Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта"
На правах рукописи 005053197
ЧЕРВИНЕЦ Юлия Вячеславовна
СИМБИОТИЧЕСКИЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЛАКТОБАЦИЛЛ И МИКРООРГАНИЗМОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
03.02.03 — микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
1 1 0КТ 2012
Москва — 2012
005053197
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тверская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социальною развития Российской Федерации.
Научные консультанты: доктор биологических наук,
профессор Даниленко Валерий Николаевич
доктор медицинских наук,
профессор Миронов Андрей Юрьевич
Официальные оппоненты: Митрохин Сергей Дмитриевич доктор медицинских наук, профессор,
главный научный сотрудник лаборатории биологии бифидобактерий «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора Мавзютов Айрат Радикович доктор медицинских наук, профессор, зав.
кафедрой фундаментальной и клинической микробиологии ГБОУ ВПО Башкирского ГМУ Минздравсоцразвития России Ряпис Леонид Абрамович доктор медицинских наук, профессор,
профессор кафедры эпидемиологии и доказательной медицины ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова Минздравсоцразвития России.
Защита состоится «§3» _2012 года в 14.00 на за-
седании диссертационного совета Д.208.040.08 в ГБОУ ВПО Первом Московском государственном медицинском университете им. И. М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, Трубецкая ул., 8, строение 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49).
Автореферат разослан «_»_2012 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д.208.040.08
доктор медицинских наук, профессор Миронов Авдрей Юрьевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Воспалительные и эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают одно из первых мест во всем мире (Ряпис Л. А., 2012). Большинство этих болезней протекают на фоне дисбиоза пищевода, желудка, 12-перстной кишки, тонкого и толстого кишечника (Бондаренко В. М., 2007; Иванова Т. Н., 2007). В настоящее время для коррекции нарушенного микробиоценоза (дисбактериоза, дисбиоза) применяют препараты-пробиотики, проявляющие свой лечебный и профилактический эффекты через регуляцию нормальной микрофлоры организма хозяина (Нилова Л. Ю., 2008; Амерханова, А. М., 2009; Алеш-кин А. В., 2011; Давыдкин В. Ю., 2011; Митрохин С.Д., 2008; 8т1ип Б., 2010). Наиболее распространенным подходом в терапии дисбиоза является «метод вытеснения», основанный на применении больших доз лечебных антибактериальных препаратов. Клинико-экспериментальные работы по бактериотерапии дисбактериозов показали, что лучший эффект достигается при индивидуальном подборе донорских штаммов, либо при использовании аутофлоры (Ермоленко Е. И., 2009). Разрабатываемые новые штаммы микроорганизмов из ЖКТ здоровых людей должны расширить и улучшить функциональные характеристики выпускаемых в настоящее время препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения социально-значимых заболеваний, сопровождающихся дисбиозом ЖКТ (Жиленкова О. Г., 2011).
Коммерциализация новых пробиотиков составляет от 2 до 23 %, однако анализ данных свидетельствует о новизне получаемых исследователями результатов, которые сопоставимы с долей получаемых прав на интеллектуальную собственность. Практически все получаемые научные результаты по выделению новых штаммов пробиотиков обладают новизной и рассматриваются как перспективный коммерческий продукт. Несмотря на то, что указанные микроорганизмы используются в качестве пробиотиков, их биосовместимость с другими пробиотическими препаратами, чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам оставляют желать лучшего. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежный исследований можно сделать вывод, что доля интеллектуальной и прикладной продукции новых пробиотиков будет увеличиваться (Корниенко Е. А., 2007; Парфенов А. И., 2009; Чер-нин В. В., 2011; ЗасЫ-А., 2009; 81ашаЮуа I. У,20Ю;. Создание, изучение и испытание относительно дешевых пробиотических препаратов представляется крайне перспективным и экономически выгодным направлением для профилактики и терапии социально значимых заболеваний.
Показано, что организм взрослого человека состоит примерно из 1013 клеток, в то время как в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 10|4-1015, а при некоторых патологических состояниях — до 1017 клеток микроорганизмов (Шендеров Б. А., 2003, 2005). Микробиота (совокупность микроорганизмов) человека активно участвует в жизнедеятельности человека (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Несмотря на обилие информации, на данный момент нет точных данных, описывающих качественные и количественные симбиотические взаимоотношения между представителями нормофлоры (лакгобацилами), а также условно-патогенными и патогенными микроорганизмами ЖКТ.
Микробиота человека интенсивно изучается (http://nihroadmap.nih.gov/ hmp/). В рамках Human Microbiome Project определена полная нуклеотид-ная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. Работа по определению полной нуклеотидной последовательности генома еще 54 штаммов 22 видов лактобацилл ведется, но еще не завершена (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Последние научные данные указывают на специфичность видового состава кишечной микрофлоры, как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения. Такие исследования проводятся и в Институте общей генетики им Н.И. Вавилова РАН (http://www.vigg.ru/, http://www.rnnbs.ru/).
Наиболее перспективными препаратами пробиотиками являются лак-тобациллы, представители нормальной микрофлоры, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, способные синтезировать ряд антибиотикоподобных веществ, таких как органические кислоты (молочную кислоту), перекись водорода, мурамидазу, бактериоцины, микроцины (Бондаренко В. М., 2010). Симбиоз лактобацилл с микроорганизмами осуществляется при формировании единой генетической системы, биоплёнки, определяющей пищевые, энергетические и другие связи между собой и внешним миром по типу «QS», «социального поведения микроорганизмов». В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов, обеспечивающих симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами ЖКТ, а также пробиоти-ческими штаммами. Это позволит выделить наиболее антагонистически активные штаммы лактобацилл, которые можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов.
Цель исследования — выделить антагонистически активные штаммы лактобацилл от здоровых людей, определить их симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами пищеварительного тракта, а также про-биотическими штаммами, и установить механизм пробиотического действия лактобацилл.
Задачи исследования
1. Выделить и идентифицировать представителей нормофлоры, патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта от здоровых людей различных возрастных групп, а также больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ.
2. Выделить и идентифицировать лактобациллы из полости рта, желудка, двенадцатиперстной кишки и толстого кишечника здоровых людей различных возрастных групп.
3. Отобрать высокоантагонистические штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей для создания новых пробиотиков.
4. Определить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами нормофлоры пищеварительного тракта.
5. Изучить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с представителями патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта.
6. Установить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с проби-отическими штаммами микроорганизмов (лактобацилл, бифидобак-терий).
7. Выяснить механизм пробиотического действия лактобацилл.
8. Определить генетические маркеры антагонистической активности лактобацилл.
9. В эксперименте на животных выявить антагонистическую активность лактобацилл в отношении сальмонелл.
Научная новизна
Новизна работы заключается в выделении из пищеварительного тракта здоровых людей новых штаммов лактобацилл, обладающих высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антибактериальным препаратам, биосовместимостью с применяемымив настоящее время другими препаратами-пробиотиками.
Лактобациллы, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой микрофлоре ЖКТ.
Показано, что механизм формирования пробиотической активности лактобацилл складывается из совместного действия пробиотического и адаптационного потенциала.
Полученные данные о симбиотических взаимоотношениях лактобацилл с микрофлорой пищеварительного тракта в составе биопленок могут быть использованы для создания перспективных пробиотических препаратов, что позволит практическому врачу оптимизировать лечение заболеваний ЖКТ.
Теоретическая значимость
Лактобациллы, выделенные из определенного биотопа, более активно подавляют патогенную и условно-патогенную микрофлору пищеварительного тракта того же локуса.
Генетическими методами исследования подтверждено, что наличие генов, ответственных за синтез бактериоцинов у лактобацилл, в значительной степени обуславливающих проявление антагонистической активности, не всегда коррелирует с бактериоциногенностью бактерий, выявленной культур ал ьным методом.
Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях лактобацилл с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, заселяющими пищеварительный тракт человека, начиная с полости рта, заканчивая кишечником. Эти материалы могут лечь в основу изучения механизмов формирования симбиотических отношений между различными родами и видами микроорганизмов.
Практическая значимость
Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии, № госрегистрации 01.2.006.06352.
Получены 2 патента РФ на изобретение: № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника» и № 2400174 от 27 сентября 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний па-родонта»; поданы 2 заявки на изобретение: «Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» № 2012105262 от 16.02.2012 и «Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» №2012105265 от 16.02.2012.
В государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотреб-надзора депонировано 19 штаммов и 2 штамма лактобацилл депонировано во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Эти штаммы можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов, обладающих широким спектром антимикробной активности и адаптированных к организму человека.
Внедрение в практику
Поданы две заявки о выдачи патента РФ на изобретение в Федеральную службу по интеллектуальной собственности ФГБУ Федерального института промышленной собственности:
1. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ B-ll 154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки — 2012105262 от 16.02.2012.
2. Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 3 8к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки — 2012105265 от 16.02.2012. Получены 2 патента РФ на изобретение:
1. № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолити-ческой активности микроорганизмов при экспресс диагностике дис-бактериоза кишечника»;
2. № 2400174 Бюл.№ 27,27.09 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта».
В государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотреб-надзора депонировано 19 штаммов.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии, а также в работе бактериологической лаборатории НИЦ ГБОУ ВПО Тверской ГМА Мин-здравсоцразвития России. Получен акт о внедрении материалов диссертации в учебный процесс и научную работу кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.
Апробация работы
Результаты исследования доложены: на международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И. И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного научного общества иммунологов, 2009 г. в виде стендового доклада; на V съезде Общества биотехнологов России и Всероссийском совещании работников биотехнологической отрасли промышленности, Москва 2—4 декабря, 2008 г. в виде стендового доклада; на XV Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии» 17—19 мая 2010 гг. Санкт-Петербург, в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференции «Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта», Тверь, 8 апреля, 2011 г. в виде устного доклада; на межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы рефлюкс-эзофагита и язвенной болезни», 20 апреля 2012 г., Тверь, в виде устного доклада.
Положения, выносимые на защиту
1. Выделенные и идентифицированные штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей обладают выраженным адаптационным потенциалом.
2. Выделенные штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия, не подавляют метаболизма и размножения би-фидобактерий, а также практически не влияют на рост нормофлоры ЖКТ.
3. Выделенные штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ, а также вакцинным полиовирусным штаммам Сэбина 1, 2 и 3 типов.
4. Механизм пробиотического действия выделенных штаммов лактобацилл связан с продукцией молочной кислоты и полипептидных фракций, обладающих избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.
5. Выявлена антагонистическая активность лактобацилл в отношении сальмонелл в эксперименте на животных и показана положительная динамика регенерации пораженных органов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 — «микробиология». Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта микробиологии.
Личный вклад
Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Вклад автора является определяющим и в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и докладах.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях: в 21 статье, втом числе, в 17 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из 397 наименований, в том числе, 270 зарубежных и 127 отечественных работ. Диссертация изложена на 364 страницах текста, содержит 134 рисунка, 149 таблиц, 1 схему и 5 приложений.
Автор выражает искреннюю признательность научным консультантам профессору, д-ру биол. наук Валерию Николаевичу Даниленко и профессору, д-ру мед. наук Андрею Юрьевичу Миронову за понимание и всемерную поддержку в выполнении работы. Сердечно признательна сотрудникам отдела генетических основ биотехнологии Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и лично д-ру биол. наук Елене Улъриховне Полуэктовой за научные консультации и ценные рекомендации. Искренне благодарна д-ру мед. наук, зав. кафедрой патологической анатомии ТГМА Вячеславу Михайловичу Курицыну за неоценимую помощь и советы при работе над диссертацией. Отдельную признательность автор выражает зав. кафедрой биотехнологии ТГУ проф. Эсфирь Михайловне Сулъман и д-ру биол. наук Александру Ивановичу Сидорову за плодотворное сотрудничество. Огромную благодарность приношу администрации ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития РФ, коллективу кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии Тверской ГМА за практическую помощь в выполнении данной работы. Благодарю своих друзей, родных и родителей за понимание, терпение и моральную поддержку.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования служило содержимое зубодесневых карманов, зубной налет, соскоб со слизистой оболочки щек, языка, био-птаты слизистой оболочки пищевода, желудка, 12 п. кишки, фекалии 600 здоровых людей разных возрастных групп и больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ (1-я группа — дети в возрасте до 8 лет, 2-я группа — дети от 10 до 14 лет, 3-я группа — от 20 до 35 лет, 4-я группа — старше 80 лет; мужчин — 240, женщин — 360). Все здоровые люди на момент обследования были клинически здоровы, не имели в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний ЖКТ.
Настоящая работа является одномоментным поперечным исследованием. У всех лиц получено информированное согласие на сбор материала.
Критерием включения для практически здоровых лиц является отсутствие: острых заболеваний, очагов гнойно-воспалительных инфекций, сахарного диабета, онкопатологии, первичного и вторичного иммунодефицита; улиц с хроническими заболеваниями старше 50 лет отсутствие обострений и стадии функциональных нарушений.
Критерием включения для лиц с патологией ЖКТ является наличие: ГЭРБ с явлениями эзофагита, хронического активного гастрита, дуоденита, язвенной болезни желудка и 12 п. кишки; диагнозы верифицированы эндоскопическим и гистологическим исследованием.
Количество выделенных клинических штаммов микроорганизмов составило: Lactobacillus spp. — 203, Micrococcus spp. — 9, Bacteroides spp. — 14, Enterococcus spp. — 6, Streptococcus spp. — 25, Staphylococcus spp. — 33, Sarcina spp. — 8, Lactococcus spp. — 2, Corynebacterium spp. — 5, Neisseria spp. — 6, Veillonella spp. — 6, Actinomyces spp. — 34, Escherichia spp. — 8, Serratia spp. — 3, Gemella spp. — 2, Eubacterium spp. — 13, Bifidobacterium spp. — 21, Clostridium spp. — 5, Propionibacterium spp. — 2, H. pylori — 6, Bacillus spp. — 13, Klebsiella spp. — 2, Proteus spp. — 18, Candida spp. — 46, Cryptococcus spp. — 2, Pseudomonas spp. — 18, Salmonella spp. — 5, Shigella spp. — 3, Enterobacter spp. — 5, Campylobacter spp. — 4, Citrobacter spp. — 3, Acinetobacter spp. — 3, Moraxella spp. — 2, Leptotrichia spp. — 2, Fusobacterium spp. — 4, Prevotella spp. — 4, Peptostreptococcus spp. — 5, Peptococcus spp. — 4.
Индикаторные культуры: производственные штаммы L. plantarum 8RA-3 и В. subtilis 534 из международных коллекций Государственного музея нормальной микрофлоры человека ФГУН им. Г. Н. Габричевского; С. albicans АТСС 885-653, S. typhimurium 415, S. sonnei I фазы 941 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; Е. coli АТСС 25922, S. aureus 209, Р. aeruginosa АТСС 9027, В. catenulatum 20103, В. breve 20213, В. bifidum 20239, В. bifidum LBA-3, В. bifidum 791, В. pseudocatenulatum 2, В. longum В379М, В. longum 2С, L. acidophilus (helveticus ТШ) NK1 и L. amylovorus БТ-24/88 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. JI. А. Тарасеви-ча, а также полиовирусные штаммы Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученные в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Питательные среды, условия роста и хранение культур микроорганизмов. Для комплексного изучения аэробной и анаэробной микрофлоры посевы производили на отечественные, и на импортные питательные среды, включающие: желточно-солевой агар (г. Оболенск), МакКонки агар (BBL®), Колумбиа агар (BBL®, "Himedia"), Эритрит агар (ФГУП НПО «Микроген», Москва), Sabouraud Dextrose Agar (BBL®), MRS Agar (BBL®), Schaedler Agar (BBL®) с кровью, Muller-Hinton II агар (BBL®), хромогенные питательные среды ("Himedia"). Посевы культивировали в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях с использованием микроанаэростатов (BBL) и газогенераторных пакетов Gas Pack Plus (BBL) в течение 24—72 часов при температуре 37 ° С. Культуры длительно хранили в криопробирках на ТСБ (TSB: Difco Laboratories, Detroit, Mich.) с 15 % глицерина в морозильной камере при температуре -20 °С.
Диски с антибиотиками. В работе использованы диски с антибиотиками производства «Himedia» Laboratories Pvt., Индия.
Тест-системы, рекомендованные Роспотребнадзором для идентификации микроорганизмов: Enterotube II, Oxi/Ferm Tube II и Mycotube (BBL), а также api® 20 STREP, api® 20 A, api® Staph, api® CAMPY, api® 50 CH, api® Coryne и api® NH (bioMerieux Vitek, Inc.).
Для определения противовирусной активности суспензий и суперна-тантов бульонных культур лактобацилл использовали полиовирусные штаммы Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученные в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Для определения антагонистической активности лактобацилл в эксперименте in vivo использованы 30 половозрелых белых лабораторных крыс самцов линии Вистар массой тела 180 г. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Все животные содержались при сходных условиях в отношении температуры, влажности и освещения, а также рациона питания (комбикорм ПК-120-1, Россия). На проведение экспериментов было получено разрешение этического комитета ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздравсоцразвития России (протокол от 30.05.2011 г.).
Методы исследований
Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов, выделенных из разных биотопов пищеварительного тракта, про под ил и на базе бактериологической лаборатории НИЦ Тверской ГМА по общепринятым методикам, а также используя новые методы исследования (Бондаренко В. М., 2004).
Генетическую идентификацию лактобацилл проводили по стандартному методу с использованием нуклеотидной последовательности гена 16S РНК на базе Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН (Москва). Для исследования генов, ответственных за продукцию бакте-риоцинов, у выделенных штаммов лактобацилл использована ПЦР и специфические праймерыдля генов L. plantarum (для генов пребактериоци-нов plnEF, plnJ, plNC8, а также для гена plnN, предположительно являющегося пребактериоцином) и L. rhamnosus (генов пребактериоцинов LGG_02380 и LGG_02400).
Первичное изучение антагонизма у лактобацилл проводили (Блинко-ва JI. П., 2003) с помощью метода перпендикулярных штрихов по отношению к индикаторным культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов: Candida albicans АТСС 885-653, Salmonella typhimurium 415, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtilis 534 из коллекции музейных культур НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН г. Москва; Escherichia coli
25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus 209 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. JI. А. Тарасевича. Антагонистическую способность лактобацилл (продукция бактериоцинов) определяли методом двухслойного агара или отсроченного антагонизма (Блинкова JI. П., 1986, Баженов JI. Г., 1997). Антимикробную активность супернатантов лактобацилл, содержащих бактериоциноподобнъге вещества, изучали методом диффузии в агар и путем определения оптической плотности.
Активность кислотообразования у лактобацилл определяли титромет-рическим методом (Лянная А. М., Гончарова Г. И., 1975). Адгезивную активность лактобацилл определяли, пользуясь средним показателем адгезии (СПА) по методу Брилис В. И. (1986) на эритроцитах человека О (I) группы Rh+. Аутоагрегация и поверхностная гидрофобность лактобацилл определялась методом A. Andreu et al. (1995). Способность лактобацилл к коаггрегации определялась методом G. Reid et al. (1990). Тестирование лактобацилл на способность формировать биопленки проводили в стерильных пластиковых чашках Петри со стеклышками по методике, описанной Романовой Ю. М., 2006. Биосовместимость исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактериями определялась методом совместного культивирования на плотной питательной среде (Глушанова Н. А., 1999).
Отношение лактобацилл к антибиотикам и химиопрепаратам определялась методом диффузии в агар на среде Muller-Hinton 2 в соответствие с методиками, рекомендованными фирмой «Himedia» (www.himedialabs.ru).
Ферменты патогенности микроорганизмов (лецитиназную, казеино-литическую, уреазную, желатиназную, нуклеазную, катал аз ную, гемолитическую, антилизоцимную активности), а также цитотоксичность определяли по стандартным методикам (Мавзютов А. Р., 2007; Агапова О. В., 1999; Червинец В. М., 2002; Никитин В. М., 1986).
Определение экзометаболитов лактобацилл осуществляли хромато-масс-спектрометрическим методом на системе «Dionex UltiMate3000-API 2000» (Лебедев А. Т., 2003; Vicki Н. W., 2005). Анализ фракций, пептидов лактобацилл, изолированных хромато-масс-спектрометрическим методом, проводился методом капиллярного зонного электрофореза на системе «КАПЕЛЬ-105» (Комарова Н. В., 2006).
Для определения активности штаммов лактобацлл в отношении вирусов проведена реакция нейтрализации в перевиваемой линии ткани Нер-2 (Cincinnati) эпидермальной карциномы человека, с использованием штаммов полиовирусов Сэбина 1, 2 и 3 типов, полученных в НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН.
Для определения антагонистической активности лактобацилл в эксперименте in vivo животные были разделены на три группы: две экспериментальные (№ 1 и № 2) и одна контрольная группы по 10 крыс в каждой группе. Животным экспериментальной группы № 1 ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в течение 7 дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 108 КОЕ/мл. Животным экспериментальной группы № 2 ежедневно в одно и то же время 3 раза в день per os в течение 2-х дней вводили Salmonella typhimurium в количестве 2 мл 10s КОЕ/ мл, а затем с 3-го дня в течение 5 дней вводили через рот суспензию лактобацилл, Lactobacillus plantarum 38к, по 1 мл 108 КОЕ/мл (ОСМ по McFarland). Животным контрольной группы никаких препаратов не вводили, они находились на обычном рационе питания. Микробиологическое исследование фекалий белых крыс всех 3-х групп проводилось на вторые, пятые и седьмые сутки. Анализ состава и качества микрофлоры проводился стандартными бактериологическими методами. Крыс выводили из эксперимента на восьмые сутки передозировкой диэтилового эфира с соблюдением принципов эвтаназии (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755). Забирали кусочки подвздошной кишки, печени, поджелудочной железы и надпочечника. Кусочки органов фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-7 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином.
Данные экспериментов обрабатывались с помощью прикладной программы «STATISTICA» (Stat Soft Russia) и «Excel». Сравнение групп микроорганизмов проводилось методом параметрической статистики по критерию Шапиро-Уилка и непараметрическими методами с использованием дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. АДАПТАЦИОННЫЙ И ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
ЛАКТОБАЦИЛЛ 1. Выделение и идентификация лактобацилл
Для отбора антагонистически активных культур изучено 203 штамма лактобацилл, выделенных из полости рта, желудка и толстого кишечника здоровых людей 3-х возрастных групп (1-я группа — дети в возрасте до 8 лет, 2-я группа — дети от 10 до 14 лет, 3-я группа — от 25 до 35 лет; мужчин — 240, женщин — 360). Изучались культуральные, морфологические, тинкториальньте, биохимические свойства, факторы патогенности, антагонистическая активность, геном и чувствительность к антимикробным химиотерапевтическим препаратам.
При исследовании этих штаммов лактобацилл на наличие каталазной активности, микробных протеаз (казеиназа и желатиназа), нуклеазной активности (ДНК-аза и РНК-аза), гемолитической, антилизоцимной и ле-цитиназной активности выявлено отсутствие указанных фенотипических признаков, ассоциированных с синтезом ферментов агрессии.
Оказалось, что лактобациллы проявляют чувствительность в 100 % к тетрациклину, 93,4 % — к гентамицину, эритромицину, рифампицину и меропенему, 86,2 % — к линезолиду, стрептомицину и ампициллину, 75,4 % — к фурадонину, левомицетину и доксициклину, 66,9 % — к бен-зилпенициллину, 33,9 % — к ципрофлоксацину, 14,3 % — к ванкомици-ну, 6,4 % — к левофлоксацину. К раствору Люголя оказались чувствительны 100 % исследуемых лактобацилл, к метиленовой сини — 60,1 %, к 0,5 % раствору диоксидина — 30,5 %, к хитозану — 15,3 %. К раствору димексида все штаммы лактобацилл показали 100% резистентность.
Установлено, что резистентность к антибиотикам генотипически связана с островками патогенности микроорганизмов (Бондаренко В. М., 2011). Высокая чувствительность выделенных нами лактобацилл к вышеперечисленным антибиотикам и химиопрепаратам свидетельствует об отсутствии генов антибиотикорезистентности у данных штаммов. Таким образом, исследуемые лактобациллы являются безопасными в применении, т. к. они не могут участвовать в формировании лекарственной устойчивости у нормальной микрофлоры ЖКТ.
В результате определения антагонистической активности штаммов лактобацилл методом перпендикулярных штрихов отобрано 20 антагонистически активных лактобацилл, проявивших антагонизм ко всем индикаторным культурам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Штаммы не подвергались генно-инженерным воздействиям.
В результате биохимической идентификации с помощью тест системы api® 50 СН (bio Mérieux) и программного обеспечения API WEB по 50 параметрам выявлено, что из 10 изолятов лактобацилл, выделенных из полости рта, 2 принадлежат к виду L. fermentum, 3 — к L. plantarum, 5 — к L. rhamnosus; из 4-х изолятов лактобацилл, выделенных из желудка, 2 принадлежат к виду L. plantarum, 2 — к L. rhamnosus; из 6 изолятов лактобацилл, выделенных из кишечника, 4 принадлежат к виду L. plantarum, 2 — к L. rhamnosus.
В результате генетической идентификации по гену 16S РНК выявлено, что из 10 изолятов лактобацилл, выделенных из полости рта, 5 принадлежат к виду L. fermentum, 4 — к L. rhamnosus, 1 — к L. plantarum, из 4 изолятов лактобацилл, выделенных из желудка, 3 принадлежат к виду к L. rhamnosus, 1 — к L. plantarum,; из 6 изолятов лактобацилл, выделен-
ных из кишечника, 3 принадлежат к виду Ь. р1агПагит, 2 — к Ь. Лашповив и 1 — к Ь. сазеи
Анализ данных, полученных после биохимической и генетической идентификации лактобацилл, показал, что в 70% случаях, подтверждена видовая принадлежность, определенная по биохимическим тестам (табл. 1). В 30 %, генетическое исследование изменило их видовую принадлежность: Ь. р1аМагиш 11 зв. на Ь. АегтепШт 11 зв., Ь. гИаптовш 291 на Ь. {егтеШит 291, Ь. рагасаве! 50 зв. на Ь. гЬатповш 50 зв., Ь. Гегтепшт 1 ж. на Ь. р1аМагит 1 ж., Ь. ГегтепШт 2 ж. на Ь. гЬатпоБШ 2 ж., Ь. р1ап1агит 17 к. на Ь. сазе1 17 к.
Таблица 1
Идентификация лактобацилл
№ Название биотопа Результаты биохимической идентификации по тест-системе api 50 СН "bio Mérieux" Результаты генетической идентификации, основанные на исследовании гена 168 РНК
1. Полость рта L.fermentum 2пр. L.fermentum 2пр.
2. L.fermentum 11 д.ст. L.fermentum 11 д.ст.
3. L.plantarum 11 зв. ^^ятпетитп 11 зв.
4. L.fermentum 39 зв. L.fermentum 39 зв.
5. L. rhamriGS«s 291 L,ffermentu.m 291
6. L.plantamm 106 зв. L.plantarum 106 зв.
7. L.rhamnosus 7 д.ст. L.rhamnosus 7 д.ст.
8. L.rhamnosus 24 д. ст. L.rhamnosus 24 д. ст.
9. L. paracaséí 50 зв. L.rhaшт)Qsus 50 зв.
10. L.rhamnosus 72 зв. L.rhamnosus 72 зв.
11. Желудок L. fermertum 1 ж. L.plar¡ta1Пlra 1 ж.
12. L. fermentara 2 ж. £, йштпжш 2 ж.
13. L.rhamnosus 3 ж. L.rhamnosus 3 ж.
14. L.rhamnosus 4 ж. L.rhamnosus 4 ж.
15. Кишечник L.plantarum 46 к. L.plantarum 46 к.
16. L.plantarum 36 ст. L.plantarum 36 ст.
17. L.rhamnosus 38 к. L.rhamnosus 38 к.
18. L. plantaram 17 к. 17 к.
19. L.rhamnosus 32 к. L.rhamnosus 32 к.
20. L. plantaran K9 L L. р1аШагит К9 L
Из полости рта (табл. 2) выделены 2 антагонистически активных штамма лактобацилл, Ь. гЬатпояш и Ь. ГегтепШш, от здоровых детей в возрасте до 8 лет; 2 штамма, Ь. гИашпохш и Ь. ГегтепШт, от здоровых детей в возрасте от 10 до 14 лет; 6 штаммов, 1_. р1апГатш, Ь. гИатповш и Ь. ГегтеМит, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет. Из желудка выделены 4 антагонистически активных штамма лактобацилл, Ь. гЬатпозш и Ь. р1атагит, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет.
Таблица 2
Видовой состав индигенных штаммов лактобацилл четырех возрастных групп, выделенных из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей
Количество штаммов
Вид Полость рта Желудок Кишечник
микроорганизма группа группа группа
I Т1 III I II III I II III
Ь. р1атиагитп 1 1 1 2
Ь. Лашповш 1 1 2 3 1 1
Ь. ГегтепШт 1 1 3
Ь. саяе! 1
Из кишечника выделены 3 антагонистически активных штамма лактобацилл, Ь. р1агЛагит, Ь. гЬатповш и Ь. саве!, от здоровых детей в возрасте от 10 до 14 лет; 3 штамма, Ь. р1аташт и Ь. гЬатповш, от здоровых людей в возрасте от 20 до 35 лет.
2. Адгезивная способность лактобацилл
При исследовании адгезивной способности 20 антагонистически активных штаммов лактобацилл (рис. 1), выделенных из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей выявлено, что средний показатель адгезии лактобацилл полости рта колебался от 3,44 до 6,08 и в среднем составил 3,8±0,99. Средний показатель адгезии лактобацилл желудка колебался от 2,48 до 3,24 и в среднем составил 3,0+0,32. Средний Рис. 1. Адгезия лактобацилл на эритро- показатель адгезии лактобацилл ки-цитах человека 0 (I) группы ЮИ- шечника колебался от 2,12 до 4,52 и
в среднем составил 3,87+1,02. Таким образом, лактобациллы имели среднее значение адгезивности.
3. Способность лактобацилл к аутоагрегации
Исследование аутоагрегации лактобацилл (рис. 2) показало, что антагонистически активные штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, обладали средней (5 штаммов: Ъ. ГегтепШт 2пр., Ь. ГегтепШт 291, Ь. р1агЦагат 106 зв., Ь. гЬатпошв 50 зв. и Ь. гИашповш 72 зв.) и высокой аутоагрегацией (5 штаммов: Ь. fermentum 11 д.ст., Ь. 1егтепшт 11 зв., Ь. ГегтепШт 39 зв., Т. гЬатповш 7 д.ст. и Ь. гЬатпояив 24 д. ст.). Все лактобациллы, выделенные из желудка, обладали средней способностью к аутоагрегации. Из 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника, только 1 обладал высокой аутоагрегацией (Ь. гИатповш 38 к.), остальные — средней. Таким образом, лактобациллы, выделенные из полости рта имели более высокие показатели аутоагрегации, чем лактобациллы желудка и кишечника.
4. Поверхностная гидрофобность лактобацилл
Определение поверхностной гидрофобности лактобацилл показало, что, антагонистически активные штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, обладали средней (Ь. 1Ъгтеп1:ит 291, Ь. р1аМагит 106 зв., Ь. гЬатпозш 50 зв. и Ь. гИашпокиз 72 зв.) и высокой поверхностной гид-рофобностью (Ь. fermentum 2пр., Ь. ГегтепШт 11 д.ст., Ь. ГегшеШиш 11 зв., Ь. fermentum 39 зв., Ь. гЬатпошз 7 д.ст. и Ь. гИашповш 24 д. ст.). Только один штамм лактобацилл (Ь. гИатпозш 2 ж.), выделенный из желудка, обладал высокой поверхностной гидрофобностью, остальные — средней. Из 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника, четыре обладали высокой поверхностной гидрофобностью (Ь. р1ап1агит 46 к., [_. р!ап1ашт 36 ст., Ь. саяе1 17 к., Ь. гЬагтиюшз 32 к.), а два, Ь. гЬатповш 38 к. и Ь. рктагиш К9 Ь— средней. Установлено, что лактобациллы, выделенные из полости рта и кишечника, в основном обладали более высокой поверхностной гидрофобностью, чем лактобациллы желудка.
5. Способность лактобацилл к коагрегации
Все лактобациллы, выделенные из полости рта, Ь. ГегтепШт 291, Ь. р1ап1агаш 106 зв., Ь. гЪатпозш 50 зв. и Ь. ЛашпоБив 72 зв., Ь. ferrnentum
А-
Щфх ■ ' \ ■ 4 „
Ж/ '
л
г.. ч/ V % 4
ус * щт : ....
Рис. 2. Аутоагрегация лактобацилл (увеличение 1x1000)
2пр., L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв,, L. rhamnosus 7 д.ст. и L. rhamnosus 24 д. ст., образовывали коагрегаты с двумя из 8 индикаторных штаммов, В. subtilis 537 и В. subtilis 6633. Только 60 % штаммов лакгобацилл полости рта образовывали коагрегаты с С. albicans 531 и P. aeruginosa АТСС 9027. Половина исследуемых штаммов коагрегировала с S. aureus 209 и Е. coli АТСС 25922 (рис. 3). Оставшиеся 30 % штаммов лактобацилл полости рта коагрегирова-ли с S. flexneri 26 и S. typhimurium 11. Все лакгобациллы, выделенные из желудка, L. plantarum 1ж., L. rhamnosus 2 ж., L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., образовывали коагрегаты с 5 штаммами микроорганизмов, S. aureus 209, Е. coli АТСС 25922, С. albicans 531, В. subtilis 537 и В. subtilis 6633. Половина штаммов лактобацилл желудка, L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., коаг-регировали с 3 патогенными микроорганизмами, Р. aeruginosa АТСС 9027, S. flexneri 26 и S. typhimurium 11.
Все лактобациллы, выделенные из кишечника, L. plantarum 46 к., L. plantarum 36 ст., L. casei 17 к., L. rhamnosus 32 к., L. rhamnosus 38 к. и L. plantarum К9 L, образовывали коагрегаты с двумя индикаторными штаммами, В. subtilis 537 и В. subtilis 6633. Только 50% штаммов лактобацилл кишечника коагрегировали с 3 микроорганизмами, S. aureus 209, Е. coli АТСС 25922, С. albicans 531. Ни один из штаммов, выделенный из кишечника, не коагрегировал с Р. aeruginosa АТСС 9027, S. flexneri 26 и S. typhimurium 11.
Выявлено, что в составе агрегатов лактобациллы могут более эффективно проявлять свои антагонистические свойства в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов ЖКТ.
6. Способность лактобацилл к формированию биопленок
При тестировании лактобацилл на способность формировать биопленки обнаружены интенсивно окрашенные спиртовым раствором кристалл виолета биопленки на дне пластиковых чашек Петри и на покровных стеклах (рис. 4).
Подсушенные чашки Петри со стеклами фотографировали цифровой фотокамерой программно-аппаратного комплекса Диаморф Цито. Выявлено, что лактобациллы располагаются скоплениями, тесно прилегающими друг к другу (рис. 5).
Рис. 3. Коагрегация между штаммами Lactobacillus and E.coli (увеличение 1x1000)
"Л"1 -У^зйГ'С < Рис. 5. Биопленка из лактобацилл на чашке (увеличение 1x1000)
Рис. 4. Образование биопленки на чашке и стекле in vitro
Определение оптической плотности (ОП) суспензии клеток лактобацилл показало, что ОП лактобацилл, выделенных из полости рта, образовавших биопленку на пластиковой чашке Петри, на порядок выше (от 0,037 до 0,225), чем на стекле (от 0 до 0,076). У всех лактобацилл, выделенных из желудка, оптическая плотность клеток на пластиковой чашке колебалась от 0,124 до 0,191 и значительно превышала ОП на стекле (ОП на стекле — от 0,033 до 0,063). У кишечных лактобацилл, сформировавших биопленку на пластиковой чашке Петри оптическая плотность клеток (от 0,144 до 0,449) превышала оптическую плотность на стекле (от 0 до 0,056). Установлено, что оптические плотности лактобацилл, выделенные из различных биотопов, формирующих биопленку на пластиковой чашке Петри, значительно превышают оптические плотности лактобацилл на стекле.
7. Способность лактобацилл к кислотообразованию
Исследована активность кислотообразования у 20 штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей, которая характеризовались разной степенью продукции кислоты в зависимости от присутствия глюкозы в качестве питательного субстрата.
При этом четыре штамма лактобацилл, Ь. ГегтепШт 11 зв., Ь гЬатпскш 24 д. ст., Ь. йгатлоБШ 7 д.ст. и Ь. ГеггпепШт 11 д.ст., выделенные из полости рта, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее, причем кислотопродуцирующая способность 2-х из них, Ь. (егтегИит 11 зв., Ь. гИатпошя 24 д. ст., имела большую тенденцию к нарастанию под действием глюкозы к концу 3 суток (102° Т и 78° Т соответственно). Другие три штамма, Ь. гЬатпояш 72 зв., Ь. Гегтепйдт
291 и L. fermentum 39 зв., характеризовались постепенным в течение 2-х суток увеличением образования кислоты с последующим ее снижением на 3-и сутки, как в присутствии, так и в отсутствии глюкозы. У 2-х штаммов, L. rhamnosus 50 зв. и L. fermentum 2пр., только присутствие в питательном субстрате глюкозы стимулировало в течение 3-х суток кислотопродукцию. Только один штамм, L. plantarum 106 зв., характеризовался постепенным увеличением продукции кислоты в течение 3-х суток без добавления глюкозы, а присутствие глюкозы привело к снижению кислотопродуцирующей способности к 3-м суткам. Четыре штамма лактобацилл, L. plantarum 1 ж. и L. rhamnosus 2 ж. L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., выделенные из желудка, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее, причем кислотопродуцирующая способность 2-х из них, L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., имела большую тенденцию к нарастанию под действием глюкозы к 3 суткам (102° Т и 90° Т соответственно). Два штамма лактобацилл, L. plantarum 36 ст. и L. rhamnosus 38 к., выделенные из кишечника, характеризовались постепенным увеличением продукции кислоты, как в присутствии глюкозы, так и без нее. У 3-х штаммов, L. plantarum 46 к., L. casei 17 к. и L. plantarum К9 L, только присутствие в питательном субстрате глюкозы стимулировало в течение 3-х суток кислотопродукцию. Только один штамм, L. rhamnosus 32 к., характеризовался постепенным увеличением продукции кислоты в течение 2-х и 3-х суток без добавления глюкозы, а присутствие глюкозы привело к продукции кислоты только на 3-й сутки. Наибольшей кислотопродуцирующей способностью обладали 2 оральных штамма лактобацилл (L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 24 д. ст.), 2 желудочных (L. rhamnosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж.) и 1 кишечный штамм (L. casei 17 к.).
Лактобациллы характеризовались разной степенью продукции кислоты в зависимости от присутствия глюкозы в качестве питательного субстрата. В течение трех суток происходило закисление среды культивирования, к первым суткам кислотность колебалась от 2 до 52 °Т (в среднем — 24,05 °Т), ко 2 суткам: от 14 до 60 °Т (в среднем — 37,75 °Т) и к 3 суткам: от 26 до 54 °Т (в среднем — 43,5 °Т). После добавлении в среду глюкозы наблюдалось закисление среды к концу первых суток (кислотность — от 2 до 48 °Т, в среднем — 25,6 °Т), ко вторым суткам кислотность (кислотность— от 25 до 92 °Т, в среднем — 44,95 °Т) и к третьим суткам (кислотность — от 12 до 102 °Т, в среднем 51,4 °Т). Таким образом, присутствие глюкозы незначительно стимулировало продукцию молочной кислоты лактобациллами (р<0,05).
8. Способность лактобацилл к синтезу бактериоцинов
При жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии культуральной среды у двух штаммов лактобацилл Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ)
NK1 и Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 выявлены 3 полипептидные фракции с Mr соответственно 228,3 Da, 347,3 Da, 351,6 Da. Определение антагонистической активности полипептидных фракций методом диффузии в агар показало практическое отсутствие антагонистической активности по отношению к грамположительным, грамотрицательным бактериям и грибам рода Candida. По-видимому, это связано с небольшим количеством полипептидов, наносимых на газон исследуемых тестовых кулыур.
При использовании метода высаливания с последующим диализом полипептидов из супернатанта бульонных культур лактобацилл выявлено, что полипептиды ведут себя неоднозначно в отношении индикаторных культур микроорганизмов Staphylococcus aureus АТСС 25923, Bacillus subtilis АТСС 6633, Е. coli АТСС 25922, Shigella sonnei III № 1908, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium 5715, Candida albicans ATCC 885-653.
Полипептиды Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 подавляют рост и размножение только В. subtilis, замедляют в 2 раза размножение S. aureus и S. typhimurium, в 1,5 раза Е. coli, S. sonnei и С. albicans и практически не оказывали влияния на рост и размножение P. aeruginosa. В то же время сам супернатант суточной бульонной культуры подавлял рост и размножение всех индикаторных микроорганизмов.
Полипептиды L. amylovorus БТ-24/88 замедляют в 2 раза рост и размножение S. aureus, С. albicans, в 1,5 раза В. subtilis и практически не оказывали влияния на рост и размножение Е. coli, P. aeruginosa, S. sonnei и S. typhimurium. Супернатант L. amylovorus БТ-24/88 тормозил рост и размножение индикаторных культур Е. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. typhimurium, C. albicans, и в 4 раза задерживал рост и размножение S. sonnei, в 1,5 раза В. subtilis.
Установлено, что полипептидные фракции лактобацилл обладают выраженным избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, по сравнению с супернатантами бульонных культур лактобацилл.
9. Генотипическая способность лактобацилл к синтезу бактериоцинов
Исследованы гены, кодирующие синтез бактериоцинов у лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника и проявляющих выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Использованы специфические прайме-ры для генов L. plantarum (для генов пребактериоцинов plnEF, plnJ, plNC8, а также для гена plnN, предположительно являющегося пребактериоци-ном) и L. rhamnosus (генов пребактериоцинов LGG_02380 и LGG_02400). Проверено наличие 6 генов (табл. 3), синтезирующих предшественники бактериоцинов, у штаммов L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum. Показано, что все проверенные 6 генов являются видоспецифичными.
По наличию (отсутствию) проверенных генов 6 исследованных штаммов Ь. гЬатпозив идентичны. Проверенные штаммы Ь. р1ап1ашш и Ь. гЬатпозш подразделяются на две группы. Штаммы Ь. ркМагиш и Ь. гЬатпозш, проявляющие выраженную и слабую бактериоцинпродуци-рующую активность, не различаются по наличию проверенных генов предшественников бактериоцинов. Наличие генов бактериоциногенно-сти не всегда проявляется фенотипически. Скорее всего, существуют определенные факторы, предрасполагающие экспрессию генов бактериоци-ногенности. Таким образом, наличие выявленных генов не имеет прямую зависимость с синтезом бактериоцинов.
Таблица 3
Наличие генов бактериоцинов в штаммах лактобацилл по данным ПЦР-анализа
Вид и штамм лактобацилл Антагонистическая активность Наличие генов пребактериоцинов
plNC8 plnN plnEF plnJ LGG 02380 LGG 02400
L.fermentum 2лрт + — — - — — -
L.fermentum Идет + — — — - - -
L.fermentum 11зв + - — — — - -
L.fermentum 39зв + — - - — - -
L.fermentum 291ч - - - - - -
L.plantarum Юбзв — + + + — —
L.plantarum 46к + — + + + - -
L.plantarum Збст — — + — — -
L.rhamnosus 7дст + - — — — + +
L.rhamnosus 24дст + - - - — + +
L.rhamnosus 50зв + - - - - + +
L.rhamnosus 72зв - - - - + +
L.rhamnosus 38к + — — - — + +
L.rhamnosus 32к + - - - - + +
+ лактобациллы проявляют высокую антагонистическую активность +(—) лактобациллы проявляют слабую антагонистическую активность
10. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных
Для изучения антагонистической активности лактобацилл in vivo проведено заражение 2-х экспериментальных групп белых крыс штаммом Salmonella typhimurium, с последующим введением второй экспериментальной группе животных суспензии лактобацилл, Lactobacillus plantarum 38к. При гистологическом исследовании у крыс экспериментальной группы № 1 в подвздошной кишке (рис. 7А) определялись отек, выраженное
полнокровие, мелкие петехиалъные кровоизлияния в слизистой оболочке, уменьшение ширины щёточной каёмки цилиндрических клеток, гипертрофия и гиперплазия слизеобразующих бокаловидных клеток, уменьшение числа межэпителиальных лимфоцитов, выраженная лимфогисти-оцитарная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки, с наличием в инфильтрате полинуклеарных лейкоцитов и небольшого количества плазмоцитов. В мышечной оболочке подвздошной кишки выявлялись незначительный отек и умеренное полнокровие. Отмеченные в тонкой кишке изменения характерны для морфологической картины острого инфекционного энтерита, при котором имеет место нарушения процессов гидролизации полисахаридов до моносахаридов, расщепления белков до аминокислот, расщепления жиров с образованием хиломикро-нов и мицелл и всасывания продуктов расщепления цилиндрическими клетками ворсинок слизистой оболочки подвздошной кишки, на что указывает уменьшение ширины их щёточной каёмки.
В свою очередь сальмонеллы приводят к развитию во внутренних органах вторичных реактивных изменений. В печени отмечались паренхиматозная белковая вакуольная дистрофия гепатоцитов (рис. 6А), отек, выраженное полнокровие центральных вен и кровеносных синусоидов (рис. 6В), увеличение в портальных трактах количества лимфоцитов.
В поджелудочной железе выявлялись отек, умеренное полнокровие, атрофия и склероз одних островков Лангерганса и компенсаторная гипертрофия других рядом расположенных. Железистые клетки ацинусов имели зернистую эозинофильную цитоплазму.
В надпочечниках отмечались отек коркового и мозгового слоев, выраженное полнокровие мозгового слоя. В клетках коркового слоя преимущественно в пучковой зоне имела место их делипидизация т. е. клетки теряли липиды, а цитоплазма их становилась оптически пустой.
У крыс экспериментальной группы № 2 после курса применения лак-тобацилл в подвздошной кишке отмечалось положительные изменения на течение острого инфекционного энтерита, которое характеризовалось уменьшением выраженности воспалительных изменений в подвздошной кишке (рис. 7Б), в составе воспалительного инфильтрата не определялись полиморфноядерные лейкоциты, количество межэпителиальных лимфоцитов увеличивалось, щёточная каёмка цилиндрических клеток становилась шире, бокаловидные клетки были небольших размеров, а число их уменьшалось и достигало контрольных значений. Во внутренних органах (в печени, поджелудочной железе, надпочечниках) выраженность реактивных изменений уменьшалась (рис. 6 Б и Г), а морфологическое строение внутренних органов восстанавливалось и было почти таким же, как в контрольной группе.
Ив »жу / !ч .-■•• - , ч-
ЯЗя&п^-"*!?
Рис. 6. Печеночные дольки у крыс экспериментальных групп № 1 и 2. Окраска гемотоксилином и эозином (увеличение х200):
— выраженная вакуольная дистрофия гепатоцитов
— отек и выраженное полнокровие центральных вен и синусовдов печеночных долек
— слабо выраженная вакуолизация гепатоцитов на периферии печеночной дольки
№ 1 А В
№2 Б Г
— уменьшение отека и полнокровия печеночных долек
Рис. 7. Слизистая оболочка подвздошной кишки у крыс экспериментальных
групп № 1 и 2. Окраска гемотоксилином и эозином (увеличение х200): А — группа № 1, в собственной пластинке слизистой оболочки отмечается отек и выраженное полнокровие с единичными петехиальными кровоизлияниями Б — группа № 2, в собственной пластинке слизистой оболочки имеет место уменьшение выраженности отека и полнокровия, петехиальные кровоизлияния не выявлены
Таким образом, у крыс экспериментальной группы № 1 в подвздошной кишке развивался острый инфекционный энтерит, а в печени, поджелудочной железе и надпочечниках — вторичные реактивные изменения. Под влиянием лактобацилл, L. plantarum 38к, у крыс экспериментальной группы № 2 наблюдалось выраженное уменьшение воспалительных изменений в подвздошной кишке и восстановление морфологической картины во внутренних органах.
Микробиологическое исследование фекалий белых крыс показало следующие результаты.
Микрофлора фекалий контрольной группы на 2 сутки эксперимента представлена в основном бактериями семейства Enterobacteriaceae в концентрации 6 lg КОЕ/мл и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. На 5 сутки концентрация этих же микроорганизмов возросла: бактерии семейства Enterobacteriaceae в концентрации 6,5 lg КОЕ/мл и грибами рода Candida в концентрации 6 lg КОЕ/мл. На 7 сутки выделялись бактерии рода Lactobacillus (6,8 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (6,5 lg КОЕ/ мл), а концентрация бактерий семейства Enterobacteriaceae снизилась до 5,9 lg КОЕ/мл. Сальмонеллы в контрольной группе выявлены не были.
Микрофлора фекалий экспериментальной группы № 1 (рис. 8) на 2 сутки после заражения сальмонеллами в основном представлена бактериями рода Lactobacillus (6,5 lg КОЕ/мл), семейства Enterobacteriaceae (6 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Бактерии рода Salmonella выявлены в концентрации 5,5 lg КОЕ/мл.
На 5 сутки после заражения сальмонеллами микрофлора фекалий (рис. 8) в основном представлена бактериями рода Bacillus (концентрация увеличилась с 5,7 до 6,7 lg КОЕ/мл), а также бактериями рода Lactobacillus (концентрация уменьшилась с 6,5 до 5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,8 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл увеличилась с 5,5 до 5,7 lg КОЕ/мл.
На 7 сутки после заражения сальмонеллами микрофлора фекалий (рис. 8) в основном представлена бактериями рода Bacillus (6 lg КОЕ/мл), грибами рода Candida в концентрации 5,9 lg КОЕ/мл. Концентрация лактобацилл к 10 суткам уменьшилась с 6,5 до 5 lg КОЕ/мл, бактерий семейства Enterobacteriaceae от 6 до 5,5 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл увеличилась с 5,5 до 5,9 lg КОЕ/мл.
Микрофлора фекалий экспериментальной группы № 2 (рис. 9) на 2 сутки после заражения сальмонеллами в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae (6 lg КОЕ/мл), бактериями рода Bacillus (5,7 lg КОЕ/мл) и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Бактерии рода Salmonella выявлены в концентрации 5,3 lg КОЕ/мл.
Candida
Staphylococcus
Bacillus
Enterobacteriaceae
Lactobacillus
Salmonella
012345678
lg КОЕ/мл
Рис. 8. Микрофлора фекалий крыс экспериментальной группы № 1
Candida
Staphylococcus
Bacillus
Enterobacteriaceae
Lactobacillus Salmonella
012345678
lg КОЕ/мл
Рис.9. Микрофлора фекалий крыс экспериментальной группы № 2
На 5 сутки после заражения сальмонеллами и получения подкормки лактобактериями микрофлора фекалий (рис. 9) в основном представлена бактериями рода Lactobacillus (концентрация увеличилась с 0 до 7 lg КОЕ/мл), семейства Enterobacteriaceae (концентрация увеличилась со 6 до 6,7 lg КОЕ/мл), рода Bacillus (концентрация увеличилась с 5.7 до 6,5 lg КОЕ/мл), а также и грибами рода Candida в концентрации 5,7 lg КОЕ/мл. Концентрация сальмонелл уменьшилась с 5,3 до 4,95 lg КОЕ/мл.
На 7 сутки после заражения сальмонеллами и получения подкормки лактобактериями микрофлора фекалий (рис. 9) в основном представле-
1 1 1 1 1 1
1 □ 7 сутки □ 5 сутки □ 2 сутки
1
i
i
1
1 1 1 1 1
1
lili
1
1 1 1 1 1
-f-1
1 1 1 1 1
-J-L- Г 1-1 1
-1-1 □ 7 сутки □ 5 сутки □ 2 сутки
1
-1
1 1 1 1 1
1
1 1 1 1 1
1
-1-1-1-1-1-
на бактериями рода Bacillus (6,3 lg КОЕ/мл). Наблюдается уменьшение концентрации лактобацилл с 7 до 5,7 lg КОЕ/мл., бактерий семейства Enterobacteriaceae с 6,7 до 5,5 lg КОЕ/мл, грибов рода Candida с 5,7 до 5 lg КОЕ/мл. Сальмонеллы к 7 дню эксперимента не выявлены.
Пероральное введение лактобацилл крысам, контаминированным сальмонеллами, позволяет достоверно (р<0.05) сократить сроки элиминации возбудителя и уменьшить морфологическую картину воспаления во внутренних органах в среднем на 2 суток.
II. СИМБИОЗ ЛАКТОБАЦИЛЛ С МИКРОБИОТОЙ ЧЕЛОВЕКА
1. Симбиоз лактобацилл с представителями нормофлоры человека
Симбиоз выделенных лактобацилл с представителями нормофлоры пищеварительного тракта изучался методом отсроченного антагонизма. Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано до вида 357 штаммов нормальной микрофлоры (75% выделено от здоровых людей, 15% — от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ).
Выявлено, что 4 из 10 штаммов лактобацилл, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили преимущественно низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к нормофлоре ЖКТ, в основном ингибируя Staphylococcus spp. и Streptococcus agalactiae. Штамм L. fermentum 11 зв. незначительно подавляет следующих представителей грамположительной нормофлоры: Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Streptococcus agalactiae, Corynebacterium xerosis и Sarcina spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. — Streptococcus agalactiae и Staphylococcus spp.; L. rhamnosus 24 д. ст. (рис. 10) — Actinomyces spp., Lactococcus lactis, Corynebacterium xerosis, и Propionibacterium propionicus; L. rhamnosus 7 д.ст. — Clostridium spp., Peptostreptococcusasaccharolyticus, Streptococcus agalactiae и Eubacterium spp.
Sarcina spp.
Staphylococcus spp. Micrococcus spp.
Streptococcus agalactiae
Propionibacterium propionicus Coiynebacterium xerosis Lactococcus lactis Actinomyces spp.
0 2 4 6 8 10 12 14 d зон задержки роста микроорганизмов, мм Рис. 10. Зоны подавления роста грамположительной нормофлоры желудочно-кишечного тракта под действием L.rhamnosus 24 д.ст.
Выделенный штамм L. fermentum 11 зв. слабо подавляет рост следующих представителей грамотрицательной нормофлоры: Escherichia coli и Leptotrichia buccalis; штамм L. fermentum 11 д.ст. — Neisseria mucosa; L. rhamnosus 24 д. ст. (рис. 11) — Leptotrichia buccalis; L. rhamnosus 7 д.ст. — \feillonella parvula и Neisseria mucosa.
(Зете11а тогЫПогит
| |
| 1
Г "I | !" -
О 2 4 6 8 10 12 14
с1 зон задержки роста микроорганизмов, мм Рис. 11. Зоны подавления роста грамотрицательной нормофлоры желудочно-кишечного тракта под действием L.rhamnosus 24 д.ст.
При определении влияния штамма Ь,. гИашпскш 24 д. ст. (табл. 4), выделенного из полости рта здоровых людей, на представителей грамположитель-ной и грамотрицательной нормофлоры ЖКТ, использованы негтараметри-ческие элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали «нормальности» по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уол-лиса выявил значимое отличие средних рангов 5 родов представителей грамположительной и 2-х родов грамотрицательной нормофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием Ь. гЬатшжк 24 д. ст.
Таблица 4
Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L.rhamnosus 24 д. ст.
Род;ранг(R) Род; ранг (R) Уровень значимости
Actinomyces spp. R: 75,25 Eubacterium spp. R: 20,5 0,000003
Actinomyces spp. R: 75,25 Peptostreptococcus asaccharolyticus R: 20,5 0,005640
Actinomyces spp. R: 75,25 Clostridium spp. R: 20,5 0,005640
Actinomyces spp. R: 75,25 Enterococcus spp. R: 20,5 0,001664
Neisseria mucosa R: 29 Bacteroides spp. R: 12 0,025777
Для 5 родов представителей грамположительной и 2-х родов грамотрицательной нормофлоры рассчитаны параметры описательной статистики (табл. 5).
Таблица 5
Описательная статистика L.rhamnosus 24 д. ст.
Параметры Actinomyces SPP- Eubac terium spp. Pepto-streptococcus asaccharol yticus Clostridium spp. Entero-coccus spp. Neisseria mucosa Bacter oides spp.
N набл. '18 13 5 5 6 6 14
Среднее 12 0 0 0 0 9,16667 0
Доверительный интервал среднего, % -95 10,32 4,13740
+95 13,68 14,19593
Медиана 12,5 0 0 0 0 10,5 0
Минимум 0 0 0 0 0 0 0
Максимум 16 0 0 0 0 13 0
Нижняя квартиль 11 0 0 0 0 9 0
Верхняя квартиль 13 0 0 0 0 12 0
Стандартное отклонение 3,378 0 0 0 0 4,792355 0
Стандартная ошибка 0,796 0 0 0 0 1,956471 0
Асимметрия -2,76 -1,82196
Стандартная ошибка асимметрии 0,536 0,845154
Эксцесс 10,029 3,57779
Стандартная ошибка эксцесса 1,038 1,740777
Статистический анализ выявил достоверное антагонистическое воздействие штамма L. rhamnosus 24 д. ст. на представителей 5 родов грам-положителъной и 2 родов грамотрицательной нормофлоры.
Прочие штаммы лактобацилл, L. fermentum 2пр., L. fermentum 39 зв., L. fermentum 291, L. plantaaim 106 зв., L. rhamnosus 50 зв., L. rhamnosus 72 зв., не оказывали подавляющего воздействия на нормофлору человека.
Отмечено, что низкой степенью антагонизма по отношению к нор-мофлоре ЖКТ обладали два штамма, L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж. выделенные из желудка здоровых людей. Штамм L. rhamnosus 2 ж. незначительно подавляет следующих представителей грамположительной нормофлоры: Streptococcus agalactiae, Lactococcus lactis и Staphylococcus
spp.; штамм L. rhamnosus 3 ж. — Streptococcus agalactiae, Micrococcus spp. и Sarcina spp. Штаммы L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж. не подавляют рост ни одного представителя грамотрицательной нор-мофлоры ЖКТ.
Показано, что все 10 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей, проявили в основном среднюю антагонистическую активность по отношению к нормофлоре ЖКТ. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамположительной нормофлоры: Staphylococcus spp., Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus; штамм L. plantarum 46 к. — Clostridium spp., Peptostreptococcus asaccharolyticus, Actinomyces spp. и Staphylococcus spp.; штамм L. rhamnosus 32 к. — Eubacterium spp., Clostridium spp. и Actinomyces spp.; штамм L. rhamnosus 38 к. — Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus; штамм L. plantarum 36 ст. — Clostridium spp., Peptostreptococcus asaccharolyticus и Actinomyces spp.; штамм L. plantarum K9 L — Clostridium spp. и Peptostreptococcus asaccharolyticus. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамотрицательной нормофлоры: Leptotrichia buccalis и Veillonella parvula; штамм L. plantarum 46 к. — Veillonella parvula и Escherichia coli; штамм L. rhamnosus 32 к. — Veillonella parvula.
Установлено, что выделенные штаммы лактобацилл различных биотопов в основном не оказывали антагонистического влияния на нормоф-лору ЖКТ. Лактобацилльг, выделенные из полости рта не подавляли роста 78 % представителей нормофлоры; лактобациллы, выделенные из желудка — 92 % нормофлоры; лактобациллы, выделенные из кишечника — 43 % нормофлоры.
Непараметрические элементы статистики выявили достоверное антагонистическое воздействие различных штаммов лактобацилл.
Симбиоз исследуемых лактобацилл между собой и бифидобактерия-ми определялся методом совместного культивирования на плотной питательной среде.
Установлено, что выделенные лактобациллы не оказывают антагонистического действия как на лактобациллы, так и бифидобактерии (рис. 12), о чём свидетельствует отсутствие зоны задержки роста культур при их совместном культивировании на плотной питательной среде.
Рис. 12. Биосовместимость лактобацилл между собой и бифидобактериями
2. Симбиоз лактобацилл с представителями условно-патогенной и патогенной микрофлоры пищеварительного тракта человека
Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано 197 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры (9 % — от здоровых людей, 91 % — от больных воспалительными и эрозивно-яз-венными поражениями ЖКТ).
Симбиоз выделенных лактобацилл с представителями условно-патогенной и патогенной микрофлоры пищеварительного тракта изучался методом отсроченного антагонизма.
Выявлено, что все 10 штаммов лактобацилл, выделенные из полости рта здоровых людей, проявили в основном высокую и реже низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штамм L. fermentum 11 зв. (рис. 13) проявляет высокую антагонистическую активность по отношению к следующим представителям условно-патогенной и патогенной грамположи-тельной микрофлоры: Staphylococcus spp. и Peptococcus niger; штамм L. rhamnosus 24 д.ст. — Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Bacillus spp.; штамм L. rhamnosus 7 д.ст. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. rhamnosus 50 зв. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp., Peptococcus niger., Bacillus spp. и Actinomyces israelii; штамм L. fermentum 39 зв. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. fermentum 2np. — Staphylococcus spp.; штамм L. fermentum 291 — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. plantarum 106 зв. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.; штамм L. rhamnosus 72 зв. — Staphylococcus spp. и Streptococcus spp.
Actinomyces israelii Bacillus spp.
Streptococcus spp.
Peptococcus niger Staphylococcus spp.
0 5 10 15 20 25
d зон задержки роста микроорганизмов, мм
Рис. 13. Зоны задержки роста грамположительной условно-патогенной и
патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта под действием
L.fermentum 11зв.
Выделенный штамм L. fermentum 11 зв. (рис. 14) проявляет высокую антагонистическую активность по отношению к следующим представителям условно-патогенной и патогенной грамотрицательной микрофлоры: Proteus spp., Pseudomonas spp. и Shigella sonnei; штамм L. rhamnosus 24 д.ст. — Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Enterobacter cloacae, Klebsiella spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. rhamnosus 7 д.ст. — Citrobacter fruendii, Shigella sonnei, Serratia spp., Enterobacter cloacae, Klebsiella spp., Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.; штамм L. rhamnosus 50 зв. — Salmonella typhimurium, Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Klebsiella spp., Fusobacterium nucleatum spp. и Prevotella spp.; штамм L. fermentum 11 д.ст. — Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Klebsiella spp., Proteus spp.и Enterobacter cloacae; штамм L. fermentum 39 зв. — Shigella sonnei, Salmonella typhimurium, Proteus spp., Klebsiella spp., Citrobacter fruendii, Pseudomonas spp., Fusobacterium nucleatum spp. и Enterobacter cloacae; штамм L. fermentum 2np. — Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Klebsiella spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. fermentum 291 — Shigella sonnei, Klebsiella spp., Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.; штамм L. plantarum 106 зв. — Shigella sonnei, Klebsiella spp., Pseudomonas spp. и Salmonella typhimurium; штамм L. rhamnosus 72 зв. — Salmonella typhimurium, Klebsiella spp., Shigella sonnei и Pseudomonas spp.
Prevotella spp. ¿I1I1N niil . , , ^ —i
Serratia spp. ^rir-t-* I |
Citrobacter fruendii ^ — I —I—,
Moraxella lacunata .....\
Enterobacter cloacae ^___ ^ l ..._____.. . —s^i
Campylobacter upsaliensis _ I |
Acinetobacter lwofSi -1
Klebsiella spp. ^ -]
Fusobacterspp. I и
Helicobacter pylori I — ^___... 3
Salmonella typhimmum .. . . L~___
Shigella sonnei I
Pseudomonas spp. III n
Proteus spp. ^ , i
0 5 10 15 20 25 30
d зон задержки роста микроорганизмов, мм Рис. 14 Зоны подавления роста грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта под действием L.fermentum Изв.
В результате изучения влияния штамма L. fermentum 11 зв. (табл. 6), выделенного из полости рта здорового человека, на представителей грамполо-
жительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ, использованы непараметрические элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали «нормальности» по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса выявил значимые отличия средних рангов исследуемых 2-х родов представителей грамположительной микрофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием Ь. ГегтепШт 11 зв.
Таблица 6
Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L.fermentum 11 зв.
Род; ранг(R) Род;ранг(R) Уровень значимости
Staphylococcus spp. R: 46,575 Actinomyces israelii R: 26,469 0,028086
Для этих 2-х родов представителей грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры были рассчитаны параметры описательной статистики (табл.7).
Таблица 7
Описательная статистика Ь.Гегтепйип 11 зв.
Параметры Staphylococcus spp. Actinomyces israelii
N набл. 20 16
Среднее 24 21,06250
Доверительный интервал среднего, % -95 22,91562 19,62649
+95 25,08438 22,49851
Медиана 24 21
Минимум 20 14
Максимум 28 25
Квартиль нижняя 22 20
верхняя 26 23
Стандартное отклонение 2,316985 2,694903
Стандартная ошибка 0,518094 0,673726
Асимметрия 0 -1,03329
Стандартная ошибка асимметрии 0,512103 0,564308
Эксцесс -0,63660 1,98998
Стандартная ошибка эксцесса 0,992384 1,090774
При определении влияния штамма Ь. ГегтепШт 11 зв. (табл. 8), выделенного из полости рта здорового человека, на представителей грамот-рицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры ЖКТ, использованы непараметрические элементы статистики, т. к. результаты не соответствовали «нормальности» по критерию Шапиро-Уилка. Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса выявил значимые отличия средних
рангов 7 исследуемых родов представителей грамотрицательной микрофлоры по их диаметру задержки роста под влиянием Ь. ГегтепШш 11 зв.
Таблица 8
Дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса
L.fermentum 11 зв.
Род; ранг (R) Род; ранг (R) Уровень значимости
Pseudomonas spp. R: 68,611 Proteus spp. R: 25,667 0,000003
Pseudomonas spp. R: 68,611 Acinetobacter lwoffii R: 10,5 0,005524
Pseudomonas spp. R: 68,611 Helicobacter pylori R: 10,5 0,00001
Pseudomonas spp. R: 68,611 Campylobacter upsaliensis R: 10,5 0,000552
Pseudomonas spp. R: 68,611 Enterobacter cloacae R: 26,3 0,028762
Salmonella typhimurium R: 60,9 Helicobacter pylori R: 10,5 0,031056
Для этих 7 родов представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры рассчитаны параметры описательной статистики (табл. 9).
Таблица 9
Описательная статистика Ь.Гегтепйнп 11 зв.
Параметры Pseudom onas spp. Proteus spp. Acinetobacter lwoffii Helicobacter pylori Campylo bacter upsaliens is Enterobacter cloacae Salmonella typhimurium
N набл. 18 18 3 6 4 5 5
Среднее 28,5 6,83333 - — — 7,4 26,4
Доверительный интервал среднего, % -95 27,32754 4,60123 — — - 2,08835 24,14441
+95 29,67246 9,06544 - - - 12,71165 28,65559
Медиана 28 9 - - - 9 27
Минимум 24 - - - 24
Максимум 32 12 - - - 11 28
Квартиль нижняя 27 - — - 8 25
верхняя 30 10 - — - 9 28
Стандартное отклонение 2,357716 4,488548 - - - 4,277850 1,816590
Стандартная ошибка 0,555719 1,057961 - - - 1,913113 0,812404
Асимметрия -0,28781 -0,87351 — — — -1,86371 -0,56716
Стандартная ошибка асимметрии 0,536278 0,536278 - - - 0,912871 0,912871
Эксцесс -0,59022 -1,02407 - - - 3,86903 -2,23140
Стандартная ошибка эксцесса 1,037795 1,037795 - - - 2 2
Статистический анализ выявил достоверное антагонистическое воздействие штамма L. fermentum 11 зв. на представителей 2-х родов только грамположительной и 7-и грамотри-цательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры.
Выявлено, что штаммы L. plan-tarum 1 ж., L. rhamnosus 2 ж., L. rham-nosus 3 ж. и L. rhamnosus 4 ж., проявляют среднюю степень антагонистической активности в отношении следующих представителей грамположительной условно-патогенной и патогенной микрофлоры: Streptococcus spp., Bacillus spp. и Staphylococcus spp. Все штаммы, выделенные из желудка, показали низкую и среднюю степень активности по отношению к грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штаммы L. plantarum 1 ж. и L. rhamnosus 4 ж., в большей степени подавляют рост следующих представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры: Shigella sonnei и Salmonella typhimurium; L. rhamnosus 2 ж. и L. rhamnosus 3 ж., — Shigella sonnei, Salmonella typhimurium и Pseudomonas spp.
Установлено, что все 6 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника здоровых людей, проявили высокую антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ. Штаммы L. casei 17 к., L. plantarum 46 к., L. plantarum 36 ст., L. rhamnosus 38 к., L. rhamnosus 32 к., L. plantarum К9 L оказывают высокую степень антагонизма в отношении грамположительных условно-патогенных и патогенных Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. Штамм L. casei 17 к. подавляет рост следующих представителей грамотрицательной условно-патогенной и патогенной микрофлоры (рис. 15) — Pseudomonas spp., Prevotella spp., Klebsiella spp., Enterobacter cloacae, Citrobacter fruendii, Fusobacterium nucleatum spp., Shigella sonnei и Proteus spp.; штамм L. plantarum 46 к. — Pseudomonas spp., Prevotella spp., Klebsiella spp., Enterobacter cloacae, Citrobacter fruendii, Fusobacterium nucleatum spp., Shigella sonnei и Salmonella typhimurium; штаммы L. plantarum 36 ст., L. rhamnosus 38 к., L. rhamnosus 32 к. и L. plantarum K9 L ингибируют рост Pseudomonas spp., Shigella sonnei, Salmonella typhimurium и Klebsiella spp.
Непараметрические элементы статистики выявили достоверное антагонистическое воздействие различных штаммов лактобацилл.
Рис. 15. Антагонистическая активность лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника по отношению к Pseudomonas aeruginosa
В исследованиях A. Mansour, 2011, отмечено фунгистатическое действие лактобацилл. Показано, что L. acidophilus и L. plantarum проявили антимикробную активность по отношению к С. albicans. Наши данные свидетельствуют (рис. 16), что средней антагонистическою активностью по отношению к грибам рода Candida обладают штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта: L. fermentum 11 зв., L. rhamnosus 7 д.ст., L. fermentum 2пр., L. fermentum 11 д.ст. и L. rhamnosus 50 зв., штаммы, выделенные из кишечника: L. rhamnosus 32 к., L. casei 17 к. и L. plantarum 46 к.
□ средний диаметр (мм) зоны подавления роста грибов рода Cry ptococcus
□ средний диаметр (мм) зоны подавления роста грибов рода Candida
Рис. 16. Антагонистическая активность лактобацилл, выделенных из полости рта и кишечника, по отношению к грибам рода Candida и Criptococcus
Прочие штаммы обладали низкой степенью антагонистической активности по отношению к дрожжевым грибам рода Candida. Средней антагонистической активностью по отношению к грибам рода Cryptococcus обладают штаммы лактобацилл: L. fermentum 11 д.ст., выделенный из полости рта, L. plantarum 46 к и L. casei 17 к., выделенные из кишечника. Остальные штаммы не обладали антагонистической активности по отношению к грибам рода Cryptococcus.
Для определения антагонистической активности штаммов лакто-бацлл, выделенных из полости рта, желудка и кишечника, в отношении вирусов проведена реакция нейтрализации в перевиваемой культуре клеток Нер-2 (Cincinnati), эпидермальной карциномы человека, с использованием полиовирусных штаммов Сэбина 1, 2 и 3 типов.
Установлено влияние суспензии и супернатантов бульонных культур лактобацилл на вирус полиомиелита. Выделенные из полости рта семь (70 %) суспензий бульонных культур штаммов лактобацилл, L. fermentum 11 зв., L. fermentum 39 зв., L. fermentum 11 д.ст., L. fermentum 2 п.р., L. rhamnosus
Рис.17. Нейтрализация полиовируса Рис. 18. Отсутствие нейтрализации
Сэбина I типа штаммом L. rhamnosus полиовируса Сэбина III типа штаммом
24 д.ст. (ЦПД ткани отсутствует) L. rhamnosus 32к (ЦПД)
50 зв., Ь.гЬатпсйш 72 зв. и Ь.р1агЛатт 106 зв., полностью нейтрализовали все 3 типа полиовирусных штаммов Сэбина. Ь. гЬатповш 7 д.с. и Ь. ГегтепГит 291 (20 %) нейтрализовали два типа полиовируса и Ь. Лашповив 24 д.с. (10 %) — один тип вируса (рис. 17). Супернатанты бульонных культур Ь. 1егтепШтп 2 пр., Ь. Лаптовив 50 зв., Ь. гЬатпо8Ш 7 д.с., Ь. ЛашпоБив 72 зв., I . р1атагит 106 зв., и Ь. ГегтеШит 29, выделенных из полости рта, показали отсутствие нейтрализации всех 3-х типов вируса; супернатанты трех штаммов, Ь. ГеппепШт 11 зв., Ь. Лаптовив 24 д.с. и Ь. ГегтепШт 39 зв., нейтрализовали два типа полиовируса и Ь. ГегтепШт 11 д.с. — один тип полиовируса.
Выявлено, что как суспензии, так и супернатанты бульонных культур лактобацилл, выделенных из желудка, не оказывали подавляющего воздействия на все типы полиовируса Сэбина.
После инкубирования суспензии бульонной культуры лактобацилл кишечника с полиовирусами обнаружено, что один из шести штаммов лактобацилл, Ь. р1аМагит 46к (16,7 %), полностью нейтрализовал все 3 вакцинных типа полиовируса Сэбина. Три штамма, Ь. Лашповив 32к, Ь. гЬатпоБШ 38к и Ь. гНашпоБив К9Ь (50 %), нейтрализовали два типа полиовируса, и два штамма, Ь. саве1 17к и Ь. р1аташт 36к (33,3 %) нейтрализовали один тип полиовируса.
При использовании супернатанта бульонных культур лактобацилл наблюдали полную нейтрализацию одного типа полиовируса двумя штаммами, выделенными из кишечника, Ь. саяе117ки Ь. р1ап1агит 36к (33,3 %); четыре штамма, Ь. гЬатпояш 32к (рис. 18), Ь. р1ал1агат 46к, Ь. Лашповш 38к и I .. гЬатпояш К9Ь, нейтрализовали два типа вируса (66,7 %).
Таким образом, показано, что суспезии бульонных культур лактоба-цилл, выделенных из полости рта, оказывают высокую противовирусную активность по сравнению с супернатантом данных штаммов. Как суспензии, так супернатанты бульонных культур лактобацилл желудка не проявили активность по отношению к полиовирусу. Выявлена средняя и низкая противовирусная активность суспензий и супернатантов культур лактобацилл, выделенных из кишечника.
ВЫВОДЫ
1. Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано до вида 357 штаммов нормальной микрофлоры (75 % выделено от здоровых людей, 15 % — от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ) и 197 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры (9 % — от здоровых людей, 91 % — от больных).
2. Оральные, желудочные и кишечные штаммы лактобацилл, выделенные от здоровых людей разных возрастных групп не имеют факторов пато-генности и чувствительны в 100 % к тетрациклину; 93,4 % — к гентамици-ну, эритромицину, рифампицину и меропенему; 86,2 % — к линезоли-ду, стрептомицину и ампициллину; 75,4 % — к фурадонину, левомицетину и доксициклину; 66,9 % — к бензилпенициллину; 33,9 % — к ципроф-локсацину, 14,3 % — к ванкомицину; 6,4 % — клевофлоксацину.
3. Из 203 штаммов лактобацилл, выделенных от здоровых людей, высокой антагонистической активностью обладают только 10 %. Высокоантагонистические 20 штаммов лактобацилл различных биотопов в основном не оказывают антагонистического влияния на нормофло-ру ЖКТ. 40 % оральных штаммов лактобацилл проявляют низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к 22 % нор-мофлоры ЖКТ, 50 % желудочных штаммов лактобацилл обладают низкой активностью по отношению к 8 % нормофлоры, все кишечные штаммы лактобацилл проявляют среднюю антагонистическую активность по отношению к 57 % нормофлоры ЖКТ.
4. Высокой и средней антагонистической активностью отличаются все штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта и кишечника здоровых людей, по отношению к 92 % и 86 % соответственно условно-патогенной и патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, по сравнению со штаммами, выделенными из желудка, проявляющими низкую активность по отношению к 64 % микрофлоры. 50 % оральных и кишечных штаммов лактобацилл обладают средней антагонистическою активностью по отношению к грибам рода Candida. Лактобациллы, выделенные из желудка, не проявляют антимикотическую активность.
5. Оральные штаммы лактобацилл обладают высоким и средним подавляющим действием на штаммы полиовирусов Сэбина, по сравнению со средней и низкой активностью кишечных штаммов. Лактобацилды, выделенные из желудка, не проявили противовирусную активность.
6. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия на L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus и L. casei, не подавляют метаболизма и размножения би-фидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. breve, В. bifidum, В. longum).
7. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, желудка и кишечника, имеют среднее значение адгезивно-сти и характеризуются постепенным нарастанием продукции кислоты, причем добавление глюкозы в питательную среду способствует увеличению их кислотообразующей способности в несколько раз.
8. Оральные штаммы лактобацилл отличаются более высокими показателями аутоагрегации, чем лактобациллы желудка и кишечника. Оральные и кишечные штаммы лактобацилл обладают более высокой поверхностной гидрофобностью, чем лактобациллы желудка. В составе коагрегатов оральные, желудочные, кишечные штаммы лактобацилл более эффективно проявляют свои антагонистические свойства в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Лактобациллы трех биотопов образуют биопленку in vitro, причем оптические плотности лактобацилл, формирующих биопленку на пластиковой чашке, значительно превышают оптические плотности лактобацилл на стекле.
9. Полипептидные фракции Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 с молекулярной массой 228,3 Da, 347,3 Da, 351,6 Da обладают более выраженным избирательным антагонистическим действием по отношению к индикаторным штаммам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, чем супернатант бульонной культуры Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1.
10. Штаммы L. plantarum и L. rhamnosus несут шесть генов (plnEF, plnJ, plNC8, plnN, LGG_02380 и LGG_02400), детерминирующих синтез предшественников бактериоцинов, но их наличие не имеет прямой зависимости с синтезом бактериоцинов.
11. Пероральное введение лактобацилл крысам, контаминированным сальмонеллами, позволяет достоверно (р<0.05) сократить сроки элиминации возбудителя и уменьшить выраженность морфологической картины воспаления во внутренних органах в среднем на 2 суток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Выделенные из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей антагонистически активные штаммы лактобацилл, обладающие разным набором свойств, характеризующих адаптационный и пробиоти-ческий потенциал, могут быть использованы в качестве препаратов пробиотиков.
2. Выделенные лактобациллы из определенного биотопа должны быть использованы для восстановления нормальной микрофлоры того же отдела пищеварительного тракта.
3. Антагонистическая активность лактобацилл проявляется за счет комплексного воздействия адаптационного и пробиотического потенциала не только в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, но и кишечных вирусов.
4. Депонированные в государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора 19 штаммов лактобацилл и 2 штамма лактобацилл во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) могут быть использованы при конструировании новых отечественных препаратов-пробиотиков.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Гаврилова О. А. Микроэкология слизистой оболочки полости рта у школьников / В. М. Червинец, Д. В. Лебедев, Ю. В. Червинец// Мат. Всероссийской научной конференции с международным участием «Социально-медицинские аспекты экологического состояния Центрального экономического района России». Тверь. — 2007. — С.289-291.
2. Пиекалнитс И. Я. Особенности микрофлоры полости рта у больных с генерализованным периодонтитом средней тяжести /О. А. Гаврилова,
B. М. Червинец, Д. В. Лебедев, Ю. В. Червинец// Мат. Всероссийской научной конференции с международным участием «Социально-медицинские аспекты экологического состояния Центрального экономического района России». Тверь. — 2007. — С.499-500.
3. Червинец В. М. Бактериоцинпродуцирующие штаммы лактобацилл, перспективные для разработки новых пробиотических препаратов / Ю. В. Червинец, Н. А. Шабанова, В. М. Бондаренко // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. — 2007. — Т.2. —
C.314—315.
4. Червинец В. М. Патогенетические основы использования пробиотиков в лечении дисбактериоза желудочно-кишечного тракта / С. Н.
Базлов, В. В. Чернин, Ю. В. Червинец // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Научно-практический журнал. — 2007. — №1—2. — С.М118, 414.
5. Червинец В. М. Скрининг непатогенных антагонистически активных штаммов ЕШегососсиз Гаесшт /В. М. Бондаренко, А. М. Самоукина, Ю. В. Червинец//ЖМЭИ. - 2007. - №1. - С.57-61.
6. Червинец Ю. В. Бактериоцин-секретирующие штаммы лактобацилл: кандидаты для новых пробиотических препаратов / В. М. Червинец, Н. А. Шабанова, В. М. Бондаренко / Клиническое питание. Научно-практический журнал. — 2007. — №1-2. — С. А72—А73.
7. Гаврилова О. А. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом / Ю. В. Червинец, В. М. Бондаренко В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Д. В. Лебедев// ЖМЭИ. — 2008. - №6. — С.59-63.
8. Давыдов Б. Н. Колонизация микроорганизмами съемных пластинчатых протезов из различных материалов у детей /Т. М. Бакерникова,
B. М.Червинец, Ю. В.Червинец// Стоматология детского возраста и профилактика. — 2008. — №4. — том.7,4(27). — С.57-60.
9. Михайлова Е. С. Микрофлора желудочно-кишечного тракта у больных хроническим холециститом /В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, А. П. Барашков, Е. В. Секарева// ЖМЭИ. - 2008. — №4. — С.103-105.
10. Самоукина А. М. Микрофлора полости рта детей 7—11 лет / Ю. В. Червинец, Д. В. Лебедев, О. А. Гаврилова // Вестник Российской Академии медицинских наук № 6, 2008, приложение, Тез. докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». — 2008 —
C.385—386.
11. Червинец В. М. Дисбиозы желудочно- кишечного тракта у больных пожилого возраста с хроническим бескаменным холециститом и желчно-каменной болезнью / Ю. В. Червинец, Е. С. Михайлова, В. Ф. Виноградов, Л. Е. Смирнова, А. И. Сидоров// Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И. И. Мечникова. «Терапевтические проблемы пожилого человека» Материалы российской научно-практической конференции. Санкт-Петербург. — 2008. — №3/1(28). - С.158—163.
12. Червинец В. М. Применение хитозана для коррекции микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе и вагинальном канидозе. / И. И. Стольникова, Ю. В. Червинец// Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международная конференция по иммунотерапии, посвященные 100-летию присуждения И. И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного
научного общества иммунологов. Аллергология и иммунология. — 2008. — Том 9. - №3. — С.309.
13. Червинец Ю. В. Антагонистическая активность пробиотических штаммов для заквасок прямого внесения. Тезисы V съезда Общества биотехнологов России и Всероссийского совещания работников биотехнологической отрасли промышленности. Москва. — 2008. — С.353—357.
14. Червинец Ю. В. Особенности микробного пейзажа полости рта у школьников с гастродуоденитами /А. М. Самоукина, О. А. Гаврило-ва// Вестник Российской Академии медицинских наук № 6, 2008, приложение, Тез. докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». — 2008. — С.466.
15. Гаврилова О. А. Возрастные изменения микробиоценоза смешанной слюны и налета с поверхности зубов при декомпенсированном течении кариозного процесса /Ю. В. Червинец// Институт стоматологии. — 2009. - №1(42). - С.80-81.
16. Гаврилова О. А. Мониторинг чувствительности к антибиотикам микрофлоры полости рта у практически здоровых детей и больных хроническим гастродуоденитом/Б. Н. Давыдов, Ю. В. Червинец, В. М. Червинец //Стоматология. — 2009. — №,6. — том 88. — С.62-65.
17. Гаврилова О. А. Содержимое зубодесневого желобка у дошкольников: физические и микробиологические характеристики / Ю. В. Червинец // Стоматология детского возраста и профилактика. — 2009. — №2. — С.66-68.
18. Михайлова Е. С. Способность к формированию биопленок у микроорганизмов, выделенных из верхних отделов ЖКТ больных хроническим холециститом и ЖКБ / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, О. А. Гаврилова, А. М. Самоукина // Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции. Журнал «Успехи современного естествознания». — Москва. - 2009. — № 7. — С.76.
19. Михайлова Е. С. Чувствительность условно-патогенной микрофлоры, выделенной из верхних отделов ЖКТ у больных хроническим холециститом и ЖКБ к пробиотическим штаммам лактобактерий / Ю. В. Червинец, В. М. Червинец, О. А. Гаврилова, А. М. Самоукина // Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции. Журнал «Успехи современного естествознания». — Москва. — 2009. — № 7. — СЛ.
20. Червинец В. М. Антимикробная активность Lactobacillus helveticus / Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова // Гастроэнтеро-
логия Санкт-Петербурга. Материалы 6-й объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург — Пробиотики-2009». — 2009. — № 4. — С.44-45.
21. Червинец В. М. Влияние низкомолекулярных углеводов Valeriana officinalis на микрофлору кишечника при эрозивно-язвенных поражениях гастродуоденальной зоны / Е. В. Ожимкова, Ю. В. Червинец, JI. Е. Смирнова, В. Ф. Виноградов, А. И. Сидоров, Е. М. Короткова,
B. П. Молчанов // Вестник Санкт-Петербургской Государственной Медицинской Академии им. И. И. Мечникова. — 2009. — №2/1 (31). —
C.100—104.
22. Червинец В. М. Микробиоценозы эзофагогастродуоденальной зоны и дуоденальный рефлюкс у больных желчнокаменной болезнью / Е. С. Михайлова, Г. С. Джулай, М. А. Львова, Ю. В. Червинец// Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. Приложение № 1 к журналу. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — Москва. — 2009. — № 2, 2009. - С.165—166.
23. Червинец В. М. Микрофлора полости рта детей 7—11 лет / О. А. Гаври-лова, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Д. В. Лебедев/ /Тезисы конференции: Современные проблемы науки и образования IV общероссийской научной конференции. Журнал «Успехи современного естествознания». — Москва. — 2009. — № 2. — С.73—74.
24. Червинец В. М. Особенности микробиоценозов эзофагогастродуоденальной зоны у больных хроническим бескаменным холециститом и желчнокаменной болезнью /Е. С. Михайлова, Г. С. Джулай, Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина // Материалы IX съезда Научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. Приложение № 1 к журналу. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология,— Москва. - 2009. — № 2, 2009. — С.164-165.
25. Червинец Ю. В. Антагонистическая активность пробиотических штаммов / В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова// Тезисы конференции: Современные проблемы науки и образования IV общероссийской научной конференции, г.Москва, Журнал «Успехи современного естествознания» . — Москва. — 2009. — № 2. — С.73.
26. Червинец Ю. В. Колонизационная и патогенетическая способность микрофлоры пародонтального кармана больных с воспалением паро-донта /Д. В. Лебедев, В. М. Червинец, О. А. Гаврилова, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова// Тезисы конференции: Актуальные вопросы науки и образования V общероссийской научной конференции.
Журнал «Успехи современного естествознания». — Москва. — 2009. — № 7. — С.111.
27. Червинец Ю. В. Способность лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей, к формированию биопленок / В. М. Червинец,
A. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, В. М. Бондаренко // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 6-й объединенной научной сессии и 2-го Международного конгресса по пробиотикам «Санкт-Петербург — Пробиотики-2009». — 2009. — № 4. — С.45.
28. Ботина С. Г. Генетическая идентификация антагонистически активных штаммов лактобацилл, выделенных из полости рта здоровых людей / Ю. В. Червинец, К. М. Климина, Н. В. Коробан, В. М. Червинец, О. А. Гаврилова, Д. В. Лебедев, А. Ю. Миронов// Клиническая лабораторная диагностика. — 2010. — №11. — С.43—46.
29. Пиекалнитс И. Я. Пути совершенствования консервативного лечения генерализованного пародонтита /Г. Л. Саввиди, О. А. Гаврилова,
B. М. Червинец, Ю. В. Червинец// XV Международная конференция челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии». — Санкт-Петербург. — 2010. — МАПО, кафедра челюс-тно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии.
30. Самоукина А. М. Мониторинг свойств, ассоциированных с персистен-цией представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры ЭГДС, улиц с патологией ЖКТ/ Ю. В. Червинец, Е. С. Михайлова, В. М. Червинец, Е. А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 7-й объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии. СПбГМАим. И. И. Мечникова. — Санкт-Петербург. — 2010. — № 4. — 2010. — С.34.
31. Смирнова Л. Е. Влияние различных видов терапии на течение язвенной болезни, сочетающейся с артериальной гипертонией / В. Ф. Виноградов, Ю. В. Червинец, А. В. Смирнов // XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Сборник материалов конгресса. Тезисы докладов. — Москва. — 2010. — С.252—253.
32. Червинец Ю. В. Антивирусная активность пробиотических штаммов лактобацилл /В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Л. А. Владимирова// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 7-й объединенной научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И. И. Мечникова.— Санкт-Петербург. — 2010. — № 4. — 2010 г. — С.48.
33. Червинец Ю. В. Способность индигенных лактобацилл полости рта человека к формированию биопленок /А. М. Самоукина, В. М. Червинец, Е. С.Михайлова, Д. В. Лебедев, В. М. Бондаренко// ЖМЭИ. — 2010. —№6.-С.80-83.
34. Гаврилова О. А. Структурные особенности микробного биоценоза полости рта практически здоровых детей /Ю. В. Червинец, Е. Н. Федотова, А. С. Хохлова// Маэстро стоматологии. — Москва. — 2011. — №43. - С.60-63.
35. Лебедев Д. В. Микробиоценозы полости рта у больных генерализованным пародонтитом и их коррекция / В. М. Червинец, А. Ю. Миронов, Ю. В. Червинец // Стоматолог. — 2011. — № 12. - С.23-29.
36. Смирнова Т. И. Исследование влияния нового лиганда и слабого постоянного магнитного поля на пекарские дрожжи / Я. М. Халяпина, В. М. Никольский, А. Н. Маслов, Ю. В. Червинец// Известия высших учебных заведений. Серия: «Химия и химическая технология», Иваново. — 2011. — том 54. — вып. 6. - С.82—86.
37. Червинец В. М. Антибактериальная активность наноструктуирован-ного серебряного геля / Ю. В. Червинец, М. М. Овчинников, А. М. Са-моукина, М. Б. Петрова, Е. А. Харитонова, В. М. Брянцева, В. М. Бон-даренко //ЖМЭИ. - 2011. - №4. - С.88-92.
38. Червинец В. М. Клинический эффект хитозана при терапии бактериального вагиноза/ Ю. В. Червинец, В. М. Бондаренко, И. И. Стольни-кова, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, А. И. Албулов//ЖМЭИ. — 2011. — № 5. — С.76—79.
39. Червинец В. М. Мониторинг чувствительности к противомикробным препаратам микроорганизмов, выделенных от больных хроническим фарингитом, хроническим тонзиллитом и фарингомикозом / Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, М. А. Куцоля, Е. А. Беляева// Научно-практические технологии диагностики и лечения в современной медицине. Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию кафедры оториноларингологии с курсом детской отоларингологии ТГМА, Тверь, 24 марта 2011г. - С.114-118.
40. Червинец Ю. В. Активность пробиотических штаммов лактобацилл в отношении полиовирусов / В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Л. А. Владимирова// Современные наукоемкие технологии. — 2011. — №1. — С.65-66.
41. Червинец Ю. В. Генетическая паспортизация и изучение способности к формированию биопленок лакгобациллами, выделенными из полости рта здоровых людей // С. Г. Ботина, А. А. Глазова, Н. В. Коро-бан, В. М. Червинец, А. М. Самоукина, О. А. Гаврилова, Д. В. Лебедев, А. Ю. Миронов // Клиническая лабораторная диагностика. — 2011. —№2. — С. 44-46.
42. Червинец Ю. В. Индигенные пробиотические штаммы лактобацилл полости рта человека / В. М. Червинец, А. Ю. Миронов, С. Г. Боти-
на, Е. Ю. Гагарина, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова // «Врач, провизор, пациент». — 2011. — №1. — С.М19.
43. Червинец Ю. В. Микробиоценоз кишечника детей в возрасте 8—10 лет / В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. — 2011. — № 4. — С. М 41.
44. Червинец Ю. В. Микрофлора полости рта и её чувствительность к антибиотикам у здоровых и больных гастродуоденитом детей / А. Ю. Миронов, В. М.Червинец // Стоматолог. — 2011. — № 10. — С. 41-45.
45. Червинец Ю. В. Симбиоз лактобацилл полости рта с микробиотой человека/В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева// Национальные приоритеты России. Специальный выпуск: «Современные аспекты природной очаговости болезней». Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию ФБУН «Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых болезней» Роспотребнад-зора, Омск. — 2011. — № 2(5). — С.203-204.
46. Червинец Ю. В. Симбиоз лактобацилл кишечника с микробиотой человека / В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева// Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии. — 2011 г. — №4.-С.М41.
47. Базлов С. Н. Применение пробиотиков — Споробактерина и Нормоф-лорина Л и Б — в лечении рецидива язвенной болезни, ассоциированной с дисбактериозом гастродуоденальной зоны /Ю. В. Червинец// XXXVIII сессия ЦНИИ Гастроэнтеролог™ XII съезд Научного общества гастроэнтерологов России. Клиническая и прикладная гастроэнтерология. Тезисы докладов. — Москва. — 1-2 марта 2012. —С.10.
48. Самоукина А. М. Молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза /В. М. Червинец, Ю. В. Червинец, Е. С. Михайлова // «Актуальные проблемы туберкулеза и оздоровительного питания» Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 130-летию доклада Р. Коха о возбудителе туберкулеза. Тверь. — 23 марта 2012 г. — С.14—15.
49. Червинец В. М. Дисбактериоз кишечника и иммунный статус у детей с заболеваниями ЖКТ и верхних дыхательных путей / Ю. В. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. А. Беляева//XXXVIII сессия ЦНИИ Гастроэнтерологии XII съезд Научного общества гастроэнтерологов России. Клиническая и прикладная гастроэнтерология. Тезисы докладов. — 2012 г. — С.113.
50. Червинец В. М. Формирование биопленок антагонистическими штаммами лактобацилл полости рта / Ю. В. Червинец, А. М. Самоуки-на, Е. С. Михайлова, О. А. Гаврилова // Стоматология. — 2012. — том 91. — С.16-19.
51. Червинец Ю. В. Индигенные лактобациллы полости рта человека — кандидаты в пробиотические штаммы / В. М. Червинец, А. Ю. Миронов, С. Г. Ботина, Е. Ю. Гагарина, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова // Курский научно-практический вестник «Человек и здоровье». — 2012.-№ 1. —С.131-137.
52. Червинец Ю. В. Микрофлора зубодесневого желобка у детей дошкольного возраста. / А. Ю. Миронов // Стоматолог. — 2012. — № 2. — С. 57-59.
53. Червинец Ю.В. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биопленки /В. М. Червинец, А. М. Самоукина, Е. С. Михайлова, Е. С. Беляева// Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», Москва, 12—13 апреля 2012г. — Том 2 «Инфекция и иммунитет». — № 1-2. - С.340—341.
Список сокращений
ВКПМ — Всероссийская коллекция производственных микроорганизмов ГЭРБ — гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь ЖКТ — желудочно-кишечный тракт КОЕ — колониеобразующая единица
ОСМ по McFarland — оптический стандарт мутности по МакФарланду
ГТЦР — полимеразная цепная реакция
СПА — средний показатель адгезии
ТСБ — триптиказо-соевый бульон
ЦПД — цитопатическое действие
Api WEB для ПК — программное обеспечение для биохимической идентификации микроорганизмов для персонального компьютера Da — дальтон d — диаметр
GasPak — газогенераторные пакеты
MRS — специализированная среда для роста лактобацилл Mr — молекулярная масса
р — критический уровень значимости величины QS — «quorum sensing» — ощущение чувства кворума Rh — резус фактор
12 п. кишка — двенадцатиперстная кишка °Т — градусы Тернера
Подписано в печать 04.07.2012. Формат 60х84'/16. Усл.-печ. л. 2,0. Гарнитура NewtonC. Тираж 100. Заказ 41.
Редакционно-издательский центр Тверской государственной медицинской академии 170100, Тверь, Советская, 4.
Тиражирование методом ризографирования в типографии редакционно-издательского центра ТГМА. г.Тверь, Беляковский пер., 21 тел. (4822) 42-04-26 e-mail: грс.tver@mail.ru
Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Червинец, Юлия Вячеславовна
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Микробные экосистемы макроорганизма.
1.2. Понятие симбиоза.
1.3. Классификация и распространённость лактобацилл.
1.4. Взаимосвязь лактобацилл и макроорганизма.
1.4.1. Положительные эффекты лактобацилл на организм человека.
1.4.2. Основные механизмы воздействия лактобацилл.
1.4.3. Адаптационные и пробиотические факторы лактобацилл.
1.5. Межмикробное взаимодействие лактобацилл (пробиотический фактор).
1.5.1. Конкуренция и сотрудничество за питательные вещества.
1.5.2. Конкурентное исключение.
1.5.3. Продукция кислот.
1.5.4. Продукция бактериоцинов.
1.5.5. Продукция перекиси водорода (Н202).
1.5.6. Бактериальная межклеточная взаимосвязь.
1.6. Воздействие на кишечный эпителий (пробиотический фактор).
1.7. Влияние на иммунитет (пробиотический фактор).
1.8. Адгезивные свойства лактобацилл.
1.9. Конкуренция бактерий in vitro.
1.10. Демонстрация антимикробной активности лактобацилл на моделях животных.
1.10.1. Адгезивные свойства и персистенция в кишечнике.
1.10.2. Активность по отношению к Н. Pylory.
1.10.3. Активность по отношению к микроорганизмам рода Salmonella.
1.10.4. Активность по отношению к Escherichia coli.
1.10.5. Активность по отношению к Listeria monocytogenes.
1.10.6. Активность по отношению к ротавирусам.
1.10.7. Активность по отношению к P. Aeruginosa.
1.11. Влияние пробиотиков на поддержание здоровья и течение заболевания.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материал.
2.1.1. Штаммы микроорганизмов.
2.1.2. Питательные среды.
2.2. Методы исследования.
2.2.1. Выделение чистой культуры микроорганизмов.
2.2.2. Биохимическая идентификация чистой культуры микроорганизмов.
2.2.3. Генетическая идентификация чистой культуры микроорганизмов.
2.2.4. Определение антагонистической способности лактобацилл методом перпендикулярных штрихов.
2.2.5. Определения кислотопродуцирующей способности лактобацилл.
2.2.6. Определение факторов патогенности лактобацилл.
2.2.7. Определение адгезивной способности лактобацилл.
2.2.8. Определение аутоагрегации лактобацилл.
2. 2.9. Определение поверхностной гидрофобности лактобацилл.
2.2.10. Определение способности лактобацилл к.
2.2.11. Определение способности лактобацилл формировать биоплёнки.
2.2.12. Отношение лактобацилл к антимикробным препаратам.
2.2.13. Определение чувствительности лактобацилл к химиопрепаратам и хитозану.
2.2.14. Определение экзометаболитов лактобацилл.
2.2.15. Определение антагонистической способности лактобацилл методом двухслойного агара или отсроченного антагонизма (продукция бактериоцинов).
2.2.16. Определение антимикробной активности супернатантов, содержащих бактериоциноподобные вещества.
2.2.17. Совместное культивирование на поверхности плотной питательной среды.
2.2.18. Определение антивирусной активности лактобацилл.
2.2.19. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных in vivo.
2.2.20. Статистические методы обработки материалов исследований.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Выделение, идентификация и отбор представителей нормобиоценоза, патогенной и условно-патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
3.1. Культуральные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека.
3.2. Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека.
3.3. Биохимические свойства микроорганизмов желудочно-кишечного тракта человека.
3.4. Факторы патогенности условно-патогенной и патогенной микрофлоры.
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ОТБОР
АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ.
4.1. Изучение культурально-морфологических свойств лактобацилл.
4.2. Факторы патогенности лактобацилл.
4.3. Отношение лактобацилл к антибактериальным препаратам.
4.4. Антагонистические свойства лактобацилл
4.5. Биохимическая идентификация лактобацилл.
4.6. Генетическая идентификация лактобацилл.
ГЛАВА 5. СИМБИОЗ ЛАКТОБАЦИЛЛ С МИКРОБИОТОЙ
ЧЕЛОВЕКА.
5.1. Симбиоз лактобацилл с нормофлорой, условно-патогенной и патогенной микрофлорой желудочно-кишечного тракта.
5.1.1. Симбиоз лактобацилл, выделенных из полости рта.
5.1.2. Симбиоз лактобацилл, выделенных из желудка.
5.1.3. Симбиоз лактобацилл, выделенных из кишечника.
5.1.4. Симбиоз лактобацилл по отношению к грибам.
5.2. Симбиоз лактобацилл между собой и бифидобактериями.
5.3. Симбиоз лактобацилл со штаммами вируса полиомиелита.
ГЛАВА 6. АДАПТАЦИОННЫЙ И ПРОБНОТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ
АНТАГОНИСТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ.
6.1. Адгезивная способность антагонистически активных штаммов лактобацилл.
6.2. Аутоагрегация антагонистически активных штаммов лактобацилл.
6.3. Поверхностная гидрофобность антагонистически активных штаммов лактобацилл.
6.4. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл к коагрегации.
6.5. Способность антагонистически активных штаммов лактобацилл формировать биоплёнки.
6.6. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл.
6.6.1. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из полости рта.
6.6.2. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из желудка.
6.6.3. Кислотопродуцирующая способность лактобацилл, выделенных из кишечника.
6.7. Определение экзометаболитов лактобацилл.
6.7.1. Хромато-масс-спектрометрия на системе
Dionex UltiMate3000- API 2000».
6.7.2. Капиллярный электрофорез на системе «Капель-105».
6.7.3. Обработка полученных результатов.
6.7.4. Получение полипептидных фракций, содержащих бактерицины.
6.8. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл.
6.8.1. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
6.8.2. Определение антагонистической активности полипептидных фракций лактобацилл в отношении представителей нормальной микрофлоры человека.
6.8.3. Определение антагонистической активности супернатанта бульонной культуры L. acidophilus (helveticus ТШ) NK и их полипептидов.
6.8.4. Определение антагонистической активности супернатанта бульонной культуры Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 и их полипептидов.
6.9. Определение генов, ответственных за синтез бактериоцинов.
6.10. Антагонистическая активность лактобацилл в эксперименте на животных in vivo.
ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Симбиотические взаимоотношения лактобацилл и микроорганизмов желудочно-кишечного тракта"
Актуальность проблемы
Воспалительные и эрозивно-язвенные поражения желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) занимают одно из первых мест во всем мире в структуре болезней органов пищеварения. Большинство этих болезней протекают на фоне дисбиоза пищевода, желудка, 12-перстной кишки, тонкого и толстого кишечника [17, 47]. В настоящее время для коррекции нарушенного микробиоценоза (дисбиоза) применяют препараты-пробиотики, проявляющие свой лечебный и профилактический эффекты через регуляцию нормальной микрофлоры организма хозяина [5, 6, 38, 72, 170]. Наиболее распространенным подходом к терапии дисбактериоза является «метод вытеснения», основанный на применении больших доз лечебных антибактериальных препаратов. Клинико-экспериментальные работы по бактериотерапии дисбактериозов показали, что лучший эффект достигается при индивидуальном подборе донорских штаммов, либо при использовании аутофлоры [44]. Разрабатываемые новые штаммы микроорганизмов из ЖКТ здоровых людей должны расширить и улучшить функциональные характеристики выпускаемых в настоящее время препаратов-пробиотиков для профилактики и лечения социально-значимых заболеваний, сопровождающихся дисбиозом ЖКТ.
Коммерциализация новых пробиотиков составляет от 2 до 23%, однако анализ данных свидетельствует о новизне получаемых исследователями результатов, которые сопоставимы с долей получаемых прав на интеллектуальную собственность. Практически все получаемые научные результаты по выделению новых штаммов пробиотиков обладают новизной и рассматриваются как перспективный коммерческий продукт. Несмотря на то, что указанные микроорганизмы используются в качестве пробиотиков, их биосовместимость с другими пробиотическими препаратами, чувствительность к антибиотикам, химиопрепаратам оставляют желать лучшего. Исходя из анализа данных отечественных и зарубежных исследований, можно сделать вывод, что доля интеллектуальной и прикладной продукции новых пробиотиков будет увеличиваться [56, 79, 102, 135, 371]. Создание, изучение и испытание относительно дешёвых пробиотических препаратов представляется крайне перспективным и экономически выгодным направлением для профилактики и терапии социально значимых заболеваний.
13
Организм взрослого человека состоит примерно из 10 клеток, в то время как в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 1014-1015,
17 а при некоторых патологических состояниях — до 10 клеток микроорганизмов [117, 119]. Микробиота человека активно участвует в его жизнедеятельности (пищеварительном процессе, обмене веществ, поддержании иммунного статуса). Несмотря на обилие информации, на данный момент нет точных данных, описывающих качественные и количественные симбиотиче-ские взаимоотношения между представителями нормофлоры (лактобацилл), а также условно-патогенными и патогенными микроорганизмами ЖКТ.
Микробиота человека интенсивно изучается (http://nihroadmap.nih.gov/hmp/). В рамках Human Microbiome Project определена полная нуклеотидная последовательность и аннотированы геномы 20 штаммов 14 видов лактобацилл. Работа по определению полной нуклеотидной последовательности генома еще 54 штаммов 22 видов лактобацилл ведется, но еще не завершена (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Последние научные данные указывают на специфичность видового состава кишечной микрофлоры как у каждого индивидуума, так и у национальных и региональных групп населения. Такие исследования проводятся и в Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (http://www.vigg.ru/, http://www.rnnbs.ru/).
Наиболее перспективными препаратами-пробиотиками являются лак-тобациллы, представители нормальной микрофлоры, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, способные синтезировать ряд антибиотикоподоб-ных веществ, таких как органические кислоты (молочную кислоту), перекись водорода, мурамидазу, бактериоцины, микроцины [18, 20]. Симбиоз лактобацилл с микроорганизмами осуществляется при формировании единой генетической системы, биоплёнки, определяющей пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром по типу «QS» («социальное поведение микроорганизмов»). В связи с этим представляется актуальным изучение механизмов, обеспечивающих симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами ЖКТ, а также пробиотиче-скими штаммами in vitro. Эти данные позволят выделить наиболее антагонистически активные штаммы лактобацилл, которые можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов. Цель исследования
Выделить антагонистически активные штаммы лактобацилл от здоровых людей, определить их симбиотические взаимоотношения с микроорганизмами пищеварительного тракта, а также пробиотическими штаммами, и установить механизм пробиотического действия лактобацилл. Задачи исследования:
1. Выделить и идентифицировать представителей нормофлоры, патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта от здоровых людей различных возрастных групп, а также больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ.
2. Выделить и идентифицировать лактобациллы из полости рта, желудка, 12 п. кишки и толстого кишечника здоровых людей различных возрастных групп.
3. Отобрать высокоантагонистические штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей для создания новых пробиотиков.
4. Определить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с микроорганизмами нормофлоры пищеварительного тракта.
5. Изучить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с представителями патогенной и условно-патогенной микрофлоры пищеварительного тракта.
6. Установить симбиотические взаимоотношения лактобацилл с пробиоти-ческими штаммами микроорганизмов (лактобацилл, бифидобактерий).
7. Выяснить механизм пробиотического действия лактобацилл.
8. Определить генетические маркеры антагонистической активности лактобацилл.
9. В эксперименте на животных выявить антагонистическую активность лактобацилл в отношении сальмонелл.
Научная новизна
Новизна работы заключается в выделении из пищеварительного тракта здоровых людей новых штаммов лактобацилл, обладающих высокой степенью антагонизма по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чувствительностью к антибактериальным препаратам, биосовместимостью с применяемыми в настоящее время другими препаратами-пробиотиками.
Лактобациллы, выделенные из полости рта здоровых людей, проявляют наиболее выраженные антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной и патогенной бактериальной и грибковой микрофлоре ЖКТ.
Показано, что механизм формирования пробиотической активности лактобацилл складывается из совместного действия пробиотического и адаптационного потенциала.
Полученные данные о симбиотических взаимоотношениях лактобацилл с микрофлорой пищеварительного тракта в составе биопленок могут быть использованы для создания перспективных пробиотических препаратов, что позволит практическому врачу оптимизировать лечение заболеваний ЖКТ.
Теоретическая значимость
Лактобациллы, выделенные из определенного биотопа, более активно подавляют патогенную и условно-патогенную микрофлору пищеварительного тракта того же локуса.
Генетическими методами исследования подтверждено, что наличие генов, ответственных за синтез бактериоцинов у лактобацилл, в значительной степени обуславливающих проявление антагонистической активности, не всегда коррелирует с бактериоциногенностью бактерий, выявленной культу-ральным методом.
Получены новые данные, расширяющие теоретические представления о симбиотических взаимодействиях лактобацилл с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, заселяющими пищеварительный тракт человека, начиная с полости рта и заканчивая кишечником. Эти материалы могут лечь в основу изучения механизмов формирования симбиотических отношений между различными родами и видами микроорганизмов.
Практическая значимость
Работа является фрагментом плановой темы НИР кафедры микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО Тверской государственной медицинской академии, № госрегистрации 01.2.006.06352.
Получены 2 патента РФ на изобретение: № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбактериоза кишечника» и № 2400174 от 27 сентября 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта»; поданы 2 заявки на изобретение: «Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» № 2012105262 от 16.02.2012 и «Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам» №2012105265 от 16.02.2012.
В государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов и 2 штамма лактобацилл депонировано во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Эти штаммы можно использовать для создания перспективных пробиотических препаратов, обладающих широким спектром антимикробной активности и адаптированных к организму человека.
Внедрение в практику
Поданы две заявки о выдачи патента РФ на изобретение в Федеральную службу по интеллектуальной собственности ФГБУ Федерального института промышленной собственности:
1. Штамм бактерий Lactobacillus plantarum 36к ВКПМ В-11154, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки — 2012105262 от 16.02.2012.
2. Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus 38к ВКПМ В-11155, обладающий широким спектром антагонистической активности по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Регистрационный номер заявки — 2012105265 от 16.02.2012.
Получены 2 патента РФ на изобретение:
1. № 2235324 от 25 августа 2004 г.: «Способ определения казеинолитиче-ской активности микроорганизмов при экспресс диагностике дисбакте-риоза кишечника».
2. № 2400174 Бюл.№ 27, 27.09 2010 г.: «Способ местного лечения воспалительных заболеваний пародонта».
В государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора депонировано 19 штаммов.
Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре микробиологии и вирусологии с курсом иммунологии, а также в работе бактериологической лаборатории НИЦ ГБОУ ВПО Тверской ГМА Минздрав-соцразвития России. Получен акт о внедрении материалов диссертации в учебный процесс и научную работу кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Новосибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.
Апробация работы
Основные результаты исследования доложены и обсуждены на российских и международных конференциях: на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммунотерапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии и 25-летию Всесоюзного научного общества иммунологов, 2009 г.; на V съезде Общества биотехнологов России и Всероссийском совещании работников биотехнологической отрасли промышленности, Москва 2-4 декабря, 2008 г.; на XV Международной конференции челюстно-лицевых хирургов и стоматологов «Новые технологии в стоматологии», Санкт-Петербург, 17-19 мая 2010 г.; на межрегиональной научно-практической конференции «Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта», Тверь, 8 апреля, 2011 г.; на межрегиональной научно-практической конференция «Актуальные вопросы рефлюкс-эзофагита и язвенной болезни», Тверь, 20 апреля 2012 г.
Положения, выносимые на защиту
1. Выделенные и идентифицированные штаммы лактобацилл из различных биотопов пищеварительного тракта здоровых людей обладают выраженным адаптационным потенциалом.
2. Выделенные штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия, не подавляют метаболизма и размножения бифидо-бактерий, а также практически не влияют на рост нормофлоры ЖКТ.
3. Выделенные штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре ЖКТ, а также вакцинным штаммам полиовируса Сэ-бина 1, 2 и 3 типов.
4. Механизм пробиотического действия выделенных штаммов лактоба-цилл связан с продукцией молочной кислоты и полипептидных фракций, обладающих избирательным антагонистическим действием по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам.
5. Выявлена антагонистическая активность лактобацилл в отношении сальмонелл в эксперименте на животных и показана положительная динамика регенерации пораженных органов.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 — «микробиология». Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта микробиологии. Личный вклад
Весь материал диссертации собран, обработан и проанализирован лично автором. Вклад автора является определяющим и в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и докладах. Публикации
Основное содержание работы отражено в 53 научных публикациях: в 21 статье, в том числе, в 17 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4-х глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы из 397 наименований, в том числе, 270 зарубежных и 127 отечественных работ. Диссертация изложена на 366 страницах, содержит 134 рисунка, 147 таблиц, 1 схему и 5 приложений.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Червинец, Юлия Вячеславовна
выводы
1. Из полости рта, желудка и кишечника выделено и идентифицировано до вида 357 штаммов нормальной микрофлоры (75% выделено от здоровых людей, 15% — от больных воспалительными и эрозивно-язвенными поражениями ЖКТ) и 197 штаммов условно-патогенной и патогенной микрофлоры (9% — от здоровых людей, 91% — от больных).
2. Оральные, желудочные и кишечные штаммы лактобацилл, выделенные от здоровых людей разных возрастных групп не имеют факторов пато-генности и чувствительны в 100% к тетрациклину, 93,4% — к гентами-цину, эритромицину, рифампицину и меропенему, 86,2% — к линезоли-ду, стрептомицину и ампициллину, 75,4% — к фурадонину, левомице-тину и доксициклину, 66,9% — к бензилпенициллину, 33,9% — к ципрофлоксацину, 14,3% — к ванкомицину, 6,4% — к левофлоксацину.
3. Из 203 штаммов лактобацилл, выделенных от здоровых людей, высокой антагонистической активностью обладают только 10%. Высокоантагонистические 20 штаммов лактобацилл различных биотопов в основном не оказывают антагонистического влияния на нормофлору ЖКТ. 40% оральных штаммов лактобацилл проявляют низкую и среднюю антагонистическую активность по отношению к 22% нормофлоры ЖКТ, 50% желудочных штаммов лактобацилл обладают низкой активностью по отношению к 8% нормофлоры, все кишечные штаммы лактобацилл проявляют среднюю антагонистическую активность по отношению к 57% нормофлоры ЖКТ.
4. Высокой и средней антагонистической активностью отличаются все штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта и кишечника здоровых людей, по отношению к 92% и 86% соответственно условно-патогенной и патогенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, по сравнению со штаммами, выделенными из желудка, проявляющими низкую активность по отношению к 64% микрофлоры. 50% оральных и кишечных штаммов лактобацилл обладают средней антагонистическою активностью по отношению к грибам рода Candida. Лактобациллы, выделенные из желудка, не проявляют антимикотическую активность.
5. Оральные штаммы лактобацилл обладают высоким и средним подавляющим действием на штаммы полиовирусов Сэбина, по сравнению со средней и низкой активностью кишечных штаммов. Лактобациллы, выделенные из желудка, не проявили противовирусную активность.
6. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл не оказывают взаимного антагонистического воздействия на L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus и L. casei, не подавляют метаболизма и размножения бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. breve, В. bifidum, В. longum).
7. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, выделенные из полости рта, желудка и кишечника, имеют среднее значение адгезивности и характеризуются постепенным нарастанием продукции кислоты, причем добавление глюкозы в питательную среду способствует увеличению их кислотообразующей способности в несколько раз.
8. Оральные штаммы лактобацилл отличаются более высокими показателями аутоагрегации, чем лактобациллы желудка и кишечника. Оральные и кишечные штаммы лактобацилл обладают более высокой поверхностной гидрофобностью, чем лактобациллы желудка. В составе коагрегатов оральные, желудочные, кишечные штаммы лактобацилл более эффективно проявляют свои антагонистические свойства в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Лактобациллы трех биотопов образуют биопленку in vitro, причем оптические плотности лактобацилл, формирующих биопленку на пластиковой чашке, значительно превышают оптические плотности лактобацилл на стекле.
9. Полипептидные фракции Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1 с молекулярной массой 228,3 Da, 347,3 Da, 351,6 Da обладают более выраженным избирательным антагонистическим действием по отношению к индикаторным штаммам условно-патогенных и патогенных микроорганизмов, чем супернатант бульонной культуры Lactobacillus acidophilus (helveticus ТШ) NK1.
10. Штаммы L. plantarum и L. rhamnosus несут шесть генов (plnEF, plnJ, plNC8, plnN, LGG 02380 и LGG02400), детерминирующих синтез предшественников бактериоцинов, но их наличие не имеет прямой зависимости с синтезом бактериоцинов.
11. Пероральное введение лактобацилл крысам, контаминированным сальмонеллами, позволяет достоверно (р<0.05) сократить сроки элиминации возбудителя и уменьшить выраженность морфологической картины воспаления во внутренних органах в среднем на 2 суток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Выделенные из полости рта, желудка и кишечника здоровых людей антагонистически активные штаммы лактобацилл, обладающие разным набором свойств, характеризующих адаптационный и пробиотический потенциал, могут быть использованы в качестве препаратов пробиотиков.
2. Выделенные лактобациллы из определенного биотопа должны быть использованы для восстановления нормальной микрофлоры того же отдела пищеварительного тракта.
3. Антагонистическая активность лактобацилл проявляется за счет комплексного воздействия адаптационного и пробиотического потенциала не только в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов, но и кишечных вирусов.
4. Депонированные в государственную коллекцию микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора 19 штаммов лактобацилл и 2 штамма лактобацилл во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) могут быть использованы при конструировании новых отечественных препаратов-пробиотиков.
305
Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Червинец, Юлия Вячеславовна, Москва
1. Авдеев, В.Г. Пробиотики и пребиотики в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта Текст. / В.Г. Авдеев // Клиническая фармакология и терапия. — 2006. — № 15 (1). — С. 36-40.
2. Агаджанян, H.A. Этюды об адаптации и путях сохранения здоровья. Текст. / H.A. Агаджанян, А.И. Труханов, Б.А. Шендеров // М.: Сирин. — 2002. —С.156
3. Адгезивные свойства лактобацилл и эшерихий в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека в норме и патологии Текст. / Е.А. Богданова [и др.] // Вестник Российской АМН. — 2006. — № 1. — С. 35-38.
4. Александрович, Н.Ж. Нарушение микробного пейзажа человека и пути их коррекции Текст. / Н.Ж. Александрович, З.И. Пирогова // Клиническое питание. — 2005. — № 2. — С. 43-46.
5. Анализ штаммовой общности пристеночных биотопов желудочно-кишечного тракта Текст. / A.A. Воробьев [и др.] // Вестник Российской АМН. — 2004. — № 6. — С. 15-18.
6. Анохин, В.А. Роль основных представителей анаэробной кишечной микрофлоры в норме и патологии Текст. / В.А. Анохин, Ю.А. Тюрин // Казанский медицинский журнал. — 2001. — Т. 82. — № 2. — С. 149-151.
7. Антибиотик-ассоциированный дисбактериоз кишечника у детей Текст. / A.A. Нижевич [и др.] // Детская гастроэнтерология. — 2005. — № 2. — С.3-7.
8. Ю.Ардатская, М.Д. Дисбактериоз кишечника: современные аспекты изучения проблемы, принципы диагностики и лечения Текст. / М.Д. Ардат-ская, A.B. Дубинин, О.Н. Минушкин // Терапевт, арх. — 2001. — № 2. — С. 67-72.
9. Ардатская, М.Д. Микробиоценоз кишечника и его роль в развитии и поддержании заболеваний желудочно-кишечного тракта Текст. / М.Д. Ар-датская // Газета «Новости медицины и фармации» Гастроэнтерология (тематический номер) / Научный обзор. — 2010. — № 313.
10. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях Текст. / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев // JI. — Медицина. 1962.160 с.
11. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков Текст. / Г.И. Новик [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. — Т. 42.2, —С. 187-194.
12. Блинкова, Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, методы выявления Текст. / Л.П. Блинкова // Журн. микробиол. — 2003. — № 3. — С. 109-113.
13. Бойцов, А.Г. Методы определения количества бактерий и статистической обработки результатов Текст.: справочник / А.Г. Бойцов, О.Н. Ластовка, A.A. Порин. — С-Петербург.: ООО «Ладога», 2003. — 51 с.
14. Бондаренко, В.М. Взаимодействие кишечной микрофлоры с Toll- подобными рецепторами Текст. / В.М. Бондаренко, В.Г. Лиходед // Иммунология.—2009.—№ 5. —С. 317-320.
15. Бондаренко, В.М. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы Текст. / В.М. Бондаренко, Т.В. Мацулевич // М.: ГЭОТАР. — М., 2007. — С.389
16. Бондаренко, В.М. Механизм действия пробиотических препаратов Текст. / В.М. Бондаренко, Р.П. Чуприна, М.А. Воробьева // Биопрепараты. — 2003. —№3. —С. 2-5
17. Бондаренко, В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и терапевтический эффект при дисбиозах кишечника Текст. / В.М. Бонда-ренко // Фарматека. — 2005. — Т. 20. — № 115. — С. 46-54.
18. Бондаренко, В.М. Роль транслокации кишечной бактериальной аутофлоры и ее токсических биомолекул в патологии человека Текст. / В.М. Бонда-ренко // Эксперимен. клин.гастроэнтерология. — 2007. № 5. -С.86-93.
19. Бондаренко, В.М. Роль условно-патогенных бактерий при хронических воспалительных процессах различной локализации Текст. / В.М. Бонда-ренко // Тверь: ООО Издательство «Триада». — 2011. — 88 с.
20. Булатова, Е.М. Питание и формирование здоровой кишечной микрофлоры у детей первых месяцев жизни Текст. / Е.М. Булатова, Т.В. Габрусская, O.K. Нетребко // Педиатрия. — 2007. — Т. 86. — № 3. — С. 85-89.
21. Бухарин, О.В. Межбактериальные взаимодействия Текст. / О.В. Бухарин, Б .Я. Усвяцов,Л.М.Хуснутдинова // Журн. микробиол.- 2003 № 4 - С.3-8.
22. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий Текст. / О.В. Бухарин // М.: Медицина, 1999. — 366 с. — Библиогр.: с. 11-13.
23. Вахитов, Т.Я. Перспективы создания пробиотических препаратов на основе «чувства кворума» у бактерий Текст. / Т.Я. Вахитов, Л.Н. Петров,
24. B.М. Бондаренко//Журнал, микробиол. — 2006.—№ 3. — С. 105-113.
25. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово Текст. / Л.Л. Леванова // Журн. Микробиол. —2001. —№ 3. —1. C. 72-75.
26. Гасилина, Т. В. Клинические аспекты применения Lactobacillus rhamnosus GG Текст. / Т. В. Гасилина, С. В. Бельмер // Вопр. дет. диетологии. —2009. —№2. —С. 30-35.
27. Генетическое разнообразие бактерий рода Lactobacillus из гастроинтести-нальной микробиомы людей Текст. / С.Г. Ботина [и др.] // Генетика. —2010. —№ 12.
28. Гинцбург, A.JI. «Quorum Sensing» или социальное поведение бактерий. Текст. / A.JI. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Журн. Микро-биол. —2003. —№ 5. —С. 86-89.
29. Гланц, С. Медико-биологическая статистика Текст. / С. Гланц // М. — Практика. — 1999. — 459 с.
30. Глушанова, Н.А. Биологические свойства лактобацилл Текст. / Н.А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. — 2003. — № 4. — С. 50-58.
31. Глушанова, Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл в условиях совместного культививрования in vitro Текст. / Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Журнал микроб, эпидемиол. и иммунобиол. — 2005. —№2. —С. 56-61.
32. Грузина, В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий Текст. /В.Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия. — 2003. — Т. 48. — № 10. — С. 32-39.
33. Дисбактериоз мукозной микрофлоры эзофагогастродуоденальной зоны Текст. / В.В. Чернин [и др.]//Миа. — 2011. — С. 144.
34. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению. 2-е изд., испр. и доп. Текст. / Под ред. Е.И. Ткаченко, А.Н. Суворова// СПб.: Ин-формМед. — 2009. — 276 с.
35. Дисбиотические изменения в полости рта и рост грибов рода Candida как фактор риска нарушения ритма сердца у детей с рефлюкс-эзофагитом Текст. / Шабалов A.M. [и др.] // Проблемы медицинской микологии. — 2010. —Т. 12, —№2. —С. 18-23.
36. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: метод обнаружения и оценка эффективности улавливания бактерий Текст. / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева // Журнал микробиологии 2009. — № 2. — С. 65-67.
37. Доронин, А.Ф. Функциональное питание Текст. / А.Ф. Доронин, Б.А. Шендеров // М.: Грантъ. — 2002. — 296 с.
38. Зверев, В.В. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии Текст. / В.В. Зверев, A.A. Воробьев, A.C. Быков // МИА. — 2-е изд.—2009
39. Иммунорегуляция в системе микрофлора-интестинальный тракт Текст. / С. Хромова [и др.] //Аллергология и иммунология. — 2004. — Т. 5. — № 2. —С. 265-271.
40. Ковальчук, J1.B. Врожденные компоненты иммунитета: Toll- подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии Текст. / Л.В. Ковальчук, Р.В. Хорева, А.С. Варивода // Журнал микробиологии 2005 - № 4 - С. 96-104.
41. Козиренко, Ю.В. Дисбактериоз желудочно-кишечного тракта человека Текст. /Ю.В. Козиренко // Кафедра общеврачебной практики, клиника ВолГМУ. — 16 мая 2007г. — № 1.- http://www.volgograd.ru .
42. Комарова, Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «Капель» Текст. / Н.В. Комарова, Я.С. Камен-цев // СПб.: ООО «Веда». — 2006. — 212 с.
43. Конев, Ю. В. Дисбиозы и их коррекция Текст. /Ю. В. Конев // Consilium medicum. — 2005. — Т. 7. — № 6. — С. 432^137.
44. Корниенко, Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков Текст. / Е.А. Корниенко // Детские инфекции. — 2007. — Т. 6. — № 3. — С. 63-68.
45. Крамарев, С.А. Защитные функции микрофлоры кишечника Текст. / С.А. О.В. Крамарев, Д.С. Янковский, Г.С. Дымент // В помощь педиатру. — 2008. — № 2(11). http://novosti.mif-ua.com/archive/is./article-5782/
46. Кулагина Е.В. Видовой состав бактерий порядка Bacteroidales в микрофлоре кишечника у здоровых людей и характеристика плазмиды, выделенной из B.uniformis Текст.: автореф. дис. . канд.мед.наук: 03.02.03; Кулагина Елена
47. Валерьевна; ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России.
48. Москва, 2011. — 28 с. — Библиогр.: с. 26-27.
49. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии Текст.: учебное пособие / А.Т. Лебедев // БИНОМ. Лаборатория знаний. -2003. — С. 501.
50. Лектины, адгезины и лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидо-бактерий Текст. / В.М. Лахтин [и др.] // Вестник Российской АМН. — 2006.— № 1,— С. 28-34.
51. Лыкова, Е.А. Нарушение микрофлоры кишечника и иммунитета у детей с аллергическими дерматитами и их коррекция Текст. / Е.А. Лыкова, А.О. Му-рашева, В.М. Бондаренко // Росс.Педиатр.журнал. — 2000. — № 2. — С. 88-91.
52. Малов, В.А. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта: современное состояние проблемы Текст. / В.А. Малов, Н.М. Гюлазян // Лечащий врач.2007.— №6,— С. 10-14.
53. Методика изучения адгезивного процесса Текст. / В.И. Брилис [и др.] // Лаб. дело. — 1986. — № 4. — С. 210-212.
54. Микробный пейзаж полости рта у здоровых подростков и больных хроническим гастродуоденитом Текст. / Гаврилова O.A. [и др.] // ЖМЭИ. — 2008. —№6.- С. 59-63.
55. Микрофлора кишечника и механизмы иммунорегуляции Текст. / С.С. Хромова [и др.] // Вопросы детской диетологии. — 2005. — Т. 3. — № 1.— С. 92-96.
56. Микрофлора кишечника у крыс в условиях хронического токсического поражения печени Текст. / A.C. Созинов [и др.] // Журнал микробиол. — 2002.— №3, —С. 60-63.
57. Несвижский, Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценоза человека в норме и патологии Текст. /Ю.В. Несвижский // Вестник Российской АМН, —2003.—№ 1, —С. 49-53.
58. Никитин, В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов Текст. / В.М. Никитин // Кишинев, 1986. — 294 с.
59. Николаева, Т.Н. Иммуностимулирующая и антиканцерогенная активность нормальной лактофлоры кишечника Текст. / Т.Н. Николаева, В.В. Зорина, В.М. Бондаренко // Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. — 2004.4. —С. 39-43.
60. Нилова Л.Ю. К вопросу о применении пробиотиков для коррекции дис-бактериоза толстого кишечника Текст. / Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов, Е.А. Оришак // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова.-2008.-№ 3.- С. 154-157.
61. Новик, Г.И. Продукция гидролаз и антибиотикорезистентность молочнокислых и бифидобактерий Текст. / Г.И. Новик, Н.И. Астапович, Н.Е. Рябая // Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. — Т. 43. — № 2.1. С. 184-192.
62. Определитель бактерий Берджи Текст. // под редакцией Дж. Хоулта с со-авт. — изд. в 2-х томах. — М.: Мир. — 1997. — 800 с.75.0садчук, М.А. Дисбактериоз кишечника Текст. / М.А. Осадчук, М.М. Осадчук // Москва-Нижний Новгород .- 2010. — www.medi.ru.
63. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс Текст. / A.A. Воробьев [и др.] // Журн. микро-биол. — 2005. — № 6. — С. 3-7.
64. Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Приказом Министерства здравоохранения РФ № 231 от 09.06.2003)
65. Парфенов, А.И. Коррекция микрофлоры кишечника пробиотиками у больных антибиотико-ассоциированной диареи Текст. / А.И. Парфенов, И.Н. Ручкина, Г.А. Осипов // Справочник поликлинического врача. — 2006. —№2. —С. 3-6.
66. Парфенов, А.И. Энтерология Текст. / А.И. Парфенов // Миа: руководство для врачей, 2-е изд. доп. и перед. — 2009. — 880 с.
67. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов Текст. / Е.А. Постникова [и др.] // Журн. микробиол. — 2004. — № 2. — С. 64-69.
68. Покровский, В.И. Человек и микроорганизмы. Здоровье и болезнь. Текст. /В.И. Покровский// Весник Российской АМН.-2001.-№ 11- С. 3-6.
69. Похиленко, В. Д. Бактериоцины: их биологическая роль и тенденции применения Текст. / В.Д. Похиленко, В.В. Перелыгин // Электронный научный журнал «Исследовано в России», http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2011/016.pdf — 2011. —С. 165-198.
70. Пробиотическая коррекция антиобиотикассоциированного дисбактериоза кишечника у детей Текст. / С. В. Бельмер [и др.] // Вопросы современной педиатрии: научно-практический журнал. Союз педиатров России (М.). — 2007. — Т. 6. — № 3. — С. 89-93.
71. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus Текст. / С.Г. Ботина [и др.] // Генетика. — 2010. — № 11. — С. 1485-1492.
72. Рыбальченко, О.В. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека Текст. / О.В. Рыбальченко, В.М. Бондаренко, В.П. Добрица // С-Петербург. — 2008. — С. 109.
73. Савицкая, К.И. Современные представления о роли и составе кишечной микрофлоры у здоровых взрослых людей. Текст. / К.И. Савицкая, А.А. Воробьев, Е.Ф. Швецова // Вестник Российской АМН. — 2002. — № 2. — С. 50-53.
74. Семенов A.B. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях Текст.: автореф. дис. . канд. биол. наук 03.00.07 / Семенов A.B.; [Оренбургская госуд. Мед. академия]. — Оренбург. — 2009. — 22 с. — Библиогр.: с. 19-20.
75. Симонова, Е.В. Роль нормальной микрофлоры в поддержании здоровья. Текст. / Е.В. Симонова, O.A. Пономарева // Сибирский медицинский журнал. — 2008. — № 8. — С. 21-28.
76. Синдром избыточного бактериального роста в тонкой кишке: патогенез, клиническое значение и тактика терапии Текст. / Е.А. Лыкова [и др.] // Эксперим. Клин, гастроэнтерол. — 2005. — № 6. — С. 51-57.
77. Способность к формированию биопленок в искусственных системах у различных штаммов Salmonella typhimurium Текст. / Романова Ю.М. [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2006.4. —С. 38-42.
78. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах: Т. 1. Пер с англ. Текст. / Под ред. И. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля — М.: Мир. — 2005. —С. 49.
79. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах: Т. 2. Пер с англ. Текст. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля — М.: Мир, 2005.1. С. 496.
80. Современные представления о механизмах формирования иммунного ответа слизистой оболочки кишечника детей раннего возраста Текст. / М.И. Дубровская [и др.] // Трудный пациент-(гастроэнтерология). — 2006.1. Т. 4, — №6, — С. 9-14.
81. Современные представления о патогенезе инфекционных заболеваний. Текст. / Е.В. Пименов [и др.] // Вестник Российской АМН. — 2003. — № 6,— С. 3-9.
82. Соколова, К.Я. Дисбактериозы: теория и практика Текст. / К.Я. Соколова, И.В. Соловьева // Н.Новгород. — 1999. — 198 с.
83. Споровые пробиотики Текст. / И.Г. Осипова [и др.] // Журн. микробиол.2003. — № 3. — С. 113-119.
84. Стратегические аспекты конструирования пробиотиков будущего Текст. / В.М. Лахтин // Вестник Российской АМН. — 2008.-№ 2.-С. 3344.
85. Терапевтический потенциал пробиотиков: оптимизация иммунного ответа и восстановление экосистемы кишечника Текст. / Л.И. Кафарская [и др.] // Вопросы детской диетологии. — 2005. — Т. 3. — № 1. — С. 72-95.
86. Терапия дисбактериоза мукозной микрофлоры гастродуоденальной зоны при ее воспалительно-эрозивно-язвенных поражениях Текст. /
87. B. В. Чернин, и др. // Терапевтический архив. — 2011. — № 2. — С. 12-16.
88. Ткаченко Е.И. Питание, микробиоценоз и интеллект человека Текст. / Е.И.Ткаченко, Ю.П. Успенский // СПб.: Спецлит, 2006. — 590 с.
89. Урсова, Н.И. Микробиоценоз открытых биологических систем организма в процессе адаптации к окружающей среде Текст. / Н.И. Урсова // Русский медицинский журнал. — 2004.-Т.12 № 16. — С. 957-959.
90. Усенко Д.В. Пробиотики и пробиотические продукты: возможности и перспективы применения Текст. / Усенко Д.В., А.В. Горелов // Вопросы современной педиатрии. — 2004. — Т. 3. — № 2. — С. 50-54.
91. Ферменты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae Текст. /Агапова О.В. [и др.] // Журн. микробиол. — 1999. — № 2. —1. C. 5-8.
92. Хавкин, А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет Текст. / А.И. Хавкин//РМЖ. — 2003. — Т. 11.— №3. — С. 122-126.
93. Хавкин, А. И. Роль пробиотической терапии при инфекции Helicobacter pylori у детей Текст. /А. И. Хавкин, С. Ф. Блат // Детские инфекции: научно-практический журнал Ассоциации педиатров-инфекционистов. — 2007. — Т. 6. — № 4 . — С. 53-58.
94. Хавкин, А.И. Терапия антибиотик-ассоциированного дисбактериоза. Текст. / А.И.Хавкин, Н.С. Жихарева // Русский медицинский журнал. -2006, —Т. 14.—№ 19. —С. 3-7.
95. Хаитов, P.M. Роль паттернраспознающих рецепторов во врожденном и адаптивном иммунитете Текст. / P.M. Хаитов, М.В. Пащенков, Б.В. Пинегин // Иммунология. — 2009. — № 1. — С. 66-76.
96. Хмель, И.А. Экспрессия Quorum sensing генов — перспективная мишень для лекарств в отношении патогенности бактерий Текст. / И.А. Хмель, А.З. Мелицкая // Молекулярная биология. — 2006. — Т. 40, № 2-С. 195-210.
97. Шендеров, Б.А. Базовые механизмы регуляции гомеостаза и их модуляция нутриентами Текст. / Б.А. Шендеров // Клиническое питание. — 2004. — №3. — С. 14-19.
98. Шендеров, Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта — важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина Текст. / Б.А. Шендеров // Клиническое питание. — 2005. — № 2. — С. 2-5.
99. Шендеров, Б.А. Молекулярный язык пробиотических микроорганизмов Текст. / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. — 2009.-№1. — С. 48-49.
100. Шендеров, Б.А. Нормальная микрофлора и её роль в поддержании здоровья человека Текст. / Б.А. Шендеров // Рос.журн.гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 1998. — № 1. — С. 61-64.
101. Шендеров, Б.А. Современное состояние и перспективы развития концепции пробиотики, пребиотики и синбиотики Текст. / Б.А. Шендеров // Пищевые ингредиенты. — 2005. — № 2. — С. 23-26.
102. Шлегель, Г. Общая микробиология Текст. / Г.Шлегель // Пер. с нем. М.: Мир. — 1987. —567 с.
103. Шпаков, А.О. Пептидные аутоиндукторы бактерий Текст. / А.О. Шпаков // Микробиология. — 2009. — Т. 78. — № 3. — С. 291-303.
104. Экспресс-метод диагностики дисбактериоза кишечника Текст. / В.М. Бондаренко [и др.] // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. — 2004. — №2(3). —Ml63 с.
105. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности Текст. / Е.И. Ткаченко [и др.] // Клиническое питание. —2005.—№ 1. —С. 14-20.
106. Эубиотики — эффективные средства нормализации микрофлоры — и вклад МНИИЭМ в их разработку Текст. / В.В. Поспелова [и др.] // Врач, — 1997. —№4. —С. 30-31.
107. Янковский, Д.С. Микроорганизмы и здоровье человека Текст. / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент // К.: Эксперт ЛТД, 2008. — 552 с.
108. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов Текст. / Л.Н. Петров [и др.] // Вестник Российской АМН. — 2006. — № 1. — С. 38-45.
109. A bacteriocin prediction by a new isolate of Lactobacillus rhamnosus GP1 under different culture conditions Text. / A.R.Sarika [et al.] // Adv.J. Food Science and Technology. — 2010. — № 2(5). — P. 291-297.
110. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing Text. /Junjie Qin [et al.] // Nature. — 2010. — № 464. — P. 5965.
111. A molecular view of the intestinal ecosystem Text. / E.E.Vaughan [et al.] // Curr. Issues Intest. MicrobioL. — 2000. — № 1. — P. 1-12.
112. Adherence of probiotic bacteria to human intestinal mucus in healthy infants and during rotavirus infection Text. / M. Juntuncn [et al.] // Clin. Diagn. Lab. ImmunoL. — 2001. — № 8. — P. 293-296.
113. Adhesion of' human Lactobacillus acidophilus strain LB to human entero-cyte-like Caeo-2 ceils Text. / G.J. Chauviere [et al.] // Gen. MicrobioL. — 1992. — № 138. — P. 1689-1696.
114. Adhesion of lactic acid bacteria to Caco-2 cells and their effect on cytokine secretion Text. / H. Morita [et al.] // MicrobioL. ImmunoL. 2002. — № 46. —P. 293-297.
115. Ajmal, S. Probiotic potential of lactobacillus strains in human infections Text. / S. Ajmal, N. Ahmed // African Journal of Microbiology ResearcH. — 2009. — VoL. 3(12). —P. 851-855.
116. Alternative therapies for Helicobacter pylori: probiotics and phytomedicine Text. / J.M. Vitor [et al.] // FEMS Immunol Med MicrobioL. — 2011. — №63(2). —P. 153-164.
117. Ammor, M.S. Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria Text. / M.S. Ammor, Bele 'n Flo 'rez A, B. Mayo // Food MicrobioL. — 2007. — № 24. — P. 559-570.
118. Analysis of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20 Text. / G. W. Tannock [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2000. — № 66. — P. 2578-2588.
119. Antagonism of Helicobacter pylori by bacteriocins of lactic acid bacteria Text. / T.S. Kim [et al.] // J. Food Protect. — 2003. — № 66. — P. 3-12.
120. Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus LJJ against intracellular Salmonella enterica serovar Typhimurium inFecting human enterocyte-like
121. Caeo-2/TC-7 Cells Text. / M.H. Coconnier [et al.] // AppL. Environ. Mi-crobioL. — 2000. — № 66. — P. 1152-1157.
122. Antagonistic activity of Lactobacillus casei strain shirota against gastrointestinal Listeria monocytogenes infection in rats Text. / R. De Waard [et al.] // Int. J. Food MicrobioL. — 2002. — № 73. — P. 93-100.
123. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens Text. / P. Hu"tt [et al.] // Journal of Applied Microbiology. — 2005. — № 100, —P. 1324-1332.
124. Antibiotic resistances of starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. Text. / A.S. Hummel [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2007. — № 73. —P. 730-739.
125. Antibiotic susceptibility of members of the Lactobacillus acidophilus group using broth microdilution and molecular identification of their resistance determinants Text. / S. Mayrhofer [et al.] // Int J Food MicrobioL. — 2010.144(1). —P. 81-87.
126. Antibiotic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains Text. / J.S. Zhoua [et al.] // Int. J. Food MicrobioL. —2005. — № 98. — P. 211-217.
127. Antidiabetic effect of Lactobacillus GG in streptozotocininduced diabetic rats Text. / M. Tabuchi [et al.] // Biosci. BiotechnoL. Biochem. — 2003.67. —P. 1421-1424.
128. Antimicrobial peptides: properties, and applicability Text. / T. Van [et al.] //BioL. Chem. —2001.—№382. — P. 597-619.
129. Assessment of Lactobacillus species colonizing the vagina of apparently healthy Nigerian women, using PCR-DGGE and 16S rRNA gene sequencing Text. / K. C. Anukam [et al.] // World J. MicrobioL. BiotechnoL. —2006. — № 22. — P. 1055-1060.
130. Bacteria-host communication: the language of hormones Text. / V. Speran-dio [et al.] // Proc. NatL. Acad. Sei. USA. — 2003. — № 100. — P. 89518956.
131. Bacteriocins: sale, natural antimicrobials for food preservation Text. / J. Cleveland [et al.] // Int. J. Food MicrobioL. — 2001. — № 71. — P. 1-20.
132. Bacteroides coprophilus sp. nov., isolated from human faeces Text. / Hidenori Hayashi [et al.] // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. — 2007. — VoL. 57. — № 6. — P. 1323-1326.
133. Bals, R. Antimicrobial peptides and peptide antibiotics Text. / R. Bals // Med. Clin. — 2000. — № 95. — P. 496-502.
134. Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinal microflora exert antimicrobial activity Text. / V. Lievin [et al.] // Gut. — 2000. — № 47. — P. 646-652.
135. Biodiversitybased identification and functional characterization of the man-nose-specific adhesin of Lactobacillus plantarum Text. / G. Pretzer [et al.] //J. BacterioL.— 2005. — № 187. —P. 6128-6136.
136. Biofilms: the matrix revisited Text. / S.S. Branda [et al.] // Trends MicrobioL. — 2005. — № 13. —P. 20-26.
137. Blandino, G. Probiotics: overview of microbiological and immunological characteristics Text. / G. Blandino, D. Fazio, R. Marco // Expert Rev. Anti Infect. Ther. — 2008. -VoL. 6. — № 4. — P. 497-508.
138. Boirivant, M. The mechanism of action of probiotics Text. / M. Boirivant, W. Strober // Curr. Opin. GastroenteroL. — 2007. — № 23. — P. 679-692.
139. Boman, H.G. Innate immunity and the normal microflora Text. / H.G. Boman// ImmunoL. Rev. — 2000. — № 173. — P. 5-16.
140. Boyle, R. J. The role of probiotics in the management of allergic disease Text. / R. J. Boyle, M. L. K. Tang // Clin. Exp. Allergy. — 2006. — № 36. — P. 568-576.
141. Callewaert, R. Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE 471 is improved and stabilized by fed-batch fermentation Text. / R. Callewaert, De Vuyst // L. AppL. Environ. Microbiol.-2000.-№ 66.-P.606-613.
142. Camilleri, M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, putative mechanisms, and evidence of clinical efficacy Text. / M.Camilleri // J. Clin. GastroenteroL. — 2006. — № 40. — P. 264-269.
143. Careri, M. Analysis of food proteins and peptides by chromatography and mass spectrometry Text. / M. Careri, A. Mangia // J. of Chromatography A.- 2003. — № 1000. — Is. 1-2. — P. 609-635.
144. Cebra, J.J. Influences of microbiota on intestinal immune system development Text. / J.J. Cebra // Am. J. Clin. Nutr. — 1999. — № 69. — P. 1046S-1051S.
145. Cell surface-associated lipoteichoic acid acts as an adhesion factor for attachment of Lactobacillus johnsonii Lai to human enterocyte-like Caco-2 cells Text. / D.Granato [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 1999. — №65, —P. 1071-1077.
146. Characterization of bacteriocins produced by Lactobacillus brevis NM 24 and L.fermentum NM 332 isolated from green olives in Iran Text. / N. Mo-jgani [et al.] // The Internet Journal of Microbiology. — 2009. — № 6(4). http://www.ispub.com
147. Characterization of Lactobacillus from Algerian goat's milk based on phe-notypic, 16S rDNA sequencing and their technological properties Text. / Marroki, A. [et al.] // Brazilian Journal of Microbiology. — 2011. — № 42.1. P. 158-171.
148. Chemotaxonomic analysis of bacterial populations colonizing the rectal mucosa in patients with ulcerative colitis Text. / S. Macfarlane [et al.] // Clin. Infect. Dis. — 2004. —№ 38. —P. 1690-1699.
149. Christensen, H.R. Lactobacilli differentially modulate expression of cytokines and maturation surface markers in murine dendritic cells Text. / H.R. Christensen, H. Frokiaer, JJ. Pestka // J. ImmunoL. — 2002. — № 168. —P. 171-178.
150. Claesson, M. J. The genus Lactobacillus — a genomic basis for understanding its diversity Text. / M. J. Claesson, D. van Sinderen, P. W. O'Toole // FEMS MicrobioL. Lett. — 2007. — № 269. — P. 22-28.
151. Coaggregation of urogenital bacteria in vitro and in vivo Text. / G.Reid et aL. // Curr. MicrobioL. — 1990. — № 20. — P. 47-52.
152. Colonization and immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the human gastrointestinal tract Text. / N. Valeur [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2004. — № 70. — P. 1176-1181.
153. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria Text. / J. Boekhorst [et al.] // Microbiology. — 2006. — № 152. — P. 273-280.
154. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1 Text. / M. Kleerebezem [et al.] // Proc. NatL. Acad. Sei. USA. — 2003. — № 100. — P. 1990-1995.
155. Computational modeling of differences in the quorum sensing induced luminescence phenotypes of Vibrio harveyi and Vibriocholerae Text. / A.T. Fenley [et al.] // J Theor BioL. — 2011. — № 274(1). — P. 145-153.
156. Cunliffe, R.N. Antimicrobial peptides in innate intestinal host defence Text. / R.N. Cunliffe, Y.R. Mahida// Gut. — 2000. — № 47. — P. 16-17.
157. Cytokine production by the murine macrophage cell line J774.1 after exposure to lactobacilli Text. / H. Morita [et al.] // Biosci. Biotech-noL. Biochem. — 2002. — № 66. — P. 1963-1966.
158. D-Alanyl ester depletion of teichoic acids in Lactobacillus reuteri 100-23 results in impaired colonization of the mouse gastrointestinal tract Text. / J. Walter [et al.] // Environ. MicrobioL. — 2007. — № 9. — P. 1750-1760.
159. De Keersmaecker, S. C. J. Constraints on detection of autoinducer-2 (Al-2) signalling molecules using Vibrio harveyi as a reporter Text. / S. C. J. De Keersmaecker, J. Vanderleyden // Microbiology 2003- №149- P. 19531956.
160. Deshpande, G. Probiotics for prevention of necrotising enterocolitis in preterm neonates with very low birthweight: a systematic review of randomised controlled trials Text. / G. Deshpande, S. Rao, S. Patole // Lancet. — 2007. — №369. —P. 1614-1620.
161. Defense factors of vaginal lactobacilli Text. / A. Aroutcheva [et al.] //Am. J. Obstet. GynecoL. —2001, —№ 185. —P. 375-379.
162. Dietary synbiotics reduce cancer risk factors in polypectomized and colon cancer patients Text. / J. Rafter [et al.] // Am. J. Clin. Nutr. — 2007. — № 85. —P. 488-496.
163. Differences in the composition of vaginal microbial communities found in healthy Caucasian and black women Text. / X. Zhou [et al.] // ISME J. — 2007, —№ 1. —P. 121-133.
164. Differential Toll-like receptor recognition and induction of cytokine profile by Bifidobacterium breve and Lactobacillus strains of probiotics Text. / T.S.Plantinga [et al.] // Clin Vaccine ImmunoL.-2011,- № 18(4). — P. 621-628.
165. Displacement of bacterial pathogens from mucus and Caco-2 cell surface by lactobacilli Text. / Y.K. Lee [et al.] // J. Med. MicrobioL. — 2003. — № 52.— P. 925-930.
166. Distinct immune response induced by peptidoglycan derived from Lactobacillus spp. Text. / J. Sun [et al.] // World J. GastroenteroL. — 2005. — V. 11. №40. —P. 6330-6337.
167. Duncan, S. H. Lactate-utilizing bacteria, isolated from human feces, that produce butyrate as a major fermentation product Text. / S. H. Duncan, P. Louis, H. J. Flint // AppL. Environ. MicrobioL. — 2004. — № 70. — P. 5810-5817.
168. Durant, J. A. Short-chain volatile fatty acids modulate the expression of the hilA and invF genes of Salmonella Typhimurium Text. / J. A. Durant, D. E. Corrier, S. C. Ricke // J. Food Prot. — 2000. — № 63. — P. 573-578.
169. Ennahar, S. Phylogenetic diversity of lactic acid bacteria associated with paddy rice silage as determined by 16S ribosomal DNA analysis Text. / S. Ennahar, Y. Cai, Y. Fujita // AppL. Environ. MicrobioL. — 2003. — № 69. p. 444-451.
170. Effect of different probiotic preparations on ami-Helicobacter pylori therapy-related side effects: a parallel group, triple blind, placebo-controlled study Text. / F. Crcmonini //Am. J. Gastroenterol.-2002.-№97.-P.2744-2749.
171. Effect of pepsin-treated bovine and goat caseinomacropeptide on Escherichia coli and Lactobacillus rhamnosus in acidic conditions Text. / G. Robitaille [et al.] // J Dairy Sei. — 2012. — № 95(1). — P. 1-8.
172. Effect of probiotic strains on interleukin 8 production by IIT29/19A cells Text. / K.M. Lammers [et al.] // Ani. J. GastroenteroL. — 2002. — № 97.1. P. 1182-1186.
173. Effect of respiration and manganese on oxidative stress resistance of Lactobacillus plantarum Text. / Masayuki Watanabe [et al.] // Microbiology.2012, —№ 158. —P. 293-300.
174. Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhoea: a meta-analysis of masked, randomised, placebo-controlled trials Text. / S. Sazawal [et al.] // Lancet Infect. Dis. — 2006. — № 6. — P. 374-382.
175. Emerging molecular insights into the interactions between probiotics and the host intestinal mucosa Text. / Peter A. Bron [et al.] // Nature reviews. Microbiology. — 2011- P. 66-78.
176. Enterotypes of the human gut microbiome Text. / M. Arumugam [et al.] // Nature. —2011,—№473,—P. 174-180.
177. Essid, I Technological and safety properties of Lactobacillus plantarum strains isolated from a Tunisian traditional salted meat Text. / I. Essid, M. Medin, M. Hassouna // Meat Sei. — 2009. — № 81. — P. 203-208.
178. Evaluation of probiotic characteristics of newly isolated Lactobacillus spp.: immune modulation and longevity Text. / J. Lee [et al.] // Int J Food Mi-crobioL.—2011. —№ 148(2). —P. 80-86.
179. Evaluation of the antagonistic effect of Lactobacillus acidophilus on clinical strains of Helicobacter pylori Text. / E Andrzejewska [et al.] // Med Dosw Mikrobiol. — 2007. — № 59(1). — P. 59-64.
180. Examination of adhesive determinants in three species of Lactobacillus isolated from chicken Text. / C. Gusils [et al.] // Can. J. MicrobioL. — 2002. —№ 48, —P. 34-42.
181. Extracellular MUC3 mucin secretion follows adherence of Lactobacillus strains to intestinal epithelial cells in vitro Text. / D. R. Mack [et al.] // Gut.— 2003. —№52. —P. 827-833.
182. Falagas, M. E. Probiotics for the treatment of women with bacterial vaginosis Text. / M. E. Falagas, G. I. Betsi, S. Athanasiou // Clin. MicrobioL. Infect. — 2007. — № 13. — P. 657-664.
183. Fedorak, R. N. Probiotics and the management of inflammatory bowel disease Text. / R. N. Fedorak, K. L. Madsen// Inflamm. Bowel Dis. — 2004. — № 10.—P. 286-299.
184. Food supplementation with milk fermented by Lactobacillus casei DN-114 001 protects suckling rats from rotavirus-assotiated diarrhea Text. / C. Guerin-Danan [et al.] // J. Nutr. — 2001. — № 131. — P. 111 -117.
185. Functional analysis of promoters involved in quorum sensing-based regulation of bacteriocin production in Lactobacillus Text. / P.A. Risoen [et al.] // MoL. MicrobioL. — 2000. — № 37. — P. 619-628.
186. Functional analysis of putative adhesion factors in Lactobacillus acidophilus NCFM Text. / B. L. Buck [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2005. — №71.— P. 344-8351.
187. Galacto-oligosaccharides and long-chain fructo-oligosaccharides as prebiot-ics in infant formulas: a review Text. / S. Fanaro [et al.] // Acta Paediatr SuppL. — 2005. — № 94(449). — P. 22-26.
188. Galdeano, C.M. The probiotic bacterium Lactobacillus casei induces activation of the gut mucosal immune system through innate immunity Text. / C.M. Galdeano, G. Perdigon // Clin. Vaccine ImmunoL. — 2006. — VoL. 13. —№2. —P. 219-226.
189. Ganz, T. Antimicrobial proteins and peptides in host defense Text. / T. Ganz // Serain. Respir. Infect. — 2001. — № 16. — P. 4-10.
190. Ganzle, M. G. Exopolysaccharide production by intestinal lactobacilli Text. / M. G. Ganzle, C. Schwab// In G. W. Tannock (ed.), Probiotics & prebiot-ics: scientific aspects. Caister Academic Press, Norfolk, United Kingdom. — 2005, —P. 83-96.
191. Genetic diversity of the pin locus among oenological Lactobacillus planta-rum strains Text. / Y.Saenz // Int.J.Food MicrobioL. — 2009. — № 134. — P. 176-183
192. Genome-scale analyses of health-promoting bacteria: probiogenomics Text. / M. Ventura [et al.] // Nature Rev. MicrobioL. — 2009. — VoL. 7. — P. 6171.
193. Genome sequence of Lactobacillus helveticus, an organism distinguished by selective gene loss and insertion sequence element expansion Text. / M. Callanan [et al.] // J. BacterioL. — 2008. — № 190. — P. 727-735.
194. Genomic diversity of cultivable Lactobacillus populations residing in the neonatal and adult gastrointestinal tract Text. /Rebecca Wall [et al.] // FEMS MicrobioL. EcoL. — 2007. — № 59. — P. 127-137
195. GroEL of Lactobacillus johnsonii Lai (NCC 533) is cell surface associated: potential role in interactions with the host and the gastric pathogen Helicobacter pylori Text. / G. E. Bergonzelli // Infect. Immun 2006. — № 74. — P. 425-434.
196. Gut microflora. Digestive physiology and pathology Text. / J.-C. Rambaud [et al.]. — London: John Libbey. — 2006. — 247 p.
197. Gupta,V. Probiotics Text. / V. Gupta, R. Garg // Indian Journal of Medical Microbiology. — 2009. — № 3. — P. 202-209.
198. Hancock, R.H. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics Text. / R.H. Hancock, A. Patrzykat // Curr. Drug Targets Tnfect. Disord. — 2002. — № 2. — P. 79-83.
199. Hedin, C. Evidence for the use of probiotics and prebiotics in inflammatory bowel disease: a review of clinical trials Text. / C. Hedin, K. Whelani, J. O. Lindsay//Proc. Nutr. Soc. — 2007.— № 66. — P. 307-315.
200. Heiander, I.M. Permeability barrier of the gram-negative bacterial outer membrane with special reference to nisin Text. / I.M. Heiander, T. Mattila-Sandholm // Int. J. Food MicrobioL. — 2000. — № 60. — P. 153-161.
201. H. pylori colocatises with MUC5AC in the human stomach Text. / G.R. Van Den Brink [et al.] // Gut. — 2000. — № 46. — P. 601-607.
202. Henke, J. M. Three parallel quorum-sensing systems regulate gene expression in Vibrio harveyi Text. / J. M. Henke, B. L. Bassler // J. BacterioL. — 2004. — № 186. — P. 6902- 6914.
203. Hiemstra, P.S. F. pithelial antimicrobial peptides and proteins: their roje in host defence and inflammation Text. / P.S. Hiemstra // Paediatr. Respir. — 2001.—Rev. 2,—P. 306-310.
204. High-level folate production in fermented foods by the B12 producer Lactobacillus reuteri JCM1112 Text. / F. Santos [et al.] // AppL. Environ. Mi-crobioL. — 2008. — № 74. — P. 3291-3294.
205. Hooper, L.V. Commensal host-bacterial relationships in the gut Text. / L.V. Hooper, J.I. Gordon // Science. — 2001. — № 292. — P. 1115-1118.
206. Hooper, L.V. How host-microbial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine Text. / L.V. Hooper, T. Midtvedt, J. I. Gordon // Annu. Rev. Nutr. — 2002. — № 22. — P. 283-307.
207. Hopkins, M.J. Variation in human intestinal microbiota with age Text. / M.J. Hopkins, R. Sharp, G.T. Macfeirlane // Dig. Liver Dis. — 2002. — № 34. -SuppL. 2. — P. S12-S18.
208. Hughes, D. T. Inter-kingdom signalling: communication between bacteria and their hosts Text. / D. T. Hughes, V. Sperandio // Nat. Rev. MicrobioL. — 2008. — № 6. — P. 111 -120.
209. Hydrogen peroxide production by Lactobacillus johnsonii NCC 533 and its role in anti-Salmonella activity Text. / R. D. Pridmore [et al.] // FEMS MicrobioL. Lett. — 2008. — № 283. — P. 210-215.
210. Hemagglutination, adherence and surface properties of vaginal Lactobacillus species Text. / A. Andreu et aL. // J. Infect. Dis.-1995.-№ 171. — P. 12371243.
211. Identification of Lactobacillus plantarum genes modulating the cytokine response of human peripheral blood mononuclear cells Text. / S. van Hemert [et al.] // BMC Microbiology. — 2010. — № 10. — 293 p.
212. Immunomodulating effects of milks fermented by Lactobacillus helvetims and its non-proteolytic variant Text. / C. Matar [et al.] // J. Dairy Res. — 2001. —№68.—P. 601-609.
213. Immunomodulating effects of peptidic fractions issued from milk fermented with Lactobacillus helveticus Text. / J.G. Leblanc [et al.] // J. Dairy Sei. 2002. — № 85. — P. 2733-2742.
214. Immune-stimulating effects of lactic acid bacteria in vivo and in vitro Text. /1. Elmadfa [et al.] // Proc Nutr Soc. — 2010. — № 69(3). — P.416-420.
215. Impact of environmental and genetic factors on biofilm formation by the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG Text. / S. Lebeer [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2007. — № 73. — P. 6768-6775.
216. In Vitro and In Vivo Inhibition of Helicobacter pylori by Lactobacillus casei Strain Shirota Text. / D. Sgouras [et al.] // Applied and Environmental Microbiology, January. — 2004. — VoL. 70. — № 1. — P. 518-526.
217. In vitro evaluation of Lactobacillus gasseri strains of infant origin on adhesion and aggregation of specific pathogens Text./ C.L. Ferreira[et al.] // J Food Prot. — 2011. — № 74(9). — P. 1482-1487.
218. Identification of a low molecular mass bacteriocin, rhamnosin A, produced by Lactobacillus rhamnosus strain 68 Text. / R.Dimitrijevic [et al.] // J Appl MicrobioL. — 2009. — № 107(6). — P. 2108-2115.
219. Isolation and characterization of plantaricin ASM1: A new bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum A-l Text. / T. Hata [et al.] // International Journal of Food Microbiology. — 2010. — № 137(1). — P. 94-99.
220. Inactivation of Salmonella Enteritidis strains by combination of high hydrostatic pressure and nisin Text. / J. Lee, G.Kaletun? // Int J Food MicrobioL. — 2010. — № 140(1). —P. 49-56.
221. Increased complexity of the species composition of lactic acid bacteria in human feces revealed by alternative incubation condition Text. / F. Dal Bello [et al.] // Microb. EcoL. — 2003. — № 45. — P. 455-463.
222. Increased tumor necrosis factor alpha production in Chron s disease can be downregulated ex vivo by probiotic bacteria Text. / N. Borruel [et al.] // Gut. — 2002. — № 51. — P. 659-664.
223. Induction of cytokines and nitric oxide in murine macrophages stimulated with enzymatically digested lactobacillus strains Text. / D.W. Kim [et al.] // J MicrobioL. — 2007. — № 45(5). — P. 373-378.
224. Induction of nitric oxide synthesis by probiotic Lactobacillus rhanmostts GG in J774 macrophages and human T84 intestinal epithelial cells Text. / R. Korhoncn [et al.] // Inflammation. — 2001. — № 25. — P. 223-232.
225. Influence of intensive and extensive breeding on lactic acid bacteria isolated from Gallus gallus domesticus ceca Text. / M.R. Souza [et al.] // Vet MicrobioL. — 2007. — № 120(1-2). —P. 142-150.
226. Inhibition of the adherence of Escherichia coli strains to basement membrane by Lactobacillus crispaius expressing an S-layer Text. / M. Horie [et al.] / J. AppL. MicrobioL. — 2002. — № 92. — P. 396-403.
227. Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri Text. / T. Mukai [et al.] // FEMS ImmunoL. Med. MicrobioL. — 2002. — № 32. — P. 105-110.
228. Inhibition of in vitro growth of Shiga toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 by probiotic Lactobacillus strains due to production of lactic acid Text. / M- Ogawa [et al.] // Int. J. Food Microbiol.-2001.-№68. — P. 135-140.
229. Inhibition of Fungi and Gram-Negative Bacteria by Bacteriocin BacTN635 Produced by Lactobacillus plantarum sp. TN635 Text. / S. Smaoui [et al.] // Applied Biochemistry and Biotechnology. — 2010. — № 162(4). -P. 1132-1146.
230. Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics Text. / E. Lönnermark [et al.] // J Clin GastroenteroL. — 2010. — № 44(2). — P. 106-112.
231. Interference of Lactobacillus plantarum with Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns: The potential use of probiotics in wound treatment
232. Text. / J.C. Valdez et al.] // Clin Microbiol Infect.-2005.-№l 1. p. 472479.
233. Intestinal Microbiota in Neonates and Preterm Infants: A Review Text. / M. F. de La Cochetiere [et al.] // Current Pediatric Reviews.-2007.-№3- P. 2134.
234. Intestinal stem cells and epithelial-mesenchymal interactions in the crypt and stem cell niche Text. / A. Shaker [et al.] // Transl Res. — 2010. — № 156(3).-P. 180-187.
235. Isolation and identification of Lactobacillus species from the vagina and their antimicrobial properties Text. / A. Mansour [et al.] // African Journal of Microbiology ResearcH. — 2011. — VoL. 5(20). — P. 3300-3304.
236. Isolauri, E. Probiotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation? Text. / E. Isolauri, P.V. Kirjavaiuen, S. Salminen // Gut. — 2002. — № 50. — SuppL. 3. — P. III54-III59.
237. Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002.
238. Kaboosi, Hami Antibacterial effects of probiotics isolated from yoghurts against some common bacterial pathogens Text. / Hami Kaboosi // African Journal of Microbiology ResearcH. — 2011. — VoL. 5(25).—P. 4363-4367.
239. Kaper, J. B. Bacterial cell-to-cell signaling in the gastrointestinal tract Text. / J. B. Kaper, V. Sperandio // Infect. Immun. — 2005. — № 73. — P. 31973209.
240. Klaenhammer, T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria Text. / T.R. Klaenhammer // FEMS MicrobioL. Rev.-1993.- № 12. — P. 39-85.
241. Koczulla, A.R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential Text. / A.R. Koczulla, R. Bals // Drugs.-2003.-№ 63. — P. 389406.
242. Lactic acid permeabilizes gram-negative bacteria by disrupting the outer membrane Text. / H. L. Alakomi [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2000. —№66, —P. 2001-2005.
243. Lactobacillus Acidophilus strain L-92 regulates the production of Thl cytokine as well as Th2 cytokines Text. / A. Torii [et al.] // Allergol Int. 2007.56(3). —P. 293-301.
244. Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria Text. / M.F. Bernct [et al.] // Gut 1994. — № 35. — P. 483-489.
245. Lactobacillus acidophilus NCFM affects host adhesion-related gene expression after adhering to host Text. / L. Han [et al.] // Wei Sheng Wu Xue Bao. — 2011. — № 51(5). — P. 609-614.
246. Lactobacillus acidophilus modulates intestinal pain and induces opioid and cannabinoid receptors Text. / C. Rousseaux [et al.] // Nat. Med. — 2007.13. —P. 35-37.
247. Lactobacillus by-products inhibit the growth and virulence of uropatho-genic Escherichia coli Text. / P.A. Cadieux [et al.] // J Physiol Pharmacol — 2009.—№ 6. — P. 13-18.
248. Lactobacillus crustorum sp. nov., isolated from two traditional Belgian wheat sourdoughs Text. / Ilse Scheirlinck [et al.] / International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. — 2007. — VoL. 57. — № 7. — P. 1461-1467.
249. Lactobacillus delbrueckii subsp lactis strain CIDCA 133 inhibits nitrate reductase activity of Escherichia coli Text. / A.A. Hugo [et al.] // Int J Food MicrobioL. — 2006. — № 111(3). — P. 191-196.
250. Lactobacillus fermentum RC-14 inhibits Staphylococcus aureus infection of surgical implants in rats Text. / B.S. Gan [et al.] // J. Infect. Dis. — 2002. -№ 185. —P. 1369-1372.
251. Lactobacillus johnsonii Lai shares carbohydrate-binding specificities with several enteropathogenic bacteria. Text. / J.R. Neeser [et al.] // Glycobiol-ogy. —2000. —№ 10. —P. 1193-1199.
252. Lactobacillus reuteri ATCC 55730 and L22 display probiotic potential in vitro and protect against Salmonella-induced pullorum disease in a chick model of infection Text. / D. Zhang [et al.] // Res Vet Sci. — 2011.
253. Lactobacillus rhamnosus strain GG prevents enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7-induced changes in epithelial barrier function Text. / K. C. Johnson-Henry [et al.] // Infect. Immun. — 2008. — № 76. — P. 1340-1348.
254. Lactobacillus strains and vaginal ecology Text. / P. Cadieux [et al.] // JAMA. —2002. —№287. —P. 1940-1941.
255. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics Text. / D. J. Lane // Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley. — 1991. — P. 115-175.
256. Le Bouguenec, C. Adhesins and invasins of pathogenic Escherichia coli Text. / C. Le Bouguenec // Int. J. Med. Microbiol.- 2005.- № 295.-P.471-478.
257. Lee, Y.K. Competition for adhesion between probiotics and human gastrointestinal pathogens in the presence of carbohydrate Text. / Y.K. Lee, K.Y. Puong//Br. J. Nutr.—2002. —№ 88. —SuppL. 1,—P. S101-S108.
258. Leroy, F. A combined model to predict the functionality of the bacteriocin-producing Lactobacillus sakei strain CTC 494 Text. / F. Leroy, L. De Vuyst // AppL. Environ. MicrobioL. —2003. — № 69. — P. 1093-1099.
259. Liong, M. T. Safety of probiotics: translocation and infection Text. / M. T. Liong // Nutr.Rev. — 2008. — № 66. — P. 192-202.
260. Lorea, G. L. Characterization of the protein synthesis dependent adaptive acid tolerance response in Lactobacillus acidophilus Text. / G. L. Lorea, G.
261. F. de Valdez, A. Ljungh // J. MoL. MicrobioL. Biotechnol.-2002.-№4.-P.525-532.
262. Lysate of probiotic Lactobacillus caseiDN-114 001 ameliorates colitis by strengthening the gut barrier function and changing the gut microenvironment Text. / Z. Zakostelska [et al.] // PLoS 0ne.-2011.-№6(ll). www.plosone.org
263. Making sense of quorum sensing in lactobacilli: a special focus on Lactobacillus plantarum WCFS1 Text. / M. H. Sturme [et al.] // J. Microbiology. — 2007. —№ 153. —P. 3939-3947.
264. Marco, M. L. Towards understanding molecular modes of probiotic action Text. / M. L. Marco, S. Pavan, M. Kleerebezem // Curr. Opin. Biotech-noL. -2006. —№ 17, —P. 204-210.
265. Martin D.H. The Microbiota of the Vagina and Its Influence on Women's Health and Disease Text. / Am J Med Sei. — 2012. — № 343(1). — P. 2-9.
266. Mary, S. L. Mass Spectrometry of Proteins and Peptides Text. / S. L.Mary, P.-T. Ljiljana // Methods and Protocols, Second Edition.-Humana Press-2009.
267. Mass spectrometry of peptides and proteins Text. / H. W. Vicki [et al.] // Methods. — 2005. — № 35. — P. 211-222.
268. Mcauliffe, O. Luntibiotics: structure, biosynthesis and mode of action Text. / O. Mcauliffe, R.P. Ross, C. Hill // FEMS MicrobioL. Rev. — 2001. — №25. —P. 285-308.
269. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response Text. / R. Medzhitov // Nature. — 2007. — № 449. — P. 819-826.
270. Meurman, J. H. Probiotics: contributions to oral health Text. / J.H. Meurman, I. Stamatova // Oral Dis. — 2007. — № 13. — P. 443-451.
271. Microbial ecology—human gut microbes associated with obesity Text. / R. E. Ley [et al.] // Nature. — 2006. — № 444. — P. 1022-1023.
272. Microflora modulates endocrine cells in the gastrointestinal mucosa of the rat Text. / A. Uribe [et al.] // Gastroenterology.-1994.- №107.- P. 12591269.
273. Mi-Hwa,0 Antiviral Activity of Lactobacillus spp. and Polysaccharide Text. / Oh Mi-Hwa, Lee Sung-Geun, Paik Soon-Young // J.Bacterio.ViroL. — 2010. — № 40(4). — P. 145-150.
274. Molecular modulation of intestinal epithelial barrier: contribution of micro-biota Text. / R. Sharma [et al.] // J Biomed BiotechnoL. — 2010. — № 30. — P. 58-79.
275. Mode of action of acidocin D20079, a bacteriocin produced by the potential probiotic strain, Lactobacillus acidophilus DSM 20079 Text. / S. Deraz [et al.] J. Ind. MicrobioL. BiotechnoL. — 2007. — № 34. — P. 373-379.
276. Modeling growth and baeteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471 in response to temperature and pH values used for sourdough fermentations Text. / W. Messens [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2002, — №68, — P. 1431-1435.
277. Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine Text. / L.V. Hooper [et al.] // J.I. Science. — 2001. — № 291. — P. 881-884.
278. Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA Text. / H. G. H. J. Heilig [et al.] // Environ. MicrobioL. — 2002. — №68.-P. 114-123.
279. Molecular monitoring of fecal microbiota of healthy human subjects during administration of lactulose and Saccharomyces boulardii Text. / T.Vanhoutte [et al.] // AppL. Environ. MicrobioL. — 2006. — № 72(9). — P. 5990-5997.
280. Neish, A.S. Microbes in gastrointestinal health and diseases Text. / A.S. Neish // Gastroenterology. — 2009. — V. 136. — № 1. — P. 65-80.
281. Nes, I.F. Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria Text. / I.F. Nes, H. Holo // Biopolymers. — 2000. — № 55. — P. 50-61.
282. Neysens, P. Effect of sodium chloride on growth and baeteriocin production by Lactobacillus amvlovorw DCE 471 Text. / P. Neysens, W. Messens, L. De Vuyst // Int. J. Food MicrobioL. — 2003. — № 88. — P. 29-39.
283. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms Text. / K.E. Pavia [et al.] // Biochim Biophys Acta. — 2011-P. 869-76.
284. Optimum bacteriocin production by Lactobacillus plantarum 17.2b requires absence of NaCl and apparently follows a mixed metabolite kinetics Text. / A.Delgado [et al.] //J BiotechnoL. — 2007. — № 15. —P. 193-201.
285. Oral administration of Lactobacillus acidophilus induces IL-12 production in spleen cell culture of BALB/c mice bearing transplanted breast tumour Text. / M.H. Yazdi [et al.] // Br J Nutr. — 2010. — № 104(2). — P. 227232.
286. O'Toole G. Biofilm formation as microbial development Text. / G. O'Toole, H.B. Kaplan, R. Kolter // Annu. Rev Microbiol. — 2000. — № 54.1. P. 49-79.
287. Ouwehand, A.C. Probiolics: an overview of beneficial effects Text. / A.C. Ouwchand, S. Salmincn, E. Isolauri // Antonie Van Leeuwenhoek. — 2002.82. —P. 279-289.
288. Perea VeTez, M. Adherence factors of Lactobacillus in the human gastrointestinal tract Text. / M. Perea VeTez, S. C. J. De Keersmaecker, J. Vander-leyden // FEMS MicrobioL. Lett. — 2007. — № 276. — P. 140-148.
289. Preventive effects of Bifidobacterium- and Lactobacillus-fermented milk on the development of inflammatory bowel disease in senescence- accelerated mouse Pl/Yit strain mice Text. / S. Matsumolo [et al.] // Digestion. — 2011. —№64. —P. 92-99.
290. Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamttosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties Text. / C. Forestier [et al.] // Res. MicrobioL. —2001. —№ 152, —P. 167-173.
291. Probiotic modulation of symbiotic gut microbial-host metabolic interactions in a humanized microbiome mouse model Text. / F. P. J. Martin [et al.] // MoL. yst. BioL.— 2008. — №4. — P. 157.
292. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial Text. / M. G. H. Besselink [et al.] // Lancet. — 2008. — № 371. — P. 1246.
293. Probiotics ameliorate the hydrogen peroxide-induced epithelial barrier disruption by a PKC- and MAP kinase-dependent mechanism Text. / A. Seth [et al.] // Am. J. PhysioL. Gastrointest. Liver PhysioL. — 2008. — № 294. — P. G1060-G1069.
294. Probiotics affect virulence-related gene expression in Escherichia coli 0157:H7 Text. / M. J. Medellin-Pena [et al.] // AppL. Environ. Micro-bioL. — 2007. — № 73. — P. 4259-4267.
295. Probiotics and Helicobacter pylori eradication Text. / F. Canducci [et al.] // Dig. Liver Dis. — 2002. — № 34. — SuppL. 2. — P. SSI-83.
296. Probiotics and immunity Text. / Andrea T. Borchers [et al.] // Journal of Gastroenterology January. — 2009. — № 44. — P. 26-46.
297. Probiotics: delineation of prophylactic and therapeutic benefits Text. / I.P. Kaur [et al.] // J.Med.Food. — 2009. — VoL. 12. — № 2. — P. 219-235.
298. Probiotics: from myth to reality: Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials Text. / C. Dunne [et al.] Antonie Van Leeuwenhoek. — 1999. — № 76. — P. 279-292.
299. Probiotics in food: their potential to impact human health Text. / M.E. Sanders [et al.] // Council for agricultural science and technology (CAST). — 2007. -http://www.cast-science.org/displayProductDetails.asp?idProduct=144
300. Probiotics inhibit nuclear factor-kappa B and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition Text. / E. O. Petrof [et al.] // Gastroenterology. — 2004. — № 127. — P. 1474-1487.
301. Probiotics to minimize the disruption of faecal microbiota in healthy subjects undergoing antibiotic therapy Text. / A. Engelbrektson [et al.] // Journal of Medical Microbiology. — 2009. — № 58(5). — P. 663-670.
302. Probiotics up-regulate MUC-2 mucin gene expression in a Caco-2 cell-culture model Text. / A.F. Mattar [et al.] // Pediatr. Surg. Int. — 2002. — № 18.—P. 586-590.
303. Production kinetics of acidophilin 801, a baeteriocin produced by Lactobacillus acidophilus IBB 801 Text. / M. Zamfir [et al.] // FEMS MicrobioL. Lett. — 2000. — № 190. — P. 305-308.
304. Production of antimicrobial substances by lactic acid bacteria I: determination of hydrogen peroxide Text. / M.S. Tomás [et al.] // Methods Mol BioL. — 2004. — № 268. — P. 337-346.
305. Production of class II bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication Text. / V. G. H. Eijsink [et al.] // Antonie van Leeuwenhoek. — 2002. — № 81. — P. 639-654.
306. Protection against translocating Salmonella typhitmirium infection in mice by feeding the immuno-enhancing probiotic Lactobacillus rhamnosus strain HNQ01 Text. / H.S. Gill [et al.] // Med. MicrohioL. ImmunoL. — 2001. — № 190. —P. 97-104.
307. Protective effect of Lactobacillus casei strain Shirota on Shiga toxin- producing Escherichia coli 0157:H7 infection in infant rabbits Text. / M. Ogawa [et al.] // Infect. Immun. — 2001. —№ 69. — P. 1101-1108.
308. Purification and characterization of a surfacebinding protein from Lactobacillus fermentum RC-14 that inhibits adhesion of Enterococcus faecalis 1131 Text. / C. Heinemann [et al.] // FEMS MicrobioL. Lett. — 2000. — № 190. — P. 177-180.
309. Rauch, M. The potential for probiotic manipulation of the gastrointestinal microbiome Text. / M. Rauch, S.V. Lynch // Current Opinion in Biotechnology. — 2011. — № 23. — P. 1-10.
310. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis Text. / S. Rakoff-Nahoum [et al.] // CelL. — 2004. —VoL. 118. —№2, —P. 229-241.
311. Reid, G. Bacterial adherence in the pathogenesis of urinary tract infection: a review Text. / G. Reid, J.D. Sobel // Rev. Infect. Dis.-1987.-№9.- P.470-487.
312. Reid, G. The potential role of probiotics in pediatric urology Text. / G. Reid //J. UroL. — 2002.— № 168, —P. 1512-1517.
313. Regulation of bacteriocin production in Lactobacillus plantarum depends on a conserved promoter arrangement with consensus binding sequence Text. / Risoen. P.A. [et al.] // MoL. Genet. Genomics. — 2001. — № 265. — P. 198-206.
314. Resected human colonic tissue: new model for characterizing adhesion of lactic acid bacteria Text. / A.C. Ouwehand [et al.] // Clin. Diagn. Lab. ImmunoL. — 2002. —№9.—P. 184-186.
315. Review article: the role of butyrate on colonic function Text. / H. M. Hamer [et al.] // Aliment. PharmacoL. Ther. — 2008. — № 27. — P. 104119.
316. Sablon, R. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis Text. / R. Sablon, B. Contreras, E. Vandamme // Adv. Biochem. Eng. BiotcchnoL. — 2000. —№ 68. —P. 21-60.
317. Safety and persistence of orally administered human Lactobacillus sp. strains in healthy adults Text. / P. Hütt [et al.] // Benef Microbes. — 2011. —№2(1). —P. 79-90.
318. Sallivan, A. Probiolics in human infections Text. / A. Sullivan, C.E. Nord // J. Antimicrob. Chemother. — 2002. — № 50. — P. 625-627.
319. Sallivan, A. The place of probiotics in human intestinal infections Text. / A. Sullivan, C.E. Nord // Int. J- Antimicrob. Agents. — 2002. — № 20. — P. 313-319.
320. Savage, D.C. Microbial ecology of the gastrointestinal tract Text. / D.C. Savage // Annu. Rev. MicrobioL. — 1977. — № 31. — P. 107-133.
321. Screening and characterization of new potentially probiotic lactobacilli from breast-fed healthy babies in Pakistan Text. / M. Nawaz [et al.] // African Journal of Microbiology ResearcH. —2011. —VoL. 5(12). —P. 1428-1436
322. Segmented filamentous bacteria are potent stimuli of a physiologically normal state of the murine gut mucosal immune system Text. / G.L. Talham [et al.] // Infect. Imnmn. — 1999. — № 67. — P. 1992-2000.
323. Servin, A. L. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens Text. / A. L. Servin // FEMS MicrobioL. Rev. — 2004. -№28. — P. 405-440.
324. Shanahan, F. Probiotics: a perspective on problems and pitfalls Text. / F. Shanahan // Scand. J. GastroenteroL. SuppL. — 2003. — P. 34-36.
325. Shehata, Afaf I. Molecular identification of probiotics lactobacillus strain isolates by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) Text. / Afaf I. Shehata // African Journal of Microbiology ResearcH. — 2012. — VoL. 6(12).—P. 3034-3041.
326. Sitaram, N. The therapeutic potential of host-defense antimicrobial peptides Text. / N. Sitaram, R. Nagaraj // Curr. Drug Targets.-2002.-№ 3.-P. 259267.
327. Soluble factors from Lactobacillus GG activate MAPKs and induce cytopro-tective heat shock proteins in intestinal epithelial cells Text. / Y. Tao [et al.] // Am. J. PhysioL. Cell PhysioL. — 2006. — № 290. — P. C1018-C1030.
328. Soluble proteins produced by probiotic bacteria regulate intestinal epithelial cell survival and growth Text. / F. Yan [et al.] // Gastroenterology. — 2007. -№ 132, —P. 562-575.
329. Sonnenburg, J. L. Genomic and metabolic studies of the impact of probiotics on a model gut symbiont and host Text. / J. L. Sonnenburg, C. T. L. Chen, J. I. Gordon // PLoS BioL. — 2006. — № 4. — P. 2213-2226.
330. Sonnenburg, J. L. Getting a grip on things: how do communities of bacterial symbionts become established in our intestine? Text. / J. L. Sonnenburg, L. T. Angenent, J. I. Gordon // Nat. ImmunoL. — 2004. — № 5. — P. 569573.
331. Spatial organization and composition of the mucosal flora in patients with inflammatory bowel disease Text. / A. Swidsinski [et al.] // J. Clin. Micro-bioL. —2005. —№43. —P. 3380-3389.
332. Spurbeck R.R. Lactobacilli at the front line of defense against vaginally acquired infections Text. / R.R. Spurbeck, C.G. Arvidson // Future Micro-bioL. — 2011. — № 6(5). — P. 567-582.
333. St Amant, D.C. Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by Lactobacillus species thai arc commonly isolated from the female genital tract Text. / D.C. St Amant, I.E. Valentin-Bon, A.E. ami Jerse// Infect. Immun. — 2002. — № 70.1. P. 7169-7171.
334. Stamatova, I.V. Probiotic activity of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulga-ricus in the oral cavity Text. / I.V. Stamatova // An in vitro study. — 2010.
335. Helsinki University, http://www.researchgate.net/
336. Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid Text. / S. C. J. De Keersmaecker [et al.] // FEMS MicrobioL. Lett.- 2006. — № 259. — P. 89-96.
337. Surface-layer protein extracts from Lactobacillus helveticus inhibit entero-haemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 adhesion to epithelial cells Text. / K. C. Johnson-Henry [et al.] // CelL. MicrobioL. — 2007. — № 9. — P. 356-367.
338. Szajewska, H. Probiotics in the prevention of antibiotic-associated diarrhea in children: a meta-analysis of randomized controlled trials Text. / H. Szajewska, M. Ruszczynski, A. Radzikowski // J Pediatr. — 2006. — № 149(3). — P. 367-372.
339. Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria Giovanna E.Felis and Franco Dellaglio Text. // Curr. Issues Intestinal MicrobioL. — 2007. — № 8. — P. 44-61.
340. Tennyson, C.A. Microecology, obesity and probiotics Text. / C.A. Tennyson, G. Friedman // Curr. Op in. Endocrinol.Diabetes Obes. — 2008. — VoL. 15. — № 5. — P. 422-427.
341. The complete coenzyme B-12 biosynthesis gene cluster of Lactobacillus reuteri CRL1098 Text. / F. Santos [et al.] // Microbiology. — 2008. — № 154.-P. 81-93.
342. The effect of Lactobacillus rhamnosus on enteroliemorrhagic Escherichia coli infection of human intestinal cells in vitro. Text. / J. Hirano [et al.] // MicrobioL. ImmunoL. — 2003. — № 47. — P. 405-409.
343. The gut microbiota shapes intestinal immune responces during health and diseases Text. / J.L. Round [et al.] // Nature Reviews Immunology. — 2009. — VoL. 9. — № 5. — P. 313-323.
344. The mucus binding of Bifidobacterium lactis Bbl2 is enhanced in the presence of Lactobacillus GG and Lact, delbrueckii subsp. bulgaricus Text. / A.C. Ouwehand [et al.] // Lett. AppL. MicrobioL. — 2000. — № 30. — P. 10-13.
345. The S-layer proteins of Lactobacillus crispatus strain ZJ001 is responsible for competitive exclusion against Escherichia coli Ol57: H7 and Salmonella typhimurium Text. / X. Y. Chen [et al.] // Int. J. Food MicrobioL. — 2007. — № 115, —P. 307-312.
346. Toll-like receptor 9 signaling mediates the anti-inflammatory effect of probiotics murine experimental colitis Text. / D. Rachmilevitz [et al.] // Gas-troenteroL. — 2004. — VoL. 126. — № 2. — P. 520-528.
347. Turner, J. R. Molecular basis of epithelial barrier regulation—from basic mechanisms to clinical application Text. / J. R. Turner // Am. J. PathoL. — 2006. —№ 169, —P. 1901-1909.
348. Uzzau, S. Cross-talk between enteric pathogens and the intestine Text. / S. Uzzau, A. Fasano // CelL. MicrobioL. — 2000. — № 2. — P. 83-89.
349. Van De Guchte, M. Production of growth-inhibiting factors by Lactobacillus del-brueckii Text. / M. Van De Guchte, S.D. Ehrlich, E. Magiiin // J. AppL. MicrobioL.—2001,—№91. —P. 147-153.
350. Vinderola, G. Mucosal immunomodulation by the non-bacterial fraction of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389 Text. / G. Vinderola, C. Matar, G. Perdigon // Int. J. of Food Micro.-2007.- Vol. 115.- №2,- P. 180-186.
351. Wall, R. Role of Gut Microbiota in Early Infant Development Text. / Alimentary Pharmabiotic Centre. Clinical Medicine: Pediatrics. — 2009. P. 45-54.
352. Walter, J. Ecological role of lactobacilli in the gastrointestinal tract: impla-cation for fundamental and biomedical research Text. / J. Walter // AppL. Envir. MicrobioL. — 2008. — VoL. 74. — № 16. — P. 4985-4996.
353. Walter, J. The microecology of lactobacilli in the gastrointestinal tract Text. / J. Walter // In G. W. Tannock (ed.), Probiotics & prebiotics: scientific aspects Caister Academic Press. — 2005. — Norfolk, United Kingdom. — P. 51-82.
354. Walters, M. AI-3 synthesis is not dependent on luxS in Escherichia coli Text. / M. Walters, M. P. Sircili, V. Sperandio // J. BacterioL. — 2006. — № 188,—P. 5668-5681.
355. Xu, J. Honor thy symbionts Text. / J. Xu, J. I. Gordon // Proc. NatL. Acad. Sei. USA. —2003. —№ 100. —P. 10452-10459.
356. Yan, F. Probiotic bacterium prevents cytokineinduced apoptosis in intestinal epithelial cells Text. / F. Yan, D. B. Polk // J. BioL. Chem. — 2002. — № 277, —P. 50959-50965.
357. Yoon, Sonia S. Probiotics, Nuclear Receptor Signaling, and Anti-Inflammatory Pathways Text. / Sonia S. Yoon, Jun Sun // Gastroenterology Research and Practice. — 2011. — Article ID 971938. — 16 pages.
358. Zasloff, M. Antimicrobial peptides in health and disease Text. / M. Zasloff // N. EngL. J. Med. — 2002. — № 347. — P. 1199-1200.
359. Zboril, V. Physiology of microflora in the digestive tract Text. / V.Zboril // Vnitr. Lek. — 2002. — № 48. — P. 17-21.
-
Червинец, Юлия Вячеславовна
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.02.03
- Динамика микробиоценоза рубца крупного рогатого скота в возрастном и сезонном аспектах
- Внутривидовое разнообразие колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ
- Микроэкологические основы коррекции "дисбиозной" микробиоты человека
- Микробиота кишечника коренного жителя Центрального федерального округа Российской Федерации как основа для создания региональных пробиотических препаратов
- Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника
