Идентификация генов δ-эндотоксинов и типирование штаммов B.thuringiensis методами генетического анализа

Мокеева, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация генов δ-эндотоксинов и типирование штаммов B.thuringiensis методами генетического анализа
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация генов δ-эндотоксинов и типирование штаммов B.thuringiensis методами генетического анализа"

На правах рукописи

МОКЕЕВА Айна Владимировна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ 5-ЭНДОТОКСИНОВ И ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ В. Ишгт81еп.ш МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

03.00.03 - «молекулярная биология»

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009

003489156

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель:

кандидат химических наук Орешкова Светлана Федоровна Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Гилева Ирина Павловна доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Ведущая организация

Новосибирский государственный университет

Защита состоится «29» декабря 2009 года в 17 часов на заседании диссертационного совета при ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан «0» ноября 2009 года

Ученый секретарь .

диссертационного совета Л.И. Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Bacillus thuringiensis - аэробная почвенная грамположительная бактерия, в ходе споруляции способная образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков дельта-эндотоксинов (также называемых Сгу белками). Эти белки обладают высокой специфичностью токсического действия в отношении ряда насекомых и одновременно безвредны для животных и человека, что позволило создать на их основе экологически безопасные инсектицидные препараты (около 90-95% рынка биопестицидов) и использовать как альтернативу химикатам для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства.

Коммерческий интерес к биологическому контролю над насекомыми усилил поиск новых изолятов В. thuringiensis, содержащих токсины к широкому спектру насекомых. Это привело к значительному увеличению числа имеющихся в коллекциях штаммов, зачастую повторному выделению и депонированию штаммов под другими названиями. Таким образом, назрела необходимость в поиске новых подходов к систематизации бактериальных культур.

Наиболее широко применяемый метод подвидовой классификации В. thuringiensis основан на Н-серотипировании, иммунологической реакции с бактериальными жгутиковыми антигенами, с дополнением биохимических данных. На сегодняшний день штаммы В. thuringiensis разделены на 84 сероварианта (серовара). Однако, многие штаммы внутри серовара не одинаковы по биохимическим, генетическим и токсическим свойствам. Так, некоторые серовары, например В. thuringiensis ssp. israelensis, включают штаммы с практически одинаковыми свойствами, другие - с широким спектром свойств. Например, В. thuringiensis ssp. morrisoni включает штаммы, токсичные для личинок комаров, жуков и бабочек. Кроме того, серотипирование не пригодно для неподвижных и самоагглютинирующих штаммов, а процесс агглютинации наблюдается и у некоторых штаммов B.cereus. Помимо этого, существующая схема серотипирования не обеспечивает никакой информации о генетическом родстве штаммов.

Таким образом, существует необходимость в специфическом типировании В. thuringiensis, для анализа распространения охарактеризованных штаммов в окружающей среде и регистрации новых изолятов.

Целью данной работы являлось всестороннее изучение штаммов энтомопатогенных бактерий В. thuringiensis, входящих в коллекцию Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН, с помощью молекулярно-биологических и биохимических методов, биоанализа на насекомых, а также проведение типирования данных штаммов методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

• характеризация штаммов В. thuringiensis по наличию определенных генов эндотоксинов;

• характеризация белкового состава спорокристаллических смесей штаммов В. thuringiensis;

• характеризация штаммов В. thuringiensis по инсектицидной активности;

• типирование штаммов В. thuringiensis методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD-метод);

• филогенетический анализ штаммов В. thuringiensis на основе данных RAPD-ПЦР анализа.

Научная новизна и практическая ценность работы

Штаммы Bacillus thuringiensis из коллекции Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и из музея Института систематики и экологии животных СО РАН охарактеризованы по наличию определенных генов 8-эндотоксинов, инсектицидной активности, белковому составу спорокристаллических смесей. Проведен филогенетический анализ штаммов.

Из 73 исследованных штаммов Bacillus thuringiensis инсектицидной активностью обладали 28 штаммов. Они могут стать основой для создания энтомопатогенных препаратов. Выявление генов 5-эндотоксинов позволит проводить поиск инсектицидной активности штаммов уже на более узком спектре

насекомых, что значительно облегчит выявление перспективных препаратов. Атипичные, неинсектицидные Штаммы, в том числе штаммы из Долины гейзеров, Камчатка, представляют интерес для исследования их цитоцидальной активности и с целью возможного использования, в дальнейшем, в противораковой терапии.

Положения, выносимые па защиту

При исследовании штаммов бактерии Bacillus thuringiensis из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН выявлено и охарактеризовано 28 штаммов, обладающих инсекцицидной активностью.

При оценке инсектицидности бактерий В. thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только-форму, но и размер кристаллов 5-эндотоксинов.

Генетическое типирование 73 штаммов В. thuringiensis с помощью метода RAPD-фингерпринтинга выявило 37 RAPD-типов. Проведенный филогенетический анализ позволяет оценить генетическое родство штаммов как внутри, так и между подвидами.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликовано две статьи в реферируемых научных журналах. Полученные результаты были представлены на: Сибирской зоологической конференции (Новосибирск, 2004), Третьей международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2004), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), Третьем московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), 38th annual meeting Society for Invertebrate pathology, (Anchorage, 2005), 39th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, 9th International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, (Wuhan, China, 2006), 2-om Байкальском Микробиологическом Симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», (Иркутск, 2007), IV Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», (Минск, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Библиография включает 210 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 7 таблицами,

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На начальном этапе исследований был проведен сравнительный анализ штаммов энтомопатогенных бактерий В. Лигт&етм, имеющих различную форму кристаллов 8-эндотоксинов, с помощью молекулярно-биологических методов и биоанализа на насекомых.

Штаммы В. //шгш^/еш'/.у, используемые в настоящем исследовании, уже были предварительно охарактеризованы по нескольким критериям: биохимические характеристики, серотипирование, морфология кристаллов. Однако штаммы из коллекций не были охарактеризованы в плане возможного инсектицидного применения.

1. Сравнительная характеристика штаммов с различной формой кристаллов б-эндотоксинов

По результатам световой микроскопии все исследованные штаммы были разделены нами на группы, согласно форме кристаллов, которые образовывала бактерия. Было выделено несколько групп штаммов: 1) образующие крупные и средние ромбовидные кристаллы; 2) образующие мелкие ромбовидные кристаллы; 3) образующие аморфные кристаллы; 4) не образующие кристаллических включений; 5) образующие включения нетипичной формы, которые интенсивно прокрашивались по периметру кристаллов и слабо - внутри.

бипирамидальньши крупными

Группа штаммов с

бипирамидальными крупными кристаллами (крупные и средние ромбовидные кристаллы,

которые по равны или крупнее споры (рис. 1)), состояла из 19

Рис. 1. Фотография споро-кристаллической смеси Б. йиплд/елзи ээр. даИвпаа В-1003

1.1. Штаммы кристаллами

штаммов 9 подвидов В. 1Нипщ1ет1ь.

Результаты проведенного ПЦР-анализа показали, что бактериии В. ихигт&епш из этой группы содержали гены сгу\, кодирующие токсины, специфичные к личинкам насекомых отряда Чешуекрылые, причем у 10 штаммов, кроме сгу 1-гена, было обнаружен ген сгу2, кодирующий токсины, специфичные для личинок бабочек и комаров.

Из анализа споро-кристаллических смесей в БОЗ-ПААГ (рис. 2, табл. 1) видно, что все штаммы из этой группы, имели один основной белок с молекулярной массой порядка 130-140 кДа, а у штаммов В. 11хигт%1еп515 взр. кипч(ак1 В-917, В-994 и В-995, В. Мигт&етгз ээр. galleriae В-1003, В-1004, В-1005 В-997, В. 1}шг'т£[е>ш$ вкр. Ыу/огьЫ В-933 был выявлен дополнительный белок с молекулярной массой около 65 кДа.

Рис. 2, Злектрофореграмма слорокристаллических * п* • ' г _ ч смесей штаммов б. Шип'пдтпк с крупными

, " - бипмрамидальнымикристалламио129450$-ПААГ:

^ ,5! ? 1. Маркер молекулярного веса;

2. В. тЪигтдктк мр. яжо В-921; 3.8.Ошппдкмв55р.ЛигпдюаЬВ-911;

4. В. г/шгтдкюй !5р. кипГаЫ В-916;

5. В. Мигтдкта 55р. еШотосШт В-925;

6. В. Ощппдкпвп ир. еп!отооЛ«В-926;

7. В. ХЬиппдюпхп ^р, о/га№о/В-927;

8. В. &иппдкт"а ¿эр. (оЛуоПЫВ-ЭЗЗ^ ' , 9. В. 1ЬитдктН кр, ки&ШВ-ЭП.

Оценка специфичности действия В. 11шг1п%1ет1$ на насекомых показала, что все штаммы с крупными бипирамидальными кристаллами проявляли токсичность в отношении личинок чешуекрылых насекомых. Однако спектры их биологической активности различались (табл. 1).

Исключением из этой группы был штамм В. 1кигт^1ет15 вер. уинпапегтя В-956 - при наличии гена сгу 1, а также белка размером 130кДа, что соответствует предполагаемому размеру токсинов, кодируемых этими генами, он не проявлял биологической активности к насекомым отряда Чешуекрылые, которые были взяты в исследование. Отсутствие энтомоцидной активности к личинкам насекомых из отряда Чешуекрылые можно объяснить узким спектром насекомых, взятых для анализа.

205 -=• 116 -•>

66 -45 ■ • 25

'ад*'

Таблица 1. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, образующих бипирамидальные кристаллы.

Bt ssp. Штамм Форма кристаллов Нали -чие гено в Белковый профиль, кЛа Специфичность действия

thuringiensis B-911 вытянутые крупные бипирамиды сгу] 130 Lepidoptera: H.evonymellus; P.sticticalis; G. mellonella -ингибирование роста

kurstaki B-916 ромбовидные cryl 130 Lepidoptera: H. evonymellus; P.sticticalis; L. dispar; Choccidentalis

B-917 B-994 B-995 крупные ромбовидные + вставки cryl cry2 130 65 Lepidoptera: H. evonymellus; P. sticticalis; L. dispar; Ch. occidentalis; Díptera A. aegypty

sotto B-921 крупные ромбовидные cryl cry9 130 Lepidoptera: H.evonymellus; L. dispar; G. mellonella -ингибирование роста

galleriae B-521 B-996 ромбовидные cryl cry9 130 Lepidoptera: H. evonymellus; P. sticticalis; L. dispar; G. mellonella

B-1005 B-1004. B-1003 B-997 крупные ромбовидные cryl cry2 cry9 130 65 Lepidoptera: H. evonymellus; P. sticticali.G. mellonella Díptera: A.aegypty

entomocidus B-925 средние ромбовидные cryl cry9 130 Lepidoptera H. evonymellus; G. mellonella - ингибирование роста

B-926 крупные ромбовидные cryl cry9 130 Lepidoptera: H. evonymellus; L. dispar; G. mellonella -ингибирование роста

aizawai B-927 средние ромбовидные cryl cry2 cry7, 8 сгу9 130 Lepidoptera: H. evonymellus; G. mellonella . - ингибирование роста

morrisoni B-928 крупные ромбовидные cryl сгу 2 сгу9 130 Lepidoptera: H.evonymellus; L. dispar; G. mellonella

tolworthi B-933 крупные ромбовидные cryl сгу2 130 65 Lepidoptera: H.evonymellus; L. dispar; G.mellonella; Díptera: A. aegypty

yunnanensis B-956 крупные ромбовидные cryl 130 активность отсутствует

Некоторые штаммы из этой группы проявляли дополнительную активность к личинкам комаров. А именно, те штаммы, у которых по результатам ПЦР анализа был выявлен ген сгу2, продукты которого, как известно, обладают двойной специфичностью (к комарам и бабочкам), и в белковом элекрофорезе показано наличие белка размером 65кДа (табл. 1). Двойная активность, обнаруженная для этих штаммов (В-917, В-994, В-995, В-1005, В-1004, В-1003, В-997, В-933), была ожидаема, так как известно, что некоторые штаммы, например В. (Иигт^етЬ ввр. киг81аМ НО-1, эффективны против вредителей из отрядов Чешуекрылые и Двукрылые.

Хотя штаммы В. 1кигт%1ет13 ввр. тгсют В-927 и В.

Бвр. тогг1яот В-928, содержали ген сгу2, они не продуцировали белков молекулярной массой 65кДа и, соответственно, не проявляли активности в отношении комаров А. аеёУрЧ (табл. 1).

Несколько штаммов с ромбовидными кристаллами: В. 1Ниг1П%1ет13 ээр. galleriae, В. 1киг1щ1ет15 ввр. ьойо В-921, В. гкшчп^пети ввр. еп1отоЫс1ш В-925 и В-926, В. &игт%1е№1$ ввр. тгсмт В-927, В. яяр. тоггичот В-928 - содержали

гены сгу9 (по результатам ПЦР анализа). Они вызывали гибель или ингибировали рост гусениц йаНепае теИопеИа.

1.2. Штаммы с мелкими бипирамидальными кристаллами

® отдельную группу были BV ■ • ^¡¿L щ Ц объединены штаммы, которые шорм^^Нр ™ формировали мелкие, по '' Я ВЦ g * сравнению со спорой, РР^ Цр бипирамидальные кристаллы ,. i M¿M ЛР* (рис. 3), длина которых _ . . . '........... " .. составляла 0,5 мкм: В.

Рис, 3. Фотография споро-кристаллическои

смеси в. thuringiensis ssp. sotto в-1020 thuringiensis ssp. finitimus B-914;

B. thuringiensis ssp. sotto B-1020 и В-1022; В. thuringiensis ssp. israelensis B-944, B-945; B. thuringiensis ssp. dacota B-947, B-948; B. thuringiensis ssp. indiana B-949; B. thuringiensis ssp. kumamotoensis B-951, B-952; B. thuringiensis ssp. mexicanensis B-969 и В. thuringiensis ssp. monterrey B-970.

У бактерий В. thuringiensis ssp.finitimus В-913, В. thuringiensis ssp. tochigiensis B-953, В. thuringiensis ssp. silo B-968 кристаллы похожей формы и размера оставались внутри экзоспориума, т.е. при микроскопии выглядели «сцеплеными» со спорой.

Спорокристаллические смеси, полученные для каждого из штаммов с мелкими бипирамидальными кристаллами, не проявляли биологической активности против представителей отрядов Чешуекрылые и Двукрылые.

Электрофорез в SDS-ПААГ показал, что у всех этих штаммов присутствует белок с молекулярной массой 130-135 кДа, в то же время имеются различия по количеству и составу других белков (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма спорокрисгадлических смесей штаммов В. thuringiensis с мелкими бипирамидальными кристаллами в 12% SDS-ПААГ: 1.8. thuringiensis ssp. finitimus В-913;

2. В. thuringiensis ssp. tochigiensis B-953;

3. В. thuringiensis ssp. israelensis 8-945;

4. 8. thuringiensis ssp. clokoto B-948;

5. B. thuringiensis ssp. indiana B-949; 6.8. thuringiensis ssp. kumomotoensis 8-952;

7. B. thuringiensis ssp. mexiconensis B-969;

8. Маркер молекулярного веса.

Из 15 штаммов с мелкими бипирамидальными кристаллами двенадцать были положительными в ГПДР с праймерами на гены cryl и 8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые. Штаммы, у которых мелкие кристаллы были «сцеплены» со спорой (В. thuringiensis ssp. finitimus В-913, В. thuringiensis ssp. tochigiensis B-953, В. thuringiensis ssp. silo B-968), a также штамм В. thuringiensis ssp. finitimus B-914, были отрицательными со всеми использованными универсальными праймерами.

Таким образом, полученные нами данные показали, что при оценке инсектицидности бактерий Bacillus thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только форму, но и размер кристаллов 5-эндотоксинов. В нашей работе мы разделили штаммы с бипирамидальными кристаллами в соответствии с их размерами на

1 2 3 4 5 6 7 М кДа

«—'.'05

.....

■Sí . Ífy ...«—116

-66

две группы. При проверке инсектицидности оказалось, что токсичность для насекомых из отряда Чешуекрылые проявляли только штаммы с крупными и средними бипирамидальными (ромбовидными) кристаллами. Штаммы с мелкими кристаллами такой же формы были неактивны в отношении этих насекомых. Они содержали гены сгу7, 8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые, в то время как ранее предполагалось, что бипирамидальная форма кристаллов обусловливает активность к насекомым из отряда Чешуекрылые.

1.3. Штаммы с аморфными кристаллами

Следующую группу штаммов образовывали культуры,

продуцировавшие аморфные

параспоральные включения (рис. 5). В нее вошли: В. thuringiensis ssp. sumiyoshiensis В-918; В. thuringiensis ssp. fukuokaensis B-919; В. thuringiensis ssp. morrisoni B-929; B. thuringiensis ssp. darmstadiensis B-935, B-936 и семь штаммов В. thuringiensis ssp. israelensis (табл. 2).

В. thuringiensis ssp. fukuokaensis B-919, B. thuringiensis ssp. morrisoni B-929; B. thuringiensis ssp. darmstadiensis B-935, B-936 и В. thuringiensis ssp. israelensis оказались токсичными для комаров. Кроме того, штаммы В. thuringiensis ssp. morrisoni В-929, В. thuringiensis ssp. darmstadiensis B-935, B-936, B. thuringiensis ssp. israelensis ингибировали рост гусениц G. mellonella, а штамм В. thuringiensis ssp. sumiyoshiensis В-918 вызывал их гибель (табл. 2).

Электрофорез спорокристаллических смесей штаммов с бесформенными включениями показал, что у штаммов В. thuringiensis, активных против комаров, основные белковые компоненты имели молекулярную массу 90 или 72 кДа, дополнительный мажорный белок с молекулярной массой 28 кДа, а также белок 130 кДа (рис. 6).

Методом ПЦР-анализа было показано, что штаммы В. thuringiensis ssp. israelensis и В. thuringiensis ssp. morrisoni B-929 имели москитоцидальные гены сгу4 и cry] 1, cytl, cytl (табл. 2). У

Рис. 5. Фотография споро-кристаллической смеси В. thuringiensis ssp. morrisoni B-929

штаммов В. thuringiensis ssp. darmstadiensis были обнаружены только cry4 и cytl москитоцидальные гены.

"Да М 1 2 3 4 5 6

205 -...■.

116....... •

97.........

Рис. 6. Электрофореграмма спорокристаллических смесей штаммов В. 1:Ьиг1пд'1еп$15 с аморфными кристаллами в 12% БОБ-ПААГ: М - маркер молекулярного веса;

1. В. ^иг'тд'шпьЫ эзр. игае/еп5Г5 В-1000;

2. В. Ошппд/епз^Б 55р. «гае/ешй В-1007;

3. 8. thl^п>)эíeпs/s 55р. /£Гое/еп5/5 В-1002;

4. В. 1Ниг1пд1епи$ ^р. татьот 8-929;

5. В. Мигтд/епяз вэр. ¡Бгае1еп$Ь В-999;

6. 8. Миплд/елхйг 55р. darmstad¡ensis В-936.

Несмотря на то, что у В thuringiensis ssp. fukuokaensis В-919 не было выявлено москитоцидальных генов cry A, cry\ 1А, cyt\, cytl, он был токсичен для комаров. Вероятно, его активность связана с наличием у данной культуры других москитоцидальных генов.

Некоторые из исследованных штаммов содержали гены 8-эндотоксинов с иной специфичностью (табл. 2). Так, у штамомв В. thuringiensis ssp. Darmstadiensis В-936, В. thuringiensis ssp. morrisoni B-929 было выявлены гены сгу\ и сгу9.

У В. thuringiensis ssp. sumiyoshiensis В-918 с аморфными параспоральными включениями не было выявлено москитоцидальных генов, но обнаруживались Lepidoptera-специфичные гены cry 1 и cry9. Этот штамм был токсичен для личинок гусениц G. mellonella и неактивен в отношении комаров. Ранее уже были описаны Ьергаор1ега-сптш\тчпы£ штаммы, которые продуцировали аморфные кристаллы (Wasano N. and Ohba М., 1998; Hansen В.М. et al., 1998).

1.5. Акристаллические штаммы

Ряд штаммов: В. thuringiensis ssp. israelensis В-943, В. thuringiensis ssp. thuringiensis B-912, В. thuringiensis ssp. yunnanensis B-955 и В. thuringiensis ssp. galleriae B-1010 - являлись акристаллическими штаммами, т.е. не формировали кристалл.

Таблица 2. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, образующих аморфные параспоральные включения__

Bt ssp. Штамм Белковый профиль, кДа Наличие cry генов Специфичность действия

ssp. israelensis В-1000 B-992 B-993 В-1007 В-1002 В-1001 В-999 130 72 28 сгу4 crylla су ti cyt2 Aedes aegypti (Díptera) - 100% гибель Galleriae mellonella (Lepidoptera) -ингибирование роста

ssp. darmstadiensis В-936 В-935 135 90 29 28 cryl cryl cry4 сгу9 cyt2 Aedes aegypti (Díptera) 100% гибель Galleriae mellonella (Lepidoptera) -ингибирование роста

ssp. morrisoni В-929 135 130 72 28 cryl c¡y4 cryl cry9 crylla cytl cyt2 Aedes aegypti (Díptera) - 100% гибель Galleriae mellonella (Lepidoptera) -ингибирование роста

1 ssp. fukuokaensis В-919 90 50 29 28 Aedes aegypti (Díptera) - 100% гибель

ssp. sumiyoshiensis В-918 130 cryl cry9 Galleriae mellonella (Lepidoptera)

Примечание: 130 72 - интенсивность проявления полосы при окрашивании

Все штаммы из этой группы были нетоксичны для личинок насекомых и не продуцировали специфических белков (рис. 7). Тем не менее, проведенный нами ПЦР-анализ (рис. 8) выявил наличие ряда генов 8-эндотоксинов у акристаллических вариантов бактерий В. //шп'и^/еяад ввр. //шп'л^/еиям (сгу\), ввр. galleriaв (сгу\; сгу9), Бвр. уиппапет1з (сгу\).

Причин подобного несоответствия может быть несколько, но наиболее вероятная - низкий уровень экспрессии или отсутствие экспрессии определенных генов токсинов вследствие мутации в ДНК.

Отсутствие энтомопатогенной активности у штаммов в данной группе закономерно, так как специфическая токсичность бактерий В. 1кигт^1епш к личинкам насекомых связана именно с кристаллами 5-эндотоксинов.

нДа М 1 2

116-ЭШ

45 >

28—* I

Рис. 7. Электрофореграмма споронристаллических смесей штаммов в 12% ПААГ. М - маркер молекулярного веса;

1 -В. Итг/пдкп-;!!35р. даИепоеВ-521;

2 В. гЛкл/>!д/ел5в 55р. доНегюе В-101О.

П.Н.

1000

Рис. 8. Электрофореграмма продуктов ПЦР-аналиэа штаммов В. И>иппд'1еп51$ на наличие генов группы сгу1.

1. В. Миппд/епзм Миппд/епз/з В-912;

2. В. Миппд/епз!! 55р. У5гае/еП5/$ В-943;

3. В. ^иппд'1еп5'1$ Бзр. даНепае В-1010;

4. 6. 55р. уиппапепя'з В-Э55;

5. Маркер молекулярного веса.

1.6. Штаммы с нетипичной формой кристаллов

Штаммы В. thuringiensis ввр. поуоьШгвк В-966, Бвр. ата%1еп51$ В-971, В-972, звр. toguch.ini , В-973, В-974 объединенные в четвертую группу,

продуцировали параспоральные включения нетипичной формы, которые интенсивно

прокрашивались по периметру кристаллов и слабо - внутри (рис. 9). Эти штаммы были нетоксичны для тестируемых насекомых отрядов Чешуекрылые и Двукрылые. Анализ спорокристаллических смесей в ЗОБ-ПААГ выявил необычный

Рнс. 9. Фотография споро-кристаллической смеси В. 1}тпп&епш%$р.по\1>мЫг5к В-966

белковый профиль у этих штаммов. Исследованные культуры имели основные белковые компоненты с молекулярной массой около 60 и 45 кДа, а у штаммов В. ввр. поуохгЫгнк

дополнительно присутствовал белок с молекулярной массой 100 кДа (рис. 10).

М 1

205 » -Г? \ :

" *; И ». *

116 .<«*< ' * Ж

97 : >щ - ..... ,

66 v — , •

45 i 'ж.

Рис. 10. Электрофореграмма спорокристаллических смесей штаммов В. Миппд/епз/! с нетипичной формой кристаллов в 12% БОБ-ПААГ:

1. Маркер молекулярного веса;

2. В. №иг/>?д/еп5/з эвр. лоиоз/ь/ге/с в-966; е. 6. мигтд/еп515 ^р. юдисЫт в-974; 4. В. ^иппд'!еп5'и э£р. атад/елз« в-971.

тш '

Штаммы Б. thuringiensis ssp. amagiensis, toguchini дали отрицательные результаты в анализе со всеми использованными универсальными праймерами, а для штамма Л. thuringiensis ssp. novosibirsk был найден ген сгу9. Известно, что семейство Сгу9 белков включает несколько подгрупп. Только токсин, кодируемый геном сгу9Аа, проявляет специфическую активность к личинкам G. mellonella. Вероятно, штамм Bt ssp. novosibirsk содержал другой вариант гена сгу9.

Таким образом, результаты исследований подтвердили, что лишь совместное применение традиционных и молекулярно-генетических методов анализа в изучении энтомопатогенной бактерии дает возможность точнее предсказать специфичность ее действия на насекомых. Кроме того, полученные нами данные показали, что при оценке инсектицидности бактерий Bacillus thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только форму, но и размер кристаллов 5-эндотоксинов.

В целом, наши результаты, полученные в ПЦР анализе по выявлению специфических генов 8-эндотоксинов, согласуются с литературными данными, и энтомопатогенная активность штаммов в группах коррелирует с наличием соответствующих генов и их белковых продуктов.

2. Типирование штаммов В. thuringiensis методом RAPD-анализа

Исследованные нами штаммы принадлежали к 27 серологическим группам, однако Н-серотипирование, иммунологическая реакция с бактериальными жгутиковыми антигенами, не дает никакой информации о родстве штаммов, филогенетических отношениях между штаммами. Целью дальнейшего исследования было выявление филогенетических взаимоотношений подвидов В. thuringiensis при помощи метода RAPD-ПЦР анализа, или метода ПЦР с "рассеянной" затравкой. Этот метод основан на использовании коротких праймеров, гибридизующихся с комплементарными участками хромосомной ДНК при невысокой температуре отжига. При этом один и тот же праймер выполняет роль и прямого, и обратного праймера. Число и локализация комплементарных участков хромосомной ДНК варьирует у штаммов одного вида, а размеры и количество амплификационных . фрагментов становятся факторами, положенными в основу диагностики штаммов.

2.1. Подбор праймеров для метода RAPD

Выбор праймеров и соблюдение стандартных условий ПЦР являются принципиально важными для эффективности метода RAPD.

Было использовано несколько произвольных праймеров, с помощью которых оценивали внутривидовое разнообразие штаммов В.thuringiensis: 09555-03, GDI, GD3.

Для дальнейшего анализа был выбран праймер 09555-03 (рис. 11), он давал стабильные, хорошо воспроизводимые, видоспецифичные наборы фрагментов, что определило выбор в его пользу. Ранее этот праймер уже применялся для типирования штаммов В. thuringiensis (BrousseauR. et al., 1993).

При работе с различными подвидами В. thuringiensis с этим праймером был получен наиболее широкий спектр различных паттернов (рис. 11). Размер анализируемых фрагментов составил от 0,4 до 3 тыс. п.н. Каждый из подвидов имел свой определенный спектр амплифицированных RAPD-продуктов, отличающийся от других количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности (рис. 11).

Рнс. 11. RAPD-ПЦР анализ с нспользованнем праймера 09555-03 1,9- маркер молекулярного веса;

2 - В. thuringiensis ssp. israelensis В-992;

3 - В. thuringiensis ssp. israelensis B-1000;

4-i?. thuringiensis ssp. israelensis,B-1001;

5-B. thuringiensis ssp. israelensis B-1002;

6-B. thuringiensis ssp. israelensis B-1007; 7 - B. thuringiensis ssp. thuringiensisB-911; S-B. thuringiensis ssp. thuringiensisB-912; 10—B. thuringiensis ssp./™tfmiöB-913; И - В. thuringiensis ssp.finitimusB-914;

12-B. thuringiensis ssp. tohokuensisB-950;

13—B. thuringiensis ssp. j/!cB-968; ¡4-S. thuringiensis ssp. amagiensisB-971; 15-B. thuringiensis ssp. amagiensis B-972; 16 - B. thuringiensis ssp. toguchiniB-973; 17-Ä thuringiensis ssp. toguchini B-974.

2.2. Анализ подвидов В. thuringiensis по RAPD-типам.

Данные по филогенетическому анализу исследованных штаммов представлены на рисунке 12. Все исследованные нами штаммы В. thuringiensis были распределены на 37 RAPD-типов (RAPD-типы были получены из филогенетического дерева при 90%-ом подобии).

Результаты, полученные нами, согласуются с данными, описанными ранее в статье Rivera А.М с соавт. (Rivera A.M., Priest F.G., 2003), где на других штаммах В. thuringiensis была построена дендрограмма, в которой взаиморасположение некоторых подвидов совпадает с нашими данными.

В нашей работе наиболее широко представленными были подвиды В. thuringiensis ssp. gallería, В. thuringiensis ssp. kurstaki, В. thuringiensis ssp. israelensis.

По результатам RAPD-анализа генетически наиболее гомогенными были подвиды В. thuringiensis ssp. gallería, В. thuringiensis ssp. kurstaki (рис. 12), т.е. все штаммы внутри подвидов показывали одинаковые, или близкие паттерны, несмотря на различия штаммов по наличию cry генов.

Ранее нами было показано, что штаммы В. thuringiensis ssp. gallería В-521, В-996, В-1005, В-1010 имеют гены сгу\ и сгу9, остальные штаммы из этого подвида В. thuringiensis ssp. gallería В-997, В-1003, В-1004, В-1006 показали наличие еще и гена сгу2.

Также эти штаммы различались и по продукции кристаллов. Однако, при генотипировании с произвольным праймером, как штаммы с крупными кристаллами В. thuringiensis ssp. gallería В-996, В-997, В-1003, так и с мелкими кристаллами В. thuringiensis ssp. gallería В-1006 и акристаллический вариант Л. thuringiensis ssp. gallería В-1010 имели одинаковые картины RAPD-профилей.

Аналогичные результаты были получены и для В. thuringiensis ssp. kurstaki. Несмотря на различия в кристаллообразовании и в распределении генов у штаммов В. thuringiensis ssp. kurstaki, картинки фингерпринтов (слэнг?) для них были одинаковыми (рис. 12). Вследствие этого можно предположить, что для В. thuringiensis ssp. gallería и ssp. kurstaki потеря/изменение кристаллообразования существенно не затрагивают геном бактерии.

В. thuringiensis ssp. israelensis был представлен 10 штаммами, которые различались по морфологии синтезируемых кристаллов. Штаммы В. thuringiensis ssp. israelensis В-944, В-945 продуцировали кристаллы в форме мелких ромбов, В. thuringiensis ssp. israelensis В-943 относился к споровым ¿кристаллическим вариантам, остальные штаммы В. thuringiensis ssp. israelensis характеризовались кристаллами в форме крупных глыбок, классическими для данного подвида (табл. 2). При определении генов эндотоксинов ранее нами было показано, что практически все штаммы этого подвида содержат москитоцидальные гены сгу4, cry\ 1, за исключением штаммов В. thuringiensis ssp. israelensis В-944, В-945, характеризовавшихся наличием генов cryl, 8, и штамма В. thuringiensis ssp. israelensis В-943, не показавшего наличие исследованных генов.

Согласно RAPD-анализу (рис. 11) и результатам, представленным в дендрограмме (рис. 12), видно, что штаммы В. thuringiensis ssp. israelensis разделились на две группы (2 RAPD-тип'а). Одну группу составляли штаммы В. thuringiensis ssp. israelensis В-944, В-945 с мелкими бипирамидальными кристаллами, другую - штаммы с крупными бесформенными округлыми параспоральными включениями и акристаллофорный штамм В. thuringiensis ssp. israelensis В-943. Совершенно очевидно, что в данном случае присутствуют существенные различия в геноме, в том числе связанные с приобретением штаммами В. thuringiensis ssp. israelensis В-944, В-945 cryl, 8 генов.

Несмотря на различие в картине паттернов у штаммов внутри подвидов В. thuringiensis ssp. yunnanensis, morrisoni, amagiensis, только штаммы подвида В. thuringiensis ssp. yunnanensis попали в разные RAPD-типы на филогенетическом дереве; остальные образовывали близкие RAPD-типы. Для В. thuringiensis ssp. yunnanensis это, вероятно, связано с тем, что исследованные 2 штамма сильно отличаются по своим свойствам: штамм В-955 является акристаллическим вариантом В. thuringiensis ssp. yunnanensis, а штамм В-956 продуцирует необычно крупные ромбовидные кристаллы.

Штаммы В. thuringiensis ssp. sotto В-1020 и В-1020 оказались одинаковы по результатам полимеразной цепной реакции с произвольным праймером, только штамм В. thuringiensis ssp. sotto В-921 этого же подвида отличался от остальных членов В. thuringiensis ssp. sotto по картине RAPD-анализа. Это отличие отражается и в спектре cry генов, так у штаммов В. thuringiensis ssp. sotto В-1020 и В-1020 был обнаружен ген cry! и/или сгу8, у штамма В. thuringiensis ssp. sotto В-921 этого гена нет, но присутствует ген сгу\.

По два штамма от В. thuringiensis ssp. dakota, darmstadiensis, entomocidus, finitimus, thuringiensis, toguchini, kumamotoensis были взяты в анализ для выявления филогенетического родства. Эти штаммы внутри подвида показали высокую гомогенность в RAPD-анализе. Необходимо отметить, что штаммы некоторых подвидов В. thuringiensis показали идентичные или близкородственные RAPD-картины со штаммами, принадлежащими к другим подвидам. Например, штаммы В. thuringiensis ssp. silo В-968 и В. thuringiensis ssp. tohokuensis В-950 имели высоко родственные RAPD-паттерны, как показано на рис. 11. В. thuringiensis ssp. gallería, В. thuringiensis ssp. kurstaki отличались друг от друга по положению только одной полосы. Можно предположить, что в обоих случаях указанные штаммы близко родственны друг другу.

Методом RAPD-анализа мы определяли таксономический статус атипичных штаммов В. thuringiensis из Долины гейзеров, Камчатка, и филогенетические отношения между ними и типовыми штаммами В. thuringiensis. Было показано, что штаммы В. thuringiensis Долины гейзеров (Gi47, Gil 17, GÍ416, GÍ424, GÍ429, GÍ443, GÍ466, GÍ530, GÍ535, GÍ542, GÍ719, Dg992, Dg994, DglOl 1,

Штамм R APD-типы

Etsg> fhurägiaisi 1 Etiip touri-fieiiSK

Etsgifiütirus Etsgi iifiiüms iüo

Riip tohobaeniii Ets$> tohrocthi

а 551 ¡аПотм gtlmte Rs^ ^Оши Rs^t ^Esritt Rssp gilsiu Rs;p gtüexiM Ets;j» giflmtA Ets^ aHmtt В1.5ф iureUki

as^itaretAi Rsg> Iflrotsbi Rs<p timwti Hi^ immsam

Rsg> sotto Ri^ sotto Btsq) sotto asspjunmiwnsis , dttott 1 а$ф daltou

j asqjkmmBOLMrsis 1 Rs^luaamütoereis

В.; ф atfomicidus 1 öttotBOcidus - Rs^jurmmäisis Rsg? uratlensis R^i iraAfensis R sg> ¿r« linsis a sip irti bniii аеф kcwlerisii as?) teteinsii asgi isrMlaiiis Rssp krailensis

fukidkunsE Rs^ duxtt&dkuü as$ damBtLdjensis asgj yikiilani , assp Krwkniii 1 Rs^) krwknsis Rsq? kisis asg) bgudliii Rs^togudiiü Rssp iUEÜTj^O^ÜÄlsii

Rsq> anagimsk Rsq> ana^Mifisis

B-911

В-9Ы

Gä52i

B-9B

B-91+

B-9S3

В 950

ВЗИ

Dg992

DflOM

DeJM

GS3(i

GBJi

№19

BslOU

Hfl (Iii

Belli Ii

Ш16

CHU

Ш29

Ш43

Güti

CS542

GC19

GS117

Ш7

B-521

B-99Ö

B-997

В-1СОЗ

B-1004

B-1C05

В-Ш6

B-1010

B-916

B-995

B-917

B-994

B-927

В-£>28

B-929

B-92I

B-ltQO

В-1И2

B-955

B-947

B-948

B-951

B-952

B-925

B-935

B-955

B-943

B-992

B-963

E-999

B-1000

В-Ш1

B-1002

В-1Ш7

B-919

B-935

B-93S

B-942

B-9+t

B-945

B-976

B-973

B-P74

B-91S

B-9Ö5

B-971

B-972

1 1

6 7

8 9

10 11 11 11 11 11 11 11 11 12 12 1J 14 15t 15t 15t 15t 15t 15b 15b 15b 16t 16t 1Й 16b

20 21 21 22 23

26 17 27 27 27 27 27 27

28 29

eo so -

% сходимости

Рис. 12. Филогенетические взаимоотношения штаммами В. thuringiensis по результатам RAPD-анализа.

между

Dgl015, Dgl018, Dgl024) составляют на филогенетическом дереве отдельную подгруппу (за исключением штамма GÍ528) (рис. 12).

Таким образом, проведено типирование В. thuringiensis с помощью метода RAPD-фингерпринтинга для определения генетического родства штаммов как внутри, так и между подвидами. В результате анализа 73 штамма В. thuringiensis были распределены нами на 37 RAPD-типов.

По результатам филогенетического анализа наиболее гомогенными были подвиды В. thuringiensis ssp. gallería, В. thuringiensis ssp. kurstaki. Сделано предположение, что для этих подвидов потеря/изменение кристаллообразования не затрагивают существенно геном бактерии.

В то же время, для В. thuringiensis ssp. israelensis мелкокристаллические штаммы В-944, В-945, характеризовавшиеся наличием генов cryl, 8, и крупнокристаллические штаммы оказались на дендрограмме разделенными на два RAPD-типа, что, вероятно, отражает существенные различия в строении их геномов.

Результаты проведенных исследований подтвердили, что данная методология позволяет вести дифференциацию В. thuringiensis не только на уровне подвидов, но и внутри подвидов. Как правило, все штаммы В. thuringiensis в пределах подвида имели идентичные RAPD-профили, и большинство штаммов, принадлежащих к разным подвидам, не показали похожих картин фингерпринтинга. Полученные картины RAPD-патгернов будут являться основой для создания геномных паспортов на исследованные штаммы, а данный подход может стать в дальнейшем эффективным инструментом паспортизации энтомопатогенных бактерий.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании штаммов бактерии Bacillus thuringiensis из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН выявлено и охарактеризовано 28 штаммов, обладающих инсекцицидной активностью.

2. Впервые показано, что при оценке инсектицидности бактерий В. thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только форму, но и размер кристаллов 8-эндотоксинов.

3. Выяснено, что токсичность в отношении насекомых отряда Чешуекрылые проявляли только штаммы с крупными и средними бипирамидальными (ромбовидными) кристаллами. Штаммы с мелкими кристаллами такой же формы были неактивны в отношении этих насекомых. Показано, что мелкие бипирамидальные кристаллы характерны для штаммов, содержащих гены cry7, 8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые, в то время как ранее предполагалось, что бипирамидальная форма кристаллов обусловливает активность к насекомым из отряда Чешуекрылые.

4. Проведено генетическое типирование 73 штаммов В. thuringiensis с помощью метода RAPD-фингерпринтинга, выявлено 37 RAPD-типов. Показано, что все штаммы В. thuringiensis в пределах подвида имели идентичные RAPD-профили, в то же время большинство штаммов, принадлежащих к разным подвидам, не показали схожих картин фингерпринтинга.

5. Полученные картины RAPD-паттернов являются основой для создания геномных паспортов на исследованные штаммы

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Мокеева A.B., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Орешкова С.Ф., Андреева И.С., Репин В.Е. Сравнительный анализ штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis молекулярно-генетическими методами // Биотехнология. - 2006. - №3. - С.47-55.

2. Мокеева A.B., Орешкова С.Ф., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Репин В.Е.. Молекулярное типирование штаммов бактерии Bacillus thuringiensis с помощью RAPD-анализа // Биотехнология. - 2008. - №3. - С.40-47.

Доклады и тезисы конференций:

1. Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Глупов В.В., Орешкова С.Ф., Мокеева A.B., Андреева И.С., Репин В.Е. Энтомопатогенность бактерий Bacillus thuringiensis и её связь с гетерогенностью популяций // Сибирская зоологическая конференция, Новосибирск, 15-22 сентября 2004 г., с.361.

2. Мокеева A.B., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Калмыкова Г.В., Репин В.Е. Типирование энтомопатогенных штаммов бактерии Bacillus thuringiensis молекулярно-биологическими методами // Третья международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 19-20 октября 2004 г.

3. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Калмыкова Г.В., Репин В.Е. Сравнительный анализ штаммов Bacillus thuringiensis с помощью методов RAPD-фингерпринтинга и ПЦР-детекции cry генов // Межрегиональная научно-практическая конференция «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 27-29 октября 2004 г., с.40-41.

4. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Калмыкова Г.В., Репин В.Е. Характеризация штаммов Bacillus thuringiensis с помощью методов RAPD-фингерпринтинга и ПЦР-детекции cry генов // Материалы третьего московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития, Москва, 14-18 марта 2005 г., с.281.

5. Kalmikova G.V., Burtseva L.I., Mokeeva A.V., Oreshkova S.F.

Characterization of selected Bacillus thuringiensis strains //38 annual meeting Society for Invertebrate pathology, Anchorage, 7-11, august 2005, p.56.

6. Kalmykova G., Burtseva L., Dybovskiy I., Glupov V., Andreeva I., Mokeeva A., Oreshkova S. and Repin V. Studying of natural strains of Bacillus cereus - B. thuringiensis from Siberia and Far East // 39th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, 9th International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, Wuhan, China, 27 August - 1 September, 2006, p. 181-182.

7. Мокеева A.B., Орешкова С.Ф., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Репин В.Е. Характеризация и типирование энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis молекулярно биологическими методами // Материалы 2-го Байкальского Микробиологического Симпозиума с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ», Иркутск, 10-15 сентября 2007, с. 182-183

8. Андреева И.С., Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Ломзов А.А., Репин В.Е. RAPD анализ атипичных штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из почвы и источников Долины гейзеров (Камчатка) // В кн.: Сб. мат. IV Межд. Научн. Конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» в 2-х томах. Минск, 2-6 июня 2008 г. - Минск, 2008. - Т.1. - С. 124-126.

МОКЕЕВА Анна Владимировна ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ 5-ЭНДОТОКСИНОВ И ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ В. thuringiensis МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Подписано в печать 25.11.2009. Заказ № 122. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Отпечатано в Институте катализа СО РАН. 630090 Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мокеева, Анна Владимировна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Энтомопатогенная бактерия B.thuringiensis.

2.2. Классификация подвидов B.thuringiensis.

2.3. Токсины B.thuringiensis.

2.3.1. Композиция кристаллов 5-эндотоксинов и их морфология.

2.3.2. Доменная организация эндотоксинов.

2.3.3. Механизм действия 5-эндотоксинов.

2.3.4. Гены 5-эндотоксинов.

2.3.5. Классификация 5-эндотоксинов.

2.4. Применение В. thuringiensis.

2.4.1. Применение препаратов В. thuringiensis в качестве биопестицидов.

2.4.2. Трансгенные растения, несущие гены энтомопатогенных белков В. thuringiensis.

2.4.3. Медицинское применение штаммов В. thuringiensis.

2.5. Устойчивость популяций насекомых к действию B.thuriniensis.

2.5.1. Лабораторные линии насекомых, устойчивые к действию В. thuringiensis.

2.5.2. Природные линии насекомых, устойчивые к действию В. thuringiensis.

2.5.3. Молекулярные механизмы устойчивости.

2.6. Скрининг коллекций для выявления перспективных штаммов В. thuringiensis.

2.6.1. Выявление белков 5-эндотоксинов с помощью иммунологического анализа.

2.6.2. Гибридизационный анализ геномной ДНК.

2.6.3. ПЦР-анализ в определении генов энтомопатогенных белков.„48 2.7. Методы классификации штаммов B.thuringiensis.

2.7.1. Секвенирование последовательностей рРНК.

2.7.2. Риботипирование рРНК (гибридизация).

2.7.3. Методы типирования, основанные на ПЦР.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Питательные среды.

3.1.4. Буферные растворы.

3.1.5. Олигонуклеотиды.

3.1.6. Бактерии.

3.1.7. Насекомые.

3.2. Методы.

3.2.1. Выделение ДНК.

3.2.2. ПЦР-анализ по выявлению генов, кодирующих 5-эндотоксины.

3.2.3. RAPD-анализ с праймерами GDI, GD3.

3.2.4. RAPD-анализ с праймером 09555-03.

3.2.5. Филогенетический анализ.

3.2.6. Приготовление культур бактерий для биоанализа.

3.2.7. Анализ белков методом электрофореза в SDS-ПААГ.

3.2.8. Биотестирование штаммов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Сравнительная характеристика штаммов с различной формой кристаллов 5-эндотоксинов.

4.1.1. Штаммы с бипирамидальными крупными кристаллами.

4.1.2. Штаммы с мелкими бипирамидальными кристаллами.

4.1.3. Штаммы с бесформенными кристаллами.

4.1.4. Акристаллические штаммы.

4.1.5. Штаммы с нетипичной формой кристаллов.

4.2. Типирование штаммов В. thuringiensis методом RAPD-анализа.

4.2.1. Подбор праймеров для RAPD-анализа.

4.2.2. Анализ подвидов В. thuringiensis по RAPD-типам.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация генов δ-эндотоксинов и типирование штаммов B.thuringiensis методами генетического анализа"

В последнее время все большее внимание уделяется микробиологическим средствам защиты растений. Препараты на основе Bacillus thuringiensis являются одними из наиболее эффективных и широко применяемых средств борьбы с насекомыми (Navon А., 2000).

Bacillus thuringiensis - энтомопатогенный аэробный почвенный грамположительный микроорганизм (Бурцева Л.И., Штерншис М.В., Калмыкова Г.В., 2001). Данные бактерии в ходе споруляции способны образовывать кристаллоподобные включения (Schnepf Е. et al., 1998), состоящие из энтомоцидных белков S-эндотоксинов (также называемых Cry белками). Эти белки обладают высокой специфичностью токсического действия в отношении ряда насекомых и одновременно безвредны для животных и человека (Schnepf Е. et al., 1998), что позволило создать на их основе экологически безопасные инсектицидные препараты (около 90-95% рынка биопестицидов) и использовать как альтернативу химикатам для борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства.

Коммерческий интерес к биологическому контролю над насекомыми усилил поиск новых изолятов В. thuringiensis с различной токсичностью, а также новых по специфичности и альтернативных генов токсинов (Feitelson J.S. et al., 1992). Это привело к значительному увеличению числа исследованных штаммов (Lecadet М-М. et al., 1999), а таюке вызвало необходимость в систематизации и изучении уже отобранных культур. Необходимо обеспечить возможность выбора, чтобы справиться с проблемой устойчивости насекомого к токсину, особенно в случае экспрессии генов В. thuringiensis, кодирующих инсектицидные белки в трансгенных растениях (Van Rie J., 1991).

Наиболее широко применяемый метод подвидовой классификации В. thuringiensis основан на Н-серотипировании, иммунологической реакции с бактериальными жгутиковыми антигенами, с дополнением биохимических данных. На сегодняшний день штаммы В. thuringiensis разделены на 84 серовара (Reyes-Ramirez A. and Ibarra J.E., 2005). Однако, многие штаммы внутри серовара не одинаковы по биохимическим, генетическим и токсическим свойствам. Так, некоторые серовары, например В. thuringiensis ssp. israelensis, включают штаммы с практически одинаковыми свойствами, другие с широким спектром свойств. Например, В. thuringiensis ssp. morrisoni включает штаммы, токсичные для личинок комаров (Padua L.E. et al., 1984), жуков (Hofte Н. et al., 1987), бабочек (De Barjac H., Frachon E., 1990). С другой стороны, некоторые серовары могут иметь биохимическое, генетическое и токсическое сходство между собой. Серотипирование не пригодно для неподвижных и самоагглютинирующих штаммов, более того агглютинация наблюдается у некоторых штаммов B.cereus (Lecadet М-М. et al., 1999, Ohba M., Aizawa К, 1986). Помимо этого, существующая схема серотипирования не позволяет судить о генетическом родстве штаммов внутри группы и между группами.

Таким образом, существует необходимость в специфическом типировании В. thuringiensis, с целью анализа распространения штаммов в окружающей среде и поиска новых штаммов.

В связи с этим целью работы являлось всестороннее изучение штаммов энтомопатогенных бактерий В. thuringiensis, входящих в коллекцию Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея Института систематики и экологии животных СО РАН, с помощью молекулярно-биологических и биохимических методов, биоанализа на насекомых, а также проведение типирования данных штаммов методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи: • характеризация штаммов В. thuringiensis по наличию определенных генов эндотоксинов;

• характеризация белкового состава спорокристаллических смесей штаммов В. thuringiensis;

• характеризация штаммов В. thuringiensis по инсектицидной активности;

• типирование штаммов В. thuringiensis методом полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами (RAPD-метод);

• филогенетический анализ штаммов В. thuringiensis на основе данных RAPD-ПЦР анализа.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Штаммы Bacillus thuringiensis из коллекции штаммов Отдела «Коллекция микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и из музея Института систематики и экологии животных СО РАН охарактеризованы по наличию определенных генов 5-эндотоксинов, инсектицидной активности, белковому составу спорокристаллических смесей. Проведен филогенетический анализ штаммов.

Из исследованных 73 штаммов Bacillus thuringiensis инсектицидной активностью обладали 28 штаммов. Они могут стать основой для создания энтомопатогенных препаратов. Выявление генов 5-эндотоксинов позволит проводить поиск инсектицидной активности штаммов уже в более узком круге хозяев, что значительно облегчит выявление более перспективных препаратов. Атипичные, неинсектицидные штаммы, а также штаммы из Долины гейзеров (Камчатка), представляют интерес для исследования их цитоцидальной активности и использования в дальнейшем в противораковой терапии. Полученные картины RAPD-паттернов являются основой для создания геномных паспортов на исследованные штаммы.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

При исследовании штаммов бактерии Bacillus thuringiensis из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и музея

Института систематики и экологии животных СО РАН выявлено и охарактеризовано 28 штаммов, обладающих инсекцицидной активностью.

При оценке инсектицидности бактерий В. thuringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать не только форму, но и размер кристаллов 5-эндотоксинов. Мелкие бипирамидальные кристаллы характерны для штаммов, содержащих гены cry 7,8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые, в то время как ранее предполагалось, что бипирамидальная форма кристаллов обусловливает активность к насекомым из отряда Чешуекрылые.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов и списка литературы. Библиография включает 210 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 7 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мокеева, Анна Владимировна

5. ВЫВОДЫ

3. Выяснено, что токсичность в отношении насекомых отряда Чешуекрылые проявляли только штаммы с крупными и средними бипирамидальными (ромбовидными) кристаллами. Штаммы с мелкими кристаллами такой же формы были неактивны в отношении этих насекомых. Показано, что мелкие бипирамидальные кристаллы характерны для штаммов, содержащих гены сгу7, 8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые, в то время как ранее предполагалось, что бипирамидальная форма кристаллов обусловливает активность к насекомым из отряда Чешуекрылые.

5. Полученные картины RAPD-паттернов являются основой для создания геномных паспортов на исследованные штаммы.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи:

1. Мокеева А.В., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Орешкова С.Ф., Андреева И.С., Репин В.Е. Сравнительный анализ штаммов энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis молекулярно-генетическими методами // Биотехнология. - 2006. - №3. - С.47-55.

2. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Репин В.Е. Молекулярное типирование штаммов бактерии Bacillus thuringiensis с помощью RAPD-анализа // Биотехнология. - 2008. - №3. - С.40-47.

Доклады и тезисы конференций:

1. Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Глупов В.В., Орешкова С.Ф., Мокеева А.В., Андреева И.С., Репин В.Е. Эитомопатогенность бактерий Bacillus thuringiensis и её связь с гетерогенностью популяций // Сибирская зоологическая конференция, Новосибирск, 15-22 сентября 2004 г., с.361.

2. Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Андреева И.С., Калмыкова Г.В., Репин В.Е. Типирование энтомопатогенных штаммов бактерии Bacillus thuringiensis молекулярно-биологическими методами // Третья международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 19-20 октября 2004 г.

5. Kalmikova G.V., Burtseva L.I., Mokeeva A.V., Oreshkova S.F. Characterization of selected Bacillus thuringiensis strains // 38th annual meeting Society for Invertebrate pathology, Anchorage, 7-11 august 2005, p.56.

6. Kalmykova G., Burtseva L., Dybovskiy I., Glupov V., Andreeva I., Mokeeva A., Oreshkova S.,and Repin V. Studying of natural strains of Bacillus cereus-B. thuringiensis from Siberia and Far East // 39th Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, 9th International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control, Wuhan, China, 27 August - 1 September, 2006, p. 181-182.

8. Андреева И.С., Мокеева А.В., Орешкова С.Ф., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Ломзов А.А., Репин В.Е. RAPD анализ атипичных штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных из почвы и источников Долины гейзеров (Камчатка) // Сб. мат. IV Межд. Научн. Конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» в 2-х томах. Минск, 2-6 июня 2008 г. - Минск, 2008. - Т.1. - С. 124-126.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе исследовались две коллекции бактерий В. thuringiensis, хранящиеся в Институте систематики и экологии животных СО РАН и в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". С помощью биоанализа на насекомых, ПЦР и белкового электорофореза был проведен сравнительный анализ штаммов, разделенных нами на группы по форме и размерам кристаллов 8-эндотоксинов. Результаты проведенных исследований показали, что энтомопатогенная активность штаммов в группах, в основном, коррелирует с наличием определенных генов и их белковых продуктов.

Полученные в работе данные позволили сделать вывод, что при оценке инсектицидности бактерий Bacillus t huringiensis, основанной на морфологии параспоральных включений, необходимо учитывать форму и размер кристаллов 8-эндотоксинов. Использованное нами объединение штаммов в группы не только по форме, но и по размерам кристаллов показало, что мелкие бипирамидальные кристаллы характерны для штаммов, содержащих гены сгу7, 8, которые кодируют токсины, активные против насекомых из отряда Жесткокрылые, в то время как ранее предполагалось, что бипирамидальная форма кристаллов обусловливает активность к насекомым из отряда Чешуекрылые.

Результаты исследований подтвердили, что лишь совместное применение традиционных и молекулярно-генетических методов анализа в изучении энтомопатогенной бактерий дает возможность быстро предсказать специфичность ее действия на насекомых.

Проведено типирование 73 штаммов В. thuringiensis, с помощью метода RAPD-фингерпринтинга для определения генетического родства штаммов как внутри, так и между подвидами. В результате анализа штаммы В. thuringiensis были распределены нами на 37 RAPD-типов.

По результатам филогенетического анализа наиболее гомогенными были подвиды В. thuringiensis ssp. galleria, В. thuringiensis ssp. kurstaki, несмотря на различия в кристаллообразовании и в распределении cry генов у входящих в них штаммов. Сделано предположение, что для этих подвидов потеря/изменение кристаллообразования не затрагивают существенно геном бактерии.

В то же время, для В. thuringiensis ssp. israelensis мелкокристаллические штаммы В-944, В-945, характеризовавшиеся наличием генов cryl, 8, и крупнокристаллические штаммы оказались на филогенетическом дереве разделенными на два RAPD-типа, что, вероятно, отражает существенные различия в организации их геномов.

Полученные в работе данные подтвердили, что RAPD-методология позволяет вести дифференциацию В. thuringiensis не только на уровне подвидов, но и внутри подвидов. Как правило, все штаммы В. thuringiensis в пределах подвида имели идентичные RAPD-профили, и большинство штаммов, принадлежащих к разным подвидам, не показали схожих картин фингерпринтинга.

Таким образом, картины RAPD-паттернов могут являться основой для создания геномных паспортов штаммов В. thuringiensis, а предложенный подход является эффективным инструментом паспортизации энтомопатогенных бактерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мокеева, Анна Владимировна, Кольцово

1. Андреева И.С., Печуркина Н.И., Бурцева Л.И., Калмыкова Г.В., Пучкова Л.И., Саранина И.В., Репин В.Е. Атипичные штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные из почвы и горячих источников Долины гейзеров (Камчатка) // Биотехнология. 2008. - № 6. — С. 41-50.

2. Бурцева Л.И., Штерншис М.В., Калмыкова Г.В. Бактериальные юолезни насекомых // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001.-С. 189-245.

3. Евлахова А.А., Швецова О.И. Инфекционные и протозойные болезни полезных и вредных насекомых. М.: Сельскохозяйственная литература. - 1956. - С. 94-107.

4. Егоров Н.С., Юдина Е.Г. Производство и приминение продуктов микробиологических производств. Вып. 6. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989, 50 с.

5. Миненкова И.Б, Григорьева Т.М., Ганнушкина Л.А., Шагов Е.М., Азизбекян P.P. Характеристика штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных в различных климато-географических регионах России // Биотехнология. 2002. - № 6. - С. 11-16.

6. Честухина Г.Г. Изучение структуры и функции дельта-эндотоксинов и протеиназ Bacillus thuringiensis: Автореф. дисс. д-ра. биол. наук. -М., 1990.-53 с.

7. Akhurst R.J., Lyness E.W., Zhang Q.Y., Cooper D.J. and Pinnock D.E. A 16S rRNA Gene Oligonucleotide Probe for Identification offiacillus thuringiensislsolates from Sheep Fleece // Journal of Invertebrate Pathology. 1997. - V. 69, № 1. - P. 24-30.

8. Allen T.M. Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy // Nat. Rev. Cancer. 2002. -V. 2. - P. 750-763.

9. Andrews R.E.Jr., Bibilos M.M., Bulla L.A.Jr. Protease activation of the entomocidal protoxin of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki // Appl. Environ. Microbiol. -1985. V. 50, № 4. - P. 737-742.

10. Andrews R.E.Jr, Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C. and Bulla L.A.Jr. The biotechnology of Bacillus thuringiensis // CRC Crit Rev Biotechnol. -1987.-V. 6.-P. 163-232.

11. Angus T.A. A bacterial toxin paralysing silkworm larvae // Nature. 1954. -V. 173.-P. 545-546.

12. Aronson A.I. and Fitz-James P. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat // Bacteriol. Rev. 1976. - V. 40. - P. 360-402.

13. Aronson A.I., Han E.S., McGaughey W. and Johnson D. The solubility of inclusion proteins from Bacillus thuringiensis is dependent upon protoxin composition and is a factor in toxicity to insects // Appl Environ Microbiol.- 1991.-V. 57.-P. 981-986.

14. Asano S. Identification of cry gene from Bacillus thuringiensis by PCR and isolation of unique insecticidal bacteria // Mem. Fac. Agric. Hokkaido Univ.- 1996.-V. 19.-P. 529-563.

15. Awad M.K., Saadaoui I., Rouis S., Slim T. and Jaoua S. Differentiation between Bacillus thuringiensis strains by gyrB PCR-Sau3Al fingerprinting // Molecular Biotechnology. 2007. - V. 35, № 2. - P. 171-177.

16. Barloy F., Lecadet M-M. and Delecluse A. Distribution of clostridial cry-like genes among Bacillus thuringiensis and Clistridium strains // Curr.Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 232-237.

17. Baumann L., Okamoto K., Unterman B.M., Lynch M.J. and Bauman P. Phenotypic characterization of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus // J Invertebr Pathol. 1984. -V. 44. - P. 329-341.

18. Beegle C.C. and Yamamoto T. History of Bacillus thuringiensis Berliner research and development // Can. Entomol. 1992. - V. 124. - P. 587-616.

19. Berliner E. Ueber die schlaffsucht der Ephestia kuhniella und Вас. thuringiensis n. sp. // Z. Angew Entomol. 1915. - V. 2. - P. 21-56.

20. Brousseau R., Saint-Onge A., Prefontaine G., Masson L., and Cabana J. Arbitrary primer polymerase chain reaction, a powerful method to identify B. thuringiensis serovars and strains // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V. 59.-P. 114-119.

21. Bucher G. Disease of the larvae of tent caterpillars caused by a sporeforming bacterium.// Can J Microbiol. 1957. - V. 3. - P. 695-709.

22. Bulla L.A., Kramer K.J. and Davidson L.I. Characterization of the entomocidal parasporal crystal of Bacillus thuringiensis // J Bacteriol. -1977.-V. 130.-P. 375-383.

23. Burges H.D. Microbial control of pests and plant diseases 1970- 1980. Academic Press, London. 1981. - P. 1-949.

24. Burtseva L.I., Burlak V.A., Kalmikova G.V., de Barjac H.,. Lecadet M. -M. Bacillus thuringiensis novosibirsk (Serovar H24a24c), a New Sspecies from the West Siberian Plain // J Invertebr Pathol. 1993. - V.66. - P. 92-93.

25. Butko P., Huang F., Pusztai-Carey M. and Surewicz W. K. Interaction of the delta endotoxin CytA from Bacillus thuringiensis var.israelensis with lipid membranes // Biochemistry. 1997. - V. 36, № 42. - P. 12862-12835.

26. Butko, P. Cytolytic toxin CytlA and its mechanism of membrane damage: data and hypotheses // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - P. 2415-2422.

27. Carlson C.R. and Kolsto A-B. A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome // J Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 1053-1060.

28. Carozzi N.B., Kramer V.C., Warren G.W, Evola S. and Koziel M. G. Prediction of insecticidal activity of B. thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. -P. 3057-3061.

29. Ceron J., Ortiz A., Quintereca L. and Bravo A. Specific PCR primers directed to identify cry I and cry III genes within a Bacillus thuringiensis strain collection // Appl Environ Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 38263831.

30. Chak K.F., Chao D.C., Tseng M.Y., Kao S.S., Tuan S.J. and Feng T.Y. Determination and distribution of cry-type genes of Bacillus thuringiensis isolates from Taiwan // Appl Environ Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 2415-2420.

31. Chilcott C.N., Wigley P.J. Isolation and toxicity of Bacillus thuringiensis from soil and insect habitats in New Zealand // J.Invertebr.Pathol. 1993. -V. 61.-P. 244-247.

32. Cooksey K.E. The protein crystal toxin of Bacillus thuringiensis: Biochemistry and mode of action // Microbial control of insects and mites / Burges H.D. and Hussey N.W. New York, London: Academic Press Inc. -1971.-P. 247-274.

33. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., van Rie J., Lereclus D., Baum J. and Dean D.H. Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. -V. 62.-P. 807-813.

34. Crickmore N. The diversity of Bacillus thuringiensis endotoxins // Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application. Kluwer Academic Publishers. - 2000. - P. 65 - 78.

35. Debro L., Fitz-James P.C., Aronson A. Two different parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis ssp. finitimus // J Bacteriol. 1986. -V. 165, №1.-P. 258-268.

36. Dulmage H.T. Insecticidal activity of HD-1, a new isolate of Bacillus thuringiensis var. alesti // Journal of Invertebrate Pathology. 1970. - V. 15.-P. 232-239.

37. Ejiofor A.O. and Johnson T. Physiological and molecular detection of crystalliferous Bacillus thuringiensis strains from habitats in the South Central United States // J Indian Microbiol Biotechnol. 2002. - V. 28. - P. 284-290.

38. Fast P.G. The crystal toxin of Bacillus thuringiensis // Microbial control of pests and plant diseases 1970-1980 / Ed. Burges H.D. New York, London: Academic Press Inc. - 1981. - P. 223-248.

39. Federici B.A., Maddox J.V. Host Specificity in Microbe-Insect Interactions // Bioscience. 1996. - V. 46, № 6. - P. 410-421.

40. Feitelson J.S., Payne J. and Kim L. Bacillus thuringiensis: insects and beyond // Biotechnology. 1992. - V. 10. - P. 271-275.

41. Ferrandis M.D., Juarez-Perez V.M., Frutos R., Bel Y. and Ferre J. Distribution of cry I, cry II and cry V genes within Bacillus thuringiensis isolates from Spain // Syst Appl Microbiol. 1999. - V. 22. - P. 179-185.

42. Ferre J., Escriche В., Bel Y. and Van Rie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 132. - P. 1-7.

43. Froechler B.C., Ny P.G., Mattencci M.D. Synthesis of DNA via deoxinuclleoside H-phosphonate intermediates // Nucl.Acds Res, 1986, V.14,p.5399-5407

44. Frutos R., Rang C. and Royer M. Managing insect resistance to plants producing Bacillus thuringiensis toxins // Crit. Rev. Biotechnol. 1999. -V. 19.-P. 227-276.

45. Gelernter W.D. and Evans H.F. Factors in the Success and Failure of Microbial Insecticides // Integrated Pest Management Reviews. 1999. -V. 4.-P. 279-316.

46. Gill S.S., Cowles, E.A. and Pietrantonio P.V. The mode of action of B. thuringiensis endotoxins // Annu. Rev. Entomol. 1992. - V. 37. - P. 615636.

47. Goldberg L.J. and Margalit J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus, Aedes aegypti and Culex pipiens // Mosq News. 1977. -V. 37.-P. 355-358.

48. Gonzalez J.M.Jr and Carlton B.C. Patterns of plasmid DNA in crystalliferous and acrystalliferous strains of Bacillus thuringiensis // Plasmid. 1980. - V. 3. - P. 92-98.

49. Gonzalez J.M.Jr, Dulmage H.T. and Carlton B.C. Correlation between specific plasmids and delta-endotoxin production in Bacillus thuringiensis // Plasmid.-1981.-V. 5. P. 351-365.

50. Gonzalez J.M., Brown B.J.Jr. and Carlton B.C. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding for delta-endotoxin among strains of B. thuringiensis and B. cereus // Proc Natl Acad Sci (USA). 1982. - V. 79. -P. 6951-6955.

51. Gonzales J.M. and Carlton B.C. A large transmissible plasmid is required for crystal toxin production in Bacillus thuringiensis variety israelensis // Plasmid. 1984. - V. 11. - P. 28-38.

52. Gould F., Martinez-Ramirez A., Anderson A., Ferre J., Silva J. and Moar W.J. Broad-spectrum resistance to Bacillus thuringiensis toxins in Heliothis virescens // Proc. Natl.Acad Sci USA. 1992. - V. 89. - P. 7986-7990.

53. Grochulski P., Masson L., Borisova S., Pusztai-Carey M., Schwartz J.L., Brousseau R. and Cygler M. Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation // J Mol Biol. 1995. — V. 254. - P. 447-464.

54. Guerchicoff A., Ugalde R.A. and Rubinstein C.P. Identification and characterization of a previously undescribed cyt gene in Bacillus thuringiensis ssp. israelensis // Appl Environ Microbiol. 1997. - V. 63. — P. 2716-2721.

55. Guerchicoff A., Delecluse A. and Rubinstein C.P. The Bacillus thuringiensis cyt genes for hemolytic endotoxins constitute a gene family // Appl Environ Microbiol. 2001. - V. 67. - P. 1090-1096.

56. Hannay C.L. Crystalline inclusions in aerobic spore-forming bacteria // Nature (Lond). 1953. - V. 172. - P. 1004.

57. Hansen B.M., Damgaard P.H., Eilenberg J. and Pedersen J.C. Molecular and phenotypic characterization of Bacillus thuringiensis isolated from leaves and insects // J Invertebr Pathol. 1998. - V. 71, № 2. - P. 106-114.

58. Hastowo S., Lay B.W., Ohba M. Naturally occurring Bacillus thuringiensis in Indonesia // Journal of Applied Bacteriology. 1992. - V. 73. - P. 108113.

59. Heimpel A.M. and Angus T.A. The taxonomy of insect pathogens related to Bacillus cereus Frankland and Frankland // Can J Microbiol. -1958. V. 4. -P. 531-541.

60. Heimpel A.M. A critical review of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner and other crystalliferous bacteria // Annu Rev Entomol. 1967. -V. 12.-P. 287-322.

61. Helgason E., Caugant D.A., Lecadet M-M., Chen Y., Mahillon J., Lovgren A., Hegna I., Kvaloy K. and Kolsto A-B. Genetic diversity of Bacillus cereus / B. thuringiensis isolates from natural sources // Curr Microbiol. -1998.-V. 37.-P. 80-87.

62. Herrera G., Snyman S. and Thompson J. Construction of a bioinsecticidal strain of Pseudomonas fluorescens active against the sugarcane borer, Eldana saccharina // Appl Environ Microbiol. 1994. - V. 60. - P. 682690.

63. Hofte, H., Seurink, J., Van Houtven, A., Vaeck M. Nucleotide sequence of a gene encoding an insecticidal protein of Bacillus thuringiensis var. tenebrionis toxic against coleoptera // Nucleic Acids Res. 1987. - V.15. -7183.

64. Hofte H. and Whiteley H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis // Microbiol Rev. 1989. - V. 53. - P. 242-255.

65. Honee G. and Visser B. The mode of action of Bacillus thuringiensis crystal proteins//EntomolExp Appl.- 1993.-V. 69.-P. 145-155.

66. Huber H.E. and Liithy P. Bacillus thuringiensis delta-endotoxin: Composition and activation // Pathogenesis of invertebrate microbial diseases / Ed. Davidson E.W. Totowa, New Jersey: Allanheld-Osmun Publishers. - 1981. - P. 209-234.

67. Huber-Lucac M., Jaquet F., Luthy P., Hutter R. and Braun D.G. Characterization of monoclonsl antibodies to a crystal protein of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki // Infect Immun 1986. - V. 54. - P. 228-232.

68. Ibarra J.E., del Rincon M.C., Orduz S., Noriega D., Benintende G., Monnerat R., Regis L., de Oliveira C.M.F., Lanz H., Rodriguez M.H.,

69. Sanchez J., Репа G. and Bravo A. Diversity of Bacillus thuringiensis Strains from Latin America with Insecticidal Activity against Different Mosquito Species // Applied and Environmental Microbiology. 2003. - V. 69, № 9. - P. 5269-5274.

70. Ichimatsu Т., Mizuki E., Nishimura К., Акао Т., Saitoh H.,. Higuchi K. and Ohba M. Occurrence of Bacillus thuringiensis in fresh waters of Japan // Current Microbiology. 2000. - V. 40. - P. 217-220.

71. Iriarte J., Bel Y., Ferrandis M.D., Andrew R., Murillo J., Ferre J. and Caballero P. Environmental distribution and diversity of Bacillus thuringiensis in Spain // Syst. Appl. Microbiol. 1998. - V. 21. - P. 97 -106.

72. Ishiwata S. On a kind of severe flacherie (sotto disease) // Dainihon Sanshi Kaiho. 1901. -V. 114.-P. 1 -5.

73. Ito A., Sasaguri Y., Kitada S., Kusaka Y., Kuwano K., Masutomi K., Mizuki E., Акао Т., Ohba M. A Bacillus thuringiensis crystal protein with selective cytocidal action to human cells // J. Biol. Chem. 2004. - V. 279. -P. 21282-21286.

74. Jaquet F., Hiitter R. and Liithy P. (1987) Specificity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin // Appl Environ Microbiol. 1987. - V. 53. -P. 500-504.

75. Joung K.B. and Cote J.C. Phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis serovars based on 16S rRNA gene restriction fragment length polymorphisms // J. Appl. Microbiol. 2001. - V. 90. - P. 115-122.

76. Joung K.B. and Cote J.C. A phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis'B>?iC\\\\xs thuringiensis serovars by RFLP-based ribotyping // J. Appl. Microbiol. -2001a. -V. 91. P. 279-289.

77. Juarez-Perez V.M., Ferrandis M.D. and Frutos R. PCT-based approach for detection of novel Bacilluss thuringiensis cry genes // Appl Environ Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 2997-3002.

78. Kalman S., Kiehne K.L., Libs J.L. and Yamamoto T. Cloning of a noval crylC-type gene from a strain of Bacillus thuringiensis ssp. galleriae // Appl Environ Microbiol. 1993.-V. 59.-P. 1131-1137.

79. Katayama, H., H.Yokota, T. Akao, O.Nakamura, M.Ohba , E. Mekada, and E. Mizuki. Parasporin-1, a novel cytotoxic protein to human cells from non-insecticidal parasporal inclusions of Bacillus thuringiensis // J. Biochem. -2005.-V. 137.-P. 17-25.

80. Knowles B.H. and Ellar D.J. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanisms of action of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins with different insect specificity // Biochim Biophys Acta. 1987. - V. 924. - P. 509-518.

81. Krieg A. Thuricin, a Bacteriocin Produced by Bacillus thuringiensis // J. Invert. Path. 1970. - V. 15. - P. 291.

82. Krieg A., Huger A.M., Langenbruch G.A. and Schnetter W. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, a new pathotype effective against larvae of Coleoptera // Z Angew Entomol. 1983. - V. 96, № 5. - P. 500-508.

83. Kronstad J.W. and Whiteley H.R. Three classes of homologous Bacillus thuringiensis crystal-protein genes // Gene. 1986. - V. 43, № 1-2. - P. 2940.

84. Kuo W.S. and Chak K.F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA // Appl. Environ Microbiol. -1996.-V. 62.-P. 1369-1377.

85. Kuo W.S., Lin J.H., Tzeng C.C., Kao S.S. and Chak K.F. Cloning of two new cry genes from Bacillus thuringiensis ssp. wuhanensis strain // Curr Microbiol. 2000. - V. 40. - P. 227-232.

86. Kurstak E.S. Donnees sur Г epizootic bacterienne naturelle provoquee par un Bacillus du type Bacillus thuringiensis sur Ephestia kiihniella Zeller Entomophaga // Mem. Hors. Ser. 1962. - V. 2. - P. 245-247.

87. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. - v.227. - N 5259. - P. 680-685

88. Lecadet M-M., Frachon E., Dumanoir V.C., Ripouteau H., Hamon S., Laurent P., Thiery I. Updating the H-antigenic classification of Bacillus thuringiensis // J Appl Microbiol. 1999. - V. 86. - P.660-672.

89. Lee M.K., Rajamohan F., Gould F. and Dean D.H. Resistance to Bacillus thuringiensis CrylA ^-endotoxins in a laboratory-selected Heliothisvirescens strain is related to receptor alteration // Appl. Environ. Microbiol.- 1995.-V. 61.-P. 3836-3842.

90. Lee H-K., Gill S.S. Molecular cloning and characterization of a novel mosquitocidal protein gene from Bacillus thuringiensis ssp. fukuokaensis // Appl and Environm Microbiol. 1997. - V. 63, № 12. - P. 4664-4670.

91. Li J., Carroll J. and Ellar D.J. Crystal structure of insecticidal (delta)-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution // Nature (Lond).- 1991.-V. 353.-P. 815-821.

92. Liithy P. Insecticidal toxins of Bacillus thuringiensis // FEMS Microbiol Letters. 1980. - V.8. - P. 1-7.

93. Liithy P. and Ebcrsold H.R. The entomocidal toxins of Bacillus thuringiensis // Pharmacol Ther. 1981. - V. 13. - P. 257-283.

94. Lynch M.J. and Baumann P. Immunological comparisons of the crystal protein from strains of Bacillus thuringiensis // J Invertebr Pathol. 1985. -V. 46.-P. 47-57.

95. Macintosh S.C., Stone T.B., Jokerst R.S. and Fuchs R.L. Binding of Bacillus thuringiensis proteins to a laboratory-selected line of Heliothis vircscens // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 8930-8933.

96. Martin P.A.W. and Travers R.S. Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates // Appl Environ Microbiol. 1989. - V. 55. -P. 2437-2442.

97. Masson L., Erlandson M., Puzstai-Carey M., Brousseau R., Juarez-Perez V. and Frutos R. A holistic approach for determining the entomopathogenic potential of Bacillus thuringiensis strain // Appl Environ Microbiol. 1998.- V. 64. P. 4782-4788.

98. Mc Connel E., Richard A. The production by Bacillus thuringiensis Berliner of a heat -stable substance toxic for insects // Can. J. Microbiol. -1959.-V. 5.-P. 161-168.

99. McGaughey W. H. Insect resistance to the biological insecticide Bacillus thuringiensis // Science. 1985. - V. 229. - P. 193-195.

100. Mc Gaughey W.H. and Beeman R.W. Resistance to Bacillus thuringiensis in colonies of Indianmeal moth and almond moth (Lepidoptera: Pyralidae) // J.Econ.Entomol. 1988. - V. 81. - P. 28-33.

101. McGaughey W.H. and Johnson D.E. Indianmeal moth (Lepidoptera: Pyralidae) resistance to different strains and mixture of Bacillus thuringiensis // J. Econ. Entomol. 1992. - V. 85. - P. 1594-1600.

102. McGaughey W. H. and Whalon M. E. Managing insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins // Science. 1992. - V. 258. - P. 1451-1455.

103. McGaughey W.H. and Johnson D.E. Influence of crystal protein composition of Bacillus thuringiensis strains on cross-resistance in Indianmeal moth (Lepidoptera: Pyralidae) // J. Econ. Entomol. 1994. - V. 87.-P. 535-540.

104. Meadows M.P., Ellis D.J., Butt J., Jarrett P., Burges H.D. Distribution, frequency, and diversity of Bacillus thuringiensis in an animal feed mill // Applied and Environmental Microbiology. 1992. - V. 58. - P. 1344-1350.

105. Miller H.I. 1983. Report on the World Health Organization Working Group on Health Implications of Biotechnology // Recomb. DNA Tech. Bull. -1983. V. 6, № 2ю - P. 65- 66.

106. Miteva V., Abadjieva A. and Gtigorova R. Differentiation among strains and serotyping of Bacillus thuringiensis by M13 DNA fingerprinting // J Gen Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 593-600.

107. Mizuki E., Ichimatsu Т., Hwang S.-H., Park Y.S., Saitoh H., Higuchi 1С. and Ohba M. Ubiquity of Bacillus thuringiensis on phylloplanes of arboreous and herbaceous plants in Japan // Journal of Applied Microbiology. 1999b. - V. 86. - P. 979-984.

108. Mizuki E., Park Y.S., Saitoh H., Yamashita S., Акао Т., Higuchi K. and Ohba M. Parasporin, a human leukemic cell-recognizing parasporal protein of Bacillus thuringiensis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. - V. 7. - P. 625-634.

109. Muller-Cohn J., Chaufaux J., Buisson C., Gilois N., Sanchis V. and Lereclus D. Spodoptera littoralis (Lepidoptera: Noctuidae) resistance to

110. CrylC and cross-resistance to other Bacillus thuringiensis crystal toxins // J. Econ. Entomol. 1996. - V. 89. - P. 791-797.

111. Nakamura L.K. DNA relatedness among Bacillus thuringiensis serovars // Int J Syst Evol Microbiol. 1994. - V. 44. - P. 125-129.

112. Navon A. Bacillus thuringiensis insecticides in crop protection reality and prospects // Crop Protection. - 2000. - V. 19. - P. 669-676.

113. Norris J.R. The protein crystal toxin of Bacillus thuringiensis: biosynthesis and physical structure // Microbial control of insects and mites / Ed. Burges H.D. and Mussey N.W. New York, London: Academic Press Inc. - 1971. - P. 229-246.

114. Office of Science and Technology Policy. 1986. Coordinated framework for regulation of biotechnology: announcement of policy and notice for public comment. U.S. Fed. Reg. -V. 51. P. 23302-23350.

115. Ohba M. and Aizawa K. Insect toxicity of Bacillus thuringiensis isolated from soils of Japan // Journal of Invertebrate Pathology. 1986. - V. 47. -P. 12-20.

116. Ohba M. and Aizawa K. Frequency of acrystalliferous sporeforming bacteria possessing flagellar antigens of Bacillus thuringiensis // J Basic Microbiol.- 1986a.-V. 26.-P. 185.

117. Ohaba M. and Aizawa K. Distribution of Bacillus thuringiensis strains in soils of Japan // J Invertebr Pathol. 1986b. - V. 47. - P. 277-282.

118. Ohba M., Yu Y.M., Aizawa K. Occurrence of non-insecticidal Bacillus thuringiensis flagellar serotype 14 in the soil of Japan // Systematic and Applied Microbiology. 1988. - V. 11. - P. 85-89.

119. Ohba M. Bacillus thuringiensis populations naturally occurring on mulberry leaves: a possible source of the populations associated with silkworm-rearing insectaries // Journal of Applied Bacteriology. 1996. - V. 80. - P. 56-64.

120. Ohba, M. Three Bacillus thuringiensis flagellar serovars widely occurring in natural environments of Japan // J. Basic Microbiol. 1997. — V. 37. — P. 71-76.

121. Oppert В., Kramer K.J., Johnson D., Upton S.J. and McGaughey W.H. Luminal proteinases from Plodia interpunctella and the hydrolysis of Bacillus thuringiensis CrylA(c) protoxin // Insect Biochem. and Mol. Biol. 1996. - V. 26.-P. 571-583.

122. Oppert В., Kramer K.J., Beeman R.W., Johnson D. and McGaughey W.H. Proteinase-mediated insect resistance to Bacillus thuringiensis toxins // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 23473-23476.

123. Padua L.E., Ohba M., Aizawa K. Isolation of a Bacillus thuringiensis strain (serotype 8a: 8b) highly and selectively toxic against mosquito larvae // J Invertebr Pathol. 1984. - V.44. - P.12-17

124. Peferoen M. Bacillus thuringiensis in crop protection // Agro-Food-Industry Hi-Tech. 1992. - V. 2, № 6. - P. 5 - 9.

125. Perez C.J. and Shelton A.M. Resistance of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) to Bacillus thuringiensis Berliner in Central America // J. Econ. Entomol. 1997. - V. 90. - P. 87-93.

126. Petricciani J.C. An overview of safety and regulatory aspects of the new biotechnology // Regul. Toxicol. Pharmacol. 1983. - V. 3, № 4. - P. 428433.

127. Priest F.G., Kaji D.A., Rosato Y.B., Canhos V.P. 1994 Characterization of Bacillus thuringiensis and related bacteria by ribosomal RNA gene restriction fragment length polymorphisms // Microbiology. 1994. - V. 140, №5. -P. 1015-1022.

128. Prieto D., Vazquez R., Gonzalez J. and de la Riva G.A. Obtainment of subclass-specific polyclonal antibodies against Bacillus thuringiensis 8-endotoxins by selective immunopurification // Adv. Mod Biotech. 1995. -V. 3.-P. 74.

129. Rai A.R., Meshram S.U., Dongre A.B. Optimization of RAPD-PCR for discrimination of different strains of Bacillus thuringiensis // Romanian Biotechnological Letters. V. 14, №. 2. - 2009. - P. 4307-4312.

130. Rihova B. Targeting of drugs to cell surface receptors // Crit. Rev. Biotechnol. — 1997. — V. 17. —№2, —P. 149-169.

131. Rivera A.M., Priest F.G. Molecular typing of Bacillus thuringiensisQacxWus, thuringiensis serovars by RAPD-PCR// System. Appl. Microbiol. 2003. -V.26.-P. 254-261.

132. Roh J.Y., Park H.W., Jin B.R., Kim H.S., Yu Y.M. and Kang S. K. Characterization of novel non-toxic Bacillus thuringiensis isolated from Korea // Lett. Appl. Microbiol. 1996. - V. 23. - P. 249-252.

133. Saiki R.K., Gaeertner F. and Wong A. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. -1988.-V. 239.-P. 487-491.

134. Samasanti W., Tojo A. and Aizawa K. Insecticidal activity of bipiramidal and cuboidal inclusions of S-endotoxins and distribution of their antigens among various strains of Bacillus thuringiensis // Agric Biol Chem. 1986. -V. 50.-P. 1731-1735.

135. Saxena D., Stotzky G. Release of Larvicidal Cry Proteins in Root Exudates of Transgenic Bt Plants // ISB News Report. 2005. - P .1-3.

136. Schnepf H.E. and Whiteley H.R. Cloning and expression of the B. thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. - P. 2893-2897.

137. Schnepf H.E., Wong H.C. and Whiteley H.R. The amino acid sequence of a crystal protein from B. thuringiensis deduced from the DNA base sequence // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 6264-6272.

138. Schnepf E., Crickmore N., van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R. and Dean D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. - V. 62. - P. 775-806.

139. Schwartz J.R., Garnean, Avaris D., Masson L., Brousseau R., Rousseau T. Lepidopteran-specific crystal toxins from Bacillus thuringiensis form cation- and anion-selective channels in planar lipid bilayers // J Membr Biol. 1993. - V. 132. - P. 53-62.

140. Shibano Y., Yamamoto A., Nakamura N., lizuka T. and Takanami M. Nucleotide sequence coding for the insecticidal fragment of the B. thuringiensis crystal protein gene // Gene. 1985. - V. 34. - P. 243-251.

141. Shisa N., Wasano N., Ohba M. Discrepancy between cry gene-predicted and bioassay-determined insecticidal activities in Bacillus thuringiensis natural isolates // J Invertebr Pathol. 2002. - V.81. - № 1. - P.59-61

142. Shukla G. S. and Krag D.N. Selective delivery of therapeutic agents for the diagnosis and treatment of cancer // Expert Opinion on Biological Therapy. 2006. - V. 6, № 1. - P. 39-54.

143. Slatin S.L., Abrams C.K. and English L. Delta-endotoxins form cation-selective channels in planar lipid bilayers // Biochem Biophys Res Commun. 1990. - V. 169. - P. 765-772.

144. Smedley D.P. and Ellar D.J. Mutagenesis of 3 surface-exposed loops of a Bacillus thuringiensis insecticidal toxin reveals residues important for toxicity, recognition and possibly membrane insertion // Microbiology. -1996.-V. 142.-P. 1617-1624.

145. Steinhaus E.A. Report on diagnoses of diseased insects, 1944-1950 // Hilgardia. 1951. - V. 20. - P. 629-678.

146. Stone T.B., Sims S.R. and Marrone P.G. Selection of tobacco budworm for resistance to a genetically engineered Pseudomonas fluorescens containing the s-endotoxin of Bacillus thuringiensis. kurstaki // J. Invertebr. Pathol. -1989.-V. 53.-P. 228-234.

147. Tabashnik B.E. Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis // Annu. Rev. Entomol. 1994. - V. 39. - P. 47-79.

148. Tabashnik B.E., Finson N., Groeters F.R., Moar W.J., Johnson M.W., Luo K. and Adang M.J. Reversal of resistance to Bacillus thuringiensis in Plutella xylostella // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 41204124.

149. Thurley P., Chilcott C.N., Kalmakoff J., Pillai J.S. Characterization of proteolytic activity associated with Bacillus thuringiensis var darmstadiensis crystals // FEMS Microbiol Letters. 1985. - V. 27. - P. 221-225.

150. Van Frankenhuyzen К. The challenge of Bacillus thuringiensis // Bacillus thuringiensis, an environmental biopesticide: Theory and practice / Ed.: Entwistle PF, Cory JS, Bailey MJ, & Higgs S. Chichester, New York, Toronto, Wiley & Sons.- 1993. P. 1-35.

151. Van Frankenhuyzen K. Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crystal proteins // J. Invertebr. Pathol. 2009. - V. 101, № 1. - P. 1-16.

152. Vankova J. Study of the effect of Bacillus thuringiensis on insects // Folia Biol. 1957. - V. 3. - P. 175-182.

153. Van Rie J., McGaughey W. H., Johnson D. E., Barnett B. D. and Van Mellaert H. Mechanism of insect resistance to the microbial insecticide Bacillus thuringiensis // Science. 1990. - V. 247. - P. 72-74.

154. Van Rie, J. Insect control with transgenic plants: Resistance proof? // Trends Biotechnol. 1991. - V. 9. - P. 177-179.

155. Warren R.E., Rubenstein D., Ellar D.J., Kramer J.M. and Gilbert R.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis: Protoxin activation and safety // Lancet. 1984. - V. 24. - P. 678-679.

156. Wasano N. and Ohba M. Assignment of й-endotoxin genes of the four lepidoptera-specific Bacillus thuringiensis strains that produce spherical parasporal inclusions // Curr. Microbiol. 1998. - V. 30. - P. 408-411.

157. Waugh R., Powell W. The use of RAPD markers for the detection of gene introgression in potato // Trends Biotechnol. 1992. - V. 10. - P. 186

158. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. - V.18, №. 24. - P.7213- 7218.

159. Whitcley H.R. and Schnepf H.E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis // Annual Review of Microbiology. 1986. - V. 40. - P. 549-576.

160. Williams I., Kubelik A.R, Livak K.I., Rafalski I.A., Tongey S.N. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers //Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18, №. 22. - P.6531-6535.

161. Wojciechowska J.A., Lewitin E., Revina L.P., Zalunin LA., Chestukhina G.G. Two novel delta-endotoxin gene families cry26 and cry28 from Bacillus thuringiensis ssp. finitimus // FEBS letters. 1999. - V. 453, № 1-2.-P. 46-48.

162. Yang H.H., Ma M.H., Vescio R.A. and Berenson J.R. Overcoming drug resistance in multiple myeloma: the emergence of therapeutic approaches to induce apoptosis// J. Clin. Oncol. 2003. - V. 21. - P. 4239-4247.

163. Yu C.G., Mullins M.A., Warren G.W., Koziel M.G., Estruch J.J The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects// Appl. Envir. Microbiol. 1997. -V. 63.-P. 532-536.

164. Yu J., Tan L, Liu Y., Pang Y. Phylogenetic analysis of Bacillus thuringiensis based on PCR amplified fragment polymorphisms of flagellin genes // Curr Microbiol. 2002. - V.45, № 2. - P.139-43.

165. Zhu L., Li C., Wu J., Liang J., Shi Y. Apoptosis of HL-60 cells induced by crystal proteins from Bacillus thuringiensis Bt9875 // Wei Sheng Wu Xuc Bao. 2008. - V. 48, № 5. - P. 690-694.

Информация о работе

Мокеева, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Идентификация генов δ-эндотоксинов и типирование штаммов B.thuringiensis методами генетического анализа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы