Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Колонизация сред разной плотности и хемотаксис у Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Колонизация сред разной плотности и хемотаксис у Bacillus thuringiensis"

На правах рукописи

КРЛВЕЦ Елена Владимировна

КОЛОНИЗАЦИЯ СРЕД РАЗНОЙ ПЛОТНОСТИ И ХЕМОТАКСИС У BACILLUS THURINGIENSIS

Специальность 03.00.16. — экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск, 2006

Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики ГОУ ВПО Иркутский государственный университет, г. Иркутск

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Валентина Ивановна Чемерилова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Дрюккер Валентин Валерианович

кандидат биологических наук, доцент Ольга Федоровна Вятчина

Ведущая организация: Иркутский Государственный педагогический

Защита диссертации состоится «20» декабря 2006 г. и 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.074.07 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет», биолого-почвенный факультет.

Адрес: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, тел. (395-2) 24-18-70, (395-2) 24-18-55 тел./факс (395-2) 24-22-38 E-mail: val@botdep.isu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО Иркутский государственный университет

Автореферат разослан 20 ноября 2006 г..

Ученый секретарь

университет

диссертационного совета, к. б. н., доцент

Е.С. Купчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Bacillus thuringiensis (ВТ) — хорошо известный вид энтомопатогенных спорообразующих бактерий, которые являются одним из естественных регуляторов численности насекомых и используются во всем мире в качестве биологических инсектицидов на протяжении более тридцати лет. Отличительной особенностью этого вида является формирование в бактериальной клетке в процессе споруляции белкового кристалла 5-эндотоксина. Признание ведущей роли этого токсина в гибели насекомых сфокусировало внимание большинства исследователей на данном признаке и обеспечило детальную изученность его молекулярной биологии, генетического контроля и механизма действия на личинок насекомых [Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты, 2001].

Намного меньше известно о других признаках этих бактерий, в частности, таких как подвижность и хемотаксис, имеющих первостепенное значение в обеспечении жизнеспособности и адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды. Исследований хемотаксиса у ВТ ранее не проводилось, а сведения о системе подвижности клеток крайне бедны. Только в последние годы отмечается повышение интереса к функционированию жгутикового аппарата клеток ВТ, несмотря на то, что его структура лежит в основе общепризнанной схемы внутривидовой идентификации штаммов данного вида [de Barjac, Fra^chon, 1990]. Такой интерес вызван появлением работ, указывающих, что экспортный аппарат жгутиков может быть одним из факторов вирулентности представителей вида ВТ для личинок насекомых-хозяев [Ghelardi étal., 2002; Bouillaut et al., 2005; Ramarao, Lereclus, 2006].

Накопившиеся к настоящему времени сведения о том, что бактерии вида Bacillus thuringiensis могут быть причиной серьезных оппортунистических инфекций человека и животных [Hernandez et al., 1998, Salamitou, 2000], a также молекулярно-генетические доказательства их близкого родства с таким патогенном как Bacillus anthracis [Helgason et al., 2000], выдвигают на первый план исследования поведения клеток ВТ при взаимодействии с компо-

нентами окружающей среды, которое обеспечивается системами подвижности и хемотаксиса. Эти системы хорошо изучены у Escherichia coli и Salmonella enterica serovar Typhimurium, а для представителей вида Bacillus thuringiensis, невзирая на всю их экономическую важность, вопрос до сих пор остается открытым.

Цель настоящего исследования - изучить особенности колонизации сред разной плотности и хемотаксические ответы на ряд химических соединений и смесей у диссоциативных S- и R-вариантов штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis.

В задачи исследования входило: выявить особенности колонизации агаросодержащих сред разной плотности клетками штаммов 16-ти подвидов ВТ; исследовать хемотаксические реакции штаммов разных подвидов на химические соединения антропогенного и природного происхождения; изучить подвижность и хемотаксис у морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации исходных штаммов.

Научная новизна исследования состоит в том, что впервые экспериментально выявлена гетерогенность штаммов энтомопатогенного вида ВТ по способности колонизировать среды с разной плотностью и различия в стратегии колонизации этих сред, проявляющейся в дифференцировке • разных типов клеток. Впервые исследованы хемотаксические реакции на ряд эффекторов у клеток десяти штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ. Обнаружены качественные изменения в хемоответах клеток морфологических вариантов, выщепляющихся при диссоциации природных штаммов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о разнообразии стратегий клеток Bacillus thuringiensis при колонизации сред с разной плотностью и возможном поведении их при контакте с различными компонентами природного и антропогенного происхождения.

Охарактеризованы коллекционные штаммы по подвижности на средах разной плотности и хемотаксису. Получена коллекция диссоциантов и му-

тантов, которая может быть использована для изучения генетического контроля типов дифференцировки клеток бацилл и системы хемотаксиса.

Защищаемые положения:

1. Клетки Bacillus thuringiensis различаются по способности и стратегии колонизации сред разной плотности.

2. Клетки штаммов разных подвидов Bacillus thuringiensis обладают хемотаксисом. Специфичность спектра аттрактантов и репеллентов для данных бацилл может отражать особенности их существования в природе.

3. Возникновение морфологических вариантов в процессе диссоциации увеличивает гетерогенность популяций Bacillus thuringiensis по подвижности и способности к хемоответу.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Всероссийских конференциях: «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 2001); «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); на Всероссийской школе по экологической генетике «Модификационная изменчивость в экологических взаимодействиях» (Санкт-Петербург, 2005); на III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 1 в журнале из перечня ВАК.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала, методов исследования, изложения и обсуждения результатов экспериментов, выводов и Приложения. Результаты работы проиллюстрированы 15 таблицами и 25 рисунками. Список использованной литературы включает 196 наименований, в том числе 141 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали типовые штаммы ВТ, полученные из коллекции Музея микробиологии Иркутского государственного университета. Характеристика использованных в работе штаммов представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика использованных в исследовании штаммов ВТ

№ Штамм Серовариант Серотип Н-антиген Аббревиатура

1 В-1010 кепуае 4a,4c KEN

2 В-1120 toumanoffi llallb TOU

3 В-1000 galleriae 5a,5b GAL

4 В-1122 canadensis 5a,5c CAN

5 2-1 galleriae 5a,5b GAL

6 49 dendrolimus Tal. 4a,4b SOT/DEN

7 В-1008 morrisoni 8a8b MOR

8 В-1007 tolworthi 9 TOL

9 В-1004 subtoxicus 6 SUB

10 4КС alesti 3a,3c ALE

11 В-805 caucasicus 10 CAU

12 В-1093 kurstaki 3a,3b,3c KUR

13 2002 thuringiensis 1 THU

14 В-1003 entomocidus 6 ENT

15 В-1075 darmstadiensis 10a,10b DAR

16 В-1009 aizawai 7 AIZ

17 В-738 finitimus 2 FIN

18 5045 dendrolimus 4a,4b SOT/DEN

19 В-741 alesti 3a,3c ALE

Клетки исследованных штаммов нормально спорулировали и формиро-

вали кристаллы 5 - эндотоксина. Культивирование бактерий и анализ колониально-морфологических признаков проводили на плотной питательной среде Луриа-Бертани (LB) с 1,5% содержанием агара при 28°С. В качестве жидкой среды использовали ту же среду без добавления агара. В экспериментальных средах варьировало только содержание агара от 0,3% до 1,0%. Для выявления потребностей в факторах роста использовали синтетическую минимальную среду Никкерсона и Буллы [Nickerson, Bulla, 1974].

В качестве эффекторов при тестировании хемотаксиса использовали растворы химических соединений в концентрациях, указанных для Borrelia

burgdorferi [Shi et al., 1998]: 7,5х1(Г2М СаС12, 10']М KCl, 10% NaOH и 60% NaHC03 (рН>9), 10"2М этанола, растворы аминокислот: триптофана,

валина, аланина, лейцина, 10"2М растворы нефтепродуктов ортоксилола и гексадекана (цетан), препарата «Гумат-80». Растворы инсектицидов готовили в концентрации, рекомендованной для обработки сельскохозяйственных культур: 15 мкг/мл бетациперметрина (кинмикс); 5 мкг/мл дельтаметрина (децис) и циперметрина (арриво), 250 мкг/мл малатиона (карбофос).

В качестве эффекторов природного происхождения использовали водные вытяжки из: хвои лиственницы (Larix sibirica Ledeb.), сосны (Pinus sylvestris L.), кедра (Pinus sibirica Du Tour), пихты (Abies sibirica Ledeb.), ели (Picea obovata Ledeb.) и туи (Thuja occidentalis L.) и листьев березы (Betula pendula Roth), тополя (Populus balsaminefera L.), яблони (Malus baccata (L.) Bakh), боярышника (Crataegus sanguínea Pall.), рябины (Sorbus sibirica Held.), шиповника (Rosa rugosa Thunb.), черемухи (Padus avium Mill.), ивы (Salix bebbiana Sarg.), ирги (Amelanchier ovalis Medik.), барбариса (Berberís vulgaris L.), черники (Vaccinium myrtillus L.), жимолости (Lonicera edulis Turez. ex Freyn), облепихи (Hippophaë rhamnoides L.), малины (Rubus ilaens L.). Для изготовления вытяжек хвою и листву соответствующих пород измельчали и навеску в 2 г тщательно растирали в ступке с 4 мл хемотаксисного буфера. Взвесь фильтровали через двойной слой марли.

Метод исследования подвижности. Клетки шестичасовой культуры, выросшей в жидкой среде LB, наносили уколом в центр чашки Петри с той же средой, но содержащей 0,4% или 1,0% агара. Высеваемую суспензию и край зоны колонизации микроскопировали (СХ-41, Olympus) через 6, 18 и более часов культивирования при 26°С. Измеряли зоны колонизации среды обычной линейкой, фотодокументировали с помощью цифровых камер: Canon Power Shot A410, COOLPIX Pl.

Метод исследования хемотаксиса. Для исследования хемотаксиса использовали модифицированный метод вставок [Tso, Adler, 1974]. Клетки тченяттпятичясокпй кл/пктупкт йыпятттрннпй r жипкпй гпрпр I R ппм ?8°Г'

осаждали и отмывали от среды центрифугированием (5мин при 3000 об/мин), ресуспензировали в небольшом количестве хемотаксисного буфера (10 мМ NaH2P04 рН 7,6, 10"4 М ЕДТА). Суспензию смешивали с равным объемом предварительно разогретой до 45°С 0,4% агарозы (Serva) и выливали на чашку Петри, в центр которой предварительно помещали 5 мм вставку из 1,5% агарозы, содержащую тестируемое вещество. Реакцию клеток оценивали через 24 час инкубации при 28°С. Образование прозрачной зоны вокруг вставки свидетельствовало об отрицательной реакции клеток на тестируемое вещество, а образование более плотного кольца - о положительной реакции клеток (рис. 1).

Рис.1. Позитивная (А) и негативная (В) реакция клеток Bacillus thur-ingiensis на вещество вставки

Вещество считали нейтральным, если плотность клеток вокруг вставки не менялась. Степень реакции оценивали по диаметру зоны, которую измеряли под бинокуляром МБС-9 при увеличении 8x06 с помощью окуляр-микрометра. Вставки изготовляли, смешивая тестируемые растворы с равным объемом 1,5% агарозы.

Статистическую обработку результатов вели общепринятыми методами [Рокицкий, 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Подбор условий для сравнительного изучения типов движения у штаммов Bacillus thuringiensis. На примере штамма 49 Bacillus thuringiensis ssp. dendrolimus установлено, что степень колонизации среды клетками бацилл в значительной степени зависит от ее плотности, не зависит от ее объема и возраста засеваемой культуры. Среда LB, с содержанием агара 0,4%, но

не с 0,5%, позволяла клеткам ВТ осуществлять движение по типу плавания. Скорость движения зоны колонизации данной среды клетками в промежуток времени от 18 до 24 час была стабильна и могла служить для оценки различий исследуемых штаммов по признаку движения в полужидких средах.

Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis в среде с 0,4% содержанием агара. Исследовали характер колонизации среды, содержащей 0,4% агара, клетками 153 клонов, принадлежащих к 19 штаммам различных подвидов ВТ. Опыт проводили в пяти повторностях для каждого клона. Результаты экспериментов показали, что клетки большинства из исследованных клонов были способны эффективно колонизировать среду LB с 0,4% содержанием агара после культивирования в жидкой среде, но их поведение и морфология зон колонизации (рис.2) различались.

Рис.2. Морфология зон колонизации среды с 0,4% содержанием агара штаммами Bacillus thuringiensis

Для выявления причин наблюдаемых различий в характере поведения клеток штаммов ВТ исследовали с помощью микроскопа выращиваемые в жидкой среде культуры и зоны колонизации ими полужидкой среды через 18 и более часов после инокуляции клеток.

Было установлено, что различия в колонизации сред связаны с разными типами дифференцировки клеток, как в жидкой среде, так и в среде с низкой плотностью. Все исследованные клоны можно было условно подразделить на 4 типа. Клоны первого типа были способны эффективно колонизировать среду за счет дифференцировки быстроплавающих коротких одиночных клеток, передвигающихся только в поверхностном слое среды. Такой тип колонизации был характерен для большинства клонов, принадлежащих к штаммам 1010 кепуае, 1000 и 2-1 ззр. &а11епае, 49 ssp. йепйгоИтиз, 1122 ззр. сапа-

densis и 1120 ssp. toumanoffi. Эти клоны отличались относительно высокой скоростью продвижения зоны колонизации (2-3 мм/час), значительным ее диаметром к 18 часу культивирования и формированием характерного ободка по краю (рис.2А, штамм 1000). Первый тип колонизации был характерен и для клеток штамма 805 ssp.caucasicus, но в период с 18 до 24 часов все клоны этого штамма проявляли низкую скорость движения зоны. Для второго типа клонов было характерно формирование длинных нитевидных клеток, способных только расти на поверхности среды с 0,4% агара, образуя вокруг плотной центральной зоны роста как бы «венец» из выступающих нитей. В жидкой среде шестичасовая культура содержала неподвижные клетки нормального размера, а в 24-ти часовой культуре дополнительно появлялись длинные нитевидные клетки. Такой тип был характерен для всех клонов штамма 1009 ssp. aizawai, которые не были способны эффективно колонизировать среду с низкой плотностью.

Клоны третьего и четвертого типов отличались от первых двух тем, что колонизировали эффективно толщу среды. Клоны третьего типа (штаммов 1008 ssp. morrisoni, 1007 ssp íolworthi, 2-1 ssp. galleriae, 1093 ssp. kurstaki, 2002 ssp thuringiensis) формировали зоны с характерным ободком, но более интенсивным ростом в точке посева (рис.2В, штамм 1007). На поверхности полужидкой среды по краю зоны наблюдали одиночные неподвижные клетки, а подвижные клетки чаще встречались в толще среды, что не было характерно для штаммов первой группы. Также в глубине среды наблюдали отходящие от места укола и интенсивного роста одиночные длинные нитевидные клетки. Клоны штаммов 4кс ssp alesti, 1075 ssp. darmstadiensis, 1003 ssp. en-tomocidus, 1004 ssp subtoxicus (четвертый тип) формировали зону колонизации иной морфологии (рис.2С, штамм 1003), которая отличалась отсутствием характерного ободка по краю. К 18 часу для этих штаммов зона движения не была заметна или имела небольшой диаметр, увеличивающийся в последующие часы культивирования. Микроскопический анализ показал, что этот тип клонов колонизирует толщу среды за счет одиночных слабо подвижных кле-

ток, которые по ходу своего перемещения оставляют расположенные на небольшом расстоянии друг от друга неподвижные микроколонии, состоящие из нескольких клеток, формирующих своеобразные «пучки», очень напоминающие начальные этапы развития колоний у В. mycoides [Di Franco et al., 2002].

Клоны штаммов: 738 ssp. ßnitimus, 741 ssp alesti, 5045 ssp. dendrolimus и, как отмечалось, 1009 ssp. aizawai оказались не способными к передвижению на среде с 0,4% агара в течение 48 час (pnc.2D, штамм 5045), но природа отсутствия видимых зон колонизации среды клетками этих штаммов различна. После длительного наблюдения клоны штаммов 738 ssp. ßnitimus, 741 ssp alesti были отнесены к четвертому типу, а клоны штамма 5045 ssp. dendrolimus — к первому типу дифференцировки по характеру возникающих подвижных мутантов.

Характер движения штаммов Bacillus thuringiensis на среде с 1,0% содержанием агара. При исследовании колонизации сред с высокой плотностью клетками штаммов разных подвидов ВТ мы также столкнулись с многообразием типов дифференцировки клеток, определяющих стратегию освоения пространства. На среде с 1% содержанием агара у всех исследованных штаммов заметные различия по степени колонизации плотной среды клетками клонов можно было отметить только на 8 сутки культивирования.

Рис. 3. Морфология зон колонизации среды с 1,0% содержанием агара клетками штаммов Bacillus thuringiensis через 8 суток после посева (26°С)

Разные клоны даже одного и того же штамма формировали зоны неправильной формы, разной морфологии и размера (рис.3), наблюдали появление секторов с разным краем зоны движения. Только клетки клонов штамма 805 ssp. caucasicus формировали на данной среде одинаковые и стабильные зоны.

Анализ под микроскопом края зоны движения клона на плотной среде, позволил объяснить характер колонизации плотной среды исследуемыми штаммами. Всего было выявлено 3 основных типа края зоны движения культур ВТ на плотной среде. Примеры этих типов представлены на рис.4.

Рис.4. Края зон, формируемых штаммами Bacillus thuringiensis на среде с 1,0% содержанием агара. Объяснение в тексте.

Край зоны первого типа (рис.4А) содержал отдельные клетки небольшого размера, лежащие боком к поверхности зоны движения или в беспорядке выступающими из зоны. Продвижение по поверхности плотной среды у этих культур было, по-видимому, обусловлено не активным движением, а просто вытеснением крайних клеток размножающимися в центре зоны клетками. По краю зоны с клетками расположенными боком наблюдали наличие тонкого ободка жидкости или слизи, которая, возможно, и облегчала продвижение . зоны.

Отличительной чертой края зон второго типа было наличие слоев тесно или рыхло параллельно уложенных длинных цепей клеток, формирующих волны различного размера, или выступающих из колонии групп роящихся клеток-швармеров, иногда образующих причудливые узоры (рис.4В). Этот тип мы разделили на два подтипа 2а и 26. Для подтипа 2а характерно образование из плотных слоев длинных клеток небольших волн, не выступающих сильно за пределы зон колонизации. Для подтипа 26 характерно более рых-

лое расположение цепочек длинных клеток и интенсивное образование швармеров, активно выступающих за пределы зон колонизации. Штаммы, формирующие край зоны колонизации второго типа, перемещались по среде с 1 % содержанием агара за счет движения по типу «роение», только недавно описанному для штамма ВТ HI серотипа [Ghelardi et al., 2002].

Край зоны третьего типа (рис.4С) не был четко обозначен, а из массы клеток центральной зоны выступали нитевидные клетки, ветвящиеся и проникающие глубоко в среду. Штаммы, имеющие край зоны третьего типа, не были способны передвигаться по плотной среде за счет движения отдельных клеток, и колонизировали среду за счет дифференцировки нитевидных клеток. Мы не нашли в литературе описания данного типа колонизации плотных сред у ВТ, хотя у представителей рода Bacillus отмечается способность формировать длинные нитевидные клетки [Коротяев, 1998]. Недавно у В. cereus была обнаружена способность расти в почве благодаря формированию многоклеточных нитевидных структур [Vilain et al., 2006]. Аналогичные формы были обнаружены и у В. mycoides, близкого родственника исследуемого нами вида [Di Franco et al., 2002]. Сигналом к дифференцировке таких клеток, возможно, служил недостаток кислорода, так как эти клетки формировались в толще среды.

Большинство штаммов, принадлежащих к разным подвидам ВТ, осуществляли колонизацию среды с 1,0% содержанием агара благодаря способности к дифференцировке клеток-швармеров, передвигающихся по поверхности плотной среды по типу роения. Только клоны штамма 49 ssp. dendrolimus характеризовались первым типом края зон колонизации, редко формируя сектора с 2а типом. По-видимому, клетки данного штамма не способны были дифференцироваться в швармеры. Только третий тип колонизации был характерен для всех исследованных клонов штаммов 1003 ssp. entomocidus, 4кс ssp. alesti, а также некоторых клонов штамма 2-1 ssp. galleriae. Один клон с третьим типом зоны колонизации был встречен среди клонов штамма 1004 ssp subtoxicus. С таким же типом края зоны колонизации были отмечены сек-

тора, образуемые при размножении некоторых клонов штаммов 1010 ssp. кепуае, 1008 ssp. morrisoni, 738 ssp. finitimus и 1075 ssp. darmstadiensis. Лучшая способность к колонизации плотной среды была характерна для штаммов, формирующих края зон 26 и 3 типов.

Следует отметить, что какая-либо классификация штаммов по способности колонизировать среды разной плотности оказывалась условной, так как для большинства исследованных штаммов вида характерна гетерогенность по анализируемому признаку, даже среди клонов одного и того же штамма можно встретить как разный тип дифференцировки, так и разную способность колонизировать среды той или иной плотности.

Хемотаксис у Bacillus thuringiensis. У клеток штаммов 49 ssp. den-drolimus и 2002 ssp. thuringiensis исследовали хемоответ на присутствие 33 химических соединений и смесей, а у 8 штаммов, отличающихся по характеру движения в средах с разной плотностью, только реакции на экстракты из хвои и листьев 18 исследуемых видов растений. Выбор хемоэффекторов не был случайным. При выборе химических соединений и смесей руководствовались исследованиями, проведенными на других микроорганизмах [Shi, 1998, Mesibov, 1973], а также условиями, с которыми Bacillus thuringiensis может встречаться в природных биоценозах.

В выбранных нами условиях изучения хемотаксиса клетки 12-ти часовых культур штаммов 49 ssp. dendrolimus и 2002 ssp. thuringiensis проявляли однозначную реакцию в 3-5 повторностях экспериментов. Из неорганических соединений сильным репеллентом для клеток обоих штаммов ВТ был раствор бикарбоната натрия. Это соединение использовали для изучения действия высокого значения pH среды, с которым Bacillus thuringiensis сталкивается в кишечнике насекомых [Falcon, 1971]. Но отрицательную реакцию вызывало не повышенное значение pH, а именно раствор NaHC03, т.к. такое же значение pH, установленное с помощью раствора NaOH, не вызывало отрицательной реакции у клеток. По реакции на растворы KCl и СаС12 клетки Bacillus thuringiensis отличались от патогенных спирохет В. burgdorferi [Shi,

1998], а по отсутствию реакции на аминокислоты - от Е. coli [Mesibov, 1973]. Отсутствие реакции на использованные аминокислоты кажется удивительным, так как штаммы 49 и 2002, как было нами установлено, являются ауксо-трофами по аминокислотам валину и лейцину.

Все соединения, имеющие антропогенное происхождение, в том числе ряд химических инсектицидов и ряд нефтепродуктов, не вызывали хемореак-ции у клеток обоих штаммов, даже при увеличении их концентрации во вставке в два или в три раза. Отсутствие реакции, как было показано, не связано с нарушением хемочувствительности клеток, а, скорее всего, клетки бацилл не содержат соответствующих хеморецепторов. В связи с тем, что основная масса исследуемых химических соединений и смесей оказалась для клеток ВТ веществами нейтральными, интересно было проверить характер хемореакции клеток данного вида бацилл на соединения - компоненты биоценоза.

Характер хемоответа штаммов дикого типа на природные соединения. Клетки всех штаммов прореагировали на экстракты из листьев хвойных и лиственных растений. Можно думать, что они встречались с данными компонентами в своем эволюционном развитии. Так же как и раствор соды, экстракты из хвои оказались для всех исследованных штаммов репеллентами. Самым сильным репеллентом для большинства штаммов является экстракт из хвои лиственницы, а самым слабым — экстракт из хвои туи. Степень реакции хемотаксиса, оцененная по диаметру формируемой прозрачной зоны вокруг вставки, не зависела от подвижности штамма в среде LB с 0,4% агара. Например, «неподвижный» на данной среде штамм 741 ssp alesti в ответ на экстракт из хвои лиственницы формировал зону реакции, равную 7,45±0,14 мм, которая достоверно не отличалась от зон подвижных штаммов 1008, 1010, 1120 (7,25±0,23 мм, 6,29±0,12 мм, 6,80±0,87 мм, соответственно). Отсюда следует, что у штамма 741 нарушена система движения по типу плавания, а движение типа роения и система хемотаксиса функционируют нормально.

В отличие от экстрактов из хвойных растений экстракты лиственных видов растений вызывали не столь однозначный хемоответ (табл.2).

Таблица 2.

Характер хемоответа клеток штаммов разных подвидов ВТ на экстрак-

Экстракты из листьев Характер хемоответа штаммов

49 2002 2-1 4 кс 741 805 1008 1010 1120 5045

березы а а а Р а а а а а а

тополя а а а а Р а Р Р а а

яблони а а а Р Р Р Р Р Р а

боярышника а а а а а а Р Р а а

рябины Р Р Р Р Р Р Р Р Р а

шиповника Р Р а Р Р Р Р Р Р Р

черемухи Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

ивы Р Р Р Р а а Р Р а а

ирги а а а а а а а а а а

барбариса Р Р Р Р Р Р Р Р Р Р

жимолости а а а а а а а а Р а

облепихи Р Р а а Р Р Р Р Р Р

Примечание: р - вещество репеллент, а - вещество аттрактант

Как следует из результатов, приведенных в табл.2, экстракт из листьев почти любого из исследованных растений мог вызывать у клеток одного штамма негативную реакцию, а у другого позитивную. Одинаково все штаммы прореагировали лишь на экстракт из листьев ирги, который был для них аттрактантом, и экстракты из листьев барбариса и черемухи, которые были для всех штаммов репеллентами. Можно предположить, что в природе наибольшее число клеток ВТ будут выделяться с листьев ирги, березы, жимолости, боярышника, экстракты из которых являются для большинства штаммов аттрактантами, а меньше всего их на листьях барбариса, черемухи, рябины и шиповника.

Какой-либо связи характера хемоответа с типом подвида, определяемым по жгутиковому антигену, не наблюдали. Так, штаммы 49 и 5045 относятся к подвиду с1епс1гоНтш, но отличаются друг от друга по спектру реакций хемоответа на исследованные хемоэффекторы. То же наблюдается и для штаммов 4кс и 741, которые относятся к подвиду ¿¿р. а1е$й. С другой стороны, штаммы, принадлежащие к разным подвидам, например, 1010 ¿¿р. кепуае и 1008

ssp. morrisoni, обладают сходными реакциями, как и штаммы 49 ssp. den-drolimus и 2002 ssp. thuringiensis. Некоторая корреляция прослеживается между способностью клеток к роению и степенью хемочувствительности, как к экстрактам из хвои, так и из листьев растений, что заслуживает более тщательного исследования.

Взаимоотношения между клетками штаммов Bacillus thuringiensis. Методику, использованную для изучения характера колонизации среды с 0,4% агара, применили для выявления взаимоотношений между штаммами, способными к плаванию. Для этого на чашку засевали по 4 штамма, располагая их крестообразно, на равном расстоянии друг от друга. Для контроля на одну и ту же чашку с одной стороны засевали клетки одного и того же штамма. Учет вели после того, как зоны колонизации каждого штамма соприкасались друг с другом. Тот штамм, который формировал выпуклую зону на границе соприкосновения штаммов, считали активным конкурентом в колонизации среды, а тот штамм, который формировал вогнутую поверхность зоны на границе соприкосновения штаммов — уступающим в конкуренции. Ровная граница между штаммами интерпретировалась как отсутствие конкуренции (рис. 5).

Рис. 5. Отсутствие конкуренции между клетками штаммов 1008 ssp. morrisoni и 1007 ssp tolworthi (А) и наличие конкуренции между штаммами 1007 ssp tolworthi и 1003 ssp. entomocidus (72 час, 26 С)

Всего проанализировали взаимоотношения 14 подвижных на среде с 0,4% агара штаммов. Одновременно учитывали диаметр зоны колонизации, формируемый клетками через 18 часов культивирования после посева. Как показали результаты экспериментов, наименее конкурентоспособными оказались штаммы с быстрым продвижением зоны колонизации (49, 1122, 1120,

805). К штаммам, способным вытеснять, относятся штаммы, медленно двигающиеся и способные дифференцироваться в нитевидные формы: 2002, 1003, 1004 и 1075. Штаммы 805 ssp. caucasicus и 1000 ssp. galleriae были по отношению друг к другу нейтральными, и между ними формировалась ровная граница, как и во всех случаях посева клеток одного и того же штамма. Горизонтальная ровная граница формировалась также между штаммами 1008 ssp. morrisoni и 1007 ssp tolworthi, а также штаммами 1003 ssp. entomocidus и 1004 ssp subtoxicus.

Результаты этих предварительных экспериментов оставляют много для спекуляции, но заслуживают дальнейшего исследования, так как можно отметить, что штаммы подвида entomocidus способны синтезировать термостабильный бактериоцин, названный энтомоцином 9, который обладает широким спектром антибактериального действия [Cherif et al., 2003], штаммы 1003 ssp. entomocidus и 1004 ssp subtoxicus, имеют сходные жгутиковые антигены.

Особенности движения и хемотаксиса у диссоциативных R-вариантов Bacillus thuringiensis. При клонировании у большинства исходных штаммов дикого типа наблюдали явление расщепления на морфологические варианты, которое исторически получило название «диссоциация». Так как многие авторы считают такой процесс у микроорганизмов адаптивным [Милько, Егоров, 1991], интересно выяснить влияние этого процесса на особенности движения и хемореакции у клеток исследуемых нами штаммов. До этого такие исследования не проводились.

Исследовали морфологические варианты, клетки которых в отличие от исходного типа формировали на плотной среде LB серые или прозрачные колонии и были олигоспорогенными. На среде с 0,4%-ми агара такие диссоци-анты часто теряли способность к колонизации или колонизировали данную среду с достоверно меньшей скоростью. Так среди 6 вариантов, полученных от штамма 1000 ssp. galleriae, 4 не формировали зон колонизации. Такие варианты были получены от штаммов 2002 и 1010. Были встречены варианты

достоверно не отличающиеся по скорости и характеру передвижения от исходного типа, как, например, все варианты, полученные от штаммов 1004 и 1075. Тем не менее, можно было встретить и варианты, у которых либо диаметр зоны, либо скорость колонизации среды с 0,4% содержанием агара достоверно были выше, чем у исходного типа.

Исследование движения штаммов на среде с 1,0% содержанием агара привело к аналогичному результату. Среди изученных морфологических вариантов мы не нашли иного типа края зон колонизации, отличимого от зон, характерных для штаммов разных подвидов ВТ. Многие варианты были неотличимы от исходных форм по данному признаку, но были встречены случаи, когда у вариантов тип края зон колонизации менялся. Так, у штамма 49, для которого был характерен 1-й тип края зоны, и встречались редко сектора с 2а типом, вариант Ю.2 формировал зону колонизации заметно большего размера с краем типа 26. У штаммов 4кс и 2-1 исходные Б-варианты колонизировали среду с 1,0% содержанием агара за счет формирования нитевидных клеток (тип 3). Морфологический Я-вариант штамма 4кс отличался краем зоны типа 2а, а вариант ЛЗ штамма 2-1 - типа 26. Один из морфологических вариантов штамма 1009 формировал более интенсивно швармеры, а другой отличался 1 типом края зоны. На рис.6 проиллюстрирована морфология зон колонизации Б- и Я-вариантов штамма 1010.

Рис., 6. Морфология зон колонизации среды.с 1,0% содержанием агара клетками морфологических вариантов штамма 1010 мр. кепуае

Хемореакцию и степень чувствительности к раствору бикарбоната натрия, экстрактам из хвои и листьев исследовали у 28 Я-вариантов, полученных от штаммов: 49 ззр. с!епс1гоИтш, 2002 зяр. и 2-1

galleriae. Результаты исследования хемореакции на экстракты из листьев хвойных и раствор соды представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Характер хемоответа клеток штаммов ВТ и полученных от них К- вари_антов на экстракты из хвои деревьев и на раствор соды_

Штамм Экстракты из хвои

лиственницы сосны кедра пихты ели туи раствор соды

49,2002,2-1; 49 1,1.1,1.2, 1.4; 2002 2.2, 3.1,3.2, 1120с1с, 2120<3с, 3120с1с, Юкс; 2-1 3 Р Р Р Р Р Р Р

49 Я04 Р Р а р Р а а

49 ТЯв. 2002 24.9 Р Р а р Р Р а

49 1.3 а Р Р р Р а Р

49 2.1,3.2 а Р Р р Р Р Р

49 3.1,2002 1.3 Р Р Р р Р а Р

2002 24.15 Р Р Р р Р а а

2002 1.4, 1.5 Р а Р р Р Р Р

2002 1.6 Р Р Р р а Р Р

2002 2.1 Р а Р р а а Р

2-1 1 Р Р Р Р а Р

2-1 2 а Р Р - а а Р

Примечание: р - вещество репеллент, а - вещество аттрактаят

Как видно, все исследованные И-варианты не теряли способность к хемотаксису и двенадцать из них по характеру хемореакции не отличались от исходных Б-вариантов. Однако также видно, что при переходе от Б- к II-варианту изменяется характер реакции (от репеллента к аттрактанту) на экстракты из хвои лиственницы — у четырех штаммов, сосны, кедра и ели — у трех, на экстракт из хвои туи изменился характер реакции у восьми II-вариантов, а на раствор соды — у четырех штаммов.

Аналогичная картина наблюдалась и при изучении хемореакции Я-вариантов на экстракты из листьев, однако, в данном случае подавляющее большинство штаммов (15) оказались в группе, не совпадающих по характеру реакции ни с одним из исследованных вариантов. Всего было обнаружено три группы Я-вариантов отличающихся по характеру реакции от исходных штаммов, но сходных с другими Я-вариантами. С характером зон хемоответа штаммов 49 и 2002 на спектр вытяжек из листьев исследованных растений полностью совпали только два Инварианта, полученных от штамма 2002 —

24.9 и 24.15. Штамм 2-1 и полученные от него R-варианты не совпали по характеру хемореакции ни с одним из вариантов.

Таким образом, результаты экспериментов показали, что при диссоциации у ВТ могут возникать разнообразные варианты, среди которых могут встречаться формы с измененным спектром хемочувствительности и способом колонизации сред разной плотности. Это обстоятельство, на наш взгляд, может свидетельствовать об определенной роли диссоциации в расширении адаптивных свойств представителей вида ВТ.

ВЫВОДЫ

1. Клетки штаммов, принадлежащих к разным подвидам Bacillus thuringiensis, различаются по способности колонизировать среду LB с 0,4% и 1,0% содержанием агара после обитания в жидкой среде. Признак является штаммоспецифичным и определяется многообразием типов дифференциров-ки у клеток бактерий данного вида в разных условиях среды.

2. Выявлено, что активная колонизация сред с низкой плотностью осуществляется штаммами Bacillus thuringiensis за счет движения клеток по типу плавания, которые мигрируют только по поверхности среды, или распространяются в ее толще. А колонизация сред с высокой плотностью происходит благодаря роению групп клеток или за счет дифференцировки и роста в толще среды длинных нитевидных клеток.

3. Впервые продемонстрировано, что клетки штаммов ВТ обладают системой хемотаксиса, которая может отличаться от систем патогенной спирохеты В. burgdorferi и энтеробактерии Е. coli.

4. Клетки штаммов 49 ssp. dendrolimus и 2002 ssp. thuringiensis не реагировали на присутствие в среде инсектицидов и ряда нефтепродуктов, но, как и клетки других 8 штаммов Bacillus thuringiensis прореагировали на водные вытяжки из листьев разных растений. Нейтральная реакция клеток Bacillus thuringiensis на присутствие инсектицидов и нефтепродуктов не связана с ин-гибированием у них системы хемотаксиса.

5. Водные вытяжки из хвои лиственницы, сосны, кедра, ели, и туи являлись репеллентами для клеток десяти исследованных штаммов Bacillus thuringiensis, реакция на листья 12 видов лиственных растений была неоднозначной. При диссоциации может происходить смена реакции хемотаксиса у клеток всех исследованных штаммов.

6. Показано, что для штаммов Bacillus thitringiensis характерна гетерогенность по стратегии колонизации сред с разной плотностью и хемотакси-ческой реакции, которая может увеличиваться в результате процесса диссоциации.

Список работ по теме диссертации

1. Лебенко (Кравец) Е.В. Хемотаксис Bacillus thuringiensis в отношении водных экстрактов хвойных и лиственных растений / Е.В. Лебенко, О.А. Секерина, В.И. Чемерилова // Экология Байкала и Прибайкалья: Материалы Всероссийского научно-практического молодежного симпозиума. Иркутск, 24-28 ноября 2001 г. - Иркутск: Иркут. ун-т, 2001. - с. 103-104

2. Лебенко (Кравец) Е.В. Хемотаксические реакции клеток Bacillus thuringiensis на некоторые соединения / Е.В. Лебенко, О.А. Секерина, В.И. Чемерилова // Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование. Материалы Межрегиональной научно-практической конференции, 2004 г., Иркутск. - ИГУ, 2004. - с.37-38

3. Лебенко(Кравец) Е.В. Хемотаксис у двух природных изолятов Bacillus thuringiensis /Е.В. Лебенко, В.И. Чемерилова // Вестник Иркутского университета. Специальный выпуск. Материалы ежегодной научно-теоретической конференции молодых ученых. — Иркутск: Иркут. ун-т, 2004. - с. 15

4. Лббенко (Кравец) Е.В. Особенности хемотаксиса у диссоциативных S-и R-вариантов Bacillus thuringiensis / Е.В. Лебенко, О.А. Секерина, В.И. Чемерилова // Микробиология,- Москва: Российская академия наук, 2005, том 75, №1, с. 87-91

5. Lebenko (Rravets) E.V. The Chemotactic Characteristics of the S and R Dissociants of Bacillus thuringiensis / E.V. Lebenko, O.A. Sekerina, V.I. Chem-erilova //Microbiology, vol.74, №1, 2005. pp.76-79

6. Чемерилова В.И. Диссоциация y Bacillus thuringiensis как проявление «мутагенеза стационарной фазы» / В.И. Чемерилова, О.А. Секерина, Е.В. Кравец, Л.В. Маланушенко // Экологическая генетика. — 2006. — т.4, вып.1, с. 28-36

7. Кравец Е.В. Возможные экологические последствия действия ряда инсектицидов на энтомопатогенные бациллы вида Bacillus thuringiensis / Е.В. Кравец, О.В. Извекова, В.И. Чемерилова // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой. Материалы III межрегиональной конференции молодых ученых. — Саратов, 2006. с.51