Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биоразнообразие бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas и создание молекулярной системы их идентификации и диагностики

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas и создание молекулярной системы их идентификации и диагностики"

на правах рукописи

ЗОТОВ Василий Сергеевич

БИОРАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ ШПгОВШМ И хштномотз И СОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИАГНОСТИКИ

Специальность 03.01.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ ш

МОСКВА 2013

005060191

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ТОПУНОВ Алексей Фёдорович

Официальные оппоненты:

УМАРОВ Марат Мутагарович доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», факультет почвоведения, кафедра биологии почв, профессор кафедры

СЕВАСТЬЯНОВА Галина Андреевна доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет», биолого-химический факультет, кафедра органической и биологической химии, доцент кафедры

Ведущая организация - ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии" Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится « 26 » июня 2013 года в 16 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 212.154.17 при ФГБОУ ВПО «Московский педагогический государственный университет» по адресу: 119021, г.Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп.5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ по адресу: 119991, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1. .

Автореферат разослан Ч_2013 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, Холмогорова Наталья Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Изучение взаимодействий между растениями и микроорганизмами - одно из активно развивающихся направлений современной биологии. Эти взаимодействия играют важную роль в жизни растений, их питании, защите от патогенов и вредителей, а также адаптации к стрессам и регуляции развития.

В данной работе были изучены бактерии двух родов, отличающихся по типу питания и сельскохозяйственной важности: симбиотические бактерии рода Rhizobium и фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas.

Семейство Бобовые (Fabaceae) включает в себя более 19000 описанных видов растений, которые, как правило, способны вступать в симбиотические взаимоотношения с азотфиксирующими бактериями с образованием клубеньков на корнях. Одними из представителей бактерий-симбионтов ценных сельскохозяйственных культур, таких как горох, чечевица, бобы, клевер, фасоль, козлятник являются бактерии рода Rhizobium.

Необходимость изучения таксономической структуры и биоразнообразия данного рода связана с тем, что знание их генетической структуры и полиморфизма сортовых линий растений, позволяет выявить динамику эволюционной изменчивости, и тем самым, спрогнозировать наиболее адаптированные друг к другу пары микро-макросимбионтов. Такая координированная селекция позволит создавать комбинации симбионт-растение с более эффективным процессом азотфиксации для полноценного развития и формирования высокого урожая. Бактерии рода Xanthomonas поражают более 400 видов растений, что приводит к серьезным экономическим потерям. Род Xanthomonas включает более 27 видов, обладающих сходными физиологическими и генетическими признаками. Недостатком их диагностики, применяемой в настоящее время, является тестирование штаммов на одном таксономическом уровне, и только известной группы бактерий.

Вследствие частых межвидовых рекомбинаций между различными аллелями таксономически важных генов (dnaK, nod, hrp) или их консервативности (I6S рРНК, 23S рРНК), не всегда удается адекватно классифицировать изоляты ризобий и ксантомонад, что приводит к необходимости получения дополнительных генетических данных. Диагностика и идентификация фитопатогенных и симбиотических бактерий затруднена также присутствием на растении эпифитов родственных видов, со сходными физиологическими и генетическими признаками.

Таким образом, становится необходимой разработка быстрого и надёжного метода молекулярно-генетического анализа данных родов бактерий, как основы для фундаментально прикладных исследований, направленных на защиту и повышение урожая сельскохозяйственных культур. Цель н задачи исследования. Целью работы является изучение разнообразия

природных популяций бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas с помощью самостоятельно разработанной единой маркерной системы бактериальной идентификации и диагностики.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

• Разработка уникальных маркеров для фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и симбиотических бактерий рода Rhizobium на основе данных ПЦР-фингерпринтинга.

• Разработка новых техник ПЦР-фингерпринтинга бактерий на внутривидовом уровне, отвечающие требованиям достоверности, воспроизводимости и информативности, а также простоты исполнения.

• Проведение биохимического и молекулярно-генетического анализа изолятов и штаммов коллекции азотфиксирующих бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины.

• Оценка генетического разнообразия ксантомонад, в том числе поражающих рапс (Brassica napus) в России, с помощью новой разработанной техники ПЦР-фингерпринтинга.

• Формирование единой базы данных, включающей совокупность биохимических и уникальных генетических признаков исследуемых бактерий.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружен специфичный для различных родов бактерий Аш-регион (заявка на патент per. № 2011135461 от 25.08.2011), позволяющий изучать биоразнообразие бактерий на внутривидовом уровне. На его основе разработаны специфические для клубеньковых бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas маркерные системы.

Предложен новый подход к изучению генетического разнообразия фитопатогенных и симбиотических бактерий на внутривидовом уровне с помощью разработанных техник Аш-регион ПЦР и saAFLP (single adapter AFLP).

Впервые изучена природная популяция клубеньковых бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины с помощью методов молекулярно-генетического анализа, включая техники A/w-регион ПЦР и saAFLP.

Впервые с помощью разработанных техник изучено генетическое разнообразие ксантомонад, в том числе поражающих рапс (Brassica napus) в России.

Создана библиотека обобщённых биохимических и уникальных генетических данных для представительной коллекции бактерий родов Xanthomonas и Rhizobium.

Практическая значимость.

Установлено, что saAFLP-фингерпринтинг и секвенирование последовательностей ДНК Аш-регионов обладают большой разрешающей

способностью на внутривидовом уровне. Данные техники могут быть использованы для:

- паспортизации ценных штаммов полезных бактерий;

- мониторинга экологической обстановки и динамики развития почвенных сообществ микроорганизмов;

- идентификации, диагностики и изучения генетического разнообразия широкого круга не только бактерий, но и растений.

Предложенные техники и обобщённая база биохимических и генетических данных являются весьма полезным инструментарием для сопоставления результатов, получаемых в различных лабораториях.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференции "Вычислительная филогенетика и геносистематика" (Москва, 2007), на международных конференциях NOVA PhD курс "Понимание взаимодействий растение-патоген в постгеномную эру" (Hyytiälä, Финляндия, 2008) и "Адаптация к изменению климата в Балтийском регионе: вклад растительной и микробной биотехнологии" (Миккели, Финляндия, 2010), на школах молодых учёных "Молекулярные методы в микробиологии. Практическое введение" (Симферополь, Украина, 2010) и "Основы практической молекулярной экологии микроорганизмов" (Симферополь, Украина, 2011), на школе-конференции молодых учёных "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2011" (Москва, 2011), на 10-ой Европейской конференции по азотфиксации (Мюнхен, Германия, 2012), а также на международной школе-конференции молодых ученых «Растительно-микробные группировки: молекулярные основы адаптивного потенциала» (Алушта, Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, включённых в список, рекомендованный ВАК РФ. Объем и структура работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 180 страницах текста, иллюстрирована 37 рисунками, включает 12 таблиц. Список литературы состоит из 498 источников, из них 477 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Бактериальные штаммы. В работе использован 51 изолят клубеньковых бактерий рода Rhizobium из коллекции полезных микроорганизмов Института сельского хозяйства Крыма Национальной академии аграрных наук Украины (Симферополь). 12 типовых штаммов Rhizobium sp. были предоставлены коллекцией ВНИИСХМ РАСХН (Санкт-Петербург). 68 штаммов Xanthomonas sp., поражающих рапс (Brassica napus) в Московской области и Северокавказском регионе России, а также штаммы, принадлежащие видам X.

campestris, X. fuscans, X. oryzae, X. citri, X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. performance, X gardneri и X. albilineans, были любезно предоставлены Лабораторией бактериальных болезней ВНИИФ РАСХН (Голицыно). Идентификация. Культуральные и физиолого-биохимические свойства изолятов Rhizobium sp. изучали согласно общепринятым методам микробиологии и биохимии (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991; Берджи, 1997) и методическим рекомендациям ВНИИСХМ РАСХН (Возняковская, Попова, 1985). Изоляты исходно были проверены на родовую принадлежность с помощью оценки вирулентности на соответствующих растениях-хозяевах и основных биохимических тестов. Все бактерии рода Xanthomonas исходно были проверены на принадлежность к роду с помощью оценки вирулентности на соответствующих растениях-хозяевах, основных биохимических тестов и анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и gyrB (Пунина с соавт., 2008).

Выделение ДНК. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК штаммы культивировали на агаризованной среде TY: дрожжевой экстракт - 1 г/л; пептон - 10 г/л; СаС12 - 0,4 г/л; агар - 20 г/л (Beringer, 1974). ДНК была выделена из свежих культур на 1-2 сутки их роста с помощью метода сорбции на магнитных частицах (набор "Минипреп", «Силекс», Россия). ПЦР амплификация. ПЦР амплификацию нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК проводили с использованием праймеров FD1 и RDI (Weisburg et al., 1991), а для последующего секвенирования — BD_F и BD_R (Коростик с соавт., 2006), /ил-региона с использованием разработанных нами специфических для рода Rhizobium праймеров Pr.rhizF и Pr.rhizR (Зотов с соавт., 2011), рецепторного гена nodOl с праймерами NODD2PH678 и NODD3PH2152' (Laguerre et al., 1996), генов субъединиц нитрогеназы nijD-K с праймерами FGPD807 и FGPK492' (Laguerre et al., 1996), гена гиразы субъединицы Б gyrÜ с праймерами UP1 и UP2r (Yamamoto et al., 1995). RFLP анализ и секвенирование межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS). Амплификацию межгенного региона рибосомального кластера (ITS) для последующего рестриктного анализа проводили с использованием праймеров FGPS1490-72 (Normand et al., 1992) и ITS_R, адаптированного для бактерий рода Rhizobium (Зотов с соавт., 2012). Рестрикционный анализ проводился с использованием эндонуклеаз рестрикции Alul, НаеIII и Mspl ("Fermentas", США) согласно инструкциям производителя. Обработанную рестриктазами ДНК анализировали при помощи электрофореза в 3%-ном агарозном геле. Секвенирование нуклеотидных последовательностей ITS проводили с использованием специфичных для рода Rhizobium праймеров Pr.Ile_F и Pr.AIa_R (Зотов с соав., 2012).

Анализ нуклеотидных последовательностей. Первичный сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных

ГенБанка был проведён с помощью программы NCBI Blast (Altschul et al., 1990). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW 1.75v. (Thompson et al., 1994). Проверка и редактирование были осуществлены с помощью редактора «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Филогенетические деревья были построены в программе Mega 3.1 (Kumar et al., 2004) с помощью алгоритма Neighbor-Joining NJ (Nei and Kumar, 2000). По парные генетические расстояния между последовательностями были определены по двухпараметрической модели Кимуры (Kimura, 1980). Уровень нуклеотидного полиморфизма вычислен в программе DnaSP 5.10 (Rozas et al., 2010).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Молекулярная идентификация фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas

saAFLP анализ и анализ Лш-регнона бактерий рода Xanthomonas

Реализованный в данной работе saAFLP анализ представляет собой модификацию классического метода AFLP (Vos et al., 1995; Willems, 2000). Для постановки данного метода на бактериях родов Xanthomonas и Rhizobium были подобраны две рестриктазы ХтаЯ и Xbal, каждая из которых в отдельности давала от 5 до 30 ожидаемых фрагментов рестрикции в диапазоне длин до 4000 п.о. После амплификации данные фрагменты исследовались путём электрофореза в 1.2%-ном агарозном геле.

Модифицированный метод saAFLP имея все преимущества оригинальной методики AFLP, обладает высокой воспроизводимостью и достоверностью и служит удобным инструментом для выбора таксонспецифичных маркеров. Одним из таких маркеров, найденных и изученных в данной работе, стал hin-регион (Зотов с соавт., 2011. Заявка на патент per. № 2011135461 от 25.08.2011). Маркер был обнаружен экспериментально при saAFLP анализе штаммов Xanthomonas sp. (рис.1) и Rhizobium sp. (рис.8).

/ия-регион 950 п.о.

____________. ид-£х.о-хпл

Рис.1 Элекгрофоретический анализ продуктов заАБЬР, ХЬа\, Стрелкой указан общий фрагмент (А/л-регион) для всех изолятов X. сатрез1г1$ из поражённых растений рапса.

Данный маркер, будучи основанием геномной архитектуры, образует независимые классы Лш-регионов, соответствующие бактериальным видам, а часто и обособленным группам, выявляемым на уровне вида, и обладает внутривидовым полиморфизмом. Hin-регион (от латинского hin - уникальный, неповторимый) - хромосомная последовательность ДНК, аналогов которой не найдено ни в одном секвенированном геноме про- и эукариот, располагается между повторами генов тРНК (Глу), которые в свою очередь являются предшественниками на начальной стадии биосинтеза тетрапирролов (гемоглобинов и хлорофилла) в растениях, археях и бактериях (Jahn et. al., 1992).

На основании результатов saAFLP анализа была впервые создана маркерная система Аш-регион ПЦР, специфическая для фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, обладающего сложной таксономической структурой. Система была апробирована на представительной выборке штаммов (>200), включающей штаммы и изоляты, видовая принадлежность которых до сих пор была не ясна. Ранее данные штаммы были исследованы с помощью биохимических и молекулярно-биологических методов (Пунина с соавт., 2008). Самым перспективным таксономическим маркером, способным составить достойную конкуренцию «золотому стандарту 16S рРНК» был признан ген гиразы Б. Однако данные исследования не позволили окончательно установить таксономическую структуру отдельно взятых видов. По результатам проведенного анализа на основании различия в структуре были выделены 7 классов А/и-региона и определены 7 характерных длин продуктов реакции (табл.1, рис.2).

1 2 3 4 5 6 7

Рмс.2 Электрофоретический анализ продуктов /»'«-регион ПЦР со штаммами Xanthomonas sp.. Номерами обозначены характерные дайны Лш-регионов: 1 - 94СН-950 + 600 п о.; 2 -940+950 п.о.; 3 - 800 п.о.; 4 - 680+690; 5 - 660 п.о.; 6 -400 п.о.; 7 - 300 п.о.

Исследование нуклеотидного полиморфизма Аш-региона у 39 коллекционных штаммов ксантомонад показало большую, чем у гена гиразы Б информативность, с сохранением топологии филогенетического древа (рис.3).

Отдельно была исследована выборка из 68 штаммов Xanthomonas sp., учитывающая фактор географической удалённости посевных площадей (Московская область и Северокавказский регион России), фактор различных генотипов растений-хозяев (различные сорта рапса - Brassica napus и горчица -Brassica nigra), а также тип посевов - озимый и яровой.

гсЕ

Х.агЬопсо1а I (3) Х.агЪоп'со1а II (3) _ X. дагс1пеп - О

X. агЬопсо1а - Ып IV (6) (4) - Ып VI

— X. огугае (3) - Ып II „г1 X. Тивсапв (2) - Ып Ша 1— Х.ахопоросЧз ри. сИп (1) - Ып ШЬ

\X.axonopodisр\. сИгитеЬ 7-7 (ИС 016010)

% X. емез'юаШ'ш - А (1) • Ып Шс

, регГогапсе - С (2) - Ып ИШ

--X. уевкаШа-В (2)-Ып V

^ X. сатрезМэ I (6) и X. сатрезМв II (9) - Ып 1а и 1Ь -X. а/ЬШпеапв (2) - Ып VII

0.01

Рис.3 Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей йш-региона ХашИотопаз Бр. с использованием алгоритма Ш. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований (генетическим дистанциям).

По результатам Л/и-регион ПЦР была установлена принадлежность штаммов к видам X. сатрезгш (1а и 1Ь класса), X. агЬопсо1а и X. gardneri. Методом ваАРЬР среди данных штаммов было выявлено 8 генотипов (табл.2). Данный подход позволяет выявить пути распространения фитопатогена, а также степень его агрессивности. Стоит отметить увеличенный видовой спектр поражающих именно озимый рапс бактерий, что, вероятно, связано с лучшим сохранением патогена на хозяйском растении. Отсутствие генетического разнообразия между изолятами ксантомонад внутри одной посевной площади может свидетельствовать о распространении патогена преимущественно с семенами сельскохозяйственных культур растений.

Таблица 1. Классы Ып-региона и генотипы штаммов Хаткотопаз эр., выявляемые с помощью Лш-регион ПЦР

Класс А/и-регнона* Группа Длина Мп-региона, п.о. Количество штаммов Растение - хозяин

1а X. сатрезК'к I 940-950 + 600 29 капуста, репа, редька, горчица, редис, хрен, томат

1Ь X. сатревЫэ II 940- -950 75

II X. о:у:ае 940- -950 4 рис

Ша X. /изсат 940- -950 3 бобы, фасоль

ШЬ Х.ахопоро(И$ ру. сИп 940- -950 1 цитрусовые

Шс X. етеэкШопа (А) 940 3 томат

ИМ X рег/огапсе (С) 800 13 люцерна, бобы, горох

IV X. агЪопсоЫ 680-690 33 крестоцветные, сложноцветные, злаки

V X. \esicatoria (В) 660 21 томат, перец

VI X. %агйпег\ (И) 400 18 томат, перец

VII X. а1Ыпеагк 300 3 сахарный тростник

* Классы Аш-региона выделены на основании различий в структуре нуклеотидных последовательностей /¡¿«-региона ХапЛютопаз ер.

Таблица 2. Генетическое разнообразие штаммов ХапЛотогш эр., поражающих рапс и горчицу

Кол-во штаммов Наименование Генотип ваАРЬР Класс Л/я-региона

Горчица (Brassica nigra)

4 Москва, РГАУ МСХА им. К.А. Тимирязева 1 la, X. campestris I

2 Московская область, Одинцовский р-н 5-6

2 Московская область, Одинцовский р-н 3 1Ъ,Х. campestris II

1 Московская область, Одинцовский р-н 2

Озимый рапс (Brassica napus)

9 сорт Шейн; Северный Кавказ, Успенский район 2 1Ъ,Х. campestris II

11 сорт Элвис; Северный Кавказ, Гулькевичи 3

1 сорт Отрадненский; Московская область, Ногинский р-н 7 IV, X. arboricola

4 сорт Отрадненский; Московская область, Ногинский р-н 3 lb, X. campestris II

8 сорт Отрадненский; Московская область, Ногинский р-н, д. Белково 4 VI, X. gardneri

12 сорт Отрадненский; Московская область, Ногинский р-н, д. Пятково 5 lb, X. campestris II

Яровой рапс (Brassica napus)

4 сорт Луговской; Московская область, Можайский р-н 8 IV, X. arboricola

4 сорт Ратник; Московская область, Одинцовский р-н 6 lb, X. campestris II

3 сорт Герое; Московская область, Одинцовский р-н 1 la, X. campestris I

Идентификация азотфикснрующих симбиотических бактерий рода Rhizobium Физиолого-биохимические свойства

Род Rhizobium традиционно классифицируют на основании фенотипических характеристик, таких, как способность к образованию клубеньков и физиолого-биохимических свойств. По результатам проведенных анализов все изученные в работе изоляты принадлежали роду Rhizobium и обладали специфичностью к инфицированию группы растений гороха, бобов, чины, вики, чечевицы (bv. viviae), а также растений фасоли (bv. phaseoli), клевера (bv. trifolií) и козлятника (Л galegae). Изоляты клубеньковых бактерий показали высокую эффективность в симбиозе с современными сортами бобовых культур в почвенно-климатических условиях Украины, что позволило повысить продуктивность растений на 10-30 % (Дидович с соавт., 2008). Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК

Изучение генетического разнообразия ризобий проводят на базе различных целевых фрагментов ДНК (рис.4). Полные ДНК последовательности гена 16S рРНК были получены для всех изолятов Rhizobium sp. В качестве контролей были применены ДНК последовательности гена 16S рРНК типовых штаммов Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium и построено филогенетическое дерево (рис.5). По результатам анализа все исследуемые изоляты были отнесены к 4 видам рода Rhizobium: R. leguminosarum, R. etli, R. giardinii и R. galegae. Для штаммов вида R. leguminosarum нуклеотидные последовательности гена имели одну внутривидовую G/A/C/T замену (1069 п.о. от начала гена по геному NC_008380). У штаммов R. giardinii, R. galegae и R. etli внутривидовой полиморфизм ДНК последовательностей гена 16S рРНК обнаружен не был. Однако, вследствие случайного характера нуклеотидных замен и частым рекомбинационным событиям, ген J6S рРНК не может быть применён для достоверного определения филогенетической структуры Rhizobium sp. на видовом и внутривидовом уровнях.

FOI BD F BD_R RDI

тРНК-lle TPHK-Ala

16S рРНК Т Т 23S рРНК

Pr.lle F РгЛ1а R

Avril 328 Avril 149 Avril

X X X

Pr.rhiz_F \ Pr.rhiz_R Pr.rhiz_R

hin-регион (R)

Рнс.4 Схематичное представление геномной ДНК ризобий с расположением на ней как референсных (голубой цвет), так и предложенных нами (песочный цвет) целевых фрагментов: генов рибосомального кластера, сайтов рестрикции редкощепящих эндонуклеаз (Avril), белок-кодирующих генов, симбиотических генов и межгешшх регионов.

R. leguminosarum (44)

R. leguminosarum bv. trifolii 132Ssi R. leguminosarum bv. viceae 31 R. leguminosarum bv. phaseoli 108* R. leguminosarum bv. phaseoli QK-6 R. leguminosarum bv. phaseoli 0H R. leguminosarum bv. phaseoli 108" R. leguminosarum bv. phaseoli QK-4 R. leguminosarum bv. phaseoli 0K-O R. leguminosarum bv. phaseoli 105

-R. leguminosarum bv. phaseoli 4>H-6

I— Rhizobium radiobacter K84 (CP000628) _i i Rhizobium rhizogenes IFO 13257 T (D14501) "Ml Rhizobium lusitanum P1-7 T(NR_0431S0) »L, Rhizobium tropici CIAT 899 T (EU488752) SL Rhizobium hainanense 166 T(U71078) |r Rhizobium etli CIAT 652 (NC 010994) Jl R. etli 700-si

r Rhizobium sullae IS 123 T(Y10170) -4 p- Rhizobium indigoferae CCBAU 71042 T (AF364068) 4 Rhizobium yangiingense SH22623 T (AF003375) ■ Rhizobium gallicum RE02sp T (U86343) - Rhizobium mongoiense USDA 1S44 T (U89817) Rhizobium loessense CCBAU 7190B T (AF364069) r Rhizobium galegae ATCC 43177 T (D11343) R. galegae K-3 R. galegae 926-st R. galegae 916-st R. galegae 913-st R. galegae K-18 R. galegae 912-st

Rhizobium huautlense S02 T (AF025852)

Rhizobium undicola LUG 11875 T(Y17047) Rhizobium vitis NCPPB3554 T(D01258) Rhizobium rubilFO 13211 T (D01259) Rhizobium tumefaciens NCPPB2437 T (D01256) ■ Rhizobium giardinii H152 T(U86344) R. giardinii <PC

r Uesorhizobium plurifarium IMG 11892 T (Y14158) rj- Mesorhizobium amorphae ACCC19665 T (AF041442) H- Uesorhizobium huakuiilFO 15243 T(D13431) IL- Mesorhizobium mediterraneum UPU-Ca3S T (U8825) P" Mesorhizobium Hanshanense USDA 3592 T(AF041447) '-Mesorhizobium chacoense PR5 T (AJ278249)

R. leguminosarum (54)

] R. etli (1)

»j-Rhizo

I I-Rhizobiui

*П |-Rhizobiur.

eil— Rhizobium tt

_T Mesorhizobium ciceri UPM-Ca7 T (U07934)

" Uesorhizobium loa LUG 6125 T (X67229) BJ Sinorhizobium meliloti LUG 6133 T (X67222) P Sinorhizobium kummerowiae CCBAU 71714 T (AF364067) if Sinorhizobium medicae A321T (L39882) I- Sinorhizobium arboris HAMB 1552 T (278204)

i- Sinorhizobium kostiense HAMB11489 T(Z78202) - Sinorhizobium terangae LUG 6463 T (X683B7) Sinorhizobium saheliLUG 7837 T (X68390) Sinorhizobium frediiATCC 35423 (D01272) Sinorhizobium xiiyiangense IAM 14142 T (D12796) -Bradyrhizobium japonicum DSM 3013t T 0(87272)

R. galegae (6)

R. giardinii (1)

Mesorhizobium

Sinorhizobium

Bradyrhizobium

Рис.5 Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей гена 165' рРНК бактерий рода ШгкоЫит и других представителей ЮнгоЫасеае с использованием алгоритма Ш. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами в скобках указано количество изученных изолятов.

RFLP анализ и секвенирование межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS)

Анализ ITS бактерий рода Rhizobium, показал, что 22 из 63 штаммов (35%) имеют 2 продукта ПЦР амплификации, отличных не только по длине (рис.6), но и по нуклеотидному составу, что соответствует полученным ранее данным для данного региона (Кwon et al., 2005; Laguerre et al., 1996; Palmer и Young, 2000).

а б

Рис.б Электрофоретический анализ продуктов ITS-ПЦР штаммов R. Ieguminosarum bv. trifolii с праймерами a. FGPS1490-72 и Pr.AIaR, б. Pr.Ile_F и ITS R.

С помощью рестрикции полученных продуктов ITS-ПЦР (целого межгенного региона) были выделены 20 ITS-RFLP генотипов рода Rhizobium. Затем, отобрав по одному штамму каждого ITS-RFLP генотипа, было проведено определение нуклеотидных последовательностей их ITS и в совокупности с нуклеотидными последовательностями референсных штаммов из ГенБанка (Kwon et al., 2005), построено филогенетическое дерево (рис.7). Высокий уровень нуклеотидной изменчивости ДНК последовательности ITS региона позволяет различать близкородственные штаммы, однако многокопийность ITS регионов затрудняет интерпретацию филогенетических связей. Так, по данным сравнительного анализа ITS региона геномы некоторых симбионтов клевера, бобов, фасоли и гороха несут в своём составе 2 типа ITS региона. При этом один принадлежит к виду R. leguminosarum (its-L - продукт ITS-ПЦР высокой молекулярной массы), другой - к R. etli (its-S - ITS-ПЦР продукт более низкой молекулярной массы). Вероятно, это указывает на горизонтальный перенос или частые рекомбинационные события, происходящие между ДНК последовательностями различных видов бактерий данного рода (Terefework et al., 1998).

Я leguminosarum bv. vidae 2486 R.leguminosarum bv. vidae 6-8 (its-L} R.loguminosarum bv. viciae K-29 RJeguminosarum bv. viciae 31 (its-L) RJeguminosarum bv. viciae 96-st R. logum inosarum bv. phaseoli ФН-6 (its-L) R. legum inosarum bv. phasooli ФК-0 RJegum Inosarum bv. phaseoli ФН (its-L) RJeguminosarum bv. viciae 245a-st RJeguminosarum bv. trifoiii KK (its-L) R. leguminosarum bv. trlfolii КП012 (its-L) R.iegumfnosarum bv. Urfolii КЛЭ1 (>1a-L) R. legum inosarum bv. viciao У-1 (its-S) RHzobium leguminosarum LMG 14904 T(AF34S271) RJeguminosarum bv. phaseoli б82 RJeguminosarum bv. trifoiii 1326-st R.leguminosarum bv. viciae 2616-st RJeguminosarum bv. viciae 6-9 (its-L) R.legumlnossrum bv. phaseoli 10S R. logum inosarum bv. viciae Б-8 (its-S) R.leguminosarum bv. trifoiii KK (its-S) R.leguminosarum bv. vidae 31 (its-S) Rleguminosarum bv. viciae ®7-«t R. leguminosarum bv. viciae У-7 R.leguminosarum bv. trifoiii КЛ91 (its-S) RJeguminosarum bv. trifoiii КП012 (7fa-SJ R.fegum inosarum bv. viciae 6-9 (it»-S)

RHzobium gall/cum R 602 T done 1 (AF345267) RHzobium gallicum R 602 T clone 2 (AF345266)

Rhizobium mongolense USDA 1844 T(AF345273) RJeguminosarum bv. phaseoli ФН-6 (its-S) RJeguminosarum bv. phaseoli ФА-4 RJeguminosarum bv. phaseoli ФН (its-S) Rhizobium etli LMG 17827 T(AF541974) RHzobium etli CI AT 650 (NC 010994) Rhizobium hainanense USDA 3588 T(AF345269) RHzobium tropid IMG 9503 T(AF345278) RHzobium rediobacter LMG 140 T(AF541973)

RHzobium rHzogenes DSM 30148 T(AF345275) Rhizobium lusttanum P1-7 T(AY943641)

RHzobium undicola LMG 11875 T(AF345280) ■ Rhizobium vit/s LMG 8750 T (AF345279) -- R.giardimi ФС

-RHzobium giardlnil H152 T(AF345268)

RHzobium rubi DSM 6772 T clone 1 (AF345276) RЫгоЫит гиЫ DSM 0772 Г clone 2 (AF345277) RHzobium huautlense LMG 18254 T(AF345270) i Rgalegae 926st

RHzobium galegae LMG 6124 T(AF345265)

Группа штаммов "R. leguminosarum LMG14904T'

Группа штаммов "R. etli LMG 17827 T • R. gallicum R602T - R. mongolense USDA1844T"

J Группа штаммов "R. giardinii H152T" ] Группа штаммов "R. galegae LMG6124T"

Puc.7 Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей ITS бактерий рода Rhizobium с использованием алгоритма NJ. Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований. Исследуемые штаммы относятся к роду, имеющему сокращение "ЙЛ

яаАРЬР анализ и анализ Лш-региона бактерий рода ЯМгоЫит.

С помощью техники яаАН1,Р все штаммы ризобий были достоверно разделены на генетически разнородные группы. При этом наблюдалась чёткое соответствие выделенных групп биоварам бактерий. Удалось установить генетическую неоднородность симбионтов гороха (К. legumwosan^m Ьу. \>к:еае) из Винницкой и Херсонской областей Украины. Вероятно, данная вариабельность связана с определёнными генетическими изменениями в процессе адаптации к различным эколого-географическим зонам и/или растениям-хозяинам. При этом изоляты симбионтов козлятника, принадлежащих по нуклеотидной последовательности гена !6Б рРНК - К. galegae, представляли собой генетически однородную группу штаммов.

Используя методику БаАРЬР, были проанализированы изоляты ризобий -симбионтов гороха. По результатам электрофоретического разделения продуктов реакции был обнаружен общий для выборки локус длинной в 270 п.о. (рис. 8).

< /»'»-регион 270 п.о.

Рис.8 Электрофоретический анализ продуктов заАР!,!', ХтаЯ. Стрелкой указан общий фрагмент (Аш-регион) для всех изолятов Я. 1е%итто$агит Ьу. \iceae.

Были амплифицированы и секвенированы полные нуклеотидные последовательности /¡/«-региона 63 штаммов бактерий рода ЛЫгоЫит и в совокупности с 5 ДНК последовательностями К. ипипояагит и Я. еШ, взятыми в базе данных ЫСВ1 (для полностью секвенированных геномов) было построено филогенетическое дерево (рис.9).

На основании различий в структуре нуклеотидных последовательностей /7/и-региона ЯИЬоЫит эр., выделенные из различных эколого-географических зон Украины, и референсные штаммы были разделены на 8 генотипов, 4 из которых внутри вида К.^ит'тояагит. Причём наибольшее генетическое разнообразие наблюдалось у симбионтов фасоли, в то время как симбионты козлятника, для которых свойственна строгая специфичность по отношению к своему растению-хозяину, представляли собой однородную по данному

маркеру группу. Также стоит отметить, что большинство изученных штаммов относятся к 1/А и В-генотипам (табл.3).

Длина ///«-региона после выравнивания у различных видов составила от 230 п.о. (Я еШ 926-$\) до 655 п.о. (Д. \egumlnosarum Ы/. ркаьеоИ 105). При этом все штаммы, за исключением представителей вида Я. galegae и трёх групп симбионтов фасоли, давали 3 продукта реакции (рис.10).

R. legumlnosarum 1/В(Ь)

R. legumlnosarum (15) - симбионты клевера и бобов

R. ItgitinhiMitrttin In-. viefar У-Г 1. К- ttguiuinatomm tn\ rieeoe R. legamiiwxantm bv. vt'nrmr У-9

R. Irgimiiiiuxinmii trv. viertle 24Sn-xt RJeguminouimm 1н>. гфШ WHMU2S &С_012Х5в) Rtii&bimii tUi CIA T6S2 tfVC 0109*4} "1

Rjnvibimu¡чмхеоп B-962J г i Rhizoblum phaseoll

RUioabium plinuvl/ TOOsi

— R. Ifgum incxarutn bv. tt\foUi 4SM2.HU фе^ОШЩ ■ R- leguiitininanim Irr. pluiwoli It)S "01_| ifgimi/ttOMivm bv. plmuoli 1('ЯЛ* R. hrguminmamm br. pitaxfoU ФИ R. Irgniiiinoxnnun bv. phaxtoü ФК-4 R.tegaminoumim trv. vireae iUt (:\Т_ОШЩ R. IfgnuiiiioxmiUH bv. phaxfoli 10g* R. /egiimiiwumim ln\ pluuroli ФК-6 R. Ifgmninoiutmm bv. plmxtoli ФК-0 . R. ItgnminoMtuiu ln\ viceae *o-if " R. ¡eguwinosaruM bv. vüvot 9'sl

RMzobintH etil CF7442 t (nc оог'61) ^Rhizoblum etil

R. tegimiiHbitrtiui bv. vicenit 2ь 16-я ). R. leguiii/tioxamiu bv. vietae..11 ~L K. Irgniiiiiioxartim trv. vittnt K-29 . R. Itgiiminoxantm bv. ttjfoli/ 1 .{Jb-.it

99"j R. legumlnosarum (20) - симбионты гороха и фасоли - яыюьит pfsi в-942iT j Rh Izoblum pisl - RMvbium xp bv. phateoH ФН-6 ~j Rhizoblum sp.

- к. ginnt/и/i W. piui&oii фс j Rhizoblum glardinll

Rlu'zobimn gntegn* 91.1+1 ~ Rhiwln'Hiii g'tifg'K-Rhiiabium gafrgne 916-tt 3 Rliiwb/'mii goUgtir К• 1Я Rbi&bt'iim gnlrgits 926st Rln'wbiutii ga/tgae K-3

R. legumlnosarum l/B

R. legumlnosarum ll/C

R. legumlnosarum l/A

Rhizoblum galegae

Рис.9 Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей /гш-региона ЯЫюЫит Бр. с использованием алгоритма КГ Масштаб соответствует 5 заменам на 100 пар оснований (генетическим дистанциям). Цифрами в скобках указано количество изученных штаммов.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис.10 Электрофоретический анализ продуктов /ни-регион ПЦР. Дорожки: 1 - Маркер 1 кЬ; Я. \egumir\osarum\ группа А - 2-4, группа Ь - 5, группа В - 6-11, группа С - 12; ЮггюЫит 5р.: группа Р -13; К. giardinii: группа Е -14; Я еШ: группа в -15; Я. galegae: группа Н -16.

Для выровненных секвенированных последовательностей hin-региона R. leguminosarum был построен график, отражающий уровень ДНК-полиморфизма между тремя одноимёнными сайтами рестрикции Avril со смещением 50-нуклеотидного окна с шагом в 1 п.о. (рис.11). Информативность предложенного нами локуса оказалась на два порядка выше, чем гена 16S рРНК и сопоставима по своей разрешающей способности с методом секвенирования ITS.

Лчггг AWU

tftîiA-CSt! (С ТС) »ЯНА-Glu {TTC)

Rl -!! • ' : ' : R2 -1 -.....I

PF PR PR

I on ««« awi «mi

ll)l-.»onuiinr lluilliunl

Рис.11 Уровень полиморфизма /н'л-региона для бактерий вида Я \eguminosarum. По оси X указаны позиции среднего значения 50-нуклеотидного скользящего окна. Л/л-регион (Я) представляет собой суммарную нуклеотидную последовательность из и Яг,

фланкированных праймерами РР и РИ..

Для изучения разнообразия и происхождения бактерий рода ЯИЬоЫит -симбионтов фасоли на внутривидовом уровне и оценке их на перспективность использования в сельскохозяйственной практике нами был применен комплексный анализ как хромосомных (/65 рРНК, 168-235 рРНК, gyrB, Ып-регион), так и симбиотических, плазмидных, маркеров (посЮ и нгДЭ-К). Секвенирование и дальнейшее сравнение нуклеотидных последовательностей /¡/«-региона и гена gyrB, а также заАРЬР-фингерпринтинг показали, что изоляты ризобий из клубеньков фасоли принадлежали к 6 генетически удалённым группам (рис.9): Л. leguminosarum (генотипы 1/А, 1/В, II, III), Я. рИазеоИ (генотип V) и /?. giardinii (генотип IV). Однако у исследованных бактерий отсутствовала корреляция между группированием штаммов по хромосомным (/гш-регион и gyrB) и симбиотическим маркерам (посЮ2 и и/ДЭ-К), что соответствует существующему представлению о том, что филогения поё-генов хорошо коррелирует с систематикой бобовых растений-хозяев, но не с таксономией самих бактерий (иес1а е! а1., 1995; Зиогшпеп е1 а1., 2001).

Таким образом, предложенный нами таксономический маркер обладает существенным преимуществом: является хромосомным, отражает существующие таксономические структуры представленных родов бактерий и присутствует в геноме в единичной копии, а ПЦР Ып-региона является

Таблица 3. Классы /»«-региона и генотипы штаммов ЮйюЫит 5р., выявляемые с помощью Мп-регион ПЦР и 5аАРЬР

Класс А/я-региона* Группа Штаммов в группе Длина Шп-региона, п.о. Количество генотипов ваАРЬР Растение-хозяин

1/А К 1е^тто$агит I 23 270 + 410 10 Горох, фасоль, клевер

1/В 23 320 + 470 7 Клевер, горох, бобы, фасоль

1/Ь 4 320 4 Фасоль

н/с Я 1е%ит\по$агит II 4 470 + 655 4 Фасоль, клевер

ИИЭ ШгоЫит эр. (ФН-6) 1 250 1 Фасоль

1У/Е & %1агсЧпИ (ФС) 1 260 1 Фасоль

УИ/Н Л е(П (СРЖ2) 1 250 + 400 1 Фасоль

У/Б Я рИазеоН 2 370 + 520 2 Фасоль

УШ Л galegae 6 230 1 Козлятник

* Классы Аш-региона выделены на основании различий в структуре нуклеотидной последовательности А/'л-региона КЫюЫит ер.

достоверным диагностическим инструментом для изучения генетического разнообразия популяций бактерий родов ЯЫгоЫит и Хашкотопав, в том числе и на внутривидовом уровне. По результатам проведенного анализа структуры /¡/«-региона были выявлены специфические нуклеотидные замены, в том числе протяжённые вставки и делеции, характерные для отдельных видов, а также групп, выделенных с помощью анализа БаАРЬР. Эти данные позволяют подбирать таксон-специфичные маркеры отдельно на каждую группу штаммов, имеющих общее происхождение.

Сравнивая результаты анализа ДНК-маркеров, мы можем выстроить процесс эволюции для каждой отдельно взятой бактерии, т.е. описать её происхождение (рис.12). А так как изменчивость бактерий по симбиотической и патогенной эффективности в основном определяется генотипом растения-хозяина, то, сопоставляя вместе пути их эволюции, становится возможным прогнозирование наиболее/наименее восприимчивых друг другу пар микро-макросимбионтов.

На рисунке 12 предложена схема не только различных разрешающих способностей генетических методов (табл.4), но и возможной интерпретации полученных результатов в контексте эволюции и бактериального и растительного геномов. Понимание причин и возможных последствий является ключевым моментом во взаимодействии человека с природой.

Таблица 4. Разрешающая способность методов, использованных в данной работе для изучения биоразнообразия бактерий рода ШгкоЫит и ХамИотопаз

Метод Род Вид Биовар/ патовар Группа штаммов

Фенотипические методы

Биохимический анализ + +/- -

Тест на инокуляцию растений-хозяев + +/- +

Генотипические методы

Л/и-регион ПЦР + + - -

ваАРЬР + + +

1ТБ ПЦР-ЛРЬР +/- - -

секвенирование 16Б рРНК ■ + -

секвенирование 168-23Б рРНК (1ТБ) + + +/-

Автор искренне признателен к.б.н. Пуннной Н.В. за научное консультирование, заведующей Лабораторией биологического азота и фосфора Института сельского хозяйства Крыма НААНУ к.с/х.н. Дидович С.В., и всему коллективу Лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН за неоценимую помощь в выполнении работы, а также ООО "Гринвайд" в лице директора Якшина А.И. за финансовую и информационную поддержку.

Диагностические маркеры бактерий

165 рРМК

1500 п.о.

МУЗА

-9 -Щ

<75%

*

.....*

<99%

Ит-регион ПЦР

130-350 п.о.

заАР1.Р

ф II ф III к IV

; фингерпринт

♦ ♦

группы штзмнов

тд 2

классы Ит-региона

Разрешающая способность

Рис.12 Разрешающая способность диагностических маркеров бактерий.

выводы

1. Разработаны маркерные ПЦР-системы на хромосомный Л/л-регион, специфичные для клубеньковых бактерий рода Rhizobium и фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, позволяющие изучить их на уровне вида - группы штаммов (подана заявка на патент per. № 2011135461 от 25.08.2011 и 09.01.2013 получено положительное решение о выдаче).

2. Разработан новый подход (saAFLP и Аш-регион ПЦР) к изучению генетического разнообразия фитопатогенных и симбиотических бактерий на внутривидовом уровне, который превосходит аналоги по разрешающей способности.

3. Показана эффективность разработанных техник ПЦР-фингерпринтинга при оценке биоразнообразия природных популяций азотфиксирующих бактерий рода Rhizobium, симбионтов культурных бобовых растений, а также выявлены группы штаммов R. leguminosarum, которые невозможно было разделить ранее существующими методами, что коррелировало с эволюционной близостью бактерий.

4. Показана эффективность разработанных техник ПЦР-фингерпринтинга при оценке биоразнообразия штаммов рода Xanthomonas на внутривидовом уровне, а также установлено, что рапс (Brassica napus) в России поражается штаммами ксантомонад, относящимися к видам X. campestris, X. arboricola и X. gardneri.

5. Создана представительная база данных, включающая совокупность биохимических и уникальных генетических признаков для фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas sp. и симбиотических - рода Rhizobium sp. (http://hin-proiect.coni/).

ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ:

1. Пунина Н.В., Зотов B.C., Пархоменко А.Л., Пархоменко Т.Ю., Топунов А.Ф. Изучение генетического разнообразия Bacillus thuringiensis, выделенных в различных эколого-географических зонах Украины, при помощи анализа генов 16S рРНК, gyrh и методов АР-ПЦР и saAFLP. // Acta Naturae. 2013. T. 5, № 1(16), С. 93-103. (1,38 п. л.), (авторских - 25%).

2. Зотов B.C., Пунина Н.В., Хапчаева С.А., Дидович C.B., Мельничук Т.Н., Топунов А.Ф. Новый таксономический маркер клубеньковых бактерий рода Rhizobium и его эволюция. // Экологическая генетика. СПб. 2012. Т.10, №2. С.50-63. (1,75 п. л.), (авторских - 80%).

3. Карлов А.Н., Зотов B.C., Пехтерева Е.Ш., Матвеева Е.В., Джалилов Ф.С., Фесенко И.А., Карлов Г.И., Игнатов А.Н. Dickeya dianthicola — новый для России бактериальный патоген картофеля. // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2010. № 3. С. 134-141. (1 п. л.), (авторских - 25%).

4. Пунина Н.В., Зотов B.C., Кузнецов Б.Б., Игнатов А.Н. Оценка генетического разнообразия межгенного транскрибируемого региона 16S-23S рРНК, гена gyrB и разработка ПЦР диагностики фитопатогенных ксантомонад. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». 2008. № 2. С. 3-17. (0,94 п. л.), (авторских - 20%).

5. Зотов B.C., Пунина Н.В., Игнатов А.Н., Матвеева, Шаад Н.В. Применение ассиметричных олигонуклеотидов для сравнения геномов фитопатогенных бактерий Xanthomonas. II Вычислительная филогенетика и геносистематика "ВФГС 2007". 16-19 ноября 2007. Москва. МГУ, с. 93-98. (0.37 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

6. Пунина Н.В., Игнатов А.Н., Зотов B.C., Матвеева Е.В., Шаад Н.В. Генетическое разнообразие фитопатогенных бактерий Xanthomomas campestris. II Вычислительная филогенетика и геносистематика "ВФГС 2007". 16-19 ноября 2007. Москва. МГУ, с. 260-266. (0.44 п. л.), (авторских - 25%).

7. Матвеева Е.В., Цыганкова C.B., Пехтерева Э.Ш., Политыко В.А., Корнев К.П., Зотов B.C., Пунина Н.В., Игнатов А.Н. Фенотипическое и генетическое разнообразие российской популяции Erwinia carotovora. II 50 лет на страже продовольственной безопасности страны. Юбилейный сборник трудов ВНИИ фитопатологии. 2008. ISBN 978-5-9901423-1-2, с. 197-210. (0.87 п. л.), (авторских - 25%).

8. Zotov V., Punina N., Topunov A., Didovich S., Khapchaeva S., Melnichuk T. Genetic diversity of Rhizobium sp. in Russian Federation and Ukraine // 10-th European Nitrogen Fixation Conference. Munich, Germany. 02-05.09.2012. 2012. PP 3-36. (0.1 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

9. Зотов B.C. Новый экспресс-метод идентификации симбиотических и фитопатогенных микроорганизмов и выявление специфичности их взаимодействия с растениями. // Школа-конференция молодых учёных "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2011". Москва, 2011. с. 31-33. (0.19 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

10. Zotov V.S., Punina N.V., Ignatov A.N., Matveeva E.V., Topunov A.F., Schaad N.W. Elaboration and use of new approach to species and strain identification of phytopatological and nitrogen-fixing bacteria. // "Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology" Mikkeli, Finland. July 12-17, 2010. Program and Abstracts. P. 87. (0.1 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

11. Zotov V.S., Ignatov A.N., Matveeva E.V., Schaad N.W. Genome sequence-based estimation of significance and errors for AFLP and AP-PCR analysis in intra-and inter-species comparison. // NOVA PhD course "Understanding plant-pathogen interactions in the post genomics era". Hyytiala, Finland. 2008. 4-11 мая 2008. (0.1 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

12. Зотов B.C., Корнев К.П., Пунина Н.В., Мазурин Е.С., Джалилов Ф.С., Матвеева Е.В., Игнатов А.Н. Сравнение методов PFGE и sAFLP для видовой диагностики фитопатогенных и промышленных штаммов ксантомонад. // 8-ая молодежная научная конференция "Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии". Москва. Россия. 2 апреля 2008 г. (0.12 п. л.), (доля личного участия не разделяется).

13. Зотов B.C., Пунина Н.В., Топунов А.Ф. Способ идентификации и дифференциации прокариотических организмов. Заявка на патент. Per. № 2011135461 от 25.08.2011. Получено положительное решение о выдаче от 09.01.13. (1.38 п. л.), (авторских - 70%).

Подписано в печать:

20.05.2013

Заказ № 8527 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зотов, Василий Сергеевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н.Баха РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

04201359228

Зотов Василий Сергеевич

БИОРАЗНООБРАЗИЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ ЯННОВШМ И ХАЫТНОМОЫАБ И СОЗДАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ДИАГНОСТИКИ

(специальность 03.01.04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Топунов А.Ф.

МОСКВА, 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ - 5

ВВЕДЕНИЕ - 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Азотфиксирующие клубеньковые бактерии рода Rhizobium - 9

1.1. Структура ризобиального генома: хромосома и плазмиды. Генетические рекомбинации - 9

1.2. Понятие "Вида" для ризобий -12

1.3. Таксономия Ризобий -13

1.4. Генетическое разнообразие, основанное на "аксессорных" симбиотических генах:

1.4.1. Гены фиксации азота (иг/и fix) -15

1.4.2. Гены клубенькообразования - 16

1.5. Филогенетические и биогеографические заключения, основанные на анализе ядерных и акцессорных генов -19

1.6. Идентификация природных популяций ризобий - 20

1.7. Экологическая значимость несимбиотических штаммов Rhizobium - 21

1.8. Разнообразие популяций: - 22

1.8.1. Ризобии клевера (Trifolium spp.) - 23

1.8.2. Ризобии ГНИ гороха (Pisum), бобов (Vicia), чечевицы (Lens) и чины (Lathyrus) - 25

1.8.3. Ризобии фасоли (Phaseolus spp.) - 28

1.8.4. Ризобии козлятника (Galega spp.) - 33 Глава 2. Фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas - 35

2.1. Бактерии рода Xanthomonas - 3 5

2.2.Полифазная таксономия бактерий рот.Xanthomonas - 41

2.3. Разнообразие внутри рода Xanthomonas на уровне генома и патовариантов - 45

2.4. Использование ДНК фингерпринтинга для оценки геномного разнообразия ксантомонад - 47

Глава 3. Методические подходы к идентификации и оценки генетического

разнообразия бактерий - 49

3.1. От групп перекрестной инокуляции к полифазной таксономии - 49

3.2. Фенотипические методы: - 50

3.2.1.Тесты на восприимчивость растений к патогенным и симбиотическим бактериям - 50

3.2.2. Культуральные, физиологические и биохимические признаки - 51

3.2.3. Мультилокусный электрофорез ферментов (MLEE) - 54

3.2.4. SDS-полиакриламидный гель электрофорез клеточных белков (SDS-PAGE) - 57

3.2.5. Серологические признаки - 57

3.3. Генотипические методы диагностики: - 58

3.3.1. ДНК-ДНК гибридизация нуклеиновых кислот - 58

3.3.2. Анализ плазмидного состава - 59

3.3.3. Рестрикционный анализ бактериальных геномов (RFLP и PCR-RFLP) - 62

3.3.4. Техники ДНК-фингерпринтинга: гер-ПЦР, Eric-ПЦР, Вох-ПЦР, RAPD, ISSR, ПЦР со специфическими праймерами, Insertion Sequences (IS-ПЦР), tRNA-ILP - 66

3.3.5. Мультилокусный анализ белок-кодирующих генов (MLSA) - 74

3.3.6. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена 16S рРНК и межгенного региона рибосомального кластера 16S-23S рРНК (ITS). Риботипирование. - 76

3.3.7. Биоинформационный анализ данных (программное обеспечение и интернет-ресурсы) - 80 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Материалы и методы исследования - 83

4.1. Объекты исследования: фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas и симбиотические бактерии рода Rhizobium - 83

4.2. Выделение и хранение чистых культур клубеньковых бактерий - 86

4.3. Проверка тестовых растений на восприимчивость к взаимодействию

с клубеньковыми бактериями - 89

4.4. Оценка конкурентоспособности штаммов клубеньковых бактерий - 89

4.5. Определение азотфиксирующей активности клубеньковых бактерий на интактных клубеньках - 91

4.6. Изучение физиолого-биохимических свойств изолятов ризобий - 93

4.7. Генетический анализ: - 93 4.7.1 Выделение бактериальной геномной ДНК - 93

4.7.2. Анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, gyrB, nodD, межгенных симбиотического ni/D-K региона и хромосомного Лш-региона - 93

4.7.3. Анализ нуклеотидных последовательностей межгенного региона 16-23S рРНК (ITS) при помощи техник RFLP и прямого секвенирования ПЦР-продуктов - 94

4.7.4. In-silico анализ генетического разнообразия бактерий с помощью метода RFLP - 94

4.7.5. Анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов (AFLP) - 95

4.7.6. Single adapter AFLP с использованием одной из редкощепящих эндонуклеаз ХЬаУХтаП - 102

4.7.7. Ферментативная очистка фрагментов ДНК перед секвенированием - 103

4.8. Биоинформационный анализ данных - 103

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Оценка генетического разнообразия бактерий рода Xanthomonas - 104

5.1. Анализ saAFLP - новый подход к изучению генетического разнообразия симбиотических и фитопатогенных бактерий на внутривидовом уровне - 106

5.2. hin-регион - новый таксономический маркер для идентификации и диагностики фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas - 107

5.3. Структура и генетическое разнообразие hin-региона у бактерий рода Xanthomonas, поражающих рапс и горчицу в России - 110

5.4. In-silico анализ нуклеотидного полиморфизма /»'«-региона ксантомонад - 112 Глава 6. Оценка разнообразия природных популяций бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины -114

6.1. Культурально-морфологические и физиолого-биохимические свойства изолятов клубеньковых бактерий - 114

6.2. Тесты на восприимчивость бобовых растений к изолятам клубеньковых бактерий -115

6.3. Установление родового и видового статуса изолятов путём анализа нуклеотидного полиморфизма гена 16S рРНК - 119

6.4. Оценка генетического разнообразия ризобий на внутривидовом уровне:

6.4.1. Анализ нуклеотидного полиморфизма межгенного региона 16-23S рРНК (ITS) -119

6.4.2. ДНК-фингерпринтинг saAFLP (ХтаЛ) - 122

6.4.3. hin-регион - новый таксономический маркер для идентификации и диагностики симбиотических бактерий рода Rhizobium - 124

6.4.4. Структура и генетическое разнообразие /гш-региона у бактерий рода Rhizobium -125

6.5. Экспресс-метод оценки эффективности симбиотической системы <(Phaseolus vulgaris - Rhizobium sp. bv. phaseoli» - 131

6.5.1. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена gyrB - 133

6.5.2. Анализ нуклеотидного полиморфизма гена nod - 134

6.5.3. Анализ нуклеотидного полиморфизма межгенного региона nijD-K - 134

6.6. Генетическое разнообразие природных популяций клубеньковых бактерий рода Rhizobium, как основа высокоэффективных симбиозов для современной агробиотехнологии -135

ЗАКЛЮЧЕНИЕ - 137

ВЫВОДЫ -139

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - 141

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ ЕТ (electrophoretic type) - электрофоретический тип

ITS (internal transcribed spacer) — межгенный регион рибосомального кластера,

расположенный между генами 16S и 23S рРНК;

IS (insertion sequence) - инсерционная последовательность

saAFLP - single adapter Amplified-Fragment Length Polymorphism Analysis;

gyrQ - DNA gyrase subunit В

atpD - F0F1 ATP synthase subunit beta

recA - recombinase A

rpoB - DNA-directed RNA polymerase subunit beta glnll - glutamine synthetase II

dnaK - chaperone protein DnaK (heat shock protein 70) git A - type II citrate synthase

rpoA - DNA-directed RNA polymerase subunit alpha glnA - glutamine synthetase thrC - threonine synthase

FAME (fatty acids methyl esters) - метиловые эфиры жирных кислот

ГПИ - группа перекрёстной инокуляции

ГПГ - горизонтальный перенос генов

Mb (Mega base) - миллион пар оснований

SDS - додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изучение взаимодействий между растениями и микроорганизмами - одно из активно развивающихся направлений современных биологических наук. Эти взаимодействия играют важную роль в жизни растений, их питании, защите от патогенов и вредителей, а также адаптации к стрессам и регуляции развития.

В данной работе были изучены бактерии двух родов, отличающихся по типу питания и сельскохозяйственной важности: симбиотические бактерии рода Rhizobium и фитопатогенные бактерии рода Xanthomonas.

Семейство Бобовые (Fabaceae) включает в себя более 19000 описанных видов растений, которые, как правило, способны вступать в симбиотические взаимоотношения с азотфиксирующими бактериями с образованием клубеньков на корнях. Одними из представителей бактерий-симбионтов ценных сельскохозяйственных культур, таких как горох, чечевица, бобы, клевер, фасоль, козлятник являются бактерии рода Rhizobium.

Необходимость изучения таксономической структуры и биоразнообразия данного рода связана с тем, что знание их генетической структуры и полиморфизма сортовых линий растений, позволяет выявить динамику эволюционной изменчивости, и тем самым, спрогнозировать наиболее адаптированные друг к другу пары микро-макросимбионтов. Такая координированная селекция позволит создавать комбинации симбионт-растение с более эффективным процессом азотфиксации для полноценного развития и формирования высокого урожая. Бактерии рода Xanthomonas поражают более 400 видов растений, что приводит к серьезным экономическим потерям. Род Xanthomonas включает более 27 видов, обладающих сходными физиологическими и генетическими признаками. Недостатком их диагностики, применяемой в настоящее время, является тестирование штаммов на одном таксономическом уровне, и только известной группы бактерий.

Вследствие частых межвидовых рекомбинаций между различными аллелями таксономически важных генов (dnaK, nod, hrp) или их консервативности {16S рРНК, 23S рРНК), не всегда удается адекватно классифицировать изоляты ризобий и ксантомонад, что приводит к необходимости получения дополнительных генетических данных. Диагностика и идентификация фитопатогенных и симбиотических бактерий затруднена также присутствием на растении эпифитов родственных видов, со сходными физиологическими и генетическими признаками.

Таким образом, становится необходимой разработка быстрого и надёжного метода молекулярно-генетического анализа данных родов бактерий, как основы для фундаментально прикладных исследований, направленных на защиту и повышение урожая сельскохозяйственных культур.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение разнообразия природных популяций бактерий родов Rhizobium и Xanthomonas с помощью самостоятельно разработанной единой маркерной системы бактериальной идентификации и диагностики. Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

• Разработка уникальных маркеров для фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и симбиотических бактерий рода Rhizobium на основе данных ПЦР-фингерпринтинга.

• Разработка новых техник ПЦР-фингерпринтинга бактерий на внутривидовом уровне, отвечающие требованиям достоверности, воспроизводимости и информативности, а также простоты исполнения.

• Проведение биохимического и молекулярно-генетического анализа изолятов и штаммов коллекции азотфиксирующих бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины.

• Оценка генетического разнообразия ксантомонад, поражающих рапс {Brassica napus) в России, с помощью новой разработанной техники ПЦР-фингерпринтинга.

• Формирование единой базы данных, включающей совокупность биохимических и уникальных генетических признаков исследуемых бактерий.

Научная новизна работы.

Впервые обнаружен специфичный для различных родов бактерий Л/я-регион (заявка на патент per. № 2011135461 от 25.08.2011. Получено положительное решение о выдаче от 09.01.13.), позволяющий изучать биоразнообразие бактерий на внутривидовом уровне. На его основе разработаны специфические для клубеньковых бактерий родов Rhizobium и Хаи/йо/иолоТмар^ ________

Предложен новый подход к изучению генетического разнообразия фитопатогенных и симбиотических бактерий на внутривидовом уровне с помощью разработанных техник hin-регион ПЦР и saAFLP (single adapter AFLP).

Впервые изучена природная популяция клубеньковых бактерий рода Rhizobium из различных эколого-географических зон Украины с помощью методов молекулярно-генетического анализа, включая техники й/л-регион ПЦР и saAFLP.

Впервые с помощью разработанных техник изучено генетическое разнообразие ксантомонад, в том числе поражающих рапс (Brassica napus) в России.

Создана библиотека обобщённых биохимических и уникальных генетических данных для представительной коллекции фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и для азотфиксирующих бактерий рода Rhizobium (http://hin-proiect.comA.

Практическая значимость.

Установлено, что saAFLP-фингерпринтинг и секвенирование последовательностей ДНК Л/л-регионов обладают большой разрешающей способностью на внутривидовом уровне. Данные техники могут быть использованы для:

- паспортизации ценных штаммов полезных бактерий;

- мониторинга экологической обстановки и динамики развития почвенных сообществ микроорганизмов;

- идентификации, диагностики и изучения генетического разнообразия широкого круга не только бактерий, но и растений.

Предложенные техники и обобщённая база биохимических и генетических данных являются весьма полезным инструментарием для сопоставления результатов, получаемых в различных лабораториях.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференции "Вычислительная филогенетика и геносистематика" (Москва, 2007), на международных конференциях NOVA PhD курс "Понимание взаимодействий растение-патоген в постгеномную эру" (Hyytiala, Финляндия, 2008) и "Адаптация к изменению климата в Балтийском регионе: вклад растительной и микробной биотехнологии" (Миккели, Финляндия, 2010), на школах молодых учёных "Молекулярные методы в микробиологии. Практическое введение" (Симферополь, Украина, 2010) и "Основы практической молекулярной экологии микроорганизмов" (Симферополь, Украина, 2011), на школе-конференции молодых учёных "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2011" (Москва, 2011 )~ "на ~Ю-ой~ Европейской конференции по-азотфикса_ции (Мюнхен, Германия, 2012), а также на международной школе-конференции молодых ученых «Растительно-микробные группировки: молекулярные основы адаптивного потенциала» (Алушта, Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, включённых в список, рекомендованный ВАК РФ.

Объем и структура работы. Диссертация включает введение, 4 главы, состоящих из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 180 страницах текста, иллюстрирована 37 рисунками, включает 12 таблиц. Список литературы состоит из 498 источников, из них 477 - зарубежных авторов. Работа выполнена в Лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Азотфиксирующие клубеньковые бактерии рода Rhizobium 1.1. Структура ризобиального генома: хромосома и плазмиды. Генетические рекомбинации

Ризобиальный геном (5-8*106 п.о.) представляет собой совокупность физически разделённых кольцевой хромосомы, меньшей по размеру мегаплазмиды (например, Sym-плазмиды) и других плазмид (Martinez et al., 1990). Число, размер плазмид и их композиция отличаются между видами и могут также отличаться у изолятов одного вида (Young et al., 2006).

Дочерние клетки, однако, не всегда идентичны материнским. Различные штаммы одного бактериального вида возникают благодаря событиям горизонтального переноса генов (ГПГ), при которых перенос генетического материала осуществляется между клетками, не являющимися потомками. У прокариот ГПГ акцессорных геномов обусловлен тремя механизмами:

i) трансформация, в которой генетический материал в форме ДНК или РНК внедряется, захватывается и экспрессируются в чужеродной клетке;

ii) трансдукция, в которой бактериальная ДНК перемещается от одной бактерии к другой посредством бактериофага;

iii) конъюгация, в которой перенос генетического материала осуществляется при непосредственном контакте двух бактериальных клеток (Levin, Bergstrom, 2000). После того, как хромосомный сегмент донора встраивается в клетку реципиент, в ней могут произойти рекомбинационные события^ Изменения в—геноме—затем—становятся наследуемыми.

IS элементы являются мобильными генетическими элементами, часто присутствующими в геномах. В ризобиях они составляют часть либо ядерного, либо акцессорного генных пулов и обычно фланкируют кластеры генов (также симбиотические компартменты). Благодаря своей мобильности IS элементы способствуют генетической диверсификации посредством таких процессов, как геномные перестановки, рекомбинации и транспозиции (Freiberg et al., 1997; Martinez et. al., 1990).

Одна из больших загадок рекомбинационных систем агробактерий и быстрорастущих ризобий состоит в том, что большое количество повторов ДНК не вызывает интенсивных перестроек генома. С момента выявления множественных повторов ДНК (Flores et al., 1987) и до настоящего времени показано, что некоторые гены являются многократно повторёнными как на плазмидах, так и на хромосоме. У Bradyrhizobium japonicum выявлены множественные копии некоторых генов (groESL,

9

rpoN; Kunding et al., 1993), однако в целом у этих бактерий уровень повторяемости генов намного ниже. Можно предположить, что: (1) рекомбинация происходит постоянно, однако против неё действует отбор, повышающий стабильность генома; (2) системы рекомбинации малоэффективны. Имеются данные в пользу амплификаций и делеций определённых сегментов генома R.etli (Romero et al., 1995), происходящего посредством систем гесА. Ситуация может быть подобна той, которая характерна для некоторых энтеробактерий, у которых возможна рекомбинация между различными копиями оперона ггп (один из немногих повторяющихся локусов у Salmonella и Escherichia), однако жизнеспособны лишь немногие возникающие геномные конфигурации, которые оказ