Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Продукция индолил-3-уксусной кислоты и её генетический контроль у различных групп бактерий

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Продукция индолил-3-уксусной кислоты и её генетический контроль у различных групп бактерий"

/

13 б

1993

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ и цитологии

УДК 579.632.35

ХОЛМЕЦКАЯ Майя Овсеевна

ПРОДУКЦИЯ ИЩОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ У РАЗЛИЧНЫХ ГРУПП БАКТЕРИЙ

03.00.15 - Генэтлкг 03.00.07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1998

Работа выполнена в лаборатории генетики и цитологии НАН Беларуси

молекулярной генетики Института

Научные руководители

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, додент Е. В. Лобанок; доктор биологических наук, профессор Л. С. Чернин;

доктор биологических наук, профессор В.А. Прокулевич; кандидат биологических наук А.Н. Перебитюк

Оппонирующая организация - Белорусский государственный

Университет

Защита диссертации состоится £ ¡у^а заседании совета

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук Д 01.31.01 в Институте генетики и цитологии АН РБ по адресу: 220072, г. Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я. Коласа

Автореферат разослал " " .¿/СУЯ-_1998 года

Ученый секретарь совета по защите диссертаций • —

кандидат биологических наук у/ Л.А.Тарутина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Почвенные, ризосферные и эпифнтные бактерии - широко распространенная и важная в научном и практическом отношении группа микроорганизмов, способная оказывать как положительное, так и отрицательное влияние на развитие сельскохозяйственных культур. Некоторые виды этих бактерий являются фитопатогенными, другие же оказывают стимулирующее действие на развитие растений. Предполагается, что патогенность и стимуляция роста растений могут быть обеспечены за счет прямого действия фитогормонов, секретируемых данной группой микроорганизмов.

Актуальность изучения этих проблем определяется ролью фитогормонов в индукции развития бактериального рака и других патологических новообразований у растений, а также в установлении симбиотических взаимоотношений в системе бактерия-растение. Изучение бактериальных генов синтеза фитогормонов в сравнительно-эволюционном аспекте открывает возможность для более глубокого понимания механизмов сложившихся взаимодействий микроорганизмов с растениями. Выяснение биологического смысла этого явления представляет значительный интерес для фундаментальных исследований, направленных на вскрытие эволюционных связей генов фитогормонов растительного и микробного происхождения. Вместе с тем, выявление микробов-продуцентов фитогормонов расширяет возможности создания искусственных биоценозов, обеспечивающих повышение продуктивности экономически значимых сельскохозяйственных культур.

Отдельной проблемой является поиск новых, эффективных путей борьбы с онкозаболеваниями сельскохозяйственных культур, инфицируемых ИУК-синтезирующими фитопатогенами. Эта проблема остается до настоящего времени нерешенной. В этой связи особое внимание привлекают плазмиды, которые при введении в клетки некоторых фитопатогенов подавляют их онкогенность. Использование такого рода взаимодействий может оказаться перспективным для защиты растений от бактериального рака и других патологических гиперплазии растительных тканей.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнялась в рамках научно-исследовательских тем:

«Изучение структурно-функциональной организации генома растений и его модификации при воздействии чужеродного генетического материала», 1986-1990 г.г., № гос. регистрации 01860021738, программа 04 «Сельское хозяйство»;

«Изучение молекулярной структуры геномов зерновых культур на основе молекулярно-генетических маркеров; разработка систем конструи-

рования трансгенных растений», 1990-1994 г.г., № гос. регистрации 1995149, программа 01 «Продуктивность растений»;

«Молекулярно-генетическое изучение организации экспрессии геномов сельскохозяйственных культур с помощью ДНК-зондов и генетической трансформации», 1995-1999, № гос. регистрации 1995858, программа 01 «Биопродуктивность растений».

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение способности продуцировать природный ауксин, индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) различными почвенными, ризосферными и эпи-фитными бактериями, включая фитопатогенные и непатогенные формы; установление возможных корреляций между способностью синтезировать ИУК и другими свойствами исследуемых микроорганизмов; изучение путей и генетических детерминантов синтеза ИУК.

В соответствии со сформулированной целью решались следующие экспериментальные задачи:

- скрининг штаммов почвенных, ризосферных и эпифитных (фитопатогенных, сапрофитных и симбиотических) бактерий на продукцию ИУК;

- количественная оценка продукции ИУК у отобранных в результате скрининга штаммов;

- выявление корреляции между способностью бактерий синтезировать ИУК, их видовой принадлежностью и фитопатогенностью;

- изучение влияния плазмиды R388 из группы несовместимости Inc W на синтез ИУК у некоторых бактерий;

- изучение путей биосинтеза ИУК через ИАМ с использованием в качестве ДНК-зондов клонированных генов синтеза ИУК из Т-ДНК Ti -плазмид Agrobacterium tumefaciens, и определением активности фермента оксидазы, участвующего в обходном пути образования ИУК;

- идентификация плазмид у бактерий, продуцирующих ИУК, с целью первичного определения локализации генов синтеза ИУК.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования являлись фитопатогенные и непатогенные почвенные, ризосферные и эпифитные бактерии родов Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Corynebacterium, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum и Rhizobium и группы неидентифициро-ванных бактерий семейства Rhizobiacea.

Предмет исследования - способность перечисленных выше микроорганизмов синтезировать фитогормон ИУК; генетические детерминанты и биохимические пути синтеза ИУК у бактерий-продуцентов; корреляции между способностью синтезировать индолил-3-уксусную кислоту и другими свойствами исследуемых микроорганизмов.

Методология и методы проведенного исследования. Для определения продукции ИУК в работе использовались методы качественного ана-

лиза в модификации Тэннера, Андерсена (Тшшег & Anderson, 1964), и количественного анализа по Гордону и Веберу (Gordon & Weber, 1951).

Определение пектатлиазной активности бактерий проводилось методом Logan (1963).

Определение активности фермента TSO проводили методом Oberhansíi et al., (1991).

Для выделения, анализа и трансформации тотальной и плазмидной ДНК использовали методы Мида (Meade et al., 1982), Бирнбойма к Доли (Birnboim, Doly, 1979), Краева (1990), Манделл и Хига (Mandel & Higa, 3970). При изучении пути биосинтеза ИУК через НАМ использовали по-лимеразную цепную реакцию (ПЦР), ДНК-ДНК гибридизации согласно Sambrook et al,, (1989) и тонкослойную хроматографию (Harirnann et ai., 1983). Для анализа бактерий на присутствие плазмид использовали метод Экхарда (Eckhard, 1978).

Научная новизна полученных результатов.

1. Впервые систематически на предмет синтеза индолил-3-уксусной кислоты исследована большая коллекция почвенных, ризосферных и эпи-фитных бактерий, как фитопатогенных так сапрофитных и симбиотиче-ских, включающая 1318 штаммов, относящихся к восьми родам и группе бактерий семейства Rhizobeaceae. Показано, что ИУК-продуцирующая способность является свойством, присущим широкому ряду бактерий, независимо от их таксономической принадлежности и характера взаимодействия с растениями.

2. Сконструирована плазмида pTV15, содержащая фрагмент гена tins-1 Agrobacterium tumefaciens (iaaM), пригодная для массового тестирования бактерий на наличие нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену iaaM, кодирующему первый фермент превращения триптофана в индолил-З-уксусную кислоту - индолил-3-монооксигеназу.

3. Для штаммов бактерий видов Pseudomonas cichorii, P. saccharophila, Xanthomonas campestris pv vesicatoria, X. campestris pv malvacearum, X. campestris pv translucens, Erwinia carotovora pv carotovora, Corynebacterium michiganense, C. insidiosum, C. sepedonicum, показано, что одним из путей биосинтеза индолил-3-уксусной кислоты является путь через индолил-З-ацетамид.

4. Выявлена корреляция между фигопатогенностью исследованных бактерий и их способностью использовать индолил-3-ацетамид в качестве предшественника ИУК.

5. Впервые для некоторых псевдомонад обнаружено свойство су-прессировать продукцию ИУК плазмидой R388.

Практическая значимость полученных результатов. Предложенные в работе методы выявления бактерий с высокой продукцией ИУК могут найти широкое практическое использование в решении задачи стиму-

ляции роста растений, поскольку микробные фитогормоны имеют ряд преимуществ перед химическими регуляторами роста: они быстро связываются и используются растительной клеткой и являются препаратами мягкого действия. С этой точки зрения промышленное использование штаммов-продуцентов фитогормона является весьма перспективным.

В целом, полученные в работе результаты создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований, направленных на выяснение общих закономерностей структурно-функциональной организации генетических систем, контролирующих синтез фитогормона индолил-3-уксусной кислоты. Эти результаты могут быть также использованы для конструирования новых штаммов с заданными свойствами с целью изучения взаимодействия микроорганизмов и растений.

Изучение взаимоотношений микроорганизмов с растениями может способствовать разработке биологических методов борьбы с болезнями растений: а) получение конкуректноспособных непатогенных штаммов из фитопатогенных; б) использование штаммов, гиперпродуцентов фитогормона, в смеси с бактериальными препаратами, обладающими антипатогенным действием.

Дериваты А%гоЬасЫпит 1ите/аает, несущие антионкогенную плаз-миду Ю88, могут быть использованы в качестве потенциального средства для биологической защиты некоторых двудольный растений от бактериального рака.

Изучение генетических детерминант синтеза фитогормонов открывает дополнительные перспективы для получения бактерий, суперпродуцентов этих соединений. При этом выявление биохимического пути биосинтеза ИУК тем или иным микроорганизмом и выяснение взаимосвязи между способом образования этого фитогормона и типом взаимодействия микроорганизмов с растениями создает возможности для направленного использования положительных воздействий микроорганизмов на растения (таких как стимуляция роста и повышение продуктивности) и вместе с тем позволяет разрабатывать принципиально новые подходы для защиты растений от фитопатогенов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- свойство продуцировать фитогормон ИУК широко распространено среди бактерий как фитопатогенных, так и непатогенных, как близкородственных, так и филогенетически далеко отстоящих друг от друга;

- существует корреляция между способностью продуцировать ИУК бактериями и их таксономической принадлежностью, и отсутствует взаимосвязь между фитопатогенностью бактерий и способностью продуцировать фитогормон;

- у большинства исследованных фитопатогенных бактерий путь биосинтеза ИУК происходит через интермедиат индолил-3-ацетамид и детер-

минируется генами с преимущественной локализацией в составе хромосомы;

- введение плазмиды R388 из группы несовместимости Inc W в бактерии Pseudomonas, отличающиеся высоким уровнем синтеза ИУК, су-прессирует функцию генов, контролирующих биосинтез ИУК.

Личный вклад соискателя. Основные результаты диссертации получены непосредственно соискателем в лаборатории молекулярной генетики Института генетики и цитологии HAH Беларуси.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы докладывались на YI и YII съездах Белорусского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Минск, 1992 и 1997); Всесоюзной конференции молодых ученых (Уфа, 1992); Республиканских конференциях «Генетическая инженерия и биотехнология» (Минск, 1994); «Современные проблемы генетики и селекции» (Минск, 1995); Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998).

Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе три статьи с общим количеством страниц -18.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (4 раздела), описания материалов и методов исследования (2 раздела), изложения результатов и их обсуждения (6 разделов), заключения, списка цитируемой литературы (183 источника) и приложения. Работа изложена на 116 страницах, содержит 12 рисунков и 18 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы, бактерии и плазмиды. В работе использованы 1327 штаммов родов Pseudomonas (11 видов, 670 штаммов); Xanthomonas (4 вида, 189 штаммов); Erwinia (9 видов, 295 штаммов); Corynebacterium (5 видов, 51 штамм); Bacillus (3 вида, 19 штаммов); Enterobacter (2 вида, 8 штаммов); Azospirillum brasilense (3 штамма); Rhizobiam leguminosarum (3 штамма); Agrobacterium tumefaciens (2 штамма); 84 штамма бактерий семейства Rhi-zobiaceae-, Esherichia coli (3 штамма) и плазмида pBluescript II KS из Института микробиологии и вирусологии (г. Киев); кафедры микробиологии Бел-госуниверситета, (г. Минск); Института сельхозбиотехнологии РАСХНИЛ, (г. Москва); Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино-на-Оке); ВНИИ генетики, (г. Москва) и ИГЦ АН РБ.

Среды и основные буферные растворы. Бактерии выращивали на полноценных и минимальных средах при оптимальных для каждого микроорганизма условиях (Carhart & Hegeman, 1975; Маниатис и др., 1984; Kado et al., 1972; King et al., 1954; Albrecht & Okon, 1980; Гловер, 1988; Langley & Kado, 1972).

Реактив Сальковского готовили согласно Гордону и Веберу (Gordon & Weber, 1951).

Реактивы. В работе использовали бакто-агар, бакто-триптон и дрожжевой экстракт фирмы "Difco" (США); бромистый этидий, X-gal, ИПТГ, проназу Е фирмы "Serva" (Германия); ЭДТА, Трис-ОН, ДДС-Na фирмы "Bio-Rad" (США).

Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-модифширующие ферменты фирм "New England Biolabs" (США), "GibcoBRL" (США), "Ainersham" (Великобритания), "USB" (США) и "Promega" (США).

Определение продукции И УК. Содержание ИУК в культуральной жидкости и в экстрактах штаммов исследуемых бактерий определяли по методу Тэннера и Андерсона (Tanner & Anderson, 1964)

Количественную оценку ИУК проводили колориметрическим методом согласно Гордону и Веберу (Gordon & Weber, 1951).

Выявление пектатлиазной активности бактерий рода Rrwinia проводили по Logan (1963).

Определение активности фермента TSO в чашечном тесте проводили по Oberhansli et al. (1991).

Коньюгационный перенос плазмиды R388, Для переноса плазмид использовали капельный метод Sistrom (1977).

Для выделения, анализа и трансформации тотальной и плазмидной ДНК использовали методы Мида (Meade et al, 1982), Бирнбойма и Доли (Bimboim, Doly, 1979), Kpacfta (1900), Манделя и Хита (Mandel & Higa, 1970). При изучении пути биосинтеза ИУК через ИАМ использовали по-лимеразную цепную реакцию (ПЦР), ДНК-ДНК гибридизации (Sambrook et al., 1989) и тонкослойную хроматографию (Hartmann et al., 1983). Для анализа бактерий на присутствие плазмид использовали метод Экхарда (Eckhard, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ СИНТЕЗА ИНДОЛИЛ-3 -УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ БАКТЕРИЯМИ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП

Проведены исследования по подбору среды и режима культивирования бактерий. Показано, что в минимальной среде PC с маннитом в качестве источника углерода, наблюдался относительно интенсивный рост исследуемых бактерий и достаточно представительная степень окрашивания культур альной жидкости реактивом Сальковского. Установлено, что у всех исследуемых бактерий наибольшее количество ИУК синтезировалось на 34 сутки от начала культивирования.

Таким образом, проведенные исследования позволили подобрать оптимальные и универсальные условия для роста и продуцирования ИУК бактериями различных групп: остановить выбор на минимальной среде PC и проводить определение продукции ИУК на 3-4 сутки культивирования.

СИНТЕЗ ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ БАКТЕРИЯМИ РАЗЛИЧНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП

При изучении видового распределения исследуемых штаммов по продукции ИУК в качественной реакции Сальковского установлено, что способность к биосинтезу ИУК присуща всем таксономическим группам взятых в эксперимент бактериальных штаммов. При этом представители различных групп в отношении продукции ИУК были крайне гетерогенны, далее для различных видов внутри каждого рода. Наибольшее количество ИУК-положительных штаммов обнаружено среди бактерий рода Envinia (91%), наименьшей способностью к синтезу ИУК обладали представители рода Bacillus (42%) (табл. 1).

Результаты экспериментов по определению ИУК-синтезирующей активности бактерий исследуемых восьми родов в качественной реакции Сальковского с разделением по интенсивности окрашивания культураль-ной жидкости демонстрируют неоднородность распределения этого признака по исследуемым группам бактерий (см. табл. 1).

Поскольку в нашей коллекции среди бактерий рода Pseudomonas были как фитопатогенные, так и непатогенные виды, мы попытались проследить наличие возможной корреляции между ИУК-синтезирующей способностью и фитопатогенностью. По результатам качественного теста для бактерий этого рода не выявлено корреляции между ИУК-продуцирующей способностью бактерий и фитопатогенностью. Этот результат показывает, что свойство продуцировать ИУК бактериями этих родов имеет значение

Таблица 1

Способность синтезировать ИУК бактериями различных родов

Не- Не- Распределение ИУК-положительных

Общее отрица- положи- штаммов по интенсивности окрашива-

Род число тельные тельные ния культуральной жидкости реактивом

бактерий штаммов штаммы, штаммы, Сальковского (в % от числа ИУК-

(в % от (в % от положительных штаммов*)

общего общего

числа*) числа*)

+ +++ I++++I +

Pseudomonas 667 240 427 197 159 28 15 28

36% 64% 46% 37% 6% 5% 6%

Xanthomonas 189 79 110 64 28 12 6 0

42% 58% 58% 25% и% 6% 0%

Erwinia 295 9 286 И 34 123 102 16

3% 97% 4% 12% 43% 36% 5%

Corynebacterium 51 13 38 10 20 6 2 0

25% 75% 26% 52% 17% 5% 0%

Bacillus 19 11 8 6 2 0 0 0

58% 42%

Enterobacter 8 2 6 2 0 4 0 0

25% 75%

Azospirillum 3 1 2 0 0 1 1 0

Rhizobium 2 1 1 0 0 1 0 0

Семейство 84 21 63 14 14 23 11 1

Bhizobiaceae 25% 75% 22% 22% 36% 18% 2%

не только как фактор патогенности, но и может играть роль в других процессах жизнедеятельности бактерий.

Таким образом, первый этап исследований позволил из 1318 штаммов бактерий выявить ИУК-продуцирующие и определить распространенность этого свойства; исследовать взаимосвязь между способностью бактерий синтезировать ИУК, их видовой принадлежностью и фитопатогенно-стью; оценить ИУК-положительные штаммы по степени их активности в отношении синтеза фитогормона и отобрать 635 активных продуцентов для дальнейшего количественного анализа колориметрическим методом.

Количественная оценка продукции ИУК бактериями исследуемых штаммов проводилась с целью получения более полных данных об активности синтеза ИУК представителями различных таксономических групп и отбора наиболее активных по продукции ИУК штаммов для последующих молекулярно-генетических исследований. Колориметрический анализ по-

казал, что для подавляющего большинства штаммов всех исследуемых родов бактерий продукция ИУК не превышала 20 мкг/мл. Из 635 штаммов выявлено только 34 с более высоким уровнем продукции ИУК, из которых было отобрано 16 наиболее активных из родов бактерий Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Corynebacterium, Azospirillum и Rhizobium для дальнейшего изучения генетических детерминант биосинтеза фитогормона

Полученные количественные данные об ИУК-синтезирующей активности бактерий позволили исследовать возможную корреляцию между продукцией ИУК и фермента пектатлиазы у 23 фитопатогенных штаммов эрвиний. Эта задача решалась нами с целью установления взаимосвязи между ИУК-синтезирующей активностью и фитопатогенностью, поскольку патогенность эрвиний связывают с их способностью продуцировать во внешнюю среду пекталитические ферменты. Полученные результаты не обнаружили корреляции между секрецией ИУК и активностью пектатлиазы у исследованных эрвиний. Средняя ИУК-синтезирующая активность для пектолитически положительных и отрицательных штаммов составила соответственно 18 и 17 мкг/мл. Возможно, отсутствие корреляций этих двух признаков связано с разнонаправленным действием гормона ИУК и фермента пектатлиазы: продукция фермента является фактором, обуславливающим патогенность этих бактерий, а синтез ИУК - скорее всего, более общим свойством эрвиний, существенным как для их патогенности, так и для обеспечения других функций важных для жизнедеятельности бактерий.

ИЗУЧЕНИЕ ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ У ФИТОПАТОГЕННЫХ И НЕПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Для 15 штаммов, отобранных как наиболее активные продуценты ИУК, 12 из которых относились к фитопатогенам, выявлялось наличие пути биосинтеза фитогормона через индолил-3-ацетамид (ИАМ). С этой целью исследовалось присутствие в их геноме нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам шаМ Р. syringae pv savastanoi и tms-\ А. tumefaciens, а также способность утилизировать ИАМ в качестве предшественника ИУК.

Последовательности гена iaaM выявляли с использованием методов ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации. При проведении ПЦР использовались праймеры, комплементарные консервативному участку гена iaaM Р. syringae pv savastanoi в положениях 133-156 и 732-712 кодирующей части гена. Результаты проведенных экспериментов по амплификации показали (рис. 1,а), что синтез ожидаемого фрагмента длиной около 600 п.н. выявлен у 11 из 15 исследованных бактериальных штаммов: всех представителей родов Corynebacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Rhizobium, и у одного

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

а) б)

Рис. 1. Идентификация гена iaaM у продуцирующих ИУК бактерий с помощью ПЦР (а) и ДНК-ДНК гибридизации (б): 1 - Xanthomonas campestris pv vesicatoria C7; 2-Х. campestris pv malvacearum 6518; 3 - Erwinia carotovora pv carotovora 227; 4 - Pseudomonas cichorii 293a; 5 - Agrobacterium tumefaciens 1D1; 6 - Rhizobium leguminosarum pv viciae VF39; 7 - Corynebacterium michiganense 13a; 8 - C. insidiosum 72466; 9 - C. sepedonicum 7662; 10 - X. campestris pv translucens Пш-1в; 11 - Р. saccharophila BKMB 488; 12 - Р. cichorii 292; 13 - A. tumefaciens С58; 14 - фрагмент, амплифицированный с плазмиды pGV0319; 15 - ДНК фага X, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции HindlII.

штамма рода Erwinia (Е. carotovora pv carotovora). У остальных четырех из пяти исследованных штаммов рода Erwinia (2 - Е. herbicola и 2 - Е. aroideae) результаты проведенного анализа показали отсутствие соответствующих последовательностей ДНК.

Наличие последовательностей гена iaaM во фрагментах ДНК изучаемых бактерий было подтверждено блот-гибридизацией. В качестве ДНК-зонда использовали меченый [j2P] препарат сконструированной нами плаз-миды pTV15. Эта плазмида содержит фрагмент гена tms-\ (iaaM) Agrobac-terium tumefaciens, который был получен в ходе ПНР с использованием в качестве матрицы плазмиды pGV0319, содержащей Т-область Ti-плазмиды А. tumefaciens с генами /«¡5-1 и tms-2. Об идентичности амплифицирован-ного продукта с фрагментом гена tms-\ судили по его молекулярной массе с помощью рестрикционного анализа, используя эндонуклеазы рестрикции Hindin, BstNl, Sali. Амплифицированный фрагмент клонировали в EcoRV-сайт плазмиды pBluescriptKS. Соответствие нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента и гена iaaM было подтверждено секве-нированием.

Результаты блог-гибридизации показали (рис. 1,6), что у клеток 11 штаммов, содержащих последовательности гена iaaM, выявленные с помощью ПЦР, наблюдался ожидаемый гибридизационный сигнал, свидетельствующий о наличии у данных бактерий гена с нуклеотидной последовательностью, гомологичной гену tms-1 А. tumefaciens. Размер гибриди-зующихся фрагментов (около 600 п.н.) совпадал с размером фрагмента, амплифицированного с плазмиды pGV0319. Гибридизационный сигнал не обнаружен у тех же четырех штаммов, относящихся к роду Erwinia, у которых не был выявлен искомый фрагмент в ходе ПЦР. Бактерии 9 из 11 исследованных штаммов, у которых был обнаружен положительный гибридизационный сигнал и присутствовал искомый фрагмент, относятся к фи-топатогенам.

Таким образом, проведенные эксперименты с использованием ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации, свидетельствуют о существовании у большинства исследуемых штаммов (11 из 15) гена, гомологичного гену iaaM Pseudomonas savastanoi и Agrobacterium tumefaciens.

Предположение о наличии пути биосинтеза ИУК через НАМ для некоторых из исследуемых штаммов было подтверждено нами методом тонкослойной хроматографии при анализе кислых эфирных экстрактов куль-туральной жидкости бактерий, выращенных в присутствии ИАМ. Такой анализ позволяет судить об активности продукта гена iaaH - индолил-3-ацетамидгидролазы, катализирующей превращение ИАМ в ИУК. Как видно из рис. 2, синтез ИУК выявлен у тех же бактерий, у которых были идентифицированы гомологи гена iaaM. Это служит дополнительным свиде-

Фронт —> Щ

ИУК —^ • тщтфФШ' *

ИАМ —► 0 ;

*

, * * »■ i

Рис. 2. Хроматограмма кислых эфирных экстрактов культураль-ной жидкости бактерий, выращенных в присутствии ИАМ: 1 -стандарты ИУК и ИАМ; 2 -Corynebacterium sepedonicum 7662; 3 - С. michiganense 13а; 4 -Erwinia carotovora pv carotovora 227; 5 - Xanthomonas campestris pv vesicatoria C7; 6 -X. campestris pv malvacearum 6518; 1-Х. campestris pv translucens Пш-1в; 8 - Pseudomonas saccharophila BKMB 488; 9 - P. cichorii 293a.

Старт —► .....

123456789

тельством наличия у бактерий исследованных штаммов пути синтеза ИУК через ИАМ.

С целью выявления других путей синтеза ИУК у отобранных бактерий была изучена возможность синтеза этого фитогормона через обходной триптофановый путь. Ключевой фермент этого пути - оксидаза TSO - катализирует превращение триптофана непосредственно в индолацетальдегид, который затем превращается в ИУК. Нами было показано, что активность фермента TSO у иследованных бактерий не выявляется. По-видимому, такой путь синтеза ИУК не имеет широкого распространения среди бактерий.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЛАЗМИД У ШТАММОВ С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ ПРОДУКЦИИ ИНДОЛИЛ-З-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ

Известно, что у фитопатогенных бактерий, таких как Agrobacterium tumefaciens и Pseudomonas savastanoi, гены биосинтеза ИУК локализованы в составе плазмид. Для изучения возможной локализации генов, контролирующих синтез ИУК у исследуемых нами бактерий, был проведен их анализ на наличие плазмид. Однако, наличие плазмидной ДНК было выявлено только у 5 из 15 проанализированных бактериальных штаммов (рис. 3). Из

1 2 3 4 5 6

Рис. 3. Электрофореграмма плазмидной ДНК бактерий: 1 - Rhizobium legumi-nosarum pv viciae VF 39; 2 -Agrobacterium tumefaciens С 58; 3 - Corynebacterium insidiosum 7446b; 4 - Corynebacterium michiganense 13a; 5 - Pseudomonas cichorii 293a; 6 - Erwinia herbicola JI-7610a.

этого следует, что, по-видимому, у большинства изученных нами бактерий, гены, контролирующие биосинтез ИУК, имеют хромосомную локализацию.

ВЛИЯНИЕ ПЛАЗМИДЫ R388 НА СИНТЕЗ ИНДОЛИЛ-3-УКСУСНОЙ КИСЛОТЫ У НЕКОТОРЫХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS И

AZOSP1RILL UM

Известно, что введение плазмиды R388 из группы несовместимости Inc W в онкогенные штаммы А. tumefaciens, несущие плазмиды Ti, приводит к подавлению их онкогенности несмотря на то, что штаммы, получившие указанные плазмиды, сохранили также онкогенную плазмиду Ti. Этот эффект коррелирует со снижением у трансконъюгантов уровня продукции ИУК. Природа такого явления остается не известной.

При постановке ниже представленных экспериментов мы исходили из того, что эволюционная связь генетических детерминант синтеза ИУК у различных бактерий изучена недостаточно. Поэтому изучение вопроса о способности плазмиды R388 супрессировать продукцию ИУК не только у агробактерий, но также у других представителей фитопатогенных и сапро-

фитных бактерий, могло бы хотя и косвенно свидетельствовать о структурном и функциональном сходстве генов синтеза ИУК у этих бактерий.

С помощью коньюгационного переноса плазмиду R388 передавали двум штаммам Р. cichorii и штамму Л. brasilense 94-3, отличающимся наибольшим уровнем синтеза ИУК. Трансконьюганты, получившие плазмиду R388, отбирали при скрещивании ауксотрофного штамма Е. coli K-12J53, несущего плазмиду R388, с прототрофными реципиентными штаммами Pseudomonas и Azospirillum.

Определение способности продуцировать ИУК у трансконьюгантов Pseudomonas и Azospirillum, несущих R388, показало статистически достоверное снижение уровня секреции ИУК в 2-3 раза по сравнению с исходными штаммами.

Полученные результаты свидетельствуют, что свойство R388 супрес-сировать функцию генов, связанных с контролем синтеза ИУК у А. tumefaciens, распространяется на другие фитопатогенные бактерии, в данном случае представителей рода Pseudomonas, а также на непатогенные бактерии Azospirillum brasilense. Можно было бы предположить, что этот эффект в содержащих плазмиды клетках связан с особым типом межплаз-мидных взаимодействий, поскольку, например, R-плазмиды репрессируют ответственные за продукцию ИУК гены плазмиды Ti Agrobacterium tumefaciens. Однако, как показали наши исследования, по крайней мере у одного из изучавшихся штаммов - Pseudomonas cichorii 292 - плазмид не обнаружено и, следовательно, гены биосинтеза ИУК имеют хромосомную локализацию. Более того, необходимо отметить невысокую степень структурной гомологии генов триптофан-2-монооксигеназы Р. cichorii 293а, Р. cichorii 292 и гена tms-l Agrobacterium tumefaciens, выявленную что в ходе ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации. Однако, у этих штаммов также проявляется супрессирующее действие плазмиды R388. Это позволяет предположить, что несмотря на различия нуклеотидных последовательностей указанных генов, их регуляторные элементы могут быть достаточно сходны чтобы служить мишенью неидентифицированного пока продукта плазмиды R388 и других антионкогенных плазмид, обуславливающего их способность подавлять продукцию ИУК у таксономически удаленных бактериальных хозяев.

ВЫВОДЫ

1. С использованием реакции Сальковского проведен скрининг на способность синтезировать ИУК фитопатогенных и непатогенных почвенных, ризосферных и эпифитных бактерий, относящихся к родам Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Corynebacterium, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum и Rhizobium и группе бактерий семейства Rhizo-

biaceae. Подобраны оптимальные условия постановки данной реакции. Показано, что ИУК-продуцирующая способность присуща бактериям независимо от их таксономической принадлежности. От 42% до 97% штаммов разных родов бактерий обладали способностью синтезировать фитогормон. Выявлена определенная корреляция между таксономическим положением бактерий и образованием ИУК. Наибольшее количество Неположительных штаммов обнаружено среди бактерий рода Erwirtia. Наименьшей способностью к биосинтезу ИУК обладали представители рода Bacillus. Результаты исследований с разделением по интенсивности окрашивания культуральной жидкости реактивом Сальковского свидетельствуют о гетерогенности ИУК-синтезирующей активности у бактерий разных таксономических групп (Холмецкая, 1992; Лобанок, Холмецкая, 1992; Холмецкая, Лобанок, 1994; Холмецкая и др., 1996).

2. Количественное определение секреции ИУК клетками штаммов, вызывающих наиболее интенсивное окрашивание культуральной жидкости в качественном тесте, показало, что хотя исследуемые штаммы были филогенетически удалены друг от друга, концентрация ИУК в культуральной жидкости в большинстве случаев не превышала 20 мкг/мл. Активные продуценты ИУК (от 20 до 85 мкг/мл) обнаружены среди представителей родов Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Corynebacterium, Rhizobium и Azospirillum. У всех отобранных бактерий Bacillus и Enterobacter продукция ИУК не превышала 10 мкг/мл. Выявленные особенности у отдельных родов, видов, патоваров и штаммов могут быть использованы при направленном отборе продуцентов фитогормона индолил-3-уксусная кислота (Холмецкая и др., 1996).

По результатам проведенных исследований отобрано 16 штаммов, клетки которых характеризовались высоким уровнем продукции ИУК.

3. В проведенных исследованиях не установлено взаимосвязи между ИУК-синтезирующей способностью и фитопатогенностью у бактерий рода Pseudomonas. Этот результат показывает, что свойство продуцировать ИУК бактериями этого рода имеет значение не только как фактор патогенности, но и может играть какую-то роль в других процессах жизнедеятельности бактерий (Холмецкая и др., 1996).

Показано, что отсутствует корреляция между ИУК-синтезирующей и пектатлиазной активностью фитопатогенных бактерий рода Erwinia. Возможно, отсутствие положительных корреляций этих двух признаков связано с разнонаправленным действием фитогормона ИУК и фермента пектат-лиазы: продуция фермента является фактором, обуславливающим фитопа-тогенность этих бактерий, их способность к мацерации растительных тканей на более поздних стадиях патогенеза, тогда как продукция ИУК является, скорее всего, более общим свойством эрвиний, существенным как для

их патогенности, так и для обеспечения других функций в их жизнедеятельности (Лобанок, Холмецкая, 1992; Холмецкая и др., 1996).

4. В результате экспериментов с использованием методов молеку-лярно-генетического анализа полимеразной цепной реакции, ДНК-ДНК гибридизации и тонкослойной хроматографии, у 11 из 15 штаммов бактерий, характеризующихся высоким уровнем продукции ИУК, с помощью использованной в качестве зонда сконструированой нами рекомбинангной плазмиды pTV15 обнаружен ген, гомологичный гену iaaM Pseudomonas syringae pv savastanoi и Agrobacterium tumefaciens. Это свидетельствует о том, что путь биосинтеза ИУК у этих штаммов происходит через индолил-3-ацетамид (Холмецкая, Лобанок, 1997; Холмецкая и др., 1998). 9 из 11 вышеуказанных штаммов относились к фитопатогенам, что подтверждает предположение о том, что этот путь характерен для фитопатогенных бактерий.

5. Проведено изучение генетического детерминирования биосинтеза ИУК у 15 активных продуцентов фитогормона. Показано, что по крайней мере у 10 проанализированных бактерий гены, контролирующие синтез ИУК, локализованы в хромосоме (Холмецкая, Лобанок, 1995; Холмецкая, Лобанок, 1998).

В итоге по результатам молекулярно-генетического анализа 15 штаммов, характеризующихся высоким уровнем продукции ИУК, можно заключить, что фитопатогенные бактерии синтезируют ИУК преимущественно через индолил-3-ацетамид, и ген iaaM, кодирующий ключевой фермент этого пути триптофан-2-монооксигеназу, в большинстве случаев имеет хромосомную локализацию.

6. Установлено, что свойство плазмиды R388 (из группы несовместимости Inc W) супрессировать функцию генов, связанных с контролем синтеза ИУК у А. tumefaciens, распространяется на ИУК-синтезирующие бактерии других родов: фитопатогенные Pseudomonas и ассоциативные Azospirillum brasilense (Холмецкая, Лобанок, 1992). Эти данные могут свидетельствовать о функциональной гомологии генетических детерминант, ответственных за продукцию ИУК у разных систематических групп бактерий, и могут служить основой для разработки методов использования плазмиды R388 для биологического контроля фитопатогенных бактерий.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Холмецкая М.О. Изучение продукции ИУК некоторыми фитопато-генными и непатогенными бактериями // Конференция молодых ученых. Тез. докл. - Уфа, 1992. - С. 29.

2. Лобанок Е.В., Холмецкая М.О. Влияние плазмиды R388 на синтез ИУК некоторыми фитопатогенными и сапрофитными бактериями // У1 съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров. Тез. докл. - г.

Горки, 2-4 июля, 1992 г. / АН Республики Беларусь. Общество генетиков и селекционеров Республики Беларусь. - Минск, 1992. - С. 14.

3. Лобанок Е.В., Холмецкая М.О. Распространение генов ауксина в популяциях почвенных бактерий // У1 съезд общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. Тез. докл. - Минск, 1992. - С. 12.

4. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В. Распространение генов ауксина среди бактерий рода Pseudomonas II В кн.: Генетическая инженерия и биотехнология. Тез.докл. - Минск, 1994. - С. 71.

5. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В. Изучение способности почвенных бактерий продуцировать индолилуксусную кислоту II Современные проблемы генетики и селекции. Тез. докл. - Минск, 1995. - С. 79.

6. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В., Чернин Л.С. Синтез индолилук-сусной кислоты некоторыми фитопатогенными и непатогенными бактериями // Докл. HAH Беларуси - 1996. - Т. 40, № 2. - С. 80-83.

7. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В. Идентификация гена iaaM у некоторых ризосферных и эпифитных бактерий // УП съезд Белорусского общества генетиков и селекционеров. Тез. докл. - г. Горки, 1997. - С. 132-133.

8. Выявление индолил-3-ацетамидного пути биосинтеза ауксина у фитопатогенных и сапрофитных штаммов бактерий из различных таксономических групп / М.О. Холмецкая, Е.В. Лобанок, Т.В. Ивашина и др. // Докл. HAH Беларуси - 1998. - Т. 42, № 3. - С. 107-111.

9. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В. Генетический контроль синтеза индолил-3-уксусной кислоты у некоторых фитопатогенных бактерий // Межд. конф. «Молекулярная генетика и биотехнология», Минск, 6-8 апреля, 1998 г. / Отделение биологических наук HAH Беларуси. - Минск, 1998. -С. 122-124.

РЭЗЮМЭ

Халмецкая Майя Аусееуна "Прадукцыя шдалш-З -воцатнай юс латы i яе ге-нетычны кантроль у розных труп бактэрый"

Ключавыя словы: шдалш-З-воцатная юслата, фггапатагенныя i непа-тагенныя бактэрьп, б!ясштэз, прадукцыя, трыптафан, ген, шдалш-З-ацэтамщ, плазмща.

Мэтай гэтай працы з'явшася вывучэнне здольнасщ прадуцыраваць шдалш-З-воцатную ислату (ШК) рознылп глебавылп, pызacфepнымi i эшфггаым1 бактэрыялп, уключая фггапатагенныя i непатагенныя формы; вывучэнне шляхоу i генетычных дэтэрмшантау сштэза IBK; устанауленне магчымых карэляцый пам1ж здольнасцю сштэз1раваць ШК i шшым1 улас-щвасцям1 даследуемых мкрааргашзмау.

3 дапамогай рэакцьп Салькоускага вывучана здольнасць прадуцыраваць фггагармон IBK у 1318 бактэрыяльных штамау, належачых да васьм> радоу i групе нещэнтыфщыраваных бактэрый сямЧ Rhizobiaceae. Паказана, што здольнасць да биюштэзу IBK уласщва yciM таксанам1чным трупам узя-тых у эксперымент бактэрыяльных штамау. Пры гэтым не выяулена карэ-ляцыя палпж здольнасцю сштэз}раваць IBK i фп-апатагеннасцю бактэрый радоу Pseudomonas и Erwinia.

Па вышкам даследвання актыунасщ сштэза IBK было адобрана 16 штамау з найбольш высоюм узроунем прадукцьп фтагармона, прад-стауюкоу 6 радоу бактэрый, у ягах праводзшася вывучэнне генетычных дэтэрмшантау сштэза IBK. 3 гэтых 16 штамау 12 был! фпгапатагеннымг

Установлена, што для даследаванных фтпатагенных бактэрыяльных штамау сштэз ШК адбываецца пераважна праз шдалш-З-ацэтамщ, i гены, дэтэрмшуючыя гэты шлях, лакал1зованы пераважна у складзе храма-сомы.

Для двух фтпатагенных штамау Pseudomonas cichorii i асацыя-тыунага штама Azospirillum brasilense выяулена супрэсуючае уздзеянне плазмщы R388 на функцыю генау, звязаных з кантролем сштэза ЮК.

Вынш, прадстауленыя у працы, ствараюць прадпасыльа дзеля да-лейшых больш дэталёвых даследванняу, наираваных на высвятленне ма-лекулярных мехашзмау, ляжачых у аснове узаемаадносш мкра- i макраар-гашзмау. Акрамя таго, вынш працы могуць мець вялпсае практычнае зна-чэнне дзеля распрацоум метадау стымуляцьп роста раслш, абароны раслш ад шфекцый i стварэння фкагарманальных прэпаратау дзеля патрэб сель-скай гаспадарш.

РЕЗЮМЕ

Холмецкая Майя Овсеевна "Продукция индолил-3-уксусной кислоты и ее генетический контроль у различных групп бактерий"

Ключевые слова: индолил-3-уксусная кислота, фитопатогенные и непатогенные бактерии, биосинтез, продукция, триптофан, ген, индолил-3-ацетамид, плазмида.

Целью настоящей работы явилось изучение способности продуцировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) различными почвенными, ризо-сферными и эпифитными бактериями, включая фитопатогенные и непатогенные формы; изучение путей и генетических детерминантов синтеза ИУК; установление возможных корреляций между способностью синтезировать ИУК и другими свойствами исследуемых микроорганизмов.

С помощью реакции Сальковского изучена способность продуцировать фитогормон ИУК у 1318 бактериальных штаммов, относящихся к восьми родам и группе неиденгифицированных бактерий семейства Rhizobiaceae. Показано, что способность к биосинтезу ИУК присуща всем таксономическим группам взятых в эксперимент бактериальных штаммов. При этом не обнаружена корреляция между способностью синтезировать ИУК и фитопатогенностыо бактерий родов Pseudomonas и Erwinia.

По результатам исследования активности синтеза ИУК было отобрано 16 штаммов с наиболее высоким уровнем продукции фитогормона, представителей 6 родов бакгерий, у которых проводилось изучение генетических детерминантов синтеза ИУК. Из этих 16 штаммов 12 были фитопа-тогенными.

Установлено, что для исследованных фитопатогенных бактериальных штаммов синтез ИУК происходит преимущественно через индолил-3 -ацетамид, и гены, детерминирующие этот путь, локализованы преимущественно в составе хромосомы.

Для двух фитопатогенных штаммов Pseudomonas cichorii и ассоциативного штамма Azospirülum brasilense обнаружено супрессирующее действие плазмиды R388 на функцию генов, связанных с контролем синтеза ИУК.

Результаты, представленные в работе, создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований, направленных на выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимоотношений микро- и макроорганизмов. Кроме того, результаты работы могут иметь большое практическое значение для разработки методов стимуляции роста растений, защиты растений от инфекций и создания фитогормональных препаратов для нужд сельского хозяйства.

SUMMARY

Kholmetskaja Maja Ovseevna "Production of indole-3-acetic acid and its genetic control in different bacterial groups"

Key words: indole-3-acetic acid, phytopatliogenic and nonpathogenic bacteria, biosynthesis, production, tryptophan, gene, indole-3-acetamid, plasmid.

Hie goal of the present research was to study the ability of producing in-dole-3-acetic acid (IAA) by diverse soil, rhizosphere and epiphytic bacteria, including phytopatliogenic and nonpathogenic forms; to study pathways and genetic determinants of IAA synthesis; to reveal possible correlations between the ability in producing IAA and other properties of the micro-organism studied.

The ability to produce IAA phytohormone in 1318 bacterial strains, attributed to eigtli genera and the group of nonidentified bacteria of Rhizobiaceae family, was investigated by means of Salkovskii's reaction. The ability for IAA biosynthesis was shown to be peculiar to all taxonomic groups of bacterial strains involved in the experiment, with no correlation between the ability for IAA synthesis and bacteria phytopathogenicity of Pseudomonas and Erwinia genera being revealed. Sixteen strains with the highest level of phytohormone production, representatives of 6 bacteria genera, were selected by the results of testing activity of IAA synthesis. Twelve out of sixteen strains were phytopatliogenic.

It was revealed that for the investigated phytopatliogenic bacterial strains IAA synthesis occurred predominantly via indole-3-acetamid, and genes, determining this padiway, are predominantly localized in chromosome composition.

Suppressing effect of R388 plasmid on function of genes related to the control of IAA synthesis was revealed for two phytopathogenic strains of Pseudomonas cichorii and an associative strain of Azospirillum brasilense.

The results represented in die work create prerequisites for further more detailed investigations aimed at finding out molecular mechanisms being the basis of micro-macro-organism interrelations. Besides, the results of work can be of great practical importance for working out methods for plant growth stimulation, plant protection against infection and developing phytohormonal preparations for agriculture needs.