Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Номализация экологического состояния микрофлоры организма при использовании микробной ассоциации и биологических добавок мягкого сыра "Аура"

ВАК РФ 03.00.29, Охрана живой природы

Автореферат диссертации по теме "Номализация экологического состояния микрофлоры организма при использовании микробной ассоциации и биологических добавок мягкого сыра "Аура""

КАЛУЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. К.Э. ЦИОЛКОВСКОГО

На правах рукописи

ЧЕРНЯЕВА Марина Николаевна Р Г В ОД

2 8 ш

НОРМАЛИЗАЦИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ МИКРОФЛОРЫ ОРГАНИЗМА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МИКРОБНОЙ АССОЦИАЦИИ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ДОБАВОК МЯГКОГО СЫРА «АУРА»

Специальность: 03.00.29 — Охрана живой природы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Калуга-2000

Работа выполнена в Калужском Государственном педагогическом универси тете им. К.Э. Циолковского и Государственном научном центре Российское Федерации - Институте медико-биологических проблем

Научные руководители: доктор биологических наук

И.Н. Лыков

кандидат биологических наук Н.И. Бевз

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор А.С. Гришин

кандидат медицинских наук Р.А. Розиев

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт фи-зкопогми, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Защита диссертации состоится «12 » апреля 2000г. в « 13 » часов на заседании диссертационного совета К. 113.70.03 в Калужском Государственном педагогическом университете им. К.Э. Циолковского, по адресу: 248023, г. Калуга, ул. Ст. Разина, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Калужского Государственного педагогического университета им. К.Э. Циолковского.

Автореферат разослан «11 » марта 2000г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Загрязнение окружающей среды, в результате развития мирового производства, изменения естественных соотношений между ее химическими составляющими и структурные нарушения естественных процессов формирования компонентов природной среды вызывают уменьшение биомассы фитоцекозов и нарушение зооценозов, уменьшение видового разнообразия и сокращение численности животных и растений, обострение экологической ситуации на Земле, ухудшение здоровья« снижение благосостояния людей /Голубев В.Н.,. с соавт., 1997; Ко-четкова A.A., с соавт. 1999/.

Количественное и качественное многообразие факторов и условий обитания приводит к существенным микроэкологическим сдвигам, проявляющимся на человеческой популяции.

Такие массовые и повсеместные микрозкологические явления, как дисбиотические нарушения нормальной аутофлоры человеческого организма, характеризуются интенсивностью возникновения и распространенностью патологий. Под действием экологических факторов может изменяться количественный и качественный состав микрофлоры человека /Г.И.Гончарова с соавт., 1988; 1989; Бевз Н.И., 1991; Haenel. Н., 1975; Mitsuoka Т., 1984; Salminen S. et al., 1995/.

По мере нарастания техногенных воздействий на среду обитания, в организме происходит накопление различных веществ разрушающих иммунную систему /Тараканов Б.В., 1998/. Проблема экологии человека, наряду с проблемами восстановления экологического равновесия окружающей среды, стала еще более актуальной после аварии на ЧАЭС, в результате которой огромные территории подверглись радиоактивному загрязнению. Воздействие Чернобыля затронуло аутофлору, ослабив естественную неспецифическую резистентность организма/Цыб А.Ф., с соавт., 1999/.

Дефицит поступления с пищей микронутриентов и прочих биолога-чески активных веществ, усугубляет сложившееся положение /Цыб А.Ф., с соавт., 1999/. Эффективным способом восстановления и поддержания микроэкологического баланса, а также иммунной системы организма, является повседневное потребление в пищу пробиотических продуктов, которые оказывают регулирующее и нормализующее воздействие либо на организм в целом, либо на определенные его органы или функции /Лизько H.H. с соавт., 1986; Грачева Н.М. с соавт,, 1991; Шарипова И.С. с соавт., 1994; Коршунов В.М. с соавт., 1994; Шендеров Б.А., Манвелова М.А., 1994; тендеров Б.А., 1994; Мельникова В.М. с соавт., 1997; Блохина И.Н. с соавт., 1997; Тараканов Б.В., 1998; Гринин A.C. с соавт., 1998; Veldman А., 1992/.

Неблагоприятным воздействием среды обитания на организм и обусловлена высокая потребность в пробиотических продуктах и препаратах. Поэтому разработка биотехнологии обогащения традиционных и наиболее потребляемых продуктов питания эубиотиками, а также повсеместное их производство, во всем мире считается наиболее перспективным направлением, обеспечивающим реальную защиту и укрепление общественного здоровья /Цыб А.Ф., с соавт., 1999; Кочеткова A.A., с соавт. 1999/.

Бактериотерапия и профилактика целого ряда микроэкологических сдвигов, связанных с нарушениями нормального микроб^оценоза кишечника человека, резистентности макроорганизма, его иммунного статуса и определяют то внимание, которое уделяется этой проблеме специалистами во всем мире /Шендеров Б.А. с соавт., 1994; Крашенинин П.Ф., 1995; Лыкова У. А. с соавт., 1996; Малышева З.В. с соавт., 1996; Veldman А., 1992/.

Внедрение функциональных биологически активных добавок (БАД) в продукты массового спроса - попытка на новом витке спирали развития снова вернуться к гармонии с природой и существенно расширить адаптационные возможности человека в условиях перманентно нарастающего техногенного и эмоционального стрессов /Тутельян В.Н., 1998/.

Важность и необходимость разработки новых пробиотических продуктов питания обогащенных БАД функционального назначения для массового потребления, обусловлена необходимостью нормализации микроэкологического статуса населения, подверженного воздействию неблагоприятных экологических факторов /Бевз Н.И., 1991; Шендеров Б.А., Ман-велова М.А., 1997; Кочеткова A.A. с соавт., 1999; Черняев С.И., 1999; Blum М., 1995; Potter D., 1995/.

Целью данной работы является создание нового продукта функционального назначения на основе пробиотической закваски и инулинового комплекса входящего в сухой концентрат топинамбура. Задачами данной работы являются:

- изучение эколого-биологическнх свойств B.bifidum, B.longum и Str.diacetilactis;

- изучение биотического влияния инулинового комплекса парафар-мацевтического препарата «Сухой концентрат топинамбура» на рост и продуктивное развитие микроорганизмов входящих в состав поликомпонентной закваски;

- отработка биотехнологических параметров получения мягкого сыра «Аура» с использованием ассоциативной закваски и БАД «Сухой концентрат топинамбура» при получении лабораторно-экспериментальных серий продукта;

- отработка биотехнологии получения мягкого сыра «Аура» в производственных условиях и получение экспериментально-производственных партий продукта.

Научная новизна

Впервые изучены свойства B.bifidum, B.longum и Str.diacetilactis, которые позволили использовать их в ассоциации способной к синергидному взаимодействию.

Впервые изучено влияние биотических факторов концентрата топи-

намбура на В.ЫА(1ит, B.longum и Зй-.сИасеШасйБ и их ассоциацию.

Впервые проведена апробация эколого-биотических факторов обеспечивающих создание благоприятных условий для развития бифидобакте-рий и мезофильного молочнокислого стрептококка, а также создания, на их основе, пробиотических продуктов.

Практическая значимость работы На основе лабораторных исследований проведена апробация в промышленных условиях, позволившая получить сыр «Аура», обладающий комплексом защитных факторов.

Экспериментальные данные позволили реализовать их в Технические условия (ТУ 9225-002-00427483-99) и технологическую инструкцию на производство продукта питания функционального назначения - мягкий сыр «Аура».

Разработанные ТУ и ТИ позволили внедрить мягкий сыр «Аура» в промышленное производство на ОАО «Кировский молочный завод» и ОАО «Думиничкин молочный завод» Калужской области.

Результаты разработок легли в основу целевых программ здравоохранения «Развитие индустрии детского и функционального питания», «Профилактика йоддефицитных состояний», «Диабет», которые в настоящее время реализуются на территории Калужской области. Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-технической конференции по социально-экономическим проблемам управления производством, созданию прогрессивных технологий, конструкций и систем в условиях рынка /г.Калуга, 1997/; на Всероссийской научно-технической конференции по социально-экономическим проблемам управления производством, созданию прогрессивных технологий, конструкций и систем в условиях рынка /г.Калуга, 1998/.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, список

которых приведен в конце автореферата.

Результаты диссертации доложены на научно-практическом семинаре с руководителями и главными специалистами молочных предприятий России 14.09.99./г.Адлер, 1999/. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами, 10 рисунками, состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций.

Список литературы включает 174 источника, из них 61 - зарубежных авторов.

положения, выносимые на защиту

1. В.ЫШшп, ВЛогщшп, ЗЬг.^асбШасЙБ и их ассоциация обладают кислотообразующей активностью, адгезивностью и бактериоциногенностью в присутствии инуликового комплекса концентрата топинамбура, что позволяет -использовать их для приготовления пробиотического продукта нормализующего микробиоценоз кишечника.

2. Получен новый продукт функционального питания, эколого-гигиенические свойства которого позволяют использовать его для улучшения микроэкологического статуса макроорганизма.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований В ходе выполнения работы нами изучались биологические свойства штаммов молочнокислых микроорганизмов В.ЫШшп и ВЛои^ит при совместном культивировании их со 8й\сНасеШас11з в молочной среде, исследовалось влияние инулинового комплекса концентрата топинамбура на процессы микробного синтеза и формирвание защитных свойств конечного продукта, разрабатывались приемы ведения биотехнологического процесса. Динамика размножения штаммов изучалась методом разведений и определением количества живых микроорганизмов в 1 мл культуральной жидкости через 4-6-10-12-24 ч. Специфическую активность определяли согласно МУК 4.2.577-96. В соответствие с поставленными задачами применяли следующие сырье и основные материалы: молоко коровье по ГОСТ 13264; молоко обезжиренное кислотностью не более 19 °Т, плотностью не менее 1030 кг/м3; бакконцентраты бифидобактерий видов В.Ыйдшп и В.кищшп не ниже 109; бакхонцентрат по ТУ 9229-032-04610209-95; антагонистическая закваска для мягких сычужных сыров по ТУ-10-02-0278666-91; препараты ферментативные молокосвертывающие; соль поваренная пищевая по ГОСТ 13830; калыций хлористый двуводный по ТУ 6-09-5077; кальций хлористый по ТУ 6-09-4711; сухой порошок топинамбура по ТУ 9379-00311866470-95. Контроль заквасок на отсутствие 51аигеиз, патоге-ных михроорганвзмов, в т.ч. сальмонелл осуществлялся, согласно МУК 4.2.577-96, посевом на скошенный столбик с МПА, на питательный агар с 5 % глюкозы и среду Эндо и инкубированием при 37 - 38 °С в течение 2 суток. Контроль готового продукта проводился в соответствие с МУК 4.2.577-96 на: количество живых бифидобактерий в готовом продукте, определяемое приготовлением разведений до Ю'10 в гидролизатно-молочной среде и термостатированием при температуре 37 - 38 °С в течение 2 суток. В мазках, окрашенных по Граму, при отсутствии посторонней микрофлоры, идентифицировалась культура бифидобактерий - грамположителыше

палочки с бифуркацией или булавовидными утолщениями на концах, в количестве не менее Ш8 в 1 мл и культура Str.diacetilactis; отсутствие бактерий группы кишечных палочек определялось отсутствием газообразования или помутнения среды при прямом посеве 10 мл эмульсии продукта в 90 мл среды Кесслера с лактозой; отсутствие бактерий рода Salmonella определялось прямым посевом в среду Мюллера с двойной концентрацией ингредиентов, при соотношении эмульсии продукта и среды 1/1 и последующим пересевом штрихом на дифференциально-диагностические среды Плоскирева и висмут-сульфитный агар; отсутствие St.aureus определялось посевом в пробирки с солевым бульоном при соотношении эмульсии продукта и среды 1/10, и последующим пересевом на желточно-солевой агар; отсутствие B.cereus определялось при посеве на среду Донована. Идентификация микроорганизмов осуществлялась общепринятыми методами. Оценка адгезивных свойств проводилась под световым микроскопом с иммерсией с помощью СПА - среднего показателя адгезии (неадгезивные, СПА - 0-2 клетки бифидобактерий на одном эритроците; низкоадгезивные

- от 3 до 5 клеток; среднеадгезивные - от 6 до 10 клеток; высокоадгезивные

- более 10 клеток, при подсчете 25 эритроцитов). Антагонистическую активность штаммов бифидобактерий, находящихся в продукте, проверяли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде в чашках Петри, а также методом совместного выращивания в жидкой питательной среде с последующим высевом на плотные среды в отношении 4 тест-штаммов: E.coli, St.aureus, Pr.mirabilis, Pr.vulgaris. Идентификация St.aureus проводилась на основании двух тестов - плазмокоагуляции и ферментации маннита в анаэробных условиях /Акатов А.К., Зуева B.C., 1983; A.C. Baird-Parker, 1965/. Бактериоциногенгость и бактериоциночувстви-тельность определяли по образованию зоны задержки роста индикаторной культуры.

Результаты исследований и их обсуждение

Для создания поликомпонентного пробиотического продукта функционального назначения, обладающего защитными факторами, нами проведены исследования эколого-биологических (культуральных, кислотообразующих, антагонистических, адгезивных и бактериощшогенных) свойств микроорганизмов, составляющих действенную основу закваски, а также их способности сквашивать молочную основу.

Активность кислотообразования штаммов изучали при культивировании их в молочной среде.

Исследовалась динамика развития В.ЫМит 791, ВЛоп^шп В379М и БйчсНасеШасШ в ассоциации и монокультуре.

Отмеченной нами особенностью полученных результатов, явился тот факт, что кислотообразующая активность смешанной популяции практически соответствовала штамму В.1оп§ит В379М (табл. 1).

Таблица 1

Активность кислотообразования ассоциации и монокультур в разные сроки культивирования (в °Т)

Ростовую активность штаммов в ассоциативной культуре оценивали по скорости размножения клеток бифидобактерий и мезофильного молочнокислого стрептококка в динамике развития в молочной среде (табл. 2).

Полученные экспериментальные данные согласовывались с результатами других исследователей (Бевз Н.И., 1991; Лянная A.M. с соавт., 1996).

Таблица 2

Динамика развития штаммов В. Bifidum 791, B.longum В379М и Str. diacetilactis при совместном и раздельном выращивании в разные сроки культивирования (lg 10)

Штаммы

Время культивирования (часы)

4 6 8 10 1 12 I

791 + B379M + Str. diacetilactis 6,6 8,8 8,7 9,15 9,15

791 6,6 8,7 8,4 8,9 8,9

B379M 6,6 8,8 8,6 9,0 9.0

Str. diacetilactis 7,1 8,5 8,9 9,1 j 9,12

Полученные данные, приведённые в таблице 2, свидетельствуют о том, что скорость размножения исследуемой ассоциациативной популяции штаммов достигала максимальных величин к 12 часам культивирования, составляя 8,9-9,15 и практически не уступала таковой в контроле штаммов B.bifidum 791, B.longum В379М и Str. diacetilactis.

Антагонистическую активность ассоциации B.bifidum + B.longum, а также их монокультур, в отношении тест-штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, исследовали в динамике при их совместном культивировании в течение 48 часов роста. К 24 часам культивирования подавление роста тест-штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов ассоциированной культурой бифидобактерий было более выраженным, чем в монокультуре. Тем не менее, к 48 часам наступала полная гибель тест-штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, как при культивировании с монокультурами бифидобактерий, так и с их ассоциацией. Величины зон задержки роста тест-штаммов условно-патогенных и патогенных микроорганизмов были более значительными при культивировании их с ассоциацией B.bifidum 791+B.longum B379M+Str. diacetilactis (табл. 3).

По нашему мнению, более высокая биологическая активность ассоциативных штаммов объясняется их синергидным взаимодействием.

Таблица 3

Антагонистическая активность штаммов В. Bifidum 791, B.longum В379М и Str. diacetilactis на плотных средах

Штаммы

791 + В379М + Str.

diacetilactis

791

В379М

При конструировании функциональных продуктов, обладающих заданными защитными свойствами, в качестве действующих основ которых используются закваски ассоциативных культур микроорганизмов, необходимо было изучить их взаимовлияние друг на друга, а именно бактериоци-ногенность и адгезивность.

Способность к образованию колицинз - это наследственное свойство бактериального штамма, это очень устойчивое свойство, и до сих пор не описано ни одного случая утраты этого признака (Адаме М. 1961).

Действие бактериоцинов очень специфично. Существует внутривидовая специфичность, когда каждый бактериоцин обладает определенным спектром лмтическош действия.

Возможность подавления штаммами бифидобактерий друг друга, при помощи образования бактериоцинов, белковых веществ узкого спектра антагонистического воздействия, является неприемлемым свойством для ведения биотехнологических операций в промышленных условиях.

Антагонистическое воздействие ассоциированных штаммов друг на

друга отрицательно влияет на динамику взаимного развития, в частности на активность кислотообразования. Это в свою очередь ведет к снижению антагонистической активности по отношению к условно патогенным и патогенным микроорганизмам. Поэтому нами были проведены опыты по выявлению бактериоциногенности у В. ЫЯйшп 791 и В.1оп§шп В379М. Оба штамма выделяли бактериоцины, образовывая зоны задержки роста индикаторных культур: В. ЫШдап 791 образовывал зону задержки 0,7+0,2 мм, а ВЛо^ит В379М - 2,0+0,5 мм (табл. 4), но при совместном культивировании они не подавляли друг друга.

Таблица 4

Считается, что адгезия (способность микроорганизмов колонизировать слизистую кишечника, и по данным Бевз Н.И. (1991), именно тесная связь бифидобактерий с поверхностью эпителия слизистой оболочки создает «экран», отделяющий от кишечного эпителия основную массу энте-робактерий) играет главную роль при колонизации слизистых оболочек макроорганизма и является наиболее общим свойством микроорганизмов, определяющим их поведение в биоценозах (Чахава с соавт., 1982).

Ряд исследователей (Бевз Н.И., 1991; Черняев С.И., 1999) полагают, что защитные свойства бифидобактерий, (а следовательно и конструируемого продукта) должны также определяться юс адгезивностью, и, что ци-тадгезия бифидобактерий - один из ключевых критериев, который должен учитываться при создании препаратов и прсбиотических продуктов функционального назначения.

Анализ различных методов изучения адгезивности бифидобактерий

позволил нам выбрать для исследований методику определения адгезивно-сти бифидобактернй на эритроцитах человека (при подсчете не менее чем 25 эритроцитов). Исследования вели под световым микроскопом с иммерсией, определяя СПА - среднее количество микробов прикрепившихся к одному эритроциту. Как видно из данных таблицы 5, штамм В.ЬШсЬш 791 обладал высокоадгезивными свойствами, а В.1ог^ит В379М -среднеадгезивными.

Таблица 5

Проведенные исследования таких эколого-биологических свойств В.ЫШит 791, В.1оп§ит В379М и Зы.&асеШасйз, как активность кислото-образования, антагонистическая активность, динамика накопления биомассы, адгезивность и бактериоциногенность, позволили нам принять обоснованное решение о целесообразности их использования при создании функционального продукта, обладающего защитными свойствами.

Полученные результаты позволили нам приступить к следующему этапу исследований - изучению условий приготовления пробиотических продуктов с использованием ассоциированной закваски и сухого концентрата топинамбура.

В связи с поставленной задачей по разработке пробиотического кисломолочного продукта питания, обладающего заданными защитными свойствами, необходимо было определить влияние различных количеств концентрата топинамбура на динамику изменения кислотности продукта в процессе ферментации. Сухой концентрат топинамбура в различных количествах вносили в нормализованное молоко.

После внесения заквасок и начала процесса ферментации через каждый час определяли удельную (титруемую) кислотность и активную (рН) кислотность.

В процессе исследований было замечено, что инулиновый комплекс концентрата топинамбура оказывает определенное стимулирующее влияние на динамику развития входящих в состав закваски микроорганизмов.

Мы также полагаем, что комплекс микроэлементов и аминокислот концентрата топинамбура, экстрагируясь в молочную основу оказывает по-видимому дополнительное влияние, стимулирующее ростовую активность, а также динамику кислотообразования бифидобактерий и мезо-фильного молочнокислого стрептококка. Аналогичные данные получены другими исследователями (Родионова Н.С., Глаголева Л.Э., 1998; Родионова Н.С., 1999).

Сравнительная характеристика удельной кислотности продукта при внесении БАД концентрата топинамбура, в различных количествах отражена в таблице 6.

Таблица б

Сравнительная характеристика удельной кислотности продукта

Сравнительная характеристика активной кислотности продукта при внесении БАД концентрата топинамбура, в различных количествах отражена в таблице 7.

Таблица 7

Сравнительная характеристика активной кислотности продукта при

Концентрация БАД, % Динамика изменения активной кислотности в процессе ферментации молока, рН

1 ч 2ч | Зч 4ч 5ч 6 ч

0,00 6,00 5,87 5,72 5,61 5,2 4,90

0,05 6,00 5,87 | 5,67 5,33 4,87 4,62 —

0,10 6,02 5,60 | 5,34 5,03 4,23

0,15 6,04 5,60 5,12 4,80 4,04 | 4,00

[ 0,20 6,04 | 5,49 | 5,00 4,76 3,62 3,44 1

Параметры приготовления нового продукта для нормализации

экологического состояния микрофлоры организма - мягкого сыра

«Аура»

Все биотехнологические операции, связанные с приемхой молока, выполняли в соответствии с требованиями, указанными в «Сборнике нормативно-технических документов по производству мягких сыров». Массовую долю жира в нормализованной смеси устанавливали в зависимости от содержания жира и белка в исходном молоке из расчёта получения в сухом веществе сыра не менее 45%; 50% жира соответственно. Температура пастеризации смеси устанавливалась 72-78 °С с выдержкой 20-25 секунд. Для сокращения продолжительности технологического процесса, повышения качества, сокращения потерь при производстве сыра использовали зрелое молоко. Допускалась выработка сыра из свежего молока с добавлением 20% зрелого молока.

Перед работой производили приготовление биодобавки. Сухой порошок заливали водой, перемешивали и оставляли на 5 часов. Затем пастеризовали при температуре 95-97 °С с выдержкой 5-10 минут. После охлаждения до 40 °С биодобавку вносили в молочную смесь. Свертывание молока и обработка сгустка осуществлялись при температуре 37-38 С. В приготовленную смесь вносили: бактериальную закваску, приготовленную из штаммов мезофильного молочнокислого стрептококка и бифидобактерий. Затем пастеризовали при температуре 95-97 °С с выдержкой 5-10 минут. После охлаждения до 40 °С биодобавку вносили в молочную смесь. Свертывание молока и обработка сгустка осуществлялись при температуре 3738 С. В приготовленную смесь вносили: бактериальную закваску, приготовленную из штаммов мезофильного молочнокислого стрептококка и бифидобактерий в количестве 1,5-2%. Для улучшения плотности сгустка вносили 40%-ный водный раствор хлористого кальция из расчета 10-40 г безводной соли на 100 кг смеси. Смесь тщательно перемешивали и оставляли в покое. Через 60-70 минут после внесения закваски в смесь добавляли необходимое количество молокосвёртывающего фермента или ферментного препарата. После внесения сычужного фермента смесь перемешивали в течение 3-5 минут, затем оставляли в покое до образования однородного сгустка. Продолжительность свертывания 30-40 минут. Готовность сгустка проверяли пробой на излом. Сгусток был нормальной плотности, к моменту разрезки при изломе имел блестящую гладкую поверхность со слегка округленными краями.

Готовый сгусток резали на кубики размером 3-5 см. Затем вели постановку зерна в течении 10-15 минут до размеров 0,8-1,0 см. После этого сырное зерно вымешивали 3-5 минут для более полного выделения сыворотки.

После удаления 50-60% сыворотки в оставшуюся сырную массу вводили поваренную соль из расчёта 1,2 кг соли на 100 кг смеси. Соль вносили в виде пастеризованного и отфильтрованного рассола.

Температура пастеризации рассола 80-85 °С, концентрация 1820%. Температура рассола при посолке 10-12 °С.

Сырную массу тщательно перемешивали и выдерживали в сырной ванне 15-20 минут. После этого удаляли оставшуюся сыворотку и приступали к осуществлению процессов формования и самопрессования сыра.

Для формования сыра «Аура» применяли прямоугольные и круглые формы, предварительно выстланные серпянкой.

Допускалось формование сыра из пласта, который образовывали и прессовали в ванне или на столе в серпянке.

Самопрессование сыра продолжали 30 минут.

Затем сыр прессовали при нагрузке 0,8-1,5 кг на 1 кг сыра в течение 50-60 минут.

В процессе прессования, для более качественного удаления сыворотки производили 2-3 перепрессовки.

После окончания процесса прессования осуществляли упаковку, маркировку, транспортирование, созревание сыра при комнатной температуре в течение 5-6 часов и хранение при температуре 0-6 °С и относительной влажности воздуха 80 ± 5% в течение всего периода проведения лабораторных испытаний.

Влияние различного количества концентрата топинамбура на орга-нолептические показатели готового продукта приведено в таблице 8.

Для дальнейших исследований нами была выбрана концентрация Б АД, равная 0,1%, которая соответствовала рекомендуемому различными исследователями (Родионова Н.С., Глаголева Л.Э., 1998; Зеленков В.Н., Колесникова О.П., Кудаева О.Т., 1999) диапазону (0,08-0,12%) по содержанию инулина, микроэлементов и аминокислот.

Данная концентрация не оказала существенного влияния на орга-нолеатические показатели продукта в сравнении с традиционными, привычными и присущими данному виду продуктов.

Таблица 8

Влияние различных концентраций БАД концентрата топинамбура на

органодептические показатели готового продукта Концентрация | Органолептическая оценка готового продукта

| БАД, %

0,00 Запах и вкус чистый кисломолочный, в меру соленый. Консистенция в меру плотная, слегка ломкая без заметных крупинок. Цвет теста белый, равномерный по всей массе. Глазки щелевидные. Поверхность чистая, без корки, слегка влажная.

0,05 1 Запах и вкус чистый кисломолочный, в меру соленый. Консистенция в меру плотная, слегка ломкая без заметных крупинок. Цвет теста светло-кремовый, неравномерный по всей массе. Глазки 1 щелевидные. Поверхность чистая, без корки, слегка 1 влажная.

0,10 Вкус чистый кисломолочный, в меру соленый с легким привкусом и запахом концентрата топинамбура. Консистенция в меру плотная, слегка ломкая без заметных крупинок. Цвет теста светло-кремовый, равномерный, с вкраплениями наполнителя. Глазки щелевидные. Поверхность чистая, без корки, слегка влажная. 1

0,15 Вкус и запах кисломолочный, с выраженным спе- 1 цифическим оттенком концентрата топинамбура. Консистенция плотная, ломкая с заметными крупинками. Цвет теста грязно-кремовый, неравномерный, с вкраплениями наполнителя. Глазки щелевидные. Поверхность чистая, без корки, слегка влажная.

0,20 Ярко выраженный, специфический вкус и запах концентрата топинамбура. Консистенция плотная, ломкая, крупинчатая. Цвет теста грязно-кремовый, неравномерный, с вкраплениями наполнителя. Глазки щелевидные. Поверхность пятнистая, без корки, слегка влажная. ]

Характеристика полученного продукта

Полученный пробштический продукт - мягкий сыр «Аура», выработанный из пастеризованного, нормализованного молока путем свертывания его сычужным ферментом с применением чистых культур

молочнокислых бактерий, бифидобактерий видов В.ЫМшп, В.1оп§шп и БАД, представляющей собой природный инулиновый комплекс с микроэлементами (концентрат топинамбура). По органолептическим показателям сыр соответствовал требованиям, указанным в таблице 9.

Таблица 9

Вкус и запах

Консистенция Цвет теста

Наименование показателя

Внешний вид

Характеристика для:

Гыр Аура с массовой | долей жира в сухом веществе 40%, 45%

□

Сыр Аура деликатесный с массовой долей жира в сухом веществе 40%, 45%

Поверхность чистая, без корки, слегка влажная

Чистый кисломолочный, в меру соленый

Чистый кисломолочный, в меру соленый с привкусом и запахом

внесенного ингредиента _

В меру плотная, слегка ломкая без заметных крупинок От белого до свет- Цвет наполнителя при применении жидких наполнителей, равномерно ный по всей массе, при применении сухих наполнителей — неравномерный, с вкраплениями наполнителя

ло-кремового, равномерный всей массе.

Глазки неправильной формы, щелевидыые

По физико-химическим показателям сыр соответствовал требованиям, указанным в таблице 10.

Таблица 10

Физико-химические показатели сыра «Аура»

Наименование сыра

Массовая доля, %

Аура

Аура деликатесный

Жира в сухом веществе, не менее

13"

45

40 45

Влаги, не более

~62~

62

Поваренной соли, не более

То" 1,0

62 62

1,0

1,0

По микробиологическим показателям продукт соответствовал МУК 4.2.577-96. В мазках из готового продукта, окрашенных по Граму, была культура бифидобактерий: грамшложителышх палочек с бифуркацией или булавовидными утолщениями на концах в количестве 108 в 1 мл, и культура мезофшшюго молочнокислого стрептококка. Посторонней микрофлоры не обнаружено.

Таблица 11

Микробиологические показатели мягкого сыра «Аура» Наименование показателей _ | Норма Фактически'

Количество бифидобактерий

в 1 см продукта, КОЕ не менее Бактерии группы кишечной палочки в 10 см3 продукта

Не допускаются

Отсутствовали

Патогенные микроорганизмы, в т. ч. Не допускают-сальмонеллы в 10 см3 продукта I ся

Отсутствовали

Полученные результаты позволили нам перейти к заключительному этапу разработки продукта в условиях производства.

Нами были составлены: «Технические условия» и «Технологическая инструкция» по производству пробиотического продукта с широким спектром защитного действия - мягкого сыра «Аура».

Приготовлены экспериментальные партии продукта.

Проведены доклинические и клинические испытания продукта.

Приготовление пробиотического продукта - мягкий сыр «Аура» в производственных условиях

Апробация биотехнологических приемов, обеспечивающих сани-тарно-экологические нормы при изготовлении пробиотических продуктов функционального назначения, в условиях промышленного производства

осуществлялась на двух предприятиях: в ОАО «Кировский молочный завод» и ОАО «Думиничкий молочный завод» Калужской области.

Как правило, при освоении промышленного производства подобных продуктов требуется дооснащение бвдтехнологической цепи специальным оборудованием, а также обеспечение специальных условий культивирования микроорганизмов.

Нам удалось при моделировании бнотехнологической схемы избежать подобных трудностей.

В ОАО «Кировский молочный завод» было апробировано производство мягкого сыра «Аура» на импортной биотехнологической линии швейцарского концерна АРУ. Продукт производится ежедневно и реализуется, как в специализированных магазинах "Диета", учреждениях социальной сферы и здравоохранения, так и в традиционной торговой сети Калужской, Смоленской и Московской областей.

В ОАО «Думиничкий молочный завод» мягкий сыр «Аура» производится исключительно на отечественном технологическом оборудовании и реализуется в Калужской, Московской и Брянской областях.

Медико-биологические исследования

Медико-биологические исследования включали в себя доклинические и клинические испытания пробиотического продукта.

Результаты доклинических испытаний мягкого сыра «Аура», содержащего в качестве действующего начала два вида бифидобактерий, мезо-фильный молочнокислый стрептококк и БАД - парафармацевтическое средство «Сухой концентрат топинамбура», подтвердили его безвредность и приемлемые органолептические свойства.

Испытания заключались в апробации продукта на безвредность и переносимость на 27 здоровых добровольцах. Продукт получали медицинские сотрудники Калужского войскового госпиталя по 125 г в день в

течение двух недель. Побочных явлений, таких как повышение температуры, тошнота, рвота, кожные проявления, усиление диарейного синдрома у лиц, получавших мягкий сыр «Аура» не наблюдалось. Переносимость продукта была хорошей. Нами не было отмечено у добровольцев различных побочных явлений и аллергических реакций.

Самими добровольцами, получавшими мягкий сыр «Аура», также не было отмечено побочных реакций на употребление продукта, не было неудовлетворительных отзывов, в том числе на органолептические свойства. Одновременно отмечалось общее улучшение самочувствия, восстановление аппетита, нормализация стула.

Таким образом, нами был получен новый кисломолочный продукт лечебно-диетического питания, который был рекомендован к проведению клинических испытаний и использован с целью профилактики и лечения дисбактериозов кишечника различной этиологии, при острых кишечных инфекционных заболеваниях (острой бактериальной дизентерии, эшери-хиозах, вирусной диарее), хронических воспалительных заболеваниях тонкого и толстого кишечника, кишечных дисфункциях на фоне дисбактериозов, стафилококковых инфекциях с поражением желудочно-кишечного тракта, при раннем переводе детей на искусственное вскармливание, при комплексном лечении сепсисов, пневмоний, сердечно-сосудистых заболеваний и других заболеваний, при антибиотикотерапии, лучевой и химиотерапии, заболеваниях обмена.

Клинические испытания мягкого сыра «Аура» проводились в Ка- . лужской Областной детской больнице.

Продукт назначался детям со следующими заболеваниями:

1. Хронический гастрит, гастродуоденит, запор - 24 ребенка.

2. Дисбактериоз кишечника - 17 детей. Из данной группы у 8 детей имелись проявления атонического дерматита.

3. Сахарный диабет - 4 ребёнка.

Курс лечения составил 15 дней.

Продукт назначался на фоне базисного лекарственного лечения детям старше 5 лет в дозе по 125 г два раза в день; детям до 5 лет - по 125 г один раз в день.

У детей страдающих дисбактериозом проводилось биологическое исследование микрофлоры кишечника.

В результате применения мягкого сыра «Аура», были получены следующие данные:

1. Дети хорошо переносили данный продукт.

2. Жалоб на органолептические свойства не было.

3. В группе страдающей дисбактериозом. кишечника отмечалась нормализация стула, исчезли аллергические кожные проявления; улучшение микробиоценоза кишечника подтверждено бактериологическими исследованиями.

4. У детей страдающих сахарным диабетом не было отмечено никаких изменений в процессах углеводного обмена.

Полученные данные позволили сделать следующие выводы:

1. Мягкий сыр «Аура» может использоваться во всех возрастных группах как обычный продукт питания, а также в лечебных целях при нарушениях микробиоценоза кишечника.

2. Данный продукт может с успехом применяться у больных с сахарным диабетом.

Таким образом, нами создан новый кисломолочный продукт обладающий защитными свойствами - антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре кишечника человека, способностью к сдерживанию ее роста и восстановлению уровней полезных популяций микроорганизмов; отсутствием необходимости выделения организмом человека инсулина для усвоения натуральной БАД растительного происхождения.

Учитывая, что микробная масса продукта находится в живой и наиболее активной форме, являясь мощным биологическим средством подавления гнилостной микрофлоры, а также активным естественным средством для нормализации аутофлоры человека, данный продукт может быть рекомендован к потреблению всеми людьми, без ограничения возраста и пола, в том числе страдающими дисбактериозами, диареями различной этиологии, колитами и энтероколитами, пониженным иммунитетом, сахарным диабетом.

Выводы

1. Исследованы эколого-биологические свойства штаммов бифи-добактерий В. bifidum и В. longum и показано, что они обладают адгезив-ностью (СПА В. bifidum 791 составил 12,6; СПА В. longum В379М - 8,2) и бактериоциногенносгью (для В. bifidum 791 зона задержки роста индикаторной культуры составила 0,7+0,2 мм; для В. longum В379М зона задержки роста индикаторной культуры составила 2,0+0,5 мм). Наличие антагонистической активности не оказало существенного взаимовлияния их друг на друга, что позволяет использовать их в комплексном препарате.

2. Установлено, что комплексный бакконцентрат с В. bifidum, В. longum и Str. diacetilactis обладает большей антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам (зона задержки роста тест штаммов: E.coli - 29,8 мм; S.aureus - 19,7 мм; Pr.mirabilis - 25,5 мм; Pr.vulgaris - 20,1 мм), чем монопрепараты из этих же штаммов.

3. Изучено биотическое влияние инулиновош комплекса сухого концентрата топинамбура на рост и продуктиное развитие микроорганизмов, входящих в состав поликомпонентной закваски, позволило установить оптимальное количество вносимого сухого концентрата топинамбура (0,1%) не оказывающего негативного влияния на микробиологические процессы.

4. В результате экспериментальной апробации разработанных эколого-биотических условий создан новый пробиотический продукт -мягкий сыр «Аура», основу которого составляют бифидобактерии двух видов, мезофильный молочнокислый стрептококк и БАД растительного происхождения - парафармацевтическое средство «Сухой концентрат топинамбура».

5. Установлено, что новый пробиотический продукт обеспечивает нормализацию экологического состояния микробиоценоза кишечника,

предотвращает возникновение кожных аллергических проявлений и является перспективным для профилактики сахарного диабета.

6. На основе исследований кислотообразующей активности, бак-териоциногенности В.ЫМит, ВЛмщит, БтсНасеШасйз и биотического влияния инулинового комплекса сухого концентрата топинамбура на рост и продуктивное развитие этих микроорганизмов, разработана биотехнология получения пробиотического продукта - мягкого сыра «Аура» и других лечебно-диетических сыров. Особенностью биотехнологического процесса является возможность использования исключительно отечественного оборудования, что способствует его максимальному внедрению.

научно-практические рекомендации

1. Разработанная нормативно-техническая документация - Технические условия №9225-002-00427483-99 и Технологическая инструкция на производство мягкого сыра «Аура», позволяет освоить его выпуск на любых предприятиях молочной промышленности и может быть рекомендована для дальнейшего практического внедрения.

2. Новый пробиотический продукт может использоваться в качестве диетического и диабетического продукта, а также в качестве средства профилактики дисбактериозов в любом возрасте.

3. Мягкий сыр «Аура» может быть рекомендован в качестве пробиотиче-ского продукта в общем комплексе лечебно-профилактических мероприятий по преодолению последствий радиационных и других чрезвычайных экологических ситуаций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Черняев С.И., Казаков A.B., Сошин С.А., Черняева М.Н. Бифифрут -реальность и перспективы П Молочная промышленность. №1. 1998. с. 16-17.

2. Черняев С.И., Гринин A.C., Пронин J1.T., Сошин С.А., Черняева М.Н. Кисломолочные эубиотики - пищевые продукты для восстановления экологического баланса организма // Тез. докл. Российская научно-техническая конференция. Калуга: КФМГТУ им. Н.Э.Баумана, 1997. с. 209.

3. Черняев С.И., Гринин A.C., Черняева М.Н. Сравнительная характеристика жидкого концентрата бифидобактерий и сухого бифидумбакте-рина // Тез. докл. Российская научно-техническая конференция. Калуга: КФМГТУ им. Н. Э.Баумана, 1997, с. 208.

4. Черняева М.Н. Микроэкологические аспекты макроорганизмов в трудах И.И. Мечникова // Тез. докл. Российская научно-техническая конференция. Калуга. КФМГТУ им. Н.Э. Баумана, 1998.

5. Черняев С.И., Черняева М.Н., Гринин A.C. Экологические аспекты бифидобактерий // Науч. докл. Российская научно-техническая конференция. Калуга: КФМГТУ им. Н.Э. Баумана, 1998. с. 228 - 231.

6. Цыб А.Ф., Розиев P.A., Бевз Н.И., Черняев С.И., Черняева М.Н. Продукты с нетрадиционными БАД // Молочная промышленность. №1-1. 1999. с. 11-13.