Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка пробиотической композиции с высокой способностью к редукции холестерина

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка пробиотической композиции с высокой способностью к редукции холестерина"

На правах рукописи

ГОЛОВИН МИХАИЛ АНАТОЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОМПОЗИЦИИ С ВЫСОКОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К РЕДУКЦИИ ХОЛЕСТЕРИНА

Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ 8 АПР 2015

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2015

005567059

005567059

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ганина Вера Ивановна

доктор технических наук, профессор

Стоянова Лидия Григорьевна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, кафедра микробиологии

биологического факультета ФГБОУ ВО Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Жиленкова Ольга Геннадьевна

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория биологии

бифидобактерий ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский

государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится «28» апреля 2015 г. в 1530 на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1.

Тел.: 8 (495) 939-54-83, эл. no4Tanpiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ и на сайте биологического факультета МГУ http://www.bio.msu.ru/.

Ведущая организация:

Автореферат разослан «2- марта 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Пискункова Нина Федоровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В приоритетных направлениях Технологических платформ «Здоровое питание» и «БиоТех 2030» предусматривается разработка продуктов питания, которые способствуют оздоровлению населения, уменьшению риска возникновения заболеваний и медикаментозной нагрузки. Важная роль в решении поставленных задач отводится функциональным и лечебно-профилактическим продуктам питания. Необходимость разработки и производства диетической и специализированной продукции обусловлена тем, что у населения наблюдается увеличение алиментарных заболеваний, приводящих к понижению производительности труда и, в целом, влияющих на развитие экономики в стране. Одним из факторов, вызывающих возникновение ряда сердечно-сосудистых заболеваний, от которых повышается смертность населения является повышение концентрации холестерина в крови. Для регулирования уровня холестерина в крови человека применяют химические препараты. Однако лечение при этом может сопровождаться серьезными побочными эффектами. Другим направлением регулирования уровня холестерина в крови может быть использование биообъектов. В частности, в последнее десятилетие ученые все больший интерес проявляют к пробиотическим микроорганизмам, имеющим длительную историю безопасного использования и входящим в перечень микроорганизмов, рекомендуемых IDF/EFFCA, способным участвовать не только в восстановлении полезной микробиоты, но и в обмене веществ, включая холестерин, в организме человека.

Степень разработанности темы исследований. Теоретические и практические основы в области создания фармпрепаратов, БАД, продуктов питания с применением пробиотических микроорганизмов и использования биологических активных веществ из сырья животного происхождения заложены в трудах отечественных и зарубежных ученых: Амерхановой А.М., Артюховой С.И., Гавриловой Н.Б., Ганиной В.И., Громовых Т.И., Донской Г.А., Евдокимова Е.А., Забодаловой JI.A., Нетрусова А.И., Нефедовой Н.В., Остроумова Л.А., [Поспеловой В.В.|, Рябцевой С.А., Семенихиной В.Ф., Стояновой Л.Г., Титова Е.И., Устюговой Е.А., Хамагаевой И.С., Харитонова В.Д., Храмцова А.Г., Эрвольдер Т.М., Ouwehand A.C., Sipola М., Zheng Y. и др.

Вопросы изучения способности микроорганизмов к метаболизму холестерина представлены в трудах отечественных и зарубежных авторов: Алёшкина В.А., Близнякова Е.Г., Бондаренко В.М., Лазаренко Л.Н., Машенцевой Н.Г., Петухова В.А., Старовойтовой С.А., Тимошка H.A., Шендерова Б.A., Bordoni A., Kumar М., Mahrous Н., Liong М.Т., Lye H.S., Lee do К., Tahri К., Tanaka H., Taranto M.P., Ziarno M. и др.

Проблема предупреждения сердечно-сосудистых заболеваний и появление новых данных о роли биообъектов и продуктов их жизнедеятельности в поддержании здоровья человека обусловливают актуальность исследований в области изучения и применения пробиотических микроорганизмов для создания пищевой продукции диетического

профилактического и диетического лечебного питания, в частности, способствующей регулированию уровня холестерина в организме.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлось создание пробиотической композиции с высокой способностью к снижению концентрации холестерина на основе специально подобранных штаммов по комплексу показателей и обоснование условий их культивирования.

Для достижения поставленной цели решали следующие основные задачи:

1. Теоретически и экспериментально обосновать состав пробиотической композиции, изучить ее свойства и способность к снижению концентрации холестерина в условиях in vitro и in vivo.

2. Выделить новые и отобрать из коллекции микроорганизмов МГУПП штаммы пробиотических бактерий, обладающие потенциально высокой способностью к снижению концентрации холестерина и адгезионными свойствами.

3. Исследовать пробиотические свойства новых штаммов микроорганизмов, включая антагонизм к условно-патогенным тест-культурам, выживаемость в условиях желудочно-кишечного тракта.

4. Определить условия культивирования изучаемых штаммов пробиотических бактерий для получения их биомассы с высокой способностью к снижению концентрации холестерина.

5. Провести апробацию биотехнологии получения пробиотического препарата, снижающего концентрацию холестерина, в производственных условиях и разработать технологическую инструкцию на его производство.

6. Изучить показатели качества и возможность применения разработанной пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, в технологии молочной продукции.

Научная новизна:

- теоретически и экспериментально обоснован штаммовый состав и создана пробиотическая композиция, снижающая концентрацию холестерина, с подтвержденным спектром технологических и функциональных свойств. Композиция включает Bifidobacterium bifidum GG-72, Lactobacillus acidophilus ACT-44, Lactobacillus fermentum LFM-2, Lactobacillus plantarum ГВИ-1, Lactobacillus rhamnosus LC-52GV;

- выделен, идентифицирован новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72, а также изучен комплекс его свойств, что позволило рекомендовать его в качестве перспективного пробиотика. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» под номером ВКПМ Ас-1884;

- определена адгезионная способность исследуемых культур бактерий in vitro. Количество клеток бактерий, адгезивных к 1000 клеток кишечника человека СаСо-2 было следующим: 2400 - В. bifidum GG-72, 2230 -L. rhamnosus LC-52GV; 915 - L. acidophilus ACT-44, 840 - L. fermentum LFM-2, 749 - L. plantarum ГВИ-1; 519 - L. acidophilus ACT-41, 470 - L. acidophilus 887.

- определены условия культивирования, в которых изученные штаммы пробиотиков, входящих в композицию, проявляли наивысшую способность к

снижению холестерина: для бифидобактерий - среда Блаурокка; для лактобактерий - МИЕ-бульон; культивирование при 37±1 °С с продолжительностью до начала стационарной фазы.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в выдвижении гипотезы о возможности создания бактериальной композиции, способной снижать концентрацию холестерина, создании нового пробиотика на основании отбора штаммов с данным свойством и разработка условий его промышленного получения.

Практическая значимость работы состоит в следующем:

- разработаны состав и условия биотехнологии пробиотической композиции с высокой способностью к снижению концентрации холестерина;

- разработанная пробиотическая композиция, снижающая концентрацию холестерина, рекомендуется для создания профилактических продуктов питания, биологически активных добавок и пробиотических препаратов;

- разработана технологическая инструкция на получение биомассы пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина;

- проведена апробация промышленного получения биомассы пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, что подтверждено актом производственной проверки;

-результаты исследований внедрены в учебный процесс: использованы в дисциплинах «Стартовые культуры в технологии продуктов питания» - для студентов специальности 260200.68 «Продукты питания животного происхождения» и «Технология молока и молочных продуктов» - для студентов специальности 260303.65.

Работа осуществлялась в рамках проектов № 4209 и № 9353 «Коллекция культур бактерий, бактериофагов, дрожжевых и мицелиальных грибов как база для научно-образовательного процесса, сохранения биоразнообразия и развития современной биотехнологии», гранта № 14.577.21.0044 «Разработка новых энергосберегающих технологий и процессов для вакуумной сублимационной сушки широкого спектра термолабильных материалов, создание на их основе опытно-промышленного образца сушильного устройства для пищевой промышленности и прикладной биотехнологии» (уникальный идентификатор 11РМЕЕ157714Х0044) (ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы»).

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертации являются труды отечественных и зарубежных ученых в области выявления ценных свойств у пробиотических микроорганизмов и их применения в биотехнологии профилактической и лечебной продукции.

При организации и проведении экспериментальных исследований применялись микробиологические, физико-химические, генетические, органолептические общепринятые и оригинальные методы определения показателей исследуемых объектов.

Степень достоверности результатов работы подтверждается 3-5-кратной повторностью экспериментов с применением стандартных методов исследований; использованием современных поверенных приборов и оборудования, имеющих установленный предел отклонений; полученными данными со статистически достоверными различиями (р<0,05), использованием компьютерных программ Statistika-10.0, Microsoft Excel 2007.

Апробация работы

Основные положения работы и результаты исследований доложены и представлены на УШ Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011); IX Международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные продукты питания» (Москва, 2011); Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); XIII Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий» (Тула, 2013); V Международной научно-технической конференции «Безопасность и качество продуктов питания. Наука и образование» (Москва, 2014).

Научная работа отмечена грамотой X Юбилейной международной научно-практической конференции «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» в рамках конференции молодых ученых «Инновационные технологии продуктов здорового питания» (Москва, 2012).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, аналитический обзор литературы, организация эксперимента с описанием материалов и методов исследования, экспериментальная часть с обсуждением результатов исследований, основные заключения по работе, список сокращений и условных обозначений, библиографический список, приложения. Библиографический список содержит 213 источника (в том числе 126 на иностранном языке). Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 41 рисунок и 7 приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложена общая характеристика проблемы создания функциональных продуктов и биологических препаратов с применением пробиотических микроорганизмов, обоснованы актуальность, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследований.

В первой главе «Аналитический обзор литературы» представлен анализ научно-технической литературы, в которой рассмотрены современные тенденции рынка продуктов здорового питания, перспективные направления

исследований в области дальнейшего изучения свойств пробиотических бактерий и особенностей биотехнологии их получения. Показаны возможности использования пробиотиков, способных участвовать в снижении концентрации холестерина, для создания диетических профилактических продуктов питания.

Во второй главе «Организация эксперимента, материалы и методы исследования» дана характеристика объектов исследований, описаны методы исследований, применяемые в работе.

Основные исследования проводили на кафедре «Технология мясных и молочных продуктов» ФГБОУ ВПО «МГУПП», ФГУП «ГосНИИгенетика», ИЛЦ «Биотест», КГКУ «Краевая ветеринарная лаборатория».

В соответствии с целью и задачами работы объектами исследований являлись пробиотические культуры из коллекции МГУПП: Lactobacillus acidophilus АСТ-41 (ВКПМ В-9644); L. acidophilus АСТ-44 (ВКПМ 9647); Lactobacillus acidophilus 887; Lactobacillus fermentum LFM-2 (ВКПМ B-10368); Lactobacillus plantarum ГВИ-1 (ВКПМ 8556); Lactobacillus rhamnosus LC-52GV (ВКПМ B-9475); в качестве контроля использовали музейный штамм Bifidobacterium adolescentis BGV-11 (ВКПМ Ас-1742), новые выделенные штаммы В. bijidum GG-71 и В. bifidum GG-72; созданная пробиотическая композиция и пастеризованный молочно-соковый напиток, обогащенный разработанной пробиотической композицией.

В диссертационной работе были применены: методы генетики (ПЦР, гель-электрофорез, секвенирование); микробиологические методы идентификации микроорганизмов, метод лунок и метод совместного культивирования с тест-культурами для определения антагонистической активности; метод P. Gofek (2007 г.) с использованием культуры клеток кишечника человека СаСо-2для исследования адгезионной способности; метод колориметрического определения концентрации холестерина по методу Златкиса-Зака.

Исследование способности созданной пробиотической композиции регулировать концентрацию холестерина in vivo проводили на базе ФБУН МНИИЭМ имени Габричевского Роспотребнадзора на линии лабораторных мышей SHK. Липиды крови определяли на биохимическом анализаторе САПФИР-400 (TOKYO BOEKI, Япония). Жирные кислоты определяли на газовом хроматографе «Хроматзк-Кристал 5000» (ЗАО СКБ "Хроматэк", РФ).

Определение сроков годности сухой биомассы проводили по МУК 4.2. 1847-04, TP ТС 021/2011; обогащенного пастеризованного молочно-сокового продукта по ГОСТ Р 52687-2006, TP ТС 033/2013.

В соответствии с поставленной целью и задачами исследований была разработана схема организации и проведения исследований, представленная на рис. 1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе «Выделение и изучение новых штаммов. Изучение функциональных свойств пробиотических культур» представлены результаты изучения морфологических, куль тур альных, технологических свойств выделенных штаммов В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72.

У выделенных и коллекционных штаммов исследованы функциональные свойства, в частности антагонистическая активность по отношению к тест-культурам патогенных микроорганизмов, адгезионные свойства, способность к снижению концентрации холестерина в условиях in vitro и in vivo.

Рисунок 1 - Схема проведения экспериментальных исследований

На основании аналитического обзора литературы были отобраны микроорганизмы следующих видов: Bifidobacterium ssp., Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus.

Новые штаммы В. bifidum GG-71 и В. bifldum GG-72 были выделены из фецес здоровых людей, не подвергались генетическому модифицированию, носят природный характер и относятся к группе микроорганизмов, имеющих длительную историю безопасного использования и входящих в перечень

микроорганизмов, рекомендуемых ГОР/ЕРРСА, для создания пробиотических препаратов.

На первом этапе у вновь выделенных культур изучали культуральные, морфологические, тинкториальные и биохимические признаки.

Особенности клеток и колоний изученных штаммов бифидобактерий, выращенных на тиогликолевой питательной среде, представлены на рис. 2 и 3.

В. Ы/гЛит СО-71 В. Ъ'фйит СО-72 В. адо1е$сепП$ ВОУ-11

Рисунок 2 — Микроскопия клеток штаммов бифидобактерий (окраска метиленовым синим, увеличение 900х, световая микроскопия)

В. bifidum GG-71 В. bifidum GG-72 В. adolescentis BGV-11

Рисунок 3 - Колонии штаммов бифидобактерий на полужидкой тиогликолевой питательной среде

Выявлено, что штаммы В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 имели характерные для рода Bifidobacterium культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические характеристики.

Клетки штаммов В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 представляют собой грамположительные, неподвижные, бесспоровые, полиморфные с бифуркациями палочки, располагающиеся одиночно или в группах, клеточная стенка с неравномерными утолщениями. На поверхности плотной питательной среды штаммы образуют круглые, выпуклые с ровными краями колонии диаметром 1-2 мм; молочно-белого цвета, со слегка тянущейся консистенцией и характерным уксусно-кисломолочным запахом.

Выделенные штаммы В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 имеют характерный рост на питательных средах: Блаурокка, тиогликолевая, ГМК-1,

ГМК-2, MRS (с 0,05 % L-цистеина), применяемых для культивирования бифидобактерий.

С целью генетической идентификации штамма В. bifidum GG-72 была проведена амплификация последовательности гена, кодирующего 16S рРНК с помощью консервативных праймеров в ходе ПЦР. Вариабельные участки гена 16S рРНК секвенированы, и получена их нуклеотидная последовательность. Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-П показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: домен Bacteria; отдел Firmicutes; тип Actinobacteria; класс Actinobacteria; подкласс Actinobacteridae; порядок Bifidobacteriales; семейство Bifldobacteriaceae; род Bifidobacterium.

Результаты обработки нуклеотидных последовательностей при помощи компьютерной программы, находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project П), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представлены на рис. 5 в графическом виде. Идентифицируемый штамм обозначен как «uknown».

Bifidobacterium breve (Т); АТСС 157D0

Bifidobacterium subtile (Т); DSM 20096

i-jji j-■Bifidobacterium sagulnl (T); AFB23-1

"■Bifidobacterium longum (T); ATCC 15697

-Bifidobacterium kashlwanohense (T); HM2-2 s--

_i-unknown)

^»Bifidobacterium bifidum (T); KCTC 3202 V.

-Bifidobacterium biavaBI (T); AFB23-4

^ --■Bifidobacterium bourn (T); JCM 1211

-Bifidobacterium thermacidophilum (T); P3-14

■ Bifidobacterium scardovll (T); CCUG 1300a

Рисунок 5 - Филогенетическое древо штамма В. bifidum GG-72 (обозначен «uknown») с гомологичными штаммами бифидобактерий

Установлено, что гомология нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма GG-72 с видом bifidum составляет 98 %, т. е. штамм относится к Bifidobacterium bifidum.

Отнесение штамма GG-72 к В. bifidum носит позитивный характер. Это обосновано принадлежностью вида к индигенным бифид о бактериям желудочно-кишечного тракта человека. Содержание В. bifidum может достигать до 51,9 % от общего объема микрофлоры ЖКТ у грудных детей. Это усиливает нашу уверенность в правильности выбора штамма для дальнейшего изучения с позиций его возможного применения в качестве пробиотического компонента в продуктах питания.

К числу наиболее важных характеристик, которые служат показателем возможности использования штамма микроорганизмов в продуктах диетического лечебного и диетического профилактического питания и БАД являются его пробиотические свойства, к которым относят их способность проявлять антагонистическую активность по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.

Результаты исследований антагонистической активности, представленные на рис. 4(a), свидетельствуют о проявлении выраженной антагонистической активности изученных штаммов по отношению к тест-культуре Е. coli. Следует отметить, что новый штамм В. bifidum GG-72 обладает

таким же выраженным антагонизмом к Е. coli, как и контрольный штамм В. adolescentis BGV-11, эффективность которого ранее подтверждена клиническими испытаниями на животных и людях.

Исследование антагонистической активности штаммов В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 к условно-патогенной тест-культуре S. aureus представлены на рис. 4(6). В данном случае можно говорить о более выраженной антагонистической активности штамма В. bifidum GG-72 - наблюдали уменьшение количества S. aureus более чем на 4 порядка, в то время как штаммы В. bifidum GG-71 и В. adolescentis BGV-11 уменьшали количество патогенного тест-микроорганизма более чем на 3 порядка.

Чтобы исключить влияние органических кислот, синтезируемых бифидобактериями, было определена антагонистическая активность супернатанта культуральной жидкости изучаемых штаммов, предварительно нейтрализованной до pH 7.0. Показано, что супернатанты с нейтрализованной кислотностью обладали антагонистической активностью по отношению к тест-культурам Е. coli и S. aureus. Установленный эффект позволяет сделать заключение о способности изученных пробиотических микроорганизмов к синтезу антибиотико-подобных веществ, что увеличивает ценность их прикладного использования.

оУ л4 \ч

У с/ oöV

а) б)

Рисунок 4 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов В. bifidum GG-71, В. bifidum GG-72 и В. adolescentis BGV-11 к условно-

патогенным штаммам: а) Е. coli 0157:Н7; б) S. aureus 209-Р; контроль - чистая культура; опыт - Е. coli 0157:Н7 или S. aureus 209-Р + штамм бифидобактерий

В результате изучения антагонистических свойств В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 в сравнении с хорошо изученным штаммом В. adolescentis BGV-11 было показано, что количество клеток Е. coli в опытных образцах со всеми штаммами бифидобактерий уменьшалось на 3 порядка. Подавление штаммами бифидобактерий роста S. aureus несколько различалось и было следующим: В. bifidum GG-71 - на 3,6 порядка; В. bifidum GG-72 - на 4,15; В. adolescentis BGV-11 - на 3,3. Установлено, что новые штаммы бифидобактерий обладают выраженной антагонистической активностью по

отношению к Е. coli, S. aureus, поэтому их использовали в дальнейших исследованиях.

Одними из основных показателей качества пробиотических микроорганизмов являются культуральных и фенотипических показатели штаммов, косвенно характеризующие выживаемость клеток в желудочно-кишечном тракте: устойчивость к повышенному уровню солей, кислоты или щелочи, желчи. Сравнение свойств вновь выделенных штаммов проводили в сравнении с коллекционным широко изученным штаммом В. adolescentis BGV-11 (таблица 1), выбранным в качестве эталонной культуры.

Таблица 1 - Показатели, косвенно характеризующие способность штаммов пробиотиков выживать в условиях желудочно-кишечного тракта

Условия Штамм NaCl, % Фенол, % Желчь, % рн

2 4 6,5 0,4 20 40 5,5 7,2 8,3

В. bifidum GG-71 ± - - ± ± - ± + +

В. bifidum GG-72 + - - ± ± - + + +

В. adolescentis BGV-11 + ± - ± ± ± ± + +

Новые выделенные штаммы В. bifidum GG-71 и В. bijidum GG-72 растут в диапазоне рН от 5,5 до 8,3 единиц; устойчивы к концентрации 2 % поваренной соли; 0,4 % фенола и 20 % желчи.

В соответствии с выше представленными данными, штаммы В. bifidum GG-71 и В. bifidum GG-72 проявляли достаточно высокую устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, которые могут влиять на штамм при прохождении клеток через желудочно-кишечный тракт организма человека.

Сравнение изученных свойств, а также оценка динамики роста показала, что штамм В. bifidum GG-72 более технологичен, поэтому его использовали в дальнейших исследованиях.

Далее была проведена экспертиза культуры В. bifidum GG-72 на отсутствие патогенных свойств в отношении лабораторных животных. При применении в рацион лабораторных животных нового штамма В. bifidum GG-72 на протяжении стандартного периода времени не выявило никаких изменений, как в поведении, так и в структуре внутренних органов животных. Новый выделенный штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 не обладает патогенными свойствами (результаты подтверждены справкой).

Таким образом, новый штамм Bifidobacterium bifidum GG-72 обладает ценными свойствами как пробиотик, на основании чего штамм принят на Национальное патентное депонирование во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов в ФГУП «ГосНИИгенетика» с присвоением коллекционного номера Ас-1884, что подтверждено соответствующей справкой и паспортом штамма.

Одним из существенных показателей перспективности пробиотических культур служит их способность закрепляться на клетках кишечника. Косвенным показателем такой способности является адгезия клеток пробиотических культур на клетках СаСо-2, представленная на рис. 6.

Полученные данные о количестве клеток изучаемых штаммов пробиотиков, способных к адгезии к модельным клеткам эпителия кишечника человека СаСо-2, приведены на рис. 7.

)

Рисунок 7 - Количество клеток исследуемых пробиотических штаммов, прикрепленных к эпителиальным клеткам СаСо-2

Уровень адгезии оценивали на основании количества бактериальных клеток, прикрепившихся к 1000 клеток СаСо-2: В. bifidumGG-12, В. adolescentis BGV-11, L. rhamnosus LC-52GV - безопасный «высокий» уровень (от 1010 до 3000 клеток); L. plantarum ГВИ-1, L. fermentum LFM-2, L. acidophilus АСТ-44 -«средний» уровень адгезии (от 210 до 1000 клеток); L. acidophilus АСТ-41, 887 - «низкий» уровень адгезии (от 0 до 200 клеток). Наиболее перспективными являются штаммы, проявляющие «высокий» и «средний» уровень адгезии.

Таким образом, на основании анализа научно-технической литературы и результатов проведенных экспериментальных исследований по изучению культуральных, морфологических, тинкториальных, пробиотических характеристик, адгезионных свойств у вновь выделенных бифидобактерий и у коллекционных штаммов пробиотиков для дальнейшего изучения способности к снижению концентрации холестерина были отобраны: В. adolescentis BGV-11, B.bifidum GG-72, L. acidophilus ACT-44, L. fermentum LFM-2, L. plantarum ГВИ-1, L. rhamnosus LC-52GV.

a) 6)

Рисунок 6 - Прикрепление клеток В. bifidum GG-72 (a) L. acidophilus ACT-44 (6) к клеткам СаСо-2, увеличение 330*, световая микроскопия

Четвертая глава «Изучение способности пробиотических штаммов микроорганизмов к снижению концентрации холестерина»

Перед проведением экспериментов по изучению способности к снижению концентрации холестерина исследуемых штаммов был проверен характер их роста в опытной среде культивирования, содержащей холестерин с эмульгирующим агентом (рис. 8).

Рисунок 8 - Влияние компонентов среды на численность клеток пробиотических штаммов

о

Штамм

*У УУ

Рисунок 9 - Снижение концентрации холестерина в среде культивирования пробиотических штаммов

Анализ полученных результатов позволил сделать заключение об отсутствии отрицательного влияния компонентов среды на численность клеток изучаемых культур. Выявлена различная способность к снижению концентрации холестерина у исследуемых штаммов (рис. 9). Показано, что наибольшей способностью к снижению концентрации холестерина в данных условиях обладали штаммы В. adolescentis BGV-11, В. bifidum GG-72, L. acidophilus АСТ-44, L. fermentum LFM-2, L. plantarum ГВИ-1, L rhamnosus LC-52GV, наименьшей L. acidophilus ACT-41, L. acidophilus 887.

Полученные результаты не противоречат литературным данным [М. Ziarno, 2007 Н. Mahrous, 2011, S. Sieladie, 2011, N. Xie, 2011 и др.] о возможности воздействия пробиотических микроорганизмов на концентрацию

холестерина in vitro через различные механизмы снижения концентрации холестерина.

На основании полученных данных об адгезионных свойствах и способности к снижению концентрации холестерина у изученных культур для создания пробиотической композиции были отобраны следующие штаммы: В. adolescentis BGV-11, В. bifidum GG-72, L. rhamnosus LC-52GV, L. plantarum ГВИ-1, L. fermentum LFM-2, L. acidophilus ACT-44 (рис. 10).

470 1764

Адгезия клеток бактерий / 1000 СаСо-2

Рисунок 10- Сравнительная поверхность снижения концентрации холестерина и адгезии пробиотическими штаммами

Следующим этапом работы являлось изучение возможности усиления целевой активности, снижения концентрации холестерина, у штаммов, отобранных для пробиотической композиции. Известно, что состав питательной среды, условия культивирования, а также фаза развития микроорганизмов влияют на их метаболизм. Однако информации о влиянии перечисленных факторов на способность пробиотиков к снижению концентрации холестерина нами не обнаружено, поэтому на первом этапе сравнивали влияние состава различных питательных сред на проявление штаммами свойства снижения концентрации холестерина. Для лактобактерий были выбраны две основные стандартные питательные среды, широко применяемые в микробиологической практике: М118-бульон и среда для лактобактерий, которые отличаются источниками азота и солями. Показано, что рассматриваемые штаммы проявили наибольшую способность к снижению концентрации холестерина на МЯ8-бульоне. Штамм Ь./егтеШит ЬРМ-2 проявлял практически одинаковую способность к снижению концентрации холестерина как на МЯЗ-бульоне, так и на среде для лактобактерий (таблица 2).

При изучении влияния состава питательных сред на снижение концентрации холестерина штаммами В. adolescentis ВСУ-11, В. Ы/^ит 00-72 использовали следующие питательные среды: МИБ-бульон с добавлением 0,05 % Ь-цистеина, ГМК-2, Блаурокка (таблица 3).

Таблица 2 - Способность штаммов лактобактерий к снижению концентрации холестерина на питательных средах различного состава

Наименование штамма Снижение концентрации холестерина, %

MRS-бульон Среда для лактобактерий

L. rhamnosus LC-52GV 27,4±1,5 23,1±1,8

L. plantarum ГВИ-1 30,61±1,7 19,77±1,4

L.fermentum LFM-2 30,95±1,4 29,97±1,6

L. acidophilus ACT-44 15,99±1,6 12,14±1,6

Анализ результатов показал, что способность к снижению концентрации холестерина у изучаемых штаммов бифидобактерий в большей степени проявлялась при их развитии на среде Блаурокка, содержащей печоночный экстракт.

Таблица 3 - Способность штаммов бифидобактерий к снижению концентрации холестерина на питательных средах различного состава

Наименование штамма Снижение концентрации холестерина, %

MRS-бульон, 0,05 % L-цистеин ГМК-2 Блаурокка

В. adolescentis BGV-11 33,6±1,5 27,4±1,6 39,0±1,5

В. bifidum GG-72 37,6±1,3 25,9±1,5 43,1±1,4

Далее была изучена интенсивность снижения концентрации холестерина штаммами лактобактерий и бифидобактерий в динамике роста культур. Плученные данные представлены на примере штаммов В. 00-72 и

Рисунок 11 - Способность штаммов В. bifidum GG-72 (на среде Блаурокка) (а) и L. plantarum (на среде MRS-бульон) ГВИ-1 (б) к снижению концентрации холестерина в динамике роста культур

Таким образом, была установлена зависимость способности пробиотических штаммов к снижению концентрации холестерина от состава питательной среды и от стадии роста: наибольшая способность отмечалась в конце фазы логарифмического роста(12-14 часов)- начале стационарной фазы.

L. plantarum ГВИ-1 (рис. 11, 12).

Разная интенсивность снижения концентрации холестерина в зависимости от возраста культуры обусловлена различиями в интенсивности метаболизма и, по-видимому, адсорбирующей способности клеточных стенок. Аналогичные данные были получены для других отобранных штаммов пробиотических бактерий.

В результате проведенных исследований определены оптимальные условия культивирования штаммов пробиотических бактерий для максимального проявления способности к снижению концентрации холестерина: по составу питательной среды (для бифидобактерий Блаурокка; для лактобактерий - МИБ-бульон) и режиму культивирования: 37±1 °С с продолжительностью - до начала стационарной фазы роста.

На основе отобранных штаммов пробиотиков были предложены две композиции, потенциально эффективные для снижения концентрации холестерина, обозначенные как «а1» и «Ы» (таблица 4).

Таблица 4 - Состав пробиотических композиций «а1» и «Ь1»

Композиция «а1» Композиция «Ы»

В. adolescentis BGV-11 В. bifidum GG-72

L. acidophilus АСТ-44 L. acidophilus ACT-44

L.fermentum LFM-2 L.fermentum LFM-2

L. plantarum ГВИ-1 L. plantarum ГВИ-1

L. rhamnosus LC-52GV L. rhamnosus LC-52GV

Составленные композиции, кроме способности к снижению концентрации холестерина, характеризуются тем, что включают в себя штаммы, обладающее выраженной антагонистической активностью по отношению к Е. coli и S. aureus и высокой способностью к адгезии к клеткам эпителия кишечника человека.

Для формирования пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, была исследована сочетаемость выбранных штаммов пробиотических бактерий. Результаты исследований приведены на рис. 13.

Рисунок 13 - Совместный рост культур внутри композиций «а1» и «Ы»

Колонии пробиотических штаммов в виде штрихов в зоне их пересечения были равномерны без явных зон ингибирования роста. Установлена возможность их совместного культивирования и объединения в одной пробиотической композиции.

После установления возможности совместного сочетания исследуемых пробиотических штаммов проводили сравнение способности к снижению концентрации холестерина у составленных композиций «а1» и «Ы» (рис. 14).

60 I 50 ~

40 - is 30 - 8 i* 20 J и о ё g ю - <D О 1 * 0 - 1

о «а1» «Ъ1» Композиция пробиотических штаммов

Рисунок 14 - Способность к снижению концентрации холестерина пробиотических композиций «а1» и «Ы»

Выявлено, что в составе композиции штаммы пробиотиков проявляли усиление способности к снижению концентрации холестерина. Более активно проявила себя композиция «Ы», содержащая штамм В. bifidum GG-72.

Исходя из выше указанных данных, можно сделать вывод о наибольшей перспективности для создания препаратов, снижающих концентрацию холестерина композиции «Ы», содержащей штаммы В. bifidum GG-72, L. rhamnosus LC-52GV, L. plantarum ГВИ-1, L.fermentum LFM-2, L. acidophilus ACT-44.

Для проверки параметров культивирования изученных штаммов бифидобактерий и лактобактерий, снижающих концентрацию холестерина, была проведена их выработка в условиях производства.

Результаты подтверждены актом и свидетельствуют о возможности реализации биотехнологии создания пробиотика, обладающего способностью к снижению концентрации холестерина, в производственных условиях.

Результаты исследований, представленные в данной главе, позволили выявить штаммы пробиотиков, которые способны снижать концентрацию холестерина; определить рациональные условия их культивирования и создать пробиотическую композицию, снижающую концентрацию холестерина.

Пятая глава «Изучение показателей качества и возможных путей применения пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина»

Выработанные в производственных условиях образцы сухой биомассы штаммов пробиотиков, вошедших в состав композиции «Ы», были перемешаны в равных пропорциях, герметично упакованы в многослойный

полимерный материал, заложены на хранение при температуре 4±2 °С и минус 18±2 °С. В ходе хранения образцов созданной композиции изучали физико-химические, микробиологические, органолептические показатели, способность композиции к снижению концентрации холестерина и антагонистическую активность к условно-патогенным микроорганизмам.

В таблицах 5, 6 представлены результаты определения показателей качества опытной партии пробиотической композиции с высокой способностью к снижению концентрации холестерина в процессе хранения при разных температурах.

Таблица 5 - Показатели качества пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, при температуре хранения 4±2 °С

Снижение Количество клеток, ^КОЕ/см3 Массовая

Месяц концентрации холестерина, % Бифидобактерии Лактобактерии доля влаги, %

контроль 47,5±0,4 10,12*0,04 10,31±0,03 4,16±0,04

1 46,1 ±0,7 9,75±0,04 10,04±0,06 4,16±0,05

2 44,6±0,5 9,38±0,05 9,66±0,04 4,16±0,05

3 43,4±0,6 9,01±0,04 9,35±0,04 4,16±0,04

4 41,7±0,4 8,69±0,06 8,95±0,03 4,22±0,05

5 40,4±0,4 8,31±0,04 8,65±0,05 4,22±0,04

6 39,8±0,4 8,04±0,03 8,54±0,04 4,22±0,04

Таблица 6 - Показатели качества пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, при температуре хранения минус 18±2 °С

Снижение Количество клеток, ^КОЕ/см' Массовая

Месяц концентрации холестерина, % Бифидобактерии Лактобактерии доля влаги, %

контроль 47,5±0,4 10,12±0,04 10,31±0,03 4,16±0,03

1 47,3±0,7 10,08±0,03 10,27±0,05 4,16±0,04

2 46,9±0,6 9,95±0,05 10,22±0,06 4,16±0,05

3 46,7±0,4 9,85±0,04 10,20±0,04 4,22±0,05

4 46,5±0,6 9,84±0,05 10,17±0,04 4,22±0,04

5 46,3±0,6 9,79±0,02 10,10±0,04 4,22±0,05

6 46,2±0,4 9,76±0,03 10,06±0,05 4,22±0,04

Анализ полученных данных показал, что при хранении пробиотической композиции при температуре 4±2 °С происходило более интенсивное уменьшение количества клеток бифидобактерий - в 120 раз, лактобактерий - в 60 раз, тогда как при хранении при температуре минус 18±2°С наблюдалось небольшое изменение количества клеток бифидобактерий - на половину порядка; количество клеток лактобактерий практически оставалось на исходном уровне. Снижение концентрации холестерина в питательной среде при развитии пробиотической композиции коррелировало со снижением количества клеток бактерий.

Одним из основных показателей функциональной ценности пробиотических культур является антагонистическая активность, результаты изучения которой при хранении представлены на рис. 15.

Контроль До сушки После сушки б мес, 4 °С 6 мес, минус

18 °С

col г S. aitreus

Рисунок 15 - Антагонистическая активность сублимированной пробиотической композиции после 6 месяцев хранения при температурах 4±2 °С и

минус 18±2°С

Способность штаммов к снижению концентрации холестерина и к антагонизму сохраняется лучше при более низкой температуре, что можно объяснить большим количеством оставшихся жизнеспособных клеток пробиотических культур.

Таким образом, был обоснован срок годности пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина: при температурах 4±2 °С - 3 месяца; при температуре минус 18±2 °С - 6 месяцев. В течение всего срока годности пробиотическая композиция по показателям качества и безопасности отвечала требованиям ТР ТС 033/2013.

Для подтверждения проявления у пробиотической композиции способности к снижению концентрации холестерина в условиях ш vivo были проведены исследования на лабораторных животных. Выявлена способность пробиотической композиции снижать концентрацию холестерина в сыворотке крови лабораторных животных следующим образом: средняя концентрация общего холестерина снизилась на 25,8 %, липопротеинов низкой плотности на 17,2%, липопротеинов высокой плотности увеличилась на 7,5%, триглицеридов снизилась на 16,2 %. Концентрация общего холестерина, ЛПНП и триглицеридов приблизилась к их показателям в группе лабораторных животных со стандартной диетой, т. е. к норме. Концентрация ЛПВП увеличилась, что может быть объяснено ускорением метаболизма холестерина в организме лабораторных животных при применении созданной пробиотической композиции.

С целью расширения области применения созданной композиции было предложено использовать ее в технологии производства пастеризованного молочно-сокового напитка в виду повышения спроса среди потребителей на витаминизированные молочные продукты питания.

Были составлены опытные образцы пастеризованного молочно-сокового напитка по разным рецептурам. В состав рецептур вводили обезжиренное молокой яблочный сок. Доля яблочного сока в образцах составляла 10 %, 20 %, 25%, 50% и 0 % в контрольном образце. В состав образцов вводили пробиотическую композицию с таким расчетом, чтобы количество клеток бифидобактерий и лактобактерий составляло не менее 1,0><108 КОЕ/см3.Количество клеток в исходной сухой биомассе пробиотических бактерий составляло Зх Ю10 КОЕ/см3, а после внесения в продукт - 7х 108 КОЕ/см3.

Напиток хранили при температуре 4±2 °С в течение 15 суток. Показатели качества напитка изучали сразу после составления напитка (0 сутки), через 6 суток, 12 суток и 15 суток.

Органолептические показатели пастеризованного молочно-сокового напитка в процессе хранения представлены на рис. 16, на котором видно, что на начальной стадии (0-е сутки) у контрольного и обогащенного пробиотической композицией «Ы» пастеризованного молочно-сокового напитка все органолептические показатели (цвет, запах, вкус и консистенция) не отличались. На 6-е сутки цвет, запах и консистенция контрольного напитка не изменились, в то время как вкус обогащенного напитка приобрел слабо выраженный кислый привкус.

— 0 суток

— 6 суток

— 12 суток

— 15 суток

Общая оценка

тенция

Общая оценка

Консистенция

Рисунок 16- Органолептические показатели пастеризованного молочно-сокового напитка в процессе хранения: а) контроль; б) напиток, обогащенный пробиотической композицией «Ы»

Цвет напитка с пробиотической композицией остался неизменным - белый с легким кремовым оттенком, а консистенция стала более вязкой и немного отличалась от консистенции контрольного напитка. На 15-е сутки у контрольного образца напитка незначительно ухудшились показатели консистенции, вкуса и запаха, в то время как цвет остался неизменным. Показатели обогащенного напитка по сравнению с контролем ухудшались более интенсивно: консистенция стала хлопьевидной, вкус и запах стали кислыми, цвет по-прежнему не изменился. Более интенсивное изменение органолептических показателей в опытном образце подтверждает присутствие жизнеспособных клеток пробиотических бактерий, внесённых при обогащении продукции.

Результаты определения количества клеток бифидобактерий и лактобактерий в пастеризованном молочно-соковом напитке представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Количество клеток бифидобактерий и лактобактерий в пастеризованном молочно-соковом напитке в зависимости от продолжительности хранения

Время хранения, суток Количество клеток, КОЕ/см"

Бифидобакгерии Лактобактерий

0 1,8x10° 7,5x10°

6 1,3x10° 7,1x10°

12 4,0x10' 3,4x10a

Количество бифидобактерий и лактобактерий в пастеризованном молочно-соковом напитке составляло соответственно: от 1,8* 108 до 4,0х107 и от 7,5х108 до 3,8х108 КОЕ/см3, БГКП не содержались в 0,01 см3, что отвечало требованиям TP ТС 033/2013, при нормируемом количестве бифидобактерий не менее 1*10б КОЕ/см3; лактобактерий - не менее 1 х 107 КОЕ/см3.

Результаты изучения показателей качества пастеризованного молочно-сокового напитка, обогащенного новой пробиотической композицией, снижающей концентрацию холестерина, показали, что напиток может храниться в течение 7 суток при температуре 4±2 °С (с учетом коэффициента запаса).

Таким образом, был показан способ практического применения новой пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, в технологии обогащенного пастеризованного молочно-сокового напитка.

Полученные в работе результаты показали эффективность и целесообразность применения созданной пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, в продуктах профилактической направленности.

Основные заключения по работе:

1. Теоретически и экспериментально обоснован состав пробиотической композиции, снижающей концентрацию холестерина, в которую включены следующие штаммы: В. bifidum GG-72, L. acidophilus АСТ-44, L.fermentum LFM-2, L. plantarum ГВИ-1, L. rhamnosus LC-52GV.

2. Выделен и идентифицирован новый безопасный штамм В. bifidum GG-72, обладающий высокой способностью к снижению концентрации холестерина, адгезией к эпителиальным клеткам, выраженной антагонистической активностью по отношению к Escherichia coli 0157:Н7 и Staphylococcus aureus 209-Р. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «ГосНИИгенетика» под номером ВКПМ Ас-1884.

3. Получены новые данные для выделенных и коллекционных штаммов пробиотических бактерий об их адгезии к клеткам кишечника человека in vitro. По количеству адгезионных бактериальных клеток к 1000 клеток кишечника, установлен допустимо высокий уровень адгезии (от 1010 до 3000): L. rhamnosus

LC-52GV (2230), В. bifldum GG-72 (2400); и средний уровень адгезии (от 210 до 1000): L. acidophilus 887 (470), L. acidophilus АСТ-41 (519), L. plantarum ГВИ-1 (749), L.fermentum LFM-2 (840), L. acidophilus ACT-44 (915).

4. Определены условия получения ассоциированного пробиотика на основе штаммов, обладающих исходно высокой способностью к снижению концентрации холестерина: В. bifidum на 37,6 %; L. rhamnosus - LC-52GV на 27,4 %; L. plantarum - ГВИ-1 на 30,6 %; L. fermentum LFM-2 на 29,6 %.

5. Проведена апробация биотехнологии в производственных условиях, что показало возможность ее реализации в промышленности для получения пробиотической композиции с высокой способностью к снижению концентрации холестерина, разработана технологическая инструкция на производство биомассы созданной композиции.

6. Обоснованы сроки годности пробиотика с сохранением показателей качества и способности к снижению концентрации холестерина, при 4±2 °С -3 месяца, при минус 18±2 °С - 6 месяцев.

7. Показана возможность применения созданного препарата для обогащения молочной продукции на примере молочно-сокового напитка. Эффективность применения разработанной пробиотической композиции подтверждена в условиях in vivo на лабораторных животных.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ:

1. Головин, М.А. Новый штамм бифидобактерий как фактор повышения биобезопасности пищевых продуктов питания [Текст] / М.А. Головин, В.И. Ганина // Техника и технологии пищевых производств. - 2012. - № 4. - С. 139-144.

2. Головин, М.А. Низколактозные молочные продукты. Пути получения / Т.Н. Данильчук, В.И. Ганина, М.А. Головин // Молочная промышленность. -2013.-№11.-С. 41—42.

3. Головин, М.А. Холестерин-редуцирующие пробиотические бактерии в молочной продукции / М.Г. Головин, В.И. Ганина, Н.Г. Машенцева // Молочная промышленность. - 2014. - № 5. - С. 46—47.

Публикации в сборниках научных трудов

4. Головин, М.А. Аспекты изучения механизмов биопотенциала бифидобактерий / МГ. Головин, В.И. Ганина, С.Н. Янов // Материалы VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». — М: МГУ lib, 2010. - С. 5-7.

5. Головин, М.А. Бактериоцины бифидобактерий как перспективные биоконсерванты продуктов питания / М.А. Головин, В.И. Ганина // Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М, 2011. - С. 172-173.

6. Головин, М.А. Изучение ингибирующего биопотенциала новых штаммов бифидобактерий по отношению к возбудителям кишечных инфекций / М.А. Головин, В.И. Ганина // Материалы IX Международной научно-

практической конференции «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные продукты питания». - М: МГУПП, 2011. - С. 161-163.

7. Головин, М.А. Биопотенциал пептидов малой молекулярной массы пробиотических микроорганизмов для создания биофармацевтических препаратов / М.А. Головин, В.И. Ганина // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ имени Д.И. Менделеева, 2012. - С. 69 - 70.

8. Головин, М.А. Перспективы получения биомассы холестерин-редуцирующих штаммов пробиотических микроорганизмов в промышленных объемах // М.А. Головин, В.И. Ганина, Е.Ю. Королева // Материалы ХШ Всероссийской научно-технической конференции «Приоритетные направления развития науки и технологий». - М: Изд-во «Инновационные технологии», 2013. - С. 92 - 94.

9. Головин, М.А. Применение холестерин-редуцирующих пробиотических микроорганизмов как безопасный метод снижения уровня холестерина в крови человека / М.А. Головин, В.И. Ганина, И.И. Ионова // Материалы V Международной научно-технической конференции «Безопасность и качество продуктов питания. Наука и образование», часть II. - М: МГУПП, 2014. - С.18-21.

Список сокращений и условных обозначений

Б АД - биологически активная добавка БГКП - бактерии группы кишечных палочек

ВАК РФ - высшая аттестационная комиссия Российской Федерации

ВКПМ — Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

ГОСТ Р 52687-2006 - Национальный стандарт российской федерации

«Продукты кисломолочные, обогащенные бифидобактериями бифидум.

Технические условия»

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИЛЦ - испытательный лабораторный центр

КГКУ - Краевое государственное казенное учреждение

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

МУК 4.2Л847-04 - методические указания «4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-эпидемиологическая оценка

обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов» TP ТС 021/2011 - Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции»

TP ТС 033/2013 - Технический регламент Таможенного союза «О безопасности

молока и молочной продукции»

ФЦП - Федеральная целевая программа

EFFCA - The European Food and Feed Cultures Association

IDF - The International Dairy Federation

Отпечатано 8 "Типографии "Галла-М" Г~7Ты™л" í \ f\ л

Подписано к печати 25.03.2015 г. OALLA Ч_У М Формат 60x84/16. Бумага "офсетная №1" 80 г/м кв. Тираж 120. Заказ 626