Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиота кишечника коренного жителя Центрального федерального округа Российской Федерации как основа для создания региональных пробиотических препаратов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиота кишечника коренного жителя Центрального федерального округа Российской Федерации как основа для создания региональных пробиотических препаратов"

На правах рукописи

БЕЛЯЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

МИКРОБИОТА КИШЕЧНИКА КОРЕННОГО ЖИТЕЛЯ ЦЕНТРАЛЬНОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.02.03 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 *» АВГ 2014

005551765

Москва — 2014

005551765

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Червинец Юлия Вячеславовна

Официальные оппоненты:

Быков Анатолий Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Блинкова Лариса Петровна, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией микробиологических питательных сред Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 2- » (ЖТ^О |12014 года в \0 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и на сайте http://www.gabrich.ra/.

Автореферат разослан « Ч » 2014 г.

Ученый секретарь /?

диссертационного совета^

доктор медицинских нау^-^ Борисова Ольга Юрьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Микроб йота кишечника человека представлена более 1014 микроорганизмов, активно участвующих в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса и др.). Последние научные данные указывают на специфичность в составе кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения (наличие различных энтеротипов) (Aramugan М., 2011). Огромное число микроорганизмов в кишечнике пока не позволяет провести их полный анализ. Существуют различные подходы, позволяющие охарактеризовать отдельные элементы микробиоты. Предлагаемый в данной работе анализ свойств бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium из кишечной микробиоты здоровых жителей Центрального федерального округа России позволит разработать новые подходы и оценить региональную специфичность состава этих компонентов микробиоты. Данные могут быть использованы для разработки научной основы создания пробио-тических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины.

Симбиотическая микрофлора людей, проживающих в регионах с разными климатическими условиями, бытовыми традициями населения, рационами питания, не одинакова, поскольку биоценозы имеют выраженный индивидуальный характер и заметно отличаются даже у индивидуумов одного региона. Еще более значительные различия отмечаются в микробной экологии окружающей среды, особенности которой в значительной степени отражаются на составе транзитор-ного компонента эндогенных микробных систем населения. Поэтому следует принимать во внимание тесную взаимосвязь между индигенной микрофлорой человека и экзогенным микробным миром, поскольку собственная микроб йота человека является частицей биосферного микробного звена, а одной из важных функций эндогенной микроэкологической системы является поддержание гармоничных взаимоотношений человека с микробным сообществом окружающей среды. Между аутофлорой людей и экзогенным микроценозом региона эволю-ционно сформировались определенные компромиссные отношения, которые позволяют предупредить агрессивное воздействие на организм человека экзогенных потенциальных патогенов (Широбоков В. П., 2008).

Адаптация организма человека к экзогенному микроценозу региона прослеживается в онтогенезе. Так, у новорожденных начинает активно развиваться эффективный иммунный ответ в отношении экзогенной микрофлоры, специфичной для конкретного региона. Поэтому наиболее высокую эффективность обычно проявляют пробиотики, основу которых составляют «местные» штаммы микроорганизмов.

Повышенное внимание к пробиотическим препаратам в настоящее время вызвано ростом контингента лиц, имеющих микроэкологические нарушения и

требующих коррекции собственной микрофлоры (Алешкин А. В., 2011). Наиболее эффективными и физиологичными средствами коррекционного воздействия на микрофлору при дисбактериозах являются биопрепараты с живыми культурами лактобацилл и бифидобактерий. Создание и широкое внедрение в медицину высококачественных пробиотиков на основе региональных биовариантов нормальной микрофлоры является в настоящее время актуальной и важной задачей (Янковский Д. С., 2008).

Степень разработанности темы исследования

Глобальные национальные и международные проекты сегодня активно занимаются изучением нормального микробиоценоза и его изменений при различных заболеваниях. Микробиота человека изучается в рамках программы Human Microbiome Project (http://nihroadmap.nih.gov/hrnp/), где определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. По проекту «Русский метагеном» осуществлено глубокое секвенирование свыше 150 образцов ДНК, выделенных из кала здоровых людей, проживающих на территории Российской Федерации. В географию выборки входили города из различных федеральных округов — Центрального (Москва), Северо-Западного (Санкт-Петербург), Приволжского (Казань, Самара, Саратов), Южного (Ростов-на-Дону), Западной Сибири (Омск, Новосибирск). В рамках проекта были выявлены территориальные различия микро-биоты у людей, проживающих в России, но был показан общий схожий метаболизм микрофлоры у людей, проживающих в разных городах.

В 2003 году региональная оценка микробиоты кишечника проводилась у населения Западной Сибири. Установлено, что характер дисбиотических нарушений зависит от уровня загрязненности атмосферного воздуха. Распространенность дисбактериоза у жителей Западной Сибири составила 762+0,05 случаев на 1000 населения (Леванова Л. А., 2003). Исследования показывают, что качественные и количественные нарушения состава собственной микрофлоры кишечника связаны с увеличением численности E.coli со сниженной лактазной активностью, стафилококков и грибов рода Candida на фоне угнетения роста и снижения колонизирующей способности лактобацилл и бифидобактерий (Алешукина А. В., 2012).

История создания пробиотических препаратов в России связана с именем Г. И. Гончаровой, которая в 1966 году впервые разработала технологию изготовления «Бифидумбактерина сухого». Среди представителей бифидофлоры от детей и взрослых был отобран ряд штаммов, перспективных как по технологическим, так и медико-биологическим характеристикам.

В настоящее время современные пробиотики получены в Германии, Бельгии, Дании. В России широкое применение находят отечественные пробиотики IV поколения, представляя собой живые B.bifiduml (Бифидумбактерин фор-

те, Пробифор) либо В.Ъ'фйит 1+Ь.р1апШгит8ЯА-3 (Флорин форте), сорбированные (иммобилизованные на частицах измельченного активированного угля).

О. Г. Жиленковой проведены работы по выделению от здоровых детей производственно-перспективных штаммов бифидобактерий, обладающих определенными физиолого-биохимическими свойствами и антагонистической активностью (2011). При генетической идентификации лактобацилл и бифидобактерий в настоящее время используют секвенирование гена 16Б рРНК (Ботина С. Г., 2011), двухлокусное секвенирование (Субботина М. Е., 2009) и секвенирование нескольких фрагментов генома (Кунда М. С., 2009).

В связи с тем, что эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в их состав, большое внимание уделяется созданию поликомпонентных пробиотиков (Алешкин А. В., 2011; Амерханова А. М.,2009).

Однако ни один из отечественных или зарубежных пробиотических препаратов не создан на основе микроорганизмов, отвечающих этно-региональным критериям. Наиболее эффективным может быть использование штаммов, характерных для данного региона, которые могут адаптироваться к конкретному макроорганизму. Поэтому создание пробиотических препаратов, основанных на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны, является инновационным направлением по улучшению здоровья населения.

Цель исследования

Охарактеризовать микробиоту кишечника коренных жителей Центрального федерального округа Российской Федерации и селекционировать новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий, перспективные для создания на их основе региональных пробиотических препаратов.

Задачи исследования

1. Выделить и идентифицировать микрофлору кишечника от практически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, постоянно проживающих на территории Центрального федерального округа Российской Федерации.

2. Селекционировать лактобациллы и бифидобактерии, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, перспективные для конструирования новых пробиотических препаратов для жителей Центрального федерального округа Российской Федерации.

3. Провести генетическую идентификацию антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий с помощью ПЦР-генотипирова-ния и прямого секвенирования.

4. Определить адаптационный и пробиотический потенциал антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.

5. Определить симбиотические взаимоотношения антагонистически активных штаммов лактобацилл и бифидобактерий.

Научная новизна

Впервые охарактеризована микробиота кишечника практически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального федерального округа Российской Федерации, проживающих в Тверской, Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областях. Установлено, что у 75 % обследованных лиц выявлены нарушения микроэкологии кишечника с преобладанием дисбиоза I степени.

Получены новые данные о видовом разнообразии состава микробиоты при дисбиотических нарушениях кишечника у практически здоровых людей с доминированием представителей рода Bacillus среди условно-патогенной микрофлоры, что может служить основой для разработки персонифицированного подхода при коррекции дисбактериоза кишечника у населения Центрального федерального округа Российской Федерации.

Из кишечника здоровых людей с нормобиоценозом, коренных жителей Центрального федерального округа России, селекционированы новые штаммы лактобацилл и бифидобактерий, обладающие высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антимикробным препаратам, широким спектром пробиотического и адаптационного потенциала, что соответствует современным требованиям общих фармакопейных статей (ОФС) 2013 года к штаммам микроорганизмов, перспективным для конструирования пробиотиков.

Теоретическая и практическая значимость

Характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium как потенциальных пробиотических штаммов, выделенных из кишечника практически здоровых жителей конкретного округа России, позволит установить региональную специфичность микробиоты и теоретически обосновать перспективы создания пробиотических препаратов, базирующихся на принципах персонализированной медицины и ориентированных на конкретные региональные группы населения страны.

Охарактеризованные 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий с наиболее выраженными антагонистическими свойствами по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной, а также грибковой микрофлоре желудочно-кишечного тракта могут быть использованы как штаммы-кандидаты для конструирования новых перспективных пробиотических препаратов.

Определенные в ходе проведения работы нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК Lactobacillus rhamnosus 32 к. аннотированы и зарегистрированы в базе данных GenBank (№ SUB 168082).

Выделенные штаммы лактобацилл и бифидобактерий депонированы в музейной коллекции лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н. И. Вавилова Российской академии наук и могут быть использованы в дальнейших исследованиях ключевых генов, отвечающих за пробио-тические свойства штаммов.

Материалы диссертации включены в электронный учебно-методический комплекс, использующийся в учебном процессе, на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Методологическая база внедрена в работу бактериологической лаборатории научно-исследовательского центра Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации при изучении микробиоценозов различных биотопов организма человека.

Методология и методы исследования

Методология настоящего исследования включает современные методы научного познания и определяет характеристику компонентов, необходимых для решения поставленных задач. Теоретической основой исследования являются данные научной литературы, посвящённой проблеме коррекции дисбактериоза.

Предмет исследования — микроэкологические нарушения кишечника, связанные с увеличением количества условно-патогенной микрофлоры и снижением количества представителей нормобиоценоза. Объектом исследования являлась микробиота клинического материала от практически здоровых людей, проживающих в Центральном федеральном округе Российской Федерации. В работе применялись бактериологические и молекулярно-генетические методы исследований, а также методы статистической обработки.

Материалы и методы

Работа проводилась на базе бактериологической лаборатории научно-исследовательского центра Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава России (г. Тверь).

Объект исследования

Материалом для исследования служили фекалии 156 практически здоровых студентов медицинской академии в возрасте от 18 до 21 года (120 девушек и 36 юношей), в третьем поколении коренных жителей Тверской, Ярославской, Московской, Костромской, Брянской, Тульской, Воронежской, Калужской, Тамбовской, Смоленской и Владимирской областей ЦФО РФ. Матери-

ал брали в зимний период. На момент обследования никаких жалоб на нарушение функций пищеварительного тракта добровольцы не предъявляли.

Микробиологические методы

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили по общепринятым методикам на основании морфологических, культуральных и биохимических свойств (Никитин В.М., 1986).

Для изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы производили на отечественные и импортные питательные среды: желточно-солевой агар, среда Эндо (г. Оболенск), Эритрит агар (ФГУП НПО «Микроген», Москва), Sabouraud Dextrose Agar, MRS Agar, Schaedler Agar с кровью, Muller-Hinton II агар (BBL®). Посевы культивировали в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях с использованием микроанаэростатов и газогенераторных пакетов Gas Plack Plus (BBL®) в течение 24—72 часов при температуре 37 °С. Для биохимический идентификации использовали тест-системы: Enterotube II (BBL®), API® 20 С AUX, API® 20 Staph; API® 20 Strept, API® 50 CH, API® 20A (bio Mèrieux).

Первичное исследование антагонизма лактобацилл и бифидобактерий к тестовым культурам патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводили согласно методике прямого антагонизма; после биохимической и генетической идентификации антагонистическую способность микроорганизмов выявляли методом отсроченного антагонизма (Блинкова JI. П., 2003). В качестве тест-культур были использованы следующие штаммы: Candida albicans АТСС885-653, Salmonella enteríca Typhimiirium 415, Shigella sonnei Iфазы 941 из коллекции культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; Bacillus subtilis 534 из коллекции МНИИ-ЭМ им. Г. Н. Габричевского; Staphylococcus aureus АТСС25923, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

Наличие лецитиназной, казеинолитической, уреазной, желатиназной, нук-леазной, каталазной и гемолитической активности у лактобацилл и бифидобактерий определяли по стандартным методикам (Общая фармакопейная статья. Требования к штаммам микрорганизмов, используемым для производства про-биотиков для медицинского применения, 2013).

Чувствительность лактобацилл к желчи определяли измеряя оптическую плотность суточной бульонной культуры с желчью при длине волны 600 нм по отношению к исходному бульону. Чувствительность бифидобактерий к желчи определяли путем подсчета количества колоний после пересева бульонной культуры с желчью на плотной питательной среде по сравнению с контролем бульонной культуры без желчи. Способность микроорганизмов сквашивать молоко определяли по образованию творожистого осадка после внесения суточной бульонной культуры лактобацилл и 48-часовой культуры бифидобактерий в стерильное обезжиренное молоко (Общая фармакопейная статья. Требования к штаммам микрорганизмов, используемым для производства проби-отиков для медицинского применения, 2013).

Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам проводили методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton с использованием стандартных дисков производства BBL® согласно требованиям МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (2004) с учётом стандартов Института клинических и лабораторных стандартов, CLSI, США.

Степень адгезии бактерий определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+ (Брилис В. И., 1986).

Биосовместимость исследуемых лактобацилл и бифидобактерий между собой изучалась методом совместного культивирования на плотной питательной среде (Глушанова Н. А., 2005).

Молекулярно-генетические методы

Видовую идентификацию лактобацилл и бифидобактерий проводили с помощью молекулярно-генетических методов на основе амплификации и секвени-рования фрагментов гена 16S рРНК на базе Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (г. Москва). Амплификацию проводили в термоциклерах «Терцик» фирмы «ДНК-Технология». Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA) с набором реактивов Big Dye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Консенсусные последовательности сравнивали с помощью алгоритма BLASTn с базой данных GenBank.

Статистическая обработка результатов, анализ данных и программное обеспечение

Данные экспериментов обрабатывали с помощью прикладной программы «STATISTICA» (Stat Soft Russia) и «Excel». Для представителей нормофлоры, патогенных и условно-патогенных микроорганизмов были рассчитаны статистические параметры. Для биохимической идентификации использовали программу API® WEB для ПК (bio Mérieux, Франция). Секвенированные последовательности сопоставляли с международной базой данных NCBI с помощью сервиса BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Личное участие автора в получении результатов

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-микробиологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах. В работе было использовано 16 различных методик. Все 575 культур микроорганизмов были выделены автором совместно с лаборантом кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммуногогии ГБОУ ВПО Тверская ГМА Минздрава России Червинец JI. Ф. и идентифицированы автором по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам с использованием современных биохимических тест-систем. У11 отобранных штаммов были определены антагонистическая активность прямым и от-

сроченным методами, чувствительность к антимикробным препаратам, наличие факторов патогенности (выявляли лецитиназную, казеинолитическую, уреазную, желатиназную, нуклеазную, каталазную и гемолитическую активности), чувствительность к желчи, способность сквашивать обезжиренное молоко, степень адгезии и биосовмесимость на плотной питательной среде.

Генетическую идентификацию 6 штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифи-добактерий проводили в Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (г. Москва) совместно с д-ром биол. наук Полуэкговой Е. У. и канд. биол. наук Не-заметдиновойВ. 3. под руководством д-ра биол. наук профессора Даниленко В. Н. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводили в НИИ ФХМ ФМБА РФ на приборе 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Клинически здоровые люди в возрасте от 18 до 21 года, постоянно проживающие в Центральном федеральном округе Российской Федерации, обладают разной степенью нарушений микробиоценоза кишечника.

2. Селекционированные и охарактеризованные штаммы лактобацилл и би-фидобактерий могут быть использованы как резерв с целью создания на их основе региональных пробиотиков для коррекции нарушений микрофлоры людей, проживающих в Центральном федеральном округе Российской Федерации.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность полученных данных основана на большом объёме материала и современных методиках сбора и обработки информации. Исследование выполнено на высоком научно-методическом уровне с применением современных микробиологических, молекулярно-генетических, биоинформационных, статистических методов и международных баз данных. В работе использовано сертифицированное и поверенное оборудование. Положения диссертационной работы научно обоснованы данными литературы, результаты подтверждены статистически. Полученные данные документированы таблицами, графиками и фотографиями. Предложены рекомендации для дальнейшего использования селекционированных штаммов.

Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №4 от 16.01.2014).

Результаты исследования представлены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Омск, 2011); 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт-Петербург, 2011); XII съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2012); X съезде Все-

российского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2012); ХШ Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2012); республиканской научно-практической конференции «Медицинское образование, наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Акгобе, 2012); V Всероссийском с международным участием медико-биологическом конгрессе молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012» (Тверь); 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург — Гастросессия-2012»; I межвузовской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и медицинская наука» (Тверь, 2013).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций, 1 — в других научных изданиях, 11 — в материалах конференций.

Объем и структура диссертации: работа состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, заключения, списка сокращений, списка литературы, приложения. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, 21 таблицей. Библиографический указатель включает 203 наименования, из них 78 отечественных и 125 зарубежных источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение и идентификация микроорганизмов

Общее количество выделенных микроорганизмов составило — 575 штаммов. Из кишечника здоровых людей выделено и идентифицировано 448 штаммов нормофлоры: 2 штамма рода Staphylococcus (S.cohnii), 124 штамма — Lactobacillus, 87 — Bifidobacterium, 95 — Enterococcus (E.durans, E.faecalis, E.faecium), 66 — Bacteroides (B.stercoris, B.ovatus), 40 — Peptostreptococcus (P.asaccharolyticus), 8 — Leptotrichia (L. buccalis), 9 — Clostridium (C.butyricum, C.beijerinckii) и 17 штаммов Escherichia coli. Выделено и идентифицировано 127 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры: 6 штаммов рода Staphylococcus (S.aureus), 40 — Actinomyces (A.israelii), 55 — Bacillus (B.subtilis, B.cereus), 26 — Candida (C. albicans, C.tropicalis).

Среди представителей нормофлоры наибольшая частота встречаемости приходилась на бифидобактерии (55 %), лактобациллы (79 %) и энтерококки (61%). В меньшей степени были распространены бактероиды (42 %), пептост-рептококки (26 %) и эшерихии (11%), и в 1—5 % случаев встречались лептот-рихии, клостридии и непатогенные стафилококки (рисунок 1).

Рисунок 1 — Спектр и частота встречаемости представителей нормофло-ры кишечника здоровых людей, % (п= 156)

Среди условно-патогенных микроорганизмов доминировали бациллы (35 % случаев) и актиномицеты (26 %), а также встречались кандиды (17 %) и золотистый стафилококк (4 %) (рисунок 2).

40

Bacillus spp.

Actinomyces spp. Candida spp.

Staphylococcus aureus

Рисунок 2 — Спектр и частота встречаемости условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, выделенных из кишечника здоровых людей, % (п=156)

Выявлено, что большинство представителей нормофлоры встречалось в количестве от 7,04 до 7,72 ^ КОЕ/г, за исключением непатогенных стафилококков (6,26 % КОЕ/г) (рисунок 3).

9 8 7 6 5 4 3 ' 2 1 О

7,72

7,58

7,33

7,25

7,25

7,17

|

-J

g, |

0 g

1

7,15

7.04

6,26

jS

'о о О О g; Й

а 1 о

! 1

Й

f о

О, 55

Рисунок 3 — Количество представителей нормофлоры, выделенной из кишечника практически здоровых людей, lg КОЕ/г (п=156)

Количество бацилл и актиномицет превалировало над количеством нормофлоры и составило 7,86 и 7, 74 lg КОЕ/г. Количество Staphylococcus aureus и дрожжевых грибов рода Candida было на порядок ниже, чем у представителей нормофлоры и УПМ (рисунок 4).

¡щЬьт! 7,86 7,74

т

6,48 6,43

Bacillus spp. Actinomyces ssp. Staphylococcus aureus Candida spp.

Рисунок 4 — Количество условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, выделенных из кишечника здоровых людей, lg КОЕ/г (п=156)

13

При определении дисбактериоза кишечника выявлено наличие разных степеней дисбиотических нарушений у клинически здоровых студентов. Нормальный биоценоз кишечника обнаружен всего у 25 % здоровых людей, I степень дисбактериоза — у 52 %, IT степень — у 15 % и III степень — у 8 % студентов (рисунок 5).

■ отсутствие дисбактериоза

■ 1 степень дисбактериоза

■ 2 степень дисбактериоза

■ 3 степень дисбактериоза 52%

Рисунок 5 — Степени дисбактериоза у практически здоровых людей, %

(п=156)

По мнению разных авторов, дисбактериоз кишечника встречается у 70— 90 % здорового населения разных возрастных групп (Андреева И. В., 2006, ДицЕ. В., 2009).

Нами впервые определена ведущая роль представителей рода Bacillus в дисбиотических нарушениях кишечника у клинически здоровых людей. Данный микроорганизм превалировал среди условно-патогенной микрофлоры и высевался в большом количестве — 7,86+0,14 lg КОЕ/г. Поданным литературы, в последнее время подобная тенденция не прослеживается. Дрожжевые грибы рода Candida высевались только в 17 % случаев, хотя анализ литературы показывает, что частота носительства данных микроорганизмов в кишечнике у здоровых лиц достигает 65-80 % (Ардатская М. Д., 2010; Бельмер С. В., 2003). Патогенные стафилококки были выявлены только у 4 % здоровых людей.

С увеличением степени дисбактериоза в ассоциации микроорганизмов входили условно-патогенные и патогенные представители микрофлоры и практически не обнаруживалась нормофлора (таблица 1).

Таблица 1 — Ассоциации родов микроорганизмов, выделенных у лиц с разной степенью дисбактериоза

Степень дисбакте риоза Ассоциации родов микроорганизмов

Нормо-биоценоз Lactobacillus+Bifidobacterium; Ixictobacillus+Actinomyces-Bifidobacterium; Lactobacillus-*- Bacteroiiks+Enterococcus+Bifidobacterium; LactobaciIus+ Ertterococcus+ Peptostreptococcus+ Bifidobacterium; Lactobacillus-*-Actinomyces+Enterococcus+Bifidobacterium; Lactobacillus+Peptostreptococcus+Bifidobacterium; Lactobacillus+ Bacteroides+ Enterococcus* Peptostreptococcus+ Bifidobacterium

1 Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides+Enterococcus Lactobacillus+Enterococcus+Bifidobacterium Lactobacillus-*-Actinomyces; Lactobacillus-*-Enterococcus Lactobacillus-*-Actinomyces+Enterococcus Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides Lactobacillus+Enterococcus+Peptostreptococcus Lactobacillus+Candida+Enterococcus+Bifidobacterium LactobaciIlus+Bacteroides+Actinomyces Lactobacillus+Bacteroides+Enterococcus Bifidobacterium-*-Enterococcus; Bifidobacterium+Actinomyces

2 Lactobacillus+Bacteroides+Candida+Enterococcus Lactobacillus+Bacillus+Bacteroides+Actinojnyces+Escherichia coli Ijictobacillus+Staphylococcus aweus+BaciIlus+Actinomyces+ Enterococcus BaciUus+Actinomyces+Escherichia coli+Peptostreptococcus-*- Clostridium + Bifidobacterium

3 Bacillus^ Bacteroides+Candida+Enterococcus Bacillus+Bacteroides+Enterococcus + Clostridium

При нормобиоценозе в ассоциации входили представители 2—5 родов микроорганизмов, среда которых наиболее часто встречались представители нормальной микрофлоры родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, реже Bacteroides и Peptostreptococcus, иногда условно-патогенные микроорганизмы рола Actinomyces.

При 1 степени дисбактериоза в ассоциации входили микроорганизмы 2—4 родов, и были представлены такими родами, как Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Bacteroides и Actinomyces, реже Bacillus и Candida.

Дисбактериоз 2 степени характеризовался ассоциациями, включающими от 4 до 6 родов микроорганизмов, представителями нормофлоры (Lactobacillus и Bifidobacterium) и УПМ {Bacillus, Candida), реже встречались — Enterococcus, Bacteroides, Actinomyces, Peptostreptococcus и Clostridium.

При 3 степени дисбиотических нарушений в ассоциации входили представители 4 родов микроорганизмов, чаще всего условно-патогенных: Bacillus, Actinomyces и Candida, а также нормальной микрофлоры — Bacteroides, Enterococcus, Peptostreptococcus. Бактерии родов Lactobacillus и Bifidobacterium при 3 степени дисбактериоза обнаружены не были.

Наши результаты подтверждают данные литературы о наличии ассоциаций представителей нормофлоры при отсутствии дисбиотических нарушений ЖКТ (Бондаренко, 2003). Исследования, проведенные среди населения Оренбургской области, выявили, что при дисбактериозе кишечника среди условно-патогенных микроорганизмов чаще всего в ассоциации микроорганизмов входят лактозонегативные Escherichia coli, Staphylococcus aureus и дрожжевые грибы рода Candida (Перунова Н. Б., 2003). В нашей работе из кишечника здоровых людей ЦФО РФ микроорганизмы рода Bacillus и дрожжевые грибы рода Candida выделялись в ассоциациях с представителями нормофлоры.

Отбор антагонистически активных штаммов лактобацилл

и бифидобактерий

Из 124 изолятов лактобацилл и 87 бифидобактерий было выделено 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 штаммов бифидобактерий от людей с нормобиоценозом, проявляющих антагонизм к тестовым культурам.

Результаты, полученные после биохимической и генетической идентификации лактобацилл, показали, что у 5 штаммов лактобацилл, подтверждена видовая принадлежность, полученная по биохимическим тестам. У 1 штамма генетическое исследование изменило его видовое название: L. plantarum 17 к. на L.casei 17к. (таблица 2).

Таблица 2 — Результаты биохимической и генетической идентификации лактобацилл

№ Результаты биохимической идентификации по тест-системе API® 50 СН "bio Merieux" Результаты генетической идентификации (ген 16S РНК)

1 L. plantarum 46 к. L. plantarum 46 к.

2 L. plantarum 36 cm. L. plantarum 36 ст.

3 L. rhamnosus 38 к. L. rhamnosus 38 к.

4 L. plantarum 17 к L. casei 17 к.

5 L. rhamnosus 32 к. L. rhamnosus 32 к.

6 L. plantarum K9 L L. plantarum К9 L

Биохимические свойства лактобацилл являются в настоящее время основным критерием межродовой и видовой идентификации этих микроорганизмов (Точилина А. Г., 2009). В других работах показано, что результаты идентификации лактобацилл, полученные с помощью генетических методов с использованием ПЦР (16S рРНК), полностью подтверждают биохимические исследования (API® 50 CHL системы), а иногда являются единственными в идентификации штаммов (Wall R., 2007).

Результаты, полученные после биохимической и генетической идентификации бифидобактерий (таблица 3), показали, что у 2 штаммов бифидобактерий подтверждена видовая принадлежность, выявленная по биохимическим тестам. У 2 штаммов генетическое исследование изменило его видовое название: В. bifidum

191 на В. а^клсепИз 191, В. ас1о1е.чсепИз 201 на В. Ьп^ут 201, и у 1 штамма биохимическая идентификация не определила видовую принадлежность штамма.

Таблица 3 — Результаты биохимической и генетической идентификации

бифидобактерий

№ Результаты биохимической идентификации по тест-системе API® 20 A "bio Merieux" Результаты генетической идентификации (ген 16S РНК)

1 Bifidobacterium sp. 212 В. angulatum 212

2 В. bifidum 191 В. adolescentis 191

3 В. adolescentis 201 В. longum 201

4 В. bifidum 172 В. bifidum 172

5 В. longum 264 В. longum 264

Биохимическая идентификация бифидобактерий с помощью системы API® 20А (bio Merieux) включает 20 параметров, и в большинстве случаев необходимо провести дополнительные биохимические тесты. В связи с этим для видовой идентификации бифидобактерий более эффективным является применение молеку-лярно-генетических методов на основе секвенирования нескольких мишеней в геноме, что подтверждает анализ литературы (Новикова Н. А., 2004).

Пробиотический потенциал лактобацилл и бифидобактерий

Отобранные штаммы лактобацилл и бифидобактерий проявили антагонизм ко всем тест-культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, зоны, подавления роста которых составили более 20 мм (таблица 4, рисунок 6). Все штаммы бифидобактерий не проявляют антагонистической активности в отношении дрожжевых грибов рода Candida. Штаммы не подвергались генно-инженерным воздействиям.

Рисунок 6 — Антагонистическая активность бифидобактерий по отношению к Bacillus subtilis 534

Объект исследования Зоны задержки роста тест-культур (мм)

C.albi-cans АТСС 885-653 S.enterica Typhimur ium 415 Shigella sonnei 1 фазы 941 Bacillus subtilis 534 Е. coli АТСС 25922 P.aerug inosa АТСС 9027 S. aureus АТСС 25923

Ь. р1ап1агит 46 к. 21,11 22,2+1 22,5±2 22,5+2 24,5+2 25,3+2 23,0+2

Ь. р1ап1агит 36 ст. 22,3+1 22,6+2 23,5+2 22,5±2 24,5+2 25,3+2 23,7+2

Ь. гИашповш 38 к. 22,5±2 22,0±1 25,2±2 23,5±2 27,5±2 23,9+3 25,4+3

Ь. саяе117 к. 24,2+2 20,1+2 23,0+2 25,8+3 25,5+3 23,0+1 27,1+2

Ь. гИатпот.ч 32 к. 21,3±3 23,8+1 24,2±2 25,0+1 26,1+2 23,5±2 25,7±1

Ь. р1агйагит К9 Ь 23,2+2 25,5+3 24,2±2 23,5+2 25,7+1 22,5±2 25,4+2

В. Ы/14г1т 172 0 22+1 35+2 35±2 35+2 35+2 35+2

В. си1о1е$сепИ5 191 0 35+2 35±2 35+2 35+2 35+2 30+1

В. 1оп^т 201 0 35+2 30+1 35±2 30±1 35+2 35+2

В. апёи1ашт 212 0 35±2 34+2 35±2 30+1 35±2 25+1

В. 1опцит 264 0 21+1 25+1 21+1 21+1 21±1 28+1

При исследовании 6 антагонистически активных штаммов лактобацилл и 5 антагонистически активных штаммов бифидобактерий на наличие каталаз-ной активности, микробных протеаз (казеиназа и желатиназа), нуклеазной активности (ДНК-аза и РНК-аза), гемолитической, уреазной и лецитиназной активности не обнаружено вышеупомянутой активности у данных бактерий. Все исследуемые штаммы не имеют указанных фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов агрессии.

При исследовании чувствительности лактобацилл к желчи было выявлено, что желчь не подавляет рост данных штаммов. При исследовании чувствительности бифидобактерий к желчи выявлено, что 10 и 20 % концентрация желчи подавляла рост всех штаммов бифидобактерий. В. 1оп^т 264 была чувствительна ко всем концентрациям желчи, даже к минимальной.

Все штаммы лактобацилл показали способность сквашивать молоко через 12-14 часов. В. Ь'фйит 172 сквашивал молоко через 18-20 часов, ВЛощит 264 -через 48 часов, у остальных штаммов бифидобактерий не выявлена способность сквашивать молоко.

Все антагонистически активные штаммы лактобацилл обладают чувствительностью к антимикробным препаратам разной степенью выраженности, за исключением левофлоксацина, ванкомицина и ципрофлоксацина, к которым они проявили резистентность (рисунок 7). Антагонистически активные штам-

мы бифидобактерий обладают высокой чувствительностью к антимикробным препаратам (рисунок 8). Фенотипическое проявление чувствительности лак-тобацилл и бифидобактерий к антимикробным препаратам косвенно свидетельствует об их безопасности в применении, т.к. они не могут участвовать в формировании лекарственной устойчивости у нормальной микрофлоры, что соответствует основным требованиям ОФС к штаммам микроорганизмов, используемым в производстве пробиотиков для медицинского применения.

левофлоксацин ванкомицин ципрофлоксацин

бензилпенициллин яма

ампициллин ■■■■■■■

линезолид мммкшшннш^нмн

фу радо нин жшш^шяшш^^^шяш^л

антимикробные „^„„„ци» ; 1

препараты _ ! 1_

эритромицин ■■■■■■■■■■■■■

тетрациклин ■■■^вичииияиш^^жиии

меропенем ■

доксициклин ■■н^ина■■■шммнмвшан!■

стрептомицин ■■■■мадшшмшнвМ

гентамицин я^шяшшккшшшшшш мнпнн ■■■■

левомицетин

О 20 40 60 80 100

%

Рисунок 7 — Чувствительность лактобацилл к антимикробным препаратам

антимикробные препараты

гентамицин амикацин бензилпенициллин оксациллин рифампицин эритромицин линкомицин ванкомицин ронстроммцмн клиндамицин меропенем линезолид цефэлексин цефазолин цефз логин фузидин ципрофлоксацин цефаклор цефуроксин

Рисунок 8 — Чувствительность бифидобактерий к антимикробным

препаратам

Адгезивная активность лактобацилл и бифидобактерий

Средний показатель адгезии лактобацилл кишечника колебался от 2,12 до 4,52 и в среднем составил 3,87+0,32. Средний показатель адгезии бифидобактерий кишечника колебался от 1,24 до 2,12 и в среднем составил 1,74±0,2. Таким образом, лактобациллы имели среднее значение адгезивности, а бифидо-бактерии - низкое (рисунок 9). Наряду с лактобациллами бифидобактерии, обладая достаточной степенью адгезии, могут входить в состав биопленок, осуществляя колонизационную резистентность.

Рисунок 9 — Адгезия лактобацилл (А) бифидобактерий (Б) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+

Степень адгезии, полученная in vitro на эритроцитах человека удовлетворяет требования ОФС к штаммам микроорганизмов, используемым для производства пробиотических фармпрепаратов.

Установлено, что исследуемые лактобациллы и бифидобактерии не оказывают взаимного антагонистического воздействия, о чем свидетельствует отсутствие зоны задержки роста чувствительной культуры (рисунок 10).

Рисунок 10 — Совместное культивирование на плотной питательной среде

В нашем исследовании селекционированы потенциально безвредные лак-тобациллы и бифидобактерии, не обладающие факторами патогенности, имеющие широкий спектр пробиотического и адаптационного потенциала, а также оказывающие высокую антагонистическую активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, но не влияющие на представителей нормофлоры, что соответствует современным представлениям и требованиям, предъявляемым к пробиотическим штаммам, и позволит их использовать как основу для конструирования эффективных моно- и поликомпонентных пробиотических препаратов для населения Центрального федерального округа России.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

1. У 75 % практически здоровых людей в возрасте от 18 до 21 года, коренных жителей Центрального федерального округа Российской Федерации, выявлены нарушения микроэкологии кишечника с преобладанием I степени дисбактериоза у 52 % обследованных лиц. У 15 % лиц обнаружена II степень дисбиотических нарушений, 8 % лиц — дисбактериоз III степени и только в 25 % случаев определен нормобиоценоз.

2. При дисбиотических нарушениях кишечника у практически здоровых людей преобладающими представителями являлись микроорганизмы рода Bacillus, что требует разработки персонифицированного подхода при коррекции дисбактериоза кишечника у населения Центрального федерального округа Российской Федерации.

3. Одиннадцать штаммов лактобацилл и бифидобактерий обладали высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Escherichia coli АТСС25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Shigella sonnei 941, Salmonella enterica Typhimurium 415, Bacillus subtilis 534. В отношении дрожжевых грибов рода Candida антагонистическая активность выявлена только у лактобацилл.

4. Определен видовой состав выделенных из кишечника антагонистически активных лактобацилл и бифидобактерий с использованием метода гено-типирования на основе секвенирования гена 16S рРНК: 3 штамма лактобацилл относятся к виду L. plantarum, 2 — к L. rhamnosus, 1 — к L. casei; 2 штамма бифидобактерий — к виду В. longum, 1 — В. bifidum, 1 — В. adolescentis, 1 — к В. angulatum.

5. Все высокоантагонистические штаммы лактобацилл и бифидобактерий не имели фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов агрессии, и обладали чувствительностью к антимикробным препаратам, что определяет их потенциальную безопасность. Лактобацилы обла-

дали большей возможностью к персистенции в желудке и верхних отделах тонкого кишечника, чем бифидобактерии, так как росли при различных концентрациях желчи, а бифидобактерии были чувствительны даже к 0,625 % желчи.

6. Все штаммы не оказывали взаимного антагонистического воздействия при их совместном культивировании на плотной питательной среде и обладали достаточным показателем адгезивности, что будет способствовать их колонизационной резистентности.

Практические рекомендации

1. Селекционированные высокоантагонистические штаммы лактобацилл и бифидобактерий, выделенные из кишечника практически здоровых людей Центрального федерального округа, могут быть рекомендованы в качестве основы для создания новых пробиотических препаратов для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у населения данного региона. Выделенные штаммы, обладающие широким набором свойств и не оказывающие взаимного антагонистического воздействия, можно использовать при конструировании поликомпонентных пробиотиков.

2. Селекционированные штаммы лактобацилл и бифидобактерий, L. rhamnosus 38к., L. plantarum 46к., L. plantarum 36cm, L. rhamnosus K9 L, L. plantarum 32 k., L. casei 17 k., B. bifidum 172, могут быть рекомендованы в качестве заквасок прямого внесения.

Перспективные направления дальнейшей разработки темы:

1. У здорового населения различных регионов России необходимо продолжить изучение разнообразия микрофлоры при дисбиотических нарушениях для своевременной коррекции при отсутствии клинических проявлений.

2. Для определения роли представителей рода Bacillus в дисбиотических нарушениях микрофлоры кишечника могут быть перспективными исследования по определению свойств данного компонента микробиоты.

3. Для конструирования новых пробиотических препаратов необходимо провести доклинические исследования выделенных штаммов лактобацилл и бифидобактерий и полногеномное секвенирование, включающее аннотацию генома по комплексу ключевых генов, ответственных за пробиотичес-кие свойства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Червинец, Ю. В. Симбиоз лактобацилл полости рта с микробиотой человека / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых болезней» Роспотребнадзора. — Омск, 2011. — № 2(5). — С. 203—204.

2. Червинец, Ю. В. Микробиоценоз кишечника детей в возрасте 8—10 лет / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. — 2011. — № 4. — С. М 41.

3. Червинец, Ю. В. Симбиоз лактобацилл кишечника с микробиотой человека / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. — 2011. — № 4. — С. М 41.

4. Червинец, В. М. Дисбактериоз кишечника и иммунный статус у детей с заболеваниями ЖКТ и верхних дыхательных путей / В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева // XXXVIII сессия ЦНИИ Гастроэнтерологии XII съезд Научного общества гастроэнтерологов России. Клиническая и прикладная гастроэнтерология. — 2012.-С. 113.

5. Червинец, Ю. В. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биопленки / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева // Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации». — М., 2012.-Т. 2. — № 1.-С. 340-341.

6. Беляева, Е. А. Содержание бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике здоровых людей / Е. А. Беляева //Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов XIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. — Владивосток: Медицина ДВ, 2012. — С. 116-117.

7. Червинец, В. М. Мониторинг чувствительности к противомикробным препаратам микроорганизмов, выделенных от больных кольпитом / В. М. Червинец, Е. А. Беляева, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова // Медицинский журнал западного Казахстана: Материалы республи-

канской научно-практической конференции «Медицинское образование, наука и практика: традиции, инновации, приоритеты». Актобе, 2012. — № 3. - 2012. - С. 257-258.

8. Беляева, Е. А. Бифидобактерии, перспективные для создания пробиотиков / Е. А. Беляева, В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова // Симбиоз Россия 2012: Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых. — Тверь: Заповедник времени, 2012. — С. 315-317.

9. Червинец, В. М. Генотипический контроль бактериоциногенности лакто-бацилл / В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, Е. У. Полуэктова, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева//Материалы 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург — Гастросес-сия-2012». — Санкт-Петербург, 2012. — М43 с.

10. Беляева, Е. А. Бифидобактерии кишечной микрофлоры здоровых людей перспективные для создания пробиотиков для населения Центрального федерального округа / Е. А. Беляева, В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова// Материалы 9-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург — Гастросессия-2012». — Санкт-Петербург, 2012. — М42 с.

11. Червинец, В. М. Микробиоценоз кишечника и иммунный статус у детей младшего школьного возраста / В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева, А. Ю. Миронов // Клиническая лабораторная диагностика. — 2013. — № 1. — С. 49-52.

12. Червинец, Ю. В. Нарушения микробиоты желудочно-кишечного тракта здоровых людей / Ю. В. Червинец, Е. А. Беляева, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, А. И. Пятова, А. В. Червинец // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. — 2013. — № 3. - С. 55-58.

13. Беляева, Е. А. Дисбиотические изменения микрофлоры кишечника у здоровых людей / Е. А. Беляева, В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, А. И. Пятова, А. Ю. Миронов // Клиническая лабораторная диагностика. — 2013. — № 3. — С. 45-47.

14. Апенченко, Ю. С. Микробиоценоз верхних отделов пищеварительного тракта у детей с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью и хроническим гаст-родуоденитом/ Ю. С. Апенченко, В. М. Червинец, И. И. Иванова, Н. В. Басалаева, Е. А. Беляева // Клиническая лабораторная диагностика. — 2013. — № 4. - С. 40-43.

15. Беляева, Е. А. Бифидобактерии, перспективные для создания региональных пробиотических препаратов / Е.А. Беляева // Материалы I межвузовской научно-практич. конф. молодых ученых «Молодежь и медицинская наука». — Тверь: Ред.-изд. центр Твер. гос. мед. акад., 2013. — С. 15-16.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт

КОЕ — колониеобразующая единица

ОФС — общая фармакопейная статья

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СПА — средний показатель адгезии

УПМ — условно-патогенные микроорганизмы

ЦФО РФ — Центральный федеральный округ Российской Федерации MRS — среда, предложенная Де Маном, Рогоза и Шарпом для выделения лак-тобацилл

Формат 60x84 !/16. Бумага офсетная. Усл.-печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 40.

Отпечатано в ГОУ НПО ПЛ № 12 170023, г. Тверь, Ремесленный пр-д , 5