Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов

Петров, Леонид Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов"

4845871»

ПЕТРОВ Леонид Николаевич г

Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Л 2 МАЙ

Санкт-Петербург 2011

4845870

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального Медико-Биологического Агентства Российской Федерации

Научный консультант - доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Яковлева Елена Павловна Доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич Доктор биологических наук, профессор Кокряков Владимир Николаевич

Ведущая организация:

ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Роспотребнадзора

Защита состоится 2011 г. в ^ часов на заседании

диссертационного Совета ДМ 001.022.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательский институт Экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

• " " - блиотеке НИИ ЭМСЗО РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

Нежинская Г.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Повышенный интерес к использованию бактериальных пробиотиков в клинической практике - ответ на вызов времени. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в мире от инфекционных заболеваний ежегодно умирают 16-18 млн. человек (Лобзин Ю.В., 2006, Онищенко Г.Г.,2008). На первом месте стоят острые респираторные и кишечные заболевания различной этиологии, в том числе эндогенные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, входящими в составы нормальных микробиоценозов человека. В этих случаях стандартные схемы лечения с использованием антибиотиков не всегда оказываются состоятельными, альтернативой являются препараты, нормализующие микробиоценозы - пробиотики (Шендеров Б.А., 2001). Внимание к пробиотикам также связано с тем, что практически при всех заболеваниях у пациентов наблюдаются дисбактериозы, что объяснимо с позиций медицинской микробной экологии (ММЭ). Показано так же, что одной из причин возникновения не только инфекционных, но и соматических заболеваний человека, являются нарушения микроэкологического его статуса (Уголев A.M. 1991, Шендеров Б.А. 1998, 2000, 2001, Morgan D. 2002, O'Hara, F.Shanahan 2006, Бондаренко В.М. 2007, Ткаченко Е.И., Суворов А.Н. 2007, 2009). Следовательно, для повышения результативности лечебного процесса и придания ему каузального характера, в терапевтические схемы включают бактериальные пробиотики. Но положительный результат наблюдают не всегда (Sullivan A., Nord С.Е., 2005). Такое положение можно объяснить отсутствием научно-обоснованных критериев выбора, как препарата, так и его формы применения, адекватных заболеванию пациента, т. е. выбор пробиотика носит случайный характер, в то время как использование препаратов на основе живых микроорганизмов имеет определенную специфику, которую необходимо учитывать практикующим врачам.

способов его введения, характера заболевания пациента, остроты течения процесса и ряда других причин. Учесть особенности этих взаимодействий можно, имея модель механизма пробиотического действия, которая выявит свойства бактериальных препаратов, предопределяющие их терапевтическую эффективность. Построить молекулярную или молекулярно-клеточную модель такого механизма на современном уровне не представляется возможным из-за сложности взаимодействующих систем. Однако, вполне реально построение феноменологической модели. Для этого необходим анализ экспериментального материала в области популяционной микробиологии чистых и смешанных культур, микробной экологии, структурно-функциональных иммунологических особенностей эпителия слизистых покровов и микробной биотехнологии.

Безусловно, разработка модели пробиотического действия бактериальных препаратов, описывающей механизм восстановления нарушенных микробиоценозов, относится к актуальным задачам медицинской микробной экологии. Такая модель необходима и для разработки критериев выбора бактериального пробиотика в клинической практике и, следовательно, для повышения терапевтической эффективности их использования в лечении заболеваний человека.

В технологии бактериальных препаратов обсуждаемая модель нужна в качестве теоретической основы для целенаправленных разработок новых высокоэффективных пробиотиков для профилактической и клинической медицины.

Настоящая работа выполнена в рамках ряда научно-технических программ, в том числе: федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» по государственному контракту № ГНТД/ГК-055 от 14.01.2000г.; по государственным контрактам № 43.600.14.0055 от 27.01.2003г., № 43.600.11.10484.4 от 18.03.2004г.; программы «Интеграция»; по государственному контракту № 40.003.06.0 от 29.12.2005г. «Разработка иммунобиотиков для повышения эффективности вакцинных препаратов» и по космическим проектам РКК «Энергия» -

«Биоэмульсия» и «Лактолен» (2006-2009 гг.)

Цель работы - Разработка основ повышения эффективности применения бактериальных пробиотиков и биотехнологических подходов к созданию новых препаратов для профилактической и клинической медицины.

Поставленная цель предполагает решение следующих основных задач:

- разработать модель пробиотического действия бактериальных препаратов, которая позволит описать механизм их влияния на измененные микробиоценозы и иммунную систему слизистых;

- обосновать подходы к созданию новых, востребованных медициной бактериальных пробиотических препаратов;

- разработать технологию получения пробиотика с оптимальным составом штаммов, провести полный цикл доклинических исследований пробиотика, получить разрешение на использование и организовать его выпуск;

- сформулировать критерии выбора бактериальных пробиотиков и их форм применения в профилактике и лечении ряда заболеваний (ОРЗ, ОКИ, хеликобактериозов и др.);

- оценить эффективность использования разработанного пробиотика «Витафлор»*' и сформулированных критериев выбора пробиотика и различных его форм в клинических испытаниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективность модели пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает особенности взаимодействия пробиотических штаммов и их метаболитов с микробиоценозами и местной лимфоидной тканью слизистых покровов, для обоснования нового направления в технологии создания новых пробиотиков и для определения критериев выбора пробиотиков в клинической практике.

2. Оригинальность технологии получения бактериального пробиотика на основе симбиотической системы штаммов.

3. Технологии получения различных форм «Симбиотического комплекса ацидофильных бактерий «Витафлор»® и результаты полного цикла их доклинических исследований.

4. Алгоритмы выбора бактериального пробиотика для решения терапевтических задач и положительные результаты их использования в клинической практике.

Научная новизна работы. Впервые разработана модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает их влияние на состав измененных микробиоценозов пациентов и местную лимфоидную ткань слизистых поверхностей. Модель имеет феноменологический характер.

Впервые предложено в качестве активного начала бактериальных препаратов использовать симбиотические системы пробиотических штаммов. Благодаря симбиозу пробиотический потенциал штаммов значительно возрастает, при этом переход бактериального штамма препарата в состояние активного метаболизма меньше зависит от особенностей энтеральных сред пациента и осуществляется в укороченные сроки.

Впервые сформулированы алгоритмы выбора пробиотика для решения терапевтических задач, эффективность использования которых подтверждена клиническими данными.

Научно-практическое значение работы. Сформулированные алгоритмы выбора пробиотиков изложены в пособии для врачей «Теоретические предпосылки и практика клинического применения пробиотика Витафлор в педиатрии» (издательство Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, 2004), в методических рекомендациях «Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения острых кишечных инфекций» (издательство ВМА, Санкт-Петербург, 2009).

Модель позволила показать преимущества использования

симбиотической композиции пробиотических штаммов в качестве

активного начала препаратов. На основе подобранной симбиотической

бикультуры Lactobacillus acidophilus (штаммы Д №75 и Д №76) разработан

новый пробиотик «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»1', производство которого организовано в 1997 году на базе ФГУП «Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА РФ в различных формах и зарегистрированного как БАД.

Научная и практическая значимость полученных результатов подтверждена патентами России на способы получения пробиотика и лечения ряда заболеваний. Как продукт современной биотехнологии, обладающий высокими целевыми характеристиками, «Витафлор»® награжден Дипломом IV международной выставки-конгресса «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (1999) и большой золотой медалью международного фонда биотехнологии им. академика И.Н.Блохиной (2004). Решением Президиума Российской Академии Естественных Наук за разработку и выпуск препарата «Витафлор»® институт награжден Почетной золотой медалью И.И.Мечникова «За практический вклад в укрепление здоровья нации» (2002).

Материалы диссертации использованы в курсе лекций «Бактериальные технологии медицинского и технического назначения» кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института.

Личный вклад автора в проведенные исследования. Работа выполнена на базе ФГУП «Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов» Федерального Медико-Биологического Агентства России (1989 - 2009). Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Автором разработана концепция эффективного применения бактериальных пробиотиков в терапевтической практике, включающая модель механизма их пробиотического действия, алгоритмы выбора пробиотика и используемой формы, а также сформулированы требования к новым пробиотикам. Под руководством диссертанта разработана технология и организовано производство пробиотика «Витафлор»®. В большом объеме работы участие принимали сотрудники института к.б.н. Вербицкая Н.Б., д.б.н. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., к.т.н. Кобатов А.И.,

д.м.н., профессор Добрица В.П., д.м.н., профессор Симбирцев A.C., к.м.н.

Пигарева Н.В., к.м.н. Петров A.B.. Полученные результаты опубликованы, доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу авторов. Соискатель выражает своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы. Основные результаты и положения работы обсуждались в виде пленарных докладов на следующих международных, всесоюзных и всероссийских конференциях и симпозиумах: International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991; International Conference "Biotechnology St. Petersburg 94", St. Petersburg, 1994; Всесоюзная научно-практическая конференция "Дисбактериоз и эубиотики", Москва, 1996; Российская научная конференция «Современная микробиология. Состояние, достижения и перспективы», Санкт-Петербург, 1998; Международная конференция «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека», Москва, 1999; Международная научно-практическая конференция памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние и перспективы использования», Москва, 2002; 5 Российский съезд врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург., 2003; 6, 7, 8, 9, 10 Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург - Гастро» - 2004, -2005, -2006, -2007, -2008; Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» - Москва, 2004; Донозология -2007 Проблемы диагностики и коррекции эндоэкологического статуса в современных условиях, Санкт-Петербург, 2007; Объединительный иммунологический форум, Санкт-Петербург, 2008; Вакцинология 08, Москва, 2008; 6-ая Международная Германо-Российская конференция Форума Кох-Мечников, Санкт-Петербург, 2008, Family Health in the XXI Century, 29 April - 7 May, Eilat, Israel, 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 работы, из них одна монография, два методических пособия для врачей, 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК, 13 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, включающего 3 части, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 175 источников, в том числе 100 на русском и 75 на иностранных языках. Работа содержит 24 таблицы и 20 рисунков. Общий объем работы 260 страницы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В обзоре литературы проведен анализ основных положений микробной медицинской экологии, устойчивости микроэкологических равновесий и последствиям их нарушений, классификация бактериальных пробиотиков, биотехнологические особенности их получения и некоторые элементы механизма их влияния на микроэкологический статус макроорганизма.

Объекты, материалы и методы исследования Объектами служили:

- производственные штаммы различных пробиотиков - Lactobacillus acidophilus Д№75, Lactobacillus acidophilus Д№76, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 21815, Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90T-C4, Lactobacillus acidophilus 126, Escherichia coli M-17, Bifidobacterium adolescentis MC-4;

- музейные штаммы патогенных и УПМ (из коллекции ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Москва - 8 штаммов; из коллекции ГУП НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи , Москва - 43 штамма; из коллекции ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России - 12 штаммов).

- клинические изоляты (54), полученные из клинических лабораторий Санкт-Петербургского НИИ фтизнопульмонологии МЗ РФ, ВМедА, ДГБ №1, НИИДИ, Областной клинической больницы, С.-Петербург, Инфекционной больницы им. С.П.Боткина, С.-Петербург.

Культуры хранили в сублимированном или криоконсервированном

виде.

Лактобациллы выращивали в жидких (обезжиренное молоко, ГМС, МРС-

1) и на плотных (МРС-4, МРС-5) средах. Бифидобактерии выращивали на

среде Блаурока (ФС 42-3947-00 на Бифидумбактерин). Е. coli К-12 и Е.

coli К-165 выращивали на среде NBE (Serva, США) с глюкозой (3 г/л); S. marcescens - на МПБ; S. enteritidis - на среде М-9 с 0,5 г/л глюкозы и 12 мл/л АПБ. Остальные бактерии культивировали на Standart 1 (Nutrient Broth и Standart Nutrient Agar, Serva, США). Дрожжи выращивали на стандартной среде ГРМ № 2 (ФС 42-0054-00 на Лактобактерин). Среды стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 0,5 атм. в течение 30 мин.

Спектры мутности регистрировали на 2-5 длинах волн в диапазоне 460-620 нм (СФ-46 с диафрагмой для уменьшения малоуглового рассеяния). Диаметр колоний измеряли при помощи программы "ВидеоТесТ-Морфо 3.2".

Соотношение штаммов L. acidophilus Д №75 и Д №76 в структуре популяции Витафлор® определяли по оригинальной методике. На 5-10 чашек со средой МРС-5 наносили по 0,1 мл бактериальной суспензии, содержащей 200-500 КОЕ/мл, растирали шпателем и инкубировали при 37°С в течение 48 часов. После этого каждую индивидуальную колонию с чашек переносили в стерильное обезжиренное молоко, предварительно разлитое в полистироловые 96-ячеечные планшеты. Исследованию подвергали не менее 200 колоний, контролем служили рабочие культуры производственных штаммов. Посевы культивировали 18-20 часов при 37°С, после чего охлаждали 2-3 часа при 4-6°С. Штаммы дифференцировали по характеру сгустка в молоке.

Антагонистическую активность лактобацилл определяли стандартным методом перпендикулярных штрихов на среде МРС-5. Учет результатов производили по величине зоны задержки антагонистом роста тест-культур (мм). Кислотообразование лактобацилл определяли титрометрическим методом. Активности стимуляторов роста определяли по способности инициировать рост E.coli М-17 при низких (50-50000 кл/мл) плотностях засева и по изменению скорости роста культур.

Хроматографию ФНМ проводили на сефадексах G-10, G-25 и TSK-

геле HW-40. Градиентную гидрофобную хроматографию осуществляли на

колонке "Labar" (24x1 см). Для ионообменной хроматографии

использовали сорбенты Dowex AG, 50WX2 и Dowex 1x2. Препаративную

хроматографию среднего давления и хроматографию высокого давления проводили на колонках с обращенной фазой (Partisil 10 ODS-3, Whatman, 8x250 мм, хроматограф Hewlett Packard HP 1090) в воде с градиентом ацетонитрила.

Спектры 'Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker СХР 300 (100-300 накоплений) в D20. УФ-спектры - на спектрофотометре Hitachi-330, масс-спектры - на приборе ММ 7070 HS (VG) в режиме FAB MS с ионизацией атомами аргона (8 кВ). Для аминокислотного анализа использовали AccQ-Tag Method анализа флуоресцирующих производных и метод анализа DABS-производных аминокислот. Разделение осуществляли на приборе HP 1090 (колонка Waters Delta Рак (Millipore) 3,9x150 мм с октадецилсиликагелем).

В иммунологические исследования брали мышей линий (СВАХ C57BL/6) F1 весом 18-20 г, полученных из питомника «Рапполово». Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20-22° С и 12 часовом световом режиме, со свободным доступом к воде. «Витафлор»® и плацебо в различных дозах вводили мышам per os (по 0,2 мл) в течение 5 или 10 дней (растворитель - дистиллированная вода). За 5 суток до последнего введения пробиотика животных иммунизировали эритроцитами барана (2x106 кл./мышь, внутривенно) или овальбумином (20 мкг/мышь, внутрибрюшинно). Через 3 суток мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации, получали сыворотку крови, лаваж перитонеальной полости, клетки тимуса и селезенки. Изучали лейкоцитоз, формулу крови, фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в отношении пекарских дрожжей, реакцию бласттрансформации тимоцитов и спленоцитов с использованием конканавалина А (КонА). Интенсивность пролиферации определяли по включению 3Н-тимидина, используя жидкостный сцинтилляционный счетчик Rackbeta 1217 (Wallac). Продукцию ИЛ-2 спленоцитами мышей, стимулированную КонА, определяли с помощью ИЛ-2-зависимой клеточной линии CTLL-2 (Gillis S. et al., 1982). Количество антителообразующих клеток определяли

в селезенке (Cunningham A.J., Szenberg А., 1968), а титр антител - в сыворотке крови (Рекомендации по доклиническим исследованиям, 2000).

Токсикологические исследования проведены на белых беспородных крысах, мышах и собаках обоего пола, которые получали пробиотик в широком интервале доз. Исследовали: ректальную температуру, вес тела, потребление воды и пищи, состояние слизистых оболочек глаз по анализу роговичных рефлексов, величине зрачка и ширине глазной щели, физиологические показатели (спонтанная двигательная активность - тест «открытое поле», суммационной способности ЦНС, электрокардиографию, измерение систолического артериального давления), нагрузочные пробы с феноловым красным (тестирование секреторной функции почек) и гексеналовая проба (тестирование антитоксической функции печени) до начала введения пробиотика, на 30-й и 90-й день. Исследования включали гематологические характеристики, биохимию сыворотки крови, коагулограмму, анализ мочи и кала. Патоморфологическое исследование (некропсия, макроскопия, взвешивание и гистологическое исследование внутренних органов) проведено у всех животных в конце исследования.

Фармакологическая активность «Витафлора» в дозах 20 мкг/кг оценивалась с использованием моделей резерпинового язвенного поражения кишечника (резерпин в дозе 2 мкг/кг вводили внутрибрюшинно 1 раз в сутки в течение 3 дней) и дисбактериоза при свинцовой интоксикации (ацетат свинца в дозе 0,3 мг/кг вводили крысам внутрижелудочно 1 раз в сутки в течение 2 месяцев). В первом случае проводили макроскопический анализ слизистой кишечника и оценивали общее состояние животных (поведенческие реакции, массу тела, потребление пищи, состояние волосяного покрова), во втором -исследовали микрофлору кала.

Процесс получения сухой формы симбиотического пробиотика «Витафлор» проводили на сублимационной установке ТГ-50 («Хох вакуум», Германия). Оптимизировали условия хранения и реактивации производственных штаммов; состав среды и условия культивирования, состав защитной среды, концентрации антиоксиданта, температуру, при

которой осуществляется приготовление, время эквилибрации; режим сублимационного высушивания, условия предварительного замораживания, и последующего досушивания, получение конечной формы препарата. Контроль различных форм пробиотика осуществляли в соответствии с разработанными требованиями ТУ9197-003-00479741-06.

Все экспериментальные данные обрабатывали статистически, используя параметрические и непараметрические критерии достоверности. Повторность всех экспериментов составляла не менее 3-х раз.

Результаты исследования и их обсуждение. На резерпиновой модели язвенной болезни у крыс показана роль нагивных бактериальных клеток «Витафлор» и их метаболитов в проявлении лечебного действия пробиотика. Установлено, что наиболее эффективным является препарат, содержащий жизнеспособные бактериальные клетки пробиотика, фильтрат культуральной жидкости, включающий весь спектр метаболитов, и «Актофлор-С» - синтетический аналог фракции низкомолекулярных метаболитов оказались менее активными, по сравнению с «Витафлором» (рис.1). В группе контроля (крысы не получали пробиотик) животные становились вялыми, отказывались от пищи, масса их тела к 7 суткам составляла 65% от массы тела интактных животных. На 3 сутки при макроскопическом исследовании слизистой кишечника отмечались гиперемия, иногда синюшность, отек и нарушение нормального расположения желудочных складок и кишечных крипт. Дефекты слизистой, вызванные резерпином, были овальной формы и располагались в железистой части по верхушкам складок или между ними. Наиболее значительные нарушения слизистой кишечника наблюдались на 7 сутки (слизистая гиперемирована, покрыта сгустками крови, складки ее сглажены; на железистой части - язвенные дефекты в количестве 44±3 диаметром от 2 до 5 мм). К 20 суткам у трети крыс отмечалось восстановление слизистой, у остальных наблюдались язвы диаметром 1 мм (среднее их число 10±2).Состояние животных значительно улучшалось при лечении резерпиновых язв «Витафлором»: масса их тела прогрессивно

нарастала (на 20 сутки она была на 30% выше, чем в контроле). На 3 и 7 сутки по данным макроскопии слизистая кишечника имела характерные повреждения, возникающие после введения резерпина, но уменьшалась тяжесть поражения: число язвенных дефектов на 3 сутки составляло 5±1 и на 7 сутки 3±1. К 10 суткам у большинства крыс слизистая желудка не имела видимых изменений.

и so п

1 6 11 16 21 Сутеи лечения

Рис.1. Количество резерпиновых язвенных дефектов в кишечнике крыс, получавшим «Витафлор», фильтрат культуральной жидкости или «Акгофлор-С».

Назначение фильтрата бактериального препарата или «Актофлора-С» приводило к снижению средней массы тела крыс на 7 сутки лечения (150±5 г), однако к 20 суткам прибавка массы была на 15 % выше, чем у контрольных животных. Макроскопические характеристики слизистой аналогичны контролю, но резко отличались по степени выраженности поражений (среднее число деструкций на 3 сутки равнялось 14±2, а на 7 сутки - 10±2). Однако, несмотря на резкое уменьшение числа деструкций, ускорения заживления язв не наступало. На 20 сутки у половины животных слизистая оставалась гиперемированной.

Таким образом, положительное влияние на макроорганизм в большей степени оказывают жизнеспособные бактериальные клетки

препарата. При этом в реализации эффекта пробиотиков значительную роль играют продукты метаболизма производственного штамма и действие, в основном, связано с низкомолекулярной их фракцией. Поэтому при описании механизма влияния бактериальных пробиотиков на макроорганизм, необходимо учитывать взаимодействия как бактериальных клеток препарата, так и их метаболитов с эпителием слизистой, микробиоценозами и с местной лимфоидной тканью. Замещение микроорганизмов в составах микробиоценозов на штамм препарата при приеме пробиотика маловероятно.

При приеме пробиотика бактериальные клетки препарата во внутренних средах организма переходят из анабиоза в стадию активного метаболизма. Следовательно, в модели пробиотического действия обсуждаемых препаратов взаимодействия можно рассмотреть в отдельности на трех уровнях: на процесс восстановления составов нормальных микробиоценозов метаболитами пробиотика, на иммуномодуляцию местной лимфоидной ткани слизистых бактериальными клетками пробиотика и их метаболитами и на нейромодуляцию метаболитами пробиотика.

Для понимания механизмов восстановления составов микробиоценозов под действием метаболитов бактериального пробиотика были выделены и охарактеризованы современными физико-химическими и микробиологическими методами метаболиты, накапливающиеся в среде при культивировании или при голодании пробиотической культуры Е. coli М-17. Наибольший интерес представляла низкомолекулярная их фракция (ФНМ), выделенная ультрафильтрацией (молекулярная масса менее 1500 Д). Анализ её состава с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, двумерной тонкослойной хроматографии, масс-спектрометрии, спектральных и резонансных методов показал, что она состоит из соединений различной природы (табл.1) и отличается выраженной биологической активностью. При добавлении в определенных концентрациях ФНМ в среду культивирования продуцента или других бактерий наблюдается сокращение лаг-фазы и повышение скорости роста (табл.2).

Таблица 1. Состав ФНМ в культуральной среде E.coli М-17

Метод анализа Компонент Концентрация, мМ

Рост Голодание

Ацетат 13,50 0,88

Формиат 3,50 0,7

1Н-ЯМР Лактат 4,80 0,20

Сукцинат 0,37 1,02

Алании 0,27 0,22

Валин 0,64 0,15

Глутамат 0,14 0,11

Глицин 0,16 0,27

Метионин 0,03 0,02

Изолейцин 0,05 0,07

Лейцин 0,02 0,12

Фенилаланин 0,01 0,05

Аминокислотный анализ Аспартат 0,06 0,09

Треонин 0,16 0,06

Серин 0,36 0,05

Гистидин 0,06 0,01

Аргинин - 0,01

Цистеин - 0,01

Лизин 0,02 0,04

УФ Нуклеотиды 0,10 0,17

фолиевая к-та 2,26x10"3 3,12хЮ"4

Флуоресценция Триптофан 9,78х 10"7 1,30x10"6

Рибофлавин 1,76хЮ"6 4,79x10"7

Примечание. Погрешности при определении состава зависели от метода анализа, но не превышали 20% от измеряемой величины.

Высокие концентрации ФНМ действовали противоположным образом, то есть подавляли рост бактерий. Соответствующие зависимости «доза - эффект» имели вид кривых с выраженным максимумом, что

свидетельствует о регуляторном характере воздействия. Надо отметить, что реакции бактериальных культур на добавление в среду роста ФНМ характеризуются специфичностью (табл. 2). Максимальные значения стимуляции роста культур при низких концентрациях ФНМ наблюдали в экспериментах со штаммом-продуцентом метаболитов, несколько меньшие значения - с родственными микроорганизмами и еще более низкие - с видами бактерий, не характерными для составов микробиоценозов, в которые обычно входит продуцент.

Таблица 2. Влияние ФНМ на рост чистых культур микроорганизмов

Концентрация ФНМ, мг/мл Индексы стимуляции (ИС)

E.coli М-П E.coli К-12 S. enteritidis S.marcescens B.adolescentis

0(контроль) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

0,125 3,4+0,3 2,7±0,3 1,7±0,3 — 1,0±0,1

0,25 5,6 ±0,5 3,9 ±0,4 2,0+0,2 2,4±0,2 —

0,5 5,8+0,5 4,0±0,4 2,5±0,3 2,7±0,3 2,0±0,2

1,0 5,7 ±0,5 2,6±0,3 1,3+0,2 1,1 ±0,2 5,0±1,0

2,0 4,2±0,4 0,9±0,5 0,8±0,05 0,75±0,05 11,0±2,0

Примечание. Индекс стимуляции определялся как отношение приростов биомассы за контрольный срок в культурах с добавлением и без добавления ФНМ

В опытах с E.coli М-17 это касается, например, бактерий Salmonella enteritidis и Serratia marcescens. Высокие дозы ФНМ, напротив, прежде подавляли рост других штаммов, а затем и собственно продуцента. При изучении роста бактериальных клеток в смешанных культурах пробиотических и других (патогенных или условно патогенных) штаммов показано, что добавление ФНМ приводит к увеличению процентного содержания клеток пробиотика и подавлению роста бактерий-конкурентов, то есть происходит вытеснение последних. Такое действие ФНМ объясняется тем, что состав входящих в нее карбоновых кислот оказался близок к составу кислот, выделяемых совокупностью других представителей нормофлоры (лактобацилл, бифидобактерий, бактероидов и др.), и составу соответствующих кислот в энтеральных средах кишечника человека. В последнем случае, однако, присутствуют некоторые компоненты, не содержащиеся в ФНМ Е. coli М-17 (например,

масляная кислота). Добавление ФНМ в определенных концентрациях благоприятствует развитию пробиотических штаммов и повышает их антагонистическую активность по отношению к штаммам-конкурентам. Таким образом, восстановление нормального состава микробиоценозов пробиотиками можно представить так: при энтеральном приеме пробиотика бактериальные клетки препарата попадают во внутренние среды, обеспечивающие их развитие и выделение метаболитов, которые способствуют увеличению численности резидентной микрофлоры, близкой по своему экологическому статусу штамму пробиотика. В результате резидентная бифидо- и лактофлора в составе измененных биоценозов под действием низкомолекулярных метаболитов пробиотика переходит в интенсивную фазу развития и, имея селективные преимущества, снижает численность УПМ до физиологической нормы.

Этому эффекту способствует наличие муцинового слоя, который представляет диффузионный барьер для высокомолекулярных соединений и прозрачен для биологически активных низкомолекулярных продуктов. Высказанное предположение косвенно подтверждается тем, что созданный нами синтетический препарат «Актофлор-С» - аналог фракции низкомолекулярных метаболитов по содержанию компонентов и их взаимному соотношению, проявляет свойства, характерные для пробиотиков, как в серии доклинических экспериментов (рис.1), так и в клинических исследованиях. В восстановлении составов микробиоценозов участвуют и продукты жизнедеятельности пробиотического штамма, ответственные за его антагонизм к другим микроорганизмам. Чрезвычайно важно наличие антагонизма пробиотика к конкретному возбудителю заболевания и отсутствие его к. полезной микрофлоре пациента, а последняя не подавляет активность штамма препарата. Эти принципиальные для реализации пробиотического эффекта данные могут быть получены стандартными методами в условиях клинических лабораторий.

Второй уровень механизма пробиотического действия

бактериальных препаратов рассмотрен, опираясь на появившиеся

публикации. В иммуномодуляции местной лимфоидной ткани участвуют

как микробные метаболиты, способные индуцировать синтез дефенсинов клетками Панета и синтез интерлейкина-8 (IL8) в эпителеоцитах, так и нативные бактериальные клетки, которые непосредственно взаимодействуют с MALT (Hart A.L., 2004, Sansonetti P. 2004, D. Kelly et al., 2005, O'Hara and F.Shanahan, 2006). Влияние бактерий пробиотика носит штаммовый характер, что является аргументом в пользу необходимости выбора пробиотика. Во всех случаях, учитывая, что захват из полости клеток пробиотика дендритными или М-клетками осуществляется пассивно, для наблюдения иммуномодулирующего эффекта, необходимо создание высокой плотности клеток препарата на участке слизистой (которая может создаваться при использовании подходящей формы пробиотика).

МАЛТ

Энтсральная среда пациента

Бактериальный щгамм препарата состояние активного ыегаболшыа

МК ДК i

нмлуиный ответ

КН

эк I

ИЛ-8

Бактериальные Мехаба'тты клетки HM ВМ

Антагонгом ПМ и УИМ

Измененный мпкробиоценоз

i .

Нормальный ыпкробиоцено?

"Сенсорные нервные Окмгитшя на уровне . швистой

Рис. 2. Схематическое представление феноменологической модели пробиотического действия бактериальных препаратов (МАЛТ-мукозоассоциированная лимфоидная ткань, МК, ДК, КП и ЭК - М-, дендритные, Панета и эпителиальные клетки; НМ и ВМ - низко и высокомолекулярные метаболиты, Д- дефенсины, ИЛ-8 - интерлейкин 8.

И, наконец, третий уровень механизма влияния бактериальных пробиотиков на макроорганизм, т.е. осуществление нейромодуляции, практически не исследован. Значение обсуждаемого эффекта предстоит понять и оценить в будущем, однако среди метаболитов пробиотиков (табл.1) присутствуют соединения, которые относятся к нейромодуляторам. Схематично модель представлена на рис.2.

Модель пробиотического действия бактериальных препаратов использована для обоснования нового направление в создании пробиотиков повышенного терапевтического потенциала. Согласно модели положительный эффект наблюдается при переходе бактериального штамма в энтеральных средах пациента из анабиоза в состояние активного метаболизма. Ппи этом очевидно, что внутренние среды пациента, состав которых зависит от характера заболевания, тяжести его течения и индивидуальных особенностей, могут не подходить для развития пробиотического штамма. Именно по этой причине моноштаммовые пробиотики часто оказываются не эффективными. Свои недостатки имеют и полиштаммовые пробиотики. Согласно закономерностям экологии, у бактерий, развивающихся в пределах одной экологической ниши, возникает конкуренция за ресурсы внешней среды (Громов Б.В., Павленко Г.В, 1989). В результате в полиштаммовых пробиотиках активность штаммов направлена на реализацию конкурентных отношений друг с другом. При этом неясно, какой из штаммов будет доминировать в организме конкретного пациента, следствием чего является поливариантность терапевтического действия препарата.

Перечисленных недостатков лишена симбиотическая культура

микроорганизмов мутуалистического типа, т.е. сообщество штаммов,

взаимно полезных друг другу (Пиневич A.B., 2009). Как следствие

пробиотические характеристики штаммов (жизнеспособность, уровни и

спектр антагонизма, устойчивость к антибиотикам и т.д.) возрастают, а

система в целом приобретает повышенный адаптационный потенциал к

неблагоприятным факторам среды обитания (Заварзин Г.А., Колотилова

H.H., 2001), в том числе и к условиям реактивации. Это означает, что

помимо прочих преимуществ, полезные свойства пробиотика на основе

симбиотических культур меньше зависят от индивидуальных особенностей макроорганизма.

Искусственная симбиотическая система, основа нового пробиотика, создана на основе первичного скрининга штаммов ацидофильных лактобацилл (L.acidophilus), выделенных от здоровых детей первого года жизни. Использование штаммов, полученных от детей, было продиктовано желанием получить пробиотик, не проявляющий антагонизм к нормальной микрофлоре человека. Далее методом подбора количества и соотношения штаммов при засеве получали полиштаммовые культуры и изучали их биологические, пробиотические и технологические свойства. В итоге получена бикультура L.acidophilus с экспериментально подтвержденными эффектами синтрофии и синергизма ряда свойств (титр, уровень и спектр антагонизма, устойчивость к антибиотикам и технологическим стрессам) (патент 2170023 РФ, 1997) и на её основе разработана технология получения нового пробиотика «Витафлор»®.

Принципиальным требованием к симбиотической культуре, используемой в качестве основы пробиотика, является её стабильность. Показано, что структура популяции «Витафлор» сохраняется на протяжении значительного числа генераций (табл.3) и мало меняется на стадиях выращивания и получения сухого пробиотика (табл.4). При использовании сублимированного пробиотика в качестве инокулята, двухштаммовая формула сохраняется (табл.5) в широком диапазоне величин засева. Представленные данные свидетельствуют об устойчивости симбиоза штаммов «Витафлор»®. Штаммы симбиотической культуры «Витафлор»® идентифицированы до вида по фено- и генотипическим признакам. Свойства как моноштаммов, так и симбиотической культуры (уровни и спектр антагонистической активности в отношении стандартных референс-культур S.flexneri 331, S. flexneri 170,Е. coli 0157, S. sonnae 5063, P. vulgaris 177, S. aureus 209, рекомендованных ГИСК им. JI.А. Тарасевича), удовлетворяют требованиям, предъявляемым к производственным штаммам пробиотиков. «Витафлор»® проявляет выраженный антагонизм к клиническим изолятам

S. flexneri, Н. pylori, Е. coli, S. aureus, К. pneumonia, С. freundii, С. albicans.

Анализ антибиотикограмм показал, что в случае разной устойчивости моноштаммов к антибиотику (тетрациклин, ванкомицин, нетилмицин, левомицетин) симбиотическая культура приобретает свойства наиболее устойчивого штамма, а при одинаковой устойчивости моноштаммов симбиотическая культура характеризуется тем же уровнем (офлоксацин, циплофлоксацин, амикацин, гентамицин, цефтазидим и др.). Штаммы по данным молекулярно-генетического анализа имеют хромосомную устойчивость к антибиотикам (не содержат плазмид).

Таблица 3. Структура популяции симбиотической культуры «Витафлор»® в зависимости от числа генераций

Процентное Число генераций (п)

содержание 0 5 15 25

Штамма

Д-75 31±4 29±4 35±5 4 0±6

Д-76 69±4 71±4 65±5 60±6

Таблица 4. Структура популяции симбиотической культуры «Витафлор»® на стадии производства.

Штамм Ь. аайоркИт Процентное содержание штамма

инокулят производственная культура сухой препарат

Д №75 33±4 25±5 25±5

Д №76 66±5 74±5 74±5

Таблица 5. Структура популяции лактобацилл в зависимости от величины засева сублимированным пробиотиком «Витафлор»®

Процентное содержание штамма Инокулят (реги драгированный препарат) Величина засева

1 % (5х106 КОЕ/мл) 0,1 % (5x105 КОЕ/мл) 0,01 % (5х104 КОЕ/мл)

Д-75 25±4 44 ±5 60±5 69±7

Д-76 75±4 56±5 40±5 31 ±7

Исследование острой и подострой токсичности различных форм «Витафлора»* при введении их per os крысам и собакам показали хорошую переносимость препарата и отсутствие токсического действия на организм, свидетельствуя о безвредности препарата даже в дозах в сотни и тысячи раз превышающих максимальные терапевтические дозы (10 мг/кг). Результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными в постинтоксикационный период острого отравления, а также данные некропсии позволяют отнести все формы «Витафлора»® к V классу нетоксичных лекарственных веществ. На модели дисбактериоза у белых крыс, вызванном внутрижелудочным введением ацетата свинца, установлено, что «Витафлор»® оказывает нормализующее влияние на микрофлору кишечника.

Производство пробиотика «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»®, зарегистрированного как БАД в следующих формах: лиофилизат биомассы в пенициллиновых флаконах, лингвальные таблетки и «Витафлор®-сырье» - порошок лиофилизированной биомассы (6 патентов РФ 1997-2002) организовано в 1997 году на базе ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России. Лиофилизат биомассы в пенициллиновых флаконах (230±10 мг в 1 флаконе) содержит не менее 100 млн жизнеспособных клеток, аскорбиновую кислоту (витамин С), молоко сухое обезжиренное, сахарозу, желатин пищевой, автолизат пекарских дрожжей, лукаротин (13-каротин). Эту форму применяют в виде водной суспензии перорально, интраназально, интравагинально, ректально (в виде микроклизм), а также местно.

Инновационной формой являются пористые быстрорастворимые (лингвальные) таблетки, полученные методом «сублимационного формования» (ПМ № 14514 РФ, патент №2169574 РФ), характеризующиеся высокоразвитой поверхностью (объем пор составляет более 50% объема таблетки) (рис.3).

Форма «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор®-сырье», предназначена для обогащения кисломолочных пищевых продуктов и производства биологически активных добавок.

Кисломолочную форму «Витафлор»® получают ферментацией молока содержимым флакона, пористой таблеткой или порошка. Эта форма содержит высокий титр бактериальных клеток пробиотика в физиологически активном состоянии, с повышенной устойчивостью к действию агрессивных факторов среды. «Витафлор"-сырье» используется для изготовления суппозиториев, саше, капсул кишечного и желудочного

растворения. Биологическая активность капсулы (масса - 350±10 мг)

составляет не менее 10 КОЕ. Основой суппозиториев служит синтетический продукт витепсол (твердый раствор триглицеридов), биологическая активность суппозиториев не менее 5 хЮ8КОЕ.

Рис.3 Сканограмма скола лингвальной таблетки «Витафлор»

Эффективность использования пробиотиков зависит от

обоснованности выбора типа препарата и его формы применения в каждом

клиническом случае. Анализ модели пробиотического действия

бактериальных препаратов позволяет сформулировать критерии выбора.

Безусловно важным критерием выбора являются содержание

жизнеспособных клеток в 1 дозе препарата. Этот критерии тесно связан с

другим - возможностью перехода пробиотического штамма в состояние

активного метаболизма в энтеральных средах пациента. Следующие

критерии определяются спектром антагонистической активности штамма

пробиотика. Так пробиотик должен проявлять выраженный антагонизм к

этиологическим агентам, вызвавшим заболевание или определяющим

тяжесть его течения, одновременно необходима устойчивость к

контрантагонизму этих агентов и биосовместимость пробиотика с

нормальной микрофлорой пациента. И, безусловно, наличие

иммуномодулирующей активности у пробиотика и информация о её

особенностях, являющихся характеристикой штамма препарата, могут рассматриваться как критерии выбора.

Если о содержании (титре) в препарате жизнеспособных бактериальных клеток указываются производителем, то вероятность перехода штамма препарата в энтеральных средах пациента в состояние активного метаболизма может быть оценена из анализа свойств штамма, но в первом приближении она пропорциональна титру. Преимущества по этим характеристикам имеют пробиотики на основе симбиотических композиций штаммов, т.е. «Витафлор». Другие критерии, связанные с антагонизмом, имеют строгую штаммовую принадлежность и могут быть определены только в исследованиях in vitro в клинических лабораториях.

Критерии выбора, учитывающие влияние пробиотиков на иммунную систему, пока не могут быть сформулированы, так как отсутствуют сравнительные исследования различных пробиотиков на одних иммунологических моделях. Так установлено, что «Витафлор» увеличение содержания IgA в составе энтеральных сред и обладает адъювантными свойствами, усиливая действие белковых (овальбумин) и корпускулярных (эритроциты барана) антигенов. Но, эта информация не означает, что аналогичными свойствами не обладают, или обладают другие пробиотики. Только после накопления сравнительного экспериментального материала можно будет сформулировать этот критерий. Вместе с тем, для наблюдения иммуномодуляции необходимо создание повышенной концентрации клеток пробиотика на участке слизистой путем использования соответствующей формы пробиотика. Этот пример показывает, что помимо выбора пробиотика по микробиологическим характеристикам, чрезвычайно важен выбор адекватной формы применения, позволяющей реализацию возможностей препарата. В зависимости от характера заболевания, его тяжести и задачи, решаемой врачом, форму применения пробиотика подбирают исходя из общих представлений, желаемом месте локализации пробиотика на слизистой и т.д. Пробиотики длительного срока хранения выпускают в следующих формах: лиофилизат биомассы во флаконах или ампулах, в

капсулах, в ректальных или вагинальных суппозиториях, прессованных таблетках. В ряде клинических случаев эффективной формой является продукт на основе молока, ферментированного пробиотиком. Инновационной формой являются пористые таблетки лингвального применения.

Таким образом, алгоритм выбора пробиотика для конкретного клинического применения основан на анализе жизнеспособности содержащегося в его составе штамма, его пробиотических характеристик, определенных in vitro, а также подбора соответствующей формы препарата.

Так, в педиатрии остро стоит проблема подверженности детей

частым простудным заболеваниям (от 2 до 11 раз в год), которые нередко

сопровождаются аллергическими проявлениями и осложнениями со

стороны JIOP-органов. Заболевания проходят под диагнозом ОРВИ и

стандартные схемы лечения (с использованием антибиотиков) не всегда

оказываются состоятельными. При хроническом воспалительном процессе

в носоглотке присутствуют стафилококки, стрептококки, аденовирусная

инфекция, что поддерживает рецидивирующие воспалительные процессы.

Хронизация носоглоточных болезней происходит на фоне местных и

системных иммунодефицитов. Все это приводит к необходимости

включения в терапевтические схемы пробиотиков. Выбор оптимального

пробиотика для этих пациентов нами базировался на сравнительном

анализе трех пробиотиков -«Бифидумбактерина» (В. bifidum №1),

«Лактобактерина» (L. plantarum SP-A3) и «Витафлора»® (L. acidophilus

Д№75 и Д№76). Определение спектра и уровня антагонистической

активности производственных штаммов пробиотиков к стафилококкам (9

тест-культур), стрепто-, пепто-, микро- и криптококкам (5 тест-культур) и

псевдомонадам (9 тест-культур) показали, что максимальным

антагонизмом обладали штаммы «Витафлора»®, а минимальным -

«Бифидумбактерина». Поэтому, для клинического использования был

выбран «Витафлор»®. Пробиотик применяли лингвально (в форме

пористой таблетки) или интраназально в виде концентрированной водной

суспензии. При этом способе применения создаются условия для

непосредственного контакта штамма препарата с возбудителем инфекции, а высокие локальные концентрации бактериальных клеток повышают вероятность осуществления местной иммуномодуляции. Клинические исследования подтвердили обоснованность использования алгоритма выбора пробиотика и его формы. Так, у 45 детей в возрасте от 2 до 8 лет с рецидивирующими, респираторными заболеваниям и аллергической энтеропатией проведен 3-х недельный курс «Витафлора»* на фоне стандартной терапии и отмечена положительная динамика. Повторные заболевания носоглотки стали редкими и возникали не чаще 1-2 раза в год, при этом течение болезни протекало без повышения температуры, и были непродолжительными.

На представительной группе исследованных (450 волонтеров) показано, что при интраназалыюм применении «Витафлора»® значительно снижается доля назофарингиального носительства (табл.6). Одновременно с нормализацией микроэкологии происходит активация индукторного звена местного иммунитета. На фоне предварительного трехдневного интраназального применения суспензии «Витафлор»* значительно повышается эффективность гриппозной (Гриппол) и пневмококковой (Пневмо-23) вакцин. Заболеваемость пневмониями, острыми бронхитами и ОРЗ среди привитых двумя вакцинами - Грипполом и Пневмо-23 на фоне приема «Витафлор»® была в 2,9 и 2,5-4,1 раза ниже по сравнению с группой, не получавшей пробиотик. При этом возрастало количество специфических антител приблизительно на порядок, титр которых в течение 5 месяцев практически не менялся. Антитела при этом сохраняли повышенную аффинность и авидность. Важно отметить, что тяжесть клинического течения пневмоний у привитых лиц, получавших «Витафлор»®, снижалась, и сократилось число трудопотерь (табл. 7).

Табл. 6 Влияние «Витафлор»® на уменьшение носительства патогенов

Вид возбудителя Носоглоточное носительство по группам (%) Индекс эффективности

Группа №1 (Витафлор + Гриппол) Группа №2 (Витафлор + Гриппол + Пневмо 23) Группа №3 (Гриппол) - группа сравнения №3/№1 №3/№2

S. pneumoniae 16,6 16,4 30,0 1,8 1,8

Н. influenzae 3,1 2,5 26,6 8,6 10,6

S.aureus 9,0 10,5 19,3 2,1 1,8

М. pneumoniae 6,4 5,5 8,3 1,3 1,5

С. pneumoniae 1,6 1,4 1,9 1,2 1,4

Вирусы ОРВИ 1,6 1,3 2,1 1,3 1,6

Аналогичный алгоритм выбора пробиотика был применен у больных вагинитами и вульвовагинитами неспецифического генеза. К набору возбудителей этих воспалительных процессов, включающем дрожжи рода Candida, наибольший антагонизм среди сравниваемых пробиотиков оказывали штаммы «Витафлора»®. В этом случае применялся пробиотик в виде вагинальных суппозиториев или местного орошения суспензией. Клинически показан каузальный характер такого лечения, что проявилось в профилактике рецидивов воспалительных процессов влагалища.

Для экадикации Н. pylori у пациентов с хроническими гастродуоденитами, ассоциированными с этим возбудителем, также был выбран «Витафлор»®, так как его штаммы проявили высокий антагонизм к 5 изолятам Н. pylori , а штаммы L.plantarum и B.bifidum №1 не активны. Выбор формы пробиотика, обеспечивающей контактные взаимодействия в месте локализации возбудителя, т.е. в желудок, является кисломолочный продукт, так как он устойчив к агрессивной среде желудка (рис.4). В кисломолочном продукте совокупность свойств штаммов сохраняется и титр микробных клеток достигает величины 15x109 КОЕ/мл.

Бактериальные клетки пробиотика в этой форме защищены от инактивирующего действия желудочного сока слоем денатурированного казеина, что позволяет им длительно находиться в желудке без потери жизнеспособности. Клинические исследования показали, что применение кисломолочной формы «Витафлора»® в течение 3-х недель в комплексной терапии детей с эрозивно-язвенным поражением ЖКТ способствовало быстрому купированию синдрома верхней диспепсии и нормализации стула у детей, страдавших запорами. Восстановление нормальной кинетической деятельности кишечника приводило к нормальному функционированию клапанно-сфинктерного аппарата ЖКТ. Эндоскопическое исследование после применения «Витафлора»® выявило уменьшение гиперплазии слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, уменьшение частоты дуоденогастралыюго рефлюкса, нормализацию тонуса привратника. У 54 больных группы сравнения эрадикация Н.рукт с использованием антибиотиков приводила к снижению титров бифидо- и лактофлоры до 105-106 КОЕ/мл., в то время как у детей, получавших «Витафлор»®, лакто- и бифидофлора сохранилась на прежнем уровне - 108 КОЕ/мл.

Таблица 7. Сравнительная характеристика тяжести клинического течения пневмоний у привитых лиц и не получивших «Витафлора»®

Характеристика клинического течения Число случаев

Не получали Получали Витафлор

Абс. ч. % Абс. Ч. %

Формы Легкая 11 52,4 5 88,3

клинического Средняя 9 42,8 1 16,7

тририш Тяжелая 1 4,7 0 0

Осложнения, 3 1 14, 0 0

в т.ч. плевпиты 3 _0 0

Среднее число трудопотерь 25,2 21,5

7,6

«Б ■ А

Время инкубации, мин.

Рис.4 Изменение титра L. acidophilus, выращенных в среде ГМС (А) и молоке (Б), при инкубации в желудочном соке.

Лечение MALT-лимфомы (mucosa-associated limpoid tissue) -экстранодальная, низкой степени злокачественная лимфома (В-лимфома маргинальной зоны), которая встречается обычно в желудке и в 72-92% случаев ассоциирована с Н. pylori, возможно с осущетвлением эрадикаций Н. pylori. Это приводит к уникальной в онкологической практике регрессии лимфомы (Isaacson Р., 1994). На практике эрадикацию проводят большими дозами антибиотиков, что приводит к возникновению серьезных осложнений и при этом MALT-лимфомы желудка в 20-30% случаев остаются резистентной к эрадикационной терапии, поэтому приходится прибегать к хирургическому вмешательству, лучевой терапии и химиотерапии. Сотрудники НИИ онкологии им проф. Н.Н.Петрова проверили эффективность эрадикации Н. pylori у больных данной категории кисломолочной формой «Витафлора»®. Под наблюдением находились 25 женщин в возрасте от 48 до 70 лет, страдающих MALT-лимфомой желудка, верифицированной в патоморфологической лаборатории НИИ онкологии. «Витафлор»® назначали только в случае неэффективности схемы лечения с антибиотиками. Клиническое обследование включало общий и специальный анализы крови и периодическую фиброгастродуоденоскопию. Переход MALT-лимфомы в диффузную B-клеточную крупноклеточную лимфому имел место у одной больной (летальный исход) в остальных случаях наблюдался

положительный эффект. Повторная фиброгастродуоденоскопия показала полный регресс опухолевых изменений в 62,5%, стабилизация наблюдалась в 12,5%. Ремиссия констатирована в течение всего срока наблюдений. Тесты на Н. pylori стали отрицательными, а пробы на пепсинообразуюгцую функцию стенки желудка изменились с нулевого показателя до 48 мг/г ткани. Таким образом, клинически показано, что кисломолочная форма пробиотика, имеющего высокий антагонизм к Н. pylori, максимально эффективна при лечении MALT-лимфомы желудка. Разработанньгй способ не имеет побочных эффектов и отражает этиопатогенетический характер лечения.

Локализация участка слизистой, контактирующего с пробиотиком,

оказывается важной для проявления терапевтического эффекта. Показана

клиническая эффективность «Витафлор»® в составе суппозиториев и в

виде микроклизм суспензии при лечении 95 больных с синдромом

раздраженной кишки (СРК), из них СРК с запорами - у 15 человек, СРК с

поносами - у 66 больных. Возраст пациентов - от 6 до 18 лет.

Монотерапия «Витафлор»* проведена у 37 детей с диагнозом СРК (1-я

группа). В группу сравнения (2-я группа) включены 30 больных,

получавших комплексную терапию без «Витафлор»®. 58 пациентам

проводилась комплексная терапия с использованием базисных препаратов

и комбинации разных форм «Витафлора» (3-я группа). В частности,

микроклизмы или суппозитории сочетали с приемом кисломолочной

формы пробиотика. Комплексная терапия пациентов с СРК включала

прием прокинетиков, желчегонных препаратов растительного

происхождения, ферментных препаратов. Выбор схемы лечения в

известной степени определялся диагнозом, характером функциональных и

структурных изменений кишечника. При анализе динамики клинических

проявлений у данного контингента больных учитывались те симптомы, в

развитии которых ведущую роль играют нарушения кишечного

микробиоценоза. К ним относятся боли в животе, нарушения стула,

сочетающиеся с метеоризмом. Динамика их проявления у пациентов,

получавших разные схемы лечения, представлена на рис.5. Анализ

динамики клинических симптомов показал, что «Витафлор»® эффективен

как в комплексной терапии с прокинетиками и желчегонными препаратами, так и в качестве монотерапии в купировании основных клинических признаков. Клинические симптомы коррелировали с изменениями в составе кишечной флоры, что подтверждает их патогенетическую связь. Перспективной формой пробиотика является пористая таблетка для лингвального применения. Эта форма ориентирована на достижение максимального иммуномодулирующего эффекта, так как учитывает особенности строения эпителия подъязычной области и быстрый распад таблетки при её контакте со слюной. В процессе распада таблетки образуется концентрированная бактериальная суспензия, в результате чего вероятность захвата клеток штамма пробиотика местной лимфоидной тканью повышается. Клинические исследования показали, что использование пробиотика в форме лингвальной таблетки чрезвычайно эффективно при купировании осложнений химио- и лучевой терапии онкологических больных в генерализованной стадии заболевания и в инфекционной клинике при лечении больных сальмонеллезами в тяжелой фазе.

Условные обозначения:

В боли, И метеоризм. Щ понос, ^ запор, И норма

Рис. 5 Динамика изменений клинических симптомов на фоне различных схем терапии. 1-я группа - курс монотерапии витафлором, 2-я группа -стандартный курс терапии и 3-я группа, прошедшая комплексный курс, включающий стандартную терапию и Витафлор.

Время в часах

Рис.6. Изменение титра L. acidophilus, внесенных в среду МРС-1 при температуре 37°С в виде порошка сублимированной биомассы (2) и порошка в кишечно-растворимых капсулах (1)

В кишечнорастворимых капсулах пробиотические бактерии защищены от инактивирующего действия желудочного сока. При растворении капсул в кишечнике пробиотические штаммы попадают в состав транзиторной микрофлоры, где переходят в состояние активного метаболизма. На рис.6 показан процесс реактивации капсульной формы пробиотика во времени. Такие формы бактериальных препаратов эффективны для профилактики, на стадии реабилитации после перенесенных заболеваний, а также при лечении болезней средних отделов ЖКТ, например болезни Крона.

За последние 10 лет разработанные алгоритмы выбора пробиотика и препарат «Витафлор»® были использованы в педиатрии, гастроэнтерологии, гинекологии, аллергологии, онкологии, хирургии, при лечении инфекционных заболеваний и при вакцинации, а также в профилактике инфекционных заболеваний и показали эффективность их применения. Общая численность пациентов, участвовавших в апробации, превысила 2 тысячи. Выпуск пробиотика «Витафлор»® осуществляется в течение 12 лет с предельной нагрузкой имеющегося оборудования.

выводы

1. Показано, что пул низкомолекулярных экзометаболитов выполняет функции регулятора численности и уровня антагонистической активности бактерий при развитии их популяций в составах чистых и смешанных культур и осуществляет коммуникационные связи внутри микробиоценозов. Низкомолекулярные экзометаболиты пробиотических бактерий участвуют в восстановлении нарушенных составов микробиоценозов.

2. Разработана модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов на микроэкологический статус макроорганизма. Согласно модели восстановление состава нормальных микробиоценозов при приеме бактериального препарата происходит в следующей последовательности: переход штамма пробиотика в состояние активного метаболизма, выделение экзометаботитов, селективная стимуляция ими роста представителей нормального микробиоценоза. Активированный штамм препарата проявляет собственную антагонистическую активность и повышает уровень антагонизма нормальной микрофлоры, что способствует элиминации возбудителей заболевания.

3. Эффективность применения пробиотиков во многом определяется вероятностью перехода бактерий в состояние активного метаболизма в энтеральных средах макроорганизма. Повышение вероятности перехода бактерий в физиологически активное состояние достигается путем использования адекватной формы препарата, или путем внесения низкомолекулярных стимуляторов роста.

4. Обосновано новое направление в медицинской биотехнологии -создании пробиотиков с повышенным терапевтическим потенциалом на основе бактериальных симбиотических комплексов мутуалистического типа, которое является логическим следствием анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.

5. Создан устойчивый симбиотический комплекс - бикультура L.

acidophilus на основе штаммов Д №75 и Д №76, который обладает

эффектами синтрофии и синергизма. По сравнению с моноштаммами

симбиотическая бикультура характеризуется повышенным

пробиотическим потенциалом (высокой жизнеспособностью, широким спектром и уровнем антагонистической активности, устойчивостью к терапевтическим дозам ряда антибиотиков, адаптивной способностью, резистентностью к абиотическим факторам среды).

6. Разработаны технологии получения пробиотика на основе симбиотической бикультуры L. acidophilus (штаммы Д№75 и Д№76) в различных формах: лиофилизат биомассы в среде культивирования во флаконах, лингвальные таблетки, лиофилизат биомассы в порошке. Производство пробиотика «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»® , который зарегистрирован как БАД, организовано на базе ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России (1997).

7. «Витафлор»® во всех формах выпуска по данным полного цикла доклинических исследований относится к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ, не обладающих аллергенными и токсигенными свойствами, с выраженной фармакологической активностью (на моделях экспериментального язвенного поражения ЖКТ и дисбактериоза, вызванного свинцовой интоксикацией).

8. Предложен алгоритм выбора эффективного бактериального пробиотика и формы его применения с учетом этиологии, характера и степени выраженности заболевания. Критерии выбора сформулированы на основе анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.

9. Целесообразность использования предложенных алгоритмов выбора, повышающих эффективность пробиотикотерапии, и высокие лечебно-профилактические свойства различных форм пробиотика «Витафлор»® подтверждены в многолетних клинических наблюдениях в педиатрии, гастроэнтерологии, гинекологии, инфектологии, аллергологии, онкологии и хирургии (более 2000 пациентов).

Список работ, опубликованных по теме диссертации, состоит из 86 названий, основные из них:

Монография и методические пособия

1. Мельникова И.Ю., Рябчук Ф.Н., Петров JI.H., Вербицкая Н.Б. Теоретические предпосылки и практика клинического применения пробиотика Витафлор в педиатрии.// Методическое пособие для врачей, СПб., Изд. СПб МАПО, 2004, с.37

2. Петров JI.H., Вербицкая Н.Б., Добрица В.П., Галкин Г.Н., Петров H.JI. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора.//СПб., ФГУП Гос.НИИ ОЧБ, 2008, с. 136

3.- Гончар Н.В., Вербицкая Н.Б., Березина Л.В., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения острых кишечных инфекций. //Методические рекомендации. СПб., ВМА. 2009, с. 20

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Багрянцева Е.А., Свентицкий Е.Н., Петров Л.Н. Исследование водного обмена в клетках Е. coli в присутствии D20 методом ИК-спектроскопии.// Биофизика - 1983, т. XXVIII, вып. 5, стр. 835-837.

2.- Рощина Е.К., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Спектрофлуориметрический анализ Е. coli в процессе хранения в физиологическом растворе.// Микробиология - 1984, т. 53, вып. 6, стр. 1016-1020.

3.- Никитин Н.В., Николаев Б.П., Торопов Д.К., Петров Л.Н Изучение физиологической активности клеток Escherichia coli методом спинового обмена // Микробиология - 1985, -т. 54, вып. 4, стр. 566-572.

4.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Термостабильность пространственной организации молекул белков и механизм ее поддержания.// Доклады Академии Наук СССР, 1989, т. 308,стр. 218-222.

5.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Состояние воды в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ по данным ИК-спектроскопии.// Журнал структурной химии, 1991, т. 32, стр. 81-85.

6.- Вахитов Т.Я., Петров JI.H. Выживаемость клеток при хранении в суспензиях различной концентрации // Микробиология- 1992, т 61,вып.6, стр.1087-1095.

7.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин СВ., Петров Л.Н. Состояние белка в микрорасслаивающихся водно-органических растворителях // Биофизика- 1993, т. 38, №3, стр. 524-525.

8.- Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Сорвин СВ., Петров Л.Н. Изменение конформации белков в водных растворах гетерофункциональных неэлектролитов.// Биофизика -1996, т. 41, №3, стр. 581-587.

9.- Вахитов Т.Я., Яшина О.Ю., Королюк A.M., Петров Л.Н. Изучение действия препарата аутостимуляторов роста E.coli М-17 (препарат «Акгофлор») на рост чистых и смешанных культур бактерий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии - 2000, №3, стр. 20-24

10.- Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Влияние препаратов «Актофлор» на выживаемость E.coli М-17 и S.enteritidis при голодании в смешанных культурах // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000, №6, стр. 67-69

11.- Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Задаура Е.Ю., Петров Л.Н. Сравнительное изучение действия аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистическую активность лактобацилл // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001, №3, стр. 80-83

12.- Вахитов Т.Я., Виснольд Н.В., Протасов Е.А., Толпаров Ю.Н., Петров Л.Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2003, №2, стр. 7-12

13.- Вахитов Т.Я., Момот E.H., Шалаева О.Н., Петров Л.Н. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2003, №6, стр. 20-25

14.- Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Петров Л.Н. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты//Журн.

микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2005, №5, стр. 108-114

15.- Петров JI.H., Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Воробьев A.A. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов.// Вестник Российской АМН, 2006, №1, стр.3845

16.- Vakhitov T.Y., Petrov L.N. Regulatory functions of bacterial exometabolites // Microbiology. - 2006. - Vol. 75. - № 4. - P. 483-488.

17.- Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко B.M., Воробьев А.А Перспективы создания пробиотических препаратов на основе чувства кворума у бактерий // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006, №3, стр. 105-113.

18.- Кобатов А.И., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Пробиотик «Витафлор» как возможное средство защиты космонавтов от негативных последствий воздействия ионизирующего излучения.// Медицина экстремальных ситуаций- 2007, № 2 (20), с. 72 - 79

19.- Кобатов А.И., Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Рыбальченко О.В., Петров Л.Н. Изучение пробиотических характеристик Lactobacillus acidophilus, выращенных в условиях космического полета.//Медицина экстремальных ситуаций, 2008, № 4 ( 26 ), с. 66 - 78.

20.- Гончар Н.В., Березина Л.В., Тихомирова О.В., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Выбор пробиотика для рациональной терапии клебсиеллезной инфекции у детей.// Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009, №2, стр. 85-89.

21. Вахитов Т.Я., Чалисова Н.И., Балыкина Н.А., Петров Л.Н., Ноздрачёв АД Модулирующее влияние метаболитов микрофлоры человека и животных на культуру лимфоидной ткани.//Доклады Академии Наук - 2009,том 428, № 1, с. 121-124.

Патенты и полезные модели

1,- Патент № 2170023 РФ, МКИ А 23 С 9/12. Штамм Lactobacillus acidophilus А-91, используемый для приготовления кисломолочных

продуктов, штамм Lactobacillus acidophilus Н-91, используемый для приготовления кисломолочных продуктов, закваска для приготовления кисломолочных продуктов и препарат, способствующий адаптации организма к неблагоприятным внешним воздействиям. // Петров J1.H., Вербицкая Н.Б. Заявка № 97122258. Заявлено 25.12.97. Опубликовано 10.07.01. Бюл№ 19.-7с.

2,- Патент № 2160992 РФ, МКИ А 23 С 9/12. Сухой биопрепарат и способ его получения. //Вербицкая Н.Б., Добролеж О.В., Кобатов А.И., Петров Л.Н. Заявка № 99117491/13. Заявлено 17.08.99. Опубликовано 27.12.00. Бюл. № 36. - 8 с.

3,- Патент № 2169574, МКИ А 61К 35/74,35/76 Способ получения препарата и сухой биопрепарат // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н. Заявка №2000101754,—Заявлено 27.01.00. Опубликовано 27.06.01. Бюл. №18.-8с.

4,- ПМ № 22420 РФ, МКИ А 61К 9/127, 31/00 . Препарат // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Белов Г.В. Заявка № 2001131754/20. Заявлено 27.11.01. Опубликовано 10.04.02. Бюл. № 10. - 1с.

5,- ПМ № 12967 РФ, МКИ А 61 К 31/13. Суппозиторий // Кобатов А.И., Добролеж О.В., Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Заручевская Н.В., Молдавер Б.Л. Заявка №99124264/20. Заявлено 23.11.99.. Опубликовано 20.03.00. Бюл. № 8.-1с.

6,- ПМ № 14514 РФ, МКИ А 61 К 9/127, 31/00. Таблетка // Кобатов А.И., Добролеж О.В. Вербицкая Н.Б., Петров Л.Н., Белов Г.В. Заявка № 2000102001/20. Заявлено 27.01.00. Опубликовано 10.08.00. Бюл. № 22. -1с.

7,- Патент №2269353 Способ лечения MALT-лимфомы желудка. // Гершанович М.А., Добрица В.П., Петров Л.Н. заявка №2004117585 от 10.06.2004 публикация 10.02.06 бюл. №4

8,- Патент №2278682 Способ лечения желудочно-кишечных заболеваний // Мельникова И.Ю., Добрица В.П., Петров Л.Н. заявка №20074983431 от 18.02.2004 публикация 27.2.06 бюл. №2

9,- Патент №2342174 Способ повышения эффективности вакцинации

против бактериальных и вирусных инфекций // Лобзин Ю.В., Добрица

В.П., Петров JI.H., Жоголев С.Д., Огарков П.И., Осмоловский С.К. заявка №2006104531 от 13.02.2006 публикация 27.12.08 бюл.№38 10- Патент №2339389 Способ профилактики назофарингиального носительства патогенной микрофлоры.// Лобзин Ю.В., Добрица В.П., Цыган В.Н., Петров JI.H., Жоголев С.Д., Огарков П.И., Осмоловский С.К., Зуева Н.В., Суханов Б.С. заявка № 2006104532 от 13.02.2006 публикация 27.12.08 бюл. №38

11,- Патент № 2090612 Стимулятор роста бактериальной культуры. // Вахитов Т.Я., Яшина Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений 20 сент. 1997.

12,- Патент № 2233875 Стимулятор роста клеток бактерий Escherichia coli.// . Вахитов Т.Я., Момот Е.Н., Петров JI.H. заявка № 2000129026 от 22.11.2000 публикация 10.08.2004 бюл. №22

13,- Патент №2291192 Стимулятор роста микроорганизмов «Полифлор» и препарат для лечения желудочно-кишечного тракта.// Вахитов Т.Я.,Петров Л.Н., Бондаренко В.М., Шалаева О.Н. заявка № 2005108334 от 24 марта 2005 г. публикация 10 01.2007 бюл. № 1

Отпечатано в Типографии Военно-медицинской академии 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6 Подписано в печать 25.03.2011. Тир. 100 экз. Зак.210

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Петров, Леонид Николаевич

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Современные представления о роли микробиоценозов в поддержании гомеостаза человека

1.2 Устойчивость микроэкологических равновесий и последствия их нарушений

1.3 Бактериальные пробиотики, особенности получения и некоторые элементы механизма их влияния на микроэкологический статут макроорганизма

Глава 2 Материалы, объекты и методы исследования

2.1 Микробиологические исследования

2.2 Химико-аналитические исследования

2.3 Иммунологические исследования

2.4 Токсикологические исследования

2.5 Биотехнологические исследования

Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Феноменологическая модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов

3.2 Разработка технологии получения пробиотика на основе симбиотической композиции бактериальных штаммов и результаты доклинических исследований

3.2.1 Перспективность использования симбиотической композиции штаммов как основы пробиотика

3.2.2 Создание искусственной симбиотической композиции - основы бактериального пробиотического препарата

3.2.3 Разработка технологии получения Б АД «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»® в различных формах

3.2.4 Результаты доклинических исследований различных форм «Симбиотического комплекса ацидофильных бактерий «Витафлор»®

3.2.5 Формы выпуска БАД «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»® и сферы их применения

3.3 Алгоритмы выбора пробиотика для решения терапевтических задач

3.3.1 Критерии выбора бактериального пробиотического препарата для решения терапевтических задач, вытекающие из анализа модели

3.3.2 Примеры использования алгоритмов выбора бактериального пробиотика для решения 170 терапевтических задач

3.4 Опыт клинического применения пробиотика

Витафлор»® в различных формах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов"

Актуальность работы. Повышенный интерес к использованию бактериальных пробиотиков в клинической практике — ответ на вызов времени. По данным Всемирной Организации Здравоохранения в мире от инфекционных заболеваний ежегодно умирают 16-18 млн. человек (Лобзин Ю.В., 2006, Онищенко Г.Г., 2008). На первом месте стоят острые респираторные и кишечные заболевания различной этиологии, в том числе эндогенные инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, входящими в составы нормальных микробиоценозов человека. В этих случаях применение стандартной антибактериальной терапии часто оказывается неэффективным, альтернативой являются препараты, нормализующие микробиоценозы - пробиотики (Шендеров Б.А., 2001). Внимание к пробиотикам также связано с тем, что практически при всех заболеваниях у пациентов наблюдаются дисбактериозы, что теоретически объяснимо с позиций медицинской микробной экологии (ММЭ). Так показано, что одной из причин возникновения не только инфекционных, но и соматических заболеваний человека являются нарушения микроэкологического статуса (У гол ев A.M. 1991, Шендеров Б. А. 1998, 2000, 2001, Morgan D. 2002, О'Нага, F.Shanahan, 2006, Бондаренко В.М.2007, Ткаченко Е.И., Суворов А.Н. 2007, 2009). Следовательно, для повышения результативности лечебного процесса и придания ему каузального характера, в терапевтические схемы часто включают бактериальные пробиотики. Но положительный результат наблюдают не всегда (Sullivan А. & Nord С.Е., 2005). Такое положение можно объяснить отсутствием научно-обоснованных критериев выбора, как самого препарата, так и его лекарственной формы, адекватных заболеванию пациента, т.е. выбор пробиотика носит случайный характер, в то время как использование препаратов на основе живых микроорганизмов имеет определенную специфику, которую необходимо учитывать практикующим врачам.

При приеме пробиотика входящие в его состав бактерии вступают во взаимодействие со сложной системой макроорганизм-микробиота, которая включает всю совокупность микробиоценозов макроорганизма. Характер этих взаимодействий зависит от штаммов пробиотика, формы препарата, способов его введения, характера заболевания пациента, остроты течения процесса и ряда других причин. Учесть особенности этих взаимодействий можно, имея модель механизма пробиотического действия, которая выявит свойства бактериальных препаратов, предопределяющие их терапевтическую эффективность. Построить молекулярную или молекулярно-клеточную модель такого механизма на современном уровне не представляется возможным из-за сложности взаимодействующих систем. Однако вполне реально построить феноменологическую модель, основанную на анализе экспериментального материала в области, популяционной микробиологии чистых и смешанных культур, микробной экологии, структурно-функциональных и иммунологических особенностей эпителия слизистых покровов и микробной биотехнологии.

Безусловно, разработка модели пробиотического действия бактериальных препаратов, описывающей механизм восстановления нарушенных микробиоценозов, относится к актуальным задачам медицинской микробной экологии. Такая модель необходима и для разработки критериев выбора бактериального пробиотика и, следовательно, для повышения терапевтической эффективности их использования в лечении заболеваний человека.

Поставленная цель предполагает решение следующих основных задач:

- обосновать подходы к созданию новых, востребованных медициной бактериальных пробиотических препаратов;

- разработать технологию получения с оптимальным составом штаммов, провести полный цикл доклинических исследований пробиотика, получить разрешение на использование и организовать его выпуск; сформулировать критерии выбора бактериальных пробиотиков и их форм применения в профилактике и лечении ряда заболеваний (ОРЗ, ОКИ, хеликобактериозов и др.);

- оценить эффективность использования разработанного пробиотика «Витафлор»® и сформулированных критериев выбора пробиотика и различных его форм в клинических испытаниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эффективность модели пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает особенности взаимодействия пробиотических штаммов и пула их метаболитов с микробиоценозами и местной лимфоидной тканью слизистых покровов, для обоснования нового направления в технологии создания новых пробиотиков и для определения критериев выбора пробиотиков в клинической практике.

2. Оригинальность технологии получения, бактериального пробиотика на основе симбиотической системы штаммов.

4. Алгоритмы выбора бактериального пробиотика для решения конкретных терапевтических задач и положительные результаты их использования в клинической практике.

Научная новизна работы.

Впервые разработана феноменологическая модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов, которая учитывает их влияние на состав измененных микробиоценозов пациентов и местную лимфоидную ткань слизистых поверхностей.

Научно-практическое значение работы.

Сформулированные алгоритмы выбора изложены в пособии для врачей «Теоретические предпосылки и практика клинического применения пробиотика Витафлор в педиатрии» издательства Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования в 2004 г. и в методических рекомендациях «Микробиологические методы выбора бактериальных пробиотиков для повышения эффективности лечения острых кишечных инфекций» издательства ВМА Санкт-Петербург в 2009 г.

Модель позволила показать преимущества использования1 симбиотической композиции пробиотических штаммов в качестве активного начала препаратов. На основе подобранной бикультуры Lactobacillus acidophilus (штаммы Д №75 и Д' №76) разработан новый пробиотик «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»®, производство которого организовано в 1997 году на базе Федерального Государственного Унитарного Предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального Медико-Биологического Агентства в различных формах и зарегистрированного как БАД.

Научная и практическая значимость полученных результатов подтверждена патентами России на способ получения пробиотика и лечения ряда заболеваний. Как продукт современной биотехнологии, обладающий высокими целевыми характеристиками, «Витафлор»® награжден Дипломом IV международной выставки-конгресса «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (Санкт-Петербург, 15-18 июня 1999 г.) и большой золотой медалью международного фонда биотехнологии им. академика И.Н.Блохиной в 2004 г. Решением Президиума Российской Академии Естественных Наук за № 148 от 27.03.02 за разработку и выпуск препарата «Витафлор»® институт награжден Почетной золотой медалью И.И.Мечникова «За практический вклад в укрепление здоровья нации».

Материалы диссертации использованы в курсе лекций «Бактериальные технологии медицинского и технического назначения» кафедры технологии микробиологического синтеза Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологической институт (Технический университет)».

Личный вклад автора в проведенные исследования.

Работа выполнена на базе Федерального Государственного Унитарного Предприятия «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального Медико-Биологического Агентства России (1989 -2009). Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Автором разработана концепция эффективного применения бактериальных пробиотиков в терапевтической практике, включающая модель механизма их пробиотического действия, алгоритмы выбора пробиотика и используемой формы, оптимально соответствующие заболеванию, а также сформулированы требования к новым пробиотикам, в которых нуждается современная медицина. Под руководством диссертанта разработана технология и организовано производство пробиотика «Витафлор»®. В большом объеме работы участие принимали сотрудники института к.б.н. Вербицкая Н.Б., д.б.н. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., к.т.н. Кобатов А.И., д.м.н., профессор Симбирцев А.С., к.м.н. Пигарева Н.В., к.м.н. Петров А.В. и д.м.н., профессор Добрица В.П.

Полученные результаты опубликованы, доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу авторов. Соискатель выражает своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы.

Основные результаты и положения работы обсуждались в виде пленарных докладов на следующих международных, всесоюзных и всероссийских конференциях и симпозиумах: International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS, Leningrad, 1991; International Conference "Biotechnology St. Petersburg 94", St. Petersburg, 1994; Всесоюзная научно-практическая конференция "Дисбактериоз и эубиотики", Москва, 1996; Российская научная конференция «Современная микробиология. Состояние, достижения и перспективы», Санкт-Петербург, 1998; Международная конференция «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека», Москва, 1999; Международная научно-практическая конференция памяти Г.И.Гончаровой «Пробиотические микроорганизмы - современное состояние и перспективы использования», Москва, 2002; 5 Российский съезд врачей-инфекционистов - Санкт-Петербург., 2003; 6, 7, 8, 9, 10 Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург — Гастро» -2004, -2005, -2006, -2007, -2008; Международная конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» -Москва, 2004; Донозология - 2007 Проблемы диагностики и коррекции эндоэкологического статуса в современных условиях, Санкт-Петербург, 2007; Объединительный иммунологический форум, Санкт-Петербург, 2008; Вакцинология 08, Москва, 2008; 6-ая Международная Германо-Российская конференция Форума Кох-Мечников, Санкт-Петербург, 2008, Family Health in the XXI Century, 29 April - 7 May, Eilat, Israel, 2008.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 работы, из них одна монография, два методических пособия для врачей, 21 статья в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов докторских диссертаций, 13 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, включающего 3 части, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Библиография включает 167 источников, в том числе 75 на русском и 92 на иностранных языках. Работа содержит 24 таблицы и 20 рисунков. Общий объем работы 264 страницы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Петров, Леонид Николаевич

выводы

1.- Показано, что пул низкомолекулярных экзометаболитов выполняет функции регулятора численности и уровня антагонистической активности бактерий при развитии их популяций в составах чистых и смешанных культур и осуществляет коммуникационные связи внутри микробиоценозов. Низкомолекулярные экзометаболиты пробиотических бактерий участвуют в восстановлении нарушенных составов микробиоценозов.

2.- Разработана модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов на микроэкологический статус макроорганизма. Согласно модели восстановление состава нормальных микробиоценозов при приеме бактериального препарата происходит в следующей последовательности: переход штамма пробиотика в состояние активного метаболизма, выделение экзометаботитов, селективная стимуляция ими роста представителей нормального микробиоценоза. Активированный штамм препарата проявляет собственную антагонистическую активность и повышает уровень антагонизма нормальной микрофлоры, что способствует элиминации возбудителей заболевания.

3.- Эффективность пробиотиков во многом определяется вероятностью перехода бактерий в состояние активного метаболизма в энтеральных средах макроорганизма. Повышение вероятности перехода бактерий в физиологически активное состояние достигается путем использования адекватной формы препарата, или путем внесения низкомолекулярных стимуляторов роста.

4.- Обосновано новое направление в медицинской биотехнологии -создании пробиотиков с повышенным терапевтическим потенциалом на основе бактериальных симбиотических комплексов мутуалистического типа, которое является логическим следствием анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.

5.- Создан устойчивый симбиотический комплекс - бикультура L. acidophilus на основе штаммов Д №75 и Д №76, который обладает эффектами синтрофии и синергизма. По сравнению с моноштаммами симбиотическая бикультура характеризуется повышенным пробиотическим потенциалом (высокой жизнеспособностью, широким спектром и уровнем антагонистической активности, устойчивостью к терапевтическим дозам ряда антибиотиков, адаптивной способностью, резистентностью к абиотическим факторам среды).

6.- Разработаны технологии получения пробиотика на основе симбиотической бикультуры L. acidophilus (штаммы Д№75 и Д№76) в различных формах: лиофилизат биомассы в среде культивирования во флаконах, лингвальные таблетки, лиофилизат биомассы в порошке. Производство пробиотика «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»®, который зарегистрирован как БАД, организовано на базе ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России (1997).

7.- «Витафлор»® во всех формах выпуска по данным полного цикла доклинических исследований относится к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ, не обладающих аллергенными и токсигенными свойствами, с выраженной фармакологической активностью (на моделях экспериментального язвенного поражения ЖКТ и дисбактериоза, вызванного свинцовой интоксикацией).

8.- Предложен алгоритм выбора эффективного бактериального пробиотика и формы его применения с учетом этиологии, характера и степени выраженности заболевания. Критерии выбора сформулированы на основе анализа модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов.

9.- Целесообразность использования предложенных алгоритмов выбора, повышающих эффективность пробиотикотерапии, и высокие лечебно-профилактические свойства различных форм пробиотика «Витафлор»® подтверждены в многолетних клинических наблюдениях в педиатрии, гастроэнтерологии, гинекологии, инфектологии, аллергологии, онкологии и хирургии (более 2000 пациентов).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы являлась разработка теоретических основ повышения эффективности применения бактериальных пробиотиков и биотехнологических подходов к созданию новых препаратов для профилактической и клинической медицины. Достижение цели предполагает использование положений медицинской микробной экологии (ММЭ) — бурно развивающейся области теоретической медицины.

В обзоре литературы приводится анализ современных представлений ММЭ, устойчивости микроэкологических равновесий и последствий их нарушений, а также'классификация бактериальных пробиотических препаратов, предназначенных для коррекции микроэкологических состояний, и биотехнологические особенности их получения. Анализ литературы показал, что нарушения микроэкологических равновесий (дизбактериозы) являются причиной или возникают при развитии не только инфекционных, но и соматических заболеваний. Теория «терапевтических инфекций», (Ткаченко Е.И., Суворов А.Н., 2007), согласно которой болезни внутренних органов возникают при недостаточном или избыточном содержании определенных» представителей нормальной микрофлоры, постоянно дополняется новыми экспериментальными данными и аргументами. Следовательно, в профилактике и лечении большинства заболеваний надо использовать препараты, способствующие восстановлению микроэкологических равновесий: К таким препаратам относятся бактериальные пробиотики, включение которых в схемы лечения придает терапевтическому процессу каузальный характер.

Однако, не смотря на то, что ассортимент бактериальных пробиотических препаратов достаточно широк и постоянно увеличивается (Несчисляев В.А., 2006, Амерханова A.M., 2009), клиническая эффективность их использования нередко остается низкой (Sullivan A., Nord С.Е., 2005, Шендеров Б.А., Глушанова H.A., 2006). В связи с этим необходима разработка концепции эффективного применения пробиотиков, включающая обоснования для использования того или иного пробиотика в решении конкретных терапевтических задач. Обоснования должны быть аргументированы и основываться на механизмах действия бактериальных препаратов. Новые теоретические представления необходимы и в медицинской биотехнологии для создания терапевтически эффективных бактериальных препаратов.

Исследуемые в диссертации проблемы, связанные с повышением клинической эффективности применения и созданием новых пробиотиков, рассмотрены в рамках разработанной модели механизма пробиотического действия бактериальных препаратов. Безусловно, разработанная модель не может в полной мере описать механизм лечебного действия бактериальных препаратов, но, как показано в работе, позволяет предложить вариант выбора пробиотика в клинической практике. Кроме этого, модель легла в основу перспективного направления в конструировании новых бактериальных препаратов, востребованных современной медициной.

Термин «пробиотическое действие бактериальных препаратов», предлагаемый нами, вытекает из общепринятого определения пробиотиков. «Пробиотики - жизнеспособные микроорганизмы и/или вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма-хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса» (Шендеров Б.А., 2001). При этом, под микроэкологическим статусом, согласно Уголеву А.Н. (1991) и Шендерову Б.А. (1998), понимают оптимальный для конкретного макроорганизма состав микрофлоры, способной выполнять свои эволюционно сложившиеся функции в жизнедеятельности хозяина, сбалансированную местную иммунную реакцию слизистых, контролирующую общий состав нормальной микрофлоры, резистентность к её представителям и реактивность к патогенам и, наконец, физиологический уровень механической активности слизистых поверхностей, связанный с модуляцией сенсорных нервных окончаний. Следовательно, прежде всего, пробиотическое действие бактериальных препаратов сводится к восстановлению состава микробиоценозов макроорганизма. Считают, что восстановленный состав микробиоценозов приводит к нормализации эволюционно созданных функций этого «невидимого» органа человеческого тела, связанных со снабжением макроорганизма пластическими и регуляторными веществами, инактивацией вредных для организма веществ и сохранением колонизационной резистентности слизистых. В результате происходит процесс выздоровления, механизм которого отличается чрезвычайной сложностью и проявляется на разных уровнях - биохимическом, клеточном, органном и системном. В диссертации механизм лечебного действия пробиотиков не рассматривается и не обсуждается.

Из материалов диссертации следует, что модель пробиотического действия бактериальных препаратов должна включать как минимум три уровня рассмотрения: восстановление нарушенных микробиоценозов, иммуномодуляцию и нейромодуляцию.

Для создания модели пробиотического действия на первом, основном уровне нами были проведены специальные исследования по изучению физиологии развития популяций пробиотических штаммов. Акцент в этих исследованиях сделан на изучении процессов метаболитной ауторегуляции развития штаммов в составах чистых и смешанных культур. Методами современного физико-химического анализа (ультрафильтрация, различные методы хроматографии, спектральный анализ и ЯМР-спектроскопия) изучен химический состав экзометаболитов (Петров JI.H., Вахитов Т.Я. 2003, 2006, 2008). Одновременно изучено влияние интегрального пула метаболитов и ряда его фракций на различные развивающиеся бактериальные популяции. Полученные результаты позволили предположить, что восстановление составов нормальных микробиоценозов бактериальными пробиотическими препаратами происходит под влиянием метаболитов пробиотического штамма (Петров JI.H. 2003, 2008). При этом низкомолекулярные метаболиты является селективным фактором роста нормальной микрофлоры, под действием которого восстанавливается количественный состав микробиоценоза. Метаболиты с высоким молекулярным весом являются преимущественно факторами антагонизма к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, и способствуют элиминации этиологических возбудителей заболевания. Эти полученные in vitro результаты подтверждаются экспериментами на лабораторных животных с использованием безмикробного пробиотика «Актофлор», содержащего фракцию нативных низкомолекулярых метаболитов пробиотического штамма E.coli М-17.

Согласно разработанной модели максимальный положительный эффект при приёме пробиотика наблюдается при условии, что в энтеральных средах пациента функционально неактивные бактерии препарата переходят в фазу активного метаболизма. Это положение подтверждается последними исследованиями (Martin Francois-Pierre J, 2008).

Для описания иммуно- и нейромодуляции, т.е. второго и третьего уровней механизма пробиотического действия бактериальных препаратов, были привлечены данные литературы, появившиеся в последние годы (Hull M.W., 2007, Ley R.E., 2006, Brandtzaeg P., 2007, Mohamadzadeh M., 2005, Boyle R.J., 2006, Feleszko W., 2007, Martin Francois-Pierre J, 2008, Олескин A.B., 2009).

Иммуномодуляция местной лимфоидной ткани слизистых покровов осуществляется как бактериальными метаболитами (например, возможна индукция синтеза дефенсинов клетками Панета, интерлейкина-8 (IL8) эпителеоцитами и т.д.), так и нативными бактериальными клетками, которые непосредственно взаимодействуют с мукозоассоциированной лимфоидной тканью. Характер иммуномодуляции (спектр цитокинов, иммуноглобулинов и других интермедиатов иммунного ответа, активизация дендритных клеток) зависит от природы штамма. В настоящее время продолжается активное накопление экспериментального материала, который в недалеком будущем станет аргументом в выборе препарата.

Третий уровень влияния бактериальных пробиотиков на макроорганизм связан с нейромодуляцией сенсорных нервных окончаний на уровне слизистой низкомолекулярными метаболитами бактерий. В составе этих метаболитов присутствуют аминокислоты, карбоновые кислоты, биогенные амины (табл. 8), которые могут преодолевать эпителиальный барьер и проявлять нейромодулирующую активность. Однако систематические исследования в этой области до сих пор не проводятся. Можно полагать, что нейромодуляцией является одной из причин действия пробиотика не только в месте его локализации, но и далеко за его пределы, то есть на всю слизистую поверхность.

В целом представленная в работе модель пробиотического действия бактериальных препаратов адекватно описывает феномен благоприятного действия пробиотиков на макроорганизм с нарушенным микроэкологическим статусом. Она позволяет предложить новое направление в разработке пробиотиков с повышенным терапевтическим потенциалом.

Как известно, основные задачи медицинской микробной биотехнологии при разработке новых бактериальных препаратов заключаются в выборе производственного штамма - основы препарата, и в сохранении его пробиотического потенциала на всех стадиях технологического процесса получения готовой формы. Решение первой задачи имеет стратегический характер, так как свойства производственного штамма определяют потенциальные лечебные и профилактические характеристики пробиотика. К микроорганизмам, на основе которых создаются пробиотики, предъявляются жесткие требования (Поспелова В.В., 1986, 1991, Чупрынина Р.П., 2002, Бондаренко В.М., 2004, Несчисляев В.А., 2005). Производственный штамм должен быть идентифицирован до вида по фено- и генотипическим признакам, должны быть исследованы его генетические свойства, в том числе наличие внехромосомных факторов наследственности. Штамм должен быть безопасным для человека, стабильным в процессе производства и при длительном хранении, проявлять антагонистическую активность к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, при этом не угнетать представителей нормальной микрофлоры.

Согласно предложенной модели к этим требованиям следует добавить ещё одно - при попадании в энтеральные среды макроорганизма штамм должен быть способен переходить из физиологически неактивного состояния в фазу активного метаболизма. Это позволяет штамму в полной мере реализовать свои потенциальные возможности и обеспечить тем самым максимальный клинический эффект. В то же время, состав энтеральных сред зависит от заболевания, тяжести его течения и от индивидуальных особенностей организма, он может быть не оптимальным для развития пробиотического штамма и, как следствие, являться причиной низкой эффективности пробиотика. Для повышения адаптации бактерий к энтеральным средам предлагается использовать в качестве основы пробиотика симбиотическую композицию бактериальных штаммов мутуалистического типа. Это предложение основывается на закономерностях экологии микроорганизмов. В природных экосистемах они существуют не в виде монокультур, а в составах разнообразных сообществ (Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н-., 2001, Пиневич A.B., 2009), которые обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам среды и высоким адаптационным потенциалом. Можно полагать, что лечебные свойства бактериального препарата на симбиотической штаммовой основе будут меньше зависеть от индивидуальных особенностей организма пациента, в том числе и от состава энтеральных сред. Одновременно при использовании симбиоза производственных штаммов может возрастать их пробиотический потенциал, что является следствием- синтрофии и синергизма свойств отдельных штаммов.

Это теоретическое положение реализовано в разработке технологии получения пробиотика «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор»®. Создана искусственная симбиотическая система двух штаммов ацидофильных лактобацилл, выделенных от здоровых детей первого года жизни. Экспериментально показано, что симбиоз стабилен на протяжении 15-20 генераций и имеет мутуалистический тип с признаками синтрофии и синергизма свойств (титр, уровень и спектр антагонизма, устойчивость к антибиотикам и технологическим стрессам). Производственные штаммы симбиотической системы (Ь.ас1с1орЫ1ш штаммы, Д-75 и Д-76) подробно изучены по фенотипическим и генетическим характеристикам. Молекулярно-генетический анализ показал, что штаммы не содержат плазмид, и устойчивость к ряду антибиотиков имеет хромосомный характер. Штаммы депонированы в Государственной коллекции микроорганизмов (паспорта и справки о депонировании приводятся в приложении 1).

В 1997 году на базе ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России организовано производство пробиотика «Витафлор®», зарегистрированного как БАД в следующих формах: лиофилизат биомассы в пенициллиновых флаконах, лингвальные таблетки и® порошок лиофилизированной биомассы «Витафлор -сырье» (акт об организации производства, приложение 2). Форма «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий «Витафлор®-сырье», предназначена для обогащения кисломолочных пищевых продуктов и производства биологически активных добавок, а также для получения на специализированных предприятиях суппозиториев, саше и капсул желудочного или кишечного растворения. Технологии получения различных форм защищены патентами РФ.

Доклинические исследования «Витафлора»® проведены в полном объеме. Данные токсикометрии, наблюдения за экспериментальными животными в постинтоксикационный период острого отравления, а также результаты некропсии позволяют отнести «Витафлор»® к V классу нетоксичных лекарственных веществ. Состояние животных после введения препарата свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические (порядка 10 мг/кг) в сотни и тысячи раз.

Фармакологическую активность «Витафлора»® изучали на модели дисбактериоза у белых крыс, вызванном внутрижелудочным введением ацетата свинца. Показано, что пробиотик при введении в дозе 0,3 мг/кг на протяжении 2 месяцев, оказывает нормализующее влияние на микрофлору кишечника.

Изучение иммунологической активности «Витафлор»® показало, что на фоне приема пробиотика происходит увеличение в энтеральных средах содержания иммуноглобулинов класса А (1§А). Препарат обладает адъювантными свойствами при вакцинации животных белковыми (овальбумин) и корпускулярными (эритроциты барана) антигенами, которые проявляются в выраженном усилении клеточного и гуморального ответов.

Опыт клинического применения- препарата «Витафлор»® (см. главу 3.4) подтвердил его высокий терапевтический потенциал и позволяет отнести бактериальные препараты на основе симбиотических штаммовых систем к новому поколению пробиотиков с высоким уровнем фармакологической активности.

Далее в диссертации рассмотрен вопрос о применимости модели пробиотического действия бактериальных препаратов для обоснования выбора пробиотика в конкретных клинических случаях. Эффективность использования бактериального пробиотика в профилактической и лечебной практике, согласно модели, определяется не только свойствами производственного штамма, но и формой доставки препарата. Форма должна обеспечивать адресность доставки препарата и защиту от инактивирующих факторов сред организма.

При выборе пробиотического бактериального препарата большое значение имеют количество жизнеспособных микробных клеток в 1 дозе препарата и способность перехода пробиотического штамма в состояние активного метаболизма в энтеральных средах пациента. Необходимо так же, чтобы штамм пробиотика проявлял антагонизм по отношению к конкретным этиологическим агентам, вызвавшим заболевание или определяющим тяжесть его течения, и, при. этом был устойчивым к контрантагонизму этих агентов. Обязательным условием является биосовместимость штамма препарата с нормальной микрофлорой пациента. Для получения положительного результата при применении препарата важно наличие у него иммуномодулирующей активности. Врач должен знать особенности иммуномодулирующей активности того или иного препарата и учитывать эти особенности при его назначении.

В диссертации показано, что преимущества по содержанию« жизнеспособных бактериальных клеток и вероятности их перехода в состояние активного метаболизма имеют пробиотики на основе симбиотических композиций штаммов.

Антагонистическая активность бактериальных пробиотиков» должна соответствовать следующим критериям:, эффективности (наличии антагонизма к этиологическому агенту заболевания, который должен быть оценен in vitro в условиях клинической лаборатории.), устойчивости к контрантагонизму этиологического агента и биосовместимости (отсутствию эффектов «пробиотик против хозяина» и «хозяин против пробиотика»).

Выбор пробиотиков по характеру действия на иммунную систему в настоящее время ограничен отсутствием систематических сравнительных исследований и сталкивается с недостаточностью клинических знаний о том, какая коррекция иммунологических характеристик необходима при том, или ином заболевании.

Согласно предложенной модели для наблюдения иммуномодулирующего эффекта при применении пробиотика важна форма его применения. Поскольку захват клеток пробиотика дендритными или М-клетками носит пассивный или вероятностный характер, для осуществления иммуномодуляции необходимо создание повышенной концентрации клеток пробиотика на определенном участке слизистой. Этого можно; добиться путемг использования соответствующих форм пробиотика (капли, капсулы, лингвальные таблетки, суппозитории).

В зависимости от характера заболевания, его тяжести и задачи; решаемой врачом, форму пробиотика подбирают исходя из общих представлений, желаемом месте локализации пробиотика на слизистой и т.д. Пробиотики длительного срока хранения выпускают в следующих традиционных формах: лиофилизат биомассы во флаконах или ампулах, в капсулах, в ректальных или вагинальных суппозиториях, прессованных таблетках. Инновационной формой пробиотиков являются разработанные нами пористые быстрорастворимые таблетки. В ряде клинических случаев эффективной формой является молоко, ферментированное пробиотиком. Каждая форма имеет свои преимущества и ограничения, которые надо учитывать при выборе.

Таким образом, алгоритм выбора терапевтически активного пробиотика для решения конкретной клинической задачи состоит из анализа жизнеспособности содержащегося в его составе штамма, его пробиотического потенциала, определенного in vitro, и выбора формы препарата, адекватной лечебной задаче.

Результаты клинической апробации предложенного алгоритма выбора бактериального пробиотического препарата в конкретных случаях приведены в главе 3.4. В качестве примера в диссертации рассмотрен алгоритм выбора бактериального пробиотического препарата для эрадикации Helicobacter pylori у больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, вызванных этим возбудителем. Выбор проведен на основе результатов сравнительного исследования трех пробиотиков:

Бифидумбактерина» на основе B.bißdum №1, «Лактобактерина», содержащего L.plantarum 8Р-АЗ, и «Витафлора»®. По числу жизнеспособных бактериальных клеток в 1 дозе препарата и вероятности перехода производственного штамма препарата в энтеральных средах макроорганизма в состояние активного метаболизма, преимущество имеет «Витафлор»® (см табл. 6 строка -урожай биомассы). Выбор пробиотика по критерию антагонистической активности моноштаммов «Витафлор»® и производственных штаммов «Бифидумбактерина» и «Лактобактерина» к клиническим изолятам Н.pylori (табл.11)> базировался на экспериментальном материале. Показано, что моноштаммы «Витафлор»® обладают ярко выраженным антагонизмом (зона задержки роста H.pylori более 50 мм), в то время как L. plantarum 8Р-АЗ и В. bifidum № 1 антагонизм к исследованным изолятам не проявляли. Биосовместимость штаммов «Витафлор»® с нормальной микрофлорой пациента в пилорическом отделе желудка можно не определять, так как численность микроорганизмов в этом биотопе чрезвычайно мала (см. рис.1). Следовательно, для эрадикации H.pylori по совокупности свойств предпочтение имеет «Витафлор»®. В данном случае была использована кисломолочная форма пробиотика. В этой форме препарата бактериальные клетки находятся в состоянии активного метаболизма и защищены от инактивирующего влияния факторов желудочного сока денатурированным казеином молока (см. рис. 18). Как следствие, возможны непосредственные контактные взаимодействия пробиотика с H.pylori в пилорическом отделе желудка. Практика подтвердила правильность сделанного выбора. Во всех случаях клинического использования кисломолочной формы «Витафлор»® для лечения больных с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированными с H.pylori, наблюдался высокий терапевтический эффект, в том числе при лечении MALT-лимфомы желудка. Применение «Витафлор»® в других формах (капсульной или суспензионной) не дают ожидаемого терапевтического результата.

Другим примером использования алгоритма выбора пробиотика и формы его применения приводится при лечении рецидивирующих респираторных заболеваний у детей. В данном случае использовали интраназальное введение концентрированной водной суспензии «Витафлор»®. Положительный результат при применении пробиотика связан не только с его высоким антагонизмом к представителям родов Streptococcus, Staphylococcus или Klebsiella, обильно заселяющим соответствующий биотоп, но и с особенностями иммуномодуляции назально-ассоциированной лимфоидной ткани (NALT). Применение концентрированной суспензии бактериальных клеток, наносимой на лимфоидную ткань Пирогова-Вальдейрова кольца, создает условия для контактного взаимодействия пробиотика и возбудителей заболевания, способствуя элиминации последних. Кроме этого, концентрированная суспензия пробиотика повышает вероятность захвата его бактериальных клеток дендритными клетками макроорганизма, которые осуществляют иммуномодуляцию. Аналогичный эффект наблюдается при подъязычном применении лингвальных таблеток. Поскольку лингвальные таблетки обладают пористой структурой и время их распада чрезвычайно мало, в подъязычной зоне создается концентрационное давление клеток пробиотика, благодаря чему повышается вероятность иммуномодулирующего эффекта.

Таким образом, можно отметить, что поставленная в начале исследования цель достигнута. Разработана модель механизма пробиотического действия бактериальных препаратов, анализ которой позволил не только предложить биотехнологические пути конструирования новых пробиотиков, но и сформулировать алгоритм выбора терапевтически активного пробиотика и формы его применения в конкретных клинических случаях.

С нашей точки зрения привлекательность предложенной модели- пробиотического действия бактериальных препаратов заключается в том, что она имеет открытый характер и с появлением новых экспериментальных данных может быть уточнена, детализирована и дополнена.

Следствия анализа модели, касающиеся биотехнологии, не ограничиваются созданием бактериального пробиотика нового поколения «Симбиотический комплекс ацидофильных бактерий

Витафлор» . Изучение механизма действия пробиотиков привело к разработке других оригинальных препаратов. Так были предложены препараты на основе регуляторных метаболитов пробиотических штаммов или их синтетических аналогов, которые можно назвать метаболитными пробиотиками (Петров Л.Н., Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., 2006). Один из таких препаратов - «Актофлор-С» в настоящее время проходит стадию доклинических исследований. Результаты экспериментов по определению фармакологической активности «Актофлора-С» на животных по лечению резерпиновых язв кишечника и дисбактериозов, вызванных антибиотиками, показали его эффективность и открывают возможность конструировании других метаболитных пробиотиков.

Развитием этого нового направления является также создание бактериально-метаболитного пробиотика «Витафлор-форте». Препарат содержит симбиотическую композицию ацидофильных бактерий и дополнительно 10% по массе синтетического аналога низкомолекулярных метаболитов пробиотического штамма E.coli М-17. Указанные компоненты введены в бактериальный препарат с целью сокращения продолжительности лаг-периода при реактивации штаммов в энтеральных средах пациента и повышения уровня их антагонистической активности к патогенной' и условно-патогенной микрофлоре.

Можно полагать, что биотехнологические следствия модели пробиотического действия бактериальных препаратов не ограничиваются перечисленными примерами.

Варианты алгоритма выбора препарата при решении конкретной терапевтической задачи, вытекающие из анализа модели и описанные в диссертации, также могут дополняться по мере расширения представлений о влиянии пробиотических штаммов и продуктов их жизнедеятельности на макроорганизм. Так, например, в последнее время появились работы, описывающие влияние пробиотика на метаболизм клеток органов человека (Martin Francois-Pierre J и др. 2008). Результаты собственных последних исследований также свидетельствует о том, что низкомолекулярные метаболиты пробиотических бактерий могут регулировать процессы клеточной пролиферации в тканях с высоким регенеративным потенциалом, например лимфоидной ткани (Вахитов Т.Я., Петров JI.H. и др. 2009). Безусловно, этот уровень взаимодействия можно и нужно ввести в рассматриваемую модель, но после того, как будет накоплен необходимый объем экспериментального материала. При этом могут появиться новые аргументы в пользу выбора пробиотика при лечении определенных заболеваний.

Подводя итоги всей работы в целом, можно считать, что разработанная модель пробиотического действия бактериальных препаратов оказалась полезной в обосновании нового направления в медицинской биотехнологии создания новых пробиотиков и алгоритмов выбора их в решении конкретных терапевтических задач и при этом потенциал модели не исчерпан.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Петров, Леонид Николаевич, Санкт-Петербург

1. Агаджанян H.A., Труханов А.И., Шендеров Б.А. Этюды об адаптации и путях сохранения здоровья. - М.: Сирин, 2002. - 156 с.

2. Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. Становление пробиотикотерапии в

3. России.// Вестник РАМН, 2005, 12, с. 3-13

4. Амерханова A.M. Научно-производственная разработка новыхпрепаратов-синбиотиков и клинико-лабораторная оценка их эффективности //М., автореферат дисс. на соикание уч. степени доктора биологических наук, 2009, С.48

5. Багрянцев Е.А., Свентицкий E.H., Петров Л.Н. Исследование водного обмена в клетках Е. coli в присутствии D20 методом ИК-спектроскопии.// Биофизика, т. XXVIII, вып. 5, стр. 835-837, 1983.

6. Беккер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов//Рига: Зинатне, 1981.-253 с.

7. Белобородова Н.В., Осипов Г.А. Гомеостаз малых молекул микробного происхождения и его роль во взаимоотношениях микроорганизмов с хозяином.//Вестник РАМН. -1999. Т. 16. -№7. с. 25-31.

8. Беляев И.М. Иммунная система слизистых // Иммунология. -1997.-№4.-С. 7-13.

9. Бондаренко В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл.//Журн. Микробиол. 2006, 2, с. 89-97

10. Бондаренко В.М. Роль условно-патогенных бактерий кишечника, в. полиорганной патологии человека //М.-Тверь, из-во «Триада», 2007, С. 64

11. Бондаренко В.М., Воробьев A.A. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией //Журн. Микробиол., 2004, №1, С.84-92

12. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А. Механизм действия пробиотических препаратов //М., БИОпрепараты, 2003, №3, С. 2-7

13. Бочков И.А., Семина A.A. и др. Микробная колонизация и сукцессия в толстой кишке у новорожденных при совместном с матерью пребывании в родильном доме //Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т. 36, № 12, С. 286-289

14. Бухарин О.В. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе «паразит-хозяин»; // Журн. микробиологии. 1997. - № 4. — С. 3-9.

15. Бухарин О.В., Валышев A.B., Гильмутдинова Ф.Г., Гриценко В:А., Карташова B.JL, Кузьмин М.Д., Усвятцов В.Я., Черкасов C.B. Экология микроорганизмов человека. // Екатеринбург: УрО РАН, 2006.- 479 с.

16. Вахитов Т.Я. Регуляция функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях // Автореферат диссертации на соискание уч. степени доктора биологических наук. — Санкт-Петербург, 2007.

17. Вахитов Т.Я., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты.//Журн. Микробиол., 2006, 5, с. 108-114

18. Вахитов Т.Я., Чалисова Н.И., Балыкина H.A., Петров Л.Н., Ноздрачёв А.Д. Модулирующее влияние метаболитов микрофлорычеловека и животных на культуру лимфоидной ткани.//Доклады Академии наук, 2009, т 428, №1, с. 121-124

19. Волков В.Я. К вопросу о физиологических и физико-химических механизмах устойчивости микроорганизмов к замораживанию и высушиванию //Микробиология, 1994, т. 63, вып. 1,С. 5-16

20. Гершанович M.JL, Петров JI.H., Добрица В.П., Калиновский В.П., Никитина М.В. Способ лечения MALT-лимфомы желудка-путем эрадикации Helicobacter Pylori витафлором // Вопросы онкологии. 2006. - Т. 52. - № 6. - С. 696-698.

21. Глушанова H.A., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro //Журн. микробиологии. -2005.-№2.-С. 56-61.

22. Горская Е.М. и др. Биологическая характеристика штаммов лактобацилл, перспективных в качестве эубиотиков //Журн. микробиологии. 1992. - № 3. - С. 17-20.

23. Гриценко В.А., Брудастов Ю.А., Журлов О.С., Чертков K.JL Свойства эшерихий, выделенных из организма мышей при бактериальной транслокации после иммобилизационного стресса //Журн. микробиологии. 2000. - № 2. - С. 37-41.

24. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий: Учебное пособие.// JL: Изд. Ленинградского университета, 1989. С. 248.

25. Дисбиоз кишечника. Руководтво по диагностике и лечению. Под редакцией Е.И.Ткаченко и А.Н.Суворова // СПб, СпецЛит, 2007, С. 238

26. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная характеристика антагонистической активности лактобацилл//Журн. Микробиологии, 2004, №5, с. 167-173

27. Ермоленко Е.И.,Черныш А.Ю., Берлов М.Н.,Тотолян А.А.,Суворов А.Н. Антагонистическая активность энтерококков в отношении StreptococcuspyoenesJiBecTwiK СПб университета, серия. 11, медицина, в. №3, с. 137-144

28. Ждан-Пушкина С.М. Основы роста культур микроорганизмов: Учебное пособие.// Л.: Изд. Ленинградского университета, 1983. — С. 187.

29. Жуковский А.П., Ровнов Н.В., Петров Л.Н. Термостабильность пространственной организации молекул белков и механизм ее поддержания.// Доклады Академии Наук СССР, т. 308,стр. 218-222, 1989.

30. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию: Учебное пособие.// М.: Книжный дом «Университет», 2001. 256 е., ил.

31. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлинский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных // Иммунология. -2004.-№5.-С. 288-290.

32. Зуева Н.В. Эпидемиологические особенности внебольничных пневмоний у военнослужащих и совершенствование их профилактики//автореферат дисс. на соикание уч. степени канд. мед.sнаук. 2006, Санкт-Петербург.

33. Карсонова М.И., Пинегин Б.В. Лимфоидные образования слизистых оболочек: принципы топической иммунизации //Иммунология. 2003. - № 6. - С. 359-365.

34. Кафарская Л.И. и др. Изучение влияния кисломолочногоtбифидумбактерина на микрофлору летчиков-испытателей //Журн. 1 микробиологии. 1992. - № 4. - С. 12-14.

35. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины //СПб, ООО «Из>во Фолиант», 2008, 552 с. 1 38. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете //Санктг

36. Петербург: Наука, 2006. С. 261.

37. Лахтин В.М., Афанасьев С.С. и др. Стратегические аспектыконструирования пробиотиков будущего //Вестник РАМН, 2008,2, С. 33-44

38. Лихтенштейн A.B., Потапова Г.И. Генетические дефекты какмаркеры опухолевого роста //Мол. биология. 2003. - Т. 37. - № 2. -С. 1-13.к

39. Лобзин Ю.В. и др. Повышение неспецифической 1 резистентности человека к инфекционным возбудителям ; бактериальной, вирусной и грибковой природы //Инфекционные 1 болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины.

40. Материалы конференции. Санкт-Петербург, 2006. — С. 192-193.

41. Маянский А.Н. Микробиология для врачей.// НГМА Н. Новгород, 1999.

42. Младзиевская Ю.А. Совершенствование биотехнологического производства и методов контроля качества пробиотиков на основе бифидобактерий и лактобацилл // Автореферат диссертации на соискание уч. степени кандидата биологических наук. Санкт-Петербург, 2005.

43. Несчисляев В .А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспектыбполучения, контроля и конструирования препаратов // автореферат дисс. на соикание уч. степени доктора, мед. наук. 2005, Пермь, С. 44

44. Олескин A.B. Биополитика. Политический потенциал современной биологии: филосовские, политологические и практические аспекты. М. изд-во Института философии РАН, 2001, с. 423

45. Олескин A.B. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях //Микробиология, 1993, т.62, № 3, с.389-403

46. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Кировская Т.А. Микробная эндокринология и биополитика //Вестник Московского Университета. Сер. Биология, 1998, №4, с.3-10

47. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова ЕА. Колонианальная организация имежклеточная коммуникация у микроорганизмов //Микробиология, 2000,т. 69, №3, с. 53-60

48. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. (ред) Иммунобиологические препараты, перспективы применения в инфектологии. М., ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002

49. Петров Л.Н., Вахитов Т.Я., Бондаренко В.М., Воробьев A.A. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов.// Вестник Российской АМН, 2006, №1, стр.3 8-45 *

50. Петров Л.Н., Вербицкая Н: Б., Добрица В.П., Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. СПб, 2008, ФГУП Гос.РИИ ОЧБ, с. 136

51. Петров Р.В: Иммунология //М.: Медицина, 1987. — 416 с.

52. Пиневич А. В: Микробиология. Биология прокариотов: Учебник. В 3 т. Том 1.// СПб. Изд-во G.-Петерб. ун-та, 2006, с.352

53. Поспелова В:В., Шабанская М-А. и др: Биологическая характеристика некоторых производственных и свежевыделенных штаммов лактобацилл //Медицинские аспекты микробной экологии: под ред. Шендерова Б.А. М., 1992. - Вып. 6. - С. 54-57.

54. Суворов А.Н. Полезные микробы кто они? //Природа, 2009, № 7, с.21-30

55. Суворов А.Н., Грабовская К.Б., Воробьева Е.И., Алехина Г.Г. Пробиотики или патогенны? Критерии выбора и оценка клинического штамма. //Гастроэнтерол. 2002, т.4,с.36-38

56. Тец В.В. Справочник по клинической микробиологии //Санкт-Петербург: Стройлеспечать, 1994. — 224 с.

57. Ткаченко Е.И., Суворов А.Н. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению //СПб, СпецЛит, 2007, с.238

58. Ткаченко Е.И., Успенский Ю.П. Питание, микробиоценоз и интеллект человека //2006, СПб., СпецЛит, 560 с.

59. Угол ев A.M. Теория адекватного питания и трофология //Санкт-Петербург: Наука, 1991.-272 с.

60. Хаитов P.M. Физиология иммунной системы.// М., 2001, с. 173

61. Хорошилова Н.В. Иммуномодулирующее и лечебное действие пробиотиков //Иммунология. 2003. - № 6. — С. 352—356.

62. Шварц С.С. Метаболическая регуляция роста и развития животных на популяционном и организменном уровнях // Известия АН СССР. Сер. Биологическая. 1972. - № 6. - С. 822-835.

63. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология: некоторые итоги и перспективы исследований .//В естник РАМН 2005, 12, с.13-17

64. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции //Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1. -М.: Грантъ, 1998. с. 288.

65. Шендеров Б.А. Пробиотики и функциональное питание //Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т 3.- М.: Гранть, 2001. с:288

66. Шпаков АО. Сигнальные молекулы бактерий непептиднойiприроды QS-типа//Микробиология, 2009; т.78, №2, с.163-175

67. Aderem A., Ulevitch R.J. Toll-Нке receptors in the induction of the innate immune response //Nature. 2000: - Vol: 406. - P. 782-787.

68. Alvares S., Herroro C., Bru E., Perdigon G. Effect of Lactobacillus casie and yogurt administration on prevention? of Pseudomonas aeragenosa infection in jonug mice //J. Food Prot. — 2001. Vol. 64. - № 11.-P. 1768-1774.

69. Asanuma H., Aizawa C., et al: IgA antibody-forming cells responses in: nasalrassociated lymphoid tissue of mice vaccinated by intranasal^, intravenous and/or cubcutaneous administration //Vaccine. 1998. - Vol. 16.-P. 1257-1262.

70. Beloborodova N.V., Osipov G.A: 2000: Small molecules originating from microbes (SMOM) and their role in microbes-host relationship/ZMicrob. Ecol. Heal. Dis., SCUP, 12: 12-21.

71. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic flora // Gut.1998. №42(1). P.2-7.

72. Boyle, R.J. & Tang, M.L.K. The role of probiotics in the management of allergic disease. // Clin. Exp. Allergy 2006, 36, p. 568576

73. Brandtzaeg, P. Induction of secretory immunity and memory at mucosal surfaces.// Vaccine 2007, 25, p. 5467

74. Brunei A., Gouet P. Kinetic Dacterial implantation in the intestine ofV

75. Newborn Rats //in Recent Advances in Germfree Research. — Tokai Univ. Press.-1981.

76. Chen T., Toivanen P., Vainio O. Suppression of antigen-specific lymphocyte roliferation by Gram-positive bacterial cell walls // APMIS. 2002. №110(6). P.490-498.

77. Chen, Y., K. Song, S. L. Eck. An intra-Peyer's patch gene transfer model for studying mucosal tolerance: distinct roles of B7 and IL-12 in mucosal T cell tolerance.// J. Immunol. 2000,165, p:3145

78. Chung T.C., Axelsson L., Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. In vitro studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri // Microbial ecology in health and disease, 1989,V.2, P. 137-144.

79. Coffinn S.E., Clark S.L. Induction of intestinal rotavirus-specific antibodies in respiratory, but not gut, lymphoid tissues following mucosal immunization of mice with inactivated rotavirus //Virology. 2001. -VoL 291.-P. 235-240.

80. Coffman R., Weid T. Multiple pathways for the initiation of T helper-2(Th2) responses//JEM.1997.№185(3). P.373-376.

81. Cossart P., Sansonetti P. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens // Science. 2004. - V. 304. - P. 242-248.

82. Cross M.L. et al. Microbes versus microbes: immune signal generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens // FEMS. 2002. №34(9). P.245-253.

83. Cunningham A J & Szenberg A. Further improvements in the plaque technique for. detecting single antibody-forming cells // Immunology. -1968.-V. 14.-P. 599-600.

84. Diep D.B., Axelsson L., Grefsli C., Nés I.F. The synthesis of the bacteriocin sakacin A is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system // Microbiol., 2000, V. 146, P. 2155-2160.

85. Eijsink V.G., Bruberg M.B., Middelhoven P.H., Nes I.F. Induction of bacteriocin production in Lactobacillus sake by a secreted peptide // J. ofBacteriol., 1996, V.178, № 8, P. 2232-2237.

86. Ericson K.L., Hubbard N.E. Probiotic immunomodulation in health and diseas //J.Nutr.2000. №130(2).P.403 409.

87. Faria A.M.C., Weiner H.L. Oral tolerance: mechanisms and therapeutic applications // Adv. Immunol. — 1999. — Vol. 73. — P. 153364.

88. Feleszko, W. et al. Probiotic-induced suppression of allergic sensitization and airway inflammation is associated with an increase of T regulatory-dependent mechanisms in a murine model of asthma. //Clin Exp Allergy 2007, 37, p.498-505

89. Fischetti, V.A., Medaglini, D., Oggioni, M. & Pozzi, G. Expression of foreign proteins on gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.// Curr. Opin. Biotechnol. 1993,4, p. 603-610

90. Furuse M., et al. Over expression of occluding, a tight juncion-associated integral membrane protein, induces the formation of intracellular multilamellar bodies bearing tight junction-like structures // J. Cell. Sci. 1996. - Vol. 109. - P. 429-436.

91. Gillis S., Ferm M.M., Ou W., Smith K.A. T cell grouth factor: parameters of production and quantitative assay for activity // J. Immunol.-1982.-V. 120.-P.2027-2032.

92. Girardin S., et al. Nodi defects a unigue muropeptide from Gramnegative bacterial peptidoglican // Science. 2003. - Vol. 300. - P. 1584-1587.

93. Golenbock D.T., et al. LipidA-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. -Vol. 266. - P. 19490-19498.

94. Granato D., et al. Cell surface-associated elongation factor Tu mediates the attachment of Lactobacillus johnsonii NCC533 (Lai) to human intestinal cells and mucins // Infect. Immun. — 2004. Vol. 72. -P. 2160-2169.

95. Haller D., Blum S., Bode C. et al. Activation of human peripheral blood

96. Hanehan D., R.A. Weinberg. The Hallmars of Cancer // Cell. 2000. -Vol. 100.-P. 57-70.

97. Hart A.L., R.Lammers, et al. Modulation of human dendritic cell phenotype and function by probiotic bacteria // Gut. — 2004. — № 53. — P. 1602-1609.

98. Hecht G.A. In Microbial Pathogenesis and the intestinal Epithelial Cell (ed. Htcht G.A.) // American Society for Microbiology Press, Washington DC. 2003. - P. 285-300.

99. Henderson B., Poole S., Wilson M. Bacterial modulins: a novel'class of virulence factors which cause host tissue pathology by inducing cytokine synthesis //Microbiol.Mol.Biol.Rev.l996.№ 60(2). P.316-341.

100. Hentzer M., Givskov M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 112. - № 9. - P. 1300-1307.,

101. Hill M. J. Microbes and Human Canceroginesis // Ed. by E. Arnold Ltd., London. 1986.

102. Horie H.,Kanazawa K., Okada M. et al. Effects of intestinal bacteria on thedevelopment of colonic neoplasm:an experimental study// Eur. J. Cancer Rev. 1999. №8(3). P.237-245.

103. Hull, M.W. & Chow, A.W. Indigenous microflora and innate immunity of the head and neck.// Infect. Dis. Clin. North Am. 2007, v |43, p.265—282,

104. Isaacson P. Gastric lymphoma and Helicobacter pylori // New Engl. J. Med.-1994.-Vol. 330.-P. 1310-1317.

105. Isolauri E. et al. Probiotics: effects on immunity//AJCN. 2001. №73(2).P.444-450.

106. Jijon H., et al. DNA from probiotic bacteria modulates murine and human epithelial and immune functions // Gastroenterology. 2004. -Vol. 126.-P. 1358-1373.

107. Kalliomaki, M. et al. Probiotics in primary prevention of atopic disease: a randomised placebo-controlled trial.// Lancet 2001, 357, p. 1076-1079

108. Kandier O., Weiss N. Regular, nonsporing gram-positive rods — in Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, 1985, V.2, P. 1209 1234.

109. Kelly D., Conway S., Aminov R. //Review TRENDS in Immunology. 2005. - Vol. 26. - № 6. - P. 326-332.

110. Kindon H., et al. Trefoil peptide protection of intestinal epithelial barier function: cooperative interaction with mucin glycoprotein // Gastroenterology. 1995. - Vol. 109. - P. 516-532.

111. Lee A., Fox J. Helicobacter pylori: what the animals have told us / in Germfree life and its Ramifications // Eds. K.Hashimoto, et al.: Shiozawa, Japan. —1996.

112. Lehrer R.I., Ganz T. Defensins of vertebrate animals // Cur. Opin. Immunol.-2002.-Vol. 14.-P. 96-102.

113. Lewenza S., Visser M.B., Sokol P.A. Interspecies communication between Bulkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa // Can. J. Microbiol. 2002. -V. 36.-P. 940-954.

114. Ley, R.E., Peterson, D.A. & Gordon, J.I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. //Cell 2006, 124, p. 837-848

115. Lilly D.M., Stillwell R.H. Probiotics: Growth promoting factors produced by microorganisms // Science. 1965. - Vol. 147. - P. 747748.

116. Litinskiy, M.B. et al. DCs induce CD40-independent immunoglobulin, class switching through BLyS and APRIL.// Nat. Immunol. 2002, 3, p.822-829

117. Macpherson, A.J. & Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. //Science, 2004, 303, p. 1662-1665.

118. Maldonado A., Ruiz-Barba J.L., Jimenez-Diaz R. Purification and genetic characterization of plantaricin NC8, a novel coculture-inducible two-peptide bacteriocin from Lactobacillus plantarum NC8 // Appl. Env. Microbiol., 2003, V. 69, №1, P. 383-389.

119. McComick B.A. et al. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattrctant (PEEC) activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by salmonella typhimurium // J. Immunol. 1998. -№ 160. - P. 455^156.

120. Meydani S.N., Ha W. Immunologic effects of yogurt //AJCN. 2000. №71(4).P. 861-872.

121. Mohamadzadeh, M. et al. Lactobacilli activate human dendritic cells that skew T cells toward T helper 1 polarization.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102, p. 2880-2885

122. Monteleone I. et al. Immunoregulation in the gut: success and failures in human disease // Gut. 2002. № 50(3). P.60-64.

123. Muriana P.M., T.R. Klaenhammer. Purification and partial-characterization of lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 53. - № 1. -P. 114-121.

124. Neutra M.R. Current concept in mucosal immunity. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system //AJP. 1998. №274(5). P.785-791.

125. Neutra M.R., Sansonetti P. In Microbial Pathogentsis and the intestinal Epithelial Cell (ed.Hecht G.A.), ASM Press, Washington DC. -2003.-P. 23-42.

126. Nimishikavi, S. & Stead, L. Images in clinical medicine. Streptococcal pharyngitis. //N. Engl. J. Med., 2005, elO |

127. Odenbreit S., et al. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion // Science. 2000. - Vol. 287. -P. 1497-1500.

128. Oh S., Kim S.H., Worobo R.W. Characterization and purification of a bacteriocin productd by potential probiotic culture // J. Dairy Sci. -2000. Vol. 83. - P. 2747-2752.

129. Ouwehand, A. C., P. V. Kirjavainen, C. Shortt, E. Salminen. Probiotics: mechanisms and established effects. // Int. Dairy 1999, J. 9 p. 43

130. Ouwehand, A.C. Antiallergic effects of probiotics.// J. Nutr. 2007, 137, p. 794-797

131. OrHara, F. Shanahan. The gut flora as a forgotten organ // EMBO reports. 2006. - Vol. 7. - P. 688-693.

132. Park, H.S. et al. Primary induction of CD4 T cell responses in nasal associated lymphoid tissue during group A streptococcal infection. // Eur. J. Immunol. 2004, 34, p. 2843-2853

133. Park, H.S., Francis, K.P., Yu, J. & Cleary, P.P. Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.// J. Immunol. 2003, 171, p.2532—2537

134. Perdigon G., Fuller R., Ray a R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system //Curr.Issus.Intest.Microbiol. 2001.№2(1). P.27-42.

135. Plant L., Conway P. Association of Lactobacillus spp. with Peyer's patches in mice //CDLI. 2001. № 8(2). P.320-324.

136. Pulendran B., et al. Lipopolysaccharides from distinct pathogens induce different classes of immune responses in vivo // J. Immunol. — 2001. — №167. P. 5067-5076.

137. Ray. B "Probiotics of lactic acid bacteria: science or myth?"- in: Lactic acid bacteria: ccurrent advantages in metabolism, genetics and applications //NATO ASI Series H: Cell Biology, 1996, V. 96, P. 101 -136

138. Renner E. Cultured Dairy Products in Human Nutrition // Bull. IOF. -1991.-Vol. 255.-P. 24.

139. Rescigno M., et al. Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria // Nature Immunol. -2001. Vol. 2. - P. 361-367.

140. Rigby R.J., Hart A.L. et al. Differential production of IL-10 and IL-12 by colonic dendritic cells in response to bacterial8 stimuli // Gastroenterology. 2002. - № 122. - A75.

141. Roos M.N., Katan M.B. Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipidmetabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and 1998 //AJCN. 2000. №71(2). P.405-411.

142. Sansonetti Ph. War.and peace at mucosal surfaces // Immunology. -2004. Vol. 4. - P. 953-964.

143. Shanahan, F. Immunology: therapeutic manipulation of gut flora.// Science 2000,289,p. :1311

144. Shojaei Amir H. Buccal mucosa as a route for systemic drug delivery: a review // J. Pharm Pharmaceut Sci. 1998. - 1 (1). - P. 1530.

145. Sonnenburg J.L., et al: Glican foraging in vivo by intestine adapted bacterial symbiont // Science. 2005. - Vol. 307. - P. 1955-1959.

146. Specian R.D., Neutra M.R. // Mechanisms of rapid mucus secretion in goblet cells stimulated by acttilcholine. J. Cell Biol. - 1980. - Vol. 85.-P. 626-640.

147. Stagg A.J., Hart A.L., Knight S.C. and Kamm M.A. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria // Gut. 2003. - № 52. - P. 1522-1529.

148. Sullivan A. end Nord C.E.,Probiotics and gastrointestinal distases (Review article) IIJ. Intern. Med., 2005 -vol 275. p. 78-92

149. Tannock G.W., et al. Plasmid profiling of members of the family Enterobacteriaceae, lactobacilli and bifidobacteria to study the transmission of bacteria from mother to infant // J. Clin. Microbiol. -1990.-№ 6.-Vol. 28.

150. Vakhitov T.Y., Petrov L.N. Regulatory functions of bacterial exometabolites // Microbiology. 2006. - Vol. 75. - № 4. - P. 483^188.

151. Van der Waaij D. Evidence of immunoregulation of the composition of intestinal microflora and its practical consequences // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1988. - Vol. 7.

152. Van der Waaij D. The Immunoregulation of the Intestinal Flora: experimental investigations on the development and the composition of the microflora in normal and thymusless mice // Microecol. Therapy. -1984.-Vol. 14.

153. Watanabe I., Hagiwara Y., et al. Characterization of protective immune responses induced by nasal influenzae vaccine containing mutant cholera toxin as a save adjvant (CT112K) // Vaccine. 2002. -vol. 20.-P. 3443-3455.

154. Weems W.A. Intestinal fluid flow: its production and control // Ed. L. R. Iohson, New York: Raven Press. 1987. - Vol. 1. - P. 571-593.

155. Weid T. et al. Induction by a lactic acid bacterium of population CD4+ T cells with low proliferative capacity that produce Transforming Growth Factor-ß and Interleukin-10// CDLI.2001.№ 8(4).P.695-701

156. Weintraub A., et al. Structural characterization of the lipidA component of Bacteroides fragilis strain NCTC9343 lipopolysacharide // Eur. J. Biochem. 1989. - Vol. 183. - P. 425-431.1. Благодарности

157. Настоящая работа комплексная, в выполнении которой приняли творческое участие многие сотрудники института и известные в Санкт-Петербурге клиницисты, за что автор выражает им глубокую благодарность.

Информация о работе

Петров, Леонид Николаевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Микроэкологические и биотехнологические основы создания и эффективного применения новых бактериальных пробиотических препаратов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы