Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование технологии приготовления пробиотика на основе лактобактерий, оценка его свойств и эффективности применения в птицеводстве

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование технологии приготовления пробиотика на основе лактобактерий, оценка его свойств и эффективности применения в птицеводстве"

На правах рукописи

Овсянников Юрий Степанович

Совершенствование технологии приготовления пробиотика на основе лактобактерий, оценка его свойств и эффективности применения в птицеводстве

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Н >- •

Москва - 2009

003485991

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Мирзаев Микаиль Нурбагандович

доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К. А. Тимирязева».

Защита состоится «23»декабря 2009 года в «10-00» час на заседании диссертационного совета Д 220.042. 01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан « 20 » ноября 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета, профессор.

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В настоящее время в числе высокоэффективных лечебно -профилактических препаратов отечественными и зарубежными специалистами рассматриваются пробиотики (эубиотики). Пробиотики - это биопрепараты из живых безвредных для организма животных, антагонистически активных бактерий. Перспективными в отношении предотвращения заболеваний желудочно-кишечного тракта являются представители нормальной микрофлоры животных и птицы - молочнокислые бактерии, обладающие широкой природной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Смирнов В.В., 1992; Стегний Б.Т., 2005; Субботин В.В., 2008; Тихонов И.В. с соавт., 2008). Учитывая отмеченное, создание эффективных препаратов на основе микроорганизмов с пробиотическими свойствами и совершенствование технологий их приготовления является весьма актуальной задачей.

Практика показывает, что наиболее эффективными при профилактике заболеваний сельскохозяйственной птицы являются пробиотические препараты на основе штаммов микроорганизмов, которые выделены от здоровых особей. Для создания нового пробиотического препарата были исследованы биологические свойства 12 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных от кур птицефабрик Кировской области, доказана эффективность лабораторного образца препарата, приготовленного на основе отобранного штамма Р6 с использованием разработанной питательной среды и усовершенствованной технологии.

Создание нового пробиотического препарата потребовало разработку и введение в процесс приготовления усовершенствованной питательной среды (ПС) для накопления биомассы микробных культур на стадиях процесса приготовления готовой формы препарата, а также разработку и внедрение в технологический процесс новой операции по приготовлению стабилизированной рабочей культуры (СРК) из посевной микробной культуры, выращенной глубинным способом в бутылях.

Цель работы - создание усовершенствованной технологии производства, пригодной для промышленного выпуска пробиотика на основе выделенного штамма Lactobacillus plantarum, с использованием в качестве посевного материала стабили-

зированной рабочей культуры и вновь разработанной по составу жидкой питательной среды для получения нативной культуры (НК) при глубинном способе выращивания в аппаратах-культиваторах (АКБ).

Задачи исследования

1. Усовершенствовать методику выделения лактобактерий, сохранить и поддержать эталонные штаммы полученных молочнокислых бактерий, изучить их биологические свойства.

2. Разработать технологию приготовления стабилизированной рабочей культуры и обосновать пропись защитной среды.

3. Отработать методику приготовления лабораторного и промышленного образца пробиотического препарата при использовании разработанной ПС и СРК и исследовать стабильность и воспроизводимость его прикладных и эксплуатационных характеристик.

4. Изучить специфическую безопасность и токсичность пробиотического препарата на лабораторных животных.

5. Усовершенствовать имеющуюся технологию промышленного производства пробиотиков на основе лактобактерий глубинным способом в аппаратах-культиваторах, оценить лечебно-профилактическую эффективность нового препарата.

6. Создать нормативно-техническую документацию на приготовление готовой формы пробиотического препарата и его контроль.

Научная новизна

1. Впервые на основе выделенных в птицеводческих хозяйствах Кировской области штаммов лактобактерий оптимизирован способ поддержания посевных материалов и приготовления нативных культур, основанный на использовании стабилизированной рабочей культуры, хранящейся при минус 20°С в течение шести месяцев.

2. Впервые для приготовления в аппаратах-культиваторах нативной культуры глубинным способом культивирования в жидкой питательной среде предложен ее новый состав, обеспечивающий высокие ростовые характеристики лактобацилл при производстве.

3. Предложенная промышленная технология производства пробиотика позволяет табилизировать стадию культивирования за счет разработанной ПС и СРК, сокра-ить процесс приготовления НК на 5 суток Получен экономический эффект в расчёте :а суточную дозу молодняка кур на 24%. Себестоимость 1 суточной дозы пробио-ика, полученного по традиционной технологии, составила 1,58 копеек, а по усовершенствованной нами технологии -1,2 копейки.

Практическая значимость работы

1. Усовершенствованная промышленная технология за счет использования СРК окращает на 5 суток пусковой период производства, стандартизирует стадию вы-уска нативной культуры, снижает процент брака.

2. Включение в схему производства СРК, хранящейся в течение б месяцев при [инус 20°С, обеспечивает выпуск пробиотика на протяжении длительного периода ремени стандартным по составу посевным материалом в необходимых объемах.

3. Разработанная пропись жидкой питательной среды для приготовления НК беспечивает выход биомассы Lactobacillus plantarum в объеме регламентных требо-аний.

4. Приготовленный пробиотик на основе выделенного штамма Lactobacillus plan-irum Р6 при его применении в промышленном производстве молодняка кур повы-1ает их сохранность до 5%.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Между-ародной научно-практической конференции, посвященной 100- летию со дня рож-ения П.Г. Петского (Киров, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных абот, в том числе 3 статьи в сборнике международных конференций, 3 статьи в урнале, включённом в перечень ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 границах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собст-гнные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о прак-яческом использовании полученных результатов, рекомендации по использованию аучных выводов, список использованной литературы (138 источник, из которых 99 гечественных и 39 иностранных), 23 таблицы, 4 рисунка, приложения.

Научные положения и результаты, выносимые на защиту

1. Усовершенствование способа поддержания и хранения клеток штамма Lactobacillus plantarum Р6, использование разработанной питательной среды, стабилизированной рабочей культуры, внедрение отработанных параметров ведения процесса выращивания в аппаратах - культиваторах позволяет получить бактериальную культуру с полноценными биологическими свойствами, пригодную для производства пробиотического препарата.

2. Усовершенствованная технология производства позволяет сократить пусковой период производства нативной культуры на 5 суток, достигнуть экономического эффекта в снижении себестоимости суточной дозы препарата на 24%, получить про-биотический препарат на основе штамма лактобактерий с необходимыми биологическими и физико-химическими показателями качества.

3. Разработанный образец пробиотического препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum Р6 безвреден, нереактогенен и обеспечивает у птицы при оральном способе применения лечебно-профилактический эффект, выражающийся в снижении падежа до 5%.

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2009 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в лабораториях НИИ Микробиологии МО РФ, кафедре микробиологии, вирусологии и фармакологии ФГОУ ВПО Вятской ГСХА. Производственные опыты были проведены в птицеводческих хозяйствах Кировской области.

В работе изучили 12 штаммов Lactobacillus plantarum, выделенных из пищеварительной системы кур в птицехозяйствах, из которых для дальнейшей работы были выбраны два штамма РЗ и Р6. Для выращивания штаммов лактобактерий с целью оценки их биологических свойств готовили питательные среды на основе сред МРС-1 и МРС-4. При выращивании других микроорганизмов готовили плотные (ППС) и жидкие (ЖПС) дифференциальные или диагностические питательные среды, а также среды на основе перевара по Хоттингеру. Для получения биомассы при культивировании лактобактерий в аппаратах-культиваторах использовали питательную среду на основе ферментативного гидролизата казеина с различными вариациями составных частей, наиболее полно удовлетворяющими потребностям данного вида бактерий.

Биологические свойства лактобактерий оценивали общепринятыми методами. Антагонистическую активность выделенных штаммов РЗ и Р6 лактобактерий оценивали в отношении микробов тест-штаммов в сравнении с изученными штаммами лактобактерий.

Реактогенность, безвредность и токсигенность лабораторного образца препарата проверяли на беспородных белых мышах и морских свинках обоего пола, согласно ФС на «Лактобактерин».

Для оценки лечебно - профилактической эффективности лабораторного образца пробиотика использовали кур разных пород и возраста из птицехозяйств Кировской области.

Культивирование лактобактерий проводили в стеклянном биореакторе объёмом 5 л при температуре 38°С, исходном значении рН=6,0, в статических условиях, в аэробных и анаэробных условиях и перемешивании магнитной мешалкой (150 об/мин), а также в 20-литровых стеклянных бутылях. Конечную стадию культивирования проводили в биореакторе (БИОР) объёмом 250 л при температуре 38°С, исходном значении рН=6,0. Посевную дозу вносили в количестве не менее 0,4 млрд на мл ПС.

Оценку роста и физиологической активности бактериальной популяции проводили по динамике изменения концентрации бактериальных клеток, удельной скорости роста и времени генерации бактериальной популяции.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальное обоснование усовершенствования методики выделения молочнокислых бактерий от птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области. Выделение молочнокислых бактерий проводили из желудочно-кишечного тракта цыплят и взрослых кур. Высев проводили на плотные и жидкие питательные спеды. В качестве селективных добавок- использонагга тетоглотголевый натрий и этанол. Во всех случаях среды готовили на основе гидролизатов молока по Богданову с добавлением 0,25г/л цистеина и 1г/л Твин-80. Культивирование проводили при тем-

пературе 30°С и 37°С в среде воздуха, диоксида углерода и анаэробных условиях в течение 2-4 суток.

При изучении основных биологических свойств полученных культур установлено, что выделенные штаммы микроорганизмов относятся к группе грамположитель-ных неспорообразующих палочек, семейству Lactobacillacae, роду Lactobacillus.

Следующим этапом этой работы была оценка возможности пассирования полученных штаммов молочнокислых бактерий на плотных и жидких питательных средах. В ходе опытов было установлено, что лучшими для сохранения выделенных штаммов микроорганизмов в жизнеспособном состоянии были среды МРС-1 и МРС-4. К сожалению, не все штаммы сохранили жизнеспособность и основные свойства при культивировании in vitro. Из 12 выделенных штаммов только два, под условным шифром РЗ и Р6, подверглись дальнейшему исследованию.

Изучение биологических свойств выделенных штаммов молочнокислых бактерий. В результате проведенных исследований показано, что молочнокислые бактерии способны подавлять рост не только возбудителей кишечных инфекций, но и пиогенной микрофлоры. Указанное свойство обусловлено, прежде всего, способностью лактобактерий продуцировать молочную кислоту. В этой связи была изучена активность кислотообразования у выделенных штаммов лактобактерий.

Определение кислотообразующей активности лактобактерий проводили титро-метрическим методом. Кислотность выражали в градусах Тернера (Т°). Результаты определения способности к кислотообразованию у выделенных штаммов лактобактерий показали, что по данному показателю штаммы Р6 и РЗ существенно не отличаются от контрольного (L.plantarum 8РА-3, полученного из ГИСК им. JI.A. Тарасе-вича). Кроме того, по гемолитической, лизоцимной, плазмокоагулазной, биохимической активности, плазмидному составу исследованные штаммы не имели существенных отличий от контрольного и между собой.

При определении уровней устойчивости лактобактерий к антибактериальным препаратам выявлено, что штаммы РЗ и Рб обладают наибольшей чувствительностью к ампициллину, доксициклину, хлорамфениколу (левомицетину) и римфампи-цину. Учитывая отмеченное, эти штаммы были отобраны для дальнейшей работы.

Технология приготовления эталонных культур отобранных штаммов и оценка стабильности их свойств. Для приготовления эталонных культур отобранных штаммов лактобактерий использовали свежепересеянные культуры штаммов лактобактерий на питательных средах MPC. Изолированные колонии с плотной питательной среды MPC пересевали в жидкую питательную среду MPC во флаконы. Далее бульонные культуры пересевали на матрацы со скошенной средой MPC. Посевы в матрацах инкубировали при температуре 36,..38°С в течение 48 часов. По истечении срока инкубации сформировавшийся на плотной питательной среде микробный газон смывали 10,0 мл средой высушивания, содержащей 1,5 % полиглюки-на. Приготовленную для лиофилизации микробную суспензию разливали по 2,0 мл в ампулы и высушивали на коллекторной установке КУ-1 в течение 12 часов.

Результаты оценки выживаемости штаммов лактобактерий в составе сухих свежеприготовленных и хранившихся эталонных культурах представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Характеристика свежеприготовленных и хранившихся эталонных культур штаммов Р6 и РЗ Lactobacillus plantarum (X±J95, n=l 5)

Исследуемая культура Концентрация микробов, млрд.кл.мл"1 Выживаемость микробов, %

ОК БК

Р6 РЗ Р6 РЗ Р6 РЗ

Микробная суспензия до лиофилизации 20±4,0 15+3,0 б,0±1,5 5,0±2,2 100 100

Свежеприготовленная сухая 19±3,0 15±3,0 4,0+1,0 2,5±1,3 67 50

Хранившаяся сухая в течение: б мес. 12 мес. 19±3,0 19±3,0 15+2,0 15±2,0 3,0±1,5 2,0+1,8 2,0±1,0 1,0±0,7 50 33 40 20

Анализ данных, представленных в таблице 1, свидетельствуют о том, что микробные культуры отобранных штаммов лактобактерий обладают достаточно высокой устойчивостью к лиофильному высушиванию и хранению в составе сухих эталонных культур в течение срока наблюдения.

Результаты оценки сохраняемости основных биологических свойств штаммов лактобакгерий показали, что значения антагонистических и кислотообразующих свойств культур штаммов РЗ и Р6 до и после высушивания, а также при хранении в течение 12 мес. в составе сухих эталонных культур не имели существенных различий в сравнении с исходными.

Отработка технологии приготовления и оптимизация прописи стабилизированной рабочей культуры в качестве посевного материала для глубинного культивирования. Анализ данных литературы и результаты предварительно проведенных нами испытаний пробиотика на основе лактобактерий в промышленном птицеводстве позволили установить, что минимальная концентрация живых клеток лактобактерий в готовой форме препарата должна составлять не менее ЗхЮ9 в мл. Использующаяся технология включает ряд последовательных стадий для накопления достаточной биомассы лактобактерий. Технологический процесс накопления биомассы из эталонной культуры в наших первоначальных исследованиях, по аналогии с уже известными, принятыми технологиями получения пробиотиков на основе различных штаммов микроорганизмов, состоял из нескольких стадий пересева микробных культур.

Рисунок 1 - Схема приготовления пробиотика по традиционной технологии Однако даже такая многостадийная схема процесса не позволяла получать нам в большинстве случаев доброкачественную продукцию в необходимых промышленных объёмах из-за низкой концентрации бактерий. При этом брак как по кондиции материала, так и по чистоте составлял почти 25%. С учетом отмеченного, в дальнейших исследованиях с целью получения пробиотика со стабильными свойствами нами был отработан способ приготовления и хранения посевной рабочей культуры в

замороженном состоянии с одновременным сокращением стадий получения посевной культуры.

Основная задача при наработке биопрепарата состояла в обеспечении производства штаммами, эталонными и посевными культурами, стабильно сохраняющими биологические свойства. С этой целью для получения посевного материала нами была принята за основу технология приготовления стабилизированной пассированной рабочей культуры, разработанная ранее в НИИМ МО РФ. Однако в отличие от прототипа предложенный нами вариант исключал стадии пассирования культуры на животных, выделения культуры и её выращивание во флаконах. Разработанная нами технология приготовления стабилизированной рабочей культуры (СРК), в отличие от традиционно применявшейся схемы приготовления посевной культуры (пробирка со скошенной агаровой средой - флакон - бутыль), сокращала количество промежуточных этапов, тем самым снижала долю брака из-за загрязнения ПМФ, повышала степень однородности посевной культуры по OK, БК, pH и увеличивала сроки её хранения с 48 часов до 6 месяцев. СРК готовили по схеме, представленной на рисунке 2.

Рисунок 2 - Схема приготовления стабилизированной рабочей культуры по новой технологии

Наиболее удобным для хранения и использования посевного материала является металлический контейнер вместимостью 2 литра, позволяющий хранить 0,8 - 1,0 литр СРК. Выбор оптимальной концентрации микробов в СРК осуществляли с учётом требуемой посевной дозы, создаваемой в реакторе объёмом 0,25 м3 и составляющей не менее 0,4 млрд. клеток в мл по оптической концентрации. Экспериментально было установлено, что содержание в СРК не менее 20 млрд. живых микробов в мл обеспечивало необходимую посевную дозу при введении в реактор coll

держимого 1-2 контейнеров. Для получения требуемой концентрации микробов в СРК суспендированную эталонную культуру из ампулы помещали в 20- литровую бутыль и выращивали в ней в течение 48 часов, а затем концентрировали путём седиментации при температуре 2-8°С в течение 20-24 часов. В процессе отстаивания в холодильнике определяли чистоту культуры полученной суспензии лактобактерий. Образовавшийся осадок отбирали в промежуточную ёмкость и вводили стабилизирующие растворы. С этой целью, исходя из опытных данных нами была выбрана пропись стабилизирующих веществ, содержащая 5% глицерина, 5% полиглюкина и соли фосфатного буфера в количестве 0,2%. Затем суспензию разливали стерильно в 2- литровые металлические контейнеры, замораживали и хранили в холодильной камере при температуре минус 18 - 22°С в течение 6 месяцев.

Результаты опытов по выращиванию лактобактерий в 20- литровых бутылях в процессе приготовления стабилизированных рабочих культур отражены в таблице 2.

Таблица 2 - Динамика накопления биомассы лактобактерий при выращивании в 20- литровых бутылях (Х±Ь5, п=30)

Питательная среда Штамм Концентрация жизнеспособных лактобактерий на... час культивирования, млрд. микр. кл-мл'1

0 12 24 36 48

МРС-1 РЗ 5,3±2,4 12,5±3,8 19,7±3,9 20,1±3,7

Рб 2,7±0,9 8,3±2,3 16,6±3,5 25,6±3,6 26,4±2,9

Концентрацию живых лактобактерий в процессе выращивания в бутылях определяли в камере Горяева. Результаты опытов свидетельствуют о достаточном накоплении микробов к 48 часам культивирования. Кроме того, концентрацию живых клеток (БК) лактобактерий после приготовления СРК и в процессе хранения при минус 20°С дополнительно определяли путём высевов соответствующих разведений культур на плотную питательную среду в чашкк Петри.

Результаты оценки выживаемости штаммов РЗ и Р6 лактобактерий в составе свежеприготовленных и хранившихся стабилизированных рабочих культур представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Характеристики свежеприготовленных и хранившихся при температуре минус 20°С стабилизированных рабочих культур штаммов лактобактерий (Х+195,п=12)

Исследуемая культура Концентрация жизнеспособных микробов, млрд.кл.мл"1

Р6 РЗ

Микробная суспензия свежеприготовленная 51,7±1,8 35,6±2,7

Замороженная, хранившаяся в течение: 6 мес. 12 мес. 47,5±1,5 34,2±2,3 25,4+1,7 18,2±3,7

Результаты определения БК, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что микробные культуры штаммов РЗ и Р6 лактобактерий в составе выбранных нами стабилизирующих добавок обладают достаточно высокой устойчивостью к замораживанию и хранению при температуре минус 20°С. Наибольшее количество живых микробов нами зафиксировано к 6 месяцам хранения культур в замороженном состоянии. В дальнейшей работе в качестве посевных культур нами использовались всесторонне оцененные СРК, хранившиеся при температуре минус 20°С не более б месяцев. Однако анализ основных биологических показателей (кислотообразующей способности, ростовые характеристики, выживаемость при хранении СРК) свидетельствовал о том, что отобранный нами штамм РЗ значительно уступал штамму Р6 по изученным свойствам, поэтому в дальнейших исследованиях нами был использован штамм Р6 с последующим углублённым изучением его биологических характеристик и депонированием в музейной коллекции НИИМ МО РФ.

Предварительно проведённый нами расчёт показал, что посев в аппарат-культиватор объёмом 250 литров (рабочий объём 150 литров) двух контейнеров СРК с концентрацией 38-45 млрд. в мл живых микробных клеток обеспечивает посевную дозу более 0,4 млрд. живых клеток в мл. В противоположность этому, при использовании в качестве посевного материала культуры, выращенной в 20- литровой бутыли СЕК8-10 млрд. в мл, для засева 250 - литрового аппарата-культиватора потребуется 6-8 бутылей, что явно увеличивает материальные затраты, а самое главное - повышает процент брака из-за вероятности загрязнения ПМФ.

Технология приготовления лабораторного образца пробиотического препарата на основе штамма Р6 лактобактерий. Следующей стадией, позволяющей накопить биомассу, является выращивание штамма Р6 лактобактерий в аппаратах-культиваторах. На этой стадии технологического процесса использование сложной и дорогостоящей питательной среды МРС-1 экономически невыгодно. Поэтому следующая серия экспериментов была проведена при культивировании штамма Р6 лактобактерий в ферментёрах малых объёмов - 5л. Дальнейшие исследования были направлены на оценку возможности использования найденной белковой основы, и оптимизацию состава питательной среды для условий выращивания лактобактерий глубинным методом в аппаратах - культиваторах промышленного объема - БИОР 250. В результате проведенных исследований была разработана новая питательная среда - казеиново-дрожже-молочная (КДМ) следующего состава, г/л:

пептон -10,0; дрожжевой экстракт - 50,0; ферментативный гидролизат казеина (с содерж. аминного азота 150 мг%) - 100,0; MnS04 х 4Н20 - 0,05; MgS04 х 4Н20 -0,02; К2НРО4 - 3,0; КН2РО4 - 3,0; глюкоза - 20,0; цистеин солянокислый - 0,2; твин-80 -1,0; молоко гидролизованное - 500,0; дистиллированная вода - до 1000 мл.

.. Концентрация водородных ионов 6,2 - 6,4 ед.рН. Кроме того, в ходе экспериментов были усовершенствованы условия культивирования бактериальной популяции с целью накопления биомассы с высокой степенью жизнеспособности в более короткие сроки культивирования и стабильного обеспечения высокой концентрации живых бактерий в препарате. Показано, что для наибольшего накопления биомассы лактобактерий с сохранением их основных биологических свойств предпочтительно применение периодического динамического гомогенного глубинного культивирования в анаэробных условиях.

Конечным этапом отработки технологии производства пробиотика на основе штамма Р6 явилась стадия культивирования лактобактерий в аппаратах-культиваторах объёмом 250 литров с использованием питательной среды КДМ. Посевную дозу обеспечивали путём введения в стерильную питательную среду объёмом 150 литров содержимого двух металлических контейнеров СРК штамма Р6, хранившихся в течение 6 месяцев при температуре минус 20°С. Процесс вели в условиях периодического динамического гомогенного глубинного культивирования в

анаэробных условиях при температуре 38°С в течение 48 часов. В конце срока культивирования полученную культуру лактобактерий после осаждения лиофильно высушивали юоветным способом. Схема приготовления готовой формы пробиотика приведена на рисунке 3.

Рисунок 3 - Схема приготовления готовой формы пробиотика по новой технологии

Результаты опытов по выращиванию лактобактерий штамма Р6 в 250- литровом

аппарате-культиваторе представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Динамика накопления биомассы лактобактерий штамма Р6 при выращивании в 250- литровом аппарате-культиваторе (X+J9J, п=6)

Питательная среда Концентрация жизнеспособных лактобактерий (XÜ95,) на ... час культивирования, млрд. микр. клеток-мл'1

0 12 24 36 48

КДМ 5,1±1,5 8,3±1,3 12,5+2,4 20,7±3,2 22,1 ±3,4

Результаты опытов свидетельствуют о достаточно большом накоплении микробов штамма Р6 к 48 часам культивирования. Исследования показали, что микробы штамма Р6 лактобактерий, выращенные по отработанной нами технологии, по основным биологическим свойствам соответствуют предъявляемым требованиям.

Таким образом, применение всесторонне оцененной СРК лактобактерий с достаточно большой концентрацией живых микробных клеток позволяет обеспечить оптимальную посевную дозу непосредственно в 250- литровый ферментёр, что сокращает этапы приготовления нативной культуры и гарантирует уменьшение брака вследствие загрязнения её ПМФ. Кроме того, важной составляющей ростовых свойств питательной среды КДМ является ферментативный гидролизат казеина, по-

лученный специальным образом подобранными условиями гидролиза и очистки. Культивирование биомассы лактобактерий в анаэробных условиях способствует сокращению длительности технологического процесса вследствие сокращения лаг -фазы и экспоненциальной фазы роста, а также способствует повышению жизнеспособности лактобактерий в препарате при высушивании. Разработанную пропись питательной среды КДМ для выращивания лактобактерий целесообразно использовать для получения препаратов на основе данного вида бактерий.

Изучение стабильности основных биологических свойств лабораторного образца препарата. Известно, что высушивание является одним из наиболее совершенных методов стабилизации свойств живых микроорганизмов. Задачу приготовления бактерийного препарата, удовлетворяющего условиям и способу его применения, решали по двум направлениям - путём подбора защитной среды и отработки оптимального режима высушивания.

При отборе среды высушивания проверено более 20 используемых в практике криоконсервации сред. При этом, наряду с традиционными требованиям к криопро-текторам - нетоксичнось, растворимость в воде и т.д., исходили из того, что вещество должно быть не утилизируемым клетками штамма Р6 лактобактерий. Таковым в наших исследованиях оказался полиглюкин. После подбора среды высушивания перешли к отработке режимов сушки.

Для этого в выращенные в аппаратах - культиваторах объёмом 250 л культуры штамма Р6 лактобактерий стерильно добавляли полиглюкин до конечной концентрации 1,5% (вес/объем) и разливали по 700 мл в кюветы при постоянной работе мешалки со скоростью 0,3...0,5 об-мин'1. Кюветы помещали в сублимационную камеру. Замораживание вели со скоростью 2°С-мин'' до температуры минус 30.. .35°С и вьщерживали при этой температуре 75...85 мин. Затем при помощи вакуумного насоса создавали разрежение в камере 0,7... 1,3 мм рт.ст. Подводили тепло и подогревали культуру со скоростью 2°С-мин' до 28"С. Досушивание вели в течение 7... 10 ч. По окончании процесса материал фасовали в полиэтиленовые пакеты и герметизировали запаиванием.

Разработанная нами технология препарата на основе штамма Р6 лактобактерий позволяет получать пробиотик с высоким содержанием живых микробов, сохра-

няющих жизнеспособность в течение длительного срока. Проведёнными исследованиями было показано, что в процессе хранения лактобактерии штамма Р6 в полученном нами сухом препарате сохраняли культуральные, биохимические свойства, кислотообразующую и антагонистическую активности, не отличающиеся от исходных культур.

Изучение безвредности, реактогенности и токсигенностн культур штамма Р6 лактобактерии в опытах на лабораторных животных. На основании проведенных исследований нами был сделан вывод о том, что введение культур исследуемого штамма Рб морским свинкам и белым мышам реакцию гиперчувствительности немедленного и замедленного типа не вызывает.

Для определения безвредности лабораторного образца пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий использовали белых мышей, которым per os вводили по 0,5 мл микробной суспензии, содержащей 1 млрд. живых бактерий. При патолого-анатомическом обследовании у убитых белых мышей никаких изменений в желудочно-кишечном тракте и внутренних органах не обнаружено.

Кроме того, для определения безвредности лабораторного образца пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий использовали морских свинок. Микробную суспензию лактобактерий штамма Р6 с концентрацией 2 млрд. живых клеток в 1 мл в объёме 1,0 мл вводили морским свинкам подкожно.

При вскрытии не обнаружено изменений кожи, подкожной клетчатки и подлежащих мышц в месте введения культуры. Не выявлено отёка подкожной клетчатки, инъекции её сосудов, геморрагических, гнойных и некротических изменений. Лимфатические узлы в месте введения препарата обычного цвета и плотности, не спаяны с окружающими тканями. При бактериологическом обследовании в месте введения препарата и внутренних органах лактобактерий не обнаружено.

Таким образом, результаты оценки штамма Р6 лактобактерий свидетельствуют о его безвредности для лабораторных животных.

Изучение эффективности лабораторного образца пробиотика в опытах на курах в птицеводческих хозяйствах Кировской области. В опытах на цыплятах 90-дневного возраста проверена безвредность препарата и поставлен опыт по изучению приживляемости лактобактерий в кишечнике цыплят. При оценке безвредности

цыплятам выпаивали (через зонд) культуру лактобактерий ежедневно в течение трех недель. Разовая доза пробиотика составляла 50-60 млн. микробных клеток в 1 мл. В течение всего периода наблюдения цыплята были клинически здоровы. При убое их через 21 день никаких макроскопических отклонений от нормы во внутренних органах и в т.ч. в желудочно-кишечном тракте установлено не было.

Кроме того, пробиотик на основе штамма Р6 лактобактерий испытали в ООО птицефабрика «Фалёнская» Кировской области. Эксперимент по скармливанию пробиотика молодняку кур кросса «Хайсекс Браун» в возрасте от 1 до 7 дней проводили методом введения в корм культур штамма Р6 лактобактерий из расчета 3...4 млн. микробных клеток на 1 голову дважды в день в течение 7 суток. Полученные данные представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5 - Динамика ежесуточного падежа молодняка кур на птицефабрике «Фалёнская»

Группа жи- Количество павших птиц на.. .сутки, голов Всего,

вотных 1 2 3 4 5 6 7 голов

Опытная 3 12 5 11 8 И 7 57

Контрольная 4 16 6 13 26 63 51 179

Таблица 6 - Влияние пробиотика из лактобактерий на основные производственные показатели птицефабрики «Фалёнская»

Показатели Группа

опытная контрольная

Поголовье до начала опыта, голов 3000 2600

Падеж, голов 57 179

Поголовье по окончанию опыта 2943 2421

Сохранность, % 98,1 93.1

Из данных таблиц 5 и 6 следует, что применение пробиотика позволяет повысить сохранность молодняка птиц до 5%.

выводы

1. Усовершенствована методика выделения, сохранения и поддержания эталонных штаммов молочнокислых бактерий за счет сокращения количества пассажей и использования разработанного состава новой питательной среды. Из 12 исследованных штаммов выбраны 2, у которых биологические свойства отвечают предъявляемым требованиям.

2. Разработана технология приготовления стабилизированной рабочей культуры, позволяющая при использовании ее в промышленном производстве пробиотическо-го препарата уменьшить количество этапов приготовления, снизить трудозатраты, повысить качество и стандартность конечного продукта, обеспечить ростовые и про-биотические свойства бактерий в составе СРК на протяжении 6-ти месяцев при минус 20° С, сократить время пускового периода на 5 суток, что снижает себестоимость суточной дозы препарата на 24%.

3. Отработана методика выделения и приготовления лабораторного и промышленного образцов нативных культур выделенных штаммов лактобактерий с использованием новой питательной среды КДМ и стабилизированной рабочей культуры, которая позволяет сохранить исходный уровень антагонистической активности и кислотообразующей способности микробных культур лактобактерий, используемых для создания пробиотических препаратов в интересах промышленного птицеводства.

4. Всесторонняя апробация лабораторного образца пробиотического препарата на основе штамм Р6, полученного по усовершенствованной технологии, показала его безвредность, отсутствие реактогенности, стабильность биологических свойств при применении и хранении.

5. Разработана универсальная технология приготовления пробиотиков на основе лактобактерий, которая может быть внедрена в промышленное производство при глубинном способе выращивания в аппаратах-культиваторах. Применение препарата на основе штамма Р6 в производственных условиях повышало сохранность цыплят до 5%.

о. Разработана и утверждена нормативно-технологическая документация на производство пробиотика на основе штамма Р6 Ь.р1аШагит и его контроль.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Пробиотик на основе выделенного штамма Рб лактобактерий используется в качестве лечебно - профилактического препарата при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у кур.

2. Разработаны и утверждены Регламент производства пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий (2009г.) и Технические условия (2009г.).

3. Разработан и утверждён Сборник методик по приготовлению лабораторного образца пробиотика на основе штамма Рб лактобактерий (2008г.).

4. Разработана и утверждена Инструкция по применению пробиотика на основе штамма Рб лактобактерий для лечения и профилактики дисбактериозов желудочно-кишечного тракта у кур и повышения их естественной резистентности.

5. Разработаны инструкции по эксплуатации оборудования, общепромышленной и специальной технике безопасности.

6. Штамм Рб лактобактерий депонирован в коллекции музея 48 ЦНИИ МО РФ под инв. № 39.

7. Результаты научных исследований по усовершенствованию технологии приготовления пробиотика на основе штамма Рб лактобактерий используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в ФГОУ ВПО Вятская ГСХА.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Усовершенствованная технология производства пробиотического препарата для орального применения в птицеводстве рекомендуется для приготовления биопрепаратов на основе других микроорганизмов при глубинном культивировании.

2. Разработанный способ приготовления и применения стандартной стабилизированной рабочей культуры, позволяющей уменьшить количество этапов приготовления пробиотика, снизить трудозатраты, повысить качество и стандартность конечного продукта, целесообразно использовать в технологиях биопрепаратов на основе пробиотических микроорганизмов.

3. Разработанный пробиотический препарат на основе выделенного штамма Р6 рекомендуется использовать в качестве лечебно - профилактического препарата при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у кур.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Овсянников Ю.С. Оценка биологических свойств культур лактобактерий и сенной палочки /Ю.С. Овсянников //Ветеринарная медицина. - 2009. - № 1-2. - С. 5154.

2. Овсянников Ю.С. Пробиотики в ветеринарии / Ю.С. Овсянников, Г.И. Тихонов, О.В. Годунова// Ветеринарная медицина. - 2009. - № 1-2. - С. 66-68.

3. Овсянников Ю.С. Изучение биологических свойств лактобактерий / Ю.С. Овсянников, В.Е. Романов, И.В. Дармов // Современные научные тенденции в животноводстве. Ч. 2. Ветеринарная медицина: Сб. статей Межд. научно-практической конференции, посвящённой 100- летаю со дня рождения П.Г. Петского. - Киров, 2009.-С. 194-197.

4. Овсянников Ю.С. Способ получения посевных культур лактобактерий / Ю.С. Овсянников, В.Е. Романов, С.А. Швецов // Современные научные тенденции в животноводстве. Ч. 2. Ветеринарная медицина: Сб. статей Межд. научно-практической конференции, посвящённой 100- летию со дня рождения П.Г. Петского. - Киров, 2009.-С. 197-199.

5. Овсянников Ю.С. Технология получения эталонных культур лактобактерий / Ю.С. Овсянников, С.А. Швецов // Современные научные тенденции в животноводстве. Ч. 2. Ветеринарная медицина: Сб. статей Межд. научно-практической конференции, посвящённой 100- летию со дня рождения П.Г. Петского. - Киров, 2009. - С. 199-201.

6. Технология получения посевных культур лактобактерий / И.В. Тихонов, Ю.С. Овсянников, В.Г. Комоско и др. // Ветеринарная медицина.- 2009,- № 1-2. - С. 17-20.

Заказ № 315. Подписано к печати 05.11.2009г. Объём п.л. 1,0. Тираж 100 экз. Бумага офсетная. 610017, г.Киров, Вятская ГСХА, Октябрьский пр., 133. Отпечатано в типографии ВГСХА, 2009

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Овсянников, Юрий Степанович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМ- 4 ВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Анализ заболеваемости птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области и Российской Федерации за последние годы.

1.2. Классификация пробиотиков, состав, назначение.

1.3. Возможные направления совершенствования технологии получения пробиотиков из штаммов лактобактерий.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.1.1 Штаммы микроорганизмов.

2.1.2 Питательные среды.

2.1.3. Лабораторные и сельскохозяйственные животные.

2.1.4. Методы оценки биологических свойств лактобактерий.

2.1.5 Методы культивирования микроорганизмов.

2.1.6 Методы оценки реактогенности, безвредности и токсигенности 57 2.1.7. Статистические методы обработки результатов.

2.2. Экспериментальное обоснование усовершенствования методики выделения молочнокислых бактерий от птиц в птицеводческих хозяйствах Кировской области.

2.3. Изучение биологических свойств выделенных штаммов молочнокислых бактерий.

2.4. Технология приготовления эталонных культур отобранных штаммов и оценка стабильности их свойств.

2.5. Отработка технологии приготовления и оптимизация прописи стабилизированной рабочей культуры в качестве посевного материала для глубинного культивирования.

2.6. Технология приготовления лабораторного образца пробиотиче-ского препарата на основе штамма Р6 лактобактерий.

2.7. Изучение стабильности основных биологических свойств лабораторного образца биопрепарата.

2.8. Изучение безвредности, реактогенности и токсигенности лабораторного образца пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий в опытах на лабораторных животных.

2.9. Изучение эффективности лабораторного образца пробиотика в опытах на курах в птицеводческих хозяйствах Кировской области.

3. ОБОБЩЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4. ВЫВОДЫ.

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Совершенствование технологии приготовления пробиотика на основе лактобактерий, оценка его свойств и эффективности применения в птицеводстве"

Актуальность темы.

В последние годы в Российской Федерации наблюдается резкое ухудшение эпидемической и эпизоотической ситуации, что безусловно связано с нарастанием неблагоприятных изменений в экосфере. Отмечено повышение удельного веса дисбактериозов, причиной которых являются ухудшение экологической обстановки, неконтролируемое использование в ветеринарии и сельском хозяйстве антибиотиков и различных химиопрепаратов, гормонов и т.п., а также стрессовые факторы и условия, снижение качества питьевой воды и кормов [12, 19, 22-27, 39-45].

На сегодня считается бесспорным, что дисбактериозы у сельскохозяйственных животных и птиц приобретают широкое распространение, так как при отсутствии своевременной коррекции нарушений нормофлоры весьма высока вероятность развития у них тяжелых, рецидивирующих инфекционных заболеваний, иммунодефицитов, различных аллергопатий, анемий, гастроэнтерологических и других болезней, включая отставание в привесах, снижение репродуктивное™ [103-121].

В значительной степени нелеченые дисбактериозы опасны как для молодняка, так и репропродуктивного поголовья сельскохозяйственных животных и птиц. Рост инфекционной заболеваемости бактериальной, вирусной и другой этиологии во многом, помимо эпизоотологических и экологических предпосылок, предопределен снижением уровня неспецифической резистентности организма животных и птиц из-за выраженных дисбиотических нарушений [1, 4952, 57-60].

Учитывая отмеченное, профилактика и лечение инфекционных заболеваний и дисбактериозов сельскохозяйственных животных и птиц в настоящее время и на ближайшую перспективу являются приоритетными задачами ветеринарии.

Их решение возможно при условии реализации комплекса соответствующих противоэпизоотических мероприятий, включая разработку, серийное производство и внедрение в практику новых лечебно-профилактических средств для предупреждения и терапии инфекционных болезней и дисбактериозов, отвечающих современным требованиям. При этом немаловажное значение для обеспечения действенности системы этих мероприятий имеет адекватность и единая методология использования соответствующих лечебно-профилактических препаратов. Таковые, в свою очередь, обусловливают необходимость подготовки, утверждения и доведения до широкого круга ветеринарных специалистов информационно-методических и справочных документов по вышеназванным проблемам.

В настоящее время в числе высокоэффективных лечебно - профилактических препаратов отечественными и зарубежными специалистами рассматриваются пробиотики (эубиотики). Пробиотики - это препараты из живых безвредных для организма человека и теплокровных животных, антагонистически активных бактерий, подавляющих in vitro и in vivo рост и размножение патогенных и условно патогенных микроорганизмов, вызывающих острые кишечные заболевания (ОКЗ) и токсикоинфекции. Пробиотики, в отличие от антибиотиков и химиопрепаратов, не оказывают негативного влияния на представителей нормомикро флоры желудочно-кишечного тракта, слизистых сельскохозяйственных животных и птиц, а наоборот, при дисбиотических изменениях способствуют её качественному и количественному восстановлению до нормальных физиологических значений [71-87].

Отечественная ветеринарная практика располагает пока ещё недостаточной информацией об использовании пробиотиков при лечении и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов. Известно, что использование пробиотиков биосана и препарата на основе штаммов Bac.subtilis при лечении и профилактике острых кишечных инфекций и дисбактериозов показало их удовлетворительную эффективность и перспективность. При этом очевидна необходимость углубления исследований по проблеме пробиотиков в аспекте поиска новых штаммов микроорганизмов с пробиотическим действием, совершенствования имеющихся и создания новых препаратов данного вида для повышения их эффективности, а также разработка универсальной технологии.

Перспективными в отношении предотвращения заболеваний желудочно-кишечного тракта являются представители нормальной микрофлоры животных и птицы - молочнокислые бактерии, обладающие широкой природной антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Ввиду незначительного числа публикаций об эубиотическом действии лактобактерий в отечественной литературе актуальными являются исследования механизмов их антагонистического действия и условий сохранения, поддержания и усиления полезных свойств. Полученные результаты могут служить основой для разработки современных высокоэффективных пробиоти-ков на основе лактобактерий для ветеринарных целей.

В связи вышеизложенным конструирование эффективных препаратов на основе микроорганизмов с пробиотическими свойствами и создание усовершенствованных технологий их приготовления является весьма актуальной задачей.

Практика показывает, что наиболее эффективными в отношении сельскохозяйственной птицы являются пробиотические препараты на основе штаммов микроорганизмов, которые выделены из здоровых особей конкретного региона. Для создания нового пробиотического препарата были исследованы биологические свойства 12 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных от кур птицефабрик Кировской области, и доказана эффективность лабораторного образца препарата, приготовленного на основе отобранного штамма Р6 с использованием разработанной питательной среды и усовершенствованной технологии.

Создание нового пробиотического препарата потребовало разработку и введение в процесс приготовления усовершенствованной питательной среды (ПС) для сохранения и поддержания исходных свойств выделенного штамма молочнокислых бактерий, накопления биомассы микробных культур на стадиях процесса приготовления готовой формы препарата, а также разработку и внедрение в технологический процесс новой операции по приготовлению стабилизированной рабочей культуры (СРК) из посевной микробной культуры, выращенной глубинным способом в бутылях.

Цель работы - создание усовершенствованной технологии производства, пригодной для промышленного выпуска пробиотика на основе выделенного штамма Lactobacillus plantarum, с использованием в качестве посевного материала стабилизированной рабочей культуры и вновь разработанной по составу жидкой питательной среды для получения нативной культуры (НК) при глубинном способе выращивания в аппаратах-культиваторах (АКВ).

Задачи исследования.

1. Усовершенствовать методику выделения лактобактерий, сохранить и поддержать эталонные штаммы полученных молочнокислых бактерий, изучить их биологические свойства.

2. Разработать технологию приготовления стабилизированной рабочей культуры и обосновать пропись защитной среды.

3. Отработать методику приготовления лабораторного и промышленного образца пробиотического препарата при использовании разработанной ПС и СРК и исследовать стабильность и воспроизводимость его прикладных и эксплуатационных характеристик.

4. Изучить специфическую безопасность и токсичность пробиотического препарата на лабораторных животных.

5. Усовершенствовать имеющуюся технологию промышленного производства пробиотиков на основе лактобактерий глубинным способом в аппаратах-культиваторах, оценить лечебно-профилактическую эффективность нового биопрепарата.

6. Создать нормативно-техническую документацию на приготовление готовой формы пробиотического препарата и его контроль.

Научная новизна. 1. Впервые на основе выделенных в птицеводческих хозяйствах Кировской области штаммов лактобактерий оптимизирован способ поддержания посевных материалов и приготовления нативных культур, основанный на использовании стабилизированной рабочей культуры, хранящейся при минус 20°С в течение шести месяцев.

2. Впервые для приготовления в аппаратах - культиваторах нативной культуры глубинным способом культивирования в жидкой питательной среде предложен ее новый состав, обеспечивающий высокие ростовые характеристики лактобацилл при производстве.

3. Предложенная промышленная технология производства пробиотика позволяет стабилизировать стадию культивирования за счет разработанной ПС и СРК, сократить процесс приготовления НК на 5 суток. Получен экономический эффект в расчёте на 1 суточную дозу молодняка кур на 24%. Себестоимость суточной дозы пробиотика, полученного по традиционной технологии, составила 1,58 копеек, а по усовершенствованной нами технологии - 1,2 копейки.

Практическая значимость работы. 1. Усовершенствованная промышленная технология за счет использования СРК сокращает на 5 суток пусковой период производства, стандартизирует стадию выпуска нативной культуры, снижает процент брака.

2. Включение в схему производства СРК, хранящейся в течение 6 месяцев при минус 20°С, обеспечивает выпуск пробиотика на протяжении длительного периода времени стандартным по составу посевным материалом в необходимых объемах.

3. Разработанная пропись жидкой питательной среды для приготовления НК обеспечивает выход биомассы Lactobacillus plantarum в объеме регламентных требований.

4. Приготовленный пробиотик на основе регионального штамма Lactobacillus plantarum Р6 при его применении в промышленном производстве молодняка кур повышает их сохранность до 5%.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 100- летию со дня рождения П.Г. Петского (Киров, 2009).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в сборнике международной конференции, 3 статьи в журнале, включённом в перечень ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании полученных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, библиографический список (138 источников, из которых 99 отечественных и 39 иностранных), 23 таблицы, 4 рисунка, приложения.

Научные положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Усовершенствование способа поддержания и хранения клеток штамма Lactobacillus plantarum Р6, использование разработанной питательной среды, стабилизированной рабочей культуры, внедрение отработанных параметров ведения процесса выращивания в аппаратах - культиваторах позволяет получить бактериальную культуру с полноценными биологическими свойствами, пригодную для производства пробиотического препарата.

2. Усовершенствованная технология производства позволяет сократить пусковой период производства нативной культуры на 5 суток, достигнуть экономического эффекта в снижении себестоимости суточной дозы препарата на 24%, получить пробиотический препарат на основе штамма лактобактерий с необходимыми биологическими и физико-химическими показателями качества.

3. Разработанный образец пробиотического препарата на основе штамма Lactobacillus plantarum Р6 безвреден, нереактогенен и обеспечивает у птицы при оральном способе применения лечебно-профилактический эффект, выражающийся в снижении падежа до 5%.

Экспериментальные исследования настоящей работы были осуществлены на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, в лабораториях НИИ Микробиологии МО РФ (ФГУ 48 ЦНИИ МО РФ), кафедре микробиологии, вирусологии и фармакологии ФГОУ ВПО Вятской ГСХА по темам НИР № 174/04 и № 13 с 2003 по 2009г г. Производственные опыты были проведены в птицеводческих хозяйствах Кировской области. Работы проводились при совместном участии большого коллектива учёных, специалистов вышеуказанных учреждений.

Лично автором осуществлены планирования экспериментов, исследования по оценке биологических свойств выделенных от птиц лактобактерий, выбору перспективного штамма лактобактерий, влияние разработанного пробиотика на производственные показатели в птицеводческих хозяйствах, а также анализ полученных данных, их обобщение.

Автор выражает глубокую благодарность всем учёным и специалистам, участвовавшим в экспериментах и их обобщении, помогавшим в оформлении диссертационной работы и позволившим ссылку на совместно произведенные работы и исследования.

Огромную благодарность и признательность выражаю научному руководителю, доктору биологических наук, профессору И.В. Тихонову за помощь и моральную поддержку на всём протяжении работы, а также лауреатам Государственных премий и коллегам по совместным исследованиям доктору медицинских наук, профессору Е.В. Пименову, доктору медицинских наук, профессору И.В. Дармову, кандидату технических наук Г.В. Комоско, а также доктору медицинских наук, профессору В.Е. Романову, кандидатам наук С.А. Швецову, А.В. Ежову.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Овсянников, Юрий Степанович

4. выводы

1. Усовершенствована методика выделения, сохранения и поддержания эталонных штаммов молочнокислых бактерий за счет сокращения количества пассажей и использования разработанного состава новой питательной среды. Из 12 исследованных штаммов выбраны 2, у которых биологические свойства отвечают предъявляемым требованиям.

2. Разработана технология приготовления стабилизированной рабочей культуры, позволяющая при использовании ее в промышленном производстве пробиотического препарата уменьшить количество этапов приготовления, снизить трудозатраты, повысить качество и стандартность конечного продукта, обеспечить ростовые и пробиотические свойства бактерий в составе СРК на протяжении 6-ти месяцев при минус 20° С, сократить время пускового периода на 5 суток, что снижает себестоимость суточной дозы препарата на 24%.

3. Отработаны методика выделения и схема приготовления эталонных и нативных культур выделенных штаммов лактобактерий с использованием новой питательной среды (КДМ) и стабилизированной рабочей культуры, которые позволяют сохранить исходный уровень антагонистической активности и кислотообразующей способности микробных культур лактобактерий, используемых для создания пробиотических препаратов в интересах промышленного птицеводства.

4. Всесторонняя апробация лабораторного образца пробиотического препарата на основе штамм Р6, полученного по усовершенствованной технологии, показала его безвредность, отсутствие реактогенности, стабильность биологических свойств при применении и хранении.

5. Разработана универсальная технология приготовления пробиотиков на основе лактобактерий, которая может быть внедрена в промышленное производство при глубинном способе выращивания в аппаратах-культиваторах. Применение препарата на основе штамма Р6 в производственных условиях повышало сохранность цыплят до 5 %.

6. Разработана и утверждена нормативно-технологическая документация на производство пробиотика на основе штамма Р6 L.plantarum и его контроль.

5. практическое использовании полученных научных результатов

1. Пробиотик на основе выделенного штамма Р6 лактобактерий используется в качестве лечебно - профилактического препарата при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у кур.

2. Разработаны и утверждены Регламент производства пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий (2009г.) и Технические условия(2009г.).

3. Разработан и утверждён Сборник методик по приготовлению лабораторного образца пробиотика на основе штамма Р6 лактобактерий (2008г.).

4. Разработана и утверждена Инструкция по применению пробиотика на ос нове штамма Р6 лактобактерий для лечения и профилактики дисбактериозов желудочно-кишечного тракта у кур и повышения их естественной резистентности.

5. Разработаны инструкции по эксплуатации оборудования, общепромышленной и специальной технике безопасности.

6. Штамм Р6 лактобактерий депонирован в коллекции музея 48 ЦНИИ МО -РФ под инв. № 39.

7. Результаты научных исследований по усовершенствованию технологии i приготовления пробиотика на основе штамм Р6 лактобактерий используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в ФГОУ ВПО Вятская ГСХА.

6. рекомендации по использованию научных выводов

1. Усовершенствованная технология производства пробиотического препарата для орального применения в птицеводстве рекомендуется для приготовления биопрепаратов на основе других микроорганизмов при глубинном культивировании.

2. Разработанный способ приготовления и применения стандартной стабилизированной рабочей культуры, позволяющей уменьшить количество этапов приготовления пробиотика, снизить трудозатраты, повысить качество и стандартность конечного продукта, целесообразно использовать в технологиях биопрепаратов на основе пробиотических микроорганизмов.

3. Разработанный пробиотический препарат на основе выделенного штамма Р6 рекомендуется использовать в качестве лечебно - профилактического препарата при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у кур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Овсянников, Юрий Степанович, Москва

1. Антипов В.А. Использование пробиотиков в животноводстве / В.А. Антипов // Ветеринария.- 1991.- № 4. С. 55-58.

2. Аркадьева З.А. Факторы, влияющие на жизнеспособность и свойства микроорганизмов при различных методах хранения / З.А. Аркадьева //Биологические науки.- 1993.- № 4.- С. 93-104.

3. Артюхин В. И. Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. Производство и применение продуктов микробиологических производств / В. И. Артюхин, А. П. Шепелин, Н. В. Киселева //Обзорн. информ.- М., 1990.-Вып.Ю.-С. 12-45.

4. Ашмарин И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев Л.: Гос. из-во мед. литературы, 1962. - С. 290.

5. Бергер М.О. Методы общей бактериологии / Под ред. М. О. Бергера. -М., 1983. С.23-56.

6. Бергер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований / Под ред. М. О. Бергера. М., 1982.-С.23 - 234.

7. Биотехнология: взгляд в будущее. Первая половина XXI века / Под ред. К.И. Скрябина. -М., 2008. 68 с.

8. Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002 г.). - М.: ЗАО «ПИК Максима», 2002. - С. 10-72.

9. Блохина И.Н., Традиционная классификация и геносистематика бактерий рода Lactobacillus / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, В.М. Бондаренко и др.// Микробиология.- 1995.- № 4. С. 19-23.

10. Бовкун Г.Ф. Нормобиоценоз и дисбактериоз молодняка / Г.Ф. Бовкун, Е.П. Ващекин, Н.И. Малик и др. // Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2008.- № 2. С. 12 - 17.

11. Бовкун Г.Ф. Пробиотическая профилактика и терапия дисбактериозов / Бовкун Г.Ф., Ващекин Е.П., Малик Н.И. и др. // Ветеринария сельскохозяйственных животных. 2008. -№ 4. - С. 28 - 31.

12. Бовкун Г.Ф. Роль бифидогенных факторов в профилактике и терапии дисбактериозов. / Г.Ф. Бовкун, Е.П. Ващекин, Н.И. Малик, и др. // Ветеринария сельскохозяйственных животных. -2008. № 10.-С.51-55.

13. Бондаренко В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков / В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова //Микробиология. -1998. № 4. - С. 107 - 111.

14. Бондаренко В.М. Дисбиоз. Современные особенности профилактики и лечения / В.М. Бондаренко. М.: Мир, 1995. - С. 20.

15. Брылин А.П. Эффективный пробиотик в интенсивном птицеводстве / А.П. Брылин // Ветеринария.- 2006.- №10. С. 16 - 17.

16. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцимная активность микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов// Антибиотики. 1981. - №10. - С. 782.

17. Волков М.Ю. Коррекция нарушения микробиоценоза человека с помощью пробиотиков / М.Ю. Волков, А.В. Синица, Е.И. Ткаченко и др.// Вопросы питания.- 2006.- № 4. С. 32-34.

18. Волков М.Ю. Новый пробиотик Бактистатин продукт современных биотехнологий / М.Ю. Волков // Перспективы развития биотехнологии в России: Сб. науч. тр. - Пущино: «МаксПресс», 2005. - С. 21-22.

19. Воронин Е.С. Выделение и идентификация бактерий желудочно кишечного тракта животных: / Методические рекомендации/ Е.С. Воронин, Т.Н. Грязнева, Д.А. Девришов. - Утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.05.2004, per. № 13-5-02/1043.

20. Воронин Е.С. Этиология и профилактика желудочно-кишечных заболеваний телят / Е.С. Воронин, Д.А. Девришов, Л.Я. Ставцева //Вестник с.-х.науки.-1989.- № 9.-С. 105-116.

21. Гаврилов В.А. Проблемы перспективы биотехнологии / В.А. Гаврилов, И.В. Тихонов // Ветеринарная медицина.- 2003. №3. - С.5-7.

22. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции: Автореф. дис. . докт. мед. наук / Е.М. Горская.- М., 1994.- С.53.

23. Грязнева Т.Н. Применение пробиотика Биод 5 в рационах кормления поросят-отъемышей// Зоотехния.- 2005.- №8. — С. 15.

24. Грязнева Т.Н. Антагонистическая активность бифидо- и лактобактерий в отношении энтеробактерий / Т.Н. Грязнева, Л.Я. Ставцева // Ветеринария. 1991.-№6.-С. 21-22.

25. Давыдкин В.Ю. Выживаемость пробиотиков на разных стадиях приготовления биопрепаратов // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002 г.) - М.: ЗАО «ПИК Максима», 2002. - С. 349-350.

26. Данилевская Н.В. Влияние пробиотика лактобифадол на продуктивность и сохранность поросят мясных пород на подсосе и доращивании / Н.В. Данилевская, Р.С. Кудинкин // Ветеринария сельскохозяйственных животных.-2008.- № 4. С. 56 - 58.

27. Данилевская Н.В. Пробиотик: действие на перепелов разных пород / Н.В. Данилевская //Птицеводство.- 2005. -№8.- С.14-15.

28. Девришов Д.А. Рекицен профилактический препарат против желудочно-кишечных заболеваний поросят / Д.А. Девришов, Г.Н. Печникова, З.М. Бедаева и др. - М., 1995. - С 81-84.

29. Егоров И. Пробиотик лактоамиловарин стимулирует рост цыплят / И. Егоров, П. Паньков, Б. Розанов и др. // Птицеводство.- 2004.- №8. С. 33-34.

30. Егоров Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова //Антибиотики и химиотерапия.- 1999.- № 6.-С. 33.

31. Елынин А.И. Сгущение суспензий микробиологических производств и способы интенсификации процесса / А.И. Елынин. М.: Агропромиздат, 1987.-С. 225.

32. Жданов П.И. Биологические и эпизоотологические аспекты производства и применение нового пробиотика из бактерий рода Bacillus в свиноводстве: Автореф. дис. . канд. вет. наук / П.И.Жданов. СПб.: ПГАВМ, 1997. -С.21.

33. Запруднов A.M. Микробная флора кишечника и пробиотики / A.M. За-пруднов, JI.H. Мазанкова. М.: Колос, 1999. -204с.

34. Зернов B.C. Включение лактоамиловорина сухого в состав рационакур-несушек кросса "Родонит" / B.C. Зернов, Е.Н. Верещагина, Т.Н. Иванова // Тезисы докладов научной конференции аспирантов и соискателей. Киров: ВГСХА, 2001. - С.60-61.

35. Изачик Ю.А. Дисбактериоз кишечника/ Ю.А. Изачик, А.А. Корсун-ский // Медицинская помощь. 1993. -№2. -С.58-60.

36. Имангулов Ш. Ферментативный пробиотик: два в одном / Ш. Имангу-лов, Г. Игнатова, А. Первова и др. // Птицеводство.- 2004.- №7. С. 10-11.

37. Коршунов В.М. Микроэкология желудочно-кишечного тракта. Коррекция микрофлоры при дисбактериозах кишечника / В.М. Коршунов, Н.Н. Володин, Б.А. Ефимов и др. М.: Мир, 1999.- 287с.

38. Коршунов В.М. Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов, В.В. Смеянов, Б.А. Ефимов // Вестн. РАМН. 1996. - №2. - С. 60-65.

39. Критская И.В. Разработка питательной среды для накопления биомассы В. bifidum в процессе непрерывного культивирования в биореакторе / И.В. Критская // Микробиология. 1996. - №5. - С. 81-83.

40. Кругликов В.Д. Возможность приживления Lactobacillus acidophilus в кишечнике белых мышей на фоне бактериальной терапии / В.Д. Кругликов, Р.И. Цураева, И.В. Рыжков // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология.- 1997.-№ 1.-С. 67-69.i

41. Куриленко А.Н. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А.Н. Куриленко, B.JI. Крупальник. М.: Колос, 2000.-275 с.

42. Ленцнер А.А. Лактофлора и колонизационная резистентность / А.А. Ленцнер, Х.П. Ленцнер, М.Э. Микельсаар //Антибиотики и мед. биотехнология. -1987.-№ З.-С. 173-179.

43. Малик Н.И. Новые пробиотические препараты ветеринарного назначения: Автореф. дис. докт. биол. наук /Н.И. Малик. М., 2002. — 53 с.

44. Методические рекомендации к контролю питательных сред по биологическим показателям. М., 1986. - 43 с.

45. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков. — М.: МЗ СССР, 1983.- 15 с.

46. Молохова Е.И. Лекарственные препараты пробиотики на российском фармацевтическом рынке / Е.И. Молохова, В.Н. Тарасевич //Фармация. — 2000. — Т.49.-№3, —С.55—58.

47. Оганов Э.О. Воздействие пробиотика СБА на рост уток / Э.О. Оганов, А.Т. Жунушов // Ветеринария. 2004. - №12.- С. 46-47.

48. Огарков В.И. Основные биотехнологические проблемы микробиологической промышленности / В.И. Огарков // Биотехнология.-1986.-№ 4.-С. 5.

49. Определитель бактерий Берджи //Под ред. Дж. Хоулта, Н.Крига, П.Спита, и др. (9-е издание в 2-х томах) /Пер. с англ. под ред. Г.А. Заварзина.-М.: Мир, 1997. -799 с.

50. Панин А.Н. Биотехнологические аспекты изготовления сухих пробио-тических препаратов / А.Н. Панин //Научные основы пр-ва вет. биол. препаратов: Сб.науч.тр. Щелково: ВНИТИБП, 2000. - С. 343-345.

51. Панюшин С.К. Биологически активные добавки к пище. Теоретические и прикладные аспекты / С.К. Панюшин, Г.А. Угодчиков. М.: Издат. дом «РТ-Пресс», 2002. - 192с.

52. Перетц М.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека и животных / М.Г. Перетц. М.: Колос, 1995.-387 с.

53. Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева и др.; под ред. Н.С. Егорова. М.: Высш. шк., 1989. - 688 с.

54. Самуйленко А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов / А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан. М.: Россельхозакаде-мия. - М.: РАСХН, 2000.- 781 с.

55. Сафонов Г.А. Пробиотики как фактор, стабилизирующий здоровье животных / Г.А. Сафонов, Т.А. Калинина, В.П. Романова // Ветеринария. 1992. -№7-8. - С 3-4.

56. Сидоров М.А. Нормальная микрофлора животных и ее коррекция про-биотиками / М.А. Сидоров, В.В. Субботин // Ветеринария. 2000. - № 11. - С. 17-22.

57. Смирнов В.В. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных /В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова // Микробиология. 1992.- № 6. - С.82-94.

58. Смирнов В.В. Пробиотики на основе живых культур микроорганизмов / Смирнов В.В., Коваленко Н.К. // Микробиология. 2002.- № 1. - С.53-58.

59. ЗАО «ПИК Максима», 2002. С. 334.

60. Смирнов В.В. Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.Б. Сорокулова // Микробиол. журн.- 1992.- № 6.-С. 8294.

61. Смирнов В.В. Спорообразующие аэробные бактерии-продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. -Киев: Нукова Думка, 1982. 278 с.

62. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / И.Б. Сорокулова // Антибиотики и химиотерапия.-1998.- №2.-С. 20-23.

63. Стегний Б.Т., Гужвинская С.А. Перспективы использования пробиотиков в животноводстве //Ветеринария.- 2005,- №11.-С. 10 11

64. Субботин В.В. Биотехнология пробиотика лактобифадола (бифацидо-бактерина) и его лечебно-профилактическая эффективность: Автореф. дис. докт. вет. наук /В.В. Субботин. М., 1999. - 41 с.

65. Субботин В.В. Профилактика и терапия инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта животных (Экологические аспекты) // Ветеринария сельскохозяйственных животных.- 2008.- №4. С. 18-21.

66. Тараканов Б.В. Использование пробиотика при откорме гусят на мясо / Б.В. Тараканов, В.Г. Никулин, В.И. Герасименко и др. // Птицеводство.- 2004.-№5.-С. 24-25.

67. Тараканов Б.В. Новые биопрепараты для ветеринарии / Б.В. Тараканов, Т.А. Николичева // Ветеринария. 2000. - № 7. - С. 45-50.

68. Тихонов И.В. Новые пробиотические препараты с гепатопротективной активностью. / И.В. Тихонов, О.В. Анохина, М.Ю. Волков //Сб. науч.тр. 10 Юбилейного междун. Славяно-Балтийского научного форума «Гастро 2008».-СПб: ООО «Гастро», 2008.- № 2-3. -С. 5-6.

69. Тихонов И.В. Пробиотики нового поколения / И.В. Тихонов, О.В. Анохина // Международное сотрудничество и развитие биотехнологии в Кировской области: Сб. науч. трудов. Киров: Экспресс, 2008. - С.6-7.

70. Тихонов И.В. Проблемы и перспективы биотехнологии. / И.В. Тихонов, В.А. Гаврилов //Ветеринарная медицина.-М.: Агровет. .-2003.- № 3- С. 26-27.

71. Тихонов И.В. Совершенствование технологии производства пробиотика "Биод-5" и методов его контроля // Ветеринарная медицина. М: Агровет, 2004. - №4. - С. 3-6.

72. Тихонов И.В. Технология приготовления оральной (таблетированной) формы вакцины против чумы / И.В. Тихонов, Н.А. Черкасов, A.JI. Ковтун // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний. Киров, 1991.-С. 90-91.

73. Трещанина Н.А. Выделение чистой культуры бактерий. Изучение свойств выделенных штаммов / Н.А. Трещанина, М.М. Серых, Ю.П. Фролов //Техника микробиологического исследования. Самара: Восход, 1997.-76 с.

74. Тхруни Ф.Н. Исследование антибактериальных свойств новых штаммов // Биотехнология состояние и перспективы развития: Материалы 1го Международного конгресса (Москва, 14-18 октября 2002 г.).- М.: ЗАО «ПИК Максима», 2002. С. 345-346.

75. Чугунова Н.К. Разработка способов стабилизации биомассы при изготовлении лекарственных форм лактобактерина / Н.Н. Чугунова, В.А. Несчисля-ев, Г.П. Вдовина и др. //Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. -1997.-№2.-С. 102—104.

76. Шайдуллина Р.Г. Новые пробиотические препараты для животноводства / Р.Г. Шайдуллина, И.Г. Пивняк, В.А. Заболотский и др. // Аграр. Россия. -2000. № 5. - С. 64-69.

77. Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / В. С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, Е.С. Воронин М.: Высшая школа, 2003.- С.469.

78. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М.: Изд-во «Грантъ», 2001. - 288с.

79. Adams Martin R. Safety of industrial lactic acid bacteria // J. Biotechnol. -1999. Vol. 68.- №2-3. - P. 171-178.

80. Berg R.D. Probiotics, prebiotics, or conbiotics / R.D. Berg // Treds Micro123

81. Bergogne-Berezin E. Treatment and preventation of antibiotic associated diarrhea // Int. J. Antimicrob. agents. 2000. - Vol. 16.- №4. - P. 521-526.

82. ЮЗ.Втег G.W. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases / G.W. Bmer, L.W. Mc Farland, C.M. Surawicz Human Press.- 1999.- P.316.

83. Cheng C.C. Effect ofpeptides and amino acid prodused by Lactobacillus ca-sei in milk on the acid production of bifidobacteria / C.C. Cheng, T. Nagasawa // Ja-panise J. of Zootechical Sci. -1984. 55(5). - P. 339-349.

84. Collins M.D. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut / M.D. Collins -Am J. Clin Nutr, 1999; 69 (suppl).- P. 1052.

85. De Simone C. Effect of Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus on gut mucosa and peripheral blood B-lymphocytes / C. De Simone, A. Ci-ardi, A. Grassi //Immunopharmacol. 1992. -Vol. 14. - № 1-2. - P. 41-43.

86. Drago L. Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin / L. Drago, M.R. Gismondo, A. Lombardi et al //FEMS Microbiol. Lett. -1997. -№ 153(2). -P.455-463.

87. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials / C. Dunne et al // Antonie Van L. -1999. Vol. 76. - №1-4. - P. 279-292.

88. Elkins C.A. Identification of genes encoding conjugated bile salt hydrolase and transport In Lactobacillus johnsonii 100-100 / C.A. Elkins, D.C. Savage //J. Bacteriol. -1998. -№ 180. -P.-4344-4349.

89. Fuller R. Probiotics in man and animals / R. Fuller //J. Appl. Bacteriol.-1997. Vol. 66. - №5. - P. 365-378.

90. Fuller R. Bacteria associated with the gastric epithelium of neonatal pigs / R. Fuller, P.A. Barrow, B.E. Brooker // Appl. Environ. Microbiol.- 1978.- Vol. 35.-№ 3.- P. 582-591.

91. Gibson G.R. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. / G.R. Gibson, E.B. Beatty, X. Wang, J.H. Cummings //Gastroenterology.- 1995.- № 108.- P. 975-82.

92. Gissen A.S. Off probiotics, prebiotics and synbiotics / A.S. Gissen // ISS VRP'S Inc. Vit Res. Prod. Newsletters. USA. - 1995. - P. 111-117.

93. Gomes-Gil B. A riview on the use of microorganisms as probiotics / B. Gomes-Gil et al. // Rev. Latinoam. Microbiol. 1998. - Vol. 40. - №3-4. - P. 166-172.

94. Gordon J.I. Interactions between epithelial cells and bacteria / J.I. Gordon, L.V. Hooper, 1. Bry et al. //Science.-1997.-№ 276.- P. 965.

95. Grangette C. Mucosal immune responses and protection against tetanus toxjin after intranasal immunization with recombinant Lactobacillus plantarum / C. Grangette et al. // Infect Immun. 2001. - Vol. 69, № 3. - P. 1547-1553.

96. Green D.H. Characterization of two Bacillus probiotics / D.H. Green // J. Appl. and Environ.Microbiol. 1999. - Sept. - P. 4288-4291.

97. Gupta M. Lytic effect of Bacillus subtilis elastase on gram-positive and negative bacteria / M. Gupta, M. Kaur, K.G. Gupta // Indian. J. Exp. Biol.-1992. Vol. 30.-№5.- P. 380-383.

98. Kitacawa H. AT oligonucleotides inducing В lymphocyte activation exist in probiotic Lactobacillus gasseri / H. Kitacawa et al. // Int. J. Food Microbiol. 2001. -Vol. 65. - № 3. - P. 149-162.

99. Kullen M.J. Genetic modification of intestinal lactobacilli and bifidobacteria / M.J. Kullen, T.R. Klaenhammer // Curr. Issues Mol. Biol. 2000. - Vol. 2. - №2.-P. 41-50.

100. Macfarlane G.N. Probiotics and prebiotics: can regulatiny the activites of intestinal bacteria benefit health? / G.N. Macfarlane // British Med. J. 1999. - Vol. 318. - № 7189. - P. 999-1003.

101. Madsen K. et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epitelial barrier function / K. Madsen et al. // Gastroenterology. 2001. - Vol. 121. -№3.-P. 580-591.

102. Maruta K. Probiotics or antibiotics / K. Maruta //World Poultry. -1999. №3.-P.112-127.

103. McDonough P.L. Salmonella enterica infections: an emerging infectious disease / P.L. McDonough et al. // J. Clin.Microbiol. 1999. - № 37. - P. 2418-2427.

104. Morishita Y. The effects of various dietary substances on the intestinal microflora / Y. Morishita // J. Germfree Life Gnotobiol. 1991. - Vol. 21. - № 1. - P. 344-346.

105. Mulder R.W. Probiotics as a tool against Salmonella contamination / R.W. Mulder // World Poultry. 1991. - Vol. 7. - N 3. - P. 36-37.

106. Mc Farland L.I. Biotherapeutic agents: past, present and future / L.I. Mc Farland, G.W. Elmer //Microecology Ther. 1995. - № 23. P. 46-73.

107. Nemcova R. Criteria for selection of lactobacilli for probiotic use / R. Nem-cova // Vet. Med. (Praha). 1995. - - Vol. 42. - №1. - P. 19-27.

108. Ohya T. Significance of fecal volatile fatty acids in shedding of E. coli 0157 from calves: experimental infection and preliminary use of a probiotic product / T. Ohya, T. Marubashi, H. Ito // J. Vet. Med. Sci. 2000. - Vol. 62. - № 11. - P. 11511155.

109. Perdigon G. et al. Immune system stimulation by probiotics / G. Perdigon et al. //J. Dairy Sci. 1995. - Vol. 78. - №7. - P. 1597-1606.

110. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system / G. Perdigon, R. Fuller, R. Raya // Curr. Issues Intest. Microbiol.126

111. Reid G. Is there a role for lactobacilli in preventation of urogenital and intestinal infections? / G. Reid et al. // Clin. Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 3. - № 4. - P. 335-344.

112. Rivas A.L. Relations between oraly-administered colostrum derived nutrients and bovine leukocyte populations. / A.L. Rivas et al. // 38th Ann National Council, Arlington, VA. -1999. P.215-217.

113. Vanbelle M. Probiotics in animal nutrition: a riview / M.Vanbelle, E. Teller, M. Focant // Arch. Tierernahr. 1990. - Vol. 40, №7. - P. 543-567.

114. Jarvis W.R. The epidemiology of colonization / W.R. Jarvis // Infection Control and Nosocomial Colonization. 1996.-№ 17. P. 47-52.