Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПРИРОДА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ ЛАКТОБАЦИЛЛ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ПРИРОДА АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ ЛАКТОБАЦИЛЛ"

А-зо^^Л

ОРДЕНА ЛЕНИНА и ОРДЕНА ДРУЖЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАШИ

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАЫЗНИ ШС1ИЗУТ МКРОБКОЛОПШ И ВШСОЛОГКИ им. Д.К.ЗАШЛ01НОГО

На правах рукописи

ПИВОВАРЕНШ Татьяна Викторовна

УД!! 579.252.5:615.33

природа антошотикоустойчивости ллктобацш

/03,00,07 - микробиология/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

КИЕВ - 1992

с

Работа выполнена в отделах вирусов водорослей к физиологии промышленных микроорганизме* ордена Трудового Красного Знамени Института микробиологии к вирусологии км. Д.К.Баболотного АН Украины

Научные руководители: доктор биол. наук

м.и.мевдш

доктор биол. наук Н.К.КОВАЛЕНКО ■

Официальные оппоненты: член-корр. АН Украины

Б.П.МАЦЕШХ

кандидат биол.наук И.Н.С1ШН

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и генетики

АН Украины

Защита' состоится •Л?" 1992 г. на заседании специали-

зированного совета Д.016.Об.01 по присуждению ученой степени доктора биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украины /252143, Киев-143, ул. акад.Заболот-ного, 16-1/.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биол. наук

Э.А.Коваленко

Общая гарантеркстика работы Актуальность теш. Молочнокислые бактерии привлекают к себе все возрастающее внимание исследователей. Успехи микробиологии, расширили и усовершенствовали области применения этих микроорганизмов. Огромна роль молочнокисл!« бактерий в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, медицине..

Лактобаниллы - палочковидные формы молочнокислых бактерий» являются компонентом нормальной микрофлоры пищеварительного трак-"та человека и животных. На и* основе создан ряд препаратов для лечения дисбактериозов. Есть сведения об иигибирующем воздействии лактобацилл на рост опухолевых клеток. В ряде случаев, однако, _ лактобадаллы могут сопутствовать различным патологическим состояниям: эндокардитам, осложнениям при пневмониях и др..Таким образом, для проведения эффективной акткбкотккотерапии, наряду с применением лактобациллярных препаратов, необходимы знания спектров, уровней и' механизмов устойчивости лактобацилл к антибиотикам. В литературе эти сведения весьма ограничены.

Широкое прикладное значение данной группы микроорганизмов -обусловило начало работ по исследованию их генетических систем. В шташа* лактобацилл обнаружены плазмиды, участвующие в контроле, метаболизма, плазмиды анткбиотикорезистентности, бактеркоцккоген-ности. Недавно обнаружены плазмиды лактобацилл с широким кругом грамположительных бактерий-хозяев. Учитывая ваяное биотехнологическое значение лактобацилл, представляет болыцу» перспективу де-* тальное исследование генетических систем этих микроорганизмов и, в частности, их плаз«ид. ■ ' .

•Цель к задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование коллекции .лактобацилл, выделенных из различных экологических ниш, на устойчивость к ряду антибиотиков, а также выделение и изучение молекулярно-биологических свойств плазмид лактобацилл. В процессе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

- определение минимальной икгибирующей концентраций /ШИ/ ряда аминогликозидных антибиотиков /канамишша.стрептомицина, ген-

тамицина/ и тетрациклина для штаммов лактобацилл;

- исследование распространения генетических детерминант*резистентности к антибиотикам среди лактобацилл;

- изучение структурно-функциональных свойств плазмиды рВ3195» выделенной из штамма ЬасъоЬаеШцв

1 ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА - Моск. сельскохоэ ачадв*»**

К. А. Тимирязева

Иив.

- исследование nunзмия других пггаммов ллктобаиилл. . Научная новизна, Установлена сгироко распространенная пеэистент-кость лактоГкяцилЛ к канамицину, стрептомицину, гентаыуцииу. Предложены критерии оценки устойчивости лактобацилл к ряду аминоглико-эидных антибиотиков и тетрациклину• Впервые показано, что 14? исследованных итаммоп лактобацилл содержат детерминанты резистентности, гомологичные генам резистентности, широко распространенным среди грамотрицательных микроорганизмов. Впервые в дактобаииллах /штамм L.plantarmn 195 / обнаружена и изучена плаэмкда pBS195 с широким кругом грамположительных к грамотринательных бактерий-хозяев. Практическая ценность. Предложенные критерии опенки ант к <5 йот неустойчивости лактобацнлл могут быть использован« для дальнейших исследований этого рода бактерий. Выявлены нетипичные для природной системы свойства плазмиды рв5195, а именно: широкий круг грамполо-жителькых и грамотридательных хозяев, сравнительно малые размеры /4,4 тпо/, наличие уникальных сайтов для эндоиуклеаэ рестрикции, мобилиэуемость, хорошо экспрессирующийся в гетерологиччых системах маркер устойчивости к канаышику, что делает возможным создание на ее основе шаттл-вектора для клонирования. Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодые ученых ИБФк АН СССР /март,1У30 г./,.ежегодной научной конференции-конкурсе работ ИБФМ АН СССР /декабрь,1990 г./, конференции молодых ученых НЬБ АН Украины /июнь,199Х -г./, ежегодной конференции-конкурсе работ ИШ All Украины /декабрь,1991 г./, Всесоюзном сопещанки"Плаэцл" /Нальчик, октябрь,1990 г./, Всесоюзной ^конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" Аосква, октябрь,1991 г./. Всесоюзной конференции "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" /Самарканд, 1991 г»/( 6th. International Sywpoaiutu of Cenetlo of Induetrial . ],:i о reorganises /Strasbourg, 1990/.

Публикация результатов исследования» Основыне положения диссертационной работы опубликованы в б печатных работах. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы /I глава/, экспериментальной части /3 главы/, заключения , выводов и списка литературы /132 источника, из них 2 работы отечественных авторов и 130 - иностранных/. Работа

изложена на 84 страницах машинописи, иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами. ■■* ' . ;

' КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты исследований..В работе было использовано 186 штаммов лантобаиклл, выделенных из различны* зяйлогических ниш /табл.1/. Лактобациллы выращивали в среде íiPC при 37°С. При исследовании ■ свойств плазмиды использовали штаммы и плйзЫиды, представ-

ленные р табл.2. 1

Основные методы. Для определения КИК "антибиотиков штаммы выращивали в жидкой среде /MFC - для лактобацилл, МПБ - для P.putldü, р.aeruginosa, В.aubtilis / в течение 18 часов. Затем культуру разводили в 100 раз свежей питательной средой и КГ* клеток помещали на чашки с агаризованной средой и антибиотиком при помощи репликатора. Культуры выращивали в термостате при 37°С. Для определения КИК лактобациял использовали следующие антибиотики в соответствующих концентрациях /мкг/мл/:

канамкцин - 25,50,100,200,300,500,1000,2000,5000,10000; , тетрациклин - 10,25,50,100,200,500,600; ■

гентамицин - 5,10,15,20,30,50; стрептомицин - 25,50,100,200,300,500; эритромицин - 15,30,50,100. "

Плаэмиднув ДКК из клеток E.coli выделяли по методу Birnboim-' Doli/1979/, из клеток лактобацилл по методуЮ-ечийотлюг /1980/. трансформацию плазмидной ДНК клеток К.coli и Pseudomonas осуществляли по методу Chacraborty etol. /1975/, клеток B.üubtill3 согласно Гловер /1988/.

Для осуществления конъюгативного переноса плаэмид ставили мобилизационное скрещивание на твердой среде и нитроцеллюлозных фильтрах /líillipore, 0,45 и® /. Расщепление ДНК рестриктазами прово^ли с использованием стандартных буферов "liißh", "low", "medium" /Ыаниатис с соавт.,1984/. В работе использовали рестрик-таэы, порученные на опытно-технологической установке ИВЕМ АН СССР, НПО "Вектор" /Новосибирск/, НПО "Фермент" /Вильнюс/. ДйС-ДНК гибридизации осуществляли по Southern. /1975/. Перенос колоний лактобациял на нитроцеллплозкые фильтры осуществляли по методике, описанной Gruna tain ot al. /1975/. Ник-трансляцию ДНК проводили по

-б -

методу Rigty et el. /1977/ с использованием набора для кик-трансляции /" Anersiioa ", Англия. Удельная радиоактивность препаратов ДЖ составляла 10^ имп/мин/мкг. Элюци» фрагментов ДНК из ага-розного геля проводили согласно Dre taen et el. /1981/ при использовании IEAE -целлюлозы / КА 45/.

С целью определения совместимости исслецуемой плазиды рBS155 о плазмкдами-тестерами осушествляли трансформацию тестерной плаами-дьг в реципиентный штамм, несущий изучаемую плазмицу. После трехкратного клонирования на селективной среде полученные трансформанты проверяли на наличие обеих плазмид. Клоны, сохранившие маркеры обеих плазмид, проверяли злектрофоретически с целы» выявления возможного образования гибридных плазмид.

Мини-клетки получали при использовании штамма L.coliХ925 по ме-Т0ДУ stoker et al. /1984/. Мечение белков, детерминируемых плазми-дой pBS-195 » в системе мини-клеток осуществляли согласно Stoker et el. /1984/. Удельная радиоактивность метионина /^s / составляла 1000 Ки/мМоль. Электрофорез белков в SDS-ПААГ осуществляли по ме-Leemili et al. /1970/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

■ I. Определение НИК ряда аминогликоэидннх антибиотиков и тетрациклина для штаммов лактобацилл. Лактобациллы, выделенные из разных экониш, в подавляющем большинстве оказались устойчивыми к одному или нескольким аминоглико-зидным антибиотикам и тетрациклину'/73Ж штаммов, выделенных от птиц и 70$ штаммов, выделенных от человека/. Установлено, что МЖ кана-мицина и стрептомицина для штаммов лактобацилл колебалась в широком диапазоне концентраций: от 50 до 1000 мкг/мл, гентамицина — от 15 до 50 мкг/мл, тетрациклина - от 25 до 600 мкг/мл. Устойчивыми считали штаммы, для которых МИК антибиотика составляла: конакицина и стрептомицина - 50 мкг/мл; гентамицина - 15 мкг/мл; ' ■ тетрациклина - 50 мкг/мл. ^

Установлено, что 83Й штаммов лактобацилл, выделенных от птиц, устойчиво к канамицину, - к тетрациклину. 6IÎ& - к гентамицину, 62fî резистентно к стрептомицину. К эритромицину /концентрация 50 мкг/мл/ устойчиво лишь 4Й штаммов /табл.3/.

Среди штаммов, выделенных из пищеварительного тракта долгожите—

Таблица I. Штаммы лактобецилл, использованные в работе.

■4стоштик выделения Виц Количество

Цыплята личного направления L.buchnsrl * ■ 24

/1{иввскея птицефабрика, пти- li.fernsntun 53

иефабрика "Украина", Василь- L.acidophilus 19

ков/, цыплята бройлеры/Но- L, sallvarius 4 розовская лтицефпбрика/. !.. animal! в • 8

L.oEilis I

L.delbrueckii .2

L.ruminis * 2

L.plantarum 2

' ' L.brevis I

.■ L.sp. 5

Куры /ИМБР Ait Украины, виварий/ L.ucidophilus 3

L.solivariua I

Т^гси домашние , L.plantisrum. 4

L.acidophilus 3

Инцюки домашние L. salivarias I

l.delbrueckii I

L.ao. I

Утки домашние L.plantorum I

Желудочно-кишечный тракт L.plaatarum 3

долгожителей Абхазии L.pseudoplantarum 3

L.xjfloous 3

L.ncicïopbilus 5

X..helveticus 3

L.salivarius 3

L.bulgariens I L.laotis * I

' L.ap. 3

Жеяудочио-кшечнмй тракт свиней L.^p. 5

Пациенты с патологией желудоч- L.plontarum 6

н0-китечнсго тракта . L.cellobioaua I

Молочные продукты L.acidopbllus 3

L.brevis 2

L.bul^aricua I

■ " ■ L.virideacens I

- Вода бассейна с форелью L. plant агата 2

Международная коллекция микро- L.brevis I

организмов /Чехословакия/ L.delbrucckii I

L.lactis I L.c.'.tci . 1 I

лей Абхазии, устойчиво к канамицину к гентамицину - 48Й, к стрептомицину - 24% /табл.4/. Три штамма оказались чувствительными ко всем использованным антибиотикам. Среди лактобацилл, выделенных от долгожителей, не обнаружено штаммов, резистентных к тетрациклину и эритромицину* " ■■; ,

Таблица 2. №аммы и плазмиды, использованное в работе.

Название лгтамда, плазмиды

Генотипическая характеристика

■ iütovhmk

получения

i E.coli К12 . JM 109

КЗ 101

. х 925

Р, aeruginosa МЫ 2 62

P.putläc BS32A F.putitfa BS250 B.aubtills 16Q E.feecalis L.lactis

EP4-4 p№322 RSF1010 pSUP2021 RS

pAi-pi pUC19

recM г^углус tili hsälil7 supE4'i лаборатория relA1 3?VtroD50/ pro/iß lacY 'биологии IcüB pro-22 thi-1 Inen гес/ИЗ илаямид end-1 rspH h.söll hsdM • AI

F- min/. MinS tUr 1ец tili ars СССР trp hia ilv not rif eye trp

trp met rif ' x

kau tro+ incP-1 tru* .incP-1

rif

tot Ъ1а te t M. а tet

atr £sal tru- inc^ küri blci

Eitr blo tm+ incX' bit

bla trrü-

Видовой состав штампов лактобацилл, выделенных от долгожителей, разнообразен и включает Ь.р1а^агига, ь.рввчаорХап^агшп, ь. Ьв1лгв1;1оиа, Ь.ао1йорЫ1иа, Ъ.хуХоеиз, Ь. оаа«1, Ь.Ъи1еаг1оиз /таблЛ/.

Ореди- лвктобацилл, выд,еленньте от птиц, преобладают штаммы: Ь-Гегтов*шв /3®й/; Ь.ЬисЬпег! к Ь-ас1ЙорМ1иа составляют равное количество/по реже встречаются вид*' Ь.р1атагшп, 1-ап1па11а, 1..ва11таг1ив. Остальные виды представлены единичными штаммами /табл.1/."

Не установлено какой-либо закономерности в лекарственной устойчивости различных видов лвктобацилл. Среди представителей всех исследуемых видов обнаружены устойчивые к антибиотикам штаммы /табл.5/. /

Таблица 3. Устойчивость к антибиотикам лактсбаиилл, вИеленнпс от птш.

Концентрация антибиотиков Л'кг/мл/ i

эрктро-

канамицин стрептомицин гентауицин тетрациклин сицин

25 50 100 200 300 500 25 50 100 200 300 5 10 15 20 10 25 50 100 200 600 25 50

Число "

устойчивых 118 ИЗ 64 56 37.19 90 85 69 19 4'89 89 03 69 106 105 91 63 26 14 6- 6 штампов

% от ■ . общего

числа 87 83 47 41 27 И 66 62 51 14 3 65 65 61 51 78 77 67 46 19 10 4 4 таташов

X Общее число исследовании* штаммов - 136.

Таблица 4. Лекарственна« устойчивость тдамов лактобвцняд,

выделенных m килечного тр;кта долгекителсй /Йхезли.

Нсщек?р.чц:гя антибиотиков /кхгДчт/

Kanai'i^nH 25 53 100 2Ô0 300 с roe п тон my к геатаищин 25 50 100 Z00 300 5 10 15 20 тстрзцтш'Л 13 25 50 100 эригрогкцш 25 iO

Число устойчивых 18 Ï8 Г8 8 8 атаюгов 5 5 3 2 - II II II 0 - - - - m 1

Ч. от cáserc числа 73 *?8 35 35 эт8ш0в 24 24 13 8 . ' - 48 48 48 35 - _ - . - -

ж Сбщзе число исследованных втаумов - 23.

Таблица 5. Устойчивость к антибиотикам различных видов лактобацилл.

Вид Количество, Количество устойчивых штаммов

штаммов ' Кт50 БтЬО &я15 . То 50

*1,.£са.Т1еп,!;ит 53 АЬ 35 32 -40

Ъ.Ьис)гпег± 24 21 18 13 14

Ъ. ^с1<ЗорЫ.1л13 30 20 16 7 20

10 10 8 10 . 5

9 9 7 9 Е>

£, с! © ХЬг ие ск±3. 3 2 _ 2 I

Ь.ип1иоХ1а 8 0 I 2 б

2 _: _ _ _

Ь.Ъгеу±з / I I I I I

- I I I I- —

I ^ _

I 4» _ _

3 3 * 2 •

3 2 _ 2

3 3 _ 3

Х.вр. 3 3 - 3 -

х Концентрация антибиотиков — мкг/кл.

2, Исследование распространения генетических детерминант ■ резистентности к антибиотикам среди лактобацилл.

Для исследования распространения генетических детерминант резистентности к антибиотикам у лактобацилл были Использованы зонды, содержащие различные гены резистентности, выделенные из плазмид грамотрицательных микроорганизмов /табл. 6/.

Аминорликозид-3'фосфотрансфераэ а I типа и С-тип ^детерминанты встречаются как среди грамотрицательных, так и среди грам-положительных микроорганизмов. В результате гибридизации колоний лактобацилл с указанными зондами установлено, что 14? исследованных штаммов содержат детерминанты антибиотикорезистентности, гомологичные детерминантам, широко распространенны» среди грамотрицательных бактерий. У 7 штаммов лантобацилл выявлена детерминанта резистентности - аминогликоэид-З'-фосфотрансфераэа I типа /арЫ!/, . аминогликоэид-3*-фосфотрансфераза II типа /арЬАИ / не обнаружен на. Выявлено 3 штамма лактобацилл,, содержащих детерминанту устойчивости аминогликозид- 3*'-фосфотрансфераэа / орЬС / и 3 штамма,

несущих гены №иногликозид-3' '-одекилтрансферазы / nodA /, у tirrnv-мов, устойчивых к тетрациклину, обнаружены tot-детерминанты С-ткпа /'I шторма/ и D-типа /& штаммов/.-

Таблица С. ТЬнстичеунке детерминанты резистентности к антибиотика», ksc пользованные для гибридизации с колониями лактобацилл.

Антибиотик

'Ген репис- Плазмида тептности

Зонд Размер

фрагмента /тпо/

Ссылка

стрептомицин uph С

иа-á А

канамицин

тетрациклин

oph ai

oph All

bet В tot С

IÍ3F1010 EcoIÍI-PvuI - '1,0 EÜ HlndlII 3,4

ТО iíindlII-Kpnl 0,5 P5UP2021 Pütl I,Ó

lié HinJIlI 4.8

'Eeoltl-Sull 0,7

Глосер, 1988 Tinmiis et ol., 1978

Lanka et al., 1983

Itasodler et

al., 1985

Timmio et ol., -

1978

Млниатис с co-авт., 1984

3. Исследование круга бактериИ-хозяев плвчмидм pBS195 , , выделенной из штамма L.pluntarum 195 . ^ ' ¡'^амм I.plonidrum 195, выделенный из пи"|нверительного тракта долгожителя Абхазии, отличается высокой устойчивостью к канамици— ну _ К)С/у) мкг/мя/ и стрептомицину* /Miflí г 500 мкг/мл/, обладает антагонистическими свойствами по. отношению к патогенной для ' человека микрофлоре и содержит несколько плозуид с мол.весом от. 4,4 до -IG тпо. ß результате трансформации клеток ¡ита^ма и.coll JMI09 тотальным препарате у плазм и дней Д1Ж, выделенной из г..р1гщ- " tfir4iaI9ñ, были получены трансформантн с частотой устойчи-

вые-к канамицину. В их клетках обнаружена плазмидная ЛИК с мол. весом 4,4 тпо /рис Л/ и обозначена pbs 195. М1К канпмицнна для трансформантов составляла 1000 мкг/мл.

At (К рВЗ 195", выделенная из трансформантов и.coli Jtó 109, была использована для трансформации других штаммов грамотрицательных и громположительных бактерий. Частота трансформации штампов Ж .coli . JU 109 и e.coli HB 101 составляла ГО МИК кенамицина для трансформантов была 1000 мкг/мл. Для штамма B.subtilis 168 частота

- - 13 -. Ч

трансформации был л нов1.юоко;1 - 10"^, и МЯК капп/ицина тшгле город гт.0 ниже - 15 мкг/мл. Шт ом мы " Р о ГЦ С МЯО О а .'1262 и 1Мш1;1<Ь ВС 2Г)0 транс форм про пол ись с частотой 10 % и НИК копам шина для 1ТизС игтаумов была 200 ичгр/мл.

С пслью вмяенвяия способности плазмид».; рвз 195 переноситься различный б-п тс т с рк и-хоз я е во путем мобилизации контиглт'ишь'ми плагшкдаии был поставлен ряд скрещипа;тий на нитроцеллюлознкх фильтрах и1 твердой питательной среде. Результаты экспериментов представлены в табл. 7.

Л. Физическое картирование плоз(/кдн рЮ 195 и идентификация некоторых продуктов ее экспрессии. ■

Проведено физическое картирование плазмиды рВЗ 195. Обнаружены уникальные сайты для энцопуклеаз КсоП1 , ВагаЩ , КрШ , БсШ , Х)ю1 . ¡1а основании полученных; дашшх построена физическая карта ллаэмиды рВЗ 195 относительно Ь'сонЬсайта /рис.2/. В области ■ Вит!и -сайта обнаружен природни!! полилиикер , В районе от 2 до 3,7тио на плазм идо р во 195 не обнаружено сайтов уэиаоания для использоно! »4« рестриктаз.

/ . 2 . 3

Рис.1. Электрофорсррамма ДНК:

1. ДНК шшзмндн рШ 195, выделенной из Е,со11,ли109;

2. ДНК фага Я , 'обработанной рестриктаз ой щ.п<ЗШ ;

3. Плозмид'инй профиль штамма Ь.р14т(игии 195.

Таблица 7. Результаты скрещивания на нитроцелл®лозных фильтрах.

Донор Реципиент Мобилиаант Частота конъюгации

(рВ3195) В.аиЬПИаЧбС асЮ*"5

1>. р1а г^и гига195 (рВ31У5) - -

(рВ£3195) Ь.ХосЫз Ь'.ГаесаНз *

Ь. р 1 а г шп195 (рВ3195) Ь.со11 Н3101 ■ Е.ооН С600 (МЧ-Ч) -

Ь.р1впйлгиш195 СрШ5195) £.со11 НВ101 . - - -

Ь.рХагЛ аг ит19 £ (рВ3195) р, ае пдЕ!ПОа а 42о2 . ]£.со11 С600 . , (НР4-4) —

Ъ.р1епСагиш1У5 Ь.р1аг^агит1У5 (рВ3195> (рвэ195) р.аегицЗлоаа '(202 Р.риМйа ^ВЗЭЧ Е.ооН СбОО

Jj.plantorum.195 СрВ3195> Р.ри^ао В339Ч ■ - -

Е.со11 ЛДЮ9 (рВ3195) Е.со11 КВ101 К_.со11 Со 00 (Ш^-Т) 2ХЮ-4 .

Щ.соИ №109 СрВ3195) Р.рииао В£>25Э К.со11 0600 (КР4-4) ЗхЮ"4

Для определения типа_детерминант резистентности к канамицину и их локализации в составе плазм иды рВБ195 была проведена гибридизация фрагментов ДНКрВ5195 с ^Р-меченными фрагментами ДНК, содержащими гены арЬА1 и ерЬ АП /табл.6/. Гибридизация с этими детерминантами отсутствовала.

Поскольку плаэмида рвз195 способна реплицироваться в грвмпо-ложительных и грамотрицательных бактериях, представляло интерес изучение области репликации рВ5195 и ее совместимости с другими плазмидами.. Обнаружена совместимость с плазмидой кер 1010, являющейся типичным представителем группы 1псй и обладающей широким кругом хозяев. Однако с векторной плазмидой рис 19 плаэмида рЩ195 оказалась несовместимой. В результате гибридизации уста-

. . Рис.Я. Физическая карта плаэмиды рВЭ 195.

новлена гомология между ДНК рВЭ 195 и ДНК плазыиды рШ 19. Для уточнения областей гомологии Р-мечекныЙ Ога1-На«и фрагмент на ДНК рИС19, содержащий область ог1У * использовали в качестве зонда для блог-гибридизадии с ДНК рВЗ 195. В области от 1,7 до 3,5 тпо на физической карте плаэмиды рвэ 195 обнаружена гомология с данным фрагментом /рис.З/.

' Исследование локализации ВатШ-сайта плаэмиды рвз 195 относительно жизненно важных областей и детерминанты резистентности к канамицину путем обработки ДКК рБЗ 195 рестрихтаэсй ВашНХ , фрагментом Кленова ДКК-полимеразы I, последующего лигирования й трансформации с отбором клонов по канамицину» показало, что этот сайт лежит вне жизненно важных: областей и детерминанты устойчивости к канамицину. Это является основанием для использования Ваши- сайта в опытах по клонированию в случае употребления рВЗЯ95 в качестве вектора. Для клонирования был выбран ген , детерминирующий оксигеназну» активность и находящийся в составе плаэмиды рШ 314,

í..-" л" f.::-'-.

.....yr^

v.'.-.V' ' - 'i. ' >

Л

Рис.З.

да

о

сэ

Sv

A - 3 я о ктрофорс т mme кое разделе и tie рестрикций! mux Фрагментов ДНК:

I - Фагя а + HiiuiIIl; Z - jAKi 19 + Ibo II + ftrn I'

3 - pBS 1УЗ + Hind III + Gm;i I;

4 - püS 195 + Smel; ■ ■ '

5 - плазмидный профиль штамма L„plaut<iruniX9Cu

В - Радиоавтографа после гибридизации их с ^Р~мечоинмм lloo II - Den I фрагментом ДИК pUC 19.

36' — 29 ■в« ~

'S >t Ъ Z i

Рис.4. Ргдксапторракма после плектрофорезл b-cdo-ПМГ меченных

3 -метиoí шлем белков, синтояируодихся в мини-клетках ' .coli : - '

"I белки, детермииируомне плолмидой piv> 19!>-1;

£ - белки, детерминируемые плпзмидок j»iíG ч 3 - белки, детерминируемые плазм ид ой, рВГ, 195; Л - белки, детсpviv¡руемк е плазмидой рис 19; 5 - ;/лг.ср!шо боле.«. 4. . ' . ■ ■ ■....- .■■■*■'-

выделенной ht P.Dor-uKinoso . Цветная реакция Азлтый цвет колоний при обработке катсхолом/ облегчает отбор рекомбинантнкх клонов. Проведено клонирование фрагмента плазмидм ркс 314 размером 3,8 тпо, содержащего ген ïîahC . Однако, при проверке контролеЙ оказалось, что клоны, содержащие только плазмиду рвз 195, также давали цветную реакцию.с катехолок, что свидетельствует о наличии в составе плазыиды pes 195 генов, детерминирующих оксигеназную активность.

При клонировании фрагментов недогидролиза ДНК плазмиды p3sI95, полученных при обработке рестриктаэой Sow 1Ш, в составе вектора pUO 19, были получены варианты: рвз I95-I, в котором вся плазмвда pBS 195 вшита в рис 19 и делеционный вариант pBS 195-2. Спонтанная делеция в области Kind Ill-Pstí /0.6-1 тпо/ на плазмвде pDS 195 приводит к потере оксигеназной активности.

В системе мини-клеток E.coli Х925 показано наличие двух белковых продуктов с мол.весом 26 и 34 icßa , детерминируемых плазмидей pBS 195 /рис.4/. Qohsko, в области 26ы>ане исключено присутствие двух белковых продуктов. Анализ белков, детерминируемых делецион-ным вариантом плазмиды pes 195-2, в системе мини-клеток показал отсутствие белка в области 34м>а /рис.4/.

Гибридизация фрагментов ДНК плазмиды pbs 195 с ^Р-меченным фрагментом, содержащим ген №ЬС . выявила гомологию1 в области EcoH I— BomH I /0-1,6 тпо/ на плазмвде pBS 195.

5. Исследование гшазмидкого профиля штаммов лактобацилл, обладающих высокой устойчивостью к канамицину.

Изучена распространенность pBS 195-подобных репликонов среди лактобацилл. Колонии 50 штаммов, выделенных из различных природных субстратов и обладающих высокой устойчивостью к канамицину, были перенесены на нитроцеллюлозные фильтры и использованы для гибридизации с ДНК pBS 195. В результате гибридизации были отобраны штаммы, проявляющие различную степень гомологии с ДНК рВЗ 195. Эти штампы были проскринировоны на наличие плаэмид. Практически все они содержат плазмвды с различными мск.весами, что свидетельствует.' вероятно, о довольно широкой распространенности плаэмид, подобных pBS195.среди лактобацилл.

выводы.

1. Проведена оценка уровней устойчивости коллекции лактобацилл /159 штанное/, выделенньЬс иэ различных.экологических ниш, к аминогликоэидным антибиотикам, тетрациклину, эритромицину. Установлено, что большинство исследованных штаммов, выделенных от птиц /ТЭ^/ и человека устойчиво .к аминогликозидным антибиотикам. Среди представителей всех исследованных видов лактобацилл обнаружены устойчивые к антибиотикам штаммы.

2. Предложены критерии сценки устойчивости лактобацилл к ряду антибиотиков. К устойчийым отнесены те штаммы» для которых МЯК ' антибиотика составляла: канамииина и стрептомицина - 50 мкг/мл; гентамицина - 15 мкг/мл; тетрациклина - 50 ыкг/ул.

3. Установлено, что у устойчивых к антибиотикам штаммов лактобацилл резистентность контролируется генами,гомологичными генам, широко распространенным среди грамотрнцателькых бактерий.

4. Впервые в лактобациллах обнаружена плаэмида / P3SI95/ с широким кругом грамположительных и грамотрицательных бактерий-хозяев. Показано, что репликация плаэмиды Рвз 195 в граиотрицательных бактериях обеспечивается системами, гомологичными таковым на векторе pU0I9. -

5. Впервые в составе плаэмиды, выделенной из лактобацилл» обнаружены гены, детерминирующие оксигеназную активность.

6» Малые размеры /4,4 тпо/ плаэмиды pBS 1%, наличие уникальных сайтов рестрикции, широкий круг хозяев, включающий грамполежи-тедьиые и грамотркцательные микроорганизмы, хорошо экспресси-рувдийся маркер резистентности к канамицину, цветной маркер, делает перспективной плаэмнду pBSigS для использования в качестве вектора для клонирования. -

Список публикаций по теме диссертации.

1. Козлова Б,В., Пивоверенко Т.В., Аминов Р.И., Воронин А.М.

Плаэмида pBS 196 с широким кругом хозяев, выделенная из лактобацилл // Мол. генетика, микробиология и вирусология»; 1991^ №5,

с.26-29.

2. Козлова Е.В., Пнвоварвнко Т.В., Аминов Р.И., Малиновская И.М.,

Коваленко Н.К., Вороним А.Н. Легарстветшя устойчивость и плазмиди

лактобацилл // Т&эиеы док*. XII Всесоюзного совещания "Пяазмида",

1990 г., Нальчик.

3. Козлова Е.В., Пивоваренко Т.В., Аминов P.M. Резистентность к антибиотикам лактобацилл // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций", 1991 р., Москва. _

4. Козлова Е.В., Пивоварекко Т.В., Асинов Р.И., Суворова E.G., Воронин A.M. Отруктурно-фуhwj ион ал ьнмй анализ плазмиды pBSI95 с пги-роким кругом грамположительннк и грамотрицательных хозяев // Тезисы докл. Всесоюзной конференции "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии"» 1991» Самарканд.

5. Козлова Е.В.,Швоваренко Т.В., Малиновская Н.М., Коваленко Н.К., Аминов Р.И., Воронин А.М. Лекарственная устойчивость лактобацилл // Антибиотики и химиотерапия, 1992 г., Itö, с.31-35.

6. Boronin A.M., Eozlova E.V., Plvovareako T.V., Arainov H.I. Plasmid pB3195 with в broad lange of grampositive and gramnegative host Isolated fron Lactobacilli // 6th International Symposium on Genetic of Industrial Microorganisms, 1990, Strasbourg,

Зак. Ш Формат 60x04/16 Уч.-изд.л. 1,0

Подписано к печати 8.04.1992 г. Тираж 100

Полиграфический участок Института теоретической физики АН Украины