Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутривидовое разнообразие колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовое разнообразие колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ"

На правах рукописи

Исаева Алина Сергеевна

ВНУТРИВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ СИМБИОТИЧЕСКИХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

б т 2013

Москва - 2013

005061628

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Летаров Андрей Викторович

Официальные Яненко Александр Степанович

оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, заведующий лабораторией генетики и биодеградации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Игнатов Сергей Георгиевич

доктор биологических наук, заведующий лабораторией Нанобиотехнологии ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

Ведущая организация: Государственное учреждение

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и

микробиологии имени почетного академика

Н.Ф. Гамалеи Российской академии медицинских наук

Защита состоится 25 июня 2013 года в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук по адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д.7, корп. 2. %

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН

Автореферат разослан «_»_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Хижняк Т.В.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В составе микробиоценоза человека и животных имеются экологические ниши, колонизированные бактериями с весьма высокой плотностью популяций отдельных видов (или групп близких видов). Наиболее исследованными являются колиформные бактерии кишечника (преимущественно представленные Е. coli), а также лактобациллы влагалища. Под влиянием различных факторов эти, а также иные микробные популяции нормальной микрофлоры могут изменяться в качественном и количественном отношении, что зачастую приводит к нарушению устоявшегося биоценоза, снижению численности или гибели отдельных представителей, к появлению микроорганизмов, не характерных для данного биотопа, и развитию дисбиотических заболеваний [Oakley et al, 2007]. Существует множество факторов, способных влиять на состав и состояние микрофлоры, и одним из наименее изученных факторов остается фаговая инфекция. Так как бактериофаги обладают, как правило, штаммовой специфичностью [Chibani-Chenouffi et al., 2004], для изучения возможной роли фаговой инфекции в экологии отдельных видов бактерий в симбиотических микробных сообществах человека и животных необходимо иметь возможность оценки уровня внутривидового разнообразия индивидуальных популяций соответствующих микроорганизмов. Для этого необходимы современные молекулярные методы, не требующие много времени и средств, и в то же время, обладающие высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью. Так как ряд физиологических и биохимических показателей (чувствительность к фагам, антибиотикорезистентность, продукция токсинов и др.) микроорганизмов, в том числе, медицински важных, являются признаками штаммов, необходимы системы, способные надёжно дифференцировать микробы на внутривидовом уровне.

В качестве объектов исследования мы выбрали две симбиотические микробные системы млекопитающих, для которых имеются основания предполагать значительное воздействие природных бактериофагов на структуру и динамику популяций хорошо охарактеризованных видов бактерий. Это биоценоз кишечника лошади, в котором мы исследовали разнообразие колиформных бактерий, и биоценоз влагалища человека с заселяющими его популяциями лактобацилл.

На настоящий момент данные о составе микробного сообщества влагалища человека на внутривидовом уровне ограничены. В то же время в ряде работ [Blackwell et al.,1999; Kilic et al., 2001] высказывались предположения о возможной роли фаговой инфекции в развитии такого распространённого дисбиотического растройства, как бактериальный вагиноз [Turovskiy et al., 2011]. Предположение о фаговой этиологии части случаев бактериального вагиноза хорошо согласуется с данными об эпидемиологии этого расстройства, характерной для заболеваний, передающихся половым путем [Sprinivasan et al., 2010]. Кроме того, при разработке вагинальных пробиотических препаратов для лечения БВ [Falagas et al., 2007; Aslim et al., 2006] полагают целесообразным учитывать различную индивидуальную совместимость пациенток не только с определенными видами, но и штаммами

лактобацилл, что требует данных о динамике как видового, так и штаммового состава сообщества.

Существующие методы видовой идентификации лактобацилл очень трудоёмки и не пригодны для массового анализа, а методы дифференциации их штаммов практически не разработаны. Представление о Lactobacillus acidophilus как о практически единственном представителе нормальной микрофлоры влагалища со времен Дедерлейна [Thomas S., 1928] непоколебимо просуществовало почти столетие. Только с внедрением молекулярно-генетических методов исследования появилась возможность на новом методическом уровне изучать композиционные особенности состава микробиоты влагалища, которая играет важную роль в колонизационной резистентности этого органа как защитного барьера репродуктивной системы человека в целом [Antonio et al., 2003; Stoyancheva et al., 2006]. Первые исследования показали значительное видовое разнообразие лактофлоры и отличия её в разных этнических группах женщин и в различных регионах мира, что, по-видимому, является генетически обусловленным [Kilic et al., 2001; Song et al., 1999; Antonio et al., 1999]. Такие исследования могут стать базой для новых терапевтических стратегий в лечении влагалищных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также основой при отборе штаммов для создания пробиотических биопрепаратов.

В России ранее не проводилось систематических исследований по видовой идентификации влагалищных лактобацилл у женщин различных возрастных групп и при различном состоянии микробиоценоза влагалища. Проблема внутривидового (штаммового) разнообразия лактобацилл также практически не изучена ни в России, ни в других странах.

В качестве модельного объекта для исследования разнообразия индивидуальных популяций энтеробактерий выбрана экосистема кишечника лошади. Слепая кишка и толстый кишечник лошади содержат сложное микробное сообщество, которое играет важную роль в переваривании целлюлозы и поддержании здоровья животного [Dombek et al., 2000]. В отличие от толстого кишечника человека, где по имеющимся косвенным данным преобладают умеренные бактериофаги и влияние фаговой инфекции на популяции бактерий ограничено [Letarov and Kulikov, 2009; Clookie et al., 2011; Letarov, 2012], в толстом кишечнике лошадей преобладают вирулентные бактериофаги [Letarov and Kulikov, 2009]. Это обстоятельство делает данную экосистему весьма привлекательным модельным объектом для изучения механизмов взаимодействия, взаимной адаптации и микроэволюции фагов и бактерий в микробном сообществе кишечника животных. Для успешного осуществления этих исследований прежде всего необходимы данные о внутривидовом разнообразии индивидуальных популяций колиформных бактерий и надёжные методы типирования штаммов, позволяющие дифференцировать, в том числе, и очень близкородственные изоляты, которые могут, тем не менее, различаться по чувствительности к индигенным бактериофагам.

Целью данной работы является исследование внутривидового разнообразия колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Разработать надежную и удобную в использовании ПЦР-систему геномного типирования штаммов кишечной палочки и близких к ней видов и сравнить дифференцирующую способность нового метода с существующими методами типирования бактерий.

2. Исследовать внутривидовое разнообразие колиформных бактерий в индивидуальных популяциях кишечных колиформных бактерий лошадей.

3. Оценить применимость масс-спектрометрического метода МАЬ01-Т0Р идентификации бактерий для целей видовой и внутривидовой дифференциации изолятов вагинальных лактобацилл и разработать на его основе методику их внутривидовой дифференциации.

4. Сформировать коллекцию изолятов лактобацилл, выделенных из биоматериала здоровых женщин и женщин с нарушением биоценоза половых путей, и охарактеризовать видовое и внутривидовое разнообразие индивидуальных популяций этих бактерий.

5. Исследовать коллекцию изолятов лактобацилл для обнаружения лизогенных штаммов.

6. Оценить изменчивость состава индивидуальных популяций лактобацилл влагалища во времени.

Научная новизна. Создана новая система геномного ¡Б-типирования колиформных бактерий. Система ГБ-типирования апробирована на серии полевых изолятов колиформных бактерий. Показано, что по дифференцирующей способности, производительности и воспроизводимости новая система превосходит существующие методы геномной дифференциации изолятов энтеробактерий, основанные на ПЦР.

Применение новой системы позволило обнаружить высокое внутривидовое разнообразие колиформных бактерий, населяющих кишечник лошадей.

Разработаны и апробированы на обширной коллекции клинических изолятов подходы к внутривидовой дифференциации вагинальных лактобацилл на основе масс-спектров цельноклеточных лизатов. Анализ индивидуальных популяций лактобацилл выявил низкий уровень их внутривидового разнообразия у большинства женщин, что не было ранее показано другими исследователями.

Практическая значимость работы. 1. Дифференцирующая способность разработанной нами системы ¡Б-типирования штаммов энтеробактерий, сравнимая с фаготипированием, делает ее наиболее предпочтительным методом при исследовании микроэкологии бактериофагов энтеробактерий в естественных микробных системах, таких, как кишечник животных или сточные воды. 2. Дифференцирующая способность 181-системы, наряду с хорошей воспроизводимостью результатов, могут быть крайне полезны и для целого ряда

других задач, например, при прослеживании эпидемиологических цепочек распространения штаммов патогенных энтеробактерий среди людей или животных. 3. Разработанный нами способ внутривидовой дифференциации лактобацилл на основе анализа их белковых спектров (MALDI-TOF) существенно превосходит описанные в литературе методы ПЦР-типирования этих бактерий по производительности, и не уступает им по разрешающей способности. 4. Полученные нами данные об уровнях внутривидового разнообразия индивидуальных симбиотических популяций колиформных бактерий и лактобацилл будут востребованы в дальнейших исследованиях по экологии подобных микробных систем, включая экологию бактериофагов, а также при разработке новых пробиотических и лечебных фаговых препаратов, и стратегий их применения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: I, II, III, V,VII Молодежных школах конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2003, 2005,2007,2011 гг.); Международной научной конференции "Микроорганизмы и биосфера" (Москва, 2007 г.); 18-й Международной конференции «Биология фагов» (18th Evergreen international phage biology meeting) (США, Эвергрин, 2009 г.); 109 Съезд Американского общества микробиологов (The American Society for Microbiology 109th General Meeting) (США, Филадельфия, 2009 г.); Конференции и семинары по научным направлениям Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине» (Москва, 2011 г.); Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010 г.), Международная научно-практическая конференция «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 18 тезисов и материалов конференций.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю к.б.н. Летарову A.B. за помощь при выполнении работы и обсуждении результатов, к.б.н. Куликову за ценные советы и помощь в освоении молекулярно-биологических методов, д.б.н., доценту Ильиной E.H. (НИИ ФХМ) за помощь в проведении отдельных экспериментов и анализе результатов, д.м.н., профессору Анкирской A.C. и к.б.н. Муравьевой В.В. (НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова МЗ РФ) за научные консультации, помощь при выполнении работы и поддержку, д.б.н., профессору Плакунову В.К. за ценные рекомендации и помощь при выполнении эксперимента.

Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 108 страницах и включают 24 рисунка и 10 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения , выводов и списка используемой литературы. Список литературы содержит 160 источников, из них 26 отечественных и 144 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были: 1) колиформные бактерии, выделенные из образцов фекалий лошадей; 2) лактобактерии, выделенные из биоматериала влагалища женщин.

Для выделения колиформных бактерий навеску (15-20 г) образца фекалий лошади суспензировали в физиологическом растворе в соотношении 1:5. Инкубировали образец при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 30 минут. Производили посев на твердую среду LTA, агар Эндо или на хромогенный агар для колиформных бактерий (HiCrome Coliform Agar w/SLS, "Himedia").

Клинические изоляты лактобактерии получали из микробиологической лаборатории Федерального государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова МЗ РФ».

Дифференциацию изолятов колиформных бактерий проводили методом полимеразной цепной реакции. (ПЦР). Для получения ДНК-матриц бактериальные клетки лизировали в 100 мкл деионизованной воды при температуре 96°С в течение 20 минут. ПЦР-смесь (20 мкл) содержала:

67 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 17 мМ (NH4)2S04, 0,001 % Tween 20, 2.5 мМ MgC12, 0.2 мМ dNTP, 1,25 единицы Taq полимеразы (Sigma), 25 пкм праймера IS1 и 1 мкл исследуемой матрицы. Для проведения реакции использовали амплификатор ("Mini Personal Thermal Cycler, "BIO-RAD", США). Детекцию результатов ПЦР проводили методом гель-электрофореза в 1-2% агарозном геле. Визуализацию продуктов ПЦР осуществляли на УФ-трансиллюминаторе. Документировали результаты цифровым фотоаппаратом Olympus SP-310.

Для гидролиза ампликонов гена 16SpPHK колиформных бактерий использовали ферменты рестрикции НаеШ и HindIII, и буферные растворы фирмы "Fermentas" (Канада).

Оценку уровня внутривидового разнообразия популяции колиформных бактерий различающихся по IS1 профилям проводили, используя программу EstimatesS (http://viceroy.eeb.uconn.edu/EstimateS) и формулу с поправкой на систематическую погрешность Chaol: Schao = Sobs + [^i х (F\ - 1)] / [2(F2+ 1)], где Sobs число обнаруженных изолятов, Fi число IS-типов, встречающихся один раз и F2 число IS-типов, отмеченных два раза.

Титрование колифагов проводили двуслойным методом высева на среде LB.

Идентификацию лактобацилл проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Microflex, Bruker Daltonics, Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров белков клеток лактобацилл использовали программное обеспечение фирмы Bruker Daltonics (Германия): FlexControl 3.0 и Biotyper 2.0. В качестве матрицы использовали а-циано-4-гидроксициннамовую кислоту в 50% ацетонитриле/ 2,5% трифторуксусной кислоте (а-СНСА, a-cyano-4-hydroxy cinnamic acid). Все измерения проводили в линейном режиме, в режиме положительных

ионов. Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона масс от 2000 до 20000 Да.

Дифференциацию лактобацилл методом REP-ПЦР проводили, как описано в работе [May et al., 2003]. ДНК из клеток лактобацилл выделяли с помощью набора ДНК-Экспресс (Литех, Россия) в соответствии с инструкцией.

Секвенироеание гена 16SpPHK лактобацилл проводили с использованием набора для секвенирования BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и секвенатора 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA) согласно инструкциям производителя.

Все изоляты лактобацилл были дифференцированы по такому клинически важному признаку, как способность к образованию перекиси водорода. Для этого колонии лактобактерий рассевали на чашки с кровяным агаром, содержащим фермент пероксидазу хрена и индикатор [Eschenbach D.A. et al., 1989], в нашем случае диаминобензидин.

Исследование способности изолятов разных видов лактобактерий (L. gasseri, L. jensenii, L. crispatus) образовывать биопленки проводили, как описано в статье [Núcleo et al. 2009].

Поиск изолятов лактобацилл, содержащих профаги, проводился с помощью ПЦР - системы. Нами были созданы пары праймеров, комплементарные участкам ДНК гена интегразы, белка, ответственного за встраивание ДНК фага в геном хозяина. Для этого были использовали геномы известных на данный момент лактофагов kc5a и phiadh.

Индукцию изолятов лактобацилл, положительных на наличие гена интегразы, проводили, как описано [Raya et al., 1989].

Наличие свободных фаговых частиц в индуцированных культурах лактобацилл детектировали с помощью ПЦР-системы [Ventura et al, 2006].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1 Исследование разнообразия колиформных бактерий.

2.1.1 Метод ISl-фингерпринтинга колиформных бактерий. Нами разработана оригинальная система геномного ПЦР-фингерпринтинга. В реакции используется только один олигонуклеотид: IS1 (5'АТС AGT AAG TTG GA(G/A) (T/G)CA ТТА СС 3'), комплементарный инвертированным терминальным повторам инсерционного элемента IS 1, наиболее широко представленного в геноме энтеробактерий [Blot M., 1994] (З'-конец праймера направлен вовне инсерционного элемента). В ходе реакции происходит амплификация ДНК, находящейся между копиями элемента IS1 и/или присутствующими в геноме сайтами потенциальной гибридизации праймера, не связанными с копиями IS 1, которые, возможно, являются остатками утраченных инсерционных элементов. Длина и количество получаемых в реакции продуктов специфической амплификации определяется расположением IS-элементов и (или) других сайтов гибридизации праймера в хромосоме бактерии. Продукты, получаемые в ходе реакции, могут быть разделены и проанализированы обычным ДНК-электрофорезом в агарозном геле. Анализ результатов ПЦР с праймером IS1

6

показал, что для каждого исследованного изолята колиформных бактерий характерен определенный паттерн полос ПЦР-продукта. Получаемые полосы хорошо разделяются электрофорезом в агарозном геле. Их число, в среднем, составляет от двух до десяти, что упрощает процесс сравнения спектров между собой для выявления идентичных или близкородственных 181-профилей {рис.1). Так, например, среди изолятов, выделенных из первого образца фекалий, обнаружено 2 идентичных профиля (рис. 1 дорожки 12,19), а среди выделенных из второго образца 2 пары идентичных паттернов (рис. 1 дорожки 8, 11; дорожки 17, 19). Были обнаружены 2 одинаковых паттерна среди изолятов из первого и второго образцов фекалий (рис. 1, дорожки 20, 10).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 1 2 3 4 5 6 со СО 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 BL M

1

V Г" « * — ш ш

— » ■ в •• m " - — *< m • •s V

— * m щ — •■■в» - т m m - IÍ5 ш • m • • » » * » »? -Z -

m — -а а* Ш Ф « ш m m » » " и m

Рис. 1. ISl-фингерпринтинг. №№ 1-20 (Слева) Изоляты колиформных бактерий полученные из первого образца фекалий. №№ 1-20 (Справа) Изоляты колиформных бактерий полученные из второго образца. Контроли: лабораторные штаммы £. coli Z85 и BL. Маркер -lkb DNA ladder (Fermentas).

Однако изоляты, дающие небольшое количество полос, не всегда могут быть дифференцированы с достаточной достоверностью. Для увеличения количества полос в паттерне нами разработаны праймеры, комплементарные инвертированным концевым повторам других, менее распространенных в геномах колиформных бактерий, инсерционных элементов (IS2, IS3, IS4, IS5, IS30), а также праймеры TR 8D, TR 8R и TR 8834, комплементарные последовательностям нуклеотидов в гене транспозазы, который представлен значительным числом копий в геномах многих штаммов E.coli. Реакции были поставлены с различными комбинациями олигонуклеотидов, однако наилучший результат был получен при одновременном использовании праймеров IS1 и TR 8834 (5'-АТС GGC GAT GCG TTG ACG ААТ-3'). Изоляты, дававшие при ISl-фингерпринтинге 2-3 полосы на электрофореграмме ПЦР-продукта (рис. 2, дорожки 1 и 3), после ПЦР с парой праймеров IS1+TR 8834 давали паттерны из 5-10 полос (рис. 3, дорожки 1и 3), что обеспечивало их достоверную дифференциацию.

1 2 3 4 5 6 7 3 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 8 19 М

- —

Рис. 2. IS1- фингерпринтинг. №№ 1-19 Изоляты колиформных бактерий из образца фекалий №3. ДНК-матрицы изолятов колиформных бактерий идентичны использованным для постановки ВОХ-ПЦР (рис. 5) и ISl/TR8834-Iin,P (рис. 3), а также проведения риботипирования {рис. б). Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 3. ПЦР-фингерпринтинг с использованием пары праймеров IS1 и TR8834. №№ 1-19 Изоляты колиформных бактерий выделенных из образца фекалий №3. ДНК-матрицы изолятов колиформных бактерий идентичны использованным для постановки ВОХ-ПЦР и ISl-ПЦР (рис. 5 и рис. 2, соответственно), и проведения риботипирования (рис. 6). Маркер -lkb DNA ladder (Fermentas).

2.1.2 Воспроизводимость, чувствительность и стабильность IS1-фингерпринтинга. Прогревание ДНК-матрицы при 100 °С в течение 10 минут не оказывало влияния на результат ISl-фингерпринтинга по сравнению с контролем. Таким образом, возможные отклонения в температурном режиме при приготовлении ДНК-матриц не должны сказываться на результатах ISl-ПЦР. ДНК-матрицы длительное время (около года) хранили в морозильной камере и часто подвергали оттаиванию и замораживанию, однако, качество и количество ПЦР-продукта ISl-ПЦР при этом не менялись. Получаемые паттерны полос оставались стабильными.

Внесение чрезмерно большого количества ДНК-матрицы может приводить к ингибированию ПЦР, что требует постановки положительного контроля в каждой серии матриц с использованием изолята, заведомо дающего специфический паттерн.

Система ISl-фингерпринтинга работает одинаково хорошо как с использованием амплификатора производства компании BIO-RAD (MJ mini

Personal Thermal Cycler), так и широко распространенного в России прибора «Терцик» компании «ДНК-Технология».

Для проверки стабильности системы ISl-фингерпринтинга изолят, характеризующийся легко читаемым IS 1-паттерном, провели через 5 последовательных пассажей в жидкой среде LB. Разведения культуры из первого и последнего пассажей были рассеяны на чашках с LB-агаром для получения отдельных колоний. ISl-ПЦР случайной выборки клонов не выявила отличия в IS-паттернах этих клонов и исходного изолята (рис. 4).

I : 5 4 5 <• 7 X «Hill IJ 1 - 17 |Ч> М 1 .í 1 5 ( -7 8 4 1 11 Ih IX л> м

в!

в

—— _ W — — :

— — ■ т та «й - • - - •ZZ.ZZZ

Рис. 4. Проверка стабильности системы IS-1-фингерпринтинга. Отсутствие различий паттернов исходного изолята (дорожка 1) и его клонов в первом (дорожки 2-20) и пятом пассажах (следующие 20 дорожек). Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

2.1.3 Сравнительная характеристика методов ISl-фингерпринтинга, ВОХ-фингерпринтинга, риботипирования и фаготипирования колиформных бактерий. Новый метод геномного ISl-фингерпринтинга мы сравнивали с существующими методами молекулярного ВОХ-фингерпринтинга. Для этого были использованы те же ДНК-матрицы, что и для ISl-ПЦР, а также рекомендованные авторами метода [Rademarker et al., 1997] сложные программы амплификации. Анализ результатов ВОХ-ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле показал, что дифференцирующая способность этой системы оказывается ниже (рис. 5), чем у предложенной нами.

Рис. 5. BOX - фингерпринтинг. №№ Í-19 Изоляты колиформных бактерий из образца фекалий №3. ДНК-матрицы изолятов колиформных бактерий идентичны использованным для постановки IS/TR8834-imP и ISl-ПЦР (рис. 3 и рис. 2, соответственно), а также проведения риботипирования (рис. 6). Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

Проведение риботипирования оказалось наиболее трудоемким и требующим материальных затрат процессом по сравнению с ПЦР-системами - BOX- и IS1-фингерпринтингом. Полученный результат не дал возможности выделить отдельные группы в пределах данной серии изолятов колиформных бактерий {рис. 6).

Рис. 6. Ферментативный гидролиз гена 168 рРНК - заключительный этап риботипирования (эндонуклеаза рестрикции НаеШ). №№ 1-19 Изоляты колиформных бактерий выделенные из образца фекалий №3.

Восприимчивость к инфицированию отдельными расами фагов является одним из наиболее динамичных свойств бактерий, быстро эволюционирующим как в естественных, так и в лабораторных микробных сообществах. В наших экспериментах изоляты, имеющие различные 181-профили (при этом их ВОХ-профили были идентичны), обладали разной чувствительностью к выборке фагов, присутствовавших в образце фекалий, из которого эти изоляты выделены. При этом изоляты, идентичные по К1-профилям (ВОХ-профили идентичны), проявляли одинаковую чувствительность к бактериофагам. Таким образом, разрешающая способность предложенной нами системы типирования сравнима с методом фаготипирования, но при значительно меньших затратах времени, материальных средств и сил.

Все эти обстоятельства делают разработанную нами систему геномного 15-типирования изолятов колиформных бактерий пригодной для быстрого анализа большого количества микробных изолятов на их родство, разнообразие и потенциальную чувствительность к фагам, существенно ускоряя и упрощая самые различные исследования вирусного и бактериального сообществ кишечника животных.

2.1.4 Оценку уровня внутривидового разнообразия популяций колиформных бактерий в фекалиях лошади проводили на произвольной выборке изолятов колиформных бактерий от 4-х лошадей (по 30 изолятов от каждой лошади). Исходя из результатов ISl-ПЦР, все изоляты в выборке от лошади №1 различались (принадлежали разным IS-типам). Образцы от лошадей №2 и №3 содержали по одной паре идентичных изолятов. В выборке от лошади №4 обнаружено 2 пары одинаковых изолятов. Затем были дополнительно отобраны еще 63 изолята из образца от лошади №2. На основании данных анализа 93-х изолятов, выделенных от этого животного, оценили возможное разнообразие IS-типов колиформных бактерий в популяции кишечника лошади, применив непараметрический критерий Chaol [Chao А., 1984]. Полученный результат свидетельствует о неожиданно высоком уровне внутривидового разнообразия колиформных бактерий (преимущественно Е.

10

coli) в кишечнике лошади, более 1000 одновременно присутствующих в образце IS-типов (интервал от 684 до 1500; Р < 0,05).

2.2 Исследование индивидуальных популяций лактобацилл. 2.2.1 Коллекция изолятов лактобацилл, сформированная в ходе исследований, включает в себя 897 изолятов, представленных 11 видами {табл. 1), полученных от 44 пациенток. Из обследованных пациенток было отобрано 30 небеременных женщин репродуктивного возраста из которых сформированы 3 группы (по 10 женщин) в зависимости от результатов микробиологической диагностики состояния микроценоза их влагалищ: «нормоценоз», «бактериальный вагиноз» и «мезоценоз». Оценку состояния микроценоза влагалища проводили на основе общепринятых критериев [И^егй е! а!., 1991], модифицированных [Анкирская е1 а1., 2005]. Из отделяемого влагалищ этих 30 пациенток были отобраны и изучены 386 изолятов лактобацилл (табл. 2).

Таблица 1.

Виды Lactobacillus Общее число изолятов (n=897) Высокая достоверность видовой идентификации Log(score)>2 Низкая достоверность видовой идентификации 1,7<Log(score)<2.0

L. crispatus 363 319(88%) 44 (12 %)

L. gasseri 248 232 (94%) 16 (6%)

L. jensenii 237 64 (27%) 173 (73 %)

L acidophilus 15 15 (100%) -

L. spl05932TCIP 12 11 (92%) 1 (8%)

L. fermentum 9 5 (62%) 4 (38%)

L. delbrueckii 5 5 (100%) -

L. salivarius 4 3 (75%) 1 (25%)

L. ultunensis 2 1(50%) 1 (50%)

L. rhamnosus 1 1 (100%) -

L. johnsonii 1 1 (100 %) -

2.2.2 Оптимизация метода МАЫН-ТОЕ масс-спектрометрии пептидов и оценка возможности его применения для идентификации изолятов лактобацилл. Масс-спектрометрический анализ клеточных белков в последнее время широко используется как для оценки разнообразия микробных сообществ, так и с целью быстрой и достоверной видовой идентификации бактерий. Важным преимуществом белкового бактериального профилирования с последующей процедурой их

идентификации с помощью программного пакета Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics, Германия) перед классическими микробиологическими методами является простота технологического процесса, включающего быструю пробоподготовку, высокую скорость получения результатов и возможность автоматизации и роботизации всех стадий исследования.

Возможность применения технологии белкового бактериального профилирования для внутривидовой дискриминации лактобацилл была исследована на изолятах трех видов - L. jensenii, L. crispatus и L. gasseri. Для анализа культур лактобацилл оказалось необходимым несколько модифицировать пробоподготовку, в частности было выяснено, что результаты типирования лактобацилл оказываются более надежными при использовании жидких культур, тогда как для других микроорганизмов, как правило, используется материал с плотных сред.

Для проведения внутривидовой дифференциации изолятов лактобацилл был использован алгоритм расчета корреляционных индексов масс-спектров. Интерпретация этих данных должна проводиться с учетом границ физиологической вариабельности состава белков у лактобацилл. Для оценки этих интервалов выбранные образцы были культивированы в 10 повторах при стандартных условиях. В результате анализа масс-спектров белков всех полученных культур, удалось определить средний корреляционный индекс для оценки воспроизводимости спектров Lactobacillus и минимальной внутриштаммовой вариабельности в зависимости от стадии культивирования для L. jensenii, L. crispatus и L. gasseri.

2.2.3 Анализ белковых спектров полученных изолятов лактобацилл. Результаты видовой идентификации 386 первичных изолятов лактобацилл, полученных от женщин трёх групп, представлены в таблице 2. Только 7 изолятов из 386 (1,8 %) не удалось идентифицировать до вида методом MALDI-TOF. У обследованных женщин было выделено 6 видов рода Lactobacillus со значительным превалированием трёх видов (L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri), которые составили в сумме 93,0% от всех идентифицированных изолятов. Большинство изолятов были идентифицированы с высокой степенью достоверности (score >2,0). Исключение составили изоляты вида L. jensenii, которые более, чем в половине случаев (75 из 130) - 57,7 % были идентифицированы с низкими показателями (score 1,7< - < 2,0). Возможно, это связано с тем, что в базе данных Biotyper на момент исследования содержалась информация для ограниченного числа штаммов этого, вида, и такой результат может быть связан с естественным внутривидовым разнообразием лактобацилл.

Таблица 2.

Видовая идентификация изолятов лактобацилл, выделенных от наблюдаемых женщин__

Виды Число Высокая достоверность Низкая

Lactobacillus изолятов видовой достоверность

идентификации видовой

(n = 386) Log (score) > 2,0 идентификации

1,7< Log (score)< 2,0

L. crispatus 133 117 16

L. jensenii 130 55 75

L. gasseri 96 90 6

L. acidophilus 15 15 -

L. salivarius 4 3 1

L.johnsonii 1 1 -

Всего 281 (72,8%) 98 (25,4%)

He иденти- 7 - -

фицированы (1,8%)

Lg (score) <1,7

Зависимость видового состава лактобацилл от состояния микробиоты влагалища представлена в таблице 3 и отображена на рисунке 7. При нормоценозе у обследованных женщин присутствовали лактобациллы только трёх видов, из которых доминирующим был вид L. crispatus, составивший 59,3% всех выделенных изолятов, на долю видов L. jensenii и L. gasseri пришлось соответственно 22,0 и 18,7% изолятов. При этом у каждой из 10 обследованных женщин в группе с нормоценозом все выделенные изоляты были представлены только одним видом лактобацилл.

При бактериальном вагинозе те же три вида лактобацилл встречались у женщин практически с равной частотой (примерно по 30 % изолятов каждого вида). 15 изолятов (11,8 %) идентифицированы как L. acidophilus (все выделены у одной женщины). Только у одной пациентки в этой группе были обнаружены 2 вида лактобацилл, у остальных девяти женщин все идентифицированные изоляты принадлежали к какому-либо одному виду лактобацилл.

При мезоценозе 51% изолятов идентифицированы как L. jensenii. Виды L. gasseri и L. crispatus составили 27,1% и 17,8%, соответственно. Изоляты других видов (L. salivarius и L. johnsonii) составили только 4% от всех изолятов в этой группе и выделены у двух женщин в комбинации с доминирующими видами лактобацилл. У 7 женщин присутствовал лишь один вид лактобацилл, у двух - по два вида, и у одной женщины среди 15 изолятов были обнаружены 3 вида лактобацилл. Таким образом, как при нормоценозе, так и при мезоценозе и бактериальном вагинозе, у подавляющего большинства обследованных женщин популяции лактобактерий были представлены каким-либо одним видом.

Нормоценоз Промежуточная Бактериальный форма вагиноз

Рис. 7. Видовой состав лактобацилл при различном состоянии микробиоты влагалища

Таблица 3.

Видовой состав лактобацилл при различном состоянии микробиоты влагалища

Состояние микробиоты влагалища Всего получено изолятов (П) Виды лактобацилл (абс. число/%)

Ь. сг1$раШ Ь^азьеп Ь.]етепп Другие

Бактериальный Вагиноз 127 37/29,1 38/ 29,9 37/29,1 15/11,8

Нормоценоз 123 73/ 59,3 23/18,7 27/ 22,0 -

Мезоценоз 129 23/17,8 35/27,1 66/51,0 5/4,0

Итого: 379 133 96 130 20

2.2.4 Тестирование изолятов лактобацилл на способность продуцировать перекись водорода. У всех изолятов лактобацилл была проверена способность к продукции перекиси водорода, как одного из ведущих защитных веществ индигенной микрофлоры. Полученные результаты представлены в таблице 4. При нормоценозе подавляющее большинство изолятов (98,4%) продуцировали перекись водорода, при промежуточной форме - 75% изолятов обнаруживали такую способность, а при бактериальном вагинозе 65% изолятов лактобацилл не продуцировали перекись водорода.

Следует отметить, что большинство изолятов Ь. сшраШ обладали способностью продуцировать перекись водорода в сравнении с другими видами лактобацилл.

Таблица 4.

Продукция перекиси водорода изолятами различных видов лактобацилл в зависимости от состояния микробиоты влагалища__

Состояние микробиоты L. crispatus Н202+/ н2о2-, n/n L. gasseri Н202+/ н2о2-, n/n L. jensenii н2о2+/ H202-, n/n Общее число (Н202+/Н202-) изолятов (включая другие виды), n/n

Нормоценоз 73/0 21/2 21 IQ 121/2

Промежуточная форма 23/0 14/21 55/11 97/32

Бактериальный вагиноз 25/ 12 27/11 15/ 22 82/45

Общее число н2о2+/ н2о2- изолятов 121/12 62/ 34 97/33 300/79

Обращало на себя внимание, что только у одной женщины способность к синтезу перекиси водорода отсутствовала у всех выделенных изолятов одного вида. Чаще изоляты, различающиеся по данному признаку, присутствовали у наблюдаемых женщин одновременно в различных соотношениях.

Так как было обследовано небольшое число женщин, трудно судить о клиническом значении полученных данных. Однако, отметим, что количество женщин, для которых было характерно преобладание изолятов лактобацилл, не продуцирующих перекись водорода, было наибольшим в группе с патологическом состоянием микрофлоры влагалища (табл.5).

Таблица 5.

Изменение количества женщин, у которых выявлены варианты лактобацилл, не продуцирующие перекись водорода, в зависимости от состояния микроценоза

Виды лактобацилл Микробиологический диагноз

Бактериальный вагиноз Мезоценоз Нормоценоз

L. crispatus 2 - -

L. gas seh 2 2 1

L.jensenii 3 1 -

Всего: 7 3 1

2.2.5 Исследование способности лактобацилл к формированию биопленок.

Адгезивные свойства лактобацилл к полистиролу были исследованы на выборке из 30 изолятов лактобацилл (по 10 для каждого вида L.crispatus, L.gasseri, L.jensenii). Сравнивая способность к формированию биопленок на дне лунки планшета из полистирола у трех наиболее часто встречающихся видов лактобацилл: L.crispatus, L.gasseri, L.jensenii, мы обнаружили более высокую (в 1,25 раза) способность к образованию биопленок у изолятов L.gasseri и L. jensenii, чем у изолятов L. crispatus.

Однако в настоящее время не ясно, в какой мере эти результаты отражают способность этих бактерий к образованию биопленок на поверхности слизистой оболочки in vivo, где, помимо иных свойств поверхности эпителия, существуют и прочие факторы, способные влиять на адгезивные способности лактобацилл (гормоны, вагинальный секрет) [Boris et al., 2000].

2.2.6 Типирование клинических изолятов лактобацилл методом REP-ПЦР.

Для определения идентичности или различий изолятов лактобацилл, одного вида, выделенных у определенной пациентки или полученных от разных женщин, было проведено типирование изолятов с помощью геномного ПЦР-фингерпринтинга методом REP-ПЦР. Полученные результаты согласовывались с наблюдениями, сделанными при масс-спектрометрическом анализе. Индивидуальные популяции лактобацилл оказались гомогенными, представленными однотипными изолятами (вплоть до предела разрешающей способности REP-ПЦР фингерпринтинга) или близкородственными; в то же время большинство профилей изолятов полученных от разных пациенток различались (рис. 8 и 9, 10).

шШ mm mm mm mm mm шт mm It M Al §

Рис. 8. REP-ПЦР. Изоляты принадлежащие к виду L. gasseri и выделенные от одной пациентки №llkk (плюсом и минусом обозначена способность к образованию перекиси водорода). Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

Рис. 9. REP-ПЦР. Изоляты L. gasseri, выделенные от разных пациенток Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

6.11 Ш ! llkkl 27tk1 135.14 135.1 6.5.1 110.6 4.1.1 33tk1 11n1 40.1 M _ s

fwí^ mam * mm

Рис. 10. REP-ПЦР. Изоляты L. gasseri, выделенные от разных пациенток (изолят № 6.5.1 принадлежит виду L.jensenii). Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

2.2.7 Мониторинг состояния и состава микрофлоры влагалища. Для изучения изменения состава и состояния лактофлоры во времени удалось организовать небольшую группу добровольцев. В исследовании принимали участие 6 женщин-добровольцев репродуктивного возраста. Изначальное состояние микрофлоры их половых путей не имело принципиального значения. Важно было скорее, чтобы добровольцы с запланированной частотой сдавали образцы, для выявления динамики состава и состояния микроценоза. Длительность эксперимента составила чуть больше года с момента взятия первого и последнего образца, в нескольких случаях около 2-Зх лет, так как трое из участниц сдавали образцы ранее с целью диагностики, эти данные также решено было использовать. От каждой женщины планировалось получить по 6 образцов микрофлоры половых путей: пять образцов в первые три месяца (цикла) и последний образец через год. В первый месяц образцы отбирались три раза: в начале, середине и в конце цикла. Далее только в середине циклов. Все полученные изоляты лактобацилл были также протестированы на способность продуцировать перекись водорода.

Удалось показать, что на протяжении по меньшей мере года видовой и внутривидовой состав лактобацилл оставался стабильным у большинства женщин в эксперименте. Изоляты иных видов лактобацилл, выявлявшиеся в ходе эксперимента у отдельных пациенток, были представлены единичными колониями и чаще всего отсутствовали в следующем по времени образце. У одной женщины в четвертом образце был обнаружен дополнительный вид к исходному (по числу колоний на чашке не сильно уступающий исходному виду). Этот вид сохранился и был выделен через месяц в пятом образце. Однако через год он уже не обнаруживался, что может свидетельствовать о занесении его извне и постепенной элиминации. Это позволяет сделать предположение о наличии резидентных видов на протяжении долгого времени и транзиторных, присутствующих в течение нескольких месяцев, которое, однако, требует дополнительных исследований.

Было бы крайне важно получить образцы вагинального микробного сообщества непосредственно до и во время развития эпизода бактериального вагиноза для оценки размаха естественных колебаний численности лактобацилл и выявления длительности колонизации влагалища отдельными изолятами. Однако, из-за объективных организационных затруднений, это оказалось невозможным.

2.2.8 Индукция профагов лактобацилл. Следует отметить, что среди 44 пациенток, от которых были получены и идентифицированы изоляты лактобацилл, у 37 - лактофлора была представлена одним видом, у 6 - двумя видами, у одной женщины разнообразие вагинальных лактобацилл доходило до 3 видов. При этом, как отмечено выше, уровень внутривидового разнообразия лактобацилл в индивидуальных популяциях также был весьма низким. При такой гомогенности популяций лактобацилл фаговая инфекция может действительно явиться причиной снижения их численности. Для проверки гипотезы о фаговой этиологии части случаев вагиноза была проведена работа по поиску изолятов лактобацилл, содержащих профаги. Нами были подобраны пары праймеров, комплементарные участкам ДНК гена фаговой интегразы, белка, ответственного за встраивание ДНК фага в геном бактерии-хозяина. Для этого мы использовали геномы известных на данный момент лактофагов кс5а и рЫасОг. При анализе выборки изолятов Х.^датеп, мы обнаружили наличие фрагмента этого гена требуемой длины у некоторых из них (рис. 11 дорожки 5, 6, 7, 8).

праймеры на интегразу фага phiadh 1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 11. Фрагменты гена интегразы фага phiadh. Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

Для того чтобы детектировать наличие свободных фаговых частиц после индукции, нами были подобраны праймеры, отжигающиеся вблизи концов генома профага. Так как при эксцизии профага вирусная ДНК замыкается в кольцо и при упаковке в вирионы раскрывается по другому сайту, на матрице ДНК из свободных вирусных частиц, мы должны были получить ПЦР-продукт известной длины (рис. 12).

Рис. 12. Обнаружение свободных вирусных частиц в одном из лизатов (дорожка №2), полученных в результате индукции профагов митомицином. Маркер - lkb DNA ladder (Fermentas).

Данная ПЦР-система позволила нам обнаружить 1 изолят, выделяющий свободные вирусные частицы при индукции митоцицином С, однако пока нельзя судить, являются ли данные частицы дефектными или могут инфицировать какие-то штаммы бактерий хозяев. В целом, низкая частота лизогении среди вагинальных лактобацилл нашей выборки

согласуется с данными [Martin et al., 2009], которые предположили, что длительное существование в присутствии перекиси водорода, являющейся индуцирующим агентом, может способствовать селекции изолятов с дефектными профагами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований, нами создана новая система геномного ПЦР-фингерпринтинга колиформных бактерий, по своему разрешению сравнимая с их фаготипированием. Эта система нашла применение в нашей лаборатории в работах по экологии и эволюции колифагов. В частности, с ее помощью показано исключительно высокое внутривидовое разнообразие индивидуальных популяций кишечных энтеробактерий лошадей - до 1000 одновременно присутствующих в образце IS-типов E.coli [Golomidova et al. 2007].

В составе влагалищной микробиоты женщин репродуктивного возраста было идентифицировано несколько видов лактобацилл благодаря использованию метода MALDI-TOF масс-спектрометрии. Три вида микроаэрофильных лактобацилл (L. crispatus, L. gasseri и L. jensenii) были абсолютно доминирующими (93,0%) независимо от состояния микробиоты влагалища (нормоценоз, мезоценоз или бактериальный вагиноз). Для выяснения возможного видового разнообразия лактобацилл при различном микробиологическом диагнозе у всех наблюдаемых женщин отбирали одинаковое количество первичных изолятов лактобацилл (10-15). Изучение 897 изолятов, полученных от 44 женщин показало, что индивидуальные популяции лактобацилл у большинства женщин гомогенны по видовому составу, реже содержат два (ещё реже три) различных вида лактобацилл.

Обнаружение нами факта видовой и внутривидовой гомогенности большинства индивидуальных популяций лактобацилл позволяет предположить, что колонизация влагалища у определённой женщины строго определённым представителем лактобацилл является не случайной, а отражает взаимное соответствие особенностей организма-хозяина (среды) и свойств микроорганизма. Например, способность адгезии к эпителию влагалища может зависеть от индивидуальных различий поверхностных белков эпителиальных клеток и штаммовых различий бактерий по набору и экспрессии адгезинов [Boris et al., 2000]. В таком случае это явление целесообразно учитывать при создании новых вагинальных пробиотиков. Возможно, окажется целесообразным проводить индивидуальный подбор пробиотического штамма с целью достижения наиболее эффективной и стойкой колонизации влагалища.

Наши результаты свидетельствуют о том, что масс-спектры клеточных лизатов лактобацилл несут достаточную информацию для их внутривидовой дифференциации, однако, по нашему мнению, необходима разработка специальных алгоритмов и программ для оптимального решения этой задачи. Следует указать, что разрешающей способности REP-ПЦР может быть недостаточно для отражения внутривидовой структуры вагинальной популяции лактобацилл. Так, нами было показано, что дифференцирующая способность этого метода не позволяет различать близкородственные изоляты E.coli, которые, тем не менее, различаются по такому экологически важному признаку, как чувствительность к бактериофагам.

выводы

1. Разработана система ISl-фингерпринтинга для внутривидовой дифференциации энтеробактерий. Метод ISl-фингерпринтинга по своей разрешающей способности сравним с методом специфического фаготипирования энтеробактерий.

2. С использованием системы ISl-фингерпринтинга выявлен высокий уровень внутривидового разнообразия индивидуальных популяций колиформных бактерий в фекалиях лошадей, содержащих сотни различных, одновременно присутствующих IS-типов.

3. Сформирована коллекция изолятов лактобацилл, выделенных из биоматериала здоровых женщин и женщин с нарушением биоценоза влагалища.

4. Установлено, что оптимизированный метод масс-спектрометрии клеточных белков (MALDI-TOF) может быть эффективно использован для идентификации и дифференциации лактобацилл. Показана высокая степень видовой и внутривидовой гомогенности индивидуальных популяций лактобацилл у обследованных пациенток.

5. В результате анализа коллекции изолятов лактобацилл с помощью ПЦР-системы установлено наличие лизогенных штаммов.

6. Выявлено относительное постоянство видового и внутривидового состава индивидуальных популяций симбиотических лактобацилл влагалища человека во времени.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Экспериментальные статьи:

1. Куликов Е.Е., Исаева A.C.. Роткина A.C., Маныкин A.A. и Летаров A.B. 2007. Биоразнообразие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей. Микробиология. 76,271-278.

2. Golomidova A., Kulikov Е., Isaeva A.. Manykin A. and Letarov А., 2007. The diversity of coliphages and coliforms in horse feces reveals a complex pattern of ecological interactions. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5975-5981.

3. Исаева A.C.. Куликов E.E, Тарасян K.K., Летаров A.B. 2010. Новый метод высокоразрешающего геномного ПЦР-фингерпринтинга энтеробактерий. Acta naturae. № 2 (1), 82-87.

4. Исаева A.C.. Летаров A.B., Ильина E.H., Боровская А.Д., Муравьёва В.В., Анкирская A.C. 2012. Видовая идентификация влагалищных лактобацилл, выделенных у женщин репродуктивного возраста. Акушерство и гинекология. №3, 60-64.

Тезисы и материалы конференций:

1. Исаева А.С.. Роткина А. С., Куликов Е.Е., Летаров А.В. Динамика численности популяций колифагов кишечника лошади. Всероссийская молодёжная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2005. Тезисы, 71-72.

2. Голомидова А.К., Исаева А.С.. Куликов Е.Е., Маныкин А.А. Разнообразие и динамика бактериофагов в микробном сообществе кишечника лошади. II Международная молодёжная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2006. Тезисы, 54-55.

3. Голомидова А.К., Исаева А.С.. Куликов Е.Е., Маныкин А.А. Сколько колифагов может ехать на одной лошади? Международная научная конференция "Микроорганизмы и биосфера", 2007. Тезисы, С. 83.

4. Голомидова А.К., Исаева А.С.. Куликов Е.Е., Маныкин А.А. Клинический случай дисбактериоза у лошади, вызванного антибиотиком: влияние на биоразнообразие колиформной микрофлоры кишечника. III Международная молодёжная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2007. Тезисы, 24-25.

5. Исаева А.С., Куликов Е.Е., Голомидова А.К. Новая ПЦР-система для высокоразрешающего фингерпринтинга штаммов колиформных бактерий, основанная на амплификации межсателлитной ДНК, фланкированной мобильными элементами IS1. III Международная молодёжная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2007. Тезисы, 41-42.

6. Golomidova А.К, Isaeva A.S.. Kulikov Е.Е., Manykin А.А How many coliphages can ride the same horse? 17th Evergreen international phage biology meeting. Abstracts 2007. С. A-3.

7. Golomidova A., Isaeva A.. Kulikov E., Manykin A. The complex pattern of ecological interactions of coliphages and their hosts in equine intestinal microflora. Phage biology, ecology and therapy meeting. Tbilissi, 2008. Тезисы, 57.

8. Ilina E., Borovskaya A., Govorun V., Letarov A., Isaeva A.. Maier Т., Kostrzewa M. Species identification and investigation of variability of Lactobacilli by MALDI-TOF MS profiling. The American Society for Microbiology 109th General Meeting in Philadelphia, Pennsylvania. 2009. Abstracts. C-107/165.

9. Исаева A.C.. Муравьева B.B., Боровская А.Д., Ильина Е.Н., Летаров А.В. Инструментальная оценка биоразнообразия лактобацилл влагалища человека. V Международная молодёжная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии". Москва, 2009. Тезисы, 81-82.

10. Isaeva A., Borovskaya A., Ilina E., Letarov A. The intraspecial diversity of vaginal Lactobacilli as a background for possible phage mediated perturbations of microflora. 18th Evergreen international phage biology meeting. 2009. Abstracts, 15.

И. Летаров A.B., Исаева A.C.. Боровская А.Д., Ильина E.H., Муравьева В.В., Анкирская A.C., Казначеева Т.В. Видовое и внутривидовое разнообразие индивидуальных популяций вагинальных лактобацилл и гипотеза фаговой этиологии бактериального вагиноза. Международный конгресс по репродуктивной медицине. Москва, 2010. Тезисы, 196-197.

12. Исаева A.C.. Летаров A.B., Боровская А. Д., Ильина E.H., Муравьева В.В., Анкирская A.C. Видовая идентификация лактобацилл влагалища, выделенных у женщин репродуктивного возраста. VII Молодежная школа конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011. Тезисы, 107-108.

13. Летаров A.B., Исаева A.C.. Ильина E.H., Муравьева В.В., Анкирская A.C. Исследование динамики и внутривидового разнообразия вагинальных лактобацилл и лактофагов с целью расшифровки этиологии бактериального вагиноза и оптимизации методов его лечения. Конференции и семинары по научным направлениям Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине». Москва, 2011. Тезисы, 19-20.

14. Исаева A.C.. Летаров A.B., Ильина E.H., Муравьева В.В., Анкирская A.C. Поиск лизогенных штаммов вагинальных лактобацилл. Международная научно-практическая конференция «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Ульяновск, 2013. Материалы конференции, Т.1, 69-73.

Формат 60x90/16. Заказ 1686. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаева, Алина Сергеевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии

наук

На правах рукописи

04201358032

Исаева Алина Сергеевна

ВНУТРИВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ СИМБИОТИЧЕСКИХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ

Специальность 03.02.03 -микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. А. В. Летаров

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................3

Актуальность работы.........................................................................3

Цель и задачи...................................................................................8

Научная новизна...............................................................................8

Практическая значимость работы..........................................................9

Апробация работы............................................................................10

Публикации...................................................................................10

Структура диссертации.....................................................................10

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 11

1.1 Микрофлора пищеварительного тракта животных и человека.................11

1.1.1 Семейство Enterobacteriaceae.......................................................16

1.1.2 Колиформные бактерии..............................................................17

1.2 Методы дифференциации штаммов E.coli..........................................20

1.3 Мобильные генетические элементы..................................................22

1.4 Микрофлора влагалища человека....................................................25

1.4.1 Род Lactobacillus......................................................................27

1.5 Роль фаговой инфекции в микробном сообществе кишечника и влагалища.....................................................................................30

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35

2.1 Выделение колиформных бактерий................................................35

2.2 Внутривидовая дифференциация колиформных энтеробактерий методом ПЦР.................................................................................36

2.2.1 Приготовление матриц для постановки ПЦР..................................36

2.2.2 Полимеразная цепная реакция....................................................37

2.2.3 Детекция результатов ПЦР.........................................................39

2.3 Работа с ДНК колиформных бактерий.............................................40

2.3.1 Переосаждение ДНК.................................................................40

2.3.2 Гидролиз ДНК........................................................................40

2

2.3.3 Выделение ДНК из агарозного геля методом "Glass milk"................41

2.4 Двуслойный метод высева колифагов.............................................42

2.5 Оценка уровня внутривидового разнообразия популяции колиформных бактерий.......................................................................................42

2.6 Методы выделения, определения, культивирования и хранения лактобактерий.................................................................................42

2.6.1 Выделение лактобацилл из биоматериала......................................42

2.6.2 Микроскопия препаратов лактобацилл..........................................44

2.6.3 Хранение лактобацилл .............................................................45

2.6.4 Идентификация лактобацилл методом MALDI-TOF масс-спектрометрии...............................................................................45

2.6.5 Дифференциация лактобацилл методом REP-PCR...........................46

2.6.6 Секвенирование гена 16S лактобацилл..........................................47

2.6.7 Исследование способности лактобактерий продуцировать перекись водорода......................................................................................47

2.6.8 Исследование способности лактобацилл к образованию биопленок.....48

2.6.9 Поиск лизогенных штаммов лактобацилл с помощью ТТЦР и индукция

профагов.......................................................................................49

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51 3 .1 Исследование разнообразия колиформных бактерий.........................51

3.1.1 Метод ISl-фингерпринтинга колиформных бактерий.......................51

3.1.2 Результаты ISl-фингерпринтинга колиформных бактерий................51

3.1.3 Воспроизводимость и чувствительность ISl-фингерпринтинга...........52

3.1.4 Стабильность системы ISl-фингерпринтинга..................................54

3.1.5 Сравнительная характеристика методов ISl-фингерпринтинга, ВОХ-фингерпринтинга, риботипирования и фаготипирования колиформных бактерий.......................................................................................55

3.1.6 Усовершенствование системы ISl-фингепринтинга..........................60

3 .1.7 Внутривидовое разнообразие популяций колиформных бактерий.......61

3 .2 Исследование индивидуальных популяций лактобацилл.....................67

3.2.1 Формирование коллекции клинических изолятов лактобацилл............67

3.2.2 Оптимизация метода масс-спектрометрии пептидов и оценка возможности его применения для видовой идентификации лактобацилл........................68

3.2.3 Анализ коллекции клинических изолятов лактобацилл..................69

3.2.4 Тестирование изолятов лактобацилл на способность продуцировать перекись водорода............................................................................73

3.2.5 Оценка возможности применения технологии прямого бактериального профилирования для внутривидовой дискриминации Lactobacillus.............75

3.2.6 Дифференциация клинических изолятов лактобацилл методом REP-ПЦР.............................................................................................78

3.2.7 Мониторинг состояния микроценоза половых путей и видового состава индивидуальных популяций лактофлоры..............................................82

3.2.8 Исследование способности лактобацилл, выделенных из половых путей, образовывать биопленки...................................................................87

3.2.9 Поиск лизогенных штаммов лактобацилл и индукция профагов........88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................90

ВЫВОДЫ.....................................................................................92

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 93

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В составе микробиоценоза человека и животных имеются экологические ниши, колонизированные бактериями с весьма высокой плотностью популяций отдельных видов (или групп близких видов). Наиболее исследованными являются колиформные бактерии кишечника (преимущественно представленные Е. coli), а также лактобациллы влагалища. Под влиянием различных факторов эти, а также иные микробные популяции нормальной микрофлоры могут изменяться в качественном и количественном отношении, что зачастую приводит к нарушению устоявшегося биоценоза, снижению численности или гибели отдельных представителей, к появлению микроорганизмов, не характерных для данного биотопа, и развитию дисбиотических заболеваний [Oakley et al, 2007]. Существует множество факторов, способных влиять на состав и состояние микрофлоры, и одним из наименее изученных факторов остается фаговая инфекция. Так как бактериофаги обладают, как правило, штаммовой специфичностью [Chibani-Chenouffi et al., 2004], для изучения возможной роли фаговой инфекции в экологии отдельных видов бактерий в симбиотических микробных сообществах человека и животных необходимо иметь возможность оценки уровня внутривидового разнообразия индивидуальных популяций соответствующих микроорганизмов. Для этого необходимы современные молекулярные методы, не требующие много времени и средств, и в то же время, обладающие высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью. Так как ряд физиологических и биохимических показателей (чувствительность к фагам, антибиотикорезистентность, продукция токсинов и др.) микроорганизмов, в том числе, медицински важных, являются признаками штаммов, необходимы системы, способные надёжно дифференцировать микробы на внутривидовом уровне.

В качестве объектов исследования мы выбрали две симбиотические

микробные системы млекопитающих, для которых имеются основания

5

предполагать значительное воздействие природных бактериофагов на структуру и динамику популяций хорошо охарактеризованных видов бактерий. Это биоценоз кишечника лошади, в котором мы исследовали разнообразие колиформных бактерий, и биоценоз влагалища человека с заселяющими его популяциями лактобацилл.

На настоящий момент данные о составе микробного сообщества влагалища человека на внутривидовом уровне ограничены. В то же время в ряде работ [Blackwell et al., 1999; Kilic et al., 2001] высказывались предположения о возможной роли фаговой инфекции в развитии такого распространённого дисбиотического расстройства, как бактериальный вагиноз [Turovskiy et al., 2011]. Предположение о фаговой этиологии части случаев бактериального вагиноза хорошо согласуется с данными об эпидемиологии этого расстройства, характерной для заболеваний, передающихся половым путем [Sprinivasan et al., 2010]. Кроме того, при разработке вагинальных пробиотических препаратов для лечения БВ [Falagas et al., 2007; Aslim et al., 2006] полагают целесообразным учитывать различную индивидуальную совместимость пациенток не только с определенными видами, но и штаммами лактобацилл, что требует данных о динамике как видового, так и штаммового состава сообщества.

Существующие методы видовой идентификации лактобацилл очень

трудоёмки и не пригодны для массового анализа, а методы дифференциации их

штаммов практически не разработаны. Представление о Lactobacillus

acidophilus как о практически единственном представителе нормальной

микрофлоры влагалища со времен Дедерлейна [Thomas S., 1928] непоколебимо

просуществовало почти столетие. Только с внедрением молекулярно-

генетических методов исследования появилась возможность на новом

методическом уровне изучать композиционные особенности состава

микробиоты влагалища, которая играет важную роль в колонизационной

резистентности этого органа как защитного барьера репродуктивной системы

человека в целом [Antonio et al., 2005; Stoyancheva et al., 2006]. Первые

6

исследования показали значительное видовое разнообразие лактофлоры и отличия её в разных этнических группах женщин и в различных регионах мира, что, по-видимому, является генетически обусловленным [Kilic et al., 2001; Song et al., 1999; Antonio et al., 1999]. Такие исследования могут стать базой для новых терапевтических стратегий в лечении влагалищных инфекций, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, а также основой при отборе штаммов для создания пробиотических биопрепаратов.

В России ранее не проводилось систематических исследований по видовой идентификации влагалищных лактобацилл у женщин различных возрастных групп и при различном состоянии микробиоценоза влагалища. Проблема внутривидового (штаммового) разнообразия лактобацилл также практически не изучена ни в России, ни в других странах.

В качестве модельного объекта для исследования разнообразия индивидуальных популяций энтеробактерий выбрана экосистема кишечника лошади. Слепая кишка и толстый кишечник лошади содержат сложное микробное сообщество, которое играет важную роль в переваривании целлюлозы и поддержании здоровья животного [Dombek et al., 2000]. В отличие от толстого кишечника человека, где по имеющимся косвенным данным преобладают умеренные бактериофаги и влияние фаговой инфекции на популяции бактерий ограничено [Letarov and Kulikov, 2009; Clookie et al., 2011], в толстом кишечнике лошадей преобладают вирулентные бактериофаги [Letarov and Kulikov, 2009]. Это обстоятельство делает данную экосистему весьма привлекательным модельным объектом для изучения механизмов взаимодействия, взаимной адаптации и микроэволюции фагов и бактерий в микробном сообществе кишечника животных. Для успешного осуществления этих исследований прежде всего необходимы данные о внутривидовом разнообразии индивидуальных популяций колиформных бактерий и надёжные методы типирования штаммов, позволяющие дифференцировать, в том числе, и очень близкородственные изоляты, которые могут, тем не менее, различаться

по чувствительности к индигенным бактериофагам.

7

Целью данной работы является исследование внутривидового разнообразия колиформных бактерий и лактобацилл симбиотических микробных сообществ.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Разработать надежную и удобную в использовании ПЦР-систему геномного типирования изолятов кишечной палочки и близких к ней видов и сравнить дифференцирующую способность нового метода с существующими методами типирования бактерий.

2. Исследовать внутривидовое разнообразие колиформных бактерий в индивидуальных популяциях кишечных колиформных бактерий лошадей.

3. Оценить применимость масс-спектрометрического метода МАЬШ-ТОР идентификации бактерий для целей видовой и внутривидовой дифференциации изолятов вагинальных лактобацилл и разработать на его основе методику их внутривидовой дифференциации.

4. Сформировать коллекцию изолятов лактобацилл, выделенных из биоматериала здоровых женщин и женщин с нарушением биоценоза половых путей, и охарактеризовать видовое и внутривидовое разнообразие индивидуальных популяций этих бактерий.

5. Исследовать коллекцию изолятов лактобацилл для обнаружения лизогенных штаммов.

6. Оценить изменчивость состава индивидуальных популяций лактобацилл влагалища во времени.

Научная новизна. Создана новая система геномного К-типирования колиформных бактерий. Система ^-типирования апробирована на серии полевых изолятов колиформных бактерий. Показано, что по дифференцирующей способности, производительности и воспроизводимости

новая система превосходит существующие методы геномной дифференциации изолятов энтеробактерий, основанные на ПЦР.

Применение новой системы позволило обнаружить высокое внутривидовое разнообразие колиформных бактерий, населяющих кишечник лошадей.

Разработаны и апробированы на обширной коллекции клинических изолятов подходы к внутривидовой дифференциации вагинальных лактобацилл на основе масс-спектров цельноклеточных лизатов. Анализ индивидуальных популяций лактобацилл выявил низкий уровень их внутривидового разнообразия у большинства женщин, что не было ранее показано другими исследователями.

Практическая значимость работы. 1. Дифференцирующая способность разработанной нами системы Ш-типирования изолятов энтеробактерий, сравнимая с фаготипированием, делает ее наиболее предпочтительным методом при исследовании микроэкологии бактериофагов энтеробактерий в естественных микробных системах, таких, как кишечник животных или сточные воды. 2. Дифференцирующая способность 181-системы, наряду с хорошей воспроизводимостью результатов, могут быть крайне полезны и для целого ряда других задач, например, при прослеживании эпидемиологических цепочек распространения штаммов патогенных энтеробактерий среди людей или животных. 3. Разработанный нами способ внутривидовой дифференциации лактобацилл на основе анализа их белковых спектров (МАЫЛ-ТОР) существенно превосходит описанные в литературе методы ПЦР-типирования этих бактерий по производительности, и не уступает им по разрешающей способности. 4. Полученные нами данные об уровнях внутривидового разнообразия индивидуальных симбиотических популяций колиформных бактерий и лактобацилл будут востребованы в дальнейших исследованиях по экологии подобных микробных систем, включая экологию бактериофагов, а также при разработке новых пробиотических и лечебных фаговых препаратов, и стратегий их применения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: I, II, Ш, V,VII Молодежных школах конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2003, 2005, 2007, 2011 гг.); Международной научной конференции "Микроорганизмы и биосфера" (Москва, 2007 г.); 18-й Международной конференции «Биология фагов» (18th Evergreen international phage biology meeting) (США, Эвергрин, 2009 г.); 109 Съезд Американского общества микробиологов (The American Society for Microbiology 109th General Meeting) (США, Филадельфия, 2009 г.); Конференции и семинары по научным направлениям Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2011 г.); Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010 г.), Международная научно-практическая конференция «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (Ульяновск, 2013 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 14 тезисов и материалов конференций.

Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 108 страницах и включают 24 рисунка и 10 таблиц. Список литературы содержит 160 источников, из них 26 отечественных и 144 зарубежных. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка используемой литературы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

1.1. Микрофлора пищеварительного тракта

Нормальная микрофлора это сообщество микроорганизмов тела здоровых животных. Это сообщество характерно совершенно здоровому организму и способствует поддержанию его здорового статуса. Вся микрофлора тела животного называется аутомикрофлорой, то есть микрофлора данного организма в норме и при патологии [Интизаров М. М., 2007]. Нормальная аутофлора животного, представляет собой специфический жизненно важный орган и выполняет ряд важных функций: защитных, метаболических, регуляторных и других [Costello et al., 2009; Berg R. D., 1996; Tancrede C., 1992].

Наибольшая концентрация микроорганизмов наблюдается в желудочно-кишечном тракте из-за наличия в нем разнообразных питательных веществ. Пище