Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области

Алексеева, Анна Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области"

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА АННА ЕВГЕНЬЕВНА

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И БИОРАЗНООБРАЗИЕ ШТАММОВ AZOTOBA CTER CHROOCOCCUM, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПОЧВ НИЖЕГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ

Специальность 03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2005

Работа выполнена на базе кафедры молекулярной биологии и иммунологии и Научно-исследовательского института молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, доцент

Ладыгина Галина Николаевна доктор медицинских наук, профессор

Добротина Наталия Аркадьевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Леванова Галина Федоровна

Ведущая

организация:

кандидат биологических наук, доцент

Штырлина Ольга Вениаминовна

Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия

Защита состоится » ^И^сг^ие- 2005 г. в часов на заседании диссертационного совета К 212.166.06 в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950 г. Н. Новгород, пр. Гагарина, 23 корп. 1, биологический факультет

e-mail: kmb@bio.unn.ru

тел: (8312) 65-82-07

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

И.Ф. Александрова

МЦ 12Ж30О

d 6W- 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Ведущая роль в геохимических процессах круговорота биогенных элементов, что прямо или косвенно влияет на газовый состав атмосферы Земли, принадлежит микроорганизмам (Заварзин, 1979; Аристовская, 1985). Обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ, несомненно, является ключевым условием поддержания жизни на Земле.

Деградация почвенных экосистем, динамическое уменьшение многообразия групп микроорганизмов (редуцентов), снижение не только количества, но и их физиологической активности, нарушение структуры биоценозов и биогеоценозов - последствия антропогенного воздействия (Самсонов, 1987; Савич и др., 2003). В связи с вышеизложенным, в регуляции круговорота биогенных элементов (азота) возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов, таких как Azotobacter. В биосфере азотобактер выполняет средообразующую функцию, как за счет азотфиксации, так и за счет продукции биологически активных веществ, в частности, индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), важнейшего гормона растений, регулирующего разнообразные реакции (Громов, 1989; Заварзин, Колотилова, 2001).

Интерес к азотфиксирующим микроорганизмам, в частности азотобактеру, обусловлен острой необходимостью перехода от химизации сельского хозяйства к биологизации, что требует современных представлений о физиологическом состоянии, адаптационных возможностях и механизмах штаммов рода Azotobacter.

В тоже время, до сих пор нет четких представлений о гетерогенности штаммов Azotobacter по активности продукции биологически активных веществ и связи различий с другими параметрами биохимической активности штаммов, таких как активность роста и интенсивность азотфиксации.

Цели и задачи исследования. Целью работы явилась оценка биоразнообразия штаммов Azotobacter chroococcum на основе выявления генетических, культуральных, биохимических различий, а также изучение физиологической активности азотобактера при экстремальных воздействиях.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать штаммы рода Azotobacter из образцов различных типов почв Нижегородской области;

2. Изучить гетерогенность штаммов по культуральным, морфологическим и биохимичеким признакам, выявить генетические различия на основе анализа структуры гена nifH\

3. Провести сравнительный анализ активности роста штаммов Azotobacter и продукции ими ИУК;

4. Исследовать эффект действия экстремальных факторов (температура и пестицид) на жизнеспособность, активность роста и продукцию ИУК клетками^. chroococcum

Научная новизна работы. Выявлено биоразнообразие штаммов азотобактера, выделенных из различных тип:>ф0ё.4flA^WSWPJtWKOPi области на

БИБЛИОТЕКА __ } СИ

оэ

IWinUIKfVI |

'ГТЖ-,

'—т^алвмЛ Ш

основе анализа генетических, культуральных и биохимических характеристик.

Впервые показаны различия в первичной структуре гена niflí внутри группы микроорганизмов, относящихся к одному виду A. chroococcum.

Впервые выявлена связь между активностью роста штаммов азотобактера и уровнем продукции индолилуксусной кислоты.

Установлена гетерогенность выделенных штаммов в отношении действия различных концентраций пестицида тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД).

Исследовано действие различных доз пестицида и теплового шока на активность роста клеток азотобактера. Установлены дозы экстремальных воздействий, приводящих культуру к состоянию стресса.

Впервые проведены наблюдения за изменением уровня продукции ИУК клетками А. chroococcum, свидетельствующие об увеличении ее секреции в условиях стресса.

Практическая значимость работы. Проведен сравнительный анализ выделенных культур Azotobacter chroococcum, позволивший выявить активно растущие штаммы, штаммы с наибольшим уровнем секреции ИУК, штаммы, устойчивые к действию пестицида ТМТД. Полученные результаты обосновывают практическое применение бактериальных удобрений, содержащих физиологически активные культуры Azotobacter chroococcum, адаптированные к конкретным условиям среды.

Положения, выносимые на защиту

1. Штаммы азотобактера, выделенные из разных типов почв Нижегородской области, различаются по фенотипическим и генотипическим признакам.

2. Уровень продукции ИУК азотобактером зависит от степени неблагоприятного воздействия и активности роста штамма.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Эколого-экономические основы формирования агробиогеоценозов» (Н.Новгород, 2002); Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003); Съезде физиологов растений России (Пенза, 2003); III сессии молодежной школы - семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003); VII научно-практической конференции «Экологической образование и воспитание в Нижегородской области» (Н.Новгород, 2003); XI Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2004); VIII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004); VIII Всероссийского популяционного семинара «Популяции в пространстве и времени» (Н.Новгород, 2005); X Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины) (Н.Новгород, 2005)

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на/^/страницах машинописного текста, иллюстрированы 6 таблицами и «^рисункам и. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего /^источника, из которых ^иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили штаммы A. chroococcum, выделенные из различных типов почв Нижегородской области.

Выделение штаммов рода Azotobacter проводилось методом почвенных комочков на плотной среде Эшби (Виноградский, 1952). Идентификацию, выделенных культур проводили по комплексу ключевых морфологических и физиолого-биохимических признаков в соответствии с определителем бактерий Берджи (1997).

Фрагменты ДНК гена nij~Н штаммов A. chroococcum нарабатывали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализировали методом конфор-мационного полиморфизма однонитевой ДНК (Fujita, Silver, 1995). Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса по Герхарду (1984)

Антибиотикорезистентность выявляли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков. В работе использовали 18 антибиотиков.

Для определения устойчивости к пестицидам применяли фунгицид тет-раметилтиурамдисульфид (ТМТД), относящийся к дитиокарбаматам, в концентрациях - 1 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,05 мг/мл, вносимых в плотную среду Эшби. После культивирования в течение 2-х суток подсчитывали число колоний (колониеобразующих единиц (КОЕ)), соответствующих числу жизнеспособных клеток в опытных вариантах.

Активность роста штаммов в жидкой безазотной среде Берка определяли по изменению величины светорассеяния - оптической плотности (ОП) суспензии при Х=590 нм каждые 12 часов. Содержание ИУК в культуральной жидкости устанавливали колориметрическим методом с использованием реактива Сальковского при Х=540 нм (Кефели, 1974). Интенсивность азо1фик-сации регистрировали по уровню накопленного аммиака в среде культивирования в реакции с образованием индофенолого синего при Х=630 нм (Allen et al, 1974).

При исследовании действия неблагоприятных факторов на клетки (штамм № 6) культуру азотобактера выращивали в жидкой среде Берка с добавлением триптофана (0,4 мг/мл) при 26°С на качалке, затем подвергали воздействию температур - 40°, 45° и 50°С, с экспозицией 5 и 15 мин. В экспериментах с изучением действия пестицида ТМТД на клетки А. chroococcum использовали 24-х часовую культуру. Бактериальную суспензию подвергали воздействию ТМТД в концентрациях 1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл в течение 1ч, 2ч и Зч. Отбирали пробы по 5 мл, центрифугировали при 10 тыс. об./мин в течение 15 мин, дважды отмывали в фосфатном буфере (pH 7,27.4). Осадок ресуспендировали, доводили по государственному бактериаль-

ному стандарту мутности до 10 ед. Определение количества жизнеспособных клеток проводили посевом суспензии на плотную среду Эшби и подсчетом КОЕ. Одновременно 3 мл суспензии пересевали на свежую среду Берка с триптофаном (0,4 мг/мл). Через 24 ч и 48 ч культивирования при 26°С определяли количество клеток в суспензии и уровень накопления ИУК в культу-ральной жидкости.

Полученные данные статистически обрабатывали с помощью программы Biostat. Достоверность различий определяли с использованием парного критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Из почв Нижегородской области было выделено 20 штаммов бактерий, растущих на безазотной среде Эшби. В 16 образцах почвы, взятых с огородных участков, регистрировалось наличие значительного числа клеток азотобактера. Из 17 образцов неокультуренных почв удалось выделить только четыре штамма. Последние присутствовали в почвах следующих типов: чернозем оподзоленныЙ, чернозем выщелочный, темно-серая лесная и серая лесная. Согласно определителю Берджи (1997) по комплексу ключевых культу-ральных и физиолого-биохимических признаков штаммы были отнесены к виду Azotobacter chroococcum.

Выделение штаммов из почв разных типов послужило обоснованием для установления различий, проявляющихся на уровне фенотипических и гено-типических признаков. Для удобства установления отличий штаммы были обозначены номерами (с 1 по 20).

Определение культуральных и генетических различий штаммов А. chroococcum

На плотной среде Эшби 18 штаммов образовывали крупные (до 7 мм в диаметре), слизистые, бесцветные колонии на вторые сутки культивирования. Образование пигмента происходило на 5-е сутки культивирования. Выявлены штаммы, отличающиеся по культуральным признакам. Так, у штамма № 6 колонии формировались значительно меньшего размера - 1-2 мм в диаметре, правильной округлой формы, мало слизистые, не растекающиеся, клетки образовывали светло-коричневый пигмент на 5-е сутки культивирования. Культура штамма № 10 образовывала плоские, достаточно крупные (5-7 мм в диаметре) колонии неправильной округлой формы. Клетки выделяли очень мало слизи. Образование коричневого пигмента наблюдалось уже на 3-е сутки культивирования.

Все исследуемые штаммы были протестированы на наличие специфического для рода Azotobacter фрагмента ni/H гена (рис. 1). Ген nifli ответственен за синтез белка азоферредоксина нитрогеназного комплекса азотфик-саторов. В качестве положительного контроля использовали штамм Azotobacter chroococcum 66 (музей кафедры микробиологии МГУ) Отрицательным контролем служил штамм Escherihia coli Top 10 (Iinvitrogen, США). Установлено, что все выделенные штаммы относятся к роду Azotobacter. Полученные данные подтвердили результаты морфологических и биохимических тестов.

1 2 3 4 5

I—1353 -1078 -872 I—603

-370 319 "281

Рис. 1. Идентификация бактерий рода Azotobacter методом полимеразной цепной реакции

1,2 - исследуемые штаммы A. chroococcum

3 - маркер размерности ДНК фага цХ174 DNA/BsuRI, 281-1353 - размеры фрагментов ДНК, выраженный в п. о.

4 - музейный штамм A. chroococcum 66

5 - штамм E.coli Тор 10

Фрагменты ДНК гена т/Н размером 370 пар оснований, полученные методом ПЦР для всех 21 изучаемых штаммов, исследовали методом кон-формационного полиморфизма однонитевой ДНК. При сравнительном анализе установлено, что штамм № 6 показал уникальные профили электрофо-ретической подвижности однонитевой ДНК гена т/Н (рис. 2), отличающиеся от других штаммов. Представленные данные, свидетельствуют о генетической неоднородности диких штаммов А. сИгоососсит, выделенных из различных почв Нижегородской области.

1 2

одноцепочечная ДНК

Рис. 2. Электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК' гена nifHА. сИгоососсит

двуцепочечная ДНК

1. - референтный штамм A. chroococcum 66

2. - исследуемый штамм № 6 A. chroococcum

Антибиотикорезистентность штаммов А. сИгоососсит

Для выявления особенностей поведения исследуемых штаммов в естественной среде обитания, богатой продуктами метаболизма почвенной био-ты, определяли резистентность к природным антибиотическим препаратам Характер резистентности отражает общую стратегию взаимоотношений азотобактера с другими микроорганизмами, а также его адаптационные возможности (Табл. 1).

Штаммы азотобактера характеризовались различной антибиотикорези-стентностью. Под действием рифампицина, стрептомицина, канамицина, эритромицина, неомицина, гентамицина наблюдалось подавление роста у всех изучаемых штаммов. Не оказывали ингибирующего действия линкоми-цин и бацитрацин. В отношении других антибиотиков у разных штаммов наблюдалось варьирование чувствительности. Наибольшая резистентность об-

наружена у штамма А сИгоососсит № 6 - к девяти антибиотикам. Наименее резистентным оказался штамм № 14. Он был устойчив только к трем антибиотикам

Таблица 1

Антибиотикорезистентность штаммов АгМоЬаМег скгоососсит

Исследуемые Количество устойчивых штаммов

антибиотики

Бацитрацин 20

Линкомицин 20

Оксациллин 19

Карбенициллин 17

Ристомицин 16

Новобиоцин 16

Полимиксин «М» 14

Левомицетин 5

Фузидин 3

Олеандомицин 1

Эритромицин 0

Неомицин 0

Канамицин 0

Гентамицин 0

Стрептомицин 0

Рифампицин 0

Как известно устойчивость к антибиотикам, наряду с хромосомными генами, часто детерминируется плазмидными генами. Проведен скрининг исследуемых штаммов А сИгоососсит на присутствие плазмидной ДНК. В клетках всех тестированных штаммов плазмидной ДНК обнаружено не было. Полученные данные свидетельствовали о хромосомной детерминированности устойчивости штаммов азотобактера к антибиотикам.

Действие пестицида ТМТД на жизнеспособность клеток различных штаммов А. сИгоососсит

Изучено отношение культур азотобактера к присутствию ксенобиотиков на примере пестицидов. Обнаружена неоднозначная реакция культур А. сИгоососсит на ТМТД (рис. 3). У штаммов № 5, 6, 12, 15, 16, 17, 18 при концентрации пестицида 0,05 мг/мл сохранялось 100 % жизнеспособных клеток. У остальных штаммов число жизнеспособных клеток снижалось по-разному от 75,4 % (штамм № 3) до 14,3 % (штамм № 20). Полное подавление жизнеспособности наблюдалось в присутствии пестицида в концентрации 1 мг/мл. Шесть штаммов (№ 3, 6, 10, 13, 15, 20) проявили наибольшую устойчивость по отношению к ТМТД. Эти же штаммы проявили высокую степень резистентности и в отношении антибиотиков.

О 0.1 0 2 0.3 0,4 0.5 0,6 0 7 0 8 0.9 1 1 «онц#нтр«ция ТМТД, мг/мл

-Ш1 » 1--шт N1 2 - - • шт № 3

- ш т № 4 — - ш т № 5 ■ ш т № 6 -шт N8 7 —шт № 8 — шт № 9 -шт № 10

0 1 0,2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0,8 0,9 1 1 1 «онцжтрацяя ТМТД, мг/мл

— шт № 11 - - - шт № 12 -»-шт N1 14 *— шт N8 13 ——шт № 15 — - шт № 16

-шт № 17 —- шт № 18 ——шт № 19

— шт № 20

Рис. 3. Изменение количества жизнеспособных клеток штаммов А. сИгоососсит под действием различных концентраций пестицида ТМТД

Исследования генетических детерминант, обуславливающих устойчивость к пестицидам исследуемых штаммов А. сИгоососсит, не проводилось, однако, представленные нами ранее данные свидетельствуют о хромосомной локализации не только генов устойчивости к антибиотикам, но и генов, обеспечивающих резистентность к пестицидам.

Активность роста и продукция ИУК штаммами А. сИгоососсит

Проведено сравнение активности роста различных штаммов. Были взяты штаммы № 6, 10, 15, выделенные из окультуренных почв и штаммы №11, 12, 14 и 20, полученные из целинных почв различных типов. Наибольшей активностью роста отличался штамм № 6 (рис. 4, А). Остальные культуры характеризовались очень слабым накоплением биомассы, максимальное значение оптической плотности (ОП) наблюдалось у штамма № 10 и составило 0,96, по сравнению со штаммом № 6, у которого значение ОП к 48 часам составило 1,9. Для стимуляции роста в среду культивирования вносили экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) в концентрации 0,5 г/л (рис. 4, В).

У штамма № 10 на среде Берка с ЭКД наблюдался быстрый прирост биомассы в первые часы культивирования, однако уже к 24 часам культура переходила в стационарную фазу роста, и с 48 часов изменения уровня биомассы не происходило. Штаммы № 12, 14, 15 и 20, как видно на рисунке, характеризовались более длительной лаг-фазой по сравнению со штаммами № 6 и № 10. Ростовая динамика штамма №11, выделенного из серой лесной почвы, отличалась очень слабым уровнем накопления биомассы по сравнению со всеми остальными культурами даже при культивировании на среде Берка с добавлением ЭКД.

оп,„

3,5 ■

3 -

2,5 -

2 ■

1,5 •

1 -

0,5 ■

0 -0

Рис. 4. Активность роста штаммов А. сИгоососсит на среде культивирования Берка А - без ЭКД; В - в присутствии ЭКД

Различия в активности роста у штаммов выделенных из окультуренных почв и целинных почв могут быть объяснены с точки зрения неоднозначности в стратегии их выживания. Условия дефицита питательных веществ, которые наблюдаются при обитании в целинных неокультуренных почвах, способствуют выработке стратегии «экономного» роста. И напротив, наличие достаточного количества питательного субстрата приводит к переключению программы выживания на стратегию «быстрого» роста (Черепнев и др., 2003).

Известно, что многие виды азотфиксаторов, в том числе азотобактер, способны продуцировать биологически активные вещества, в частности ИУК, которая является одним из важнейших гормонов растений (Шильнико-ва, Серова, 1983; Шарма, Чахал, 1986; Кравченко, Леонова, 1993). В связи с этим, в дальнейшем исследовали уровень продукции ИУК выбранными нами штаммами № 6, 10, 11, 12, 14, 15 и 20 в сопоставлении с динамикой их роста.

Установлена гетерогенность исследуемых штаммов АгоюЬаШг сНгоо-соссит по количеству продуцируемой ИУК (рис. 5). Так, наиболее активными продуцентами ИУК оказались штаммы № 11 и 15, активность роста которых была минимальной по сравнению с остальными культурами. Они накапливали 25,65 и 28,31 мкг/мл ИУК, соответственно. Активно растущие штаммы № 6 и № 10 оказались наименее эффективными продуцентами ИУК. Таким образом, впервые выявлена зависимость уровня накопления ИУК от физиологических особенностей каждого штамма микроорганизмов. Более активно растущие штаммы продуцировали меньшее количество фитогормона, по сравнению со слаборастущими штаммами азотобактера.

—— штамм № 6

-♦-штамм № 10

—»—штамм № 11

—»—штамм № 12

- «- штамм № 14

—штамм № 15

—штамм 1« 20

10 20 30 40 50 60 время культивирования, ч

10 20 30 40 50 60 70 80 время культивирования, ч

60 70 80 время культивирования,ч

штамм №6 - - - штамм N8 10--штамм № "1 — - штамм № 12

—»—штамм № 14 —»—штамм № 15 — - штамм №20

Рис. 5. Продукция индолил-3-уксусной кислоты различными штаммами А. сИгоососсит

По-видимому, у активнорастущих штаммов азотобактера на безазотных средах процесс азотфиксации будет протекать более интенсивно, накопленный аммиак будет конкурировать с триптофаном за акцепторы аминогрупп, где аммиаку отводится главная роль. Рядом авторов (Мордухова, 1991; Тро-ценко и др., 2001; Доронина и др., 2002) показано, что повышение концентрации аммония в среде ингибирует синтез ИУК. По данным Ю.А. Троценко и др. (2001) замена сульфата аммония на нитрат калия вызывет увеличение количества индольных соединений в 2-15 раз у штаммов метилотрофов, осуществляющих биосинтез ИУК по тому же пути, что и азотобактер, через ин-долилпировиноградную кислоту.

Для проверки высказанного предположения был проведен сравнительный анализ накопления аммиачного азота между быстрорастущим штаммом № 6 и медленно растущим штаммом №11. Как видно из результатов, представленных на рисунке 6, штамм № 6 характеризовался более высоким уровнем накопления аммиачного азота. Через 48 часов культивирования количество ЫНз в культуральной жидкости штамма № 6 составляло 6,2 мкг/мл, что в 7,75 раз превышало количество аммиачного азота, нарабатываемого штаммом №11.

0 12 24 36 48

время культивирования,ч ■жшм кол-во N>-13, штамм № б | I кол-во N1-13, штамм № 11 —*— Штамм №6 - -й- - штамм № 11 Рис. 6. Активность роста и уровень накопления аммиака штаммами А. сИгоососсит

Таким образом, полученные результаты дополняют ранее опубликованные данные о влиянии различных факторов на систему синтеза индолил-3-уксусной кислоты и свидетельствуют о связи уровня секреции ИУК с активностью роста культуры микроорганизма и интенсивностью азотфиксации.

Действие повышенных температур на активность роста и уровень продукции ИУК клетками А. скгоососсит

Эксперименты с использованием температуры в качестве стрессирую-щего воздействия проводились на штамме № 6. Как видно из представленных результатов (рис. 7), после воздействия температуры 40°С активность роста штамма № 6 не отличалась от контроля (26°С). При повышении температуры до 45°С ростовая динамика менялась. Если пятиминутное выдерживание клеток при данной температуре не оказывало эффекта на ростовую активность, то 15-тиминутная экспозиция сопровождалась торможением роста клеток в течение одного часа.

80 л

706050 40204 10-

о--

40°С

время, ч

SOTO-60 ■ 50-■40-

30 ¥:

2010-

50°С

--X--5 мим - - - о ■

3 4

время, ч

"контроль 26С

Рис. 7. Активность роста А. сНгоососсит (штамм № 6) после действия повышенных температур

и.

ж 2

8л 7 6

54 -

2 Н 1

Анализ числа клеток через сутки после нагрева показал, что культуры, подвергавшиеся воздействиям экстремальных температур, равных 45 С и 50°С, в течение 15-ти и 5-ти минут, соответственно, статистически достоверно опережали контрольную культуру (26°С) по числу клеток. В первом случае повышение составило 41 % и во втором случае - 32 %.

Динамика роста культуры после действия повышенных температур (5 мин при 50°С и 15 мин. при 45°С) свидетельствует о том, что клетки А сИгоососсит (штамм № 6) находились в состоянии стресса, так как именно для стрессовой реакции характерен такой ростовой эффект - торможение роста числа клеток, а затем его активация.

Анализ влияния повышенных температур на уровень секреции ИУК показал, что температура 40°С не оказывала статистически достоверного воздействия на ее продукцию клетками (рис. 8, А). При смене температуры до 45°С или 50°С клетки реагировали выбросом ИУК (рис. 8, В, С). Наибольшее количество ИУК в среде сразу после температурного шока обнаружено при выдерживании клеток при 50°С в течение 5 минут и 45°С в течение 15 минут. Оба эти варианта, как указывалось выше, в постшоковый период характеризуются возобновлением и интенсификацией активности роста. Таким образом, первичная реакция бактерий на стресси-рукмцую температуру - это выброс ИУК во внешнюю среду. Механизм такого выброса не ясен, поскольку в литературе время, ч отсутствуют данные, касаю-

—— контроль 26С -х- 5 мин.....15 мин щиеся транспорта ИУК через

Рис. 8. Динамика продукции ИУК клег- бактериальную мембрану, ками А. сИгоососсит (штамм № 6) после действия повышенных температур

время, ч

ъ£ >

время, ч

Влияние ТМТД на активность роста и продукцию ИУК клетками Л. сИгоососсит

В присутствии ТМТД в концентрации 0,05 мг/мл изменения числа жизнеспособных клеток не наблюдали (рис. 9). В концентрации 0,5 мг/мл и 1 мг/мл в первый час экспозиции устанавливали статистически достоверное снижение числа жизнеспособных клеток до 43,6±15,9% и 33,7±6,3%, соответственно. Через 2 часа и 3 часа количество жизнеспособных клеток сохранялось на том же уровне. Отсутствие статистически достоверных различий в количестве жизнеспособных клеток на второй и третий час экспозиции с "ГМТД в сравнении с одночасовой экспозицией свидетельствует об оптимизации адаптационных процессов, происходящих в культуре.

КОЕ. •/.

1вО -

140 -

120 -

ЮО -

ао

во -

40 -

О -

О концентрация ТМТД 0,05 мг/мл О концентрация ТМТД 0.5 мг/мл О концентрация ТМТД 1 мг/мл

Рис. 9. Изменение количества жизнеспособных клеток А сИгоососсит (штамм № 6) после контакта с ТМТД * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (Р<0,05)

Воздействие пестицида в концентрации 0,05 мг/мл не приводило к изменению динамики роста культуры по сравнению с контролем (рис. Ю, А). После контакта с пестицидом в концентрации 0,5 мг/мл (I, 2 и 3 часа) удельная скорость роста культур была выше (ц= 0,25 ч"1) по сравнению с контрольной (ц=0,22 ч'1). Повышение удельной скорости происходило за счет сокращения времени генерации £ от 2,14 часа в контроле до 1,88 часа в опыте и через 48 часов опытные культуры догоняли контрольную по количеству клеток (рис. 10, В). Культура, подвергавшаяся действию пестицида в концен-Iрации 1 мг/мл, не обнаружила тенденции к увеличению активности роста после воздействия пестицида. Удельная скорость роста не отличалась (ц= 0,22 ч'1) от контрольного варианта и разница в количестве клеток сохранялась постоянной до конца эксперимента и была равна 40 % (рис. 10, С). По-видимому, при данной (1 мг/мл) концентрации ТМТД происходило необратимое нарушение развития адаптационных процессов в клетке.

□ контроль в 1час В 2 часа ш 3 часа

О часов

через 24часа через 48 часов

О часов через 24часа через 48 часов

Рис. 10. Активность роста А. скгоососсит (штамм № 6) после контакта с ТМТД А - в концентрации 0,05 мг/мл; В - в концентрации 0,5 мг/мл; С - в концентрации 1 мг/мл * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (Р<0,05)

% ИУК от контроля

300

250 Н 200 150 100 50 -| 0

% ИУК от контроля

300

1 час

2 часа

контроль

Зчаса

контроль

Зчаса

% ИУК от

контроля

300 и

250 -

200 -

150 -

100 - ---

50 -

0 -

1 час 2 часа 3 часа

П через 24 часа □ через 48 часов

Рис. 11. Количество ИУК продуцируемой клетками/!. сИгоососсит (штамм № 6) после контакта с ТМТД А - в концентрации 0,05 мг/мл; В - в концентрации 0,5 мг/мл; С - в концентрации 1 мг/мл * - различия статистически достоверны в сравнении с контролем (Р<0,05)

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что доза пестицида, равная 0,5 мг/мл, во всех экспозициях оказывала стрессирующее воздействие на исследуемую культуру азотобактера, сопровождающееся снижением числа жизнеспособных клеток. Однако при переносе культуры в благоприятные условия наблюдалось повышение ростовой активности, свидетельствующие о выходе культуры из стрессированного состояния.

При изучении активности продукции ИУК был произведен пересчет количества продуцируемой ИУК на одну бактериальную клетку. Данные представлены на рис. 11 в процентах относительно контроля, принимаемого за 100%.

Выявлен дифференцированный эффект действия пестицида на уровень продукции ИУК азотобактером ТМТД в концентрации 0,05 мг/мл не оказывал эффекта на продукцию ИУК во всех вариантах эксперимента (рис. 11, А).

Концентрация пестицида, равная 0,5 мг/мл, вызывала увеличение синтеза ИУК клетками бактерий (рис. 11, В), о чем свидетельствовал анализ ее содержания через 24 часа культивирования. Относительно контроля уровень продукции ИУК статистически достоверно увеличивался на 105,9116,2%, 138,7144,3% и 166,5116,5% после контакта с ТМТД в течение 1, 2 и 3 часов, соответственно. При анализе содержания ИУК через 48 часов культивирования различия были уже недостоверны.

Действие пестицида в концентрации 1 мг/мл после одночасовой экспозиции также приводило к статистически достоверному увеличению продукции фитогормона клетками азотобактера через 24 часа культивирования на 83,4112,7% (рис. 11, С). После экспозиции в течение 2 и 3 часов количество ИУК составило 154,8+56,1% и 138,3122,1% относительно контроля, но различия оказались недостоверны. Эти данные могут свидетельствовать о более значительном повреждающем действии пестицида в концентрации 1 мг/мл, вызывающем необратимое снижение физиологической активности микроорганизма.

Таким образом, сопоставляя результаты, полученные в экспериментах с действием пестицида и теплового шока на продукцию ИУК клетками азотобактера, мы наблюдаем сходную картину. Так, воздействие температуры (40°С в течение 5 и 15 минут) и ТМТД в концентрации 0,05 мг/мл, не оказывающее влияния на жизнеспособность клеток культуры азотобактера, также не сказывалось на уровне продукции индолил-3-уксусной кислоты. При увеличении дозы воздействия (температура 45°С, экспозиция 15 мин, и 50°С, экспозиция 5 мин, концентрация ТМТД 0,5 мг/мл), приводящей культуру к состоянию стресса, наблюдалось снижение количества жизнеспособных клеток и временная приостановкой роста. Однако после прекращения действия стрессора культура азотобактера характеризовалась ускоренным темпом роста и увеличением уровня продукции ИУК. Более значительные дозы неблагоприятного воздействия (50°С, экспозиция 15 мин, и концентрация ТМТД 1 мг/мл) вызывали снижение количества жизнеспособных клеток в культуре,

не сопровождавшееся, однако, ускорением роста культуры после стресса и увеличением секреции ИУК.

Таким образом, обнаружена взаимосвязь между дозой стрессирующего воздействия (температура и концентрация пестицида) на культуру азотобактера и уровнем продукции ИУК. В последние годы появились работы, в которых секреция внутриклеточных соединений оценивается с позиции реакции, направленной на выживание клетки в неблагоприятных условиях (Пирог и др., 1997; Рощина, Петров, 1997; Николаев, Воронина, 1999). Продуцируемая бактериями ИУК участвует, как свидетельствуют многочисленные литературные данные (Мишустин, 1972, Олюнина, Шабаев, 1996; Кацы, 1997), в формировании ассоциата "бактерии - высшее растение". Создание такого ас-социата при действии неблагоприятных условий внешней среды - это реакция, направленная на выживание.

Выводы

1. На основании ключевых морфо-физиологических и генетических признаков выделено и идентифицировано 20 штаммов бактерий рода Аго^Ьас-Гег, вида Аю!оЬас1ег сИгоососсит. Показана зависимость частоты выделения азотобактера от вида почвы: наибольшая высеваемость установлена для окультуренных почв (84%), для целинных почв она составила 23,5 %.

2. Установлена генетическая неоднородность выделенных штаммов. Обнаружен штамм Лго(оЬас1ег сИгоососсит (штамм № 6), отличающийся уникальным профилем конформационных изоформ однонитевой ДНК гена т/Н.

3. Впервые выявлена обратная зависимость продукции индолил-3-уксусной кислоты от активности роста и уровня азотфиксации штаммов АгоюЬас/ег сИгоососсит, что свидетельствовует об адаптационном значении секреции ИУК в жизнедеятельности азотобактера.

4. Обнаружена гетерогенность штаммов по резистентности к антибиотикам и действию различных концентраций пестицида ТМТД. Выявлены наиболее устойчивые штаммы. Установлено, что резистентность к антибиотикам и пестицидам детерминирована хромосомными генами.

5. Показано, что воздействие стрессирующих доз гипертермии (45°С и 50°С в течение 15 мин и 5 мин, соответственно) и пестицида ТМТД (0,5 мг/мл) на культуру Аго(оЬас(ег сИгоососсит (штамм № 6) сопровождается стимуляцией продукции клетками индолил-3-уксусной кислоты, что взаимосвязано со средообразующими процессами.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 ■ Ладыгина, Г.Н. Использование биопрепаратов для стимуляции роста и подкормки растений / Г.Н. Ладыгина, Л.Н. Олюнина, А.И. Речкин, А.Е. Алексеева // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Эколого-экономические основы формирования агробиогеоценозов». -Н.Новгород, 2002. - С. 89-91.

2. Олюнина, Л.Н. О роли индолилуксусной кислоты в формировании ас-социата «бактерии-высшие растения / Л.Н. Олюнина, В.П. Шабаев, А.Е. Алексеева, Ю.А. Мацкова // Тез. докл. Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков». - Ярославль, 2003. - С. 167-167.

3. Олюнина, Л.Н. Развитие стресс-реакции клеток Azotobacter chroococcum при ответе на тепловой шок / JI.H. Олюнина, Т.А. Гончарова, Ю.Ю. Гущина, А.Е. Алексеева, Ю.А. Мацкова // Тез. докл. съезда физиологов растений России. - Пенза, 2003. - С. 187-187.

4. Ладыгина, Г.Н. Экологический кризис и микробиологические последствия. Угрозы и опасения / Г.Н. Ладыгина, H.A. Новикова, А.Е. Алексеева, H.A. Добротина // Тез докл. III сессии молодежной школы -семинара «Экологическая и промышленная безопасность». - Саров, 2003. - С. 20-21.

5. Алексеева, А.Е. Роль индолил-3-уксусной кислоты в жизнедеятельности Azotobacter chroococcum / А.Е. Алексеева // Тез. докл. XI Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины). - Нижний Новгород, 2004. - С. 198-199.

6. Алексеева, А.Е. Влияние некоторых современных пестицидов (фунгицидов) на жизнеспособность азотфиксирующих бактерий вида Azotobacter chroococcum / А.Е. Алексеева // Тез. докл. VIII международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2004. - С. 75-76.

7. Ладыгина, Г.Н. Актуальные проблемы микробиологии в условиях экологического кризиса / Г.Н. Ладыгина, H.A. Добротина, А.Е. Алексеева // Материалы VIII Всероссийского популяционного семинара «Популяции в пространстве и времени». - Нижний Новгород, 2005. - С. 190-193.

8. Алексеева, А.Е. Физиологическая активность бактерий Azotobacter chroococcum под действием некоторых пестицидов / А.Е. Алексеева // Тез. докл. X Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины). - Нижний Новгород, 2005. - С. 250-251.

Подписано к печати 17.11.2005. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Заказ 1576. Тираж 100.

Типография Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского. Лицензия № 18-0099 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

2 4 4 1 9

РНБ Русский фонд

2006-4 26557

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алексеева, Анна Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологичекая фиксация азота как общепланетарный процесс.

1.1.1. Строение нитрогеназной системы

1.1.2. Регуляция нитрогеназной системы

1.2. Эколого-физиологическая характеристика бактерий рода Azotobacter

1.2.1. Строение и особенности роста азотобактера

1.2.2. Основные физиологические свойства азотобактера.

1.2.3. Влияние факторов внешней среды на характер роста бактерий рода Azotobacter

1.2.4. Характер распространения азотобактера

1.3. Взаимодействие с высшими растениями

1.3.1. Ризосфера как среда обитания

1.3.2. Взаимодействие с высшими растениями

1.4. Спектр биологического действия ИУК.

1.4.1. Фитогормональная функция ИУК

1.4.2. Роль бактериальной индолилуксусной кислоты.

1.4.3. Биосинтез ИУК клетками прокариот

1.5. Механизмы адаптации клеток прокариот к воздействиям внешней среды

1.5.1. Общие механизмы адаптации к неблагоприятным воздействиям

1.5.2. Действие пестицидов на клетки прокариот

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 64 3.1. Выделение штаммов рода Azotobacter

3.2. Идентификация и культуральные признаки выделенных штаммов.

3.3. Генетический анализ.

3.4. Антибиотикорезистентность штаммов Azotobacter chroococcum

3.5. Дозозависимый эффект действия тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) на жизнеспособность клеток штаммов A. chroococcum.

3.6. Активность роста и продукция индолил-3-уксусной кислоты штаммами A. chroococcum

3.7. Действие неблагоприятных факторов на физиологическую активность батерий A. chroococcum

3.7.1. Влияние повышенной температуры на активность роста бактерий A. chroococcum.

3.7.2. Продукция ИУК клетками A. chroococcum после действия повышенных температур

3.7.3. Временнозависимый эффект действия различных концентраций пестицида ТМТД на жизнеспособность и активность роста бактерий A. chroococcum

3.7.4. Воздействие ТМТД на активность продукции ИУК клетками A. chroococcum

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области"

Актуальность проблемы. Микроорганизмам принадлежит ведущая роль в геохимических процессах круговорота биогенных элементов в водных и наземных экосистемах. Эти процессы прямо или косвенно влияют на газовый состав атмосферы Земли. Обеспечение сбалансированной деятельности природных микробных сообществ, несомненно, является ключевым условием поддержания жизни на Земле (Заварзин, 1979; Аристовская, 1985).

Деградация почвенных экосистем, динамическое уменьшение многообразия групп микроорганизмов (редуцентов), снижение не только количества, но и их физиологической активности, нарушение структуры биоценозов и биогеоценозов - последствия антропогенного воздействия (Самсонов, 1987; Использование биологических тестов., 2003). В связи с вышеизложенным возрастает роль физиологически значимых микроорганизмов, в плане регуляции круговорота биогенных элементов (азота), таких как Azotobacter (Громов, Павленко, 1989; Заварзин, Колотилова, 2001).

В биосфере азотобактер осуществляет регуляцию важнейших процессов:

Эволюционно-значимого процесса фиксации молекулярного азота, вовлекая его в биологический круговорот.

Средообразующих - как за счет азотфиксации, так и за счет продукции биологически активных веществ (БАВ): витаминов группы В, гиббереллинов, цитокининов и ауксинов, а также фунгистатического антибиотика азохроомицина (Мишустин, Марьенко, 1965; Умаров, 1982; Шильникова, Серова, 1983; Кравченко и др, 1991; Zahir et al., 2004)

Интерес к азотфиксирующим микроорганизмам, в частности азотобактеру, обусловлен необходимостью перехода от химизации сельского хозяйства к биологизации, что требует современных представлений о физиологическом состоянии, адаптационных возможностях и механизмах штаммов рода Azotobacter.

В настоящее время основной активирующий эффект действия от применения азотобактера в качестве бактериального удобрения связывают не столько с его азотфиксирующей способностью, сколько с продукцией различных биологически активных веществ, в частности индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (Татарова и др., 1965; Siddiqui, Mahmood, 2001; Zahir et al., 2004). До сих пор нет четких представлений о гетерогенности штаммов Azotobacter по активности продукции БАВ, в частности ИУК, и связи различий с другими параметрами физиологической активности штаммов, таких как активность pocTf и интенсивность азотфиксации.

В почве, как среде обитания, микроорганизмы находятся под влиянием биогенных и абиогенных факторов, которые, несомненно, оказывают воздействие на их физиологическую активность, в том числе, на синтез БАВ микроорганизмами. Известно, что ауксины участвуют в развитии защитных реакций растений в ответ на стрессирующее воздействие, в частности тепловой шок (Веселов и др., 1998). В работе М. В. Симко (2002) показано, что снижение интенсивности накопления ИУК может нарушить механизмы адаптации микромицетов-деструкторов к действию различных стрессоров. В отношении роли ИУК, продуцируемой прокариотами, в ответ на неблагоприятное воздействие, сведений в литературе не встречается. К настоящему моменту сложилась концепция, исходя из которой роль продуцируемой микроорганизмами ИУК многообразна, начиная с проявления различных сторон взаимодействия с высшими растениями до организации своей экологической ниши (Мишке, 1988).

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Выделить и идентифицировать штаммы рода Azotobacter из образцов различных типов почв Нижегородской области;

2. Изучить гетерогенность штаммов по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам, выявить генетические различия на основе анализа структуры гена nifH\

3. Провести сравнительный анализ активности роста штаммов Azotobacter и продукции ими ИУК;

4. Исследовать эффект действия экстремальных факторов (температура и пестицид) на жизнеспособность, активность роста и продукцию ИУК клетками A. chroococcum

Научная новизна работы. Выявлено биоразнообразие штаммов азотобактера, выделенных из различных типов почв Нижегородской области на основе анализа генетических, культуральных и биохимических характеристик.

Впервые показаны различия в первичной структуре гена nifH внутри группы микроорганизмов, относящихся к одному виду A. chroococcum.

Впервые проведены наблюдения за изменением уровня продукции ИУК клетками A. chroococcum, свидетельствующие об увеличении ее секреции в условиях стресса.

Положения, выносимые на защиту.

Материалы диссертации изложены на 141 страницах машинописного текста, иллюстрированы 6 таблицами и 20 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 179 источников, из которых 54 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Алексеева, Анна Евгеньевна

выводы

1. На основании ключевых морфо-физиологических и генетических признаков выделено и идентифицировано 20 штаммов бактерий рода Azotobacter, вида Azotobacter chroococcum. Показана зависимость частоты выделения азотобактера от типа почвы: наибольшая высеваемость установлена для окультуренных почв (84%), для целинных почв она составила 23,5 %.

2. Установлена генетическая неоднородность выделенных штаммов. Обнаружен штамм Azotobacter chroococcum (штамм № 6), отличающийся уникальным профилем конформационных изоформ однонитевой ДНК гена nifH.

3. Впервые выявлена обратная зависимость продукции индолил-3-уксусной кислоты от активности роста и уровня азотфиксации штаммов Azotobacter chroococcum, что свидетельствует об адаптационном значении секреции ИУК в жизнедеятельности азотобактера.

5. Показано, что воздействие стрессирующих доз гипертермии (45°С и 50°С в течение 15 мин и 5 мин, соответственно) и пестицида ТМТД (0,5 мг/мл) на культуру Azotobacter chroococcum (штамм № 6) сопровождается стимуляцией продукции клетками индолил-3-уксусной кислоты, что взаимосвязано со средообразующими процессами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии, относящиеся к роду Azotobacter, обладают значительным средообразующим потенциалом, который в первую очередь определяет продукция широкого спектра БАВ. Многочисленные публикации отмечают стимулирующий эффект действия азотфиксирующих микроорганизмов на рост и развитие растений. Кроме того, инокуляция семян активирующими рост микроорганизмами, в частности азотобактером, способствует повышению резистентности к фитопатогенам, а также снижению накопления в растениях ионов тяжелых металлов и радионуклидов (Казарова, Волобуева, 2004; Effect of inoculation with nitrogen fixing bacteria on heavy metals., 1995; Zahir et al., 2004). В работе «Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв» (2003) Н. Б. Градовой с соавт. показано, что в нефтезагрязненных почвах штаммы азотобактера способствуют формированию специфической микрофлоры, осуществляющей процесс активного разложения углеводородов нефти.

В связи с вышесказанным на современном этапе важно иметь информацию о степени присутствия и частоте встречаемости бактерий рода Azotobacter в разных типах почв, а также о биохимической и физиологической активности различных штаммов.

Целью исследования являлась оценка биоразнообразия, выделенных из различных типов почв Нижегородской области, штаммов рода Azotobacter на основании изучения их фенотипических и генотипических признаков, а также изучение изменения физиологической активности (динамики роста и продукции ИУК) после действия неблагоприятных факторов.

Для выделения штаммов азотобактера было собрано 36 образцов почв различных типов: 19 образцов были представлены окультуренными почвами с огородных участков, 17 образцов - целинными почвами различных типов. В ходе работы выделено 20 штаммов азотобактера, из них 16 культур были получены из почв с огородных участков, и только 4 штамма - из неокультуренных почв. Последние относились к следующим типам: чернозем выщелочный, чернозем оподзоленный, темно-серая лесная и серая лесная. Полученные результаты свидетельствовали о достаточно низкой степени распространенности штаммов азотобактера в целинных почвах и согласуются с данными литературы (Мишустин, Шильникова, 1968, Мишустин, 1972; Колешко, 1981). Улучшение условий существования при окультуривании, в первую очередь за счет обогащения органическим субстратом, способствует увеличению популяций азотобактера.

Все штаммы идентифицированы по комплексу ключевых морфо-физиологических признаков согласно определителю бактерий Берджи (1997) и отнесены к виду Azotobacter chroococcum.

Выделение штаммов из почв разных типов послужило обоснованием для установления различий, проявляющихся на уровне фенотипических и генотипических признаков.

Штаммы были проанализированы на наличие различий в культуральных признаках. На плотной среде Эшби 18 штаммов на вторые сутки культивирования образовывали крупные (до 7 мм в диаметре), слизистые, бесцветные колонии. На 5-е сутки их культивирования происходило образование коричневого пигмента. Два штамма отличались по культуральным признакам. У штамма № 6 формировались колонии значительно меньшего размера, правильной округлой формы, мало слизистые, не растекающиеся. На 5-е сутки культивирования клетки образовывали светло-коричневый пигмент. Культура штамма № 10 образовывала плоские, достаточно крупные колонии неправильной округлой формы. Клетки выделяли очень мало слизи. Уже на 3-й сутки культивирования наблюдалось образование коричневого пигмента.

Все исследуемые штаммы были протестированы на наличие специфического для рода Azotobacter фрагмента ДНК nifH гена методом ПЦР. Было установлено, что все выделенные штаммы относятся к роду Azotobacter.

Фрагменты ДНК гена nifli размером 370 пар оснований, полученные методом ПЦР, были исследованы методом конформационного полиморфизма однонитевой ДНК. При сравнительном анализе установлено, что штамм № 6 обладал уникальным профилем электрофоретической подвижности однонитевой ДНК гена riifH. Представленные данные, свидетельствовали о генетической неоднородности диких штаммов A. chroococcum, выделенных из различных почв Нижегородской области.

Для выявления особенностей поведения исследуемых штаммов в естественной среде обитания, богатой продуктами метаболизма почвенной биоты, определяли резистентность к природным антибиотическим препаратам. Характер резистентности отражает общую стратегию взаимоотношений азотобактера с другими микроорганизмами, а также его адаптационные возможности. Штаммы азотобактера характеризовались различной антибиотикорезистентностью. Под действием рифампицина, стрептомицина, канамицина, эритромицина, неомицина, гентамицина наблюдалось подавление роста у всех тестированных штаммов. Не оказывали ингибирующего действия линкомицин и бацитрацин. В отношении других антибиотиков у разных штаммов наблюдалось варьирование чувствительности. Наибольшую устойчивость проявил штамм А. chroococcum № 6. Он был устойчив к девяти антибиотикам. Наименее резистентным оказался штамм № 14, устойчивый только к трем антибиотикам.

Скрининг исследуемых штаммов A. chroococcum показал отсутствие плазмидной ДНК в клетках всех тестированных штаммов, что свидетельствовало о хромосомной локализации детермининант устойчивости штаммов азотобактера к антибиотикам.

При изучении отношения культур азотобактера к присутствию ксенобиотиков обнаружена неоднозначная реакция культур A. chroococcum на пестицид тетраметилтиурамдисульфид (ТМТД), характеризующийся фунгицидной активностью. При концентрации пестицида, равной 0,05 мг/мл, только у 7 штаммов сохранялось 100 % жизнеспособных клеток. У остальных штаммов сохранялось разное число жизнеспособных клеток: от 75,4 % (штамм № 3) до 14,3 % (штамм № 20). Полное подавление жизнеспособности клеток всех штаммов наблюдалось в присутствии пестицида в концентрации 1 мг/мл. Штаммы азотобактера, проявившие наибольшую устойчивость по отношению к ТМТД, также характеризовались высокой степенью резистентности и в отношении антибиотиков. Отсутствие плазмидной ДНК в клетках исследуемых штаммов свидетельствуют о хромосомной локализации не только генов устойчивости к антибиотикам, но и генов, детерминирующих резистентность к пестицидам.

Проведено сравнение активности роста штаммов, выделенных из окультуренных почв, и штаммов, полученных из целинных почв различных типов. Наибольшей активностью роста отличался штамм № 6, выделенный из окультуренной почвы. Остальные культуры характеризовались значительно более слабым накоплением биомассы. Для стимуляции роста в среду культивирования вносили экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) в концентрации 0,5 г/л.

У штамма № 10 на среде Берка с ЭКД наблюдался быстрый прирост биомассы в первые часы культивирования, однако уже к 24 часам роста культура переходила в стационарную фазу роста, и к 48 часам изменения уровня биомассы не происходило. Штаммы № 12, 14, 15 и 20 характеризовались более длительной лаг-фазой по сравнению со штаммами № 6 и № 10. Ростовая динамика штамма №11, выделенного из серой лесной почвы, отличалась очень слабым уровнем накопления биомассы по сравнению со всеми остальными культурами даже при культивировании на среде Берка с добавлением ЭКД.

Различия в активности роста у штаммов выделенных из окультуренных почв и целинных почв могут быть объяснены с точки зрения стратегии их выживания. Условия дефицита питательных веществ, которые наблюдаются при обитании в целинных неокультуренных почвах, способствуют выработке стратегии «экономного» роста. И напротив, наличие достаточного количества питательного субстрата приводит к переключению программы выживания на стратегию «быстрого» роста (Морфологические и физиологические отличия., 2003).

Известно, что многие виды азотфиксаторов, в том числе азотобактер, способны продуцировать биологически активные вещества, в частности ИУК, которая является одним из важнейших гормонов растений (Полевой, 1982; Woodward, Bartel, 2005). В связи с этим, в дальнейшем исследовали уровень продукции ИУК штаммами в сопоставлении с динамикой их роста.

Установлена гетерогенность исследуемых штаммов Azotobacter chroococcum по количеству продуцируемой ИУК. Так, наиболее активными продуцентами ИУК оказались штаммы № 11 и 15, активность роста которых была минимальной по сравнению с остальными культурами. Активно растущие штаммы № 6 и № 10 оказались менее эффективными продуцентами ИУК. Таким образом, впервые выявлена зависимость уровня накопления ИУК от физиологических особенностей каждого штамма микроорганизмов. Более активно растущие штаммы продуцировали меньшее количество фитогормона по сравнению со слабо растущими штаммами азотобактера.

Проведен сравнительный анализ накопления аммиачного азота между быстро растущим штаммом № 6 и медленно растущим штаммом № И. Штамм № 6 характеризовался более высоким уровнем накопления аммиачного азота в сравнении со штаммом № 11. Через 48 часов культивирования количество NH3 в культуральной жидкости штамма № 6 в 7,7 раза превышало количество аммиачного азота, нарабатываемого штаммом №11.

Таким образом, полученные результаты дополняют ранее опубликованные данные о влиянии различных факторов на систему синтеза ИУК и свидетельствуют о связи уровня секреции ИУК с активностью роста культуры микроорганизма и интенсивностью азотфиксации.

На следующем этапе работы изучалось воздействие неблагоприятных факторов (температура и пестицид) на физиологическую активность азотобактера. Показано, что после воздействия температуры 40°С активность роста штамма № 6 не отличалась от контроля (26°С). Не выявлено изменений и в уровне секретируемой ИУК.

При повышении температуры до 45°С ростовая динамика менялась. Если пятиминутное выдерживание клеток при данной температуре не оказывало эффекта на ростовую активность, то 15-тиминутная экспозиция сопровождалась торможением роста клеток в течение одного часа. Отмечено также увеличение содержания ИУК в культуральной жидкости после воздействия температурой 45°С в течение 15 минут.

При пятиминутной экспозиции клеток при температуре 50°С было выявлено сохранение числа клеток на неизменном уровне в течение 3 часов, с последующим постепенным его увеличением. После пятнадцатиминутной экспозиции наблюдалось подавление роста на протяжении всего периода наблюдения. В обоих случаях происходило также увеличение продукции ИУК, однако максимальный уровень ИУК наблюдался после 5 минутной экспозиции.

Динамика роста культуры после действия повышенных температур (5 мин при 50°С и 15 мин при 45°С) свидетельствовала о том, что клетки A. chroococcum (штамм № 6) находились в состоянии стресса, так как именно для стрессовой реакции характерен наблюдавемый ростовой эффект -торможение роста числа клеток, а затем активация роста.

Таким образом, первичная реакция бактерий на стрессирующую температуру - это выброс ИУК во внешнюю среду. Механизм такого выброса не ясен. В литературе отсутствуют данные, касающиеся механизмов транспорта ИУК через бактериальную мембрану.

Исследовали влияние ТМТД на физиологическую активность культуры азотобактера. В присутствии ТМТД в концентрации 0,05 мг/мл изменения числа жизнеспособных клеток не наблюдали. ТМТД в концентрации

0,5 мг/мл и 1 мг/мл вызывал в первый час экспозиции статистически достоверное снижение числа жизнеспособных клеток. Через 2 часа и 3 часа количество жизнеспособных клеток сохранялось на том же уровне.

При пересеве отмытых от пестицида клеток азотобактера на свежую среду было установлено, что после воздействие пестицида в концентрации 0,05 мг/мл изменения динамики роста культуры по сравнению с контролем не происходило. После контакта с пестицидом в концентрации 0,5 мг/мл (1,2 и 3 часа) удельная скорость роста культур была выше по сравнению с контрольной. Повышение удельной скорости происходило за счет сокращения времени генерации и к 48 часам опытные культуры догоняли контрольную по количеству клеток. Культура, подвергавшаяся действию ТМТД в концентрации 1 мг/мл, не обнаружила тенденции к увеличению активности роста после воздействия пестицида, а разница в количестве клеток опытного и контрольного вариантов сохранялась постоянной до конца эксперимента и была равна 40 %. По-видимому, при данной концентрации ТМТД происходило необратимое нарушение развития адаптационных процессов в клетке.

Исходя из представленных результатов, был сделан вывод, что концентрация ТМТД, равная 0,5 мг/мл, во всех экспозициях оказывала стрессирующее воздействие на исследуемую культуру азотобактера, сопровождающееся снижением числа жизнеспособных клеток. Однако при переносе культуры в благоприятные условия наблюдалось повышение активности роста, свидетельствующее о выходе культуры из стрессированного состояния.

Выявлен дифференцированный эффект действия пестицида на уровень продукции ИУК азотобактером. ТМТД в концентрации 0,05 мг/мл не оказывал эффекта на продукцию ИУК.

1-3 часовой контакт с ТМТД в концентрации равной 0,5 мг/мл, вызывала увеличение синтеза ИУК клетками бактерий более чем в два раза.

Однако, уже через 48 часов после действия ТМТД содержание ИУК приходило к контрольным значениям.

Действие пестицида в концентрации 1 мг/мл приводило к статистически достоверному увеличению продукции фитогормона клетками азотобактера только после одночасовой экспозиции. Экспозиция в течение 2 и 3 часов не вызывала повышение концентрации ИУК. Эти данные могут свидетельствовать о более значительном повреждающем действии пестицида в концентрации 1 мг/мл, вызывающем необратимое снижение физиологической активности микроорганизма.

Таким образом, обнаружена взаимосвязь между дозой неблагоприятного воздействия (температура и концентрация ТМТД) на культуру азотобактера и уровнем продукции ИУК. Доза воздействия (температура 45°С, экспозиция 15 мин, и 50°С, экспозиция 5 мин, концентрация ТМТД 0,5 мг/мл), приводящая культуру к состоянию стресса, вызывает увеличение синтеза ИУК клетками азотобактера. Полученные данные свидетельствуют об участии ИУК в реакции культуры микроорганизма на стрессирующее воздействие.

В условиях ризосферы подобная реакция на действие стрессирующего фактора может способствовать созданию зон аттрагирования на корнях растения, в результате в растении формируется направленный транспорт метаболитов, что способствует разрастанию корневой системы и, в конечном итоге, формированию взаимовыгодного ассоциата микроорганизм-растение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеева, Анна Евгеньевна, Нижний Новгород

1. Авакян, 3. А. Токсичность тяжелых металлов для микроорганизмов / 3. А. Авакян // Итоги Науки и техники ВИНИТИ. Сер. Микробиология. - 1973. - Т. 2. - С. 5 - 45.

2. Авакян, 3. А. Сравнительная токсичность тяжелых металлов для некоторых микроорганизмов / 3. А. Авакян // Микробиология. 1967. - Т. 36, вып. З.-С. 446-451.

3. Антибиотическая активность и гетерогенность популяции Azotobacter chroococcum / И. Н. Позмогова, Г. Л. Герасимова, Н. В. Садовова, М. П. Ховрычев // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. - Т. 24, № 2.-С. 182- 186.

4. Араратян, Л. А. Цитогенетические эффекты фитогормонов / Л. А. Араратян. Ереван, 1989. - 136 с.

5. Аристовская, Т. В. Геохимическая деятельность микроорганизмов как фактор почвенного плодородия в условиях разных экосистем / Т. В. Аристовская // Успехи микробологии. 1985. - вып. 20. - С. 154- 174.

6. Бершова, О. И. Микроэлементы и почвенные микроорганизмы / О. И. Бершова. Киев: Наукова Думка, 1967. - 204 с.

7. Биологическая фиксация азота в лесных биогеоценозах / С. В. Егорова, В. А. Лаврова, А. А. Петров-Спиридонов и др. // Азотфиксация в лесных биогеоценозах. М.: Мир, 1989 - С. 5 - 42.

8. Блинков, Г. К. Азотобактер и его значение для высших растений / Г. К. Блинков. Томск: Изд-во Томского ун-та, 1959. - 123 с.

9. Воронин, А. М. Генетические аспекты деградации бактериями ксенобиотиков / А. М. Воронин, Г. К. Скрябин // Успехи микробиологии. -1985.-вып. 20.-С. 39-60.

10. Веселов, А. П. Изменение в содержании фитогормонов в ответной реакции растений при тепловом шоке и в период его последствий /

11. А. П. Веселов, В. П. Лобов, Л. Н. Олюнина // Физиология растений. 1998. -Т. 45, №5.-С. 709-715.

12. Виноградский, С. Н. Микробиология почвы (проблемы и методы) / С. Н. Виноградский. М.: АН СССР, 1952. - 300 с.

13. Влияние азотобактера на прорастание семян огурцов / А. Ф. Антипчук, Р. М. Канцелярук, Н. Н. Скочинская и др. // Микробиологический журнал. 1985. - Т. 47, № 2. - С. 19 - 23.

14. Влияние линурона и прометрина на биологическую активность почвы / Ю. В. Круглов, Н. Б. Герм, А. В. Бешанов и др. // Актуальные проблемы сельскохозяйственной микробиологии. Л., 1974. - С. 48 - 53.

15. Воробьева, Л. И. Антистрессовое действие белковой фракции Propionibacterium freudenreichii / Л. И. Воробьева, Е. Ю. Ходжаев, Г. М. Пономарева // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 4. - С. 449 - 454.

16. Гамбург, К. 3. Метаболизм ауксина и его действие на культуры изолированных клеток растений / К. 3. Гамбург. Иркутск: Наука, 1976. -130 с.

17. Гамбург, К. 3. Биохимия ауксина и его действие на клетки растений / К. 3. Гамбург. Новосибирск: Наука, 1990. - 271 с.

18. Ганева, Г. И. Физиологическая активность ауксина в анеуплоидных линиях пшеницы / Г. И. Ганева, Е. В. Зозикова, А. А. Дрянова // Физиология растений. 2000. - Т. 47, № 2. - С. 236 - 239.

19. Гиляров, М. С. Жизнь в почве / М. С. Гиляров, Д. А. Криволуцкий. М.: Молодая гвардия, 1985. - 192 с.

20. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002. - С. 306 - 330.

21. Головлев, Е. Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е. Л. Головлев // Микробиология. 1999.-Т. 68, №5.-С. 623-631.

22. Головлева, Jl. А. Деградация пестицидов микроорганизмами / JI. А. Головлева // Микробиология окружающей среды. Алма-Ата: Изд-во «Наука» Казахской ССР, 1980. - С. 41 - 52.

23. Готтшалк, Г. Д. Метаболизм бактерий / Г. Д. Готтшалк. М.: Мир, 1982.-С. 280-285.

24. Громов, Б. В. Экология бактерий / Б. В. Громов, Г. В. Павленко. -Л.: ЛГУ, 1989.-248 с.

25. Дарзниек, Ю. О. О скорости размножения клеток азотобактера / О. Ю. Дарзниек // Микробиология. 1982. - Т. 30, вып. 6. - С. 1042 - 1044.

26. Дерфлинг, К. Гормоны растений / К. Дерфлинг. М.: Мир, 1985. -304 с.

27. Догонадзе, Ю. Н. Действие гиббереллина и ауксина на образование абсцизовой кислоты и этилена в точках роста клубней картофеля в покое и при прорастании / Ю. Н. Догонадзе // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - Т. 36, № 5. - С. 588 - 591.

28. Действие пестицидов на жизнеспособность микроорганизмов / Н. Н. Карлина, Н. А. Вакараш, В. А. Кодрян, С. Г. Нагаре // Взаимодействие пестицидов с микроорганизмами. Кишинев: Штиница, 1984. - С. 18-30.

29. Доронина, Н. В. Новые данные о способности метилобактерий и метанотрофов синтезировать ауксины / Н. В. Доронина, Е. Г. Иванова, Ю. А. Троценко//Микробиология. 2002. - Т. 71, № 1.-С. 130- 132.

30. Емнова, Е. Е. Механизм антимикробного действия пестицидов / Е. Е. Емнова, В. А. Кодрян // Взаимодействие пестицидов с микроорганизмами. Кишинев: Штиница, 1984. - С. 31 - 47.

31. Жолкевич, В. Н. Рост листьев Cucumis sativus L. и содержание в них фитогормонов при почвенной засухе / В. Н. Жолкевич, В. Н. Пустовойтова // Физиология растений. 1993. - Т. 40, № 4. - С. 676 - 680.

32. Заварзин, Г. А. Микроорганизмы и состав атмосферы / Г. А. Заварзин // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М.: Наука, 1979.-С. 5-35.

33. Заварзин, Г. А. Введение в природоведческую микробиологию / Г. А. Заварзин, Н. Н. Колотилова. М.: Университет, 2001. - 256 с.

34. Зайцева, Г. Н. Биохимия азотобактера / Г. Н. Зайцева. М.: Наука, 1965.-304 с.

35. Звягинцев, Д. Г. Почва и микроорганизмы / Д. Г. Звягинцев. М.: МГУ, 1987.-256 с.

36. Ибрахим-Заде, X. Изменения содержания ИУК, фенольных соединений, пероксидазы, ИУК-оксидазы и полифенолоксидазы при зацветании шафрана / X. Ибрагим-Заде, П. Абришаллхи // Физиология растений. 2001. - Т. 48, № 2. - С. 223 - 228.

37. Иванова, Е. Г. Аэробные метилобактерии синтезируют ауксин / Е. Г. Иванова, Н. В. Доронина, Ю. А. Троценко // Микробиология. 2001. -Т. 70, №4.-С. 452-458.

38. Использование биологических тестов при оценке загрязнения почв и сельскохозяйственной продукции свинцом / В. И. Савич, А. М. Куликов, А. А. Валькова и др. // Изв. ТСХА. 2003. - Вып. 1. - С. 21 - 26.

39. Исследование структуры Mo-Fe-кофактора из Mo-Fe-белка азотобактера. Расположение на макромолекуле Mo-Fe-белка и аминокислотный анализ / И. 3. Мицова, А. Ю. Скрипкин, Р. И. Гвоздев и др. // Изв. АН СССР. Сер. Биологическая. 1981. - № 2. - С. 316 - 318.

40. Камнев, А. А. Физико-химические и экологические аспекты взаимодействия ИУК с железом (III) / А. А. Камнев, Ю. Д. Перфильев // Вестник московского университета. Сер. Химия. 2000. - Т. 41, № 3. - С. 207 -210.

41. Казарова, Т. М. Роль интродуцируемых бактериальных ассоциаций в ризоценозе пшеницы на почве с повышенным содержанием Zn / Т. М. Казарова, В. Ф. Волобуева // Изв. ТСХА. 2004. - Вып. 4. - С. 74 - 80.

42. Капивец, В.И. Бактериальная микрофлора протравленных семян сахарной свеклы / И.В. Капивец, И.Н. Пищур // Микробиология. 2001. - т. 70, №3.-С. 370-373.

43. Кацы, Е. И. Участие ауксинов в регуляции экспрессии генов бактерий и растений / Е. И. Кацы // Генетика. 1997. - Т. 33, № 5. - С. 565 -576.

44. Кацы, Е. И. Генетико-биохимические и экологические аспекты подвижности и хемотаксиса у фитопатогенных, симбиотических и ассоциированных с растениями бактерий / Е. И. Кацы // Успехи современной биологии. 1996. - Вып. 5. - С. 579 - 593.

45. Кефели, Ф. Н. Природные ингибиторы роста и фитогормоны / Ф. Н. Кефели. М.: Наука, 1974. - 253 с.

46. Кефели, Ф. Н. Природные ингибиторы роста / Ф. Н. Кефели // Физиология растений. 1997. - Т. 44, №3. - С. 927 - 929.

47. Козыровская, Н. А. Азотфиксирующие виды Klebsiella выделяют индолщ-3-уксусную кислоту / Н. А. Козыровская, В. JI. Макитрук, Э. Рукдашел // Биополимеры и клетка. 1990. - Т. 6, № 6. - С.93 - 95.

48. Колешко, О. И. Азотфиксирующие бактерии (физиология развития) / О. И. Колешко. Минск: Изд-во БГУ, 1981. - 111 с.

49. Кравченко, JI. В. Возможность биосинтеза ауксинов ассоциативными азотфиксаторами в ризосфере пшеницы / JI. В. Кравченко, А. В. Боровков, 3. Пшикрил // Микробиология. 1991. - Т. 60, № 1. - С. 55 -59.

50. Кравченко, J1. В. Использование триптофана корневых экзометаболитов при биосинтезе индолил-3 -уксусной кислоты ассоциативными бактериями / JI. В. Кравченко, Е. И. Леонова // Микробиология. 1993. - Т. 62, вып. 3. - С. 453 - 459.

51. Красильников, Н. А. Микроорганизмы почвы и высшие растения / Н. А. Красильников. М.: Изд-во АН СССР, 1958. - 493 с.

52. Кретович, В. JI. усвоение и метаболизм азота у растений / В. Л. Кретович. М.: Наука, 1987. - 483 с.

53. Кретович, В. Л. Обмен азота в растениях / В. Л. Кретович. М.: Наука, 1972.-342 с.

54. Кузнецова, Е. В. Доказательство участия гена trp из Agrobacterium tumifaciens в ауксин независимом росте трансформированных клеток моркови / Е. В. Кузнецова// Физиология растений. 1998. - Т. 45, № 5.-С. 716-724.

55. Куринный, А. И. Исследование пестицидов как мутагенов внешней среды / А. И. Куринный, М. А. Пилинская. Киев: Наукова думка, 1976.- 116 с.

56. Львов, Н. П. Регуляция активности нитрогеназы у микроорганизмов / Н. П. Львов, Н. С. Сергеев, В. Л. Кретович // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. 1976. - № 4. - С. 541 - 545.

57. Максимова, Н. П. Регуляция биосинтеза ароматических аминокислот у облигатных метилотрофных бактерий Methilobacillus mucogenes М75 / Н. П. Максимова, Е. В. Доброжнецкая, Ю. К. Фомичев // Известия РАН. Сер. Биологическая. 2000. - № 4. - С. 428 - 436.

58. Матвеева, Т. В. Опухолеобразование у растений / Т. В. Матвеева, Л. А. Лутова, Ю. Нестер // Генетика. 2001. - Т. 37, № 9. - С. 1188 - 1197.

59. Медведев, С. С. Физиологические основы полярности растений / С. С. Медведев. -С.Пб.: Калька, 1996. 159 с.

60. Мельников, Н. Н. Пестициды и окружающая среда / Н. Н. Мельников, А. И. Волков, О. А. Короткова. М.:Наука, 1977. - 233 с.

61. Мельников, Н. Н. Пестициды / Н. Н. Мельников. М.-.Наука, 1987.- 712 с.

62. Мельников, Н. Н. Современная ситуация с применением пестицидов / Н. Н. Мельников // Химическая промышленность. 1994. - С. 14-20.

63. Меркис, А. И. Ауксины и рост растений / А. И. Меркис. -Вильнюс: Москалас, 1982. 200 с.

64. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта. М.: Мир, 1984.-Т. 2.-С. 136- 139.

65. Мишке, И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве / И. В. Мишке. Рига: Зинатне, 1988. - 152 с.

66. Мишке, И. В. К вопросу о связи микроэлементов с ауксиновым обменом некоторых эпифитных микроорганизмов / И. В. Мишке // Растения и микроорганизмы. Рига: Зинатне, 1970. - С. 43 - 54.

67. Мишустин, Е. Н. Фиксация молекулярного азота микроорганизмами / Е. Н. Мишустин, Т. А. Калининская, Н. М. Шемаханова // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1973. - № 6. - С. 779 - 795.

68. Мишустин, Е. Н. Влияние культуры Azotobacter chroococcum на урожай сельскохозяйственных растений. / Е. Н. Мишустин, В. Г. Марьенко // Микробиология. 1965. - Т. 36, вып. 5. - С. 863 - 867.

69. Мишустин, Е.Н. Санитарная микробиология почвы / Е. Н. Мишустин, М. И. Перцовская, В. А. Горбов. М.: Наука, 1979. - 304 с.

70. Мишустин, Е. Н. Ассоциации почвенных микроорганизмов / Е. Н. Мишустин. М.: Наука, 1975. - 108 с.

71. Мишустин, Е. Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия / Е. Н. Мишустин. М.: Наука, 1972. - 344 с.

72. Мишустин, Е. Н. Биологическая фиксация атмосферного азота / Е. Н. Мишустин, В. К. Шильникова. М.: Наука, 1968. - 532 с.

73. Мишустин, Е. Н. Круговорот азота и его соединений в природе / Е. Н. Мишустин // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. -М.: Наука, 1972.-С. 68-91.

74. Мишустин, Н. А. Микробиология /Н. А. Мишустин, Г. Н. Емцев. М.: Агропромиздат, 1987. - С. 155 - 366.

75. Молибдокофакторы молибенсодержащих белков / Н. П. Львов, 3. А. Аликулов, И. А. Кильдибеков, В. Л. Кретович // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. 1981. - № 2. - С. 219 - 236.

76. Мордухова, Е. А. Варианты ризосферных бактерий рода Pseudomonas с увеличенным уровнем секреции фитогормона ИУК / Е. А. Мордухова, А. К. Дубейковский, В. В. Кочетков // Генетика. 1993. - Т. 29, № 9. - С. 63 - 69.

77. Морфологические и физиологические отличия быстро и медленно растущих клеток Escherichia coli / Г. В. Черепнев, Ю. В. Абреимова, Г. Ю. Яковлева, Б. М. Куриненко // Микробиология. 2003. - Т. 72, №2.-С. 277-278.

78. Муронец, Е. М. Синтез индолилуксусной кислоты сапрофитной ассоциативной бактерией Agrobacterium radiobacter / Е. М. Муронец // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 4. - С. 506 - 513.

79. Николаев, Ю. А. Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов / Ю. А. Николаев, Н. А. Воронина // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 1. - С. 45 - 50.

80. Николаев, Ю. А. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluorescens / Ю. А. Николаев, Дж. И. Проссер, Н. С. Паников // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 5. - С. 629 - 635.

81. Новикова, Н. А. Детекция ротовирусов человека с использованием электрофоретического анализа нуклеиновых кислот (методические рекомендации) / Н. А. Новикова, Н. В. Епифанова. Нижний Новгород, 1994.-С. 11.

82. Олюнина, Л. Н. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста / Л. Н.

83. Олюнина, В. П. Шабаев // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 6. - С. 813 -817.

84. Определитель бактерий Берджи / под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снитаи др. -М.: Мир, 1997.-Т. 1.-С. 79-80.

85. Отношение микроорганизмов к пестицидам / А. Б. Бызов, B.C. Гузев, Н. С. Паников и др. // Микроорганизмы и охрана почв. М: Изд-во МГУ, 1989.-С. 86- 128.

86. Пейве, Я. В. Роль микроэлементов в симбиотической азотфиксации /Я. В. Пейве // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. 1970. - № 2.-С. 238-245.

87. Полевой, В. В. Фитогормоны / В. В. Полевой. Д.: ЛГУ, 1982.248 с.

88. Полевой, В. В. Физиология растений / В. В. Полевой. М.: Высшая школа, 1989. - 464 с.

89. Полевой, В. В. Механизм действия ауксина и его роль в системах регуляции и интеграции у растений / В. В. Полевой // Вестник Санкт-Петербургского университета. 1998. - Сер. 3. - Вып. 2. - № 10. - С. 34 - 40.

90. Полевой, В. В. Физиология роста и развития растений / В. В. Полевой, Т. С. Саламатова. Л.: Наука, 1991. - 240 с.

91. Практикум по микробиологии / под ред. Н. С. Егорова. М.: МГУ, 1976.-С. 90-97.

92. Прокофьев, А. А. Динамика содержания свободной ИУК в развивающихся семенах подсолнечника / А. А. Прокофьев, Л. П. Жданова, Т. Е. Карягина // Физиология растений. 1985. - Т. 32, Вып. 1. - С. 138-142.

93. Пузина, Т. И. Влияние ауксина на темп роста клубней картофеля // Тезисы докладов IV-й Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений». М, 1997. - 117 с.

94. Пузина, Т. И. Динамика индолилуксусной кислоты в органах картофеля на разных этапах онтогенеза и ее роль в регуляции роста клубня /

95. Т. И. Лузина, И. Г. Кириллова, Н. И. Якушева // Известия РАН. Сер. Биологическая. 2000. - № 2. - С. 170 - 177.

96. Ратнер, Е. И. Молибден проблема биологического азота в земледелии / Е. И. Ратнер // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. 1964. - № 2.-С. 223-243.

97. Регуляция внутриклеточной концентрации низкомолекулярных веществ у бактерий / В. К. Плакунов, И. М. Волкова, Ж. Д. Лебедева и др. // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1985. - № 5. - С. 715 - 721.

98. Сабельникова, В. И. Биологически активные вещества клубеньковых бактерий / В. И. Сабельникова. М.: Агропромиздат, 1991. — 147с.

99. Салахетдинова, О. Я. Топологические изменения ДНК как отражение адаптации Е. coli к окислительному стрессу в условиях голодания по глюкозе и при переходе ее к росту / О. Я. Салахетдинова // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 1. - С. 70 - 74.

100. Самсонов, С. К. Невидимые земледельцы / С. К. Самсонов. М.: Мысль, 1987.- 174 с.

101. Самсонов, С. К. В союзе с микробами / С. К. Самсонов. М.: Знание, 1990.-64 с.

102. Симко, М. В. Скрининг экологически безопасных средств защиты ПВХ-материалов от биоповреждений микромицетами на основе изучения продукции индолил-3-уксусной кислоты: Автореф. Дисс.канд. биол. наук 03.00.16/М. В. Симко. -Н. Новгород, 2002.-24 с.

103. Синтез фитогормона индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas / Е. А. Мордухова, Н. П. Скворцова, В. В. Кочетков и др. // Микробиология. 1991. - Т. 60, вып. 3. - С. 494 - 499.

104. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот / А. И. Марусина, Е. С. Булыгина, Б. Б. Кузнецов и др. // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 1. - С. 86 -91.

105. Татарова, Н. К. О природе действия азотобактера на высшие растения / Н. К. Татарова, Е. Н. Мишустин, В. Г. Марьенко // Изв. АН СССР. Сер. биологическая. 1975. - № 4. - С. 565 - 569.

106. Ткаченко, А. Г. Роль путресцина и энергетического состояния Е. coli в регуляции топологии ДНК при адаптации к окислительному стрессу / А. Г. Ткаченко, М. Р. Пшеничнов // Микробиология. 1999. - Т. 68, № 1. - С. 27-32.

107. Ткаченко, А. Г. Роль путресцина и калия в адаптации E.coli к голоданию по аммонию / А. Г. Ткаченко, О. Я. Салахетдинова, М. Р. Пшеничнов // Микробиология. 1996. - Т. 66, № 6. - С. 740 - 744.

108. Ткаченко, А. Г. Роль путресцина в регуляции экспрессии генов адаптации Escherichia coli к окислительному стрессу / А. Г. Ткаченко, J1. Ю. Нестерова, М. Р. Пшеничнов // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 2. - С. 168 - 173.

109. Ткаченко, А. Г. Путресцин как фактор защиты Escherichia coli от окислительного стресса / А. Г. Ткаченко, М. Р. Пшеничнов, JI. Ю. Нестерова // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 4. - С. 487 - 494.

110. Троценко, Ю. А. Аэробные метилотрофные бактерии как фитосимбионты / Ю. А. Троценко, Е. Г.Иванова, Н. В. Доронина // Микробиология. 2001. - Т. 70, № 6. - С. 725 - 736.

111. Тягны-Радно, М. Г. Образование аминокислот микроорганизмами в культуральной жидкости и почве / М. Г. Тягны-Радно // Микробиология. -1966.-Т. 35, вып. 6.-С. 1028- 1032.

112. Умаров, М. М. Значение несимбиотической азотфиксации в балансе азота в почве / М. М. Умаров // Изв. АН СССР. Сер. биологическая.1982.-№ 1.-С. 92-105.

113. Федоров, М. В. Биологическая фиксация азота атмосферы. -М.:Сельхозгиз, 1952. 345 с.

114. Федоров, М. В. Микробиология. М.: Изд-во с/х литературы,1983.-С. 304-322.

115. Федорова, Е. Э. Метаболизм ИУК при установлении симбиоза между Phaseolus vulgaris и Rhizobium phaseoli / Е. Э. Федорова // Физиология растений. 2000. - Т. 48, № 2. - С. 231 - 235.

116. Федорова, Е. Э. Фитогормоны в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений / Е. Э. Федорова // Физиология и биохимия культурных растений. 1991.-Т. 23, вып. 5.-С. 426-428.

117. Феофилова, Е. П. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля / Е. П. Феофилова // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 5.-С. 606-611.

118. Феофилова, Е. П. Термофилия мицелиальных грибов с позиций биохимической адаптации к температурному стрессу (обзор) / Е. П. Феофилова, В. М. Терешина // Прикладная биохимия и микробиология. -1999.-Т. 35, №5-С. 546-556.

119. Филимонова, А. Е. Способность продуцировать индолил-3-уксусную кислоту фитопатогенами / А. Е. Филимонова // Прикладная биохимия и микробиология. 1987. - Т. 23, № 4. - С. 431 - 442.

120. Хмель, И. А. Рост и азотфиксация A. vinelandii в условиях различной аэрации / и. А. Хмель, К. Н. Габинская, Н. Д. Иерусалимский // Микробиология. 1965. - Т. 36, вып. 4. - С. 689 - 693.

121. Холмецкая, М. О. Выявление индолил-3-ацетамидного пути биосинтеза ауксина у фитопатогенных и сапрофитных штаммов бактерий из различных таксономических групп / М. О. Холмецкая // Докл. АН Беларусь. 1998. - Т. 42, № 3. - С. 91 - 95.

122. Чернин, Jl. С. Плазмидные гены фитогормонов и их роль в онкогенезе растений /Л. С. Чернин, И. Д. Авдиенко // Молекулярная биология. 1985. - Т. 19, вып. 4. - С. 869 - 887.

123. Шарма, П. К. Влияние акцепторов аминогрупп на образование азотобактером индолилуксусной кислоты из триптофана / П. К. Шарма, В. П. Чахал // Микробиология. 1986. - Т. 55, № 6. - С. 1041 - 1043.

124. Шильникова, В. К. Микроорганизмы азотонакопители на службе растений / В. К. Шильникова, Е. М. Серова. М.: Наука, 1983. - 150 с.

125. Шлегель, Г. Микробиология / Г. Шлегель. М.: Мир, 1987. - 403с.

126. Abd-Alla Mochamed, Н. Utilization of some phenolic compounds by A. chroococcum and their effect on growth and nitrogenase activity / H. Abd-Alla Mochamed // J. Microbiology. 1994. - Vol. 10, № 3. - P. 273 - 278.

127. Abd-el-Malek, Y. Association between Azotobacter and other soil bacteria and its effect on nitrogen fixation (Abstract) / Y. Abd-el-Malek, I. Hosny, В. T. Shawky // Zentralbl. Bakteriol. Naturwiss. 1979. - Vol. 134, № 5. - P. 381 -389.

128. Aquilanti, L. Comparison of different strategies for isolation and preliminary identication of Azotobacter from soil samples / L. Aquilanti, F. Favilli, F. Clementi // Soil Biol. Biochem. 2004. - Vol. 4 - P. 345 - 354.

129. Antipchuk, A. F. Species and strain sensitivity of diasotrophs to heavy metals (Abstract) / A. F. Antipchuk, V. N. Rangelova, E. V. Tantsiurenko // Mikrobiol Z. 2002. - Vol. 64, № 3. - P. 44 - 51.

130. Asghar, H. N. Relationships between in vitro production of auxins by rhizobacteria and their growth-promoting activities in Brassica juncea L. / H. N. Asghar, Z. A. Zahir, M. Arshad I I Biol. Fertil. Soil. 2002. - Vol. 35, № 4. - P. 231 -237.

131. Burris, R. H. Nitrogenases / R. H. Burris // J. Biol. Chem. 1991. -Vol. 266, № 15.-P. 9339-9342.

132. Chemical analysis of ecological materials / S. E. Allen, H. M. Grimshaw, J. A. Parkinson, C. Quarmby. London: Blackwell Scientific Publications, 1974.-P. 184-206.

133. Dalton, H. Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture / H. Dalton, J. R. Postgate // J. Gen. Microbiol. 1969. - Vol. 56, №3.-P. 307-319.

134. Datta, C., Production of indoleacetic acid in root nodules and culture by a Rhizobium species from root nodules of the fodder legume Melilotus alba DESK / Datta C., P. S. Basu // Acta Biotechnol. 1998. - Vol. 18, № 1. - P. 53 -62.

135. Das, A. C. Soil application of insecticides influences microorganisms and plant nutrients / A. C. Das, D. Mukherjee // Appl. Soil Ecol. 2000. - Vol. 14. -P. 55 -62.

136. Diazotrophs and their effect on wheat / M. Govedarica, N. Milosevic, M. Jarak, D. Milosev // Proc. of 10th Inter. Congr. on Nitrogen Fixation, St. Petersburg, Russia, 28 May 3 June, 1995. - Dordrescht; Boston; London, 1995. -P. 758.

137. Effect of benzidine and benzidine analogues on the growth and nitrigenase activity of Azotobacter I C. Pozo, M. V. Martinez-Toledo, V. Salmeron et al. // Appl. Soil Ecol.-2000.-Vol. 14.-P. 183- 190.

138. Effect of herbicides on nitrogen fixation (C2H2 reduction) associated with rice rhizosphere / G. K. Patnaik, P. K. Kanungo, В. T. S. Moorthy et al. // Chemosphere. 1995. - Vol. 30, № 2. - P. 339 - 343.

139. Effect of pesticides on microbial biomass of flooded soil / A. M. Rath, B. Ramakrishnan, A. K. Rath et al. // Chemosphere. 1998. - Vol. 37, № 4. - P. 661 -671.

140. Effect of the herbicide simazine on vitamin production by Azotobacter chroococcum and Azotobacter vinelandii / R. Murcia, B. Rodelas, V. Salmeron et al. // Appl. Soil Ecol. 1997. - Vol. 4. - P. 187 - 193.

141. Forlani, G. Root colonization efficiency, plant-growth-promoting and potentially related propeties in plant-associated bacteria / G. Forlani // J. Genet, and Dreed. 1995. - Vol. 48, № 4. - P. 343 - 352.

142. Furukawa, T. Increased production of IAA by Rhizoctonia solani is induced culture filtrate from rice suspension cultures / T. Furukawa, K. Syono // Plant and Cell Physiol. 1998. - Vol. 39, № 1. - P. 43 - 48.

143. Fujita, K. Singl-strand conformational polymorfism / K. Fujita, J. Silver // PCR primer a laboratory manual. CSHL PRESS. - 1995. - P. 249 - 255.

144. Halbleib, С. M. Regulation of biological nitrogen fixation / С. M. Halbleib, P. W. Ludden // J. Nutr. 2000. - Vol. 130. - P. 1081 - 1084.

145. Influence of the insecticides profenofos and diazinon on the microbial activities of Azospirillum brasilense / F. Gomez, M. V. Martinez-Toledo, V. Salmeron et al. // Chemosphere. 1999. - Vol. 39, № 6. - P. 945 - 957.

146. Influence of Rhizobium/Azotobacter and Rhizobium/Azospirillum combined inoculation on mineral composition of faba bean (Vicia faba L.) / B. Rodelas, J. Gonzalez-Lopez, M. V. Martinez-Toledo et al. // Biol. Fertil. Soils. -1999.-Vol. 29.-P. 165- 169.

147. Kanungo, P. K. Influence of repeated applications of carbofuran on nitrogenase activity and nitrogen-fixing bacteria associated with rhizosphere of tropical rice / P. K. Kanungo, Т. K. Adhya, V. R. Rao // Chemosphere. 1995. -Vol. 31, №5.-P. 3249-3257.

148. Kennedy, I. R. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop-farming system: can their potential for plant growth promotion be better exploited? /1. R.

149. Kennedy, А. Т. M. A. Choudhury, M. L. Kecskes // Soil Biol. Biochem. 2004. www.elsiver.com/locate/siolbio.

150. Lee, M. Effect of some culture conditions on the production of indolil-3-acetic acid and gibberellin-like substuns by Azotobacter vinelandii / M. Lee, C. Breckenzidge, R. Knowles // Can. J. Microbiol. 1983. - Vol. 29, № 8. - P. 916 -923.

151. Lukin, S. M. The effectiveness of preparations of associative nitrogen-fixing bacteria on potato / S. M. Lukin, G. V. Simacov, A. M. Morosov // Proc. of

152. Oth Inter. Congr. on Nitrogen Fixation, St. Petersburg, Russia, 28 May 3 June, 1995. - Dordrescht; Boston; London, 1995. - P. 768.

153. Maia, M. Plasmids of Azotobacter vinelandii / M. Maia, J. M. Sanchez, G. R. Vela // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170, № 4. - P. 1984 - 1985.

154. Metabolite gene regulation of the L-arabinose operon in Escherichia coli with indolacetic acid and other indole derivatives / E. L. Kline, C. S. Brown, V. Bankaitis et al. // PNAS. 1980. - Vol. 77, № 4. - P. 1768 - 1772.

155. Molecular analysis of diazotroph diversity in the rhizosphere of the smooth cordgrass, Spatina alterniflora / C. R. Lovell, Y. M. Picento, J. M. Quattro, С. E. Bagvell // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66, № 9. - P. 3814 -3822.

156. New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil / H. Biirgmann, F. Widmer, W. V. Sigler, J. Zeyer // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - Vol. 70, № 1. - P. 240 - 247.

157. Normeneli, J. Rethinking auxin biosynthesis and metabolism / J. Normeneli, S. Cohen // Plant Physiol. 1995. - Vol. 107, № 2. - P. 323 - 329.

158. Occurrence of multiple antibiotic resistance in Azotobacter chroococcum (Abstract) / S. S. Sindhu, V. Grover, N. Narula, K. Lakshminarayana

159. Zenralbl. Mikrobiol. 1989. - Vol. 144, № 2. - P. 97 - 101.

160. Ohkuma, M. Phylogenetic diversity of nitrigen fixation genes in the symbiotic microbial community in the gut of diverse termites / M. Ohkuma, S.

161. Noda, Т. Kudo // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, № 11. - P. 4926 -4934.

162. Pandey, S. Total bacterial and fungal population after chorpyrifos and quinalphos treatment in groundnut {Arachis hypogaea L.) soil / S. Pandey, D. K. Singh // Chemosphere. 2004. - Vol. 55. - P. 197 - 205.

163. Physiological Diversity of the rhizosphere diazotroph assemblages of selected salt marsh grasses / С. E. Bagwell, Y. M. Picento, A. Ashburne-Lucas C. R. Lovell // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, № 11. - P. 4276 - 4282.

164. Pricrill, L. Auxin formation by rhizosphere bacteria's factor of root growth / L. Pricrill, V. Vuncura, M. Wurst // Plants. 1985. - Vol. 23, № 2. - P. 159- 163.

165. Production of B-group vitamins by two Azotobacter strains with phenolic compounds as sole carbon source under diazotrophic and adiazotrophic conditions / J. J. Revillas, B. Rodelas, C. Pozo et al. // J. Appl. Microbiol. 2000. -Vol. 89.-P. 486-493.

166. Remarkable N2-fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifH gene sequence / T. Ueda, Y. Suga, N. Yahiro, T. Matsuguchi // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, № 5. - P. 1414 - 1417.

167. Response of Faba bean (Vicia faba L.) to combined inoculation with Azotobacter and Rhizobium leguminosarum bv. viceae / B. Rodelas, J. Gonzalez-Lopez, C. Pozo et al. // Appl. Soil Ecol. 1999. - Vol. 12. - P. 51 - 59.

168. Root exudates of Zea mays and production of auxine, gibberellins and cytokinins by Azotobacter chroococcum / M. V. Martines-Toledo, T. Rubia, S. Moreno, S. Gonzalez-Lopez // Plant and Soil. 1988. - Vol. 110, № 1. - P. 149 -152.

169. Rosch, С. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil / C. Rosch, A. Mergel, H. Bothe // Appl. Environ. Microbiol.- 2002. Vol. 68, № 8. - P. 3818 - 3829.

170. Rubio, L.M. Maturation of nitrogenase: a biocemical puzzle / L. M. Rubio, P. W. Ludden // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, № 2. - P. 405 - 414.

171. Seed inoculation with Azotobacter chroococcum in sand cultures and its effect on nitrogen balance (Abstract) / M. Monib, Y. Abd-el-Malek, I. Hosny, M. Fayez // Zentralbl. Bakteriol. Naturwiss. 1979. - Vol. 134, № 3. - P. 243 -248.

172. Siddiqui, Z. A. Effect of plant growth promoting bacteria and composed organic fertilizers on the reproduction of Meloidogyne incognita and tomato growth / Z. A. Siddiqui // Bioresour. Technol. 2004. www.scincedirect.com.

173. Strandberg, M. T. Field effects of simazine at lower trophic levels a review / M. T. Strandberg, J. J. Scott-Fordsmand // Sience Total Environ. - 2002. -Vol. 296.-P. 117-137.

174. Tsai, J. C. Phosphate-limited culture of Azotobacter vinelandii / J. C. Tsai, S. L. Aladegbami, G. R. Vela // J. Bacteriol. 1979. - Vol. 139, № 2. - P. 639-645.

175. Vancura, V. Inoculation of plant with Pseudomonas putida / V. Vancura // Proc. Int. Symp., Lublice/22-27 June 1987. Praha, 1989. - P. 185 -190.

176. Variation of microbial rhizosphere communities in response to crop species, soil origin, and inoculation with Sinorhizobum meliloti L33 / R. Miethling, G. Wieland, H. Backhaus, С. C. Tebbe // Microb. Ecol. 2000. - Vol. 41. - P. 43 -56.

177. Wipps, J. M. The influence of rhizosphere on crop productivity / J. M. Wipps, J. M. Lynch // Advances in Microbial ecology. New York: Plenum Press.- 1986.-Vol. 9.-P. 187-244.

178. Woodward, A. W. Auxin: regulation, action, and interaction / A. W. Woodward, B. Bartel // Ann. of Botany. 2005. - Vol. 95. - P. 707 - 735.

179. Zahir, Z. A. Effect of an auxin precursor tryptophan and Azotobacter inoculation on yield and chemical composition of potato under fertilized conditions / A. Zahir // J. Plant Nutr. 1997. - Vol. 20, № 6. - P. 745 - 752.

180. Zahir, Z. A. Cytokinin and its precursors for improving growth and yield of rice / Z. A. Zahir, H. N. Asgar, M. Arshad // Soil Biol. Biochem. 2001. -Vol. 33.-P. 405-408.

181. Zahir, Z. A. Plant growth promoting rhizobacteria: application and perspectives in agriculture / Z. A. Zahir, M. Arshad, W. T. Frankenberger // Adv. Agron. 2004. - Vol. 81. - P. 97 - 169.

182. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: cross-sestem comparison / J. P. Zehr, B. D. Jenkins, S. M. Short, G. F. Steward // Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 5, № 7 - P. 539 - 554.

Информация о работе

Алексеева, Анна Евгеньевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Физиолого-биохимическая активность и биоразнообразие штаммов Azotobacter Chroococcum, выделенных из почв Нижегородской области - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы