Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки и ее применение при выращивании цыплят-бройлеров

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки и ее применение при выращивании цыплят-бройлеров"

На правах рукописи

СИТНИКОВ ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2004

Работа выполнена на кафедре «Микробиологии и ветсанэкс-пертизы», ФГОУ ВПО «Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова».

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф. Васильев Дмитрий Аркадьевич

д.м.н., проф. Самойлова Любовь Владимировна

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии гигиены и экологии РАСХН

Защита состоится «л »рйА&^Я 2004 г. йИ3^ часов на заседании диссертационного сов'ета Д 220.061.04 в ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова» по адресу 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335

Автореферат разослан 2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальностьтемы

В промышленном птицеводстве, в последнее время, ведущую роль в гибели молодняка стали занимать желудочно-кишечные заболевания бактериального происхождения (Гусев и др., 2003). Мировой опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью, а штаммы многих возбудителей кишечных инфекций приобрели множественную лекарственную устойчивость (Тараканов, 2000; Малик, Панин, 2001; Schoeni et. al, 2002).

Возрастающие требования к экологической безопасности выпускаемой продукции привели к необходимости разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты в промышленном птицеводстве (Лизько, 1999). Этим требованиям отвечают пробиотические кормовые добавки и препараты, в состав которых входят живые видоспецифичные бактерии из числа основных представителей нормальной микрофлоры кишечника теплокровных (лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки, эшерихии) (Мали, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998).

Ввиду этого является актуальным направление по разработке пробиоти-ческих кормовых добавок и препаратов, в том числе и на основе молочной сыворотки, т.к. она является богатой питательной средой для роста микроорганизмов, обладает пищевой и биологической ценностью. Кроме того, проблема рационального использования молочного сырья неразрывно связана с ее эффективной переработкой. Данный вопрос рассматривался в Международной молочной федерации (ММФ) и, неоднократно, на международных молочных конгрессах. Промышленной переработке подвергается только около 20% всего объема (Ковтунова, Бушуева, Пинаева, 1985; Храмцов, 1990; Шиллер, 1983; Шильнаиков, Минакова, 1986; Мацерушка, 1998).

Недостаток эффективных технологий переработки и способов использования молочной сыворотки с одной стороны и с другой - необходимая потребность в кормовых добавках с пробиотическими свойствами для птицеводства в целях профилактики кишечных инфекций послужили основанием для выбора темы.

Цель работы - создание пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием микроорганизмов с выраженными пробиотическими свойствами из желудочно-кишечного тракта кур для применения в промышленном птицеводстве и разработка экспериментальной технологии ее получения.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

ys

Задачи исследований

1. Выделить от здоровой птицы активные культуры микроорганизмов-пробионтов родов Enterococcus и Lactobacillus, способные активно развиваться на молочной сыворотке.

2. Разработать технологию получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур микроорганизмов.

3. Определить эффективность от применения пробиотической добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна

• По разработанным нами схемам впервые выделены штаммы микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus от сельскохозяйственной птицы, способные активно размножаться при культивировании на молочной сыворотке и обладающие пробиотическими свойствами.

• На основе молочной сыворотки с применением отобранных культур штаммов разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки для применения в промышленном птицеводстве.

• Установлено, что применение пробиотической кормовой добавки при выращивании цыплят-бройлеров способствует более быстрому формированию микрофлоры кишечника цыплят, сокращению периода откорма, снижению падежа и затрат корма.

Практическая значимость

Выделены штаммы культур микроорганизмов из числа представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы родов Enterococcus и Lactobacillus обладающих пробиотическими свойствами, перспективные для разработки пробиотических препаратов и кормовых добавок.

Как один из способов рационального использования вторичного молочного сырья разработана экспериментальная технология производства про-биотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) для применения на птицеводческих предприятиях.

Предлагаемая к применению пробиотическая кормовая добавка позволяет снизить гибель цыплят в первые дни жизни за счет профилактического эффекта и повысить экономическую эффективность работы птицеводческого предприятия.

Пробиотическая кормовая добавка использована в работе ОАО «Птицефабрика Михайловская», что сопровождено соответствующими актами:

^акт о проведении клинических испытаний экспериментальной пробио-тической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 14 сентября 2003 г;

^ акт о внедрении в промышленное птицеводство пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 21 сентября 2003 г.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Выделены штаммы культур микроорганизмов обладающие пробио-тическими свойствами и необходимыми ростовыми качествами.

2. Разработана экспериментальная технология производства пробиоти-ческой кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных штаммов микроорганизмов.

3. Исследован процесс формирования отдельных групп нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров при применении разработанного продукта.

4. В промышленных условиях показан профилактический и экономический эффект от применения пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятах-бройлерах.

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и ветсанэкспертизы, и технологии молока и молочных продуктов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова в рамках темы основного направления работы кафедры технологии молока и молочных продуктов - «Комплексная переработка вторичного молочного сырья».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Саратов, 2003), на Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (2002), на Международном симпозиуме Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания (Кемерово, 2002), на конференции в РосНИПЧИ «Микроб» Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте Микроб (Саратов, 2004).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2002-2003 г.г.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 5 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованных лите-

ратурных источников. Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста, включают 14 рисунков, 23 таблицы. Список использованных литературных источников включает 118 наименований, в том числе 31 зарубежных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы

Обогащение проб фекалий взрослых клинически здоровых кур и выделение штаммов ацидофильной палочки и энтерококков осуществляли по методике Л.А. Банниковой (1975). Идентификацию выделенных штаммов осуществляли по совокупности отдельных характерных морфологических, физиологических и культуральных признаков изучаемых микроорганизмов, установленных в ходе их выделения и исследования.

Отбор наиболее активных культур кислотообразователей осуществляли при их высеве на гидролизованное молоко с агаром и мелом по величине зон просветления вокруг колоний.

Безвредность штаммов энтерококков определяли в тестах in vitro (гемолиз, лецитиназная активность, фибринолитическая активность) и in vivo (на белых мышах per os) (Биргер, 1982).

Антагонистическую активность лактобацилл и энтерококков определяли по методу «отсроченного антагонизма» (Хмель и др., 1976) и методом «развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в монокультуре» (Ганина и др. 1999). Исследование пассажной изменчивости, а также детальное изучение культуральных, физиологических и биохимических свойств лактобацилл и энтерококков (по внутриродовым признакам) проводили, в соответствии со справочником Л.А. Банниковой и др. (1987) и девятым изданием определителя бактерий Берджи.

Все исследования при подборе культур лактобацилл и энтерококков для приготовления закваски осуществляли в соответствии с методиками Л.А. Банниковой и др. (1987). Определение характера влияния совместного выращивания пробиотических культур на совокупную антагонистическую активность питательной среды (молочной сыворотки) проводили по одному из вариантов метода диффузии в агар (Гриневич, 1981).

Выбор оптимального температурного режима процесса сквашивания молочной сыворотки, осуществляли по наименьшей продолжительности и необходимому конечному соотношению видов микроорганизмов.

Выбор вида и режима тепловой обработки молочной сыворотки осуществляли в соответствии с санитарными требованиями к производству пробио-тиков (Степаненко, 2002).

Санитарную оценку готового продукта проводили в соответствии с методиками определения наличия посторонней микрофлоры и бактерий группы кишечной палочки (Степаненко, 2002; Банникова и др., 1987).

Определение антагонистической активности готовой пробиотической добавки и изменение ее в процессе хранения осуществляли по одному из вариантов метода диффузии в агар (Гриневич, 1981).

Безвредность пробиотической кормовой добавки определяли при даче ее белым мышам в течение 10-ти дней по 2 мл в день.

Возможные сроки хранения при 4 и 20 °С пробиотической кормовой добавки устанавливали по изменению ее антагонистической активности, КОЕ микроорганизмов, их соотношения, активной и титруемой кислотности и санитарным показателям.

При определении влияния пробиотической кормовой добавки на цыплят-бройлеров учитывались клинические показатели (наличие энтеритов, динамика заселения кишечника лактобациллами, бифидобактериями, энтерококками, кишечной палочкой) и зоотехнические показатели (сохранность, привес, затраты корма, период откорма до массы забоя).

Экономический эффект от применения пробиотической кормовой добавки определяли по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» утвержденной департаментом ветеринарии при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия РФ 21 февраля 1997 г.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке по общепринятым методам с применением t-критерия Стьюдента с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 и электронных таблиц Microsoft Excel 2003.

Результаты исследований

Селекция штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами

С марта по июнь 2002 г. при исследовании 40 проб фецес взрослых клинически здоровых кур, было выделено 14 культур лактобацилл и 29 культур энтерококков. Было отмечено, что выделяемость культур выше в мае-июне. Все культуры обладали типичными для лактобацилл и энтерококков культу-рально-морфологическими и биохимическими свойствами. В мазках из культур лактобацилл обнаруживались крупные грамположительные бесспоровые палочки правильной формы, из культур энтерококков - грамположительные кокки, часто неоднородные по размерам и форме (удлиненные или округлые). От каждой культуры было изолировано по пять вариантов (в совокупности лактобацилл - 66, энтерококков - 145).

При исследовании каталазной активности выделенных вариантов большая часть (лактобацилл около 91%, энтерококков около 84%) показала отрицательную реакцию.

Большинство вариантов лактобацилл имели слабую кислотообразующую способность, выраженную и в активности свертывания молока, и в пределе наращивания титруемой кислотности по сравнению с промышленными

штаммами ацидофильной палочки. Так, в среднем около 65% вариантов культур, давших отрицательный тест на каталазу, при внесении одной петли жидкой культуры в 10 мл молока и теромостатировании при 37 °С свертывали его через 28-32 ч; 19% - через 24-28 ч; 16% - 20-24 ч. В контроле же культуры промышленных штаммов ацидофильной палочки свертывали молоко за 16-17 ч.

Предел кислотообразования в молоке ограничивался у самых активных 5 вариантов - 210-237 °Т, у средне активных вариантов (23%) - 182-209 °Т, и малоактивных (69%) - 153-181 °Т. Для сравнения, кислотность культур промышленных штаммов ацидофильной палочки, составляла у неслизистой расы 279-296, слизистой - 251-277 °Т; в культурах из препаратов "Лаком-П" и Таллиферм" соответственно- 173-186 и 181-193.

При исследовании энтерококков по тестам Шермана из 122 каталазоот-рицательных культур все положительные реакции выявляли 87,7% культур. В результате проведения тестов на утилизацию маннита и сорбита из 107 вариантов энтерококков 67 были отнесены к виду Е. faecium (маннит «+», сорбит «-») и 34 - к Е. faecalis (маннит «+», сорбит «+»), шесть культур дали не типичные результаты ни для одного из двух видов (маннит «-», сорбит «-») и в дальнейшем не использовались.

По скорости свертывания молока наиболее активные 13 вариантов (12,9%) культур энтерококков способны свертывать его за 19,0-21,5 ч, 56 вариантов (55,4%) культур средней активности сворачивают за 21,5-24,0 ч и малоактивные 32 варианта (31,7%) культур сворачивают за 24,0-26,5 ч.

При исследовании энтерококков на безвредность in vitro из 69 вариантов d-гемолиз давали 23,9%, Р-гемолиз давали 4,1%, лецитиназной активностью не обладал ни один вариант, фибринолитическая активность наблюдалась у 3,1% вариантов. Для определения патогенности in vivo было отобрано 42 культуры (27 - Е. faecium 19 - Е. faecalis) показавшие отрицательные реакции в тестах in vitro. При заражении мышей per os по истечении 12-ти дней наблюдения случаев гибели животных не наблюдалось, патологических изменений состояния кишечника не выявлено. В содержимом кишечника отмечалось повышенное количество энтерококков.

Исследование и отбор культур по антагонистической активности

По результатам исследований антагонистической активности к тест-культурам (возбудителям кишечных инфекций и условно патогенным) исследованные варианты нами были условно разделены на группы по активности. По методу отсроченного антагонизма малоактивные варианты культур образовывали зоны задержки роста тест-культур 1-7 мм, средней активности - 7 - 12 мм, высокоактивные - более 12 мм (Гриневич, 1981; Банникова, 1975). Из результатов, полученных по методу развивающихся смешанных популяций малоактивные варианты подавляли развитие тест-культур до тысячи раз; средней активности - до десяти тысяч раз; высокоактивные - до ста

и более тысяч раз (Ганина и др., 1999). При сопоставлении данных пр результатам этих методов коэффициент корреляции составил 0,87, что говорит о высокой достоверности полученных результатов. Усредненные данные результатов двух методов представлены на рисунке 1. На основании приведенных результатов нами были отобраны три наиболее активных варианта культур L. acidophilus и восемь вариантов Efaecium. В отношении использованных тест-культур они являются высоко- и среднеактивными антагонистами. Отобранные варианты лактобацилл и энтерококков сопоставимы с культурами из препаратов "Лаком-П" и "Галлиферм" и превосходят по данному свойству промышленные штаммы ацидофильной палочки, которые показали себя малоактивными антагонистами к большинству тест-культур.

Рис 1 Соотношение исследуемых культур по степени антагонизма к тест-культурам в общем количестве вариантов (%) а - L acidophilus, б- Еfaecium, в-Еfaecalis

Исследование свойств штаммов при пассажах in vitro и длительном лабораторном хранении

Исследование стабильности свойств лактобацилл при пассажах показало, что все взятые в опыт культуры не проявляли значительных изменений по кислотообразующим свойствам и отклонение в сторону снижения не превышало 2%. По стабильности антагонистических свойств исследуемые культуры ацидофильной палочки были менее подвержены изменчивости (от -28,4% до +1,3%) чем культуры энтерококков, у которых наблюдался значительный разброс антагонистических свойств со стороны отдельных вариантов (от -100% до +10,7% от начального уровня). При этом у наиболее стабильных вариантов энтерококков Е. faecium 24, 7з, 74, И I83 отклонение составляло от -16,9 до +10,7%, а у варианта L acidophilus Is-от -4,1 % до +1,3%.

У энтерококков выражено изменение свойств кислотообразования как в сторону снижения, так и увеличения. Так, у варианта Е. faecium 232 предел кислотообразования снизился в течение трех пассажей на 23,3 %, а у Е faecium 19, вырос на 14,9%. Наиболее стабильными были варианты Е. faecium 2^, 73, 182 И 233, у которых снижение кислотообразования не превышало 2,4%.

Наиболее стабильными по совокупности свойств кислотообразования и антагонизма из выделенных нами от птицы культур являются L. acidophilus 7j И 142, среди энтерококков - Е.faecium 7з, Тц, И I82.

При хранении в течение 4 месяцев в замороженном состоянии исследуемые культуры своей активности не утрачивали.

Подбор сочетания микроорганизмов для пробиотической кормовой

добавки

В результате исследования 24 возможных парных сочетаний культур лактобацилл и энтерококков было установлено, что в 11-ти из них ацидофильная палочка угнетала развитие энтерококков, в 8-ми сочетаниях не проявлялось какого-либо влияния на развитие друг друга и в 5-ти сочетаниях выявлено в разной степени стимулирующее действие на взаимное развитие. В одном случае было отмечено, что стимулирующим рост друг друга действием обладали культуры, выделенные из одной пробы (L. acidophilus 73 и Е. faecium li И 74) (табл. 1.).

Таблица 1

Сравнительные данные количества и соотношений клеток культур L. acidophilus и Е. faecium в сочетаниях и в монокультурах в свернувшемся молоке

Сочетания Микробиологические показатели в свернувшемся молоке

Соотношение микроорганизмов сочетания Количество микроорганизмов в1 мл* 107 Отклонение от значения титра клеток в монокультуре, раз

в сочетании в монокультуре

L acidophilus 14г Е.faecium 2< »1:2 Ю,1±1,0 3,5±0,3 2,9

18,7±2,4 2,1±0,4 в,9

L acidophilus 14г Е. faecium 74 »2:3 7,5±1,1 6,4±0,5 1,2

11,4±3,4 12,1±2,9 0,9

L acidophilus 7 s E.faeciumTt »1:1 13,6±1,2 2,2±0,5 6.2

18,8±2,6 7,4±1,1 2,5

L, acidophilus 7s E.faecium73 »1:2,5 7,8±0,3 6,7±0,8 1,2

2,9±0,5 1,9±0,3 1,5

L. acidophilus7s E. faecium 182 »2:3 5,2±1,7 5,6±1,3 0,9

7,6±1,9 5,9±1,2 1,3

При определении стабильности соотношений микроорганизмов и при установлении характера влияния совместного выращивания культур в отобранных сочетаниях на суммарную антагонистическую активность жидкой культуры было отмечено два сочетания - L acidophilus 142 с Е. faecium 2^ и L acidophilus 75 с Е. faecium I4 Они проявляли более выраженный синергизм

в антагонистических отношениях к тест-культурам, тогда как в остальных сочетаниях антагонизм был на уровне одной наиболее активной из входящих в него культур. Данные сочетания сохраняют стабильность в течение пяти пересевов. По скорости свертывания молока из ранее отобранных двух сочетаний наиболее активным было L. acidophilus 75 с Е. faecium 74, которое и было выбрано для дальнейшей работы.

Определение технологических параметров и режимов при получении

пробиотической кормовой добавки Исходя из требований к содержанию посторонних микроорганизмов в готовом продукте (не более 103- 104 КОЕ на 1 г (мл) (Степаненко, 2002)., для исследования нами были определены два режима высокотемпературной пастеризации и один режим стерилизации. При определении ОЧМ и БГКП после тепловой обработки допустимым считалось их значение соответственно не более 100 КОЕ/мл и бродильный титр не менее 100 мл. Сравнительные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Оценка эффективности различных видов тепловой обработки молочной сыворотки

Покаэатели Молочная сыворотка до тепловой обработки Молочная сыворотка после тепловой обработки

85-87 "С 10 мин 92-95°С Змин 110°Сбез выдержки

Общее количество микроорганизмов, КОЕ/мл 2,347 x10s 1,2-3,6*103 2,3-4,8 х 102 4,1-7,9 х 10'

Бродильный титр отсутствие в 0,01 мл отсутствие в 10 мл отсутствие в 100 мл отсутствие в 100 мл

Из таблицы 2 следует, что для обеспечения данных требований достаточным является режим высокотемпературной пастеризации (93-95 °С в течении 3 мин), но для обеспечения большей длительности хранения готового продукта во внимание был принят режим стерилизации при 110 °С без выдержки.

При определении температурного режима сквашивания молочной сыворотки было исследовано четыре значения температуры сквашивания (интервал - 2 С0), свойственных для термофильных микроорганизмов и находящихся в близи оптимума их развития. Нас интересовала динамика изменения во времени титруемой и активной кислотности, что позволяло судить о скорости процесса сквашивания, а также конечное количество и соотношение микроорганизмов при различных температурах. Данные результатов изменения кислотности во времени представлены на рисунке 2, из которого следует, что с увеличением температуры время сквашивания молочной сыворотки до заданной кислотности (80 °Т) сокращается, так как скорость нарастания титруемой и снижения активной кислотностей увеличивается. Между тем динамика нарастания кислотности в интервале температур 42-44 °С практически не изменяется и время сквашивания составляет 18,5-19,5 ч. Данные результатов опреде-

ления количества микроорганизмов и их соотношения при исследуемых температурных режимах сквашивания представлены на рисунке 3.

Из рисунка 3 следует, что количество микроорганизмов обоих видов и их соотношение также подвержены изменению. Отмечено, что с увеличением температуры усиливается развитие, как энтерококков, так и ацидофильной палочки. Их соотношение меняется от 1:5 при 38 °С культивирования до 1:12 при 44 °С. Количество энтерококков достигает максимума при 42 °С и незначительно ниже при 44 °С. У ацидофильной палочки, максимум развития также приходится на 42 °С и снижается при температуре культивирования 44 °С.

Рис 2 Характеристика изменения кислотности (а - титруемой, б - активной) в зависимости от температуры сквашивания

При сопоставлении данных рисунков 2 и 3 видно расхождение между оптимумом развития микроорганизмов (40-42 °С) и оптимумом кислотообразования (42-44 °С), что как мы считаем, может объясняться более высоким уровнем ферментативной активности микроорганизмов при культивировании в интервале температур 42-44 °С. Т.о. как наиболее подходящий со стороны длительности процесса, так и со стороны постоянства соотношения пробиотических культур нами был выбран интервал 4042 °С. В этих условиях при внесении 3% закваски достигались наименьшая длительность сквашивания (18-19,5 ч) молочной сыворотки и наибольший титр

Рис 3 Количественное значение микроорганизмов при различных температурах сквашивания молочной сыворотки до заданной кислотности (80°Т)

микроорганизмов в готовом продукте (лактобацилл - 71 ± 19 х 10 КОЕ/мл, энтерококков - 469±73 *106 КОЕ/мл). Для сокращения времени сквашивания нами было увеличено количество вносимой закваски до

7-10%, что позволило сократить длительность процесса до 12,5-14,5 ч. Показатели готового продукта представлены в таблице 3.

Таблица 3

Показатели готового продукта - пробиотической кормовой добавки

Показатель Значение

Кислотность -активная, рН - титруемая,°Т 4,5-4,4 75-80

Количество живых микроорганизмов, КОЕ*10б - L acidophilus - E.faecium 52,1-90,7 396,9-542,1

Содержание посторонних видов микроорганизмов в 1 мл, КОЕ Д010

БГКП (бродильный титр), в 100 мл -

Исследование готового продукта (пробиотической кормовой добавки) и изменений его свойств при хранении

При определении безвредности пробиотической кормовой добавки на белых мышах при ежедневном скармливании в течение 10-ти дней по 2 мл было установлено отсутствие у них каких-либо внешних клинических изменений.

В ходе исследования изменения свойств пробиотической кормовой добавки при хранении в различных температурных условиях (4 и 20 °С) были получены следующие результаты (рис.4)

Рис. 4. Динамика изменения титруемой кислотности и количества микроорганизмов в пробиотической кормовой добавке при хранении при 4 и 20 °С

Клинические исследования и производственные испытания пробиотической кормовой добавки

Заключительным этапом нашей работы было проведение клинических и производственных испытаний полученного продукта на цыплятах-бройлерах. В ходе клинических испытаний установлено, что в группе I получавшей в течение 21 дня по 2 мл в сутки пробиотическую кормовую добавку наблюдалось более быстрое формирование основных групп микрофлоры кишечника цыплят, особенно лактобацилл и энтерококков, популяции которых нарастали быстрее в 2-3 раза чем в контрольной группе и в 1,5-2 раза чем в группе II, получавшей сыворотку сквашенную промышленным штаммом ацидофильной палочки и к седьмым суткам их уровень был выше на порядок (рис.

5)

Рис. 5. Формирование отдельных групп микрофлоры кишечного тракта цыплят-бройлеров

Из данных рисунка 5 следует, что формирование популяции кишечной палочки (общего количества) в опытной группе I цыплят находится примерно

14

на одном уровне с остальными двумя группами. Количество лактозонегатив-ной палочки в опытной группе I в сравнении с контрольной и группой II ниже к двадцатым суткам соответственно на 0,25 и на 0,49 КОЕ/г.

При клинических испытаниях также было установлено, что показатели клинического статуса цыплят выше в группе I, в которой среднесуточный привес составляет 42,1 г, а случаи падежа и энтеритов отсутствуют (табл. 4)

Таблица 4

Сравнительные данные показателей цыплят опытных и контрольной групп

Показатели Группа 1 Группа II Контрольная группа

Среднесуточный привес массы, г 42,1 38,7 со

Падеж, голов 2 3

Сохранность, голов 30 28 27

Наличие энтеритов не отмечено отмечались единичные случаи отмечались

Производственные испытания показали, что дача суточным цыплятам-бройлерам пробиотической кормовой добавки позволяет повысить у них среднесуточный прирост массы тела на 3,51% (Р<0,05), снизить гибель молодняка с 2,61% до 1,47%. При этом затраты корма снизились на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма до массы забоя с 49 сократился до 45 дней.

При сравнении пробиотической кормовой добавки с применяемым пре-паратом-пробиотиком на данной птицефабрике было установлено, что испытуемая добавка по своей эффективности уступает коммерческому препарату лишь незначительно, что выразилось в увеличении периода откорма на один день.

В ходе бактериологического обследования тушек птицы в группе, получавшей пробиотическую кормовую добавку санитарные показатели значительно были выше чем в контрольной группе. Частота выделения золотистого стафилококка из внутренних органов ниже на 6,1-12,9% чем в контроле, а кишечной палочки - на 8,1-57,5% (рис. 6)

Динамика прироста массы тела цыплят контрольной группы, группы получавшей коммерческий препарат и группы получавшей пробиотическую кормовую добавку представлена на рисунке 7.

Экономический эффект от применении пробиотической кормовой добавки составил 6,94 рубль на рубль затрат, а предотвращенный экономический ущерб на один птичник с количеством цыплят 45270 голов составил 24429,1 рубля.

Рис 6 Частота выделения условно-патогенных микроорганизмов во внутренних органах птицы а - золотистого стафилококка, б - кишечная палочка

1 1 1

I

—\ /

V 1"/ /

1/> ■

Лу /

/

I ^ I/

Группа получавшая коммерческим /

препарат «пррооиотик-1» N /Л

V ' т/

V/ А

к

У Т Л

.1' / \ _|„... ........... 1_

/V

А/

/л

Уу

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Время, сутки

Рис 7 Динамика прироста массы тела цыплят по суткам при обычном рационе, при включении пробиотической кормовой добавки, при включении коммерческого препарата "Пробио-тик-1"

выводы

1. Разработана рациональная схема, показавшая высокую эффективность при выделении из содержимого кишечника здоровых птиц энтерококков и лактобацилл, обладающих высокой антагонистической активностью и способностью к культивированию на молочной сыворотке. В результате отобраны три варианта лактобацилл и восемь вариантов энтерококков потенциально пригодных для создания пробиотических препаратов.

2. Установлено, что при длительных пассажах на обезжиренном молоке отобранные штаммы лактобацилл и энтерококков остаются стабильными по свойствам антагонизма и кислотообразования.

3. Показано, что отобранное для получения пробоитической кормовой добавки симбиотическое сочетание двух штаммов - L acidophilus 75 с Е. faecium 74 обладает выраженным синергизмом в свойствах кислотообразова-ния и антагонизма к возбудителям кишечных инфекций.

4. Определены основные технологические параметры получения пробио-тической кормовой добавки, влияющие на качество и санитарные показатели готового продукта (режим тепловой обработки, оптимальная температура сквашивания, количество вносимой закваски). Установлены возможные сроки хранения, составляющие, соответственно, не более 23 суток при 4 °С и не более 12 суток - при 20 °С.

5. Установлено, что применение пробиотической кормовой добавки в первые дни жизни цыплят способствует более быстрому формированию кишечного микробиоценоза, оказывает положительное влияние на клинический статус их организма, при этом гибель молодняка снижается с 2,61% до 1,47%, среднесуточный привес увеличивается на 3,51% (Р<0,05), затраты корма снижаются на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма сокращается с 49 до 45 дней, что в общем выражается в положительном экономическом эффекте, составляющем 6 рублей 94 копейки на рубль затрат связанных с использованием пробиоитческой кормовой добавки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ситников В.В., Каврук Л.С. О возможности использования штамма энтерококка, выделенного из кишечника птицы, в качестве основы пробиотика // Тезисы докладов Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова. Саратов, 2002 - С. 61-62.

2. Ситников В.В. Перспективы использования молочной сыворотки, сквашенной пробиотическими культурами в прицеводстве // Материалы межрегиона-льной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа, (серция переработки сельскохозяйственной продукции) - Саратов, 2003, С. 33-35.

3. Ситников В.В., Щербаков А.А., Матвиевский В.Я. Антагонистическая активность нового штамма энтерококка // Тезисы международного симпозиума «Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания». - Кемерово, 2002,

С. 79-80.

4. Ситников В.В. Исследование формирования микрофлоры кишечника цыплят бройлеров при даче пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки // Материалы межрегиона-льной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа, (секция ветеринарной медицины и биотехнологии). - Саратов, 2003, С. 15-20.

5. Ситников В.В. Пробиотическая кормовая добавка на основе молочной сыворотки и ее применение в птицеводстве // Ветеринария Поволжья № 3 (6) 2003.-С. 16-18.

Считаем необходимым, выразить глубокую благодарность ветеринарному врачу «Михайловской Птицефабрики» В.М. Спиридонову за консультации и большую помощь в проведение экспериментов с цыплятами.

Подписано в печать 20.10.04. Формат 60х84 Vi 6. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 1015/975.

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» 410600, Саратов, Театральная пл., 1.

4212 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ситников, Владимир Владимирович

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Значение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта в иммунном статусе теплокровных.

1.2. Механизмы действия пробиотических культур микроорганизмов (пробиотиков) в коррекции иммунного статуса организма хозяина.

1.3. Использование молочной сыворотки и микробных препаратов на основе вторичного молочного сырья в кормлении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Отбор проб.

2.2.2. Обогащение проб, выделение чистых культур и их первичная идентификация.

2.2.3. Методы определения патогенности энтерококков.

2.2.4. Методы определения антагонистической активности лактобацилл и энтерококков.

2.2.5. Методы исследования культуральных физиологических и биохимических свойств лактобацилл и энтерококков.

2.2.6. Исследование свойств штаммов при пассажах in vitro и лабораторном хранении.

2.2.7. Методы исследования и условия подбора культур микроорганизмов для закваски и разработки технологии ф, пробиотической кормовой добавки.

2.2.8. Исследование готовой кормовой добавки.

2.2.9. Клинические исследования и производственные испытания пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятахбройлерах ф 2.2.10. Расчет экономического эффекта от применения пробиотической кормовой добавки.

2.2.11. Статистические методы обработки результатов экспериментов.

2.3. Результаты исследований и их обсуждение.

2.3.1. Схемы проведения исследований по выделению, отбору и изучению штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами.

2.3.2. Селекция штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами.

2.3.3. Исследование энтерококков на патогенность.

2.3.4. Исследование и отбор культур по антагонистической активности.

2.3.5. Изучение основных кулыуральных, физиологических и биохимических свойств культур лактобацилл и энтерококков

2.3.6. Исследование свойств штаммов при пассажах и хранении

2.3.7. Схема проведения исследований по разработке технологии пробиотической кормовой добавки.

2.3.8. Подбор сочетания микроорганизмов для пробиотической кормовой добавки.

2.3.9. Определение технологических параметров и режимов при получении пробиотической кормовой добавки.

2.3.10. Исследование готового продукта (пробиотической ф кормовой добавки) и изменений его свойств при хранении.

2.3.11. Клинические исследования и производственные испытания пробиотической кормовой добавки.

2.3.12. Экономическая эффективность от применения пробиотической кормовой добавки.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки и ее применение при выращивании цыплят-бройлеров"

Актуальность работы

В промышленном птицеводстве, в последнее время, ведущую роль в гибели молодняка стали занимать желудочно-кишечные заболевания бактериального происхождения (Гусев и др., 2003). Попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химических препаратов, в том числе нового поколения, не только не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. Мировой опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью, а штаммы многих возбудителей кишечных инфекций, циркулирующие в хозяйствах, приобрели множественную лекарственную резистентность к антибиотикам (Тараканов, 2000; Малик, Панин, 2001; ЗсИоеш а1 2002). В свою очередь это влечет к возможности длительного их персистирования в организме птицы и создает предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку (Клименко, 2002; Булатов, 2003).

Таким образом, проблема профилактики и лечения кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение (Хапугин и др., 1999).

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило во всем мире пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно патогенная микрофлора и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты сельскохозяйственных животных и птицы (Лизько, 1999).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические кормовые добавки и препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного микробиоценоза животных и птицы, такие как лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки (Малик, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998).

Актуальная потребность в пробиотических кормовых добавках и препаратах привела к тому, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птицы стали использовать медицинские препараты, содержащие в своей основе штаммы микроорганизмов-пробионтов, выделенных от человека, и показавшие недостаточную эффективность вследствие отсутствия у них видоспецифичности (Павлова, Киржаев, Лапинскайте, 2002).

Ввиду этого представляется целесообразным разработка пробиотических кормовых добавок и препаратов, в том числе и на основе молочного сырья с использованием культур, выделенных от сельскохозяйственных животных и птицы для использования в ветеринарии.

Проблема рационального использования молочного сырья неразрывно связана с эффективной переработкой молочной сыворотки. Данный вопрос рассматривался в Международной молочной федерации (ММФ) и, неоднократно, на международных молочных конгрессах. Молочная сыворотка обладает пищевой и биологической ценностью, является богатой питательной средой для роста микроорганизмов. В то же время промышленной переработке подвергается только около 20% всего объема. Одной из причин такого нерационального использования служит недостаток эффективных технологий ее переработки (Ковтунова, Бушуева, Пинаева, 1985; Храмцов, 1990; Шиллер, 1983; Шильнаиков, Минакова, 1986; Мацерушка, 1998).

Цель работы - создание пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием микроорганизмов с выраженными пробиотическими свойствами из желудочно-кишечного тракта кур для применения в промышленном птицеводстве и разработка экспериментальной технологии ее получения.

Задачи исследования:

1. Выделить от здоровой птицы активные культуры микроорганизмов-пробионтов родов Enterococcus и Lactobacillus, способных активно развиваться на молочной сыворотке.

2. Разработать технологию получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур микроорганизмов.

3. Определить эффективность от применения пробиотической добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Научная новизна

• По разработанным нами схемам впервые выделены штаммы микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus от сельскохозяйственной птицы, способные активно размножаться при культивировании на молочной сыворотке и обладающие пробиотическими свойствами.

• Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур

• Определена эффективность от применения пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Практическая значимость

Выделены перспективные для разработки пробиотических препаратов и кормовых добавок штаммы культур микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus.

Как один из способов рационального использования вторичного молочного сырья разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) для применения на птицеводческих предприятиях.

Предлагаемая к применению пробиотическая кормовая добавка позволяет снизить гибель цыплят в первые дни жизни и, кроме того, обогатить рацион питания по углеводному компоненту, минеральным солям, биологически активным веществам, микроэлементам и др.

Пробиотическая кормовая добавка использована в работе ОАО «Птицефабрика Михайловская»: акт о проведении клинических испытаний экспериментальной пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 14 сентября 2003 г; акт о внедрении в промышленное птицеводство пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 21 сентября 2003 г.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Выделенные от кур штаммы микроорганизмов обладают пробиотическими свойствами и необходимыми ростовыми качествами.

2. Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных штаммов микроорганизмов.

3. Исследован процесс формирования отдельных групп нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров при применении разработанного продукта.

4. Применение пробиотической кормовой добавки при выращивании суточных цыплят-бройлеров в промышленных условиях показало профилактический и положительный экономический эффект.

Работа выполнена на кафедрах микробиологии и ветсанэкспертизы, и технологии молока и молочных продуктов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова в рамках темы основного направления работы кафедры технологии молока и молочных продуктов - «Комплексная переработка вторичного молочного сырья».

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Саратов, 2003), на Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (2002), на Международном симпозиуме Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания (Кемерово, 2002), на конференции в РосНИПЧИ «Микроб» Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте Микроб (Саратов, 2004).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2002-2003 г.г.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 5 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков, 23 таблиц. Список использованных литературных источников включает 118 наименований, в том числе 31 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ситников, Владимир Владимирович

-126-выводы

1. Разработана рациональная схема, показавшая высокую эффективность при выделении из содержимого кишечника здоровых птиц энтерококков и лактобацилл, обладающих высокой антагонистической активностью и способностью к культивированию на молочной сыворотке. В результате отобраны три варианта лактобацилл и восемь вариантов энтерококков потенциально пригодных для создания пробиотических препаратов.

2. Установлено, что при длительных пассажах на обезжиренном молоке отобранные штаммы лактобацилл и энтерококков остаются стабильными по свойствам антагонизма и кислотообразования.

3. Показано, что отобранное для получения пробоитической кормовой добавки симбиотическое сочетание двух штаммов - L. acidophilus 75 с Е. faecium 74 обладает выраженным синергизмом в свойствах кислотообразования и антагонизма к возбудителям кишечных инфекций.

4. Определены основные технологические параметры получения пробиотической кормовой добавки, влияющие на качество и санитарные показатели готового продукта (режим тепловой обработки, оптимальная температура сквашивания, количество вносимой закваски). Установлены возможные сроки хранения, составляющие, соответственно, не более 23 суток при 4 °С и не более 12 суток - при 20 °С.

5. Установлено, что применение пробиотической кормовой добавки в первые дни жизни цыплят способствует более быстрому формированию кишечного микробиоценоза, оказывает положительное влияние на клинический статус их организма, при этом гибель молодняка снижается с 2,61% до 1,47%, среднесуточный привес увеличивается на 3,51% (Р<0,05), затраты корма снижаются на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма сокращается с 49 до 45 дней, что в общем выражается в положительном экономическом эффекте, составляющем 6 рублей 94 копейки на рубль затрат связанных с использованием пробиоитческой кормовой добавки.

-118-ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Профилактика желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы, а особенно ее молодняка (в частности цыплят) в настоящее время является неотъемлемым мероприятием в организации любого рентабельного птицеводческого хозяйства (Гусев и др., 2003; Хапугин и др., 1999). В этих целях традиционное применение антибиотиков и химических препаратов ведет к появлению и накоплению лекарственно устойчивых штаммов возбудителей кишечных инфекций. Помимо риска заражения такими штаммами, через продукцию птицеводства возможно попадание и антибиотиков в организм человека, что при современных требованиях к экологической безопасности пищевых продуктов не допускается.

В данных условиях для профилактики кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы целесообразно применять пробиотические препараты и кормовые добавки, содержащие в своем составе микроорганизмы (и/или их метаболиты) из числа основных представителей нормальной микрофлоры данного вида птицы (Лизько, 1999; Малик, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998). Наиболее перспективными в этом плане являются жидкие препараты и кормовые добавки содержащие микроорганизмы в физиологически активном состоянии, созданные на основе вторичного молочного сырья (молочной сыворотки или обезжиренного молока) (Залашко М.В., Залашко JI.C 1976; Выдрицкая, Ромашко 1999; Шиловская, Бастрыкина 1982).

Нами осуществлена разработка экспериментальной технологии получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) с использованием культур микроорганизмов из числа представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы / родов Enterococcus и Lactobacillus для применения в промышленном птицеводстве.

С этой целью по предложенным нами схемам было исследовано 40 проб фецес, из которых было выделено 14 культур лактобацилл и 29 культур энтерококков. Было отмечено, что частота выделения имела тенденцию к росту в сторону мая-июня, что как мы считаем, связано с обогащением рациона дополнительными питательными веществами при вольном содержании кур. От каждой культуры были изолированы варианты, среди которых 66 -лактобацилл и 145 - энтерококков.

При изучении отобранных вариантов лактобацилл особое внимание уделялось продолжительности свертывания молока, так как это косвенно указывает на уровень активности кислотообразования. По данным ряда авторов отмечено, что антагонистические свойства ацидофильной палочки в большинстве случаев активнее проявляются у ее культур со средним и высоким уровнем кислотообразования (более 170 °Т) (Гриневич 1981; Жубанова и др. 2002; Банникова 1975). Было установлено, что среди отобранных нами вариантов у наиболее активных (8%) предел кислотообразования в молоке составлял 210-237 °Т, скорость свертывания молока - 20-24 ч. Промышленные штаммы ацидофильной палочки (контроль) свертывали молоко быстрее (1617 ч), а предел кислотообразования составлял 251-296 °Т. что, как мы считаем, можно объяснить их направленной селекцией и лучшей адаптированностью к росту в молоке. При сравнении же со штаммами, изолированными из препаратов «Лаком-П» и «Галлиферм», по уровню предельной кислотности и скорости свертывания молока (соответственно 177-193 °Т и 22-26 ч) исследуемые варианты ацидофильной палочки незначительно превосходили их.

Другими, определяющими отбор, свойствами как у энтерококков так и у лактобацилл являлись устойчивость к желчи и щелочной реакции среды, а для лактобацилл еще и устойчивость к фенолу (которые являются и дифференциальными внутривидовыми признаками). Они косвенно указывают / на потенциальную возможность данных культур приживаться в кишечнике теплокровных и развиваться в нем, и являются одними из необходимых свойств, которыми должны обладать пробиотические штаммы микроорганизмов (Банникова, 1975; Малик, Панин, 2001).

Исследование вариантов культур энтерококков на отсутствие патогенности в тестах in vitro, показало что, лишь незначительная их часть обладает факторами патогенности (р-гемолиз выявлен у 4,1% культур, а-гемолиз - у 23,9%, фибринолитическая активность выражена у 3,1% ). При этом выявленный a-гемолиз у энтерококков хотя и не является точным показателем патогенности (Биргер, 1982; Базаров, 1978), тем не менее такие варианты нами в дальнейшем не использовались. В тестах in vivo исследовались культуры энтерококков, показавшие отрицательные реакции в опытах in vitro. В ходе наблюдения падежа зараженных мышей не наблюдалось, а при их вскрытии каких-либо патологических изменений внутренних органов не выявлено.

При отборе по антагонистическим свойствам в отношении к тест-культурам возбудителей кишечных инфекций со стороны изучаемых вариантов культур было выявлено, что среди энтерококков вида E.faecium выраженные антагонисты встречаются — 3,6% случаев против 0,7% у Е. faecalis (в отношении только отдельных тест-культур), среди вариантов L. acidophilus таковых 4,5%. Повторное исследование антагонизма наиболее активных культур, проводимое параллельно по двум методам в основном подтвердило предварительные результаты. При этом сходимость результатов двух методов составила 89%, что говорит о их высокой достоверности. Таким образом на основе полученных данных нами были отобраны три варианта культур ацидофильной палочки (L. acidophilus 62, 75, и 142) и восемь вариантов культур энтерококков (E.faecium 24, 75, 74, 13ь 182,19ь 232 и 233).

При определении свойств сбраживания различных углеводов изучаемыми культурами лактобацилл и энтерококков полученные результаты совпадали с данными и определителя Берджи и других авторов (Сорокин и др., 1973; Гриневич, 1981; Банникова и др., 1987; Базаров, 1979, Банникова, 1975).

Для более детального изучения и идентификации отбираемых вариантов лактобацилл и энтерококков нами проводилось определение морфологических, культуральных и физиологических свойств.

С целью создания пробиотической кормовой добавки было необходимо отобрать культуры со стабильными свойствами кислотообразования и антагонизма, а также провести скрининг симбиотических сочетаний.

Было установлено, что по кислотообразующим свойствам культуры ацидофильной палочки в совокупности являются более стабильными (отклонение в пределах от -2,0% до +4,9%) чем энтерококки, которые сильнее подвержены изменчивости (от +14,9% до -23,3% от начального уровня). В литературе встречаются сведения о том что культуры гомоферментативных термофильных молочнокислых палочек, в частности L. acidophilus и L. bulgaricus более стабильны в свойстве кислотообразования чем гомоферментативные термофильные молочнокислые стрептококки, с которыми у энтерококков большая степень сродства (Степаненко, 2002; Ганина, 1999; Charteris et al., 1997). Наиболее стабильными вариантами оказались варианты E.faecium 24, 7з, I82 и 233.

Антагонистическая активность при пересевах лактобацилл и энтерококков оказалась более вариабельной чем их свойства кислотообразования. Исследуемые культуры ацидофильной палочки были менее подвержены изменчивости (от -28,4% до +1,3%) чем культуры энтерококков, у которых наблюдался значительный разброс антагонистических свойств со стороны отдельных вариантов (от -100% до +10,7% от начального уровня). При этом у наиболее стабильных вариантов энтерококков Е. faecium 24, 7з, 7д, и I83 отклонение составляло от -16,9 до +10,7%, а у стабильного варианта L. acidophilus 75 - от -4,1% до +1,3%.

Следующим этапом нашей работы был подбор симбиотического сочетания культур двух видов (лактобацилл и энтерококков), в котором достигалось бы усиление их развития не в ущерб друг другу, или усиление физиологических функций одного или обоих видов. При этом нас больше интересовали следующие возможные варианты: усиление развития от совместного культивирования; усиление молокосвертывающей способности и/или антагонистической активности. В литературе имеется достаточно много сведений о подобных эффектах при совместном культивировании молочнокислых палочек и стрептококков. Кроме того в молочной промышленности на принципе симбиотического сочетания основан и подбор культур для заквасок кисломолочных продуктов и сыров (Гриневич, 1981; Банникова, 1975; Банникова и др., 1987; Шаманова, 1998).

В ходе наших исследований из пяти было выявлено два сочетания L. acidophilus 14г с Е .faecium 24, и L. acidophilus 75 с Е .faecium 14, культуры которых усиливали взаимное развитии друг друга, увеличивая титр клеток от 2,5 до 8,9 раз. Кроме того, дынные совместные жидкие культуры показали и увеличение уровня антагонизма по сравнению с их раздельным культивированием, что выразилось в увеличении зон задержки роста тест-культур. На основании этих данных можно сказать, что симбиотические отношения в упомянутых сочетаний носят двойственный характер, проявляющийся в мутуализме и синергизме входящих в них культур. Данные сочетания показали хорошую стойкость соотношения культур при пересевах. Однако при сравнении продолжительности свертывания молока упомянутые два сочетания были не самыми активными. В частности, сочетание L. acidophilus \4г с Е .faecium 24 свертывало молоко в течение 4,67 ч, в то время как самое активное сочетание (L. acidophilus 75 с Е .faecium 7з) - за 4,34 ч. По совокупности свойств для дальнейшей работы нами было отобрано сочетание L. acidophilus 75 с Е faecium 74. Необходимо отметить, что варианты культур данного сочетания изолированы из одной пробы и вполне вероятно, что данный симбиоз является закономерным, но в силу малого числа выборки выявленных симбиозов мы этого утверждать не можем. В литературе имеются данные о том, что от одного организма хозяина гораздо чаще выделяются симбиотические сочетания микроорганизмов, чем от разных (Глушанова, Блинов, 2002).

После выбора симбиотического сочетания для создания пробиотической кормовой добавки в нашу задачу входили выбор температуроно-временного режима тепловой обработки питательной среды (молочной сыворотки), а также оптимальной температуры ее сквашивания до конечной кислотности за наименьшее время. Определяющим фактором при выборе вида и режима тепловой обработки были требования по содержанию посторонней микрофлоры в молочной сыворотке, предъявляемыми к производству пробиотиков (Степаненко 2002), в соответствии с которыми в готовом продукте не должно содержаться в 1 г (мл): посторонней микрофлоры более 103-104 КОЕ, а присутствие БГКП не допускается вовсе. Нами было установлено, что для обеспечения данных требований достаточным является режим стерилизации при 110 °С без выдержки.

В ходе определения оптимальной температуры сквашивания молочной сыворотки из четырех температур близких к физиологическому оптимуму микроорганизмов закваски как наиболее подходящий со стороны длительности процесса, так и со стороны постоянства соотношения пробиотических культур нами был выбран интервал 40-42 °С. В этих условиях при внесении 3% закваски достигались наименьшая длительность сквашивания (18-19,5 ч) молочной сыворотки и наибольший титр микроорганизмов в готовом продукте (лактобацилл - 71±19><10б КОЕ/мл, энтерококков - 469±73*106 КОЕ/мл). Поскольку молочная сыворотка является для микроорганизмов менее питательной средой чем обезжиренное молоко, то для сокращения времени сквашивания нами было увеличено количество вносимой закваски до 7-10%, что позволило сократить длительность процесса до 12,5-14,5 ч.

При определении безвредности полученного продукта на белых мышах нами не было выявлено у них каких-либо внешних клинических изменений.

В ходе установления сроков хранения готового продукта определяющими / факторами были снижение титра микроорганизмов-пробионтов (7,5 КОЕ/мл), уровень титруемой кислотности (свыше 140 °Т). Было установлено, что при температуре 4 °С хранение возможно в течение 22-24 суток, при 20 °С — не более 12 суток.

Заключительным этапом нашей работы было проведение клинических и производственных испытаний пробиотической кормовой добавки на цыплятах-бройлерах. В ходе клинических испытаний при ее выпаивании в течение 21 суток в дозе 2 мл/голову установлен положительный эффект от ее применения, что выразилось в более быстром формировании основных групп микрофлоры кишечника цыплят, особенно лактобацилл и энтерококков, популяции которых нарастали в 2-3 раза быстрее чем в контрольной группе и к седьмым суткам их уровень был выше на порядок. Среднесуточный привес массы тела цыплят составлял 42,1 г, что больше на 4,9 г чем в контрольной группе и больше на 3,4 г чем в группе получавшей молочную сыворотку сквашенную промышленным штаммом ацидофильной палочки. При этом случаев энтерита в опытной группе не отмечалось.

Производственные испытания показали, что дача суточным цыплятам-бройлерам пробиотической кормовой добавки ежесуточно в течение 10 дней в дозе 1 мл на 10 голов позволяет повысить у них среднесуточный прирост массы тела на 3,51% (Р<0,05), снизить гибель молодняка с 2,61% до 1,47%. При этом затраты корма снизились на 0,53 к.е. на 1 кг живой массы, а период откорма до массы забоя с 49 сократился до 45 дней.

При бактериологическом обследовании тушек птицы в группе, получавшей пробиотическую кормовую добавку санитарные показатели значительно выше чем в контрольной группе. Так частота выделения золотистого стафилококка из внутренних органов ниже на 6,1-12,9% чем в контроле, а кишечной палочки -на 8,1-57,5%.

Таким образом, на основании проведенных клинических и производственных испытаний можно сделать вывод о том, что выпаивание / пробиотической кормовой добавки цыплятам-бройлерам с первых суток жизни способствует более быстрому формированию кишечного микробиоценооза, увеличению показателей роста, экономии корма и улучшению санитарных показателей качества птицы.

Экономический эффект от применении пробиотической кормовой добавки составил 6,94 рубль на рубль затрат, а предотвращенный экономический ущерб на один птичник с количеством цыплят 45270 голов составил 24429,1 рубля.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ситников, Владимир Владимирович, Саратов

1. Базаров Х.К. Свойства, идентификация, видовая дифференциация и таксономия Streptococcus faecalis и Streptococcus faecium выделенных от животных и из других источников: Автореф. дис. канд. вет. наук. -Самарканд, 1978. 17 с.

2. Бакулина Л.Ф. и соавт. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизомов рода Bacillus их использование в ветеринарии // Биотехнология. 2001. - №2. - С. 48-56.

3. Банникова JI.A. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности. М.: Пищевая промышленность, 1975. - 255 с.

4. Банникова JI.A., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства: Справочник. М.: Агропромиздат. - 1987. - 400 с.

5. Баталова Т.А., Лазарева Д.Н., Голубева Л.М. Коррекция нормофлоры кишечника человека. Материалы науч.-практич. конф. - Уфа, 1993. - С. 14-17.

6. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы. М., 1979. - 87 с.

7. Бондаренко В.М. с соавторами. Дисбиоз: современные возможности профилактики и лечения. М., 1995.

8. Булатов A.C. Изыскание штамма микроба-антагониста в отношении сальмонелл // Ветеринария. 2003. - №5. - С.26-29.

9. Воробьев Л.И. Пропионовые бактерии и образование витамина В12. М., 1976.-89 с.

10. Ю.Выдрицкая И.Н, Ромашко А.Н. Нетрадиционные корма решение проблемы // Птицеводство. - 1999. - № 1. - С. 15-17.

11. З.Грачева Н.М., Чахава О.В., Поспелова В.В. Теоретит. и практит. проблемы гнотобиологии. -М.: Агропромиздат, 1986. 116 с.

12. Гриневич А.Г. Молочнокислые бактерии: Селекция промышленных штаммов. Минск: Высшая школа, 1981. - 164 с.

13. Гусев B.C., Светоч Э.К., Глазков Н.И. Мониторинг возбудителей бактериальных инфекций // Птицеводство. 2003. - №2.- С.8-10.

14. Дорофейчук В.Г. Проблемы клинической микробиологии в инфекционной клинике. М., 1983. - 275 с.

15. Дубинская А.П., Мещерякова В.Д., Орлянская И.Н. Биологическая ценность белковых сывороточных концентратов // Молочная промышленность. 1980. -№11.- С.65-67.

16. Зайцева Л.Г. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1986. - №6. -С.29-32.22.3ахаренко С.М. Микроэкология человека непознанная реальность. URL:http://www.iacmac.ru/cmac/20013 2001 март.

17. Интизаров М.М. Введение в гнотобиологию. М., 1991. 12 с.

18. Каблучеева Т.И. Применение микробных препаратов в птицеводстве: Сб. науч. тр. «Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии». -Уфа, 2000. - С. 158-161.

19. Карпуть И.М., Бабина М.П. Формирование иммунного статуса цыплят-бройлеров // Ветеринария. 1996. - №6. - С.28-30.

20. Квасникова Е.И. Антагонизм микробов и пути его практического использования. Ташкент, - 1948. - 79 с.

21. Клименко В.В Применение пробиотиков в ветеринарии // Биотехнология, экология, медицина. Материалы Ш-1У Международных научных семинаров 2001-2002гг. Москва-Киров: ЭКСПРЕСС. 2002, -С. 32 -34

22. Коваленко Я.Р., Сидоров М.А. Влияние факторов внешней среды на резистентность организма и иммуногенез. Труды РАСХН (ВИЭВ). М.: Колос,- 1973.-С. 22—41.

23. Ковтунова Л.Е., Бушуева А.Н., Пинаева А.Н. Основные направления переработки сыворотки в СССР и за рубежом: Обзорная информация. М.: ЦНИИТЭИмясотолпром, - 1985. - 39 с.

24. О.Коровин Р.Н. Справочник ветеринарного врача птицеводческого предприятия (ВНИВИП). С.-Пб. - 1995. - Т. 2. - С. 92-94.31 .Костенко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. М., 2002. -413 с.

25. Костенко Т.С. и соавт. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М.: Колос, - 2001. - 341 с.

26. Куваева И.Б. Обмен веществ организма и кишечная микрофлора. — М., -1976.- 118 с.

27. Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическаядиагностика (справочное пособие) под общ. ред. М.Х. Турьянова в 3-х частях. М.: Каппа, 1995. - ч.2. - 144 с.

28. Лизько H.H. Антибиотики и медицинская биотехнология. — 1987. — №3. -С.16-19.

29. Лизько H.H. Аспекты использования пробиотиков для повышения эффективности животноводства и получения экологически безопасной продукции. URL: http://space.copris. ru/Journals/200lll.htm октябрь 2001.

30. Леонович B.B. Труды ВНИИ биопрепаратов. М., - 1973. - С.50-52.

31. Лозовой В.П., Шергин С.М. Структурно-функциональная организация иммунной системы. Новосибирск, 1981. - 226 с.

32. Малик Н.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты // Ветеринария. 2001. - №1. - С.46-51.

33. Малик Н.И., Панин А.Н., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты.

34. URL:http://uralbiovet.url.ru/Journals/2002/200202.htm февраль 2002.

35. Мальцева H.H. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1992. -Т.37. -№12. -С.61-65.

36. Мартыненко A.B. Роль лактозы в кормлении птицы // Птицеводство. 2002, -№6. С. 32.

37. Мацерушка А.К. Ценный продукт из молочной сыворотки с цеолитом // Птицеводство. 1998. - №3. - С. 16-17.

38. Микельсаар М.Э. // Антибиотики и колонизационная резистентность. М., 1990. - Вып. XIX. - С.26-35.

39. Мишурнова Н.В., Киржаев Ф.С. Современное представление о роли нормальной микрофлоры пищеварительного тракта // Ветеринария. 1993, - №6. - С. 30-33.

40. Моршанин В.П. Применение АБК в ветеринарии // Ветеринария. №4. -1958. -С.66-67.47.0вечкин A.M. Сравнительная оценка лечебных свойств ацидофильных микробов при заболевании утят // Птицеводство. 1953. №7. - С.72-78.

41. Определитель бактерий Берджи, Т.2. М.: Мир, 1997. - 799 с.

42. Павлова H.B. Адгезивные и колонизационные свойства основных доминирующих видов пристеночной (нормальной) микрофлоры кишечника птиц в возрастной динамике.

43. URL:http://uralbiovet.url.ru/Journals/2001/2001 11.htm. декабрь 2001.

44. Павлова Н.В., Киржаев Ф.С Лапинскайте., Р.П. Значение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта птиц для их организма. URL: http://uralbiovet.url.ru/Journals/2002/200201textl.htm январь 2002.

45. Панин А.Н. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят // Ветеринария. 1996. - №3. - С.32-33.

46. Панин А.Н., Маннапова Р.Т. Колонизационная резистентность кишечника при ассоциированном сальмонеллезно-аскаридозном заболевании поросят // Сб. стат. -Уфа. 1999. - С. 13-15.

47. Пергат Ф.Ф. Препарат АБК эффективное сохранение молодняка с.-х. животных и птицы. // Сельское хозяйство Узбекистана. - 1959. - №9. -С.74-76.

48. Перетц Л.Г. Значение нормальной микрофлоры для организма человека. М.: Медгиз, 1955. - 117 с.

49. Пинегин Б.В., Мальцев В.П., Коршунов В.М. Дисбактериоз кишечника. М., 1984.- 168 с.

50. Платонов A.B. Производство препаратов для животноводства на основе микроорганизмов симбионтов желудочно-кишечного тракта. - М.: ВНИИСЭНТИ, - 1975. - 86 с.

51. Сергеева Т.Я. Ацидофильно-бульонная культура (АБК). М.: Агропромиздат, - 1956. - 322 с.5 9. Сизова A.B. Значение микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных и использование бактерий-симбионтов в животноводстве / М.: ВНИИТЭИСХ, 1974. - 92 с.

52. Смирнов В.В. Антибиотики и/или пробиотики: размышления и факты. URL:http://www.nedug.ru/lib/lit/farm.htm октябрь 2002.

53. Соколов В., Андреева Н. Молочная кислота как кормовая добавка // Птицеводство, 1995. - №4. - С.17-18.

54. Соколова Г.С. Применение в птицеводстве специфических ацидофильных культур. Труды Великолужского с.-х. института, - 1965. - вып. 5. -С.142-146.

55. Сорокин В.В., Тимошко М.А., Николаева A.B. Нормальная микрофлора кишечника животных. Кишинев. - 1973. - 98 с.

56. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, - 1982. - 463 с.

57. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов. М.: Лира,-2002.-415 с.

58. Тамм А.О. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - №3. -С.24-27.

59. Тарабрина Н.П. ЖМЭИ., 1980. №2. - С.62-65.

60. Тараканов Б.В., Соловьев А.П. «Новый пробиотик» // Птицеводство. -1999. №6. - С.32-33.

61. Тараканов Б.В. Механизмы действия пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм животных. // Ветеринария. 2000. -№ 1.- С.47-54

62. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка с.-х. животных. Кишинев. - Штиница, - 1990. - 108 с.

63. Хапугин В.Г., Клименко В.В., Бояринцев JI.E. и др. Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека. Тез. Всеросс. конф. - М. 1999. -С.38-39.

64. Хмель К.А., Манохина И.М., Басюк Е.И., Метлицкая А.З. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия. // Генетика. т. 29, №5 С.768-775.

65. Храмцов А.Г. Молочная сыворотка. М.: Агропромиздат, - 1990. - 239 с. 74.Чахава О.В. Гнотобиология. - М.: Медицина, - 1972. - 199 с. 75.Чахава О.В. и др. Микробиологические и иммунологические основыгнотобиологии. М., - 1982. - 116 с.

66. Шаманова Г.П. Микробиологические и технологические подходы к производству ферментированных продуктов // Молочная промышленность.- 1998-№3-С. 18-20.

67. Шендеров Б.А. Антибиотики и медицинская биотехнология. 1987. - №3.- С.26-29.

68. Шендеров Б.А. Классификация современных пробиотиков. URL:http://newprobiotics/052002text.html май 2002.

69. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. М., - 1998. - 94 с.

70. Шендеров Б.А. Перспективы исследований в области микробной экологии человека и животных // Сб. Медицинские аспекты микробной экологии. -М., 1992. - Вып. 6. - С.6-9.

71. Шилер Г.Г. О выборе перспективных путей переработки молочной сыворотки // Сб. науч. трудов «Достижения в области технологии и техники переработки молочной сыворотки». Углич: ВНИИМС, - 1983 -С.3-9.

72. Шиловская Т.Е., Бастрыкина H.A. Производство обогащенной молочной сыворотки и ее использование в кормах для сельскохозяйственных животных // Обзорная информация «Цельномолочная промышленность». -М.: ЦНИИТЭИмясомолпром, 1982. - 16 с.

73. Шильнаиков Ю.С., Минакова Г.С. Основные направления комплексного использования сырьевых ресурсов // Молочная промышленность. 1986. -№6.-С.6-9.

74. Шурыгина Л., Злищева Э., Петялис К. Лактовит в рационе фазанят // Прицеводство. 2001. - №4. - С. 15-16.

75. Шубин А.А., Шубина Л.А., Поташов А.Н., Гизатуллин И.С. Бактериальные препараты при профилактике желудочно-кишечных болезней телят // Ветеринария. 1994. - №3. - С.42-45.

76. Ament М.Е., Shimoda S.S., Saunders D.R. Pathogenesis of steatorrhea in three cases of small intestinal stasis syndrome // Gastroenterology. 1972. T.63, -C.728-747.

77. Axselsson L.T., Chung T.C., Dobrogosz W.J. Porductin of a broad spectrum antimicrobial substance by Lactobacillus reuteri II Microbi. Ecolog. Health Dis.- 1989. V.2. -P.131-136.

78. Barrow P.A., Brooker B.E., Fuller R., Newport M.J. The attachment of bacteria to the gastric epithelium of the pig and it's importance in the microecology of the intestine // J. Appl. Bacteriol. 1980. - V.8. - P.147.

79. Bengmark S. Colonic food: pre- and probiotics // Am J Gastroenterol, 2000. -V.95. -P.5-7.

80. Bloksma N., Ettekoven H.,Hothous F. M. Performance of broiler chickens supplemented with Bacillus coagulans as probiotic // Med. Microbiol. Immunol. 1981.-V.11.-P.170.

81. Bogdanov I.G., Pokhirstov P., Marinov L. // Abst. VII Intern. Cancer Congress.- 1962. -P.74-78.

82. Bogdanov I.G., Dalev P.G., Gurevich A.I. et al. Antitumoral activity L. bulgaricus IIFEBS Lett. 1975. V.57. - P.68-73.

83. Clarke R.J.T. Microbial ecology of the gut / Eds. R.J.T. Clarke, T. Bauchop. London, 1977.-P.129.

84. Fuller R. 1984 Microbial activity in the alimentary tract of birds // The Proceedings of the Nutrition Society. 1984. - V.43. - P.55-60.

85. Fuller R. Probiotics in man and animals. A review // J.Appl. Bacterid. 1989. -V.66. — N 5. - P. 365-378.

86. Fuller R. Gibson G.R. Probiotics and prebiotics: microflora management for improved gut health // Clin Microbiol Infect. 1998. - V.4. - P.477-480.

87. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic micro-biota: introducing the concept of prebiotics. J Nutr 1995. - №125. - P. 1401— 1413.

88. Gilliland S.E., Nelson C.R., Maxwell C. Role of normal microflora in regulation of cholesterol in an organism of the owner // Appl. Envirion. Microbiol. 1985. -V.49.-P. 118-126.

89. Gilliland S.E. Influence отельных kinds of microflora of intestines on a level of cholesterol in blood of laboratory animals // FEMS Microbiol. Rev. 1990. -V.87. -P.61-65.

90. Goodling A.C. Production performance of White Leghorn layers fed Lactobacillus fermentation products // Poultry Science. 1987. - V.66. - P.480-486.

91. Huang H. The lactoperixidase system // Prog. Industr. Microbiol., 1964. V.5. -P.356-369.

92. Jin L.Z., Ho Y.M., Abdullah W. Effect of adherent Lactobacillus cultures on growth, weight of organs and intestinal microflora and VFAs in broilers // Animal Feed Sciens and Tehnology (in press). 1997. - V.9. - P. 13-17.

93. Kailasapathy K.A., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol Cell Biol 2000: Immunol Cell Biol: 78: 80-8.

94. Nisstle A. Erlanterungen über die Bedeutung der Kolondys bakterie und den Werkungsmechanismus der Coliterapie (Mutaflor). Medizinescht, 1959; V. 21. -P1017-1022.

95. Nurmi E., Rantala M. New aspects of salmonella infection in broiler production // Nature. 1973. - V.241. - P.210.

96. Ogasahara K., Imanishi A., Isemura T. Studies on thermophilic alpha-amilase from Bacillus stearothermohilus 11 Thermal stability of thermophilic alpha-amilase. J. Biochem., 1970, - V.67. - №1. - P.77.

97. Rigby C.E., Pettet I.R. et. al. Functions of normal microflora of intestines warm-blooded, 1979, v. 32, №3

98. Rigby C.E. et. al., 1980, v.24, №3

99. Tabaqchali S, Hatzioannou J, Booth CC. Bile-salt deconjugation and steatorrhoea in patients with the stagnant-loop syndrome. Lancet, 1968;2:12-16.

100. Tanaka R., Takayama H., Morotomi M. et al. Effect of administration TOS and B. breve 4006 on the human fecal flora. Bifidobacteria microflora 1983; 2: P.17-24. The lactopiroxidase system // In Natural Antimicrobial system. Brussels, 1985.-P. 18-30.

101. Toskes PP, Giannella RA, Jervis HR, et al. Small intestinal mucosal injury in the experimental blind loop syndrome. Light- and electronmicroscopic and histochemical studies. Gastroenterology, 1975;68:193-203.

102. Выражаем глубокую благодарность ветеринарному врачу «Михайловской Птицефабрики» В.М. Спиридонову за консультации и большую помощь в проведение экспериментов с цыплятами.