Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка поликомпонентного метаболитного пробиотика для наружного применения на основе лактобацилл

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка поликомпонентного метаболитного пробиотика для наружного применения на основе лактобацилл"

На правах рукописи

Ъ-ь

005057536

КУЛАКОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА ПОЛИКОМПОНЕНТНОГО МЕТАБОЛИТНОГО ПРОБИОТИКА ДЛЯ НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НА ОСНОВЕ

ЛАКТОБАЦИЛЛ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

005057536

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор [Поспелова Вероника Владимировна] доктор биологических наук, Алешкин Андрей Владимирович

Официальные оппоненты:

Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»

Митрохин Сергей Дмитриевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом микробиологии и клинической фармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «14» марта 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д.10. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

Автореферат разослан «/^А» февраля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

О.Ю. Борисова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы все большую клиническую актуальность приобретает проблема нарушений в составе симбиотических ассоциаций, представляющих нормальную микрофлору кожных покровов человека. Дисбаланс нормального микробиоценоза является одним из ведущих этиологических факторов развития гнойно-воспалительных заболеваний в дерматологической практике (Ростовщикова М.В., 2011). Все более широкое применение в профилактике и лечении кожных заболеваний находят биопрепараты - пробиотики, которые содержат живые культуры нормальной микрофлоры человека и/или вещества микробного происхождения (в т.ч. метаболиты), оказывающие благоприятные эффекты на физиологические функции и биохимические реакции организма хозяина через оптимизацию его микроэкологического статуса (Бондаренко В.М., 2007; тендеров Б.А., 2011).

Антагонистическая активность пробиотических штаммов играет ведущую роль при их отборе в качестве производственно перспективных микроорганизмов. Механизм осуществления данного свойства связан с продукцией этими бактериями органических кислот, в первую очередь молочной и уксусной, аминокислот, антибиотикоподобных веществ -бактериоцинов, витаминов и микроэлементов (Онищенко Г.Г. и др., 2002; Светоч Э.А., 2011; Бондаренко В.М., 2012). Бактериоцины и кислоты подавляют рост патогенных микробов, оказывая противовоспалительное действие. Пептиды способствуют повышению местного иммунитета кожи и слизистых открытых полостей. Углеводы, аминокислоты и витамины питают кожу и усиливают обменные процессы, стимулируют репарацию тканей, оказывают смягчающее действие. В связи с этим представляется актуальным создание лечебно-профилактических средств, содержащих комплексный набор продуктов жизнедеятельности пробиотических микроорганизмов для осуществления заместительной терапии с последующим восстановлением нарушенного бактериоценоза и оптимизацией микроэкологии кожных покровов (Алешкин В.А., 2006; Поспелова В.В., 2007).

Согласно ряду предварительных исследований, проведенных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, наиболее перспективными пробиотическими продуцентами биологически активных веществ являются штаммы лактобацилл, входящие в трехкомпонентный консорциум препарата «Ацилакт» (Поспелова В.В., 2009; Амерханова A.M., 2010; Алешкин A.B., 2011). Разработка метаболитного пробиотика на его основе позволит, с одной стороны, оптимизировать технологически трудоемкий процесс получения

стандартизированного биопрепарата, а, с другой, - удовлетворить все более возрастающую потребность российского фармацевтического рынка в пробиотических средствах для наружного применения.

Цель исследования

Разработать пробиотическое средство наружного применения на основе супернатанта лактобацилл с подтвержденными комплексом доклинических исследований безопасностью и эффективностью использования в дерматологической практике.

Задачи исследования

1. Используя комплексную фенотипическую и молекулярно-генетическую оценку производственных микроорганизмов, отобрать перспективные штаммы лактобацилл, как основу для создания пробиотического средства наружного применения.

2. Исследовать спектр биологически активных веществ (пептидов, амино- и других органических кислот) и других факторов (профиль бактерицидной активности), обусловливающих пробиотический эффект супернатанта и ультрафильтрата культуральной жидкости лактобацилл.

3. Подтвердить безопасность супернатанта и ультрафильтрата культуральной жидкости лактобацилл в экспериментах по острой и хронической токсичности на лабораторных животных.

4. Сконструировать рецептуру и отработать пилотную технологию крема (космецевтического средства) на основе супернатанта культуральной жидкости лактобацилл.

5. Оценить эффективность применения наружного пробиотического средства (крема) в опытах с экспериментально инфицированными и естественно травмированными млекопитающими.

Научная новизна

Впервые создана рецептура и отработана пилотная технология получения крема из супернатанта культуральной жидкости лактобацилл.

Исследован спектр биологически активных веществ и других факторов, обуславливающих пробиотический эффект сконструированного метаболитного средства для наружного применения.

Сформирован на базе существующих методов оценки безопасности и эффективности бактериальных препаратов и адаптирован для метаболитного пробиотика в форме крема необходимьш комплекс доклинических контрольно-испытательных мероприятий.

Практическая значимость

На созданную рецептуру и пилотную технологию крема из супернатанта культуральной жидкости лактобацилл разработана нормативная документация в соответствии с ГОСТ Р 52343-2005 «Кремы косметические. Общие технические условия» (рецептура и технологическая инструкция на крем «Вералактин»),

Впервые предложена и апробирована новая область клинического использования пробиотиков в качестве местного дерматологического средства. Полученные результаты по бактерицидной активности метаболитного пробиотика в экспериментах, проведенных in vitro и in vivo, позволяют рассчитывать на эффективность разработанного средства для наружного применения при патологических состояниях кожных покровов, вызванных стафилококком и другими возбудителями инфекционно-воспалительных заболеваний.

Внедрение в практику

Разработанный метаболитный пробиотик на основе супернатанта консорциума штаммов лактобацилл послужил основой для патента на изобретение РФ № 2393214 «Иммунобиологическое противоаллергическое средство (варианты), штамм Lactobacillus acidophilus NKJC, штамм Lactobacillus acidophilus JCH, штамм Lactobacillus acidophilus КАА» и заявки на изобретение № 2012112390 «Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью».

Нормативно-техническая документация на крем «Вералактин», сертифицирована в установленном порядке и передана для пилотного выпуска и отработки полномасштабного технологического процесса на биотехнологическое производство.

Положение, выносимое на защиту

Поликомпонентный метаболитный пробиотик на основе супернатанта штаммов лактобацилл представляет собой безопасное и эффективное бактерицидное средство для местного применения при гнойно-воспалительных заболеваниях кожных покровов.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании секции Ученого Совета «Медицинская биотехнология» ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №6 от 20 декабря 2012 г.

Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: Национальной российской конференции «Прошлое, настоящее и будущее отечественной косметологии, косметики и пластической хирургии», Москва, 20-21 сентября

5

2006 г.; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты» г. Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г.; IDF International symposium «Lactose and its Derivatives», Moscow, 14-17 may 2007; Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», г. Сочи-Адлер, 19-22 сентября 2007 г.; Межрегиональной научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции», г. Пенза, 2-3 октября 2008 г.; Научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ, г. Москва, 8 октября 2008 г; Научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», г. Москва, 11-12 ноября 2008 г; Юбилейной научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», г.Ростов-на-Дону, 23-24 сентября 2009 г.; Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», п. Оболенск, 31 мая - 2 июня 2011 г.; Международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии», г. Саранск, 3-5 октября 2012 г; 9-я Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Санкт-Петербург - Гастросессия-2012», г. Санкт-Петербург, 22-23 ноября 2012 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, в том числе, 5 статей - в рецензируемых изданиях, 5 статей - в других изданиях, 16 работ - в материалах конференций, 1 патент на изобретение РФ, 1 методические указания, 1 заявка на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах основного машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы, список использованной литературы, который содержит 192 источника (128 отечественных и 64 зарубежных). Работа иллюстрирована 13 рисунками и 17 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы, методы и объем проведенных исследований

Работа выполнена в ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора на базе двух лабораторий: биопрепаратов и лекарственных форм, клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов.

Объекты и объем проведенных исследований представлены в таблице 1.

6

Раздел работы Объект исследований Объем исследований

Разработка метаболитного пробиотика наружного применения

Отбор производственных штаммов Культуры трех штаммов лактобацилл, составляющих консорциум «Ацилакт»: LJielveiicus NKJC, Lhelveiicus JCH, Lcasfi КАЛ, полученные из ГКНМ ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского», ФГУН ГИСК им.Л.А.Тарасевича, ГНУ ВНИМИ, ВКПМ Морфология 36 образцов культур; Биохимические свойства 36 образцов культур; Моле кул яр но-генетическое типирование 12 образцов культур; Культуральные свойства 36 образцов; Антибиотикочувствительность 36 образцов культур к 12 антибиотикам; Антагонистические свойства 36 образцов культур к тест-штаммам.

Получение культуральной жидкости (ЮК) лактобацилл Питательные среды: казенно во-дрожжевая с солями (КД-5С), молоко сухое обезжиренное. 230 циклов ферментации

Получение супернатантов КЖ лактобацилл трех штаммов отдельно и в составе консорциума Методика получения метаболитной составляющей лактобацилл 174 цикла центрифугирования

Получение ультрафильтратов КЖ лактобацилл трех штаммов отдельно и в составе консорциума Методика получения метаболитной составляющей лактобацилл 18 циклов ультрафильтрации

Изучение бактерицидной и антиканд идо зной активности Тест-штаммы: S.aureus 209, S.aureus 34, H.feacalis 1154, Е.соН 224, Can Juki albicans 5 u S. aureus, выделенные из клинического материала. 40 образцов супернатантов лактобацилл и 12 образцов препарата «Хилак форте», следующего состава: беззародышевые водные субстраты продуктов обмена веществ: E.coU DSM4087, S.faecalis DSM4086, Lacidophilus DSM4149,1..heiveiicus DSM4183; вспомогательные вещества: натрия фосфат кислый х 7Н;0, калия фосфат кислый, молочная кислота 90%, фосфорная кислота 85%, калия сорбат. моногидрат лимонной кислоты Капельным методом - 120 опытов к 11 штамм .Ч.аиге^" Методом серийных разведений - 114 опытов к 3 тест-штаммам; Методом диффузии в агар - 138 опытов к 5 тест-штаммам

Определение спектра органических кислот 53 образца супернатантов и ультрафильтратов лактобацилл, 12 образцов препарата «Хилак форте» 212 опытов по определению концентрации 9 органических кислот

Определение спектра аминокислот 42 образца супернатантов лактобацилл, 12 образцов препарата «Хилак форте» 168 опытов по определению концентрации 17 аминокислот

Определение концентрации белка 28 образцов супернатантов лактобацилл 92 опыта по определению концентрации белка

Определение концентрации гнетамина 16 образцов питательных сред КД-5С и КЖ лактобацил 32 опытов по определению гистамина

Получение опытных серий метаболитного пробиотика наружного применения 6 вариантов мазевых основ (компоненты основы для крема: воск эмульсионный, воск пчелиный, масло соевое, масло какао, масло оливковое, масло вазелиновое, парафин, ланолин безводный, глицерин, консерванты, отдушка, смесь Унна. пентол, вода дистиллированная, гель хитозана 1%) 90 серий метаболитного пробиотика наружного применения в композиции с разными мазевыми основами

Оценка биосовместимости компонентов крема и действующего вещества 12 образцов метаболитного пробиотика наружного применения с мазевой основой следующего состава: вода дистиллированная, масло оливковое, воск эмульсионный, ланолин, глицерин, консервант (нипагин).Тест- штаммы: S.aureus 209, K.feacaUs ¡154, Candida albicans 54 36 опытов по отношению к 3 тест-штаммам

Доклинические исследования

Изучение безопасности штаммов [..11е1\х'11си\ NKJC, 1.Ие1уе11С1^ ]СН, /..пшч КАЛ, и консорциум трех штаммов, беспородные (нелинейные) мыши обоего пола 130 животных

Изучение токсичности супернатантов и удьтрафильтратов КЖ лактобацилл 5 образцов супернатантов 5 образцов ультрафильтратов 12 опытов с использованием 50 беспородных (нелинейных) мышей, обоего пола

Оценка эффективности метаболитного пробиотика Морские евин и 6 животных по 4 очага, инфицированные S.aureus 6

Кролики 10 животных по 3 очага, инфицированные S.aш■eus 6

наружного применения Обезьяны 32 животных с термическими ожогами и травмами

Видовая принадлежность трех штаммов лактобацилл уточнялась путем идентификации их морфологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических свойств в соответствии с «Методическими указаниями по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов» (МУ 2.3.2.2789-10). Для молекулярно-генетической характеристики штаммов использовали анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, особенности которых определяли с помощью фрагментарного секвенирования ДНК лактобацилл по Сенгеру.

Изучение безопасности штаммов было проведено в опытах острой и хронической токсичности в соответствии с «Методическими указаниями Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» (МУК 4.2.2602-10) совместно с сотрудниками ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава РФ - к.б.н. K.M. Мефед, к.б.н. Д.С. Давыдовым.

Содержание гистамина в питательной среде до и после культивирования лактобацилл измеряли методом определения гистидиндекарбоксилазной активности бактерий (Куяров A.B. и др., 2007).

Для получения супернатантов в центрифужный стакан наливали по 50 мл культурапьной жидкости лактобацилл, состоящей из клеточной биомассы, продуктов их жизнедеятельности и остатков питательной среды и центрифугировали при 5500 об/мин в течение 30 мин. Супернатант, представляющий собой надосадочную жидкость, отбирали не затрагивая осевших бактериальных клеток. Центрифугирование проводили на центрифуге РС-6 (Россия) с угловым ротором на 8 стаканов по 70 мл.

Количественное определение белка проводили биуретовым методом в соответствии с ГФ XI (ч.2., стр. 116) совместно с сотрудником ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» В.П. Носоновым.

Органические кислоты определяли по методу газовой хромотографии в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10 совместно с сотрудником ФГБОУ ВПО "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова" - A.A. Ивановым. Разделение органических кислот происходило в капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms фирмы Agillent technologies. Концентрацию веществ определи по масс-спектрам, используя стандартную программу идентификации прибора, основанную на базе данных NIST.

Для анализа на содержания свободных аминокислот использовали анализатор Биотроник 1С-2000 (Германия) с аналитической колонкой, заполненной ионообменной смолой Durrum DC-4A с размером частиц 6-8 микрон в трех-буферной системе (буфер «А» рН=3,25, буфер «В» рН=3,90, буфер «С» рН=4,75). Анализ на суммарное наличие свободных и связанных аминокислот проводили после предварительного гидролиза образцов. Исследования по изучению содержания аминокислот было проведено совместно с сотрудником ФГУП «Государственным научно-исследовательским институтом генетики и селекции промышленных микроорганизмов» - к.х.н. Е.А.Тимохиной.

Изучение бактерицидной и антикандидозной активности проводили с помощью следующих методов: капельного, диффузии в агар и серийных разведений совместно с сотрудником ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» к.м.н. JI.B. Пожалостиной и с сотрудниками ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава РФ - к.б.н. K.M. Мефед, к.б.н. Д.С. Давыдовым.

Острую (аномальную) токсичность супернатантов и ультрафильтратов оценивали в соответствии ГФ XII ч.1 с. 125 (Аномальная токсичность. ОФС 420060-07) с использованием лабораторных животных. Препарат вводили мышам однократно внутрибрюшинно и внутрижелудочно. Оценку хронической (подострой) токсичности супернатантов и ультрафильтратов проводили на основании «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005). Препарат вводили мышам внутрижелудочно в течение 14 дней.

Основы для изготовления метаболитного пробиотика наружного применения подбирали с учетом биосовместимости компонентов крема и руководствуясь общепринятыми требованиями, предъявляемыми к мазям (в соответствии с ГФ XI, вып.2, стр. 146) совместно с сотрудником ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Министерства здравоохранения РФ - Е.В. Волковой. Контроль биосовместимости компонентов метаболитного пробиотика для наружного применения проводили сравнивая бактерицидную и антикандидозную активность, изученную методом серийных разведений, супернатанта до внесения его в рецептуру и после выделения из готового крема.

Оценку эффективности крема проводили совместно с сотрудниками ФГБУ «Медицинского радиологического научного центра» Минздрава РФ -Л.П. Ульяновой и ФБУН "Научно-исследовательского института медицинской приматологии" РАМН - к.б.н. И.М. Аршба И.М. и Т.Е. Гвоздик. Изучение эффективности кремов проводили в условиях искусственно вызванного

9

иммунодефицита на морских свинках и кроликах, создавая экспериментальную кожную инфекцию в области спины с помощью внутрикожной инъекции музейного штамма стафилококка. Изучение эффективности кремов на обезьянах, страдавших повреждениями кожных покровов в результате термических ожогов и травм, было проведено в комплексе с хирургическим лечением.

Статистический анализ результатов экспериментальных исследований, выполнялся с использованием статистических программ Windows Excel и включал следующие его элементы: построение гистограмм для визуальной оценки характера распределения; расчет средних значений и элементарная статистика для определения основных параметров распределений показателей и проверки их на соответствие нормальному закону распределения; корреляционный анализ для выявления взаимосвязи между параметрами; расчет Т-критерия Стьюдента и непараметрических критериев для определения различий средних значений показателей в сравниваемых выборках.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование иробиотического средства в форме крема из супернатантов культуральной жидкости лакгобацилл

Для решения задачи по конструированию пробиотического средства в форме крема использовали метаболитную составляющую культуральной жидкости лактобацилл - супернатанты (СН) и ультрафильтраты (УФ), а не нативные штаммы микроорганизмов, что позволило избежать проблем по сохранению стабильности действующей биологической субстанции при взаимодействии с консервантом мазевой основы, с точностью дозирования, и, соответственно, качественной и количественной стандартизацией серий препарата, с возможной несовместимостью действующего вещества с индигенной микрофлорой, а также привело к снижению антигенной нагрузки (Глушанова H.A., 2005).

В качестве пробиотических штаммов-продуцентов метаболитов на предварительном этапе конструирования крема были отобраны и исследованы с точки зрения их производственной перспективности в соответствии с требованиями «Методических указаний по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов» (МУ 2.3.2.2789-10) штаммы лактобацилл, входящие в трехкомпонентный консорциум «Ацилакт», отличающиеся высокой антагонистической активностью. В том числе, нами решалась задача по подтверждению видовой подлинности штаммов-претендентов, которая была уточнена в результате

10

проведенных молекулярно-генетических исследований. По особенностям структуры гена I6S рРНК, полученным с помощью секвенирования ДНК лактобацилл по Сенгеру, определена принадлежность штамма L.acidophilus NK, к виду L.helveticus, L.acidophilus ЮОаш к виду L.helveticus. L.acidophilus Kj/II24 к виду L.casei. В связи с уточненным таксономическим положением штаммы были задепонированы в ГКНМ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора: NK, как NKJC, ЮОаш как JCH, K JII24 как КАА.

В дополнение к вышеуказанным характеристикам штаммов, обращая внимание на возможность продуцирования лактобациллами, по данным зарубежной литературы, метаболитов, обладающих провоспалительными свойствами (например, L.acidophilus, L.buchneri, L.delbrueckii синтезируют гистамин [Azcarate-Peril М.А., 2004; Garai G., 2007]), a также частоту встречаемости заболеваний аллергического характера в дерматологической практике провели ряд экспериментов по количественному определению гистамина в КЖ. В результате исследований было показано, что как при раздельном, так и при совместном культивировании исходное содержание гистамина в питательной среде КД-5С не повышается и составляет 4,5+0,4 мкмоль/мл до культивирования и 4,4+0,4 мкмоль/мл после.

Убедившись в безопасности отобранных штаммов в опытах на животных (смотри раздел «Доклинические исследования по безопасности и эффективности сконструированного метаболитного пробиотика для наружного применения»), перешли к следующему этапу биотехнологического проекта -получению супернатантов и ультрафильтратов из КЖ лактобацилл. Для этого нами была разработана следующая технология их получения (рис. 1):

Клеточная биомасса Продукты жизнедеятельности Остатки питательной среды

Центрифугирование при 55(jO об/ivwH в течении 30 минут Супер"4«"*

Микрофильтрация при помощью «Steriflip®» (Millipore, США) с диаметром noD 0.22м(м.

Мембранная ультрафильтра ция в режиме центрифугирования в полипропиле новом стакане «Сепїгісоп® РІив-гО» (МіІІіроге, США) с мембраной, удерживающей биополимеры с молекулярной массой более ЗОкД.

Рисунок 1. Схема получение супернатантов и ультрафильтратов

11

Для подтверждения гипотезы о сохранении основных пробиотических свойств в супернатанте, полученном по разработанной автором технологии, провели сравнительное исследование спектра биологически активных веществ, содержащихся в нативной культуре (КЖ), супернатантах, ультрафильтратах и пероральном коммерческом препарате Хилак форте. При определении концентрации метаболитов белковой природы была показана аналогичность показателей в супернатантах (18,5±1 мг/мл), с концентрацией таковых в нативных культурах (18,6±1 мг/мл). Так же было показано, что как в испытуемых супернатантах, так и в КЖ лактобацилл присутствовал одинаковый набор карбоновых кислот: молочная, уксусная, масляная, пропионовая, яблочная, валериановая, янтарная, изовапериановая, капроновая (табл. 2). Отмечено, что количественное содержание карбоновых кислот отчетливо зависело от среды культивирования щтаммов лактобацилл. В молоке их продуцирование уменьшалось. При сравнении абсолютных количеств карбоновых кислот существенной разницы между их содержанием в супернатанте и нативной культуре также не обнаружено. В то же время наблюдалось снижение концентраций некоторых видов карбоновых кислот в ультрафильтратах. Принимая во внимание ведущую роль молочной кислоты в осуществлении антагонистических свойств лактобациллами, необходимо отметить, что количественное содержание данного метаболита в супернатанте на основе консорциума штаммов было в 2 раза выше, чем в коммерческом препарате.

Таблица 2. Содержание карбоновых кислот (мг/мл)*

Наименование кислоты Лактобациллы, выращенные на питательной среде КД-5С Хилак форте

Консорциум трех штаммов Супернатанты

КЖ СН УФ NKJC КАА JCH

Молочная 538+1,0 602±1,0 456+1,0 406+1,0 415+1,0 397±1,0 313+1,0

Уксусная 236+0,5 243±1,0 206+0,5 205±1,0 144+0,5 102+Ю.5 297±0,5

Пропионовая 23+0,1 57+0,5 25+0,1 63+0.5 72+0.5 61+0,5 135+0,5

Масляная 123±0,5 150+1,0 105±0,5 132+1,0 150±1,0 150+1,0 131+0,5

Яблочная 187+0,5 157±1,0 157±0,5 161±1,0 132±0,5 158±1,0 111+0.5

Валериановая 79±0,1 82+0,1 82+0,1 91+0,1 43+0,1 39+0,1 45+0,5

* представленные значения скорректированы на количества, исходно содержавшиеся в

питательной среде.

Биологический потенциал и бактерицидная активность метаболитов культур лактобацилл определяется не только набором пептидов и органических кислот, но и во многом зависят от состава продуцируемых аминокислот. Нами было определено, что супернатанты лактобацилл содержат 17 видов

12

аминокислот, причем в гидролизованных образцах, т.е. при суммарном определении свободных и связанных аминокислот, концентрации по всем кислотам существенно выше. Необходимо отметить, что среди выявленных аминокислот присутствуют такие, например, глицин, аланин. глутамин, которые входят в комплекс пептидогликанов клеточной стенки лактобацилл и играют ведущую роль в их иммуномодулирующей активности в отношении гуморального и клеточного звеньев иммунной системы человека (Онищенко Г.Г. и др., 2002). При сравнение спектра и концентраций аминокислот, содержащихся в супернатанте и коммерческом пероральном препарате, было показано количественное превосходство супернатантов (рис. 2).

м

ІІ

хшх

і і 5

■ Супернатант - свободные

■ Супернатант- свободные и связанные

Хилаи форте - свободные

■ Хилак форте - свободные и связанные

Рисунок 2. Содержание свободных и связанных аминокислот в супернатанте консорциума трех штаммов лактобацилл и коммерческом препарате

Таким образом, при переходе от состояния культуральной жидкости к супернатантам, полученным по приведенной выше технологии, абсолютное количество и соотношения метаболитов претерпевают лишь незначительные изменения, которыми, на наш взгляд, можно пренебречь при комплексной оценке пробиотических свойств действующего начала.

Важным подтверждением сохранения пробиотического эффекта при переходе от КЖ лактобацилл к супернатантам является уровень их бактерицидной и антикандидозной активности. Так, при сравнении данных свойств, проявляемых нативной культурой и супернатантом в отношении тест-штаммов Б.аигею 209, Е./еасаНх 1154 и С.а1Ысат 54 методом серийных разведений, была показана равноценность обоих образцов (табл. 3).

При сравнении супернатантов, нативного консорциума КЖ и коммерческого препарата по степени проявления бактерицидной и антикандидозной активности в отношении тест-штаммов на плотных питательных средах методом диффузии в агар установлено: с одной стороны, практически одинаковая антибактериальная и антикандидозная эффективность супернатантов и нативной культуры, с другой стороны, превосходство супернатантов и нативной культуры над коммерческим препаратом, (табл. 4).

Таблица 3. Изучение бактерицидной и антикандидозной активности пробиотиков методом серийных разведений

Тест- S.aureus 209 E.fecalis 1154 С.аІЬісат 54

штаммы Разведение исследуемого образца Разведение исследуемого образца Разведение исследуемого образца

Исследуемый образец контр X S <N СО чо <N контр о К <N ОО VC (N Ті контр X и X сч ОО

КЖ - + + + + + ± - + + + + + + - + + + -

сн - + + + + - - + + + + + + - + + + -

Обозначения:

+ высокий бактерицидный и антикандидозный эффект (отсутствует рост тест-штаммов); ± слабый бактерицидный и антикандидозный эффект (незначительный рост тесг-штаммов); - отсутствие бактерицидного и антикандидозного эффекта (типовой рост тест-штаммов).

Таблица 4. Изучение бактерицидной и антикандидозной активности пробиотиков методом диффузии в агар

Тест-штаммы Состав пробиотиков S.aureus 209 S. aureus 34 E.fecalis 1154 Exoli 224 С.albicans 54

Разведение пробиотика Разведение пробиотика Разведение пробиотика Разведение пробиотика Разведение пробиотика

исх ; 1:2 исх 1 1:2 исх 1 1:2 исх 1 1:2 исх 1 1:2

Диаметр зон задержки роста, ММ

Консорциум из лактобацилл нативный 17+1 13±1 20+1 17+2 18±2 6+1 15+1 6±2 0 0

Консорциум из лактобацилл супернатант 16+1 13+1 20+2 8+2 19+1 7+1 15+1 7+1 3+1 0

Штамм ГШС супернатант 21+2 8+1 23+2 15+2 22±2 8+2 13+1 5+1 3+1 0

Штамм КАА супернатант 19+1 7+1 23+1 14+2 20±2 7+1 13+1 3+1 3+1 0

Штамм .1СН супернатант 20+1 11+1 21+1 16+1 18+1 9±1 16+1 6+1 3+1 0

Хилак форте 16+1 4+1 15+1 3+1 20+1 7+1 8+1 0 4+2 0

Необходимо отметить, что наиболее выраженная бактерицидная активность испытуемых супернатантов была выявлена капельным методом в

14

отношении свежевыделенных штаммов золотистого стафилококка, что имеет существенное клиническое значение для конструирования средства наружного применения (табл. 5).

Таблица 5. Бактерицидная активность супернатантов из лактобацилл при испытании капельным методом в отношении золотистого стафилококка

Супернатанты на основе лактобациллы

Консорциум Штамм Штамм Штамм

Тест-штаммы 3 штаммов Г\'ЮС КАА .ІСН

677к + - - +

78 + + + -

79 + + + -

О 82 + + + -

^ С 887 + - - +

908 - - - +

о С) 411 ± + + +

408 ± + + +

§■ 180 ± ± + ±

ьо 513 + + ± -

532 ± + ± +

Примечание:

+ высокий бактерицидный эффект (отсутствует рост тест-штаммов);

+ слабый бактерицидный эффект (незначительный рост тест-штаммов);

- отсутствие бактерицидного эффекта (типовой рост тест-штаммов).

Проведенные исследования по определению спектра и концентраций амино- и других органических кислот в процессе разработки метаболитного пробиотика показали значительное преимущество супернатантов перед ультрафильтратами, которое объясняется потерей биологически активных веществ при дополнительной фильтрации, что дало нам основание использовать супернатант, полученный из культуральной жидкости консорциума лактобацилл, в качестве действующего вещества для пробиотического средства наружного применения.

На следующем этапе конструирования пробиотического средства наружного применения необходимо было определиться с мазевой основой крема, от которой требовалось не только обеспечение биодоступности метаболитов супернатанта при нанесении на кожные покровы и стабильное хранение готовой формы в течение 12 месяцев при комнатной температуре, но и биосовместимость с действующим веществом. В результате проведенных исследований в рецептуру была включена основа, содержащая: воду дистиллированную, масло оливковое, воск эмульсионный, ланолин, глицерин и консервант (нипагин, нипазол) (табл. 6 ).

Оценка биосовместимости компонентов метаболитного пробиотика для наружного применения также подтвердила практически полную сохранность

15

бактерицидных свойств действующего вещества при включении в рецептуру выбранной мазевой основы. В данном случае сравнивали бактерицидную активность супернатанта до внесения его в рецептуру и после выделения из готового крема (табл. 7).

Таблица 6. Варианты рецептур и результаты наблюдения за стабильностью в течение 12 месяцев при комнатной температуре метаболитного пробиотика наружного применения (крема)

Параметры Состав мазевой основы

Масло соевое, ланолин безв., консервант Масло соевое, вода диет., масло вазел., ланолин безв.. пентол, воск пчел..масло какао, парафин, консервант Вода диет., масло соевое, масло вазел.. глицерин, смесь Ун на. пентол. парафин, консервант, отдушка Вода диет., воск эмульс., масло соевое, масло вазел., глицерин, консервант, отдушка Гель хитозана. вода дист.,масло оливк.. глицерин, ланолин безв., консервант Вода диет., масло оливк., воск эмульс., глицерин, ланолин безв., консервант

Внешний вид - - - - Загустение -

Цвет Темнел Темнел - - - -

Запах - Прогорклого масла - - - -

рн - - Снижение - - -

Коллоидная стабильность Расслоение - Расслоение Расслоение - -

Термостабильность - - - - - -

Микробиологическая чистота - - - - - -

Примечание: «-» - параметр не изменялся в течении всего срока наблюдения

Таблица 7. Изучение бактерицидной и антикандидозной активности супернатанта методом серийных разведений до его внесения и после выделения из крема

Тест-штаммы S.aureus 209 Е./есаШ 1154 С. albicans 54

Разведение исследуемого образца Разведение исследуемого образца Разведение исследуемого образца

Исследуемый образец контр о S 00 контр * S Ci -з; ОО чэ fN ТЇ контр X (J S Г4

СН выделенный из крема - + + + + - - + + + + + - - + + -

СН исходный - + + + + + - + + + + + + - + + +

Обозначения:

+ высокий бактерицидный и антикандидозный эффект (отсутствует рост тест-штаммов); + слабый бактерицидный и антикандидозный эффект (незначительный рост тест-штаммов); - отсутствие бактерицидного и антикандидозного эффекта (типовой рост тест-штаммов).

Доклинические исследования по безопасности и эффективности сконструированного метаболитного пробиотика для наружного

применения

Одним из основных этапов доклинических исследований биотехнологического продукта является подтверждение его безопасности в опытах острой и хронической (подострой) токсичности на модели лабораторных животных. Поэтому дополнительно к изучению фенотипических и молекулярно-генетических свойств производственно-перспективным штаммов, отобранных как основа для получения супернатанта, была проведена оценка их токсичности in vivo. В результате показано, что введение испытуемых штаммов-продуцентов метаболитов Lhelveticus NKJC, L.helveticus JCH и L.casei КАА не оказывало токсического действия на органы, ткани и поведение животных, что подтвердило их полную безвредность (табл. 8).

Сконструированная рецептура метаболитного пробиотика, полученного на основе консорциума трех штаммов лактобацилл, также подвергалась испытаниям по оценке острой и хронической (подострой) токсичности. В результате проведенного на белых беспородных мышах эксперименте негативного воздействия на органы и ткани (при гистологическом исследовании), а также на прирост массы тела и поведение животных в период проведения опытов выявлено не было (рис. 3).

Таблица 8. Схема опыта по изучению острой токсичности штаммов

Испытуемые штаммы Способ введения Доза введения 0,5 мл Количество мышей Сутки забоя по окончании опыта

Внутрибр 15* 10'J КОЕ/мл 5 1

NKJC Внутрижел. 90*10'' КОЕ/мл 5 1

Внутрибр 15* 10''КОЕ/мл 5 7

Внутрижел. 90*10" КОЕ/мл 5 7

Внутрибр 15* 10" КОЕ/мл 5 1

JCH Внутрижел. 90*10" КОЕ/мл 5 1

Внутрибр 15*10" КОЕ/мл 5 7

Внутрижел. 90*10" КОЕ/мл 5 7

Внутрибр 15*10" КОЕ/мл 5 1

КАА Внутрижел. 90*10" КОЕ/мл 5 1

Внутрибр 15* 10" КОЕ/мл 5 7

Внутрижел. 90*10" КОЕ/мл 5 7

Внутрибр. физ- раствор 0,5 мл 5 1

контроль Интактные особи 5 1

Внутрижел. физ-раствор 0,5 мл 5 7

Интактные особи 5 7

На следующем этапе доклинических исследований крема на основе метаболитного пробиотика оценивали эффективность его применения в опытах

с экспериментально инфицированными и естественно травмированными млекопитающими: морскими свинками, кроликами и обезьянами.

А Б

Рисунок 3. Динамика веса мышей, получавших супернатант консорциума лактобацилл per os (А) и внутрибрюшинно (Б) в эксперименте по оценке острой токсичности

У морских свинок с помощью х-облучения и циклофосфана было смоделировано состояние иммунодефицита, позволившее при внутрикожном введении S.aureus 6 вызвать стафилококковое воспаление кожи, спровоцировавшее в очаге заражения коагуляционную форму некроза. Заживление на фоне применения сконструированного крема проходило в кратчайшие сроки под сухим тонким струпом, нагноений и изъязвлений не наблюдалось. В контрольных очагах стафилококковой инфекции средний период рубцевания был дольше на 3 дня (табл. 9).

Таблица 9. Оценка эффективности метаболитного пробиотика наружного применения на модели экспериментального иммунодефицита у морских свинок при заражении 5.«»/-«« 6

Способ создания иммунодефицита Количество животных (количество очагов) Количество дней, потребовавшихся на выздоровление

Опытные очаги, инфицированные S.aureus 6 (2х109КОЕ/мл) в дозе 0,1 мл Контролные очаги, инфицированные S.aureus 6 (2х 1 09КС)Е/мл) В дозе 0,1 мл

СН крем Питательная среда КД-5С

Х-облучение в дозе 1 Гр ' 3(12) 6 7 8 9

Циклофосфан (иммуносупрессор) 3(12) 6 7 8 9

контроль

о

опыт

Рисунок 4. Схема эксперимента по инфицированию S.aureus 6 морских свинок (одно и тоже животное имело 3 опытных и 1 контрольный очаг инфицирования)

Для оценки бактерицидной эффективности крема in vivo он был также применен при искусственно вызванной очаговой стафилококковой инфекции кожи у кроликов. Испытание крема на основе супернатанта культуральной жидкости лактобацилл показало его хорошую переносимость и эффективность в качестве средства, способствующего более раннему (на 5-10 дней) заживлению воспалительных очагов на коже у этого вида лабораторных животных (табл. 10). Как и в эксперименте с морскими свинками, контрольный и опытные очаги присутствовали одновременно на каждом животном.

Таблица 10. Оценка эффективности метаболитного пробиотика наружного применения у кроликов

Количество животных (количество очагов) Количество дней, потребовавшихся на выздоровление (количество очагов)

Опытные очаги, инфицированные S.aureus 6 (10у КОЕ/мл) в дозе 0,1 мл Контрольные очаги, инфицированные S.aureus 6 (10<J КОЕ/мл) в дозе 0,1 мл

10(40) 9-10(30) 15-20(10)

На заключительном этапе доклинических исследований, проведенном в питомнике ГУ НИИ медицинской приматологии РАМН, крем на основе супернатанта культуральной жидкости лактобацилл был применен у 32 обезьян с различными травматическими и термическими повреждениями туловища и конечностей. Включение крема, полученного из метаболитного пробиотика, в комплексную терапию приматов положительно влияло на процесс заживления ран, ускоряло их очищение от гноя и некротических тканей, способствовало заживлению пораженных участков кожи первичным натяжением. Средний срок выздоровления при аналогичных повреждениях у обезьян контрольной и опытной групп различались на 5-10 дней (табл. 11).

Таблица 11. Оценка эффективности метаболитного пробиотика наружного применения у обезьян

Характер повреждения Опытная группа, с применение крема Контрольная группа, без применения крема

№ обезьяны Продолжительность лечения в днях № обезьяны Продолж ител ьность лечения в днях

Множественные раны (асептические) 1 4 1 9

2 4 2 9

3 6 3 14

4 8 4 14

5 10 5 15

6 10 6 15

7 11 7 17

Гематомы 8 12 8 19

Термические ожоги 9 14 9 19

10 15 10 22

11 16 11 24

12 17 12 24

13 18 13 25

Множественные раны (инфицированные) 14 19 14 27

15 19 15 27

16 27 16 33

Таким образом, впервые создан метаболитный пробиотик наружного применения (крем) с доказанной в доклинических испытаниях безопасностью и клинической эффективностью в отношении кожных заболеваний, вызванных стафилококком и другими возбудителями инфекционно-воспапительных заболеваний.

выводы

1. Используя комплексную фенотипическую и молекулярно-генетнческую оценку производственных микроорганизмов были отобраны штаммы лактобацилл: L.helveticus NKJC, L.helveticns JCH и L.casei КАА, как основа для безопасного и эффективного метаболитного пробиотика наружного применения.

2. Супернатант культуральной жидкости лактобацилл штаммов Lhelveticus NKJC, Lhelveticus JCH и L.casei КАА по своей пробиотической эффективности, характеризующейся спектром содержащихся биологически активных веществ, антибактериальной и антикандидозной активностью, не уступает нативной культуре данных штаммов.

3. Подтверждена безопасность метаболитного пробиотика, включающего консорциум штаммов Lhelveticus NKJC, Lhelveticus JCH и L.casei КАА в опытах по острой и хронической (подострой) токсичности на лабораторных животных.

4. Сконструирована биосовместимая рецептура и отработана пилотная технология получения крема с высокой биодоступностью метаболитов супернатанта культуральной жидкости лактобацилл и стабильным хранением в течение 12 месяцев при комнатной температуре.

5. Доказана высокая эффективность сконструированного метаболитного пробиотика на основе супернатанта консорциума штаммов лактобацилл в отношении кожных заболеваний, вызванных золотистым стафилококком и другими патогенными микроорганизмами, у млекопитающих.

ПРАКТИЧЕНСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При создании пробиотических средств в форме крема, в соответствии с принципами биосовместимости компонентов биотехнологического продукта, в качестве действующего вещества рекомендуется использовать супернатант культуральной жидкости, полностью сохраняющий бактерицидные свойства нативных штаммов производственных микроорганизмов.

2. Созданный на основе метаболитного пробиотика крем (космецевтическое средство) после прохождения клинических испытаний рекомендуется для применения в дерматологической практике при инфекционно-воспалительных заболеваниях кожи, вызванных S.aureus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Черепанова Ю.В. Использование метаболитов молочнокислых бактерий для получения лечебно-косметических кремов/ Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Агапова Ю.В.// Материалы Национальной российской конференции «Прошлое, настоящее и будущее отечественной косметологии, косметики и пластической хирургии», 20-21 сентября 2006 г., г.Москва.-2006. - С. 152-156.

2. Алешкин В.А. Пробиотики, пребиотики, синбиотики и их роль в поддержании иммуномикроэкологического статуса человека/ Алешкин

B.А., Афанасьев С.С., Поспелова В.В., Черепанова Ю.В. и др.// Materia Medica. - М. - Москва: «Фармарус Принт», 2006. - С. - 43-57.

3. Поспелова В.В. Разработка пробиотиков наружного применения на основе лактобацилл/ Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М., Агапова Ю.В.// Клиническое питание. - 2007 - № 1-2 -

C.А63.

4. Поспелова В.В. Пробиотикотерапия при смешанной кишечной инфекции у телят/ Поспелова В.В., Бовкун Г.Ф., Черепанова Ю.В. // Клиническое питание. - 2007 - № 1-2 - С.А23.

5. Лахтин В.М. Исследование перспективных компонентов концентратов супернатантов культуральной жидкости трех штаммов лактобацилл Lacidophilus - компонентов Ацилакта/ Лахтин В.М. Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., тендеров Б.А., Агапова Ю.В. // Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С. А48.

6. Pospelova V. Probiotic Acilact and the field of its application/ Pospelova V., Cherepanova Yu.// IDF International Symposium «Lactose and its Derivatives», Book of abstracts, 14-17 May 2007, Moscow, P.328.

7. Черепанова Ю.В. Разработка лечебно-косметических кремов на основе метаболитов молочнокислых бактерий/ Черепанова Ю.В., Поспелова

B.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М., Иванов И.Ю.// Актуальные вопросы пластической, эстетической хирургии и дерматокосметологии, Сборник трудов НИИ пластической хирургии и косметологии, 2007, Москва,

C.146-153.

8. Поспелова В.В. Эффективность апробации на обезьянах пробиотиков разных составов и лекарственных форм/ Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Гвоздик Т.Е., Волкова Е.В.// Материалы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах», 19-22 сентября 2007, Сочи-Адлер, С. 199-205.

9. Лахтин В.М. Стратегические аспекты конструирования пробиотиков будущего/ Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Несвижский Ю.В., Поспелова В.В., Лахтин М.В., Воропаева Е.А., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В.// Вестник РАМН.-2008.- № 2. - С. 3344.

10.Лахтин В.М. Антимикробный потенциал высокомолекулярных ассоциатов концентратов супернатантов Ацилакта и составляющих его штаммов/ Лахтин В.М., Алешкин В.А., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Лахтин М.В.// Материалы 4 Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2-4 июня 2008 г, г. Санкт-Петербург, С. 155.

П.Поспелова В.В. Влияние пробиотика Ацилакт на факторы иммунного гомеостаза в эксперименте/ Поспелова В.В., Ульянова Л.П., Черепанова Ю.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции», 2-3 окт 2008, Пенза, С.91-93.

12.Лахтин В.М. Потенциал биологических активностей лектинов и других белков пробиотических микроорганизмов для стимулирования цитокинов и иммунокоррекции/ Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В.// Материалы Всероссийской НПК «Современные представления об иммунокоррекции», 2-3 окт 2008, Пенза, С.70-72.

13. Поспелова В.В. Пробиотик Ацилакт, его лекарственные формы и сферы применения/ Поспелова В.В., Алешкин В.А., Ульянова Л.П., Черепанова Ю.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Волкова Е.В., Агеева Л.В.// Материалы научно-практической конференции, посвященной 50-летию детского инфекционного отделения МОНИКИ, 8 октября 2008 г, С.210-213.

14.Поспелова В.В. Пробиотик Ацилакт и перспективы его применения при ротавирусной инфекции/ Поспелова В.В., Волохович Т.Т., Черепанова Ю.В., Брюлина Л.М., Ханина Г.И., Лахтин В.М.// Конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г, С. 99

15.Лахтин В.М. Лектины пробиотических микроорганизмов/ Лахтин В.М., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В.// Конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств и профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г, С.70.

16.Поспелова B.B. Изучение вариантов пробиотика Ацилакт на живых моделях/ Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Лахтин В.М., Криворучко Е.В., Ульянова Л.П., Гвоздик Т.Е., Аршба И.МУ/ Вестник РУДН - 2009. - №1. - С. 5-10.

17.Поспелова В.В. Эффективность пробиотика Ацилакт при ротавирусной инфекции/ Поспелова В.В., Волохович T.T., Брюлина Л.М., Черепанова Ю.В., Ханина Y.W.II Юб.науч.-практ. Конф. «Актуальные вопросы инфекционной патологии», Ростов-на-Дону, 23-24 сентября 2009 г, С. 344-347.

18.Лахтин В.М. Комплексная оценка белка в супернатантах грамположительных бактерий/ Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.// Клин. Лаб. Диагн. - 2010. - № 9. - С. 37.

19. Лахтин В.М. Высокомолекулярные биосурфактанты грамположительных бактерий человека/ В.М. Лахтин, М.В. Лахтин, Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. // Клин. лаб. диагностика. - 2010. - № 9. - С. 37-38.

20.Тутельян В.А. Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов/ Шевелева С.А., Хотимченко С.А., Исаков В.А., Конь И.Я., Мазо В.К., Ефимочкина Н.Р., Трушина Э.Н., Батищева С.Ю., Черкашин A.B., Алешкин В.А., Шендеров Б.А., Амерханова A.M., Жиленкова О.Г., Алешкин A.B., Бляхер М.С., Федорова И.М., Воропаева Е.А., Черепанова Ю.В., Урбан Ю.Н., Гинзбург А.Л., Зигангирова H.A., Народицкий Б.С., Нестеренко Л.Н., Шагинян И.А., Чернуха М.Ю., Ананьина Ю.В., Янковский Н.К., Даниленко В.Н., Ботина С.Г., Аверина O.K., Зинченко В.В., Карбышева Е.А., Харитонов В.Д., Семенихина В.Ф., Рожкова И.В., Будрик В.Г., Синеокий С.П., Туркин А.И., Иванова Я.В. // Методические указания,- М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора,- 2010,- 104 с. (утверждено лабораторным советом Роспотребнадзора 18.06.2010).

21.Лахтин В.М. Блочный анализ белков пробиотических грамположительных бактерий в комбинированных средах/ Лахтин В.М., Алешкин В.А., Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Черепанова Ю.В., Криворучко Е.В., Поспелова В.В.// Сб. тезисов Всероссийской НПК «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств и профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 9-10 ноября 2010, Москва, С. 66.

22.Лахтин M.B. Карты протеома культуральных жидкостей производственных штаммов пробиотических бактерий человека/ Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В., Лахтин В.М., Алешкин A.B., Криворучко Е.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.// Сб. материалов науч-практ. школы-конф. мол. ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 31 мая-2 июня 2011, п. Оболенск, Моск.обл. - С.287-290.

23.Лахтин М.В. Белковый состав в сочетании с экзополисахаридами культуральных жидкостей бифидобактерий человека/ Лахтин М.В., Лахтин В.М., Черепанова Ю.В., Алешкин A.B., Криворучко Е.В., Агапова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.// Сб. материалов науч-практ. школы-конф. мол. ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности»,31 мая-2 июня 2011, ФГУН ГНЦ ПМБ, п.Оболенск, Моск.обл. - С. 284 - 287.

24.Лахтин М.В. Ранжирование качеств производственных ингредиентных пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл человека для прогнозирования новых пробиотических формул/ Лахтин М.В., Лахтин В.М., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.// В сб. материалов международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии», г. Ставрополь, 21-23 июня, 2011.-С. 49-51.

25.Лахтин М.В. Оценка деградации бактериальных препаратов с помощью двухпараметровой рН-метрии и электрофореза на примере пробиотических бифидобактерий и лактобацилл человека/ Лахтин М.В., Лахтин В.М., Криворучко Е.В., Черепанова Ю.В., Агапова Ю.В., Алешкин A.B., Поспелова В.В., Афанасьев C.C.II В сб. материалов международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии», г. Ставрополь, 21-23 июня, 2011. - С. 51-52.

26.Лахтин В.М. Преимущества пробиотического консорциума «Ацилакт» в сравнении с ингредиентными штаммами с использованием алгоритма ранжирования качеств/ Лахтин В.М., Лахтин М.В., Агапова Ю.В., Беликова Ю.В., Кулакова Ю.В., Афанасьев С.С., Алешкин Q.A.II Materialy VIII Mi^dzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Naukowa przestrzeñ Europy - 2012», Przemysl, Vol. 32. - P. 50-57.

27.Лахтии М.В. Экзополимеры пробиотических лактобацилл и бифидобактерий (новые подходы и свойства)/ Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин A.B., Афанасьев С.С., Кулакова Ю.В., Беликова Е.В.,

Агапова Ю.В.// Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2012. - № 5. (т. 87 часть 1). - С.257-261.

Изобретения

28. Патент RU 2393214 С1, МПК C12N 1/20, А61К 35/74, С12Р3700, Заявка № 2009102950/13 от 29.01.2009; опубликовано 27.06.2010, бюлл № 18/ Иммунобиологическое противоаллергическое средство (вариантов), штамм Lactobacillus acidophilus NKJC, штамм Lactobacillus acidophilus JCH, Lactobacillus acidophilus КАА/ Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Амерханова A.M., Куяров А.В., Рубальский О.В., Ульянова Л.П., Алешкин А.В., Волкова Е.В., Лахтин М.В., Ахминеева А.Х., Рубальский Е.О., Куяров А.А., Афанасьев М.С., Афанасьев Д.С.

29.3аявки на изобретение № 2012112390/ Способ получения лектинов, обладающих противокандидной активностью / Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Кулакова Ю.В.

Диссертация посвящена памяти моего учителя, известного российского ученого, основателя направления исследований по созданию и использованию в практическом здравоохранении поликомпонентных пробиотических препаратов - профессору Поспеловой Веронике Владимировне.

Список сокращений

ГФ - Государственная Фармакопея

КД-5С - среда казеиново-дрожжевая с солями

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующая единица

МУ - методические указания

СН - супернатант

УФ — ультрафильтрат

рН - водородный показатель

Напечатано в Типографии на Брестской ООО "СТК-пресс", 121059, г. Москва, ул. Киевская д. 8, ИНН: 7730513833 КПП: 773001001 Подписано в печать «05» февраля 2013г. Формата А5 (148x210мм)

Тираж 100 экз. Заказ № 197 от 05.02.13