Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функцилнальной организации дельта-эндоксина CryGal из В. thuringiensis ssp galleriae и его гена

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функцилнальной организации дельта-эндоксина CryGal из В. thuringiensis ssp galleriae и его гена"

МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

На правах рукописи

Новикова Светлана Ивановна Р Г Б ОД

2 г Ш 2309

Изучение структурно-функциональной организации дельта-'Ч1Д0Т0)-:снна CrvlGal из В. thuringiensis ssp galleriae и его гена.

Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре Молекулярной Биофизики Московского Физико-Технического Института и в лаборатории химии белка им. В.М. Степанова ГУП «ГосНИИ Генетика - Государственного научно-исследовательского института Генетики и Селекции промышленных микроорганизмов».

Научный руководитель: кандидат биологических наук А.Б.Шевелев

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук В.И. Иванов

кандидат физико-математических наук, кандидат биологических наук М.Ю. Щелканов

Ведущая организация: Институт Молекулярной Генетики РАН

Защита состоится 23 мая 2000 г. в 14.30 на заседании диссертационного совета К063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институте (Государственной Университете) по адресу: 141700 Московская область г.Долгопрудный Институтский проезд 9, аудитория 119 ГК. С диссертацией можно ознакомитьс в диссертационном совете Московского Физико-Технического Института (Государственного Университета).

Автореферат разослан:

2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета К063.91.10

кандидат физико-математических наук

Киреев В.Б.

/

п^.го

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время широкое применение в биологических средствах защиты растений находят 5-эндотоксины Bacillus thuringiensis, активные в отношении личинок более чем 300 видов насекомых отрядов Lepidoptera, Díptera и Coleóptera. В связи с высокой избирательностью действия 5-эндотоксинов для поражения всего спектра насекомых-вредителей требуется использование большего их разнообразия. Поэтому усилия многих исследовательских групп направлены на поиск новых 5-эндотоксинов, обладающих ранее неизвестным типом специфичности. На данный момент клонированы и секвенированы гены более чем 80 различных 5-эндотоксинов. Тем не менее, поиск новых S-эндотоксинов и их генов остается актуальной задачей. Кроме того, механизмы экспрессии 5-эндотоксинов, их возможная взаиморегуляция, а также происхождение изучены недостаточно. Поэтому модель генов 5-эндотоксинов является перспективной с точки зрения изучения регуляции экспрессии генов у грам-положительных микроорганизмов в ходе споруляции, а также эволюции их генома. Изучение механизмов экспрессии генов 5-эндотоксинов, в особенности в штаммах с множественными генами, к которым относится выбранный нами штамм подвида galleriae, не только представляет научный интерес, но может также служить базой при создании новых высокоэффективных штаммов-продуцентов 5-эндотоксинов для сельского хозяйства.

Целью работы являлось клонирование и структурно-функциональная характеристика геномного локуса Bacillus thuringiensis подвида galleriae 11-67, содержащего новый ген 5-эндотоксина и изучение его белкового продукта, а также изучение возможности использования мини-гена устойчивости к эритромицину в качестве прямого транскрипционного репортера при создании продуцентов на базе Б. thuringiensis и широкого круга других микроорганизмов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В ходе проведенной работы разработан методический подход к скринингу геномных банков В. thuringiensis, основанный на использовании вырожденных праймеров для получения гибридизационного зонда на основе наиболее консервативного участка генов cry. За счет использования этого подхода клонирован и охарактеризован геномный локус, содержащий природно неэкспрессирующийся ген 5-эндотоксина cry 1 Gal, значительно отличающийся от известных ранее генов по последовательности. Общая длина секвенированной области составила 7 т.п.н. Проведена гетерологичная экспрессия клонированного гена в клетках Е. coli и В. subtilis, а также в клетках В. thuringiensis подвидовßnitimus и kurstaki. Предполагается, что экспрессия клонированной копии гена в клетках В. thuringiensis под контролем собственных регуляторных элементов при отсутствии его экспрессии в природном штамме достигнута лишь за счет перемещения гена из хромосомы в состав плазмиды рВА4, в результате чего изменилась его копийность и геномное окружение.

Доказана высокая устойчивость белка Cry 1 Gal, полученного в природно акристаллическом штамме В. thuringiensis к протеолнзу трипсином, что с одной стороны, доказывает нативность его пространственной структуры, с другой - является необычным

признаком для большинства кристаллических белков В. Ihuríitgiensis, под действием трипсина превращающихся в зрелые активные истинные токсины.

Проведены биотесты полученного белка-эндотксина Cry 1 Gal в отношении сосновой шагающей гусеницы Т. pytiocampa. Обнаружена умеренная токсичность белка в отношении этого экономически значимого вредителя леса. В ходе анализа 5'-фланкирующей части гена crylGal была найдена последовательность, подобная промотору транскрипции ВТП-типа. Наличие только одного споруляционного промотора BTII-типа ранее не показано для генов 5-эндотоксинов и обнаружено впервые. Обнаружено, что отсутствие промотора BTI, ответственного за природную суперэкспрессию 5-эндотоксинов, обуславливает отсутствие данного белкового продукта гена в кристаллах, но делает возможным его синтез под контролем собственного промотора, находящимся в составе мультикопийной бациллярной плазмиды.

Недавно в работах кафедры генетики Иллинойского университета под руководством профессора Манькина был постулирован новый механизм обеспечения устойчивости к макролидным антибиотикам за счет транскрипции и трансляции 15-ти нуклеотидной открытой рамки считывания, находящейся в составе природной 23S рРНК Е. coli. Дальнейшие исследования показали, что некоторые синтетические мини-гены, кодирующие тетра-, пента- и гексапептиды способны придавать устойчивость к макролидным антибиотикам клеткам К coli. На основании анализа набора последовательностей, обладающих этой способностью, полученных в результате скрининга экспрессионного банка синтетических олигонуклеотидов, была выведена консенсус-последовательность, обеспечивающая наибольшую степень защиты от антибиотика. Исследования поведения транскригтгов мини-генов в системах трансляции ш vitro позволили выдвинуть модель «бутылочного ерша», объясняющую механизм взаимодействия этих мРНК с рибосомой, в результате которого происходит удаление связанного в ней антибиотика.

Ранее не было получено доказательств возможности функционирования Е-псптидов в клетках бацилл, эволюционно удаленных от К coli. В настоящей работе мини-ген был впервые использован в качестве транскрипционного репортера (Рис. 4). В рамках характеристики мини-гена наряду с геном c/ylGal был использован ген глутамилэндопептидазы В. licheniformis (gseBL). Это дало возможность, в частности, существенно улучшить продуктивность низкоэффективных штаммов, продуцирующих глутамилэндопептидазу В. licheniformis.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 1 находится в печати. Результаты работы представлены на V Научной Конференции ГосНИИгенетика (Москва, Россия, 1997 г.) и Международном Симпозиуме Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses.(Хельсинки, Финляндия, 1997).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков и 7 таблиц. Полный объем работы 120 страниц.

Содержание работы.

1. Разработка универсальной схемы детекции и идентификации генов cry в геномах штаммов 11-67 и 6-96 методом PCR.

Для разработки универсальных олигонуклеотидов были приняты во внимание 10 индивидуальных генов, относящихся к различным классам - cry\A, cry IB, cry\C cry ID, crylGa2, cry IE, cry IF, cry9 G, cry4A и cry4B. Был проведен множественный элайнмент (выравнивание) их нуклеотидных последовательностей, соответствующих высококонсервативной С-концевой половине, не существенной для энтомоцидной активности. Гены cry2, cryi, cry4С and cry4D, у которых отсутствует эта часть, были исключены из рассмотрения. Сайты, выбранные для отжига праймеров, соответствовали наиболее консервативным участкам последовательности и служили для амплификации 255 п.н. фрагмента cry-гена. Все обнаруженные различия в последовательностях были приняты во внимание, таким образом, не было дискриминации в отношении редко представленных остатков в каждой позиции.

Степень вырожденности составляла около 1000 раз для праймера 1 и 3000 для праймера 2, поэтому условия PCR играют значительную роль в специфичности реакции. Была применена двухстадийная схема PCR. Первая стадия проводилась в жестких условиях, допускающих синтез только целевого фрагмента с участием хорошо отжигающейся части праймеров (не более 1/500), при этом образовывалось небольшое количество продукта. На второй стадии условия проведения смягчались, что увеличивало долю отжигающихся со значительными расхождениями праймеров, в результате происходило необходимое размножение нужного фрагмента. Описанные условия позволили получить около 0.5 мкг амплификата на Юмкл реакционной смеси с использованием в качестве матрицы геномной ДНК штаммов 11-67 и 6-96.

С целью изучения свойств полученного амплификата его метили методом рассеянной затравки и гибридизовали по Саузерну с сильно различающимися клонированными генами cry\A (crylAä) и сгу9А, которые присутствовали в геномах, служивших матрицами для амплификации. В качестве контроля ставилась гибридизация с этими генами зонда на основе cry 1А из штамма B.thutringiensis kurstaki. Использованная схема позволяла доказать присутствие в амплифицированном продукте фрагментов различных генов cry в соответствии с их представленностью в геноме исследуемого штамма. Полученные результаты показали возможность гибридизации амплификата с обоими генами, в то время как контрольный зонд гибридизовался только с cry 1Аа. Этот факт подтверждал присутствие в амплифицированном фрагменте ДНК двух наименее родственных друг другу с/у-генов, имеющихся в исходном штамме. Таким образом, полученный амплификат представлял всю совокупность генов, присутствующих в штамме, поэтому он мог служить универсальным с/у-зондом для их выявления в геноме с помощью гибридизации.

2. Идентификация генов cry штамма ealleriae 11-67.

Для идентификации генов исследуемого штамма была проведена Саузерн-гибридизация тотальной геномной ДНК, обработанной рестриктазами: Clal, Hindlll, Bell, Sspl, Xbal, EcoRI. В качестве зондов использовался универсальный cry-зонд штамма 6-96 и аналогичный ему амплификат, полученный на матрице клонированного геиа cry\ Ал. Используемые зонды специфичны в отношении высококонсервативного района сгу-последовательности, поэтому предполагалось обнаружение всех имеющихся в данном

штамме генов 8-эндотоксинов, за счет использования универсальных зондов ожидалось обнаружение новых генов, не родственных сгу\ и сгу9. Однако, по-видимому, данные штаммы не обладают сильно отдаленными по структуре генами, поэтому результаты использования разных зондов в данной ситуации не отличались. При использовании универсального зонда в штамме 11-67 было обнаружено три гена, пять генов были найдены в штамме 6-96 (три гибридизующиеся фрагмента генома при рестрикции EcoRI и Hindlll, и четыре фрагмента при рестрикции Clal, что может быть результатом наличия сайта Clal внутри области отжига зонда). С использованием зонда на основе гена crylAa было выявлено три гибридизующихся фрагмента в штамме 6-96 и один - в штамме 11-67, все они совпадали с фрагментами, гибридизующимися с универсальным зондом 6-96. Фрагменты, гибридизующиеся с универсальным, но не crylAa-зондом оказались одинаковыми в обоих исследуемых штаммах. Они имели размер 3 т.п.н и 5 т.п.н. при рестрикции EcoRI, и 2.5 т.п.н. и 3.0 т.п.н. при рестрикции Hindlll. Эти размеры совпадают с известной рестриктной картой генов сгу9А (сгуЮ) и cry9B (crylX), ранее клонированных из штамма 6-96. Они имеют не более 30% совпадающих оснований с cryXks. и, согласно ранее полученным данным, не способны перекрестно гибридизоваться. Проведенный эксперимент позволил подтвердить возможность выявления столь сильно различающихся генов с помощью единственного универсального зонда, полученного по разработанной нами схеме.

На основании проведенных исследований было установлено, что фрагменты, полученные по рестриктазе Hindlll имеют самый большой размер, к тому же, в литературе имеются данные о низкой встречаемости сайтов Hindlll в кодирующей области с/у-генов. Фрагмент размером 9 т.п.н., общий для штаммов 11-67 и 6-96, не имел аналогов при анализе карт известных в литературе генов cryl, он был выбран в качестве предполагаемого источника нового гена. Мы приняли решение клонировать его из штамма 11-67, так как он оказался единственным геном в его геноме, гибридизующимся с зондом cry 1Аа. С этой целью нами был сконструирован' плазмидный мини-банк из рестрикционных фрагментов генома штамма 11-67, полученных полной рестрикцией по сайтам Hindlll размером около 9 т.п.н..

3. Конструирование миин-банка В. thurinsiensis подвида galleriae.

Проведенная Саузерн-блот гибридизация показала локализацию cryl-подобного гена исследуемого штамма в составе единственного HindIII-фрагмента генома, что давало возможность клонировать этот ген из сильно вырожденного банка, несущего только HindIII-фрагменты заданного размера. Для создания такого банка тотальная геномная ДНК была полностью расщеплена Hindlll рестриктазой (рестрикция проводилась в стандартных условиях), фракция размером 7-10 т.п.н. была очищена методом Gene-Clean и лигирована с линеаризованным плазмидным вектором pUKtgl31, несущим канамициновую устойчивость. Лигированная ДНК трансформировалась в Е. coli NM522, рекомбинанты селектировались по утрате р-галактозидазной активности. 500 клонов (1 геномный эквивалент) были упорядочены в иммунологических планшетах. Проведенное выборочное исследование ДНК показало соответствие её размера размеру клонируемого фрагмента (7-10 т.п.н.). Полученные клоны были скринированы ДНК-гибридизацией с универсальным сгу-зондом.

4. Гибрндизаиионный скрининг банка универсальным сгу-зонлом и секвенировние.

Скрининг банка проводился ДНК-гибридизацией с зондом на crylAa, полученным с амплификацией с использованием вырожденных универсальных праймеров, и универсальным слу-зондом 6-96 с ДНК-репликами на нейлоновых фильтрах упорядоченного банка. При скрининге обоими зондами был обнаружен единственный положительный клон. Этот клон, обозначенный A5G12, и был использован в дальнейших исследованиях.

Рекомбинантная плазмида A5G12, содержащая вставку размером 7т.п.н., была подвергнута рестрикционному картированию, сначала по сайтам Xbal, а затем BglII, EcoRV, Eco47.III, Muni, MluI, Seal, Xhol, Kpnl и Bstl 107.1. Было отмечено сходство рестрикционной карты с картой ранее клонированного в нашей лаборатории гена aylGa2 из В. thuringiensis ssp wuhanensis, что позволило примерно определить число субклонов, необходимых для секвенирования.

С целью секвенирования был создан ряд субклонов, несущих фрагменты локуса по сайтам EcoRI, Muni, HincII, Seal, TaqI, Xhol, Kpnl, Xbal, Bglll, Seal, Mlul, Smal, Eco47.III. Всего в процессе работы была получена 21 конструкция. Нуклеотидная последовательность этих субклонов перекрывала 4.7 т.п.н., которые были секвенированы. В З'-фланкирующей области нового гена расположена IS231-подобная последовательность. Схема секвенирования показана на рис.1

5. Анализ иуклеотиднои последовательности нового гена.

Анализ нуклеотидной последовательности нового гена обнаружил открытую рамку считывания гомологичную рамкам считывания генов класса сгу\. Закодированная аминокислотная последовательность имеет 67% совпадающих остатков с CrylAa, наиболее сходным с ним. Другие представители Cryl-класса содержат меньшее число аминокислотных совпадений, варьирующее в диапазоне 40-62 %. Наименее родственным новому токсину оказался белок Сгу9А (ранее имевший название CrylG и также относившийся к первому классу 8-эндотоксинов), обнаруженный в штаммах подвидов wuhanensis и galleriae, а также белки других классов (СгуЗ, Сгу4). Уровень сходства внутри консервативных блоков между последовательностью нового белка и CrylAa несколько выше и составляет для первого блока - 69%, для второго блока - 72%, третьего 88%, а для четвертого и пятого - 100%. Интересным представляется участок размером 4 аминокислотных остатка между вторым и третим консервативными блоками, не обнаруживающим сходства ни с одной из известных последовательностей 5-эндотоксинов. Считается, что этот участок вовлечен в узнавание рецепторов на поверхности эпителиальных клеток кишечника личинок насекомых.

Дальнейший анализ аминокислотной последовательности показал значительное (около 96%) сходство клонированного в данной работе гена с последовательностью ранее клонированного в нашей лаборатории гена стуЮа2 из родственного штамма В. thuringiensis. ssp wuhanensis. В последствии обнаружилось и полное совпадение с геном oylGal (номер доступа EMBL Z52210, В. Lambert, неопубликованные данные). Наибольшие расхождения между CrylGal и CrylGa2 расположены внутри V консервативного блока и в соседней с ним области вблизи С-конца "истинного токсина". Это различие происходит из-за локальных сбоев рамки считывания, которые вскоре восстанавливаются. Аналогичная часть белковой молекулы, как было показано,

s

Рис.1 Схема геномного локуса и стратегия секвенирования гена 6-эндотоксина c/ylGal из В. thuringiensis galleriae 11-67.

1 2 3 4 5 6 7 kb.

I-1-1-1-

1-1-Г

1-1-r

1—■—I

cry 1 Gal

IS231G

Bgl II

Eco 47.3

Mun I Kpn I

Bgl II Taq I

Xba I Eco RV

Mlu I

/Eco RV

Eco RV Bel I Seal

Mun I Xba I Eco RV Xhol

Xba I Mlu I Taq I

Taq I Pnal Seal

cry 1 Gal

Seal ; Taq Г

I

1

i i I I I i i 1 I I i i I I I i i I I I i i I I I i i I I I i i I I I i i I I I i i I i i i i I

4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 kb.

определяет специфичность токсина Cry 1С к личинкам Spodoptera, что позволяет предположить некоторые различия в токсичности между CrylGal и CrylGa2.

С целью изучения структурно-функциональной организации клонированной области был проведен сравнительный анализ секвенированной последовательности нуклеотидов с последовательностями базы данных EMBL, а также поиск потенциально транслируемых областей, промоторов и других функционально важных участков.

Анализ 5'-фланкирующей области cry IGal позволил нам обнаружить последовательности, сходные с BTI и BTII промоторами. Сравнение cry IGal с сгуЮгй показало полное совпадение между последовательностями этих генов в данной области. При сравнении 5'-фланкирующей области cry с промоторной областью cry I An, обладающего естественной суперэкспрессией, на характерном расстоянии от начала кодирующей области было обнаружено сходство с консенсус-последовательностью промотора BTI типа. Однако в двух из четырех наиболее значимых позиций блока -35 имеются замены: вместо GC стоит AT. Так как расхождение пришлось на значимые позиции, консервативные среди всех известных промоторов генов cry, то можно предположить, что такой промотор будет иметь измененную функциональность по сравнению с BTI.

В области, характерной для промотора BTII, также обнаружено сходство c/ylGal с c/ylAa, при этом в районе -35 расхождение с консенсусом найдено всего в одной позиции: Т вместо G, но и в этом случае замена находится в значимой позиции, поэтому нельзя сделать вывода о функциональности промотора BTII. Таким образом, последовательность BTII cry IGal более соответствует известному в литературе консенсусу, чем его последовательность BTI.

Рнс.2. Предполагаемая промоторная область cry IGal.

Сравнение 5'-фланкирующей области cr^lGal с предполагаемой промоторной последовательностью сгуЮа2 и промотором cry 1Аа

CrylGal TCATTTTTTATATTTTCTCATAGGATGAATCATATGCTT

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I crylGa2 TCATTTTTTATATTTTCTCATAGGATGAATCATATGCTT

II III I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I

crylAa GCACTTTGTGCATTTTTTCATAGATGAGT CATATGTTTT

-35 (BTII) -35(BTI) - 10(BTII) -IO(BTI) GCATnTnnnnnnnnnnnnCATAnnnT консенсус -35 -10

промотора cryl

В 3'-фланкирующей области нового гена был обнаружен инвертированный повтор, способный формировать шпилечную структуру в составе транскрипта (20 п.н. - "стебель" и 4 п.н. - "петля"). Этот элемент характерен для прокариотических терминаторов транскрипции. На рисунке 3 показаны в сравнении З'-концевые регуляторные элементы генов 8-эндотоксинов cryl Gal и сгу\АЪ.

Рнс.З. З'-концевые регуляторные элементы генов 5-эндотоксинов.

A GluEnd __

GAATAA... 8 5 п.н.... AAAAAACGgGCATCACTCTTAAaaGAATGATGTCCGTTTTTT A GAATAA. . . 85 п.н.... AAAAAACGcGCATCACTCTTAAgtGAATGATGTCCGTTTTTT GluEnd "

А) Структура 3'-концевого фланга гена cryl Ab . Б) Структура З'-концевого фланга гена с/у IGal.

End - терминаторный кодон гена; стрелками отмечена последовательность инвертированного повтора, предположительно участвующая в образовании терминаторной шпильки.

Полученные данные позволяют предполагать, что транскрипт гена сгуЮа1 способен формировать шпилечную структуру на З'-конце, что может быть существенным для регуляции экспрессии гена на уровне стабильности мРНК.

6. Изучение экспрессии клонированной копии гена cryIGal в клетках В. thurinsiensis.

В природном хозяине В. thuringiensis ssp galleriae 11-67 экспрессия гена cry IGal находится на крайне низком уровне или полностью отсутствует. Тем не менее установленная структура кодирующей и регуляторной области этого гена позволяла предположить возможность его эффективной экспрессии. В литературе встречаются многочисленные сообщения об экспрессии природных критических генов cry в клетках гомологичного хозяина под контролем собственных регуляторных элементов, достигнутой только за счет перемещения хромосомной копии гена на плазмидный вектор. Поэтому с целью изучения функциональности гена crylGal была поставлена задача создать конструкцию, несущую его клонированную копию на базе репликона грам-положительных бактерий, и ввести ее в клетки различных штаммов В. thuringiensis. Для облегчения отбора клонов-трансформантов В. thuringiensis, экспрессирующих cry IGal была разработана система прямой фенотипической селекции на основе мини-гена устойчивости к эритромицину.

Рис. 4. Структура мини-гена Е-пептида в составе плазмиды pES7 и экспрессионных конструкций на его основе.

Mfel Miel AfIII SD Ndel Spei EcoRl

caattgctagcttaaggaggtctcat ATG GTT TTG TTT GTT TAActagtgaattc

M V L F V stop

promoter кап promoter gseBL gseBL c^rfE

pLFgapl4-Em

promoter BTI cryl orfE ori-pBA4

pBA-G12

Плазмида pES7 (Рис. 4), содержащая мини-ген пентапептида Met-Val-Leu-Phe-Val (MVLFV), была получена ранее путем скрининга плазмидной библиотеки случайных 15-ти нуклеотидных последовательностей на базе стандартного вектора рОТ301 под контролем lac-tac промотора. Плазмида pLFgapH содержит ген глутамилэндопептидазы gseBL из В. licheniformis с собственным промотором и не имеет собственного транскрипционного терминатора.

Плазмида pLFgapl4-Em была получена вставкой Mfel-EcoRl фрагмента, содержащего мини-ген Е-пептида из pES7, в £coRI сайт плазмиды pLFgapl4 за геном gseBL (Рис.4). В полученной плазмиде pLFgapl4-Em мини-ген Е-пептида экспрессировался в транскрипциональном слитии с геном gseBL. Транскрипция бицистронной мРНК, содержащей GseBL и MVLFV (ORF), осуществлялась под контролем, промотора гена gseBL и промотора канамицинфосфотрансферазы из TN903. Конструкция была введена в В. subtilis, и плазмида, выделенная из клонов, устойчивых к эритромицину, перетрансформирована в Е. coli.

Для конструирования плазмиды pBA-G12, содержащей ген эндотоксина cry\Ga\ из В. Ihuringiensis ssp. galleriae с его собственным промотором, был использован 4/711-фрагмент плазмиды pA5G12, который ввели в соответствующий сайтЛ/Ш плазмиды pES7 выше MVLFV. Минимальный репликон природной плазмиды рВА4 В. amyloloquenfaciens (предоставленной И. Иомантасом) был введен в виде 2.5-тпн EcoRl фрагмента в уникальный сайт ЕсоШ полученной конструкции, содержащей гены эндотоксина и Е-пептида. Как и в pLFgapl4-Em ген Е-пептида в pBA-G12 экспрессировался как второй цистрон бицистронной мРНК, чья транскрипция регулировалась собственным промотором гена crylGal и, возможно, lac-tac промотором плазмиды pES7.

Трансформация обеих конструкций pLFgapl4-Em и pBA-G12 в клетки В. subtilis по методу Спицайзена позволила получить устойчивые к эритромицину колонии. Ни одной колонии не было получено при концентрации эритромицина в среде 80 мг/л и выше. При

трансформации плазмиды pLFgapl4-Em одна колония выросла при концентрации эритромицина 50 мг/л. Трансформированные pBA-G12 клетки В. subtilis не росли при концентрации эритромицина выше 20 мг/л.

Так как минимальная ингибирующая концентрация эритромицина для нетрансформированных клеток В. subtilis всего 0.3 мг/л, а трансформация В. subtilis аналогичной конструкцией без MVLFV не придает клеткам эритромициновой устойчивости, можно сделать вывод, что экспрессия MVLFV подтверждает подобную устойчивость не только в грам-отрицательных бактериях - Е. coli, но также и в грам-положительных - В. subtilis. Наблюдаемая разница в уровне устойчивости, обнаруженная при тестировании двух конструкций, может быть вызвана несколькими факторами. Длина промотора и (или) стабильность мРНК может влиять на трансляцию цистрона MVLFV. Вероятно, что разница в копийности плазмиды могла вызвать понижение уровня экспрессии MVLFV ORF в клетках, трансформированных pBA-G12 по сравнению с pLFgapl4-Em.

Отдельные клоны рекомбинантного и естественно продуцирующего штамма при своей генетической идентичности показали разный уровень продукции секретируемого белка. Таким образом, была создана возможность непосредственно селектировать наиболее продуктивные клоны. Обычно подобный мониторинг проводится путем непосредственного определения уровня синтеза целевого продукта для выборки изогенных клонов, полученных после трансформации. Мы показали, что ген E-пептида может существенно упростить подобную процедуру, если он будет транскрипционно слит с интересующим геном. Метод быстрого скрининга клонов был основан на гипотезе, что транскрипция гена gseBL и гена Е-пептида обоюдозависима, и эффект защиты от эритромицина пропорционален транскрипции гена E-пептида. В связи с этим мы сравнили клоны pLFgapl4-Em, отобранные на максимально высокой концентрации эритромицина, и контрольные клоны произвольно выбранные после трансформации продуцента GseBL. Активность GseBL клонов, отобранных на эритромицине составляла, около 0.06 ед/мл, в то время как активность контрольных клонов не превышала 0.023 ед/мл (почти трехкратное превышение). Таким образом, мы предполагаем, что ген Е-пептида может служить селектором, обеспечивающим возможность быстрого скрининга клонов на наилучший возможный уровень транскрипции рекомбинантной ДНК и оптимизации экспрессии генов.

Похожие результаты были получены также для гена 5-эндотоксина cry 1 Gal, который не проявлял активности в природном хозяине штамме В. thuringiensis ssp galleriae. Эритромициновая селекция гена crylGal, транскрипционно слитого с E-пептидом, позволила добиться его экспрессии в В. subtilis без какой-либо модификации области промотора. Трансформированные этой плазмидой клетки В. thuringiensis не только обладали эритромициновой устойчивостью, но и по сравнению с контрольным акристаллическим штаммом производили белковые кристаллы, содержащие белок Cry 1 Gal.

В качестве реципиентов были использованы штаммы В. thuringiensis ssp. kurstaki 4D10 и flnitimus ВКПМ В-1166. Выбранный штамм В. thuringiensis ssp. kurstaki 4D10 не способен к продукции собственных кристаллических включений, содержащих 5-эндотоксины. Поэтому экспрессия в нем чужеродного гена позволила бы легко идентифицировать и очистить соответствующий белковый продукт. В процессе споруляции штамм В. thuringiensis ssp. flnitimus одновременно продуцирует кристаллы -эндотоксинов, лежащие как вне экзоспориальных оболочек (свободные кристаллы), так и внутри последних (сцепленные кристаллы). 5-эндотоксины этого штамма структурно не родственны Cry 1 Gal, что предположительно дает возможность избирательной иммунологической детекции продукта гена сгуЮа.1 в присутствии собственных белков cry.

Введение ДНК в В. thuringiensis представляет собой сложную методическую задачу, так как этот организм лишен механизма природной трансформации. Поэтому введение конструкции pBA-G12 потребовало отработки метода получения и регенерации протопластов выбранных штаммов. За основу был принят ранее опубликованный метод, который в ходе работы был оптимизирован за счет вариации концентрации лизоцима и времени протопластирования. В итоге частота трансформации достигла около 104 колоний на мкг

плазмидной ДНК, что позволило получить достаточное число колоний (более 104) и осуществить их скрининг с помощью эритромицинового селектора.

Наиболее устойчивые к эритромицину клоны (более 20 мкг/мл) В. thuringiensis выращивались на специальной среде, обеспечивающей высокую эффективность споро- и кристаллообразования, после чего клетки подвергались световой микроскопии. Для обнаружения кристаллов зафиксированные мазки окрашивались красителем амидовым черным, избирательно связывающимся с белками. В результате было показано восстановление способности трансформанта В. ¡1тгт§1еги!5 Бвр киШаЫ 4010 к кристаллообразованию. При этом доля клеток, содержащих кристаллы, составляла более 80%. Трансформанты штамма В. г/шл'ля/елля ББр/тШтиз образовывали преимущественно свободные кристаллы.

7. Выделение и характеристика белкового продукта экспрессии гена сгуЮа!.

Для получения кристаллов штаммы В. Липщгежх выращивались 60 часов в специальной среде ТУ. Споро-кристаллическую смесь собирали центрифугированием (15 минут, 4000 об/мин), ресуспендировали в воде, наслаивали небольшой объем ксилола и инкубировали 48 часов при +4°С.

Для изучения белкового состава кристаллов 5-эндотоксины экстрагировали из осажденной центрифугированием споро-кристаллической смеси карбонатным буфером рН 9.8, содержащим дитиотрейтол. Растворенные белки по данным БОБ-ПААТ-электрофореза имеют молекулярную массу 130 кИа. (Рис.5)

Рис. 5. БОЗ-ПААГ электрофорез экстрактов споро-кристаллических смесей рекомбинантных штаммов В. экспрессирующих клонированную копию сгуЮа\.

1. Предварительно окрашенный маркер молекулярной массы Kaleidoscope (Biorad): 201, 85, 42, 32, 18,6.5 kDa

2. В. Ihuringiensis ssip.finitimus ВКПМ B-l 166 pBA-G12

3. В. thuringiensis ssp.finitimus ВКПМ B-l 166

4. В. thuringiensis ssp. kurstaki 4D10 pBA-G12

12 3 4

t.-

MP"

l V ,

I-' ••

■■• 5 -t -

J

.1

Для иммунологической идентификации продукта гена стуЮа1 полученные экстракты споро-кристаллической смеси штаммов В11-66 (рВА-012), 4010 (рВА012), а также контрольного бесплазмидного штамма В11-66 изучались методами Вестерн-блоггинга (Рис. 6).

Рис. 6. Иммуноблоттинг экстрактов споро-кристаллических смесей рекомбинантных штаммов В. ¡¡гигт&епзк, экспрессирующих клонированную копию сгуХСа1, проявленный: (а) -сывороткой против кристаллов В. Бвр^аПепае 11-67, (б) - сывороткой против

кристаллов В. Г/шп/де/емш йяр./тШтиз ВКПМ В-1166.

1. В. йгигЫфегик взр./¡пШтиз ВКПМ В-1166 рВА-012 130 Ша 2. в. Мигает!! ъър.рпШтиз ВКПМ В-1166

3. В. 1Ииг^1ет15 ээр. кигх1аИ 4010 рВ А-в 12

б)- -

130 kDa 1- B.lhuringiensis ssp. finilimus ВКПМ B-1166 pBA-G12

2. B.lhuringiensis ssp finitimus ВКПМ В-1166

3. B.thuringiensis ssp. kurstaki 4D10 pBA-G12

1

С целью доказательства наличия у рекомбинантного продукта гена cry 1 Gal нативной пространственной структуры были проведены эксперименты по его искусственной активации путем ограниченного протеолиза трипсином и химотрипсином. Было установлено, что ограниченный протеолиз Cry 1 Gal химотрипсином, подобно другим изученным эндотоксинам приводит к образованию фрагментов с молекулярной массой 70 kDa, соответствующих истинному токсину В. thuringiensis классов 1, 4, 9 и других. Кроме того, в ходе протеолиза CrylGal иногда появлялся минорный компонент с молекулярной массой около 35 kDa, который, вероятно, является продуктом гидролиза 70 kDa белка. Этот результат свидетельствует о наличии у CrylGal типичной для 5-эндотоксина третичной структуры, обеспечивающей нормальную активацию в физиологических условиях, и предохраняющей от неспецифической деградации. В то же время, протоксин оказался высоко устойчив к действию трипсина, что нехарактерно для кристаллических белков класса 1. По-видимому, устойчивость CrylGal связана с отсутствием в сайте С-концевого процессинга необходимого для распознавания трипсином остатка аргинина.

8. Изучение биологической активности CrylGal.

Наличие нативной структуры у рекомбинантного продукта гена crylGal позволило провести эксперименты по изучению его токсической активности в отношении насекомых. В качестве тест-объекта были выбраны гусеницы сосновой процессионарии Т. pytiocampa, токсичность к которому ранее была определена только для небольшого числа индивидуальных эндотоксинов. В качестве положительного контроля использовали споро-кристаллические смеси В. thuringiensis нескольких видов: alesti, finitimus, shondungensis, caucasicus и kenyae. Суспензии споро-кристаллических смесей наносили на поверхность игл сосны Pinus nigra, после чего помещали иглы в контейнеры и вносили туда личинок сосновой процессионарии первого возраста. Для повышения достоверности эксперимента использовали выводки насекомых, собранные в нескольких изолированных друг от друга биотопах в Северной Италии. Использованные выводки представляли собой потомство одной самки - от 150 до 300 личинок. Обычно самка скрещивается с одним самцом, но возможность множественного

скрещивания не должна бьпъ исключена. Таким образом, выводок включает в себя братьев и сестер, содержащих гены обоих индивидуумов.

Основные параметры, используемые при обработке статистических данных пакетом ANOVA, предназначенным для проверки гипотезы о превышении межгрупповой вариабельности значений над внутригрупповыми:

F - соотношение вариабельности значений между группами к вариабельности внутри групп; р - вероятность того, что нулевая гипотеза (об отсутсвии различий между группами) верна; df - степень свободы анализа, т.е. общее число повторностей - число сравниваемых групп - 1; MS - среднеквадратичное отклонение (сумма квадратов отклонений отличий индивидуальных значений от среднего значения).

Статистический анализ.

В анализе использовались две переменные: процент съеденных во время испытаний иголок, и процент смертности в течение 7 дней с момента начала испытаний. Для обработки результатов использовался пакет ANO VA. Данные были представлены как arcsinVp/100 для достижения гомогенности расхождений.

8.1. Постановка отрицательных контролен.

Сосновая процессионария Т. pytiocampa обладает рядом биологических особенностей, осложняющих ее разведение в условиях неволи. В частности, для нее не разработана искусственная диета, что затрудняет предъявление гусеницам препаратов 8-эндотоксинов. Кроме того, сосновая процессионария не является стандартным объектом биотестов, что требует в ходе экспериментов внимательного учета посторонних факторов, способных внести искажения в наблюдаемые результаты.

С этой целью до начала испытаний биологической активности эндотоксинов были поставлены контрольные эксперименты по изучению эффекта содержания и обработки корма, а также индивидуальных различий между особями.

В эксперименте по изучению эффекта содержания и обработки корма гусеницам предъявлялись сосновые иголки после стерилизации раствором гипохлорита (высушенные, намоченные в воде и растворе сахарозы), а также нестерильные необработанные иголки. Результаты представлены в виде рисунка 7.

Хотя в условиях эксперимента при использовании в качестве корма стерилизованных иголок - как высушенных, так и влажных, наблюдались более низкая смертность и более высокое поедание, чем при использовании нестерильных иголок или стерилизованных иголок после обработки сахарозой, эти различия не являются статистически значимыми, что позволяет сделать вывод об отсутствии существенного влияния обработки корма на поведение и выживание тест-объекта.

Наличие эффекта индивидуальных различий между особями, проявляющееся в неодинаковой скорости питания и естественной смертности, способно существенно исказить результаты биотестов. Кроме того, этот параметр характеризует способность популяции тест-объекта адаптироваться к применению против нее токсического препарата. Поэтому перед началом биотеста были изучены различия как естественной смертности, так и скорости питания для 17 независимых выводков Т. pytiocampa, причем каждое измерение было воспроизведено в двух повторностях. Результат этого эксперимента представлен на Рис.8.

Процент смертности: F(17,25)= 1.782995, р=.092007 Процент поедания: F(17,25)= 2.673082, р=.01258б

Рис. 7. Изучение влияния факторов условий содержания и обработки корма на жизнеспособность и скорость питания сосновой шагающей гусеницы Т. pytiocampa. иголки сосны (Pinus nigra, побеги текущего года);

иголки, стерилизованные погружением в 2% гипохлорит натрия на 15 минут, а затем трижды промытые стерильной водой;

иголки, стерилизованные как выше указано, промытые водой без высушивания; иголки, стерилизованные как выше указано, затем промытые раствором 10% сахарозы. Каждый контроль ставился в двух повторносгях. Целью эксперимента была проверка гомогенности контрольных обработок в биопробах 1 и 2. Процент смертности: F(3,48)=.043321, р=.987857 Процент поедания: F(3,48)= 1.893649, р=. 143251

Рис. 8. Изучение индивидуальной варибельности выводков Т. руНосатра из различных популяций по параметрам "скорость питания" и "естественная смертность".

120

100

t 80

V

я о 60

е.

В

40

20

0

66 16 42 10 13 32

48 24 61 17 104 25 44 2 Выводки

□поедание ■смертность

1 43

к

В рамках проведенной статетической обработки результатов эксперимента было установлено, что индивидуальные различия между выводками существенно влияют ш скорость питания гусениц, но не на уровень смертности от естественных причин. Тем не менее на основании имеющихся данных нельзя исключать, что различие в смертности не детектировалось только по причине ее низкого общего уровня, и может быть обнаружено npi удлинении сроков проведения эксперимента.

8.2. Постановка положительных контролей.

Поскольку, как уже говорилось, сосновая процессионария не является стандартные объектом биотестирования препаратов на основе 5-эндотоксинов, были поставлены также положительные контроли, необходимые для оценки уровня эффективности CrylGal относительно других кристаллических белков. В качестве абсолютного контроля были выбраны природные кристаллы штаммов 11-67 и 6-96 подвида galleriae. Такой выбор быт обусловлен наличием в них как белков CrylA, ранее дававших заметный токсический эффекп против этого тест-объекта, так и других белков Cry. Кроме того, штамм 11-67 является природным хозяином гена cry 1 Gal, хотя и не накапливает его продукта в кристаллах.

Всего было проведено 160 независимых (четыре повторное™ на четыре различных разведения) теста. Разведение указано в разах по отношению к матричному раствору, Величины предъявляемой насекомым дозы токсина вычислялась на основании его известной концентрации в матричной суспензии и расходе раствора (определялся путем взвешивания пробирки с раствором до и после обработки в ней скармливаемых насекомым сосновых игл) Каждая игла опускалась в суспензию отдельно.

Токсин в разведении 1000 раз наносили на 1 грамм свежих иголок. При этом концентрация токсина составляла до 2.57 мкг на г корма (Таблица 1, Рис. 9,10).

Таблица 1. Изучение биологической активности эндотоксинов против сосновой шагающей гусеницы Т. pytiocampa.

Тест Тип токсина Концентрация токсина в суспензии (мкг/мл) Количество токсина на иголках (мкг/иголка)

Btgal 6-96 1 Cry9A, CrylAb7 25000 80.625

Btgal 6-96 10 Cry9A, CrylAb7 2500 6.813

Btgal 6-96 100 Cry 9 A, CrylAb7 250 0.688

Btgal 6-96 1000 Cry9A, CrylAb7 25 0.073

Btgal 11-67 1 Cry9A, Cry ID, Cry IF 25000 85.625

Btgal 11-67 10 Cry9A, CrylD, Cry IF 2500 8.750

Btgal 11-67 100 Cry9A, CrylD, Cry IF 250 0.806

Btgal 11-67 1000 Cry9A, CrylD, Cry IF 25 0.095

Рис. 9. Значения и стандартные отклонения для поедания.

6£6

разведенне

Рис. 10. Значение и стандартные отклонения смертности личинок:

11-67

Тесты

рачвсденис

Среди двух препаратов на основе В. íhuringiensis ssp galleriae наиболее эффективным оказался 11-67, что можно объяснить более высоким содержанием в его кристаллах Сгу9А по сравнению со штаммов 6-96, Тем не менее, оба В. íhuringiensis galleriae не вызвали значительной смертности в разведениях 3 и 4 (Рис. 11). Один из выводков (№ 26) в стократном разведении ни в одном тесте не показал какой-либо смертности. Это было причиной полученного высокого стандартного отклонения.

8.3. Постановка биотеста прапарата Cry 1 Gal и кристаллов природных штаммов R íhuringiensis.

Постановка основных биотестов с использованием CrylGal и других 5- эндотоксинов технически проводилась аналогично постановке положительных контролей. Статистически препараты В. íhuringinesis дали отличия только в поедании, но не в смертности личинок. Кристаллы из штаммов подвидов finitimus, shondungensis, а также источник CrylGal — кристаллы штамма kurstaki 7D10 (pBA-G12), показали средний уровень поедания среди других препаратов В. íhuringiensis. Эти препараты показали также высокое стандартное отклонение по смертности, которая, вероятно, превышает различия, которые были бы статистически значительны, среди препаратов В. íhuringiensis. В íhuringiensis caucasicus и кепуае показали лучшие и наиболее стабильные результаты, несмотря на то, что в обоих препаратах не содержалось белка CrylA, ранее считавшегося наиболее активным в отношении сосновой процессионарин. Анализируя результат биотестов кристаллов рекомбинантного штамма kurstaki 7DI0 (pBA-G12), необходимо указать, что достоверно обнаруживаемый уровень смертности в его случае достигнут при использовании относительно более высоких

концентраций белка, чем в случае контрольных препаратов, что, возможно, компенсирует более низкую эффективность этого 5-эндотоксина:

Процент поедания: Р(14,58)= 3.756, р<.00 Процент смертности: Р(14,58)= 6.551, р<.00

Рис. 11. Эффект наследственности гусениц Т.руНосатра на чувствительность к СгуШа1 (контрши исключены).

120 100

6 80 I -

с 40 20 0

'«смертность ¡□поедание

71 33 10 31 ВО 101 35 47 33 24 2 61 14 34 20 Выводок

Таким образом, проведенные эксперименты по биотесгированию доказывают наличие биологической активности у искусственно полученного продукта гена c/ylGal - эндотоксина CrylGal, хотя уровень его токсичности недостаточно велик для практического применения против использованного насекомого-мишени. Тем не менее, эксперимент окончательно доказывает нативность структуры полученных кристаллов рекомбинантного штамма 7D10 (pBA4-G12) и позволяет использовать имеющийся препарат для проведения биотестов на других объектах.

9. Возможные применения разработанной универсальной системы детекции сгу-генов методом PCR.

Предложенная нами схема предназначена для первичного обнаружения и предварительной идентификации генов cry из различных источников, в первую очередь, природных изолятов В. thuringiensis. Ее главным преимуществом является возможность идентифицировать большую область известных cry генов, используя одну пару праймеров, что делает данный метод существенно более быстрым по сравнению с аналогичными, предложенными ранее. В литературе не сообщалось о существовании основанной на PCR универсальной системы для подобных целей, которая позволяет не только обнаруживать, но и классифицировать гены в природном материале. Таким образом, описанная здесь методика может рассматриваться как оригинальная. Специфичность подобранных праймеров к высоко консервативной части гена, кодирующую С-концевую половину белка, позволяет обнаружить не только близко родственные производные известных генов, но и найти новые прототипы.

Амплификация методом PCR, обладая высокой чувствительностью, позволяет детектировать сту-гены в биологических материалах различного происхождения, таких как природные изоляты из В. thuringiensis, генно-инженерные конструкции, изготовленные в ходе работы, трансгенные растения, несущие cry-гены. Последняя проблема становится актуальной, так как некоторые компании активно используют трансгенные растения. Поэтому ко!ггроль распространения cry-генов в природных и сельскохозяйственных популяциях растений требует быстрого метода обнаружения и идентификации их ДНК.

Гибридизационная стадия предложенной схемы позволяет различать все типы сту-генов, описанных в литературе, если они могут быть амплифицированы. Эта процедура заменяет громоздкий ряд дополнительных PCR-реакций, которые необходимы для идентификации генов

стандартным способом. Этот метод может быть предложен для рутинных испытаний больших серий образцов.

Данная процедура приобретает ряд преимуществ ввиду большого числа известных генов cry. Она позволяет определить и первоначально оценить число копий ay-генов, если они представлены в образце в виде смеси.

В результате проведенных экспериментов было показано, что разрабатываемая схема полностью соответствует предъявляемым к ней требованиям. В модельных опытах с клонированными генами cry\Gal и cry)А и на примере мультигенных штаммов 6-96 и 11-67 В. thuringiensis ssp galleriae была продемонстрирована универсальность схемы: амплификация с равным выходом проходила на относительно близкородственных генах, таких как с;у 1 Ab и с/у 1 Gal, так и на структурно отдаленных cry9А и сгу9В. Гибридизационная техника позволила идентифицировать в геноме штамма 6-96 новый ген crylGal, в короткий срок разработать и реализовать схему его клонирования с помощью плазмидного мини-банка. Полученные результаты дают основания считать схему пригодной для характеристики природных штаммов В. thuringiensis по наличию генов cry и клонирования наиболее перспективных вариантов.

Клонированный в данной работе ген cry 1 Gal обнаружен в подвиде galleriae впервые. Ранее он был клонирован из неидентифицированного природного изолята В. thuringiensis В. Lambert (Plant Genetics System, Бельгия), однако последовательность гена не была опубликована, а сам ген не доступен для исследовательских целей.

Ген cry 1 Gal структурно близок ранее обнаруженному нами cry\Go2 из подвида wuhanensis. Последний не способен к экспрессии в природном штамме, несмотря на наличие необходимых регуляторных элементов. Клонированный в данной работе ген не до конца охарактеризован с точки зрения причин отсутсвия его полноценной природной экспрессии, однако не исключено, что обнаруженная пара генов cry\Ga\/cry\Gd2 может служить удобной моделью для изучения причин криптичности или слабой активности геномных генов cry. Исследования такого рода представляют интерес в связи с тем, что данное явление криптичности генов cry широко распространено в природных штаммах В. thuringiensis.

Фланкирующие области генов cry lGal и cry 1 Ga2 на значительном протяжении совпадают. Однако, в отличие от crylGa2, клонированный нами ген не находится в соседстве с копией cry 1 Ab, таким образом, на расстоянии 2 т.п.н. выше cry lGal картируется геномная перестройка.

10. Перспективы использования мини-гена E-пептида для получения высокоэффективных штаммов-продуцентов па базе бацилл.

В рамках настоящей работы 15-пн мини-ген, кодирующий пептид MVLFV и моделирующий фрагмент 23S-pPHK Е. coli, впервые был введен в клетки В. subtilis и В. thuringiensis и обеспечил высокий уровень устойчивость к эритромицину, равный ранее обнаруженному для стандартных детерминант устойчивости к этому антибиотику. В работе сконструированы две новые плазмиды, содержащие исследуемый мини-ген в виде транскрипционного слияния с генами глутамилэндопептидазы В. licheniformis и 5-эндотоксина В. thuringiensis. Мини-ген E-пептида был использован в качестве эффективного прямого транскрипционного репортера, что позволило в краткий срок отобрать наиболее продуктивные штаммы-продуценты, в 2-3 раза превышающие по эффективности исходные варианты. Мини-ген эритромициновой устойчивости в силу своего малого размера может служить удобным маркером в составе векторов широкого круга хозяев как для грам-положительных, так и для грам-отрицательных бактерий.

Небольшой размер эритромицин-устойчивого мини-гена позволяет использовать его в качестве селективного маркера при трансформации. Эта особенность ценна при конструировании векторов на основе плазмид, реплицирующихся по принципу катящегося кольца, чья стабильность существенно зависит от общего размера конструкции. Будучи транскрмпционно слит с другим геном, orJE может служить эффективным репортером для оптимизации экспрессии рекомбинантной ДНК.

пригодность для анализа мультигенных штаммов.

2. Из B.thuringiensis ssp galleriae штамма 11-67 клонирован природно критический reí с/у 1 Gal, родственный cry\Ga2 из подвида wuhanensis.

3. Доказана возможность экспрессии crylGal в клетках природного хозяина < образованием нативного белка-эндотоксина под контролем собственных регуляторньп элементов, несмотря на природную криптичность и обнаруженные различия предполагаемого промотора с консенсусами споруляционно-зависимых промоторов BTI и ВТП.

4. Доказана возможность экспрессии в клетках бацилл мини-гена устойчивости > эритромицину и перспективность его использования в качестве транскрипционного репортера.

5. Доказано наличие умеренной биологической активности белка CrylGal в отношен™ сосновой процессионарии Т. pytiocampa.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Shevelev А.В., Kogan Ya.N., Bushueva A.M., Voronina E.J., Rebrikov D.V., Novikova S.I., Chestukhina G.G., Kuvshinov V., Pehu E., Stepanov V.M. FEBS lett. 404 (1997) 148-152. A novel delta-endotoxin gene ctylM from Bacillus thuringiensis ssp.wuhanesis.

2. LevitinE.I., Shevelev A.B., Novikova S.I., Wojciechowskaja Ya.A., Usaclieva E.A.. International Symp. on Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses. 1997, Helsinki, Finland. A new universal PCR-based approach for fast search of Bacillus thuringiensis strains for new delta-endotoxin genes and cloning of crylGal gene from Bacillus thuringiensis ssp. galleriae.

3. Shevelev A.B., Lewitin E., Novikova S.I., Wojciechowska Ya.A., Usacheva E.A., Chestukhina G.G. and Stepanov V.M.. Biochem. Molec. Biol. Internat.,1998,VoI.45.No.6. A new universal PCR-based approach for fast search of Bacillus thuringiensis strains for cry\, cryA and cry9 genes.

4. Novikova S.I., Bushueva A.M., Trachuk L.A., Konstantinova'G.E., Serkina A.V., Hoischen Ch., Gumpert J., Chestukhina G.G., Mankin A. and Shevelev A.B. FEMS Microbiol. 2000, 182, 213-218. Intoduction of a mini-gene encoding a 5-amino-acid peptide confers erythromycin resistance on Bacilus subtilis and provides temporary erythromycin protecion in Proteus mirabilis.

5. Shevelev A.B., Aleoshin V.V., Trachuk L.A., Novikova S.I., Granovsky A.E., Semenova E. V., Kogan Ya.N., Bushueva A.M., Shcheglov A.S., Kostrov S.V., Livshits V.A.,Chestukhina G.G.,. Plasmid 2000, in press, Expression of bacillar glutamylendopeptidase genes in B. subtilis by a new mobilizable single-replicon vector pLF

Новикова Свешана Ивановна Изучение струетурно-фунвдионалыгой организации дельта-эндотоксина CrylGal из В. thuringiensis ssp galleriae н ta n гена.

Издлиц_№040060 ot21.08.96 Подписано в печать 12.04.2000. Формат 60x90/16. Бумага офссшая. Печать офсетная. Усл. печ л. 125. Тираж60экз. 3аказ№

Московский Физико-технический институт (государственный университет) Огдел ашомагишрованиих издательски* систем

«ФИЗТЕХ-1ЮШ11ТЛФ»

141700, Московская обл., г.Долгоирудный, Институтский пср.,9