олигоспорогенными На среде с 0,4%-ми агара такие диссоци-анты часто теряли способность к колонизации или колонизировали данную среду с достоверно меньшей скоростью Так среди 6 вариантов, полученных от штамма 1000 ssp galleriae, 4 не формировали зон колонизации Такие варианты были получены от штаммов 2002 и 1010 Были встречены варианты

достоверно не отличающиеся по скорости и характеру передвижения от исходного типа, как, например, все варианты, полученные от штаммов 1004 и 1075. Тем не менее, можно было встретить и варианты, у которых либо диаметр зоны, либо скорость колонизации среды с 0,4% содержанием агара достоверно были выше, чем у исходного типа.

Исследование движения штаммов на среде с 1,0% содержанием агара привело к аналогичному результату. Среди изученных морфологических вариантов мы не нашли иного типа края зон колонизации, отличимого от зон, характерных для штаммов разных подвидов ВТ. Многие варианты были неотличимы от исходных форм по данному признаку, но были встречены случаи, когда у вариантов тип края зон колонизации менялся. Так, у штамма 49, для которого был характерен 1-й тип края зоны, и встречались редко сектора с 2а типом, вариант R3.2 формировал зону колонизации заметно большего размера с краем типа 26. У штаммов 4кс и 2-1 исходные S-варианты колонизировали среду с 1,0% содержанием агара за счет формирования нитевидных клеток (тип 3). Морфологический R-вариант штамма 4кс отличался краем зоны типа 2а, а вариант R3 штамма 2-1 - типа 26. Один из морфологических вариантов штамма 1009 формировал более интенсивно швармеры, а другой отличался 1 типом края зоны. На рис,6 проиллюстрирована морфологии зон колонизации S- и R-вариаитов штамма 1010.

Рис.. 6. Морфология зон колонизации среды .с 1,0% содержанием агара клетками морфологических вариантов штамма ЮЮ.ир. кепуае

Хемореакцию и степень чувствительности к раствору бикарбоната натрия, экстрактам из хвои и листьев исследовали у 28 Я-вариантов, полученных от штаммов: 49 зхр. с1епс1гоНти.ч, 2002 ахр ¡Ьигтфепв1в и 2-1 ¿¿р.

gaПerшe Результаты исследования хемореакции на экстракты из листьев хвойных и раствор соды представлены в таблице 3

Таблица 3

Характер хсмоответа клеток штаммов ВТ и полученных от них К- вари_антов на экстракты из хвои деревьев и на раствор соды_

Штамм Экстракты из хвои

лиственницы сосны кедра пихты ели туи раствор соды

49,2002,2-1,49 1, 1 1, 1 2, 1 4, 2002 2 2,3 1,3 2, 1120с1с, 2120с1с, 3120с1с, Юкс, 2-1 3 Р Р Р Р Р Р Р

49 Я04 Р Р а Р Р а а

49 ТЯ8,2002 24 9 Р Р а Р Р Р а

49 1 3 а Р Р Р Р а Р

49 2 1,3 2 а Р Р Р Р Р Р

49 3 1,2002 1 3 Р Р Р Р Р а Р

2002 24 15 Р Р Р Р Р а а

2002 1 4, 1 5 Р а Р Р Р Р Р

2002 1 6 Р Р Р Р а Р Р

2002 2 1 Р а Р Р а а Р

2-1 1 Р Р Р Р а Р

2-1 2 а Р Р - а а Р

Примечание р - вещество репеллент, а - вещество аттрактант

Как видно, все исследованные К-парианты не теряли способность к хемотаксису и двенадцать из них по характеру хемореакции не отличались от исходных Б-вариантов Однако также видно, что при переходе от Б- к Я-варианту изменяется характер реакции (от репеллента к аттрактанту) на экстракты из хвои лиственницы — у четырех штаммов, сосны, кедра и ели - у трех, на экстракт из хвои туи изменился характер реакции у восьми II-вариантов, а на раствор соды - у четырех штаммов

Аналогичная картина наблюдалась и при изучении хемореакции К-вариантов на экстракты из листьев, однако, в данном случае подавляющее большинство штаммов (15) оказались в группе, не совпадающих по характеру реакции ни с одним из исследованных вариантов Всего было обнаружено три группы И-вариантов отличающихся по характеру реакции от исходных штаммов, но сходных с другими Я-вариантами С характером зон хемоответа штаммов 49 и 2002 на спектр вытяжек из листьев исследованных растений полностью совпали только два Я-варианта, полученных от штамма 2002 -

24 9 и 24 15 Штамм 2-1 и полученные от него R-варианты не совпали по характеру хемореакции ни с одним из вариантов

Таким образом, результаты экспериментов показали, что при диссоциации у ВТ могут возникать разнообразные варианты, среди которых могут встречаться формы с измененным спектром хемочувствительности и способом колонизации сред разной плотности Это обстоятельство, на наш взгляд, может свидетельствовать об определенной роли диссоциации в расширении адаптивных свойств представителей вида ВТ

ВЫВОДЫ

1 Клеаки штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, различаются по способности колонизировать среду LB с 0,4% и 1,0% содержанием агара после обитания в жидкой среде Признак является штаммоспецифичным и определяется многообразием типов дифференциров-ки у клеток бактерий данного вида в разных условиях среды

2 Выявлено, что активная колонизация сред с низкой плотностью осуществляется штаммами Bacillus thuringiensis за счет движения клеток по типу плавания, которые мигрируют только по поверхности среды, или распространяются в ее толще А колонизация сред с высокой плотностью происходит благодаря роению групп клеток или за счет дифференцировки и роста в толще среды длинных нитевидных клеток

3 Впервые продемонстрировано, что клетки штаммов ВТ обладают системой хемотаксиса, которая может отличаться от систем патогенной спирохеты В burgdorferi и энтеробактерии Е coli

4 Клетки штаммов 49 ssp dendrolimus и 2002 ssp thuringiensis не реагировали на присутствие в среде инсектицидов и ряда нефтепродуктов, но, как и клетки других 8 штаммов Bacillus thuringiensis прореагировали на водные вытяжки из листьев разных растений Нейтральная реакция клеток Bacillus thuringiensii, на присутствие инсектицидов и нефтепродуктов не связана с ин-гибированием у них системы хемотаксиса

5 Водные вытяжки из хвои лиственницы, сосны, кедра, ели, и туи являлись репеллентами для клеток десяти исследованных штаммов Bacillus thuringiensis, реакция на листья 12 видов лиственных растений была неоднозначной При диссоциации может происходить смена реакции хемотаксиса у клеток всех исследованных штаммов

6 Показано, что для штаммов Bacillus thuringiensis характерна гетерогенность по стратегии колонизации сред с разной плотностью и хемотакси-ческой реакции, которая может увеличиваться в результате процесса диссоциации

Список работ по теме диссертации

1 Лебенко (Кравец) Е В Хемотаксис Bacillus thuringiensis в отношении водных экстрактов хвойных и лиственных растений /ЕВ Лебенко, О А Се-керина, В И Чемерилова // Экология Байкала и Прибайкалья Материалы Всероссийского научно-практического молодежного симпозиума Иркутск, 24-28 ноября 2001 г - Иркутск Иркут ун-т, 2001 -с 103-104

2 Лебенко (Кравец) Е В Хемотаксические реакции клеток Bacillus thuringiensis на некоторые соединения /ЕВ Лебенко, О А Секерина, В И Чемерилова // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование Материалы Межрегиональной научно-практической конференции, 2004 г , Иркутск - ИГУ, 2004 - с 37-38

3 Лебенко(Кравец) Е В Хемотаксис у двух природных изолятов Bacillus thuringiensis /ЕВ Лебенко, В И Чемерилова // Вестник Иркутского университета Специальный выпуск Материалы ежегодной научно-теоретической конференции молодых ученых — Иркутск Иркут ун-т, 2004 -с 15

4 Лебенко (Кравец) Е В Особенности хемотаксиса у диссоциативных S-и R-вариантов Bacillus thuringiensis /ЕВ Лебенко, О А Секерина, В И Чемерилова // Микробиология,- Москва Российская академия наук, 2005, том 75, №1, с 87-91

5 Lebenko (Kravets) Е V The Chemotactic Characteristics of the S and R Dissociants of Bacillus thuringiensis / E V Lebenko, О A Sekenna, V I Chem-erilova //Microbiology, vol 74, №1, 2005 pp 76-79

6 Чемерилова В И Диссоциация у Bacillus thuringiensis как проявление «мутагенеза стационарной фазы» / В И Чемерилова, О А Секерина, Е В Кравец, Л В Маланушенко // Экологическая генетика - 2006 - т 4, вып 1, с 28-36

7 Кравец Е В Возможные экологические последствия действия ряда инсектицидов на энтомопатогенные бациллы вида Bacillus thuringiensis /ЕВ Кравец, О В Извекова, В И Чемерилова // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых - Саратов, 2006 с 51

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кравец, Елена Владимировна

Введение.

1 .Обзор литературы.

1.1 .Биология вида Bacillus thuringiensis.

1.1.1 .История открытия, систематическое положение.

1.1.2.Морфологические, культуральные и биохимические свойства Bacillus thuringiensis.

1.1.3 .Спорообразование у Bacillus thuringiensis.

1.1.4.Биологически активные соединения, синтезируемые Bacillus thuringiensis.

1.2.Экология ВТ.

1.2.1 .Местообитание и распространение Bacillus thuringiensis.

1.2.2.Изменчивостьвида5асг7/щ thuringiensis: мутационная, рекомбинационная, диссоциативная.

1.2.3.Внутривидовое разнообразие вида Bacillus thuringiensis.

1.3 .Системы подвижности и хемотаксиса у прокариот.

2 .Материал и методы исследования.

2.1.Материал ы.

2.1.1 .Штаммы и условия культивирования.

2.1.2.Эффекторы для тестирования хемотаксиса.

2.2.Методы исследования подвижности и хемотаксиса.

2.2.1 .Метод исследования подвижности.

2.2.2.Метод вставки для исследования хемотаксиса.

2.2.2.1 .Приготовление вставок для исследования хемотаксиса.

2.3.Статистическая обработка результатов и фото-документирование.

3.Результаты и обсуждение.

3.1.Подбор условий для сравнительного изучения типов движения у штаммов Bacillus thuringiensis.

3.1.1.Влияние плотности среды и возраста культуры на характер колонизации.

3.1.2.Стабильность проявления реакции движения на средах с 0,3% и 0,4% содержанием агара.

3.1.3 .Гетерогенность популяции клеток штамма 49 по реакции движения.

3.2.Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis на среде с 0,4% содержанием агара.

3.3.Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis на среде с 1,0% содержанием агара.

3.4.Хемотакси

3.4.1 .Особенности проявления хемореакции у Bacillus thuringiensis.

3.4.2.Анализ хемоответа штаммов дикого типа, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, на разные эффекторы.

3.4.3.Характер хемоответа штаммов дикого типа на природные соединения.

3.5.Взаимоотношения между штаммами Bacillus thuringiensis на среде, содержащей 0,4% агара.

3.6.Особенности движения и хемотаксиса у диссоциативных

R-вариантов Bacillus thuringiensis.

3.6.1.Особенности движения диссоциантов на средах разной плотности.

3.6.2.Хемотаксис у диссоциативных вариантов, полученных от штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Колонизация сред разной плотности и хемотаксис у Bacillus thuringiensis"

Актуальность работы. Bacillus thuringiensis (ВТ) - хорошо известный вид энтомопатогенных спорообразующих бактерий, которые являются одним из естественных регуляторов численности насекомых и используются во всем мире в качестве биологических инсектицидов на протяжении более тридцати лет. Отличительной особенностью этого вида является формирование в бактериальной клетке в процессе споруляции белкового кристалла 5-эндотоксина. Признание ведущей роли этого токсина в гибели насекомых сфокусировало внимание большинства исследователей на данном признаке и обеспечило детальную изученность его молекулярной биологии, генетического контроля и механизма действия на личинок насекомых [Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты, 2001].

Намного меньше известно о других признаках этих бактерий, в частности, таких как подвижность и хемотаксис, имеющих первостепенное значение в обеспечении жизнеспособности и адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды. Исследований хемотаксиса у Bacillus thuringiensis ранее не проводилось, а сведения о системе подвижности клеток крайне бедны. Только в последние годы отмечается повышение интереса к функционированию жгутикового аппарата клеток Bacillus thuringiensis, несмотря на то, что его структура лежит в основе общепризнанной схемы внутривидовой идентификации штаммов данного вида [De Barjac, Frachon, 1990]. Такой интерес вызван появлением работ, указывающих, что экспортный аппарат жгутиков может быть одним из факторов вирулентности представителей вида Bacillus thuringiensis для личинок насекомых-хозяев [Ghelardi et al., 2002; Bouillaut et al., 2005; Ramarao, Lereclus, 2006].

Накопившиеся к настоящему времени сведения о том, что бактерии вида Bacillus thuringiensis могут быть причиной серьезных оппортунистических инфекций человека и животных [Hernandez et al., 1998, Salamitou, 2000], а также молекулярно-генетические доказательства их близкого родства с таким патогеном как Bacillus anthracis [Helgason et ah,

2000], выдвигают на первый план исследования поведения клеток Bacillus thuringiensis при взаимодействии с компонентами окружающей среды, которое обеспечивается системами подвижности и хемотаксиса. Эти системы хорошо изучены у Escherichia coli и Salmonella enterica serovar Typhimurium, а для представителей вида Bacillus thuringiensis, невзирая на всю их экономическую важность, вопрос до сих пор остается открытым.

Настоящее исследование является первым этапом в изучении особенностей поведения бактерий вида Bacillus thuringiensis.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучить особенности колонизации сред разной плотности и хемотаксические ответы на ряд химических соединений и смесей у диссоциативных S- и R-вариантов штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis.

В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Выявить особенности колонизации агаросодержащих сред разной плотности клетками штаммов 16-ти подвидов Bacillus thuringiensis.

2. Исследовать хемотаксические реакции штаммов разных подвидов на химические соединения антропогенного и природного происхождения.

3. Изучить подвижность и хемотаксис у морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации исходных штаммов.

Защищаемые положения:

1. Клетки штаммов Bacillus thuringiensis, различаются по способности и стратегии колонизации плотных сред после обитания в жидких средах.

2. Клетки штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis обладают хемотаксисом. Специфичность спектра аттрактантов и репеллентов для данных бацилл может отражать особенности их существования в природе.

3. Возникновение морфологических вариантов в процессе диссоциации увеличивает гетерогенность популяций Bacillus thuringiensis по подвижности и способности к хемоответу.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые экспериментально выявлена гетерогенность штаммов энтомопатогенного вида Bacillus thuringiensis по способности колонизировать среды с разной плотностью и различия в стратегии колонизации этих сред, проявляющейся в дифференцировке разных типов клеток. Впервые исследованы хемотаксические реакции на ряд эффекторов у клеток десяти штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis. Обнаружены качественные изменения в хемоответах клеток морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации природных штаммов.

Практическая значимость.

Разработана методика, позволяющая качественно и количественно оценивать особенности колонизации клетками бацилл сред разной плотности и исследовать их взаимоотношения между собой. Охарактеризованы коллекционные штаммы по подвижности на средах разной плотности и хемотаксису. Получена коллекция диссоциантов и мутантов, которая может быть использована для изучения генетического контроля процессов дифференцировки клеток бацилл при колонизации плотных сред и системы хемотаксиса.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены:

- на Всероссийских конференциях: «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 2001); «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004);

- Всероссийской школе по экологической генетике «Модификационная изменчивость в экологических взаимодействиях» (Санкт-Петербург, 2005);

- на III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006)

Основные положения диссертации представлены в статьях и тезисах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 в журнале из перечня ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала, методов исследования, изложения и обсуждения результатов экспериментов, выводов и приложений. Результаты работы проиллюстрированы 15 таблицами и 25 рисунками. Список использованной литературы включает 196 наименований отечественных и зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Кравец, Елена Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Клетки штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, различаются по способности колонизировать среду LB с 0,4% и 1,0% содержанием агара после обитания в жидкой среде. Признак является штаммоспецифичным и определяется многообразием типов дифференцировки у клеток бактерий данного вида в разных условиях среды.

2. Выявлено, что активная колонизация сред с низкой плотностью осуществляется штаммами Bacillus thuringiensis за счет движения клеток по типу плавания, которые мигрируют только по поверхности среды, или распространяются в ее толще. А колонизация сред с высокой плотностью происходит благодаря роению групп клеток или за счет дифференцировки и роста в толще среды длинных нитевидных клеток.

3. Впервые продемонстрировано, что клетки штаммов ВТ обладают системой хемотаксиса, которая может отличаться от систем патогенной спирохеты В. burgdorferi и энтеробактерии Е. coli.

4. Клетки штаммов 49 ssp. dendrolimus и 2002 ssp. thuringiensis не реагировали на присутствие в среде инсектицидов и ряда нефтепродуктов, но, как и клетки других 8 штаммов Bacillus thuringiensis прореагировали на водные вытяжки из листьев разных растений. Нейтральная реакция клеток Bacillus thuringiensis на присутствие инсектицидов и нефтепродуктов не связана с ингибированием у них системы хемотаксиса.

5. Водные вытяжки из хвои лиственницы, сосны, кедра, ели, и туи являлись репеллентами для клеток десяти исследованных штаммов Bacillus thuringiensis, реакция на листья 12 видов лиственных растений была неоднозначной. При диссоциации может происходить смена реакции хемотаксиса у клеток всех исследованных штаммов.

6. Показано, что для штаммов Bacillus thuringiensis характерна гетерогенность по стратегии колонизации сред с разной плотностью и хемотаксической реакции, которая может увеличиваться в результате процесса диссоциации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биологические инсектициды, основанные на споро-кристаллическом комплексе бактерии вида Bacillus thuringiensis, широко используются во всем мире для борьбы с листогрызущими насекомыми в течение многих лет. Благодаря удивительному свойству формирования белкового кристалла в процессе споруляции клетками этой бактерии, который оказался специфически токсичным для ряда насекомых-вредителей и безвредным для животных, внимание многочисленных исследователей было направлено только на изучение этого признака и поиска штаммов с высокой продуктивностью. Многие биологические свойства клеток вида ВТ, не связанные с синтезом эндотоксина и особенностями их размножения на экономически выгодных средах, остаются на сегодняшний день слабо изученными. Экологические аспекты существования данных бактерий в природе в основном ограничиваются вопросами продолжительности их циркуляции в биоценозах после внесения биоинсектицидов и сравнительно немногочисленными экспериментами по чувствительности клеток к воздействию тех или иных факторов среды. Как следует из обзора литературы, до сих пор нет ясности в происхождении и местообитании этих бацилл.

Тем не менее, как показано, бактерии вида встречаются повсеместно и являются представителями одного геновида с такими патогенами для человека как Bacillus anthracis [Helgason et al., 2000]. Накопившиеся данные о том, что помимо белкового 8-эндотоксина представители вида thuringiensis продуцируют различные факторы вирулентности [Estruch et al., 1996], сильно изменчивы и способны обмениваться генетической информацией с представителями других видов бактерий [Thomas, 2000], а также способны вызывать довольно серьезные заболевания и даже гибель животных [Hernandez et al., 1999], заставляют взглянуть на этот вид не только со стороны его полезности, но и как на потенциально опасного представителя микромира.

Одним из важных признаков для патогенных микроорганизмов является их способность активно распространяться, колонизируя среды обитания за счет движения и хемотаксиса. Можно считать, что наиболее полно эти процессы изучены у E.coli и Salmonella enterica serovar Thyphimirium. Крайне мало известно о движении и ничего не известно о хемотаксисе Bacillus thuringiensis. Известно, что в жидких средах бациллы данного вида подвижны благодаря перитрихиально расположенным жгутикам, но встречаются штаммы с неподвижными клетками (var. wuhanensis). На твердых средах бациллы могут формировать колонии ограниченного размера и разной морфологии [Бурцева, 1991]. Некоторый интерес к движению и жгутиковому аппарату ВТ возник после изоляции авирулентного плейотропного мутанта, утратившего одновременно гемолитическую активность и жгутики [Heierson et al., 1986]. Авторы предположили, что жгутики и подвижность у этого организма играют роль во взаимодействии паразит-хозяин. Дальнейшие исследования безжгутикового мутанта показали, что регуляция генов, кодирующих жгутиковые компоненты и вирулентность, может быть скоординирована [Zhang et al., 1993], и что за координацию движения и вирулентности отвечает ген flhA, который играет критическую роль в экспорте флагеллина и других белков через секреторный аппарат жгутиков III типа у Salmonella. Как было показано в дальнейшем, продукты этого гена также необходимы для дифференцировки клеток ВТ в роящиеся клетки-швармеры, но иерархия в экспрессии генов, отвечающих за жгутики и подвижность отличается от описанной для Bacillus subtilis и энтеробактерий [Ghelardi et al., 2002, Bouillaut et al., 2005].

Проведенное нами исследование расширило представление о возможных стратегиях в колонизации сред разной плотности клетками штаммов ВТ, а обнаружение хемотаксических ответов на растительные экстракты, свидетельствует о наличии рецепторов, которые, возможно, сформировались в процессе существования клеток вида в соответствующих условиях обитания.

Ранее только для клеток одного штамма ВТ, принадлежащего к серотипу Н1, было показано, что они могут двигаться по типу плавания в среде с 0,25 и 0,3% содержанием агара, а на среде с 0,45 % и более (оптимум 1,0% агара) осуществляют движение по типу роения [ОЪекгсН е1 а1., 2002]. Мы расширили спектр исследуемых подвидов и обнаружили еще один тип дифференцировки клеток и способ колонизации как сред с низкой плотностью, так и плотных сред. Было показано, что клетки ВТ в ответ на изменение плотности субстрата способны к дифференцировке в различные морфологические формы: короткие палочки, удлиненные швармеры или длинные нитевидные клетки, которые могут существовать как на поверхности среды, так и в ее толще. В среде с 0,4% содержанием агара клетки некоторых штаммов способны были передвигаться, как и в жидкой среде, благодаря движению по типу «плавание». Роения на этой среде не наблюдали. Неожиданным было распространение некоторых штаммов ВТ по полужидкой среде не за счет активного плавания, а за счет формирования микроколоний - тип распространения, описанный: недавно у АгояртИит ЬгазИете, микроорганизма, ассоциативного с растениями [Шелудько и др., 2006]. Такой тип колонизации, хотя и медленный, но, по-видимому, имеет преимущество по сравнению с плаванием, так как в экспериментах, направленных на выявление взаимоотношений штаммов друг с другом на среде с 0,4% агара, клоны, образующие микроколонии, подавляли распространение «плавающих» штаммов. Можно полагать, что, встречаясь в природе с подобными условиями, например, слизистым слоем эпителиальных клеток или других поверхностей, данные штаммы будут эффективно колонизировать субстрат, тем более что они предпочитают располагаться в толще среды.

Эффективная колонизация плотных сред осуществлялась клетками большинства изученных штаммов за счет дифференцировки в длинные нитевидные клетки, которые двигались по типу роения. Как было показано, роение является жгутико-управляемой формой подвижности, используемой многими бактериями для совместной колонизации твердых поверхностей [Harshey, 1994]. Роящиеся клетки отличаются от плавающих большим количеством жгутиков, которые являются одним из факторов лучшей адгезии и вирулентности клеток [Ramarao, Lereclus, 2006]. Исследованные нами клоны отличались по интенсивности формирования и продвижения клеток-швармеров по субстрату, признак был штаммоспецифичным. Выделенный нами тип 2а формировал длинные нити, но продвижение по плотной среде было незначительным. Штаммы, способные формировать швармеры типа 26 активно колонизировали поверхность среды. Связь между роением и вирулентностью, установленная в основном на грамотрицательных бактериях, но и подтверждаемая для ВТ [Ghelardi et al., 2002, Bouillaut et al., 2005], позволяет предполагать, что штаммы с 26 типом роения будут более вирулентными для насекомых.

В своем исследовании мы столкнулись еще с одним типом колонизации плотной среды, ранее не отмеченным у Bacillus thuringiensis. Мицелиеподобный рост и образование ризоидных колоний описаны для вида Bacillus mycoides [Di Franco et al., 2002], близкого родственника вида ВТ. Отличительная особенность наблюдаемого нами заключалась в дифференцировке длинных нитевидных клеток, глубоко проникающих в среду. Как правило, такой тип дифференцировки был характерен для клонов, распространяющихся по полужидкой среде с помощью микроколоний. Мы отметили, что нитевидные клетки способны формировать 8 из 19 исследованных штаммов ВТ, причем, например, у штаммов 2-1 ssp. galleriae и 4кс ssp alesti выявили способность к дифференцировке в клетки подобной морфологии, тогда как у штаммов 1000 и 741, относящихся к этим же подвидам, соответственно, подобной картины не наблюдалось. Отсюда следует, что такой тип дифференцировки не связан с серотипом (т.е. жгутиковым антигеном), а является штаммоспецифичным и, по-видимому, определяется отношением клеток к кислороду. Именно способ посева клеток, который мы применили (укол), по-видимому, позволил обнаружить нам новые способы колонизации сред разной плотности клетками некоторых штаммов ВТ.

Нитевидные клетки, проникающие глубоко в субстрат, возможно медленно, но более эффективно будут колонизировать ткани насекомого-хозяина, не только за счет их лучших адгезивных свойств, но и благодаря возможности распространяться в анаэробных условиях тканей насекомого. Субстратом для них могут быть, например, и листья растений - основной компонент питания насекомых-хозяев. Такие клетки могут поселяться не только на поверхности листовой пластинки, но и проникать в нее через устьица и ранки. Косвенным свидетельством того, что листья растений могут быть одним из мест обитания ВТ в природе, могут быть полученные нами результаты исследования реакций клеток ВТ на экстракты из хвои и листьев разных видов растений. Клетки ВТ десяти изученных штаммов не реагировали на присутствие веществ антропогенного происхождения, таких как инсектициды, нефтепродукты и препарат «Гумат-80», но все прореагировали на экстракты из листьев растений. Причем, как было нами показано, инсектициды и нефтепродукты не ингибировали хеморецепторы бактерий. Все экстракты из листьев хвойных оказались для клеток ВТ разных подвидов репеллентами. Возможно, этим можно объяснить редкую встречаемость клеток ВТ на хвойных деревьях даже в местах эпизоотий насекомых [Ходырев, 2004]. Клетки исследованных штаммов по-разному прореагировали на экстракты из листьев двенадцати лиственных растений, отличаясь индивидуальными особенностями. Универсальными репеллентами для них были экстракты из листьев барбариса и черемухи, а аттрактантом -ирги. Исходя из низкой встречаемости бацилл на листьях хвойных, можно думать, что на растениях ирги клетки бацилл исследованных подвидов будут встречаться чаще, чем на листьях барбариса и черемухи.

Наконец, можно отметить общую гетерогенность по всем проанализированным признакам, выявленную для всех исследованных штаммов ВТ. Такая гетерогенность отмечается многими исследователями ВТ, и, как правило, любой штамм характеризуется индивидуальным сочетанием признаков. Это было характерно и для структур жгутикового флагеллина [Xu, Cote, 2006] и адгезивных свойств клеток-швармеров [Ramarao, Lereclus, 2006], а также проявилось в нашем исследовании относительно способности колонизировать среды разной плотности и хемотаксических реакций. Как было продемонстрировано в данном исследовании, одним из факторов, увеличивающих гетерогенность популяций ВТ, может быть процесс диссоциации, при котором клетки одного и того же клона способны изменить стратегию колонизации среды или поменять предпочитаемый субстрат.

Хочется надеяться, что полученные нами данные будут положены в основу дальнейших более глубоких/исследований, которые помогут познать особенности существования клеток ВТ в природных условиях и их адаптивных возможностях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кравец, Елена Владимировна, Иркутск

1. Азизбекян P.P. Нестабильность некоторых ауксотрофных маркеров у Bacillus thuringiensis / P.P.Азизбекян, P.A. Белых // Генетика. 1981. - Т. 17, №11.-С. 1936-1944.

2. Азизбекян P.P. Микробные инсектициды: достижения и перспективы / Р.Р.Азизбекян // Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. -М.: Наука,1990. С. 172 - 185.

3. Азизов И.С. Микробиологические аспекты применения импульсного электрического разряда у больных эпиемой плевры: автореф. дис. канд. мед. наук: 03.00.07 /И.С.Азизов. Акмола, 1997. - 20 с.

4. Ануфриев Л.Ф. К вопросу о диссоциации в культуре ВТ var. dendrolimus Talalaev. в жидких и твердых питательных средах // Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве. Иркутск, 1979. -С. 118-121.

5. Африкян Э.К. Новая разновидность спорообразующих бактерий-продуцентов энтомоцидных токсинов / Э.К. Африкян, JI.A. Чил-Акопян // ДАН Арм. ССР. 1968. - Т. 47, №4. - С. 227-230.

6. Бациллы. Генетика и биотехнология: Пер. с англ./ Под ред. К. Харвуда. -М.: Мир, 1992.- 531с.

7. Белых P.A. Антибиотикочувствительность штаммов Bacillus thuringiensis var. galleriae / P.A. Белых, Т.А. Смирнова, T.B. Степанова, P.P. Азизбекян // Микробиология. 1982. - Т. 51, №3. - С. 490-496.

8. Богданова Т.JI. Генетические свойства безжгутикового мутанта Bacillus thuringiensis / T.JI. Богданова, Т.А. Смирнова, И.Б. Миненкова, P.P. Азизбекян М.: ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. - 1991. - С. 29-31.

9. Брезгунов В.Н. Хемотаксис бактерий / В.Н. Брезгунов, Л.Ю. Завальский, A.B. Лазарев // Успехи микробиологии. 1989. - Т. 23. - С. 3-28.

10. Бурцева Л.И. Селекция промышленных штаммов кристаллообразующих бактерий для производства энтомопатогенных препаратов / Л.И. Бурцева // Biotecnology&Bioecology. 1991. - №5. - С. 4-5.

11. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola) в Камчатской области / О.Ф. Вятчина// Сибирский экологический журнал. 2004. - №4. - С. 501-506.

12. Головлев Е.Л. Метастабильность фенотипа у бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67, №2. - С. 149-155.

13. Гриценко И.Н. Частота выделения из природы Bacillus thuringiensis var. galleriae / И.Н. Гриценко, М.Я. Соколова, Н.Е. Черепанова, Е.В. Юдина // Генетика и селекция микроорганизмов. Новосибирск. 1975. - Т. 25. - С. 106-109.

14. Громов Б.В. Поведение бактерий / Б.В. Громов // Соросовский образовательный журнал. 1997. - №6. - С. 28-32.

15. Дедондер Р. Контроль выражения генов в процессе спорообразования у ВТ / Р. Дедондер, М. Лекадет, Г. Раппопорт и другие // Молекулярные основы генетических процессов. М.: Наука, 1981.- С. 338-349.

16. Добрица А.П. Разработка биопестицидов против колорадского жука / А.П. Добрица, Н.Г. Корецкая, В.И. Гайтан и др. // Рос. Хим. Ж. (Ж. Рос. Хим. Об-ва им. Д.И. Менделеева). 2001. - Т. XLV, № 5-6. - С. 174-184.

17. Ермилова Е.В. Подвижность и поведение микроорганизмов. В 2 томах. Т.1. Прокариоты. / Е.В. Ермилова, Ж.М. Залуцкая, Т.В. Лапина СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2004. - 192 с.

18. Завальский Л.Ю. Хемотаксис бактерий / Л.Ю. Завальский // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т. 7, №9. - С. 23-29.

19. Завальский Л.Ю., Марченко А.И., Боровик Р.В. Изучение хемотаксиса бактерий к нафталину / Л.Ю. Завальский, А.И. Марченко, Р.В. Боровик // Микробиология. 2003. - Т. 72, №3. - С. 407-413

20. Захаров И.С. Качество воды качество жизни / И.С. Захаров, A.B. Пожаров, Н.И. Папутская // Мониторинг. - 1995. - №1. - С. 39-42.

21. Ивенскене В.Л. Фосфокиназа и термолабильный экзотоксин ВТ / В.Л. Ивенскене // Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. -1987.-С. 55-75

22. Кацы Е.И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий / Е.И. Кацы // Успехи современной биологии. 1996. - Т. 116, вып.5. - С. 579-582.

23. Коппел X. Биологическое подавление вредных насекомых / X. Коппел, Д. Мартине М.: Мир, 1980. - 480с.

24. Коротяев А.И. Медицинская иммунология и вирусология / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев //Учебник. СПб: «Специальная литература», 1998. 592 с.

25. Краткий определитель бактерий Берги / ред. Дж. Хонлт. М: Мир, 1980. -495 с.

26. Кузин А.И. Фаготипирование Bacillus thuringiensis / А.И. Кузин, K.P. Азизбекян // Биотехнология. 1995. - №3. - С. 7-10.

27. Лескова А.Я. Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений /

28. A.Я. Лескова, Л.М. Рыбина Новосибирск, 1987. - С. 31-42.

29. Милько Е.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации / Е.С. Милько, Н.С. Егоров М.: Изд-во МГУ, 1991. - 144 с.

30. Миненкова И.Б. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных в различных климато-географических регионах России / И.Б. Миненкова, Т.М. Григорьева, Л.А. Ганушкина, Е.М. Шагов, P.P. Азизбекян // Биотехнология.-2002.-Т. 6.-С. 11-16.

31. Неудачина Э.И. Патогенность ß-экзотоксина для насекомых / Э.И. Неудачина // Использование микроорганизмов в сельском и лесном хозяйстве. Иркутск, 1979. - С. 49-55.

32. Осадчая А.И. Рост и развитие продуцента бактокулицида в зависимости от pH среды / А.И. Осадчая, B.C. Подгорский, С.Ф. Прокопченко, Н.В. Михновская и др. // Микробиология. 1999. - Т. 52, №1. - С. 24-27.

33. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред.

34. B.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001. - 736 с.

35. Погосбекова М.Р. Трансдукция у Bacillus thuringiensis / М.Р. Погосбекова, P.P. Азизбекян//Генетика, 1981.-Т. 17, №4.-С. 609-613.

36. Пожаров A.B. Использование эспресс-биотестирования для оценки антропоэкологической ситуации / A.B. Пожаров, С.А. Шелемотов // Экология (РАН). 1992. - №2. - С. 94-95.

37. Прозоров A.A. Рекомбинантные перестройки генома бактерий и адаптация к среде обитания / A.A. Прозоров // Микробиология. 2001. - Т. 70,№5.-С. 581-594.

38. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика / П.Ф. Рокицкий 3-е изд., испр. -Минск: Вышэйш. школа, 1973. - 320 с.

39. Секерина O.A. Эколого-генетический анализ диссоциативной изменчивости у Bacillus thuringiensis: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.16 / O.A. Секерина. Иркутск, 2003. - 19 с.

40. Цыганкова C.B. Получение внутрипопуляционных диссоциантов некоторых бацилл и применение метода DIR-ПЦР для их идентификации / C.B. Цыганкова, Е.С. Булыгина, Б.Б. Кузнецов и др. // Микробиология. -2004.-Т. 73, №3,-С. 398-405.

41. Чемерилова В.И. Диссоциация у Bacillus thuringiensis как проявление «мутагенеза стационарной фазы» / В.И. Чемерилова, O.A. Секерина, Е.В. Кравец, JI.B. Маланушенко // Экологическая генетика. 2006. - Т.4, вып.1. -С. 28-36.

42. Честухина Г.Г. Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ Bacillus thuringiensis: автореф. дис. д-ра. биол. наук / Г.Г. Честухина М., 1990. - 53 с.

43. Чуйко Н.В. Хемотаксис Bradyrhizobium japonicum к различным органическим соединениям / Н.В. Чуйко, Т.С. Антонюк, И.К. Курдиш // Микробиология. 2002. - Т. 71, №4. - С. 460-466.

44. Чуйко Н.В. Хемотаксисные свойства Bradyrhizobium japonicum в присутствии природных высокодисперсных материалов / Н.В. Чуйко, И.К. Курдиш // Микробиология. 2004. - Т. 73, №3. - С. 364-367.

45. Шамшина Т.Н. Внеклеточный фактор Bacillus thuringiensis, подавляющий спорообразование / Т.Н. Шамшина, Г.Е. Константинова, Н.И. Кузнецова, P.P. Азизбекян // Биотехнология. 1994. - №5. - С. 11-13.

46. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель Пер. с нем. - М.: Мир, 1987.-567 с.

47. Штерншис М.В. Историческая справка / М.В. Штерншис, И.В. Исси, Э.Г. Воронина, В.В. Глупов / Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год. - 2001. С.5-20.

48. Экология микроорганизмов: учеб. для студ. вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.А. Горленко и др.; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.

49. Adams I.C. Longevity of Bacillus thuringiensis Berliner in the rumen / I.C. Adams, P.A. Hartman // J. Invert. Patol. 1965. - V. 2. - P. 245-247.

50. Adang M.J. The reconstruction and expression of a Bacillus thuringiensis crylllA gene in protoplasts and potato plants / M.J. Adang, M.S. Brody, G. Cardineaus, N. Eagan, R.T. Roush, et al. II Plant. Mol. Biol. 1993. - V. 21. - P. 1131-1145.

51. Addison J.A. Persistence and non-target effects of Bacillus thuringiensis in soil: a review / J.A. Addison // Can. J. For. Res. 1993. - V. 23. - P. 2329-2342.

52. Agaisse H. How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein? / H. Agaisse, D. Lereclus // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - P. 6027-6032.

53. Aizawa S.-I. Signaling components in bacterial locomotion and sensory reception / S.-I. Aizawa, C.S. Harwood, R.J. Kadner // J. Microbiol. 2000. - V. 182.-P. 1459-1471.

54. Akiba Y. Microbial ecological studies on Bacillus thuringiensis II. Dynamics of B. thuringiensis in sterilized soil / Y. Akiba, Y. Sikijima, K. Atzawa, N. Fujiyoshi // Japanese J. Appl. Entomol. Zool. 1977. - V. 21. - P. 41-46.

55. Alberti L. Differentiation of Serratia marcescens 274 into swimmer and swarmer cells / L. Alberti, R.M. Harshey // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 14322-14328.

56. Andreev J. Chemotaxis, sporulation, and larvicide production in Bacillus sphaericus 2362. The influence of L-ethionine, and of aminophenylboronic acid / J. Andreev, P.A. Dibrov, D. Klein, S. Braun // FEBS Lett. 1994. - №2-3. - C. 231-234.

57. Armitage J.P. Bacterial chemotaxis: Rhodobacter sphaeroides and Sinorhizobium meliloti variations on a theme? / J.P. Armitage, R. Schmitt // Microbiology. - 1997. -V. 143. - P. 3671-3682.

58. Aronson A.I., Shai Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action / A.I. Aronson, Y. Shai // FEMS Microbiology Letters.-2001.-V. 195, №1.-P. 1-8.

59. Atlavinyte O. Effects of entobacterin on earthworm activity / O. Atlavinyte, A. Galvelis, J. Daciulyte, A. Lugauskas // Pedobiologia. 1982. - V. 23. - P. 372379.

60. Barry J.W. Predicting and measuring drift of Bacillus thuringiensis sprays / J.W.Barry, etal. //Environ. Toxicol. Chem. 1993. - V. 12.-P. 1977-1989.

61. Baum J.A. Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis / J.A. Baum, T. Malvar // Mol. Microbiol. 1995. - V. 18. - P. 1-12.

62. Beegle C.C. Invitation paper (C.P. Alexander Fund): History of Bacillus thuringiensis Berliner research and development / C.C. Beegle, T. Yamamoto // Can. Entomol. 1992. -V. 124. - P. 587-616.

63. Belas R. Characterization of Proteus mirabilis precocious swarming mutants: identification of rsbA, encoding a regulator of swarming behavior / R. Belas, R. Schneider, M. Melch // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 6126-6139.

64. Berg H.C. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking / H.C. Berg, D.A. Brown // Nature. 1972. - V. 239. - P. 500-504.

65. Bernhard K. Natural isolates of Bacillus thuringiensis: worldwide distribution, characterization, and activity against insect pests / K. Bernhard, P. Jarrett, M. Meadows, J. Butt, D.J. Ellis, et al. // J. Invertebr. Pathol. 1997. - V. 70. - P. 59

66. Bibikov S.I. A signal transducer for aerotaxis in Escherichia coli / S.I. Bibikov, R. Biran, K.E. Rudd, J.S. Parkinson // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 40754079.

67. Blair D.F. How bacteria sense and swim / D.F. Blair // Annu. Rev. Microbiol. -1995.-V. 49.-P. 489-522

68. Bourret R.B. Molecular information processing: lessons from bacterial chemotaxis / R.B. Bourret, A.M. Stocks // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 9625-9628.

69. Carlson C.R. Genotypic diversity among B. cereus and B. thuringiensis strainse / C.R. Carlson, D. A. Caugant, and A.-B. Kolst0. // Appl. Environ. Microbiol. -1994.-V. 60, №6.-P. 1719-1725.

70. Chaufaux J. Investigation of natural strains of Bacillus thuringiensis in different biotopes throughout the world / J. Chaufaux, M. Marchal, N. Gilois, Jehanno, and C. Buisson // Can. J. Microbiol. 1997. - V. 43. - P. 337-343.

71. Crickmore N. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins / N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, et al. // Microbiol and Molec. Biology Reviews. 1998. - V. 62. - P. 807-813.

72. De Barjac H. Essey de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B. thuringiensis / H. De Barjac, A. Bonnefoi // Entomophaga. -1962.-V. 7, №1. P. 5-31.

73. De Barjac H. Classification of Bacillus thuringiensis strains / H. De Barjac, E. Frachon // Entomophaga. 1990. - V. 35, №2. - P. 233-240.

74. DeLucca A.J.I. Bacillus thuringiensis distribution in soils of United States / A.J.I. DeLucca, J.G. Simonson, A.D. Larson // Can. J. Microbiol. 1981. - V. 27. -P. 865-870.

75. Di Franco C. Colony shape as a genetic trait in the pattern-forming Bacillus mycoides / C. Di Franco et al. II BMC Microbiol. 2002. - V.2, № 1. - P. 33.

76. Drobniewski F.A. A review: the safety of Bacillus species as insect vector control / F.A. Drobniewski // J. Bacteriol. 1994. - V. 76. - P. 101-109.

77. Dulmage H.D. Distribution of Bacillus thuringiensis in nature / H.D. Dulmage, K. Aizawa // Microbial and Viral Pesticides (ed. Kurstak E.D.). New-York. 1982. -P. 209-239.

78. Dunny G. Cell-cell communication in gram-positive bacteria / G. Dunny, B.A. Leonard // Ann. Rev. Microbiol. 1997. V. 51. - P. 527-564.

79. Edwards D.L. Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes / D.L. Edwards, J. Payne, G.G. Soares // Mycogen. Corp. N 84653: Заявл. 12.08.87. Опубл. 14.08.90. Пат. 4948734 США МКИС 12R 1/07.

80. Eskils К. Release of Bacillus thuringiensis subsp.israelensis in Swedish soil / K. Eskils, A. Lovgren // FBMS Microbiol. Ecol. 1997. - V. 23, №2. - P. 115117.

81. Estruch J.J. Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects / J.J.

82. Estruch, G.W. Warren, M.A. Mullins, G.J. Nye, et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 5389-5394.

83. Fedhila S. Distinct clpP genes control specific adaptive responses in Bacillus thuringiensis / S. Fedhila, T. Msdadek, P. Nel, D. Lereclus // Journal of Bacteriology. -2002. -V. 184, №20. P. 5554-5562.

84. Gominet M. Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence / M. Gominet , L. Slamti, N. Gilois, M. Rose, D. Lereclus // Mol Microbiol. 2001. - V. 40, №4. - P. 63-75.

85. Grebe T.W. Bacterial chemotaxis: the five sensors of a bacterium / T.W. Grebe, J. Stock//Curr. Biol. 1998.-V. 8.-P. 154-157.

86. Greek M. Analysis of chemotaxis operon in Rhizobium meliloti / M. Greek, J. Platzer, V. Sourjik, R. Schmitt // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 989-1000.

87. Grochulski P. Bacillus thuringiensis CrylAa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation / P. Grochulski, L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey,

88. J.-L. Schwartz, R. Brousseau, M. Cygler // Journal of Molecular Biology. 1995. -V. 254.-P. 447-464.

89. Hanny C.L. The dissociation of Bacillus thuringiensis / C.L. Hanny // Journal of Microbiology. 1967. - V. 13.-P. 1566-1568.

90. Harshey R.M. Dimorphic transition in Escherichia coli and Salmonella typhimurium surface-induced differentiation into hyperflagellate swarmer cells / R.M. Harshey, T. Matsuyama // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V. 91. - P. 86318635.

91. Heierson A. Bacteriophage-resistant mutants of Bacillus thuringiensis with decreased virulence in pupae of Hyalophora cecropia / A. Heierson, I. Siden, A. Kivaisi, H.G. Boman // J. Bacteriol. 1986. - V. 167. - P. 18-24.

92. Heimpel A.M. A taxonomic key proposed for the species of the crystalliferous bacteria / A.M. Heimpel // J. Invert. Patol. 1967. - V. 9. - P. 364-375.

93. Helgason E. Genetic structure of population of Bacillus cereus and B. thuringiensis isolates associated with periodontitis and other human infections / E. Helgason, D.A. Caugant, I. Olsen // J. Clin. Microbiol. 2000. - P. 1615-1622.

94. Helgason E. Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis -One species on the Basis of Genetic Evidence / E. Helgason, D.A. Caugant, H.A. Sohansen, A. Fouet, et al. II Applied And Environmenta Microbiology. 2000. -P. 2627-2630.

95. Hoch J. Two-component signal transduction / J. Hoch, T. Silhavy // ASM Press, Washington, D.C. 1995. - 488 p.

96. Hofmann C. Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brash-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae) / C. Hofmann, P. Luthy, R. Hufter, V. Pliska // Eur. J. Biochem. 1988. -V. 173.-P. 85-91.

97. Hoti S.L. Changes in the populations of Bacillus thuringiensis H- and Bacillus sphaericus applied to vector breeding sites / S.L. Hoti, K. Balaraman // The Environmentalist. 1991.-V. 11, №1.-P. 39-44.

98. Huang Y. Field study of the persisting effect of Bacillus thuringiensis in citrus groves / Y. Huang, R. Huang //Chinese J.Biological Control. 1990. - V. 6, №3. -P.131-133.

99. Jasuja R. Response tuning in bacterial chemotaxis / R. Jasuja, Yu-Lin, D.R. Trentham, S. Khan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - P. 1134611351.

100. Jenkins J. Environmental toxicology and chemistry memo. Subject: B.t. / J. Jenkins // Corvallis Q.R. Oregon State University Extension Service. 1992.

101. Johnson K.S. Toxicity of Bacillus thuringiensis var. kurstaki to three nontarget Lepidoptera in field studies / K.S. Johnson, J.M. Scriber, J.K. Nitao, D.R. Smitly // Environ. Entomol. 1995. - V. 24. - P. 288-297.

102. Jones C.J. The bacterial flagellum and flagellar motor: structure, assembly and function / C.J. Jones, S.-I. Aizawa // Adv. Microb. Physiol. 1991. - V. 32. - P. 109-172.

103. Joung K.-B. A review of the environmental impacts of the microbial insecticide Bacillus thuringiensis / K.-B. Joung, J.C. Cote // Technical Bulletin 2000.-№29.-27 p.

104. Joung K.-B. A phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis serovars by RFLP based ribotyping / K.-B. Joung, J.C. Cote // Journal of Applied Microbiology. - 2001. - V. 91. - P. 279-289.

105. Kirby J.R. Che Y-dependent methylation of the asparagine receptor, Mcp B, during chemotaxis in Bacillus subtilis / J.R. Kirby, M. M. Saulmon, C.J. Kristich, and G.W. Ordal // The Journal of Biological chemistry. 1999. - P. 11092-11100.

106. Krieg A. Photoprotection against inactivation of Bacillus thuringiensis spores by ultraviolet rays / A. Krieg // J. Invertebr. Pathol. 1975. - V. 25 - P. 267-268.

107. Krieg A. Susceptibility of arthropod species to Bacillus thuringiensis / A. Krieg, G.A. Langenbruch // Microbial control of pests and plant diseases, 19701980 (ed. H.D. Burges). Academic Press, New York. 1981. - P. 837-896.

108. Krieg A. Bekämpfung von insekten im Pflanzenschutz mit Bacillus thuringiensis/ A. Krieg // Umweltschutz. 1983. - V. 56, №3. -P.41-52.

109. Krieg A. Bacillus thuringiensis var. telebrionis: ein neuer gegenüber larven von Coleopteren wirksamer / A. Krieg, A.M. Huger, G.A. Langenbruch, and W. Schnetter // Pathotyp. Z. Ang. Entomol. 1983. - V. 96 - P. 500-508.

110. Kumar P.A. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis. / P.A. Kumar, R.P. Sharma, V.S. Malik //Advances in Applied Microbiology. 1997. - V. 42. -P. 1-43.

111. Lacey L.A. Current developments in microbial control of insect pests and prospects for the early 21 century / L.A. Lacey, M.S. Goettel // Entomophaga. -1995.-V. 40, №1.-P. 3-27.

112. Lambert B. Insecticidal promise of Bacillus thuringiensis / B. Lambert, M. Perferoen // Bioscience. 1992. - V. 42. - P. 112-122.

113. Leong K.L.H. Factors affecting Bacillus thuringiensis total field persistence / K.L.H. Leong, R.J. Cano, A.M. Kubinski // Environ. Entomol. 1980. - V. 9, №5. -P. 593-599.

114. Lereclus D. Genetigue et biologie molecuiaire de Bacillus thuringiensis / D. Lereclus // Bull. Inst. Pasteuer. 1989. - V. 86. - P. 337-371.

115. Lereclus D. Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes. In: Bacillus thuringiensis, an Environmental Biopesticide: theory and practice / D. Lereclus, A. Delecluse, and M.-M. Lecadet Wiley, New York, 1993. - P. 37-69.

116. Liu Z.-X. Negative Chemotaxis in Cytophaga johnsonae / Z.-X. Liu, I. Fridovich // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42, №5. - P. 515-518.

117. Lovgren A. Molecular characterization of immune inhibitor A, a secreted virulence protease from Bacillus thuringiensis / A. Lovgren, M.-Y. Zhang, A.

118. Engstrom, G. Dalhammar, R. Landen // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 21372146.

119. Mahillon J. IS231 and other Bacillus thuringiensis transposable elements: a review / J. Mahillon, R. Rezsohazy, B. Hallet, J. Delcour // Genetica. 1994. - V. 93.-P. 13-26.

120. Martin P.A.V. World-wide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates / P.A.V. Martin, R.S. Travers //Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55, № 10.-P. 2437-2442.

121. Martin W.F. Bacillus thuringiensis persistence and movement in field crops / W.F. Martin, C.F. Reichelderfer // Proceedings and Abstracts; Society for Invertebrate Pathology XXII Annual meeting, Univ. Maryland, USA, 20-24 August, 1989.-P. 25.

122. Matsunaga T. Molecular mechanism of magnet formation in bacteria / T. Matsunaga, T. Sakaguguchi // J. Biosci. Bioengin. 2000. - V. 90. - P. 1-13.

123. McLeod P.J. Persistence of Bacillus thuringiensis on second year loblolly pine cones / P.J. McLeod, W.C. Yearian, S.Y. Young // Environ. Entomol. 1983. - V. 12. - P. 1190-1192.

124. Menon A.S. Survival of Bacillus thuringiensis var. kurstaki in waters / A.S. Menon, J. De Mestral // Water, Air, and Soil Pollution. 1985. - V. 25. - P. 265274.

125. Miller J.C. Field assessment of the effects of a microbial pest control agent on non-target Lepidoptera / J.C. Miller // Am. Entomol. 1990. - V. 36. - P. 135-139.

126. Mireles J.R. II. Salmonela enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation / J.R. II Mireles, A. Toguchi, R.M. Harshey // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 58485854.

127. Navon A. Control of lepidopteran pests with Bacillus thuringiensis / A. Navon / Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theory and practice (ed. P.F. Entwistle, J.S. Cory, MJ. Bailey, S.Higgs). Wiley, New York, 1993. P. 125146.

128. Ohana B. Fate of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis simulated field conditions / B. Ohana, J. Margalit, Z. Barak //Appl. Environ. Microbiol. 1987. -V. 57, № 4. - P. 828-831.

129. Ohba M. A new subspecies of Bacillus thuringiensis isolated in Japan: Bacillus thuringiensis subsp. tohokuensis (serotype 17) / M. Ohba, K. Aizawa // J. Invert. Pathol. 1981. - V. 37, №2. - P. 307-309.

130. Otvos I.S. Environmental report and current status of Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Use for control of forest and agricultural insect pests / I.S. Otvos, S. Vanderveen // British Columbia Forestry Canada Rep. 1993. - 36 p.

131. Perlak F.J. Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles / F.J. Perlak, T.B. Stone, Y.M. Muscopf, L.J. Petersen, G.B. Parker, et al. II Plant. Mol. Biol. 1993. - V. 22. - P. 313-321.

132. Petras S.F. Survival of Bacillus thuringiensis spores in soil / S.F. Petras, L.E. Casida//Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 50.-P. 1496-1501.

133. Pinnock D.E. The field persistence of Bacillus thuringiensis spores / D.E. Pinnock, J.R. Brand, J.E. Milstead // J. Invertebr. Pathol. V. 18. - P. 405-411.

134. Porter S.L. The third chemotaxis locus of Rhodobacter sphaeroides is essential for chemotaxis / S.L. Porter, A.V. Warren, A.C. Martin, J.P. Armitage // Mol. Microbiol. 2002. -V. 46. - P. 1081-1094.

135. Prevot A.R. Traite de systematique bacterienne / A.R. Prevot Paris, 1961.-931. P

136. Pruett C.J.H. Effect of exposure to soil on potency and spore viability of Bacillus thuringiensis / C.J.H. Pruett, H.D. Burges, C.H. Wyborn // J. Invertebr. Pathol. 1980. - V. 30. - P. 168-174.

137. Rajamohan F. In: Progress in nucleic research and molecular biology / F. Rajamohan, M.K. Lee, D.H. Dean New York, Academic Press, 1998. - V. 60. -P. 1-27.

138. Ramarao N. Adhesion and cytotoxicity of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis to epithelial cells are FihA and PlcR dependent, respectively / N. Ramarao, D. Lereclus // Microbes Infect. 2006. - Vol. 8, №6. - P. 1483-1491.

139. Reardon R.C. Efficacy and field persistence of Bacillus thuringiensis after ground application to Balsam fir and white spruce in Wisconsin / R.C. Reardon, K. Haissig // Can. Ent. 1984. - V. 116. - P. 153-158.

140. Rosario M.M. Chemotaxis in Bacillus subtilis requires either of two functionally redundant CheW homologs / M.M. Rosario, K.L. Fredrick, G.W. Ordal, J.D. Helmann // J. Bacterid. 1994. - V. 176. - P. 2736-2739.

141. Rubicas J. Crystal protein formed by Bacillus subtilis cells / J. Rubicas, D. Androsiuniene, G. Chestukina, T. Smirnova, O. Kapitonova, V. Stepanov // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 5258-5262.

142. Sachidanandham R. Formation of spontaneous asporogenic varians of Bacillus thuringiensis subsp. galleriae in continious cultures / R. Sachidanandham, N. Jayaraman, M. Kunthala // Applied Microbiology and Biotechnology. 1993. - V. 40,№4.-P. 504-507.

143. Salamitou S. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects / S. Salamitou, F. Ramisse, M. Brehelin, D. Bourguet // Microbiol. 2000. - V.146. - P. 2825-2832.

144. Saleh S.M. Fate of Bacillus thuringiensis in soil: effect of soil pH and organic amendment / S.M. Saleh, R.F. Harris, O.N. Allen // Can. J. Microbiol. 1970. - V. 16.-P. 677-680.

145. Sampson M.N. Involvement of chitinases of Bacillus thuringiensis during pathogenesis in insects / M.N. Sampson, G.W. Gooday // Microbiology. 1998. -V. 144.-P. 2189-2194.

146. Scharf B.E. Control of direction of flagellar rotation in bacterial Chemotaxis / B.E. Scharf, K.A. Fahrner, L. Turner, H.C. Berg // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. -1998.-V. 95, №1. -P. 201-206.

147. Scharf B. Sensory transduction to the flagellar motor of Sinorhizobium meliloti / B. Scharf, R. Schmitt // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 4. - P. 183186.

148. Schnepf E. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Ciystal Proteins / E. Schnepf, N. Crickmore, D. Lereclus, S. Baum, J. Feitelson, D.R. Zeigler, D.H. Dean // Microbiology and Molecular Biology Reviews. Sept. 1998. - V. 62, №3. -P. 775-806.

149. Shi W. Chemotaxis in Borrelia burgdorferi / W. Shi, Z. Yang, A.M. Lovett // Journal of Bacteriology. 1998. - V. 180, №2. - P. 231-235.

150. Slamti L. A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group / L. Slamti, D. Lereclus // EMBO J. 2002. -V. 21, №17.-P. 4550-4559.

151. Smirnoff W.A. A strain of Bacillus thuringiensis Berliner isolated from the larch sawfly Pristiphora erichsonii / W.A. Smirnoff, A.M. Heimpel // J. Invert. Patol. 1961. - V. 3. - P. 347-351.

152. Smith R.A. The phylloplane as a source of Bacillus thuringiensis variants / R.A. Smith, G.A. Couche // Appl. Envir. Microbiol. 1991. - V. 57, №1. - P. 311-315.

153. Stock A.M. Two-component signal transduction / A.M. Stock, V.L. Robinson and P.N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V. 69. - P. 183-215.

154. Stock J. Sensitivity, cooperativity and gain in Chemotaxis signal transduction / J. Stock // Trends Microbiol. 1999. - V. 7, №1. - P. 1-4.

155. Sundaram K.M. Sorptive interactions and binding of'delta'-endotoxin protein from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki in forest soils / K.M. Sundaram // J. Environ. Sei. and Health. 1996. -V. 31, № 6. - P. 1321-1340.

156. Todar K. The Genus Bacillus Электронный ресурс. / К. Todar // Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology. Режим доступа: http: //www. textbookofbacteriology.net(2003).

157. Tso W. Negative Chemotaxis in Escherichia coli / W. Tso, J. Adler // J. Bacteriol. 1974. - V. 118. - P. 560-574.

158. USDA (United States Department of Agriculture). Gypsy moth management in the United States: a cooperative approach. Final environmental impact statement. // USDA, forest service, Northeastern Area State and Private Forestry. Radnor, PA. -1995.

159. Van Frankenhuyzen K. The challenge of Bacillus thuringiensis. In: Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: theoiy and practice / K. Van Frankenhuyzen Wiley, New York, 1993. - P. 1-35.

160. Vandenberg J.D. Safety of four entomopatogens for caged adult honey bees (Hymenoptera: Apidae) / J.D. Vandenberg // J. Econ. Entomol. 1990. - V. 83, №3. - P. 755-759.

161. Vilain S. Analysis of the life cycle of the soil saprophyte Bacillus cereus in liquid soil extract and in soil / S. Vilain, Y. Luo, M.B. Hildreth, V.S. Brozel // Appl. And Enveron. Microbiol. 2006. - V. 72, №7. - P. 4970-4977.

162. Vilas-Bfas L.A. Survival and conjugation of Bacillus thuringiensis in a soil microcosm / L.A. Vilas-Bfas, G.F. Vilas-Bfas, H.O. Saridakis, M.V. Lemos, D. Lereclus // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V. 31, №3. - P. 255-259.

163. Wagner D.L. Field assessment of Bacillus thuringiensis on nontarget Lepidoptera / D.L. Wagner, J.W. Peacock, J.L. Carter, S.E. Talley // Environ. Entomol. 1996. - V. 25, №6. - P. 1444-1454.

164. Weyant R.S. Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Bacillus anthracis / R.S. Weyant, J.W. Ezzell, T. Popovic // Centers for Disease Control and Prevention. USA. 2001. - V. 16. - P. 718-721.

165. Whiteley H.R. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis / H.R. Whiteley, E. Schnepf // Annual Review of Microbiology. 1986. -V. 40. - P. 549-576.

166. Xu D. Sequence diversity of the Bacillus thuringiensis and B. cereus sensu lato flagellin (H antigen) protein: comparison with H serotype diversity / D. Xu, J.C. Cote // Appl. and Environ. Microbiol. 2006. - V. 72, №7. - P. 4970-4977.

167. Zeigler D.R. Bacillus genetic stock center catalog of strains Электронный ресурс. / D.R. Zeigler // Seven edition, Part 2: Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. Режим доступа: http: // -www.bgsc.org/Catalogs/Catrat2.pdf (1999).

168. Zhang M.Y. Adhesion and cytotoxity of Bacillus thuringiensis to cultured Spodoptera and Drosophila cells / M.Y. Zhang, A. Lovgren, R. Landen // J. Invertebr. Patol. 1995. - V. 66, №1. - P. 46-51.