Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мобилизуемые векторы для лактобацилл и других грамположительных бактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мобилизуемые векторы для лактобацилл и других грамположительных бактерий"

{йУчко-ггсетЕдовлтЕльгаий ккстэтг гажтет ш СЕЛЁКИШ йРшишзшЕК ржрсоргамшжз

КСКШЗУЕЮЕ ВЕКТОР!! ДОЗ ДАКТШАЦИИ' S ДРУГИХ ГРАатЖШЕШЙК БАКТЕРИЙ

Специальность 03.0C.iS. - Генетика

Автореферат диссертации на соискание учеяоЛ степега кандидата биологических науи

Ma -правая рзгеоетсй

для еяушбипго пояьвоюткя

СЕКШШ Em« злАдюгировиА

/ ;

Москва - 1994

Ра&гаа ваошкева в жабозютории тюте® м сеяводга иагочгго-¡шикк м анаэробных бгигаерий Научвго-ксслэдозатзхасиото шстччща гшеяши и сэлеквдш промшкеннил мдарооугаизгзмоа

Иаучимэ руководит!® : кегздвдет бзкшмгинвских достаю? бгяшзгкчесЕиг наук

Сфазеяаяыига спсонэкти: йокт-ор бгвоеттмчесгат наук, профессор А. А. Призеров

дштар бкешзгкчвекзи иаул,

вро&ессар К). Д. Цыташоз

Ведтззз ¡Институт иолзкулярной генеттам РАМ

■ Завдяа состоится ? шмя 1094 г. в '¿Учесов на засеяаиил Спе-вдааюииравгцшого Ученого созэта Д. 038.12.01 при Маучно-ксследо-ваавяьскоа ккезжутв гавшк и се&вкцеш прсыи&ягЕшшг мкироорга-гишквв по адзюсу: 113545, СЗхнсла, 1 Дорошнй проезд, д. 1

0 якссертацкей можно ознакомиться в библиотеке шггеистжа.

¿9 аШ.С?1

Автореферат разослан "-ш 1004 г.

В.А. .Еешщ В. С. Тараяеизз

Учений езярэтарь сп&зфзздэсгхрозашюго совета,

кавдвдат биологических иаук л / /В.И. Щербакова

СВ1ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЛШГЫ

Актуальность темы. Молочнокислые бактерии и лактобациллы, в частности, являются чрезвычайно перспективными объектами генетических и генно-инженерных манипуляций. Это одни из наиболее полезных для человека микроорганизмов. Лактобациллы широко используются в пищевой промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Они являются симбионтами человека и животных и играют ванную роль з их жизнедеятельности. Однако до настоящего времени лактобациллы ■ остаются генетически малоизученными организмами, поскольку у них отсутствует хорошо разработанная система генетического обмена и нет удобных векторов для клонирования генов.

Относительно недавно.были преодолены методические трудности по введению плазмидвой ДНК в клетки этих микроорганизмов с помощью трансформации протопластов. Однако это трудоемкий и малоэффективный метод. Более перспектив?™?.™ способами введения ДНК s клетки лзктобацилл представляются кониогативнаэ мобилизация и электротрансформация. Поскольку в большинстве случаев конструирование рекомбинантной ДНК легче проводить в Escherichia coli, конгюгативная мобилизация удобна для переноса полученных конструкций непосредственно из Б. coli в клетки других бактерий.

Цель и вадзчя тгжйэдятакия. Целью настоящей работы являлось создание удобных векторов для молекулярного клонирования в лак-тобациллах и разработка эффективной системы введения векторных молекул в клетки лактобацилл.

В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

-получить мобилизуемые векторы для бактериаяьной системы Escherichia coli - лактобациллы на основе известных двурепликон-ных плазмид широкого круга хозяев рНУЗЗ и рСВ20;

-разработать систему межродового конъюгационного переноса плазмидной ДНК из Е. coli в лактобациллы и другие грамгсоложи-тельные бактерии;

-изучить структурно-функциональные свойства криптической плазмиды pLF1311 из штамма Lactobacillus fermentum ВКМ1311;

-получить векторы для лактобацилл на основе критической плазмиды PLF1311, в том числе вектор с прямым отбором вставок.

Кашзна результатов к научно-пракгкчэсмое значение работы

Разработана система межродового конъюгационного переноса из Е. coll в лактобациллы и другие грамположительные бактерии. Получены мобилизуемые векторы на основе двурепликонных плазмид рНУЗЗ и РСВ20. Дана характеристика криптической шизмиды pLF1311 из L. fermentum, изучена ее структурно-функциональная организация. На основе этой плазмвды получены векторы для клонирования ДНК в лактобациллах и других грамположительных бактериях. В частности, получен вектор широкого круга хозяев pLF6, мобилизуемый из Е. coll с помощью конгюгативной плазмиды RP4 и позволяющий проводить прямой отбор трансформантов с гибридными плазмида-ми. В работе показана возможность использования сконструированных векторов для клонирования чужеродных генов и введения их в клетки Lactobacillus brevis, L. buchneri, Lactococcus lactls, Enterococcus faecalis, 2. faecium, Bacillus subtllis, B. thuringlensis ssp. galleriae, B. thuringlensis ssp. kurstaki, B. thuringlensis ssp. flnitimus, B. amylollguefaciens, Brevlbacterium flavum, а также E. coll, Erwlnla sp.

Мъэы рабохи. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включает материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения й выводов; иллюстрирована <£i рисунками и ^таблицами. Библиография содержит ^.^наименований.

Апробация. Материалы диссертационной работы были доложены на Всесоюзном семинаре "Современные проблемы антибиотикорезис-' тентности" (Москва, 1988), Всесоюзной научно-технической конференции "Современная технология сыроделия и безотходная переработка молока" (Ереван, 1989), конгрессе международного союза микробиологических обществ (Осака, Япония, 1990), семинаре отдела молекулярной генетики НИИгенетика (1994), научной конференции НИИгенетика (Москва, 1994).

ОДТЕРЫА2Ы И №Г0ДЫ

В работе использовали штаммы: Bacillus amylollquefaciens А50 (получен в музее ВНИИгенетика), В. amylollquefaciens В3157 Smr502, В. amylollquefaciens В1796 Smr162, В. amylollquefaciens В1796 Smr7-1 (получены от Казариновой Л.А.), В. subtllis 168. SmrtrpC2, В. subtllis 168 ribD107 гесЕ4, В. subtilis А773 ашуЕ4

прг512 арг73 (получены от Йомантаса Ю.В.), В. thurlngiensis ssp. galleriae, В. thuringiensis ssp. kurstaki HD-1 (получены от Азизбекяна P. P.), В. thuringiensis ssp. flnitimus (получен от Честухиной Г.Г.), Brevibacterium flavum 120 (получен в музее ВНИИгенетика), Erwinia sр. (получен от Чисгосердоза А.Ю.), Escherichia coli С600, Е. coli С600 recA", Е. coli TGI, Е. coli B2S05:W802 met~rib28 (получены в музее ВНИИгенетика), Е. coli SI7-1 (получен из штамма S17-l(pSUP5011), предоставленного Саймоном Р., путем элиминации плазмиды pSUP5011), Enterococcus faecalis 0G1, E. faecalls JH2-2(pAMfll), E. faeciun M74, Lactococcus lactls LPIT6, Lactobacillus casei.BKM 535, L. brevis BKM 1309, L. buchneri BKM 1310,' L. fermentum BKM 1311, L. plantarum BKM 578, L. plantarum 20p (получены в лабораторной коллекции).

Плазмиды, использованные в работе, были получены от Сорокина А.В. (рСВго, рТМ261), Йомантаса Ю.В. (pPR2), Саймона P. (PSUP5011), Лубиса A. (pBamHIM4(3)), Остермана А.Л. (pOZ119).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. КшсФруироваике мобилизуемого вектора иа осигаз© дауцгеп-даошой плазмиды рИV33

Конъюгативная мобилизация из клеток Е. coli представляется наиболее технологичным способом введения ДНК в клетки лактоба-цилл и других бактерий, для которых отсутствует хорошо разработанный способ введения генетического материала.

Для мобилизации неконъюгативкой плагмиды нужны цис-действу-ющая область начала конъюгативного переноса (oriT) и транс-действующие продукты tra-генов конъюгативной плазмиды-помощника, присутствующей в донорной клетке.

Для разработки мобилизации челночных векторов иу Е. coli в клетки лактобацилл мы использовали систему, конъюгативного переноса плазмиды IncP группы несовместимости RP4. На начальном этапе работы мы переклонировали РР4-срецифичный oriT в двурепликон^ ную плазмиду рНУЗЗ, включающую репликативные элементы pBR322 и стафилококковой плазмиды рС194 [Primrose, Ehrlich, 1981] . Источником' oriT служила плазмида pSUP5011, несущая область начала-переноса конъюгативной плазмиды RP4. Полученная рекомбинантная плазмида имела размер 8,6 т.п.н. и была обозначена pSL201 (рис.1).

Рис. 1 Схема конструирования мобилизуемой пл&шиды pSL201. ori 1 - область репликации рС 194 orí 2 - область репликации pBR322 oriT - область начала конъюгативного переноса

Для проверки мобилизуемости плазмиды pSL201 были сконструированы донорные штаммы Е. coli: 1) С600 recA" (RP4, pSL201), 2) S17-1 (pSL201), несущий tra-гены RP4 в составе хромосоме. Оба' докоркых шт&чма были проверены в скрещиваниях с реципиентным штаммом В. subtilis 168 Smr. Скрещивания проводили на мембранных штроцеллюлозных фильтрах с диаметром пор 0,45 ыкм (Millipor). Смешивали в одной пробирке ночные культуры клеток донора и реципиента. Смесь клеток осаждали на фильтрах. Фильтры с клетками помещали на чашки с полноценной средой и инкубировали 18 ч при 37°С. Затем клетки смывали с фильтров 1 мл физиологического раствора НаС1 и высевали на селективные среды. Частота мобилизации в обоих случаях была порядка 10~5 колоний зксконгюгашв та клетку донора. Для последующих скрещиваний мы использовали до-норный штамм С600 recA" (RP4, pSL201). В этих экспериментах плазмвда pSL201 была перенесена в ¡тетки LactdbacúRÜ'iis plantarum, L. buchnerí, а также в Е. faecalis, Е. coli. Экскошь-. юганты бактерий, устойчивые к хлорамфеииколу, возникали с часто-

той 1С)"8 - 10~2 колоний на клетку донора (табл. 1). В клетках эксконъюгантов наблюдалась структурная и сегрегационная нестабильность плазмиды pSLZOl. Плазмида стабильно поддерживается только в клетках Е. coli (табл. 1). Из-за высокой сегрегационной и структурной нестабильности плазмиду pSL201 трудно использовать в практических целях для клонирования генов, однако проведенные эксперименты показали принципиальную возможность кониогатквной мобилизации двурепликояных плазмид из Е. coli в лактобациллы.

Таблица 1.

Частота мобилизации и уровень сегрегационной стабильности плазмиды pSL201 в различных бактериях

Реципиентный штамм

L. buchneri L. plantarum В. subtilis Е. faecalis Е. coli

■ Частота мобилизации (на клетку донора)"

5 х 10"8

1 х 1СГ8

5 х Ю-5

5 х 10"7

1 х 10~2

Сегрегационная стабильность з эксконмогаятая, %й*

О

О

8

О

92

* - Частоту мобилизации определяли как отношение числа эксконъюгантов к числу донорных клеток.

** - Для определения сегрегационной стабильности клетки бактерий, несущие плазмиду, выращивали в течение 18-24 ч в среде без соответствующего антибиотика. Выросшие культуры рассевали на чашки с полноценной средой. Среди образовавшихся колоний подсчитывали процент устойчивых к соответствующему антибиотику, т.е. сохранивших плазмиду.

2. Конструирование мобилизуемого вектора на основе двуреплйконной плазмиды рСвгО

Известно, что векторы на основе стрептококковых плазмид.

реплицирующихся по тета-механизму, отличаются высокой структур-иой стабильностью и большой емкостью. Поэтому на следующем этапе мы применили разработанную систему для мобилизации двурешшкон-кого вектора рСВ20, сконструированного на основе P8R322 и плазмиды pSM19035 из Streptococcus pyogenes. Репли;:он плазмиды PSM1S035 гомологичен области репликации конгязгативной плазмиды грамполсиштедьных бактерий с широким кругом хозяев pAMßl, способной поддерживаться в лактобациллах.

В коде предварительной работы мы осуществили конъюгационный перенос плазмиды pAM3l из донорного штамма Е. faecalis JH2-2 (рАМЗ!) в клетки L. plantarum ВКМ 578, L. plantarum 20 р, L. casei ВКМ 535, L. brevis ВКМ 1309. На основе полученных данных ыы предположили, что вектор рСВ20 будет также реплицироваться в лактобациллах. Для введения его в клетки лактобацилл был сконструирован мобилизуемый вар..ант, содержащий RP4-специфичный ог1Т из плазмиды pSUPSOll. Полученная конструкция была обозначена pCB20mob (общий размер плазмиды 9,3 т.п.н.) (рис. 2).

В результате "тройных" скрещиваний плазмида pCB20mob была введена из Е. coli в клетки L. buchneri ВКМ 1310, а также в L. lactis LPIT6Smr, В. subtilis 168 Smr. Для этого смешивали культуры трех штаммов: реципиентных клеток, штамма Е. coli C600(RP4) и штамма Е. coli C500(pCB2Qmob). Частота возникновения эксконъ-югантоа, одновременно устойчивых к эритромицину и линкомицину (признак, детерминируемый pCB20mob), составляла от 10~7 до Ю-6 колоний на клетку реципиента.

S. Суйююмщюзазшэ рмбо&лаиикоЕага сяершза 3. subtilis в Еелтсрэ рЖКгксЬ

Чтобы оценить возможности плазмиды pCB20mob как вектора для клонирования генов в лактобациллах, мы переклонировали в ее составе гены рибофдавинового (rib-) оперона В. subtilis. В качестве источника rib-оперона использовали плазмиду pPR2. EcoRI-фрагмент плазмиды pPR2 размером 10 т.п.н., несущий гены rib-оперона В. subtilis, дигировали с ДНК вектора pCB20mob. Полученная гибридная плазмида размером 19,3 т.п.н. была обозначена pSL212 '(рис.2).

Для изучения круга хозяев плазмиды PSL212 был проведен ряд экспериментов по введению ее путем конъюгативной мобилизации из Е. coli в различные виды грамположительных бактерий. Для этого

Psll

Рис.2. Схема конструирования плазшэд pSB20nob и pSL212.

ori1 - область репликации pSM19035

oriT - область начала конъюгативного переноса

Rib - гены биосинтеза рибофлавина из B.subtilis

был сконструирован донорный штамм на основе ауксотрофного по рибофлавину штамма Е. coli-B2905. С помощью RP4 плазмиду pSL212 удалось мобилизовать в клетки L. buchnerl ВКМ 1310, L. lactis LP1I6 Si)r» В. subtllis 168 3i>r, В. thuringiensis ssp. gallería, В. thuringiensls ssp. Kurstaki HD-1, B. amyloliquefaciens B3157 anrK)2, B. amyloliquefaciens B1796 Sm^-l, B. amyloliquefaciens B1796 Smr162. Частота переноса варьировала от 10~8 до 10~3 на клетку донора (табл. 2). При выращивании культур эксконгюгантов в неселективных условиях в течение 18-24 ч (10-20 генераций) наблюдался различный уровень сохранения ими плазмэды pSL212 (табл. 2).

Таблица 2.

Частота мобилизации и уровень сегрегационной стабильности плаэмиды pSL212 в различных бактериях

Реципиентный штамм

Частота мобилизации (на клетку донора)'

Сегрегационная стабильность в эксконгюгантах, X*

L. buchnsri

L. lactis

В. subtilis

В. thuringiensis gallerías

i x 10~8 1 x 10"6 5 x 10"4 3 к 10~3

10

76 2 0

B. thuringiensls kurstaki

3 x 10

,"7

40

B. auyloliquefaciens 4 x 10~8

0

*, *л - см. примечания к табл. 1.

Мы определяли способность эксконгюгантов, несущих плазмиду рЗЬ212, синтезировать рибофлавин. В кулътуралыюй жидкости ре-комбинантных штаммов содержание витамина составило:

В. subtilis 168 SmrtrpC2 (pSL212) - до 1БОО мг/л

В. subtilis 168 ribD recE4 (pSL212) - до 1000 мг/л

В. thuringiensis galleriae (pSL212) - 10-40 мг/л

В. thuringiensis kurstaki HD-1 (pSL212) - 80-120 мг/л В. amyloliquefaciens В31Б7 Smr502 (pSL212) - 400 мг/л В. amyloliquefaciens B1796 Smr7-1 (pSL212) - 10 мг/л В. amyloliquefaciens B1796 Smr162 (pSL212) - 40 мг/л L. buchneri 1310 (pSL212) - <10 мг/л

L. lactls LP1T6 Smr(pSL212) - <10 мг/л

Приведенные данные свидетельствуют о возможности экспрессии клонированных на pCB20mob генов рибофлавинового оперона В. subtilis под контролем собственных промоторов в клетках разных видов бацилл. В то же время функционирования их в клетках Lactobacillus buchneri 1310 (pSL212) и Lactococcus lactls LPlT6Smr (pSL212) не происходило, вероятно, в связи с тем, что регуляторные элементы рибофлавинового оперона В. subtilis не обеспечивают его экспрессию и синтез рибофлавина в молочнокислых бактериях.

4. Характержстена плазюзды pLFiSli L. fer«ratua Недостаточная сегрегационная стабильность рекомбикантных плазмид на основе стрептококковой плазмиды при клонировании генов в лактобациллах заставила нас провести поиск и исследование собственных плазмид лактобацилл. Мы изучали кряптическую плазми-ду pLF1311 из Lactobacillus fermentum ВКМ 1311.

Плазмида pLF1311 - это единственная плазмида, содержащаяся в штамме L. fermentum ВКМ 1311 (рис. 3).

Общая длина pLF1311 составляет 2389 п.и. Функциональные детерминанты плазмиды определяли путем сопоставления данных нукле-отидной последовательности и экспериментов по делеционному картированию. Была определена минимальная область, необходимая для репликации плазмиды. Она расположена между сайтами Нае11 (931 п.н.) и Sspl (2094 п.н.) и имеет протяженность 1163 п.н. Репли-кативная область плазмиды pLFl311 включает две открытые рамки-считывания, кодирующие полипептиды 6 кДа и 27 кДа, и общий промотор (рис. 4). Структура промотора хорошо укладывается в кон-сенсусную последовательность вегетативных промоторов грачположи-тельных бактерий, в ней отчетливо выделяются канонические элементы: "-10" (TATAATG) И "-35" (TTGTATT) с промежутком в 17 П.Н.

мГ4

рШЗН

2,4т.п.м.

repA

герВ

Рис. 3. Структура критической плазмиды pLF13U из Lactobacillus fermenturn

Аминокислотная последовательность предсказанных белков об-нарудшает заметное сходство с релликативндаи белками рЕ194-подобных пжазмид грамподожительных бактерий, реплицирующихся по механизму "катящегося кольца". Наибольшее сходство проявляется мевду соответствующими бедками плазмиды PLF1311 и плазмиды pLB4 мз L. plantarum [Bates, Gilbert, 19393.

Полипептид RepA размером 6 кДа плазмиды pLF1311 имеет структурное сходство с аналогичным белком плазмиды pMV158 из Streptococcus agalactiae, для которого показано его участие в регуляции транскрипции репликативных генов [del Solar et al., 19893. Мы предполагаем аналогичную функцию для структурно-родственного полипептида 6 кДа плазмиды pLF1311.

Белок £7 КДа, обозначенный RepB, гомологичен топоизомеразам, выполняющим функции инициации репликации плазмид, реплицирующихся с образованием одноцепочечных интермедиатов (оцДНК-плазмид). Дополнительные, эксперименты подтвердили участие белка RepB в репликации pLF1311, Была осуществлена интеграция гена кап из ТпЭОЗ (кодирует аминогдикозвд-3"-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость к канамицину), в сайт Bglll в кодирующей части гена герВ.

..-' . --:......cm........-

i:e¡cccitittttnttt|{ttt(i(t¡Kiti3iiiatt;:;ciliaiuit(ti^(cictu(icteccccnt{t(tt(;cHg(ecctt;acctn "йеП

......-.......If0«51»5>..........

[C!ttUUtc!Sfi!ícccUt!;itt!;5fjttUc[g!!í«í'U£iiiUttlf{:!!¡si:tt¡tjttíctJecittUHtü;U(tiij!:a)¡3

rtfä IES J ! 5 T ! I I ! I Î l S I t ï I î t t a 1

!(tiWtitiiiti|tij¡ii^!altllit(tl{(tt:ii¡ll;iit^wuilliclíl(blilKt!¡H¡!!¡{Uili,'!i!:cti;

teil S I l S g I r S В T i S S I ? 3 f t f t 9 7 S t S S ï I Í 3 M

!af:iU£;cccá;»aatit;*cil£3cti»!tctf:aUjgttisUtUl:¡ttutci;¡Uíú!:í!SctS3!scttíti:ti^cí3t;!¡;:tc

BS Q Í S S S E ! ï 0 7

:ettila;{ciitiaaati!:c(ccct|t(icii:t3c(citictiittii>c|tuu.(>tttiuicatct¡it3ist:í:tctii:i'.cftttf(ie 'bill

re;] » Г I P Э I I ? ¡ î S $ ? ! i В 6 t О 3 13 ? ï î ? ï i í 3 2 S Iltacetc]tccaaitaaaaatcccataacaaaaca{ccttataaac{t{itc{taitt¡|{cuttstt¡tttitcct{aa>iccHcsc(¡tt:att^

rtjl t I 1 I I Q ! Г ! i I S Í I I t I î » g f » í t I I 1 1 a ! ! I î iai2atattatta;ícia;a|cct;t;|c(itMttcetttar9t(it)»(it|ttaatcct{>t¡j2tíc>«>iaaaa<i2cteettitc<ictffUt

. rep) l g ! ! e В « S ! î t I t e I 1 I S 1 I 4 i I Г I В ! S 8 1 t 6 4 » t¡aactae!iíe|a»t!»tc>tH|aieaaatt;aceaaitt(ctaiitctttai¡a¡ctcc(atUct¡:ia({itU¡tascHscc{!¡t'ci{t

retí I I l ? I S J I t î 8 ! 9 ! i S S I ! ? î F 6 G ? ä i. 5 I С I t t ta(atittteictettat||atiatcet(aaaaatatea|tat|iti|ttctaat)ttca¡icattt((t;(tttt(atel(|aaaatt|tctt¡i;ttti

'Sajl

mi s î e i î m « i i t i i i f î s s i a i t i i î j i i g t с i s

tctictjlt|itai¡cricj|¡cut|criitit|clafcuuilttctfi¡aitastattuiciutiii«jittti(cinuittftil5kt!

"Sipl

refl ( g 1 r 1 С 8 r ! ! I ?! I I I L F 1 I E I I t S g I ( I 0 1 I g g

ííjit{cttcaictj(ttf(lttjuatUt|aci(aniifatacactttttatt!!síaatatatiiaHc¡aitt{jci«is!ci!aj»itt|itia

reri S t I Г Г S E ï î С t g I I « I Г f t i Í

U|a;icaiU)ttittca|aaaaic(U|lUica(aatcatcaaiaiUcoctctU(ataiiititt|tttcuiat

■SepI

Рис. 4. Репликативная область плазмиды pLF1311

Полученная плазмида была способна поддерживаться в клетках лишь в присутствии плазмиды-помощника с интактным геном терВ. Таким образом, белок ИерВ необходим для репликации плазмиды как транс-действующий фактор.

Возможную область начала репликации мы идентифицировали по гомологии с ог1+ плазмиды рЬВ4 и других рЕ194-подобных плазмид (рис. б).

Были проанализированы также нуклеотидные последовательности рЬПЗИ, необязательные для репликации. В их составе не выявлено протнненных открытых рамок считывания, способных кодировать полипептиды. Очевидно, что кроме герА и герВ, кагло-лнбо структурные гены в пдааыиде рЬПЗИ отсутствуют.

А С Т 6 С А

А С .С А 990 G-C ' G-C G-C 6-С G-C I С Т-А А-Т C-G А-Т

АААА GTCCAT. 980 1100

Рис. 5. Возможная вторичная структура области ог!+ плазмиды pLF1311

Нуклеотидная последовательность pLF13ll содержит также длинный несовершенный палиндром, находящийся выше промотора реп-ликативных генов и гомологичный области orí- плазмиды pLB4 и не-

G A • A Т А

С G T С Т А

С G T A С G

G С С G С G

A G С G в С

G A G С А а

T A A G G А Т т

T A G A Т Т Т А

A 7 T T Т А С G

T T t A А Т G С

T A A ? Т Т 7 А

С G T T Т А • С G

С A T A С G Т тТ

G С с G С . т

A T G С G. С т А

T A G С 3 С с G

A T G С G С G С

G С G С G С G С

A T A Т ' А ? G С

T A G с G С G С

G A т A t . А т

С T т ? Т А т

A T G Т G А т

G с G С G Т т

С G Г A A А А А Т т

G G А G

G С G С G А А

G T (3 Т G G G

С A С С С G

A T т А Т Т С

A T A AT А Т

A T A Т А Т А т

T A i А Т А А т

A G G А А А Т А

G G G G G G G А

С G С G С G j

А Т А Т А Т С G

А Т А Т А Т А Т

С G С G С G- А Т

Т А т А т А С G

G Т G Т G С Т А

Т А Т А Т А G С

С G С G С G Т А

Т А Т А Т А С G

G С G С G С ' Т А

ТААСТ TTTGC ТААСТ TAGAC TAGCT ТААСС • AACOG

Т'ГСА

р353-2

р8014-2

pLJl

plf1311

А

Рис. 6, Вероятные структуры ori- различных плазмид, выделенных из бактерий рода Lactobacillus

р353-2 из L. pentosus; р8014-2 из L. plant arum; pLJl ИЗ L helveticus; pLF1311 из L fernentum.

которых других плазмид лактобадилл, реплицирующихся по механизм "катящегося кольца". Он, по-видимому, функционирует как ori-плазмвды PLF1311 (рис. 6).

В целом можно отметить оригинальность организации pLF1311, сочетающуюся с чертами сходства с другими плазмидами грамположи-тельяшх бактерий. Сходство проявляется в гомологии RepB белка РШ1311 с топоизомеразами, a RepA - с ДНК-связываящимися репрес-сорами транслфипции некоторых оцЦНК-плазиид; в наличии консервативных последовательностей, гомологичных ог1+ и ori-. В то же время pLF1311 выделена из L. fennentuns - объекта, у которого пдеаде плазмиды описаны не были. Определение полной нуклеотидной пскиедовательности pLF13li продемонстрировало ее отличие от любых-; известных плазмид.

5. вентщш кэмейгжза /¡LF

Изученная нами плазмида pLFi'311 была использована для конструирования на ее основе векторов для клонирования генов в лактобациллах и других молочнокислых бактериях.

Поскольку возможности генетических манипуляций с криптичес-кой! плазмвдой pLF1311 ограничены, на первом этапе представлялось целесообразным маркировать ее геном устойчивости к антибиотику. НЁшичие рестрккционного сайта Pstl в несущественной для репликацию области позволило интегрировать ген устойчивости к хлорамфе-ннколу (cat) из стафилококковой плазмиды рС194, который экспрес-скруется как в грамголояительных, так и в грамотрицательных бактериях . Полученная плазмида была обозначена pLF2 и имела размер г.я.н. (рис. 7).

Шазмвдз pLF2 имеет уяйкалькйе сайты для эндонуклеаз рестрикции Mlui, Sali, Snai, а такие дба сайта'Sphi, лежащие в несущественной для решшкацйй области и .пригодные для клонирования; ее вариант, pLFVl имеет дополнительно сайты EcoRi и BamHI, введенные в составе линкера. Плазмиды pLF2 и pLFVI проявили свойства однорепликонных векторов, способных к репликации с использованием собственных .функций' как в Е. coll, так в В. subtilis, L. fernentum, L. lactis.

Для конструирований мобилизуемой плазмиды в BamHI сайт pLFVl ввели фрагмент ДНК плазмиды pSUP50il, несущий [^-специфичный oriT. Выли отобраны две рёкомбинантные плазмиды, одна ие которых размером 5,1 т.п.н., обозначенная pLFVMl, и ее делецион-

ный вариант размером 4,7 г.п.н., обозначенный pLFYM2 (рис. 7). Вариант pLFVM2 со встроенным EcoRÍ-линкером в уникальныйáSmal сайт, обозначен pLFRÎ.

Достоинством плазмад pLF¥M2 и pLFRI является их способность к мобилизации, что позволяет клонировать гены в Е. coli, а--затем переносить их при конъюгации в различные грамподоаштельные 'бактерии. Эти векторные молекулы содержат уникальные сайты для ->эн-донуклеаз рестрикция, пригодные для клонирования генов1(сайт Smal в векторе pLFVlß п сайг EooRI в векторе pLFRI).

В плазмиде pLFVtG за геном cat (по ходу транскрипции)-находится область размером 2,4 т.п.н., несущественная для репликации и ограниченная сайтами Salí. После ее удаления мы получили i плаз-аду, обозначенную pLFDl (рис. 8).

Плазмида pLFDl - минимальный челночный вектор (размер 2,35 т.п.н.), способный к репликации в Е. coli и грамположительных бактериях, таких как В. subtilis, куда может быть введен трансформацией. В его полилинкере находятся сайты узнавания эндонук-леаз рестрикции Smal, Kpnl, Spill, PstI, Sali} из них сайты Smal, Pstl, Sali уникальны, а вторая копия сайта SphI хотя имеется в пределах плазмиды, ко находится в несущественной для репликации области, и клонирование по этому сайту также возможно.

Рис. 7. Структуры векторных плазмид pLF2 и pLFVM2.

герВ

Рис.8. Схема конструирования мобилизуемых векторов plFmob76 и pLF4 * - сайты лигирования Xho I - Sal I

В целях дальнейшего усовершенствования з полученный минимальный вектор pLFDl был клонирован второй селективный маркер, ген кап из Гп903, обеспечивающий устойчивость к канамицину и экспрессирующийся в грэлположительных и грамотрицательных бактериях. Полученная плазмида обозначена pLF-Kl (рис. 8). Вектор pLF-Kl позволяет проводить отбор вставок по иксэрциояной инактивации маркера устойчивости к кгнач:щнну или к нлоргмфениколу. Он имеет следующие уникальные сайты: Xhol, Pvul (в пределах гена кап) и t'col, StuI (в пределах гена cat).

В сайт Xhol плазмиды PLF-Kl проведено клонирование Sali фрагмента ДНК, содержащего oriT плазмиды' RP4 (1,7 т.п.к.). Полученные плазмиды, содержащие вставку в противоположных ориентаци-ях, обозначены pLFinob7 и pLFirobS.

Удаление из плазмиды pLFmob7 фрагментов Smal-Smal и Smal -Aval по 0,82 т.п.и. каддый, привело к образованию плазмиды размером 3,5 т.п.н., обозначенной pLFmob75 (рис. 8).

Дяазнида pLFmob76 - челночный вектор малого размера, несущий маркер устойчивости к хлорамфениколу и способный к мобилизации из Е. coll в грамполояительные бактерии с помощью RP4. Со-дер.тлт уникальные, пригодные для клонирования сайты BamHI, Pstl, Sali, Smal, Sphl.

С целью оптимизации из pLFirob76 был удален фрагмент Нае 11 размером 0,7 т.п.н., несущественный для репликации плазмиды. Ре-комбинанты нужной структуры были обозначены pLF4 (рис. 8). Пгаз-мида pLF4 содержит два уникальны;« сайта Smal и HindiII, не затрагивающих функционально вашых областей. Из нее получека прсиа-воднап (pLF4H) с инактивированным сайтом HindiН. Последняя плазмида объединена по единственному оставшееся для клонирования сайту с lacZ' из pBluescriptSK(+).

Рекембинаятная плазмида,' обозначенная pLF6 (рис. 9), представляет собой усоЕераенствоваиный челночный вектор, ' 'реплицирующийся в Е. coli и широком круге грампогояитедьных бактерий, придающая меткам устойчивость к хлорамфениколу. Вектор pLFS содержит унигллыше, пригодные для клонирования сайты Apal, Xhol, Sali, Hindll I, EcoRY, EcoRI, Pstl, Smal, BamHI, Spei, Xbal, Sac 11 и позволяет проводить селекцию рекомбинантных клоноз по цвету колоний Е. coll на иидгасаторных чайках с X-gal и ШТГ. Отобранные рекомбинантные плазмиды могут быть введет! в различные реципиентяые бактерии с поморю конгягативной мобилизации из

.iacy.

fipal

Xhol

Sail' '

Hindi 11

EcoRV

EcoRI

PstI

Smal

BamHI

Spel

Xbai

N□41

Ealll

Рис. 9. Структура мобилизуемого вектора. pLF6.

Указаны уникальные сайты» пригодные для клонирования.

штамма-донора Е. coll, содержащего плазмиду-мобилизатор RP4 и мобндивуомую плаэмиду pLF6.

Таким образом, была сконструирована серия челночных плаз-мидных векторов pLF, основанных на критической плазмиде из L. fermentum. Среди семейства pLF имеются векторы, обладающие различными полезными для манипулирования с ДНК свойствами: малыми размерами (2,35 т.п.н., pLFDl), выбором селективного маркера (хлорамфеникол или канамицин, pLF-Kl), мобилизуемостью из донора Е. coll в граыгюложительные бактерии (pLFVM2, pLFmob76, pLF4, pLF6), большим числом .пригодных для клонирования сайтов рестрик-таз, возможностью прямой селекции рекомбинантов по цвету колоний Е. coll (pLF6). Полученное семейство pLF обеспечивает задачи клонирования различных генов с собственными промоторами в лакто-баци/лах, Е. coll и широком круге грамположительных бактерий.

6. Определенна круга хозяев репликона рLF1311

Так как процесс конъюгативной мобилизации относительно слабо вависит от свойств реципиентного штамма, нам представлялось

возможным изучить круг хозяев решшкона pLF1311 среди различных лактобадилл и других грампположительных бактерий» используя мобилизуемые векторы - производные pLF1311.

Выше было указано, что плазмида pLF2 реплицируется в клетках В. subtilis. Подобно некоторым другим плазмидам из грамполо-лительных бактерий (рС194, pMV158, pSH71, pWVOl), для которых показана их способность реплицироваться в Е. coli, pLF2 также поддерживается в клетках кишечной палочки. Круг возможных хозяев репликона pLF1311 оказался необычайно широким. Производные PLF1311 были введены в клетки Lactobacillus buchneri, L. brevis, В. subtilis, В. thuringiensis ssp. galleriae, B. thuringiensis ssp. kurstaki, B. thuringiensis ssp. finitimus, B. anyloliquefaciens, E. faecalis, E. faecium, L. lactis, Brevibacterium flavura, а также в грамотрицателыше бактерии Е. coli и Erwinia sp. Частоты мобилизации приведены в табл. 3.

При выращивании культур эксконтогантоз в неселективкыя условиях в течение 18-24 ч (10 -20 генераций) большинство из них сохраняло ллазмиду. Сегрегационная нестабильность производных PLF1311 (в проверенных культурах) наблюдалась в штаммах Е. coli (74 %), в клетках Br. flavum (96 X), в В. thuringiensis kurstaki (50 Z) (табл. 3).

Способность плазмид семейства pLF реплицироваться з широком круге грамотрицательных и грамполояительных бактерий можно объяснить исходя из структурной организации pLF1311. Репликация этой плазмиды инициируется собственным белком RepB, закодированным в ее геноме. Таким образом, для поддержания репликона PLF1311 в широком круге хозяев достаточно, чтобы промотор герВ гена узнавался РНК-подимеразами многих бактерий. Это узнавание, очевидно, и происходит благодаря близости промотора pLF1311 к консенсусной промоторной последовательности.

Способность полученных на основе pLFl311 векторой поддерживаться в Е. coli позволяет легко клонировать различные гены в этом хозяине. А возможность мобилизации рекомбинантных плазмид позволяет вводить клонированные гены з лактобациллы и другие грамположительные бактерии и изучать эффективность экспрессии в них, что облегчает скрининг перспективных реципиентов.

Таблица 3.

Частота мобилизация й. уровень' сегрегационной стабильности репликона pLF13ii в различных бактериях

Реципкентный Частота Сегрегационная

штамм мобилизации стабильность в

(ка клетку донора)* экскониогантах, %**

L. brevls 3 X ю-8 100

L. buchnerl ■ 1 X Ю-7 100

L. lactls 3 X ю-7 100

E. faecal is 1 X 10"5 100

E. faecium 5 X 10~7 100

B. subtllis 5 X Ю-5 96

B. thuringiensis 2 к Ю-3 96

galleriae

B. thurlngiensis 5 к 10"6 50

kurstaki

B. thuringiensis 5 X Ю-5 Н.О

flnitirous

B. atiyloliquefaciens 2 X 10"6 98

Brevlbacterlum 5 X Ю-8 4

flavu-n

•E. coli 1 X Ю-2 26

н.о - данные не определяли.

- см. примечания к табл. 1.

(^Зшгощртагшё иешщрш генов в производных рМ1311 Чтобы проверить возможность клонирования в векторах-произ-водккх pL.Fl 311 различных генов, а также исследовать возможное^ введения чужеродного генетического материала в лактобациллы ] другие молочнокислые бактерии, мы субклонировали в производим pL.Fl311 некоторые известные гены различного размера.

а) субклонирование гена препрокарбоксипептидазы Т

Thermoactinomyces vulgaris 936 Одним из выбранных генов для субклонирования был ген преп

рокарбоксипептидазы Т термоактиномицета Т. vulgaris 936. Источником гена служила плазмида pOZ119, содержащая указанный ген на фрагменте размером 1,9 т.п.н. плазмиды pOZ119. Этот ген переклонировали в вектор pLFRI. Полученные рекомбинантные конструкции, обозначенные pLFCPl и pLFCPS, содержащие ген препрокарбоксипеп-тидазы Т в противоположной ориентации, были введены с помощью конъюгативной мобилизации в клетки L. lactis, В. thuringiensis finitimus, В. thuringiensis kurstaki, В. subtilis. Экспрессии карбоксипептидазы Т в исследуемых штаммах не было обнаружено, что может быть связано с различиями в структуре промоторов термоактиномицетов, лактококков и бацилл. Однако, проведенная работа показала возможность клонирования-в производных pLF1311 чужеродных генов, а также возможность введения этих генов в различные реципиенты.

б) субклонирование гена нейтральной протеиназы В. brevis в векторе pLF6

Клонирование генов протеолитических ферментов в молочнокислых бактериях может повысить эффективность использования реком-бинантных штаммов в качестве пробиотиков или в составе заквасок.

Мы переклонировали в вектор pLF6 ген нейтральной протеиназы В. brevis. Источником данного гена послужила плазмида рТМ261, содержащая ген нейтральной протеиназы на фрагменте размером 2,35 т.п.н. Рекомбинантные плазмиды с противоположной ориентацией вставки были отобраны на селективной среде с X-gal и ИПТГ и обозначены pLFnpr2 и pLFnpr4 (5,65 т.п.н.). ¡В результате конъюгативной мобилизации из донорных штаммов £. coli, содержащих также плазмиду-помощник RP4, рекомбинантные плазмиды были введены в клетки L. buchneri ВКМ1310, Е. faecalis 0G1, В. subtilis 168 Smr, В. subtilis А773.

Препараты ДНК из эксконъюгантов L. ^buchneri ВКМ' 1310, В. subtilis А733 , Е. faecalis OGl содержали ¡плазмиды большей подвижности по сравнению с контрольных«! ллазмидами ipLF6npr2 и pLF6npr4. Все наблюдаемые делеции затрагивали клонированный ген 'нейтральной протеиназы, не изменяя структуру .исходного вектора !pLF6. 'Структурная нестабильность ¡рекомбинантных плазмид, несущих ген нейтральной протеиназы, 'выявляется уже ® донорных штаммах Е. coli ¡после .нескольких пересевов бактерий.

Укороченный фрагмент гена нейтральной протеиназы плазмиды

pLFnpr4 обеспечивает некоторый синтез фермента в клетках экс-конъюгантов В. subtilis А773 и в клетках эксконъюгантов Е. faecal is OGi. Клетки экскониогантов L. buchneri 1310 не давали зон гидролиза молока. "

Таким образом, эксперименты по конъюгативной мобилизации конструкций на базе pLF1311, несущих ген нейтральной протеиназы, в большинстве случаев не привели к получению продуцентов фермента. Однако, это не связано с принципиальными возможностями использованного вектора и метода конъюгативной мобилизации, а зависит, очевидно, от токсических свойств соответствующего белкового продукта, сникающего жизнеспособность донорных рекомбинант-ных клеток. .

8. Ешзии© система рестрикции - кодафзвкдии ЕатШ . ма частоту обцшавашзя эксошньигэдлгаа

При попытках ввести плазмиду pSL212 путем конъюгативной мобилизации из донора Е. coli В2905 (RP4, pSL212) в штаммы В. amyloliquefaciens, первоначально нам не удавалось получать экс-конъюганты бацилл, устойчивые к эритромицину. Мы предположили, что это может быта связано с функционированием в реципиенте системы рестрикции ВапШ.

С целью изучения влияния рестрикции-модификации BamHI на частоту образования эксконкогантов- в докорный штамм Е. coli -B2QQ5 (RP4, pSL212) была дополнительно введена многокопийная плазмида рВашНШ4(3)а содержащая экспрессирующийся ген метилазы BamHI и совместимая с имеющимися плазмидами. Специфическая активность метилазы выявлялась по ингибированкю рестрикции ДНК, выделенной из трехплазмидного штамма, ферментом BamHI. Для скрещивания в качестве реципиентов брали штаммы В. amyloliquefaciens В3157 Smr502, В. amyloliquefaciens В1796 Smr7-1, В. amyloliquefaciens В1795 Smr162. Если в качестве донора выступал штамм Е. coli В2905 (RP4, pSL212), ке содержащий ген метилазы BamHI, образования эксконыогантов бацилл не происходило. Экс-конъюганты В. amyloliquefaciens, устойчивые к эритромицину и продуцирующие' 'рибофлавин, появлялись лишь при использовании метилирующего донора Е. coli В2905 (RP4, pSL212, pBamHIM4(3)) (табл. 4).

В опытах по переносу мобилизуемых плазмид, производных PLF1311, в клетки В. amyloliquefaciens А50, эксконъюганты ба-

цилл удалось получить только при использовании вектора pLF4, не имеющего ВашНЬсайта рестрикции (табл. 4).

Таким образом, мы продемонстрировали возможность конъюга-ционного переноса плазмидной ДНК из Е. coli з клетки В. amyloliquefaciens, при котором частота образования эксконъюган-тов зависит от активности системы рестрикции-модификации BamHI реципиентного штамма.

Таблица 4.

Частота мобилизации различных плазмид в клетки В. amyloliquefaciens

Донорный штамм Селективные маркеры Частота 1

Е. coli эксконъюгантов. мобилизации 1

C600recA~(RP4, pLFVM2) PmrCmr <10"9 I

СбООгесА"(RP4, pLF4) PmrCmr 2 x 1СГ6 I

В2905 (RP4, pSL212) PmrEmrLmr <10'9 1

В2905 (RP4, pSL212, PmrEmrLmr 4 x 10'8 1

pBamHIM4(3))

вывода

1) На основе известных двурепликонных плазмид pHV33 и рСВ20 получены векторы pSL201 и pCB20mob, которые с помощью конъюгатив-ной мобилизации могут быть перенесены из Е. coll в клетки лакто-бацилл и других грамположительных бактерий.

2) В вектор pCB20mob переклонирован'ы гены биосинтеза рибофлавина В. subtllis и с помощью конъюгативной мобилизации полученные гибридные плазмиды введены из Е. coli в клетки лактобацшл, лак-тококков и различных бацилл. Показана экспрессия генов биосинтеза рибофлавина в бациллярных клетках.

3) Изучена структурно-функциональная организация криптической плазмиды pLF1311 из L. fermentum.

4) На основе плазмиды pLF1311 построены векторы для клонирования ДНК в лактобациллах и других грамположительных бактериях, в том

числе мобилизуемые векторы» и вектор, обеспечивающий прямой отбор рекомбинантов. Показана возможность использования этих векторов для клонирования чужеродных генов и введения их в различные грамположительные бактерии.

5) Исследованы некоторые факторы, влияющие на эффективность контюгативкой мобилизации. Показано влияние ка частоту образования эксконъюгантов системы рестрикции-модификации BamHI В. anyJoliquefaciens.

йшсш печатана работ, опубжиойаашыа по хеке диссертации

1. Лившиц В.А., Румер J!.M., Семенова Е.В. Введение плазмид в клетки молочнокислых бактерий с помощью трансформации протопластов и конъюгации. Материалы Всесоюзной научно-технической конференции "Современная технология сыроделия и безотходная переработка молока". Ереван, 1988.

2. Румер Л.М., Абклев С.К., Семенова "Е.В., Рябченко Н.Ф., Лившиц В.А. Коныогационный перенос плазмиды pAMel, несущей детерминанты устойчивости к макролидным антибиотикам, мезду различными грамположительными бактериями. В сборнике докладов Всесоюзного семинара "Современные проблемы антибиотикорезистентнос-ти". 1988, Москва.

3. Лившиц В.А., Макарян К.В., Кочарйн Н.А., Семенова Е.В. Селекция антибиотикоустойчивых ыолочнокислых бактерий/ Биол. ж. Армении, 1989, 42, 11, 1023-1025.

4. Лившиц В.А., Семенова Е.В.» Макарян К.В. Конъюгационный перенос плазмиды из. Escherichia coli в клетки молочнокислых бактерий. Биол. ж. Армении, 1990, 43, 9, 793-795.

5. V.A. Llvshits, Е.В. Torban, J.V. lomantas, V.G. Doroshenko, E.V. Semyonova. A new broad host range plasmid from Lactobacillus fermentum. 1UMS Congress: Bacteriology 6 Mycology-Osaka, Japan-1990.

6. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum, используемый для приготовления пшеничной закваски: А.с. 1620482 СССР, МКИ4 С 12 N 1/20 // А 21 D 2/00/ С.З. Сагындыкова, М.Х. Шигаева, В.А. Лившиц, Е.В. Семенова/СССР/.- Бюлл. No 2, 15.01.91.