Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства лактобацилл и тест-системы для их идентификации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства лактобацилл и тест-системы для их идентификации"

1 1 9 я

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НИЖЕГОРОДСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 576.852.24-576.8.078.3!)

ЛИХАЧЕВА Алла Юрьевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛАКТОБАЦИЛЛ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ

03.00.07 — Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Нижний Новгород, 1992

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии.

Научный руководитель — доктор медицинских наук К. Я. Соколова.

Научный консультант — доктор медицинских наук, профессор В. М. Бондаренко.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А. Н. Маянскии;

кандидат медицинских наук С. И. Пылаева.

Ведущее учреждение — Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского.

Зашита диссертации состоится «_» _1992 г.

в_час._мин. на заседании Специализированного совета К 084.39.02

в Нижегородском государственном медицинском институте им. С. М. Кирова по адресу: 603600, Н. Новгород, пл. Минина, д. 10/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного медицинского института им. С. М. Кирова.

Автореферат разослан «_»_________1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

А. В. Леонов.

РОССИЙСКАЯ f~7;;---

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем»: Широкое распространение дисбаитв-риозов кшечника, внражавдееся прежде всего в угнетении лакто-и бифидофлоры, является следствием и отражением экологического неблагополучия внешней среди. Неблагоприятное влияние на микробную систему человека оказывает широкое использование антибиотиков в медицине и ветеринарии; загрязнение биосферы промышленными отходами, в том числе радиоактивными и химическими веществами; заболевания как инфекционного, так и неинфекционного характера; пребывание в экстремальных условиях; нерациональное питание; старение организма (И.Н.Бяохина, В.Г.ДОрофей-чук, 1979; Б.В.Пинегин, В.Н.Мальцев, В.М.Коршунов, 1984;

A.Я.Бесеяов, 1988; Н.Аманов, Ф.Ю.Гариб, Я.А.Умаров, IS89; Г.И.Гончарова, В.Г.Дорофейчуи, А.З.Смолянокая с соавт., 1989;

B. Н. Красного ловец, 1989; T.Miteuoka ,1988; A. van. Jurthetol.. 1989; M.Knobe et al. ,1989; D.Savaee ,1989; H.H.Lia'ko , 1989).

В связи с этил проблема конструирования и использования экологически безопасных биопрепаратов из представителей нормальной микрофлоры человека является в настоящее вреда чрезвычайно актуальной.

В качестве одного из основных действующих начал в производства сухих препаратов и продуктов лечебного питания как у нас в стране, так и за рубежом, широко используются представители рода lactotaciilus . По данным многих авторов (А.А.Ленц-нерД.ПДенцнер,1986; т.Р.Ьуопз, R.J.Fallon ,1986; F.Hm-bert ,1988; S.E.Gilliland ,1989) эффективность бактерийных препаратов определяется биологическими свойствами входящих в них штаммов микроорганизмов.

В налей стране при отборе и характеристике штадаов-нанди-

датов в эубиотики учитывают превде всего их технологичность, спектр и уровень антагонистической активности, что явно недостаточно (Е.И.Беляев,1388). Изучается антибиотикорезистент-ность лактобацилл (М.В.Тюрин,1989; М.В.Тюрин, Б.А.Шендеров, В.И.Панасвшсо,1989; Н.С.Гряанова, Н.А.Субботина, И.В.Белявская с соавт., 1990). Весьма скудны в отечественной литературе сведения о природе антагонистической активности, механизмах адгезивной и колонизирующей способности лактобацилл. Имеются лишь единичные работы о приштляемости в кишечнике и адгезивных свойствах лактобацилл, в том числе в смешанных популяциях (В.И.Бршхис, 1983; Л.А.Левков,1988; А.А.Лешдаер, А.А.Левков, Х.П.Лекцнер с соавт. ,1989; В.И.Брилис с соавт. ,1990; Н.К.Коваленко с соавт.,1990), Нет единого подхода к критериям отбора производственных штаммов.

Многообразие видов лактобацилл, разная их приспособленность к существованию в различных экологических нишах и ряд видовых биологических особенностей, придает проблеме надежной идентификации этих микроорганизмов особую актуальность. Отсутствие единой унифицированной схемы идентификации; дефицит реактивов, дифференциально-диагностических сред свидетельствуют о необходимости разработки стабильных коммерческих тест-систем для видовой идентификации лактобацилл.

Все вышесказанное определяет целесообразность комплексных исследований по изучению биологических свойств штаммов лактобацилл и конструированию эубиотиков с известным механизмом действия.

Работа выполнена в рамках научной тематики Нижегородского НИИЭМ по договору К 3-131-66 в соответствии с целевой программой научных исследований Ш РФ по проблеме "Микробная экология человека в норме и при патологии" на 1990-1995 гг.

Цель и задачи исследования. Целью рабг-ты являлось комплексное исследование свойств лактобацилл для отработки критериев отбора штаммов, перспективных для изготовлеюш препара-тов-зубиотиков и конструирование стабильных тест-систем для энзимовдетифинащп! лактобацшш.

В соответствии с целью били поставлены следующие задачи:

1. Создать коллекций итаглмов рода ЬасгоЪасШиа различного происхождения.

2. Отработать способы ускоренной видовой идентификации лактобацшш с помощью рационального набора биохимических тестов.

3. Сконструировать тост-слстомы, позволяющие унифицировать процесс видового определения лактобацилл в лабораториях разного уровня.

4. Изучить адгезивные свойства лактобацилл на рапных участках пищеварительного тракта.

5. Определить антагонистическую активность лактобацилл к наиболее часто встречающимся возбудителям инфекционных заболеваний.

6. Детально охарактеризовать штаты лактобацилл, перспективный в качества производственных.

Научная новизна исследования.

Впервые в модельных опытах на различных видах эпителиальных клеток кишечника крыс определены основные механизмы адгезивной активности лактобацилл, выявлены рецепторы для адгези-нов лактобацилл на эпителиоцитах. Установлена роль фибронекти-на п муцина в процессе колонизации этими бактериями желудочно-кгашзчного тракта.

Впервые на основании детального изучения биологических свойств лактобпцпдл расширены критерии для отбора произведет-

ванно-торспективных штаммов за счет кошшэк оного определения на только антагонистической активности к наиболее часто встречающимся возбудителям инфекционных заболеваний, спектра и уровня лекарственной устойчивости, но и изучения адгезивной активности штаммов бактерий к фибронектину, муцину, колоноцитам, определения их бактериоциногешюсти и устрйчивости к собственным бактериодашам.

По рекомендуемому комплексу свойств охарактеризованы штаммы лактобацилл, входящие в состав бактерийных препаратов, проходящее в настоящее время государственные испытания в комитете МИШ, Доказана нецелесообразность совмещения трех изучен-

<1

ных штаммов в одном препарате - эубиотике. Селекционирован оригинальный штамм Ь.р1ап4агат 30, перспективный в качестве производственного.

Впервые сконструировано два типа оригинальных отечественных биохимических тест-систем, позволяющих осуществлять видовую идентификацию бактерий рода ХасгоЪасШиз . Для облегчения интерпретации результатов биохимического тестирования разработано программное обеспечение дая компьютера и каталог кодов к коммерческим тест-системам СИБ-1 и ПБДИ.

Практическая целость работы

I. Составлена и представлена на утверждение в комитет медицинских иммунобиологических препаратов нормативно-техническая документация:

Изменение Й I к ФС 42-342ВС-90 "Системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов";

Проект инструкции по применению систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов рода ЬасПоЪасШив;

Дополнения Л 3 к регламенту производства систем индикаторных бумажное (СИБ) № 114-78.

2. Подготовлены экспериментальные серии ПЕДД для лаборатории испытаний.

3, Дана детальная биологическая я генетическая характеристика штаммов: 1.рагаеаяе1 йиЪзр.рм-асаее! ИСК 37, Ь.р1вп-гагит ГЙСК 38, I.. {вгяепгия ГИСК 39, рекомендованных для производства бактерийных препаратов.

Ра защиту выносятся сделушиэ положения:

1. Принципы конструирования биохимических тест-систем

и составление каталога кодов к идентификационным тест-системам СИБ-Л и ПБДЛ, позволивших стандартизировать и ускорить процесс впдовоА идентификации лактобашши

2. Критерии отбора производственно-перспоктивгшх штаммов, включающие оценку адгезивно», колонизирующей и конкурентно-антагонистической активности.

Апробация диссертации

Основные положения работы доложен» на конференции молодых ученых Горьковского медицинского института "Актуальные вопросы медицины" (Горьки,1, 1990), на заседании эпидемиологического Всесоюзного семинара "Факторы пагогекности бактерий в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи Российской АМН (Москэа, 1990), на заседании эпидемиологического семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии й микробиологии (Нижний Новгород, 1990,1992), на заседании Ученого совета Нижегородского НИИЗМ, 1992).

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, 2 приняты в печать.

- б -

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и приложении!. Работа содержит 199 страниц машинописного текста, 32 таблицы, 4 рисунка. Список литературы включает 230 источника, в то» числе 159 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛА И'МЕТОДЫ ИССЛВД0ВА1ВД

Бактериальные штаммы. Объектом исследования являлись 78 штаммов лактобацилл 14 видов различного происхождения, в том числе эталонные и музейные - 43, свеневыделеняые из организма 'человека и внешне¡/' среды - 30. Кроме них в опыты были взяты 2 штамма - I.plantarurn ШАЗ и Ь. fermsntum 90ТС-4, используемые в производстве,лактойактерина, и 3 штампа -l.paracasei sabep.persicaspi ГИСК 3?, l.plantarum ГИСК 38, L. Eennentuia ГИСК 39 из коллекции Нижегородского ИИ, Московского НШ медико-биологических проблем и Тартуского университета, входящие в состав бактерийных препаратов, проходящих в настоящее время государственные испытания в комитете МИВП (авторские свидетельства соответственно №1517354, 1517353 и 1517352 дата приоритета 27.07.87)-

В качестве'индикаторных шташов для определения антагонистической -активности лактобацилл было исследовано 12 эталонных музейшх культур энтеробактерий: б.coil 0138:К88, В. coll 09:К9Э, E.coli 3, E.coli В, S.dublin .,1976; S,typhimuriiim 1433, S,enter!tldis 2269, K.pneumoniae 812, K.pneumoniae 12, K.p/ieumoniae 39, y.suigaiis 135, P.raixa-bills 26, обладающих комплексом факторов натогшшост -

энтеротоксинами,- гемолизинами и адгезинамй (И.Н.Блохина, В.М.Лавровская, Н.Ф.Бруснигина с соавт., 1990), а также 7 штаммов условно-патогенных бактерий, выделенных от больных с острыми кишечными инфекциями: A.faecalis 1434, 3.aureus 1435, в.аигеиз 1437, S.aureua 1433, S.attreua 1438, ^-aeruginosa 1455, P.aetuginosa 1462.

В опытах совместного культивирования были Использованы полученные наш резистентные н антибиотикам мутанты потенци-алыгопроизводствэннж штатов: b.paracasei subgp.paracasel 37, устойчивый н стрептомицину (1000 мкг/мл), L.iemen turn 39, устойчивый л рифампицину (400 мхг/мл).

Среды. В работе использовали модифицированные питательные среда M.RogosA и S.Sharps , ацетатный агар (АДАМ) (А.А.Ленцнер, 1973). Обнаружение штаммов лактобацилл, продуцирующих перекись водорода, проводили на среде МРС-4, содержащей допол1штельно 1% лактозы, 1% растворимого крахмала и 0,04/5 йодистого калия.

Выделение чистой культур». Проводили дозированный посев на пластинчатые селективные спады 1ЛРС-4 и ацетатный агар из трех диагностически значимых разведений исходного материала. Исходным материалом для исследований являлись фекалии, слюна и влагалищное отделяемое здоровых ладей.

Изучение биохимических свойств проводили с помощью расширенного набора д1гфференциально-<51Юхи?,1ичдских тестов, содержащих арабинозу, целлобиозу, эскулин, фруктозу, галактозу, глзокозу, лактозу, мальтозу, машшт, маннозу, мелецитозу, мэли-биозу, раглнозу, салицин, сорбит, сахарозу, трегалозу, ксилозу, а такие по продукции газа при ферментация глшоэы и способности расти при 15°0. При установлении видовой принадлежности штаммоп лактобацилл использовали классические био-

химические тести и разработанные'нами тест-системы - иШ-Л и ПБДД.

Исследование динамики роста проводили методом подсчета колониеобразувдих клеток в популяции.

Лйзошыную активность определяли методом агаровых пластинок (А.А.Ленцнер, Х.П.Ленцнер, М.А.Тоом, 1975)..

Продукцию перекиси водорода оценивали по цветной реакции после обработки поверхности агара'с выросшими колониями лакто-бацилл 10^-ной серной кислотой.

Изучение антагонистической активности проводили методом отсроченного антагонизма.

Определение адгезивных свойств осуществляли к изолированным эпителиальным клеткам кишечника крыс ин витро (Е.М.Горская, И.М.Манохина, А.В.Горелов с соавт., 1989), к эпителию слизистой оболочки эксплантатов кишечника крыс (В.П.&алко-Титаренко, В.М.Бондаренко, А.В.Григорьев с соавт.,1981), к иммобилизиро-ванным субстратам (фибронектйну, муцину) в •реакции бактерио-сорбции (Б.Л.Николаев, М.У.Дусмагамбетов, М.М.Дыхно, 1990). Выбор моделей был обусловлен задачами работы по комплексному изучению механизмов адгезии лактобацилл.

Определение уровней устойчивости к тетрациклину, ампициллину, гентамищшу, каламицину, хлораыфениколу, налидиксовой кислоте, рифампициау, сульфаниламидам проводили методом реплик на плотной питательной среде (МРС-5), содержащей серии двукратных равведений препаратов.

Выделение ДНК проводили методом М.Ыандель и Дк.Марвдур (1970).

Определение» куклеотидного состава ШЖ (суша гуанина и цитозина в молъ/0 осуществляли модифицированным методом тепловой денатурации (Г.Ф.Леванова, 1970). Содержании 1'Ц-пар в ис-

следуемой ДНК рассчитывали по формуле М.Манделл и Дя.Мармура (1970).

При изучении гомологии ДНК использовали модификацию бе-зизотопного спектрофотомэтрического метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК Дж.Де Лея (Г.Ф.Яеванова, Е.В.Носова, В.Н.Сорокина с соавт., 1984).

Генетические методы исследования выполняли совместно с сотрудниками лаборатории геносистематпки бактерий Нгасегородско-го НИИЭЫ (руководитель - докт. биол. наук Г.Ф Леваяова).

Выделение мутантов. устойчивых к аяуибиогикам. проводили путем юс солекции на питательных средах, содержащих определенные концентрации антибиотиков (Дя.Миллер, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЭДОЕАНКЯ

При решении задачи по отработка способа ускоренной идентификации лактобацилл были отобраны диагностически значимые тесты, сконструированы субстратные среды, подобрана реакциошая среда и посевная доза бактерии, разработан метод постановки биохимических тестов в миврообъемох.

Учитывая воспроизводимость, простоту постановки и учета теста, доступность необходимых реактивов, было установлено, что дач идентификации лактобацилл целесообразно использовать 17 тестов: салицин, цоллобиозу, мелибиозу, маннозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, машшт, зокулин, галактозу, мэлецитозу, арабинозу, сорбит, мальтозу, ксилозу, рамнозу, фруктозу. Кроме того, в состав тостов включили глюкозу, как лолояштельный контроль, подтверждающий принадлежность изучаемого микроорганизма к роду ЬасгоЪасШиз.

Аналогично с СИВ для идентификации других групп микроорганизмов (вибрионов, энтэробактериЗ, стафилококков) в качества

носителя использовали хроматографичеснув бумагу, а для плас- • тинчатой системы - планшет для иммунологических реакций.

При отработке соотношений компонентов субстратных сред для тест-систем было испытано несколько вариантов композиций с разным содержанием ингредиентов. Наиболее оптимальным оказалось содержание в диске СИБ 10,0±1,0 мг утлевода; 5,0+1,0 мг многоатомного спирта; 1,0+рД мг аскулина и 0,5+0,1 мг лимоннокислого железа, а в луике панели - 2,4 мг углевода шш многоатомного спирта; 0,24 мг эсьулина и 0,12 мг лимоннокислого железа.

Учитывая потребность яактобацилл в факторах роста была проведена специальная работа по подбору реакционной среда. Наилучшие результаты были получены при использовании модификации среды ЫРС-3 без агара, о индикатором, рН среды 7,0+0,1, получившей название - среда СШЗ-Д. .

Стремление упростить, стандартизировать и ускорить процесс видовой идентификации дактобацюхл привело к созданию двух тиров оригинальных отечественных биохимических тест-систем -СИБ-Л и ПБДЯ.

Для установления надежности и специфичности сконструированных нами тест-систем вся работа проводилась в параллельных опытах на дифференциально-диагностических средах ИРС-З. Было показано полное совпадение результатов при изучении биохимических признаков с помощью разработанных нами тест-систем -СйБ-Л, 1ЩРи классическим методом, В опытах с 22 эталонными штаммами лактобациял 10 видов и.З подввдов бала подтверждена их видовая принадлежность, что также доказывает надежность работы тест-систем.

Использование тест-систем значительно облегчаот работу, освобождает от приготовления в кустарных условиях питательных

сред и дозволяет сократить время затраченное на идентификацию на II суток.

Форма выпуска СИБ-Л в вида отдельных дисков допускает возможность повторения выполнения отдельных тестов, постановка дополнительных тестов (рост При 15°С, утилизации глюкозы с образованием газа) и свободное маневрирование ими в ходе анализа, но трудоемкость работн микробиологов использование СИБ-Л уменьшает незначительно.

Поэтому большие преимущества имеет планшетная тест-система, которая требует от бактериолога лишь инокуляции исследуемой культуры. Однако 96 луночный планшет предназначен для од-но!яоментиогр изучения В итамтов, поэтому при работе требуется большая сосредоточенность во л'збеяание неверного закаливания микробной Еэвеси изучаемой культуры в близко расположенные лунки, предназначенные для другого штамма. Кроме, того, тесты расположены в двух планшетах. Использование ЛВДЯ исключает возможность постановки указанных вйше дополнительных тестов.

Изначальная вариабельность признаков, разнообразная ферментативная активность усложняют процесс видового определения представителей рода ЬасЮЬасШив.

С целью облегчения интерпретации результатов биохишческо-го тестирования, к коммерческий идентификационным тест-систе-чам СИБ-Л и ЩЩ с помощью ЭВМ был разработан каталог цифровых ходов. При составлении цифрового кода была использована октальная система кодирования. Всего было получено 418 вариантов кодовых чисел. Информация в каталоге кодов представлена в четырех графах: первая графа - кодовое число микроорганизмов, вторая - видовое название, третья - абсолютная вероятность видовой идентификации, четвертая (при совпадении кодовых чисел) -относительная вероятность видовой идентификации. Коды в каталоге кодов расположены в порядке возрастания их числовых

значений.

Каталог кодов был апробирован на 48 музейных штаммах лак-тобацилл с известным таксономическим положением и на 30 свеже-выделеншх культурах. Биохимические свойства указанных штаммов были изучены с помощью СИБ-Л и ПВДД. Результаты определенш. видовой принадлежности лактобащош с помощью разработанного каталога кодов совпали с паспортными данными у 47 штаммов из 48. Штамм 37 ГИОК, описанный авторама как Ь.рагасаве! виЬер. рагасазв! , бил вдентифицирован нами как Ь.р1ап1агит.

На основании комплекса данных о нуклеотидном составе ДНК, степени гомологии ДНК-ДНК.^фенотипических признаках провели уточнение таксономического положения штамма 37 как 1.р1ап*агиш.

В целях дальнейшего совершенствования этапа интерпретации результатов биохимического тестирования лактобацшы и создания автоматизированного рабочего места микробиолога, было разработано программное обеспечение для 1Ш - совместимых компьютеров класса РСДТ АТ зарубежного и советского производства.

Программа содержит базу данных, включающую описание 48 видов и нескольких подвидов рода 1аси>ЪасШ.из по 18 биохимическим признакам, входящим в состав тест-систем СИБ-Л и ПВД1. Кроме того, в памяти программы хранятся данные по дополнительным тестам, которые в каждом конкретном,случае выбирает и подсказывает ЭВМ. Программа позволяет вычислить абсолютную и относительную вероятность принадлежности изучаемого штамма к тому или иному виду.

Совпадение результатов определения видовой принадлежности лактобацилл с использованием компьютера с программным обеспечением и каталога кодов составило 100$.

Применение компьютера с программным обеспечегаюм или каталога цифровых кодов ушфицирует и ускоряет оценку результатов

биохш:яеского тестирования лактобацшш. При этом оценка

получении* данных становится в определенной степени независимой от опыта и уровня профессиональной подготовки исследователя.

Совершенствование видовой идентификации лактобацилл, иь ряду с задачами таксономического плана, имеет определенное практическое значение для характеристики пейзажа лактобацилл изучаемых объектов (различных биотопов человека, животных, пищевых образцов и т.д.), а также для усовершенствования пре-паратов-эубиотиков путем подбора новых производственных штаммов.

При отборе и характеристике штаммов - кандидатов в эубио-тики представлялось целесообразным проведение комплексных исследований по изучению биологических свойств штаммов лактоба-цилл, определяющих колонизационную резистентность: антагонистической активности, адгезивных и колонизирующих свойств.

Результаты проведенных исследований показали, что лакто-бациллы обладают выраженной антагонистической активностью в отношении наиболее часто встречающихся возбудителей инфекционных заболеваний человека: сальмонелл, энтеропатогевных штаммов эшерихий, протеев, клебсиелл, стафилококков, синегнойной палочки. Антагонистические свойства были присущи всем изученным штаммам лактобацилл принадлежащих к 9 видам. Наиболее выражена эта активность "была у представителей видов ь. рШ^агит и 1*.ТеппепЪ\т . Было установлено, что антимикробная активность всех штаммов лактобацилл связана с выработкой кислот, накапли-ваицихся в 1,5$ агаровой среде МРС-5 в процессе культивирования лактобацилл и оказывающих неспецифическое ингибирующее действие на культуры микроорганизмов таксоиомически далеких лактобациллам родов. Результаты, полученные наш согласуются о дашшми ряда других авторов (П.В. Гирцн, Б. А.Шен-

- 14 -

деров, Н.Г.Рахимова с соавт., 1989; H.Hin-Chung, C.Ya-Lel » 1968; Y.Hechard, M.DherbemieB, Y.Cenatiempo et al. , 1990; J.A.Reinheimer, It.R.Demkov, K.C.Canaiotl , 1990; R.K.A.Tf.

Mulder ,1991). Из исследованных шгашов лактобацилл, выделенных из пищеварительного тракта человека, только 26,9$ культур продуцировали лизоцшл и лишь I шташ - перекись водорода. Связи между антимикробной активностью лактобацилл и наличием продукцией ими лизоцима и перекиси водорода установлено не было. Однако у некоторых штаммов лактобацилл антагонистические свойства были обусловлены не только образованием органических кислот, но и продукцией других антибиотических субстанций, прежде всего бактериоцинов.

Производственные штаммы лактобацилл - Ь.plantarua ERA-3 и l.feraentum 90ТС-4 оказались бактериоциногенными а были умеренно-устойчивы к действии собственных бактериоцинов.

Для изучения адгезивных свойств лактобацилл, путем случайной выборки, было отобрано 27 штаммов лактобацилл 7 видов, показавших высокую' антагонистическую активность в отношения ряда патогенных и условно-патогснных бактерий. В целях выявления рецепторов адгезии на отдельных участках пищеварительного тракта были выбраны 3 экспериментальные модели исследования.

Были обнаружены штамловые колебания адгезивности лактобацилл одного вида при оценке юс адгезии к' антероцитам и к кояоно- . . цитам. Наиболее адгезивными, с высокой степенью адгезивной активности к колоноцитам, оказались штаммы x.pxantarum 30, L.paracaeei eubep.paraeaeei ГИСК 37, iplantarum ШСК 38. По отношении к эштельальным клеткам тонкой кишки только 3 штамма ( l.picntarum 30, l.plentaTum 296, L.Tjrevip 5) обладали средней адгезивной активностью, другие исследованные штаммы лактобацилл - низкой адгезией,

- 15 -

В результате сравнительного изучения адгезивности лактобацилл к различным типам эпителиальных клеток тонкой и толстой киши было обнаружено, что большинство штаммов тлеют более высокую адгезию к нолоноцитам, чем к знтероцитам. Это свидетельствует о наличии большого количества рецепторов к адгезинам лактобацилл на колоноцитах по сравнении с энтероци-тами.

Разницы не установили в прикреплении лактобацилл к эпителию пейероБых бляшек и рядом расположенных зон тонкой киши.

При изучении влияния изменения на адгезивный процесс лактобацилл выявили, что при снижении значения р!1 среды о ?,2± 0,1 до рИ 5,5+0,1 адгезия бактерий к энтероцитам пейерових бляшек или достоверно повышается или имеет тенденцию к возрастанию.

Результаты исследований показали, что выделение ланто-бацилламн органических кислот в кишечнике служит одним из способов поддержания нормального микробиоценоза (антагонизм других бактерий) и вместе с тем, возможно, оказывается фактором, благоприятствующим прилипанию молочнокисл бактерий.

Исследования адгезивной активности лактобацилл к иммоби-лизированному на пластина фибронектину показали, что с фибро-нэктипом связывалось 90,9?« культур; из них все изученные итам-мы Ь.р1апгагит , L.feгп!ex^tют ( Ь. рагалазе! виЬзр. рагасааеА. Полученные данные свидетельствуют о роли фибронектина как рецептора для адгезинов лактобацилл на эукариотических клетках. Учитывая присутствие фибронектина на поверхности эпителиальных клеток, можно предположить, что фибролектиносвязывающая активность имеет важное значение в обослечении колонизации лактобацшиами желудочно-кишечного тракта.

Установили разную адгезивную активность лактобацилл к му-

- 16 -

цину: 16 штаммов лактобацилл относились к низкоздгаз ивным, 12 штаммов - к среднэадгезивным и только 4 штамма - к выооко-адгезивным.

При сравнительном анализе адсорбции лактобацилл на различит биологических субстратах не установили корреляции между адгезивной активностью штаммов лактобацилл к муцину и адгезией их к фибронектину. Обнаружили два штамма лактобацилл ( Ь.р1в1г1агив1 38 и Ь. р1ап1агит 242), тлеющих высокую степень связывания и с фибронектшюм и с муцином. Средней адгезивно-стью к обоим биологическим субстратам обладали 6 штаммов, а низкой - 2.

Эффективность бактерийных препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в состав препарата. Поэтому представлялось интересным конструирование комплексного препарата из разных штаммов лактобацилл. Для создания ассоциированного препарата было отобрано три штамма: 1.рагас&ве1 зиЬар.рагасаее1 ГИСК 37, Ь.рХаг^агит П1СК 38, Ii.fennent.um ГИСК 39, поскольку все они входят в состав бактерийных препаратов, проходящих в настоящее время государственные испытания в комитете МЖП. Эти штш.гли являлись бакте-риоциногеннши, были устойчивы к действию бактериоцшшв друг друга и собственных. Все три штамма обладали высокой антагонистической активностью к широкому кругу патогенных и условно-патогенных бактерий. По степени адгезии к эпителиальным клеткам толстой кишки штаммы х.рагасаве1 зо.Ъзр.рагасаее1 ГИСК 37 и 1.р1а1гЬагит ГИСК 38 относились к высокоадгезивным, а ЬЛегшев-Ьша ГИСК 39 - к среднеадгезйвшм. Етамм Ь.р1ап1агиш ГИСК 38 имел высокую, а Ь.рагасаее! ЕиЪзр.рагасаае! ГИСК 37 - среднюю степень связывания и с фцбронектином и с муцином. Штамм I. {<згтеп1ит ГИСК 39 обладал высокой адгезией к фибронектину и средней - к муцину. При решении задачи

- 17 -

о совместимости разных штаммов лактобацилл в комплексном препарата, было проведено изучение биологических свойств смеси трех отобранных штаммов.

В результате сравнительного изучения' адгезивности штаммов лактобацилл Ь.рагасазе1 аиЪвр.рагасаае! ГИСК 37, Ь.рЗап-taгшa ИСК 38, еггеептв ГИСК 39 и их смеси н различным типам эпителиальных клеток тонкой и толстой киши, а такяэ к эпителию слизистой эксплантатов кишечника крыс било обнаружено, что адгезивная активность смеси дактобацилл находится на уровне адгезивности одного Из трех штаммов - ь.рагасаве! гцЪзр.рагасаге! ГИСК 37, обладающего наибольшей прилипающей способностью. Сравнение кривых роста отдельных шташов лактобацилл и их омеси выявило их взаимное отрицательное влияние. Данные экспериментов по совместному культивированию отобранных штаммов дактобацилл свидетельствуют о нецелесообразности совмещения в одном препарате-эубиотике укааанных шташов дактобацилл. Кроме того, у шташов не выявили каких-либо существенных отличий, позволяющих повысить эффективность препарата-эубиотика.

Были определены уровни и изучены спектры лекарственной уотойчивости лактобацилл. Все штаммы дактобацилл были усто!-чивы я лаладинсовой кислоте, гентамицину, сульфаниламидам. К тетрациклину были резистентно 92,3$ культур. Высокой активностью в отношении изучаемых микроорганизмов обладали канамицин, ампициллин, рифампицин, хлорамфеникол. Анализ уровней лекарственной устойчивости лактобацилл показал, Что минимальные подавляющие концентрации (ШК) налидиксовой кислоты и сульфаниламидов являются высокими - более 500 мкг/мл и более 12800 мкг/мл соответственно.' ШК тетрациклина я гентамицина являлись-невысокими и колэбались от 12,5 до Я)'мкг/мл. Исклю- ■

чение составил штамм t.breviз I, для которого ШК тетрациклина - 200 мкг/ия.

Таким образом, комплексные исследования биологических свойств лактобацилл показали, что штаммы ь.рШпгагит 30, Ь.рагасаэ«! виЪзр.рагасаве1 П1СК 37, Х..р1ап1агиго. ГИСЖ 38, обладают большей активностью по сравнению с производственными штаммами - Х.рйаМагит 8ЯА-3- и ЬЛегте^ии 90ТС-4. Указанные штаммы являлись бактериоциногенныш и были устойчивы к собственным бактериоцинам; Штамм 1.р1£ипагит 30 характеризовался высокой адгезивной активностью к колоноцитам, средней - к он-тероцитам и фибронектину, низкой - к муцину. Штамм Ь.р1апга-гиш ГИСК 38 имел высокую степень прикрепления к колоноцитам, фибронектину и муцину. Втачм Ь.рагасазз! заЪзр.рагасаве! ГИСЖ 37 обладал высокой адгезией к эпителиальным клеткам толстой кишки, к фибронектину и средней - к муцину. Производственные итаммы лактобацилл - Ь.рааг^агит бИА-З И 1,. ? егпеп1гит 001(3-4 была умеренно устойчивы к действию собственных бакге-риоцинов; обладали средней степенью прикрепления к колоноцитам и фибронектину, низкой - к энтероцмтам и к муцину. Штаммы 1..р1£т^агша 30, 1.рагасаве1 аиЪвр.рагасаве! ГИСК 37, I.. р1агЛагит ГИСК 38 являются наиболее перспективными для создания препаратов и продуктов лечебного питания, нормализующих микрофлору кишечника.

Результаты исследований показали, что адгезивная способность лактобацилл н различным типам эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника, к фибронектину и муцину является важным свойством их биологической активности. Таким образом, следует считать необходимым расширить характеристики лактобацилл при отборе производственных штаммов за счет скрининговых исследований адгезивных свойств к фибронектину, а па послед-

- 19 -

них этапах - к муцину и к колоноцитам, а также изучение их бактериоциногенности и устойчивости к действию собственных бактариоцинов. При создании поликошонентных препаратов рекомендуется сравнительное изучение биологических свойств (скорости роста, адгезивной, антагонистической активности) штаммов и их смеси,

выводи

1. Разработан метод ускоренной биохимической идентификации лактобацилл до вида, апробированный на колленции эталонных и свежевнделешшх культур.

2. На основе особенностей метаболизма бактерий рода 1л.<^оЪас111дз внесены изменения в оригинальную, экономичную технологию изготовления двух типов тест-систем: систем индикаторных бумажных "СИВ" и.пластины биохимической дифференцирующей "ПБД",

3. С помощью,ЭВМ составлено программное обеспечение для компьютера и каталог кодов к разработанным тест-оистемам ПВДГ и СИБ-Я.

4. На основе комплексных наследована! биологических свойств обширной коллекций производственных, музейных, све-жевыделешшх из организма человека штаммов лактобацилл, отобран и рекомендован в качестве перспективно-производственного штамм Ь.р1ап1агаш 30, обладающий выраженной антагонистической .адгезивной и колонизирующей активностью.

5. Выявлена внутриродовая антагонистическая активность культур Ь.рвгасазе! аиЬвр. рагасаве1 ГИСК 37, Ь.ргалиапап ГИСК 38 и 1|.£еггаепгит ЛЮК 39, свидетельствую^»! о шциле» сообразности совмещения в о,ином препарате--эубпотаке указан-

- 20 -

ных штаммов лактобацилл.

6. Установлено, что штаммы лактобацилл различного происхождения имеют одинаковые спектры и уровни лекарственной устойчивости.

7. Показана возможность одновременного применения бактерийных препаратов, содержащих лакгобащшш, с сульфаниламидами, налпдиксовой кислотой, гентамицином, тетрациклином и нецелосообразность их совмещения о канамицшгом, ампицшшшом, ряфамшщином, хлорамфениколом.

3. На основе детального изучения биологических свойств лактобацилл разработаны новые научно обоснованные критерии, включающие оценку адгезивной, колонизирующей и конкурентно-антагонистической активности штаммов лактобацилл, позволяющие отбирать наиболее перспективные штаммы для производства препаратов-зубиотиков.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лихачева A.D., Горская Е.М., Соколова К.Я. Адгезия лактобацилл к различным типам эпителнпльшк клеток слизистой оболочки кишечника // Медицинские аспекты микробной экологии. - М.,1991.- С.47-52.

2. Соколова К.Я., Сильванэва H.H., Якимычева S.A., Доро-фейчух Б.Г., Гончарова Г.И., Лихачева A.D. Принципы разработки различных форм продуктов лечебного питания для нормализации микрофлоры кишечника// Медицинские аспекты микробной экологии.- М. ,1991.- С.160-169.

3. Лихачева A.D., Горская Е.М. Специфическая активность лактобацилл при совместном культивировании нескольких штам-

mob// Hobos в практике лабораторных исследований инфекционных заболеваний. - Н.Новгород, 1991.- С.33-37.

4. Горская Е.М., Лизько H.H., Денцнер A.A., Бовдарен-ко В.М., Соколова К.Я., Лихачева A.D. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл перспективна в качестве эубио-тиков '// 3. микробиол,- 1992.- Л 3.- С.17-20.