Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Универсальная система олигонуклеотидных праймеров для поиска и филогенетического анализа генов азотофиксации nifH у прокариот

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Универсальная система олигонуклеотидных праймеров для поиска и филогенетического анализа генов азотофиксации nifH у прокариот"

МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ _(ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)_

На правах рукописи

РГБ ОД

1 3 ДЕК 7ППП

Марусина Алина Игоревна

Универсальная система олигонуклеотидных пранмеров для поиска н филогенетического анализа генов азотофиксацип т/Н у прокариот.

Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре Молекулярной Биофизики Московского Физико-Технического Института и в Межинститутском Центре Молекулярной диагностики при Центре Биоинженерии РАН и ИНМИ РАН

Научный руководитель: академик РАСХН, профессор К.Г. Скрябин

кандидат биологических наук Е.С. Булыгина

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук В.И. Иванов

кандидат биологических наук А.Б. Шевелев

Ведущая организация: Московский Инженерно Физический Институт

(Государственный Университет).

Защита состоится 19 декабря 2000 г. в/^^на заседании диссертационного совета К063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институте (Государственном Университете) по адресу: 141700 Московская область, г.Долгопрудный, Институтский проезд 9, аудитория 113 ГК.

С диссертацией можно ознакомиться в диссертационном совете Московского Физико-Технического Института (Государственного Университета).

Автореферат разослан: /С, 2000 г.

Ученый секретарь кандидат физико-математических наук

диссертационного совета К063.91.10 В.Б.Киреев

Е Ш. п. о

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Современные тенденции развития микробной экологии включают, наряду с совершенствованием традиционных методов, активное использование молекулярно-биологических подходов для изучения микробиологических процессов и микробного разнообразия. Наиболее популярным среди таких методов является подход, основанный на идентификации прокариот, составляющих исследуемое природное сообщество, по нуклеотидным последовательностям 168 рРНК. Однако, в последнее время внимание исследователей все чаще привлекают так называемые «функциональные гены», анализ которых позволяет оценить разнообразие микроорганизмов, выполняющих определенную экологическую функцию в экосистеме. К таким генам относятся гены нитрогеназного комплекса, ответственного за трансформацию молекулярного азота в минеральные и органические вещества, доступные для микроорганизмов и растений.

Азот, фиксированный микроорганизмами, является единственным экологически чистым источником азотного питания микроорганизмов, и, через микробный метаболизм - растений и животных. Он быстро и эффективно используется растениями, не образует токсичных производных. Несмотря на большую экологическую и практическую значимость процесса азотфиксации, все существующие микробиологические методы определения нитрогеназной активности и количества азотфиксаторов не включают оценки биоразнообразия некультивируемых или находящихся в неактивной форме в момент отбора образцов бактерий.

Эти проблемы могут быть успешно решены за счет использования молекулярно-биологических методов. Так, с помощью методов, основанных на сравнении нуклеотидных последовательностей «функциональных генов», возможен прямой анализ биоразнообразия природных микробных сообществ.

Одним из таких генов является ген т/Н, входящий в нитрогеназный оперон. Однако большинство существующих в настоящее время олигонуклеотидных праймеров сконструированы для амплификации генов т/Н отдельных таксономических групп прокариот или даже отдельных микроорганизмов. Такой подход сильно сужает рамки исследований. Поэтому для проведения более детальных экологических исследований необходима универсальная система праймеров, специфичных для участка нитрогеназного комплекса широкого круга прокариот. Такая система позволила бы

детектировать в природных объектах микроорганизмы, обладающие генами азотфиксации, независимо от их экспрессии в момент отбора образцов.

Другой важной задачей исследований на ближайшее будущее является поиск и анализ генов nifH у микроорганизмов, для которых вопрос об участии в процессе азотфиксации окончательно не решен. Среди них наиболее перспективными являются метанокисляющие бактерии (метанотрофы), которые играют важную роль в биогеохимическом цикле азота экосистем болотных почв, а также в глобальном -круговороте метана.

Целью работы являлось:

-конструирование универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать участки генов азотфиксации и[/Н для максимально широкого спектра прокариот;

-проверка выбранной системы праймеров на препаратах ДНК, выделенных из принадлежащих к различными таксономическим группам микроорганизмов, для которых ранее была продемонстрирована способность к азотфиксации и известна первичная структура генов nifH\

-выявление с помощью разработанной системы праймеров генов nifH и определение их нуклеотидных последовательностей у азотофиксирующих микроорганизмов родов Beijerinckia, Xanthobacter, Methanosarcina, для которых отсутствовали данные о первичной структуре генов nifH;

-применение данной системы праймеров для исследования представителей метанокисляющих бактерий, относящихся к родам Methylocystis, Methylococcus, Methylomonas, Methylobacter, на наличие гена nifH;

-проведение филогенетического анализа полученных последовательностей фрагментов генов nifH.

Научная новизна и практическая ценность работы.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей генов nifH, представленных в СепВапк, разработана новая универсальная система вырожденных праймеров, позволяющая выявить гены азотфиксации как у представителей эубактерий, так и у архей. Применение этой системы к азотфиксирующии бактериям, для которых известна первичная структура этих генов и принадлежащих к различным

таксономическим группам, показало эффективность предложенной системы для выявления наличия генов иг/7/у широкого круга прокариот.

С помощью разработанной системы были определены de novo и депонированы в GenBank последовательности генов nifH азотфиксирующих бактерий родов Xanthobacter, Beijerinckia, Methanosarcina, для которых ранее была продемонстрирована способность к азотофиксации, но данные о наличии и нуклеотидном составе этих генов отсутствовали.

Выявлены и определены нуклкотидные последовательности генов nifH у. ряда представителей метанотрофных бактерий рода Methylocystis, способных фиксировать молекулярный азот. Кроме того, выявлены фрагменты гена nifH и определены их нуклеотидные последовательности у представителей метанотрофных бактерий родов Methylococcus, Methylomonas, Methylobacter, для которых способность к азотофиксации находилась под вопросом.

Проведенные филогенетические исследования всех определенных de novo генов nifH подтвердили выводы, сделанные на основе анализа 16S рРНК, о таксономической принадлежности этих микроорганизмов к соответствующим филогенетическим группам.

Филогенетический анализ также показал, что один из клонированных фрагментов гена nifH Methylocystis echinoides (штамм 2) относится к семейству ванадиевой нитрогеназы, что предполагает наличие ванадиевого оперона в геноме данной бактерии.

Проведенные исследования выполнены в рамках гранта РФФИ (проект 99-04-48-801а) Публикация и апробация работы.

По материалам диссертации опубликована 1 статья и 1 принята к печати. Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (ссылок). Диссертация содержит / $ рисунков и / О таблиц. Полный объем работы^ О О страниц.

Место проведения работы.

Работа выполнена в Межинститутском Центре Молекулярной диагностики при Центре Биоинженерии РАН и НИМИ РАН

Содержанне работы 1. Материалы н методы исследований

1.1.Выбор праймероп.

Был проведен поиск нуклеотидных последовательностей генов nifii прокариот различных таксономических групп в международном банке данных GenBank. Процедуры выравнивания нуклеотидных последовательностей проводили через сеть Интернет с помощью программы Basic Genebee Clustal W1.75 (http://www.genebee.msu.su/clustal)

1.2.Выпелеине ДНК.

Выделение ДНК проводили согласно протоколу Miniprep (Promega, USA) с небольшими модификациями. Полученные препараты ДНК имели концентрацию 5-7 мкг/мл. РНК в препаратах присутствует в следовых количествах (по электрофоретическим данным, менее 1%).

1.3.Амплификация, выделение и клонирование участков тШ гена.

Амплификацию проводили с использованием сконструированных нами пар праймеров (F1-R6, F2-R6) на приборе Cetus 480 (Perkin Elmers, Швеция). С применением термостабильной полимеразы BioTaq («Диалат ЛТД», Москва) согласно рекомендациям фирмы-производителя полимеразы. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Температурно-временной профиль ПЦР был следующим: первый цикл -

94°С 3 мин, 50°С - 3 мин и 72°С - Змин; последующие 5 циклов -94°С - 30 сек, 50°С - 2 мин и 72°С - 30 сек; последние 30 циклов -94°С - 30 сек, 40°С - 30 сек и 72°С - 30 сек. После завершения последнего цикла смеси дополнительно выдерживали 7 минут при 72°С для завершения достройки цепей.

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% геле агарозы. Наличие продуктов амплификации определяли визуально в УФ свете на трансиллюминаторе «БиоКом» (Москва) после окрашивания гелей бромистым этидием. Для документирования результатов гели фотографировали. Выделение и очистку

фрагментов из легкоплавкой агарозы проводили с использованием набора «Wizard PCR Preps» фирмы «Promega» согласно рекомендациям производителя. Фрагменты клонировали в векторе pGEM-3Zf(+) в клетках E.coli DH5a.

1.4.Секвеннпованне клонированных фрагментов.

Секвенирование проводили по методу Сэнгера с использованием набора «Silver Sequencing» фирмы Promega (США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборах Macrophore, Pharmacia (Швеция) и SQ3 Sequencer, Hoefer (США), при толщине полиакриламидного геля 0,19 мм. Для секвенирования применяли как универсальные плазмидные праймеры (SP6 и Т7), так и сконструированные нами праймеры.

1.5.Филогенетнческнй анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей. Филогенетический анализ последовательностей проводили через сеть Интернет

с помощью пакета программ Phylip (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/phylogeny/phylip-uk.html) с использованием следующих программами: djiadisl (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dnadist-simple.html); dnapars (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dnapars-simple.html); fastPNAml (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/fastdnaml-simple.html); neighbor (http://bioweb.pasteur.fr/seqanaI/interfaces/neighbor-simple.htmI).

1.6.Депонирование нуклеотидных последовательностей.

Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов генов nifli были депонированы в базе данных GenBank под номерами AF296348, AF296349, AF296350, AF296351, AF296352, AF296353, AF296354, AF296355, AF296356, AF296357, AF296358, AF302904, AF302905.

2. Результаты исследовании и их обсуждение.

2.1. Разработка универсальной системы ол'игонуклеотидных праймеров для амплнфикаини генов тШ различных таксономических групп прокариот.

В настоящее время известны три гомологичные нитрогеназные системы: молибденовая (л//), ванадиевая (уп/) и альтернативная (ап/). Наиболее изученой из них является молибденовая нитрогеназная система. Ферментный комплекс молибденовой нитрогеназы состоит из двух субъединиц: РеМо- белка, кодируемого генами п1/Т) и т/К, и Ре-белка, который кодируется геном т/Н. Ген т/Н является одним из наиболее консервативных функциональных генов, причем филогения бактерий, основанная на анализе последовательностей этого гена, хорошо согласуется с данными, полученными при анализе 16Б рРНК. Это позволяет применить молекулярно-биологические подходы, основанные на анализе последовательностей т/Н гена к исследованиям как изолятов, так и биоразнобразия целостных микробных природных сообществ.

Для определения нуклеотидных последовательностей гена т/Н ранее уже были предложены олигонуклеотидные праймеры, позволяющие амплифицировать участки этих генов, достаточные для идентификации микроорганизмов. Однако существенным недостатком этих праймеров является то, что они были сконструированы для амплификации генов т/Н узких групп прокариот, или даже для отдельных родов микроорганизмов. Это связанно с определенными трудностями, возникающими при подборе таких праймеров. Из-за широкого филогенетического разнообразия азотфиксирующих микроорганизмов набор консервативаных участков гена т/Н, пригодных для конструирования олигонуклеотидных праймеров, довольно ограничен. Кроме того, высокая степень вырожденности нуклеотидных последовательностей генов т/Н в целом, практически исключает возможность существования достаточно протяженных инвариантных участков последовательностей. Помимо этого, количество нуклеотидных последовательностей генов т/Н, опубликованных к настоящему времени в базе данных ОепВапк, относительно невелико (в сравнении с количеством опубликованных последовательностей для генов 168 рРНК), что также затрудняет подбор достаточно универсальных праймеров.

Таким образом, первым этапом работы явился компьютерный анализ имеющихся в современных банках данных нуклеотидных последовательностей генов т/Н с целью выявления наиболее консервативных участков и подбора к ним

универсальных праймеров. Первоначальный объем выборки составил 360 последовательностей, имеющих отношение к генам rtifH. После удаления из выборки последовательностей генов альтернативной нитрогеназы, ванадиевой нитрогеназы, nifH-подобных либо гомологичных последовательностей, а также последовательностей генов rtifH неидентифицированных микроорганизмов количество анализируемых последовательностей сократилось до 150. Данное сокращение объема выборки не повлияло на ее репрезентативность в отношении таксономичнского разнообразия азотфиксирующих прокариот (табл.1).

Таблица 1.

Таксономическое разнообразие микроорганизмов, использованных при

конструировании праймеров к генам nifH.

Филогенетические группы микроорганизмов Представители родов.

Зелёные серные бактерии СЫогоЫит

Грам-положительные бактерии с низким Г+Ц составом Bacillus, Clostridium, Paenibacillus

Грам-положительные бактерии с высоким Г+Ц составом Franckia

Цнанобактерии Caloihrix, Chlorogloeopsis ,Cyanothece, Dermocarpa , Fischer el la, Gloeothece, Lyngbya, Microcoleus, Myxosarcina, Phormidium, Plectonema, Pseudanabaena, Scytonema, Syrtechococcus, Anabaena, Trichodesmium, Nostoc, Xenococcus.

Протеобактерии: (Х-подгруппа Acetobacter, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium, Rhodobacter, Rhodospirilium, Azospirillum.

Протеобактерии: (^-подгруппа Alcaligenas, Herbaspirilium, Azoarcus.

Протеобактерии: у-подгруппа Azotobacter, Klebsiella, Vibrio, Marichromatium, Pseudomonas, Tiobacilus.

Протеобактерии: 5-подгруппа Desulfobacter, Desulfovibrio, Desulfonema

Архебактерии Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanobrevibacter

После тщательного анализа выравненных последовательностей генов т{Н, в них были выбраны наиболее консервативные участки, соответствующие позициям 19-56,

115-131 и 457-494 гена т/Н Аго!оЬас1ег vine!andii. На их основе была создана система праймеров (два прямых - Р1 и Р2 и один обратный - 116) для амплификации участков гена т/Н длиной приблизительно в 470 пар оснований для праймеров Р1-116 и 370 пар оснований для праймеров Р2-116. Последовательности этих, а также встречающихся в литературе праймеров приведены на рисунке 1.

КОНСЕНСУС

F ПРАЙМЕР Ueda и др., 1995 (Flu) F ПРАЙМЕР Widroer и др., 1998 (F1W) F ПРАЙМЕР Ohkuma и др., 1996 (FIO) F ПРАЙМЕР Fl Б

КОНСЕНСУС

F ПРАЙМЕР Kirshtein и др., 1991IF2K) F ПРАЙМЕР Widmer и др., 1998 (F2W) F ПРАЙМЕР Ohkuma и др., 1996 (F20) F ПРАЙМЕР F2

19

gcnwtytayggnaarggnggnatnggnaartcnacnacnhmbcaraa

gciwtytayggiaarggigg---------------------------

gciwtitayggnaarggngg---------------------------

------------aarggnggnathggnaa------------------

------tayggiaarggiggiatiggiaartc---------------

КОНСЕНСУС

R ПРАЙМЕР Ueda и др., 1995 (Rlu) R ПРАЙМЕР Ohkuma и др., 1996 (RIO) Г

nnncasgrnvrnmcvE tnmtbc tbrwnkjcnt gygayccnaavgcnga

------------------------------tgygayccnaargcnga

---------------------------ggitgtgayccnaavgcnga

------------------------------tgygayccnaargcnga

------------------------------tgygaycciaaigciga

380

nqrnGqanatnynrmnbqqbqqntvyqcrir tqccnathmqnvanr r

-----qavqtiqtitqvqqyqqntt---------------------

-----------qtntqyqqnqqnttyqc------------------

450

КОНСЕНСУС

Р ПРАЙМЕР К1гз11Ье1п и др., 1991 (К2К) й ПРАЙМЕР Шйтег и др., 1998 ( И ПРАЙМЕРЫ ОЬкита и др., 199б(К20, ЯЗО) И ПРАЙМЕР Кб

tnrtndbntcnggngaratgatggcnntbtayginngcnaayaayaty

-----------ggngaratgatggcnht-------------------

--------------garatgatggcnvtitaygc-------------

-----------ggngaratgatggcnht-taygcngcnaayaayat-

--------tciggigaratgatggc----------------------

Рис. 1. Последовательности праймеров для амплификации участков гена т/Н.

Нумерация консенсуса по нуклеотидной последовательности гена шШ АююЬаМег \inelandn М20568 Использованные сокращения:

У=Т,С; Я=А,С; М=А,С; К=Т,С; У/=А,Т; 8=С,С; В=Т,С,С;

У=А,С,С; 0=А,Т,0; Н=А,Т,С

Ы=0,А,Т,С

Выделеные заглавные буквы обозначают делеции или вставки в консенсусе. Выделеные подчеркнутые буквы указывают на несоответствия литературных праумеров с консенсусом.

Хотя из рисунка 1А видно, что литературные праймеры соответствуют консенсусу, следует иметь в виду ограниченную репрезентативность выборки на этом участке. Данные о репрезентативности выборки для всех литературных праймеров, а также для праймеров И1, ?2 и Я6 приведены в таблице 2.

Таблица 2.

Таблица универсальности праймеров.

Праймер (расшифровка обозначений на рис. 1.) пи ПО п гск гео ¥2 ЯШ яю Я2К Я2\У Я20 язо Я6

Количество родов микроорганизмов охватываемых праймером 15 15 17 21 20 9 20 22 31 31 16 16 16 16 35

Первоначальная степень вырожденности для праймера Р1 составляла 4096 раз, для праймера Р2 256 раз и 32 раза для праймера Кб. Использование таких сильно вырожденных праймеров, также как и литературных, оказалось неэффективно. Поэтому в дальнейшем при конструировании праймеров вместо КД),Н,У использовалось универсальное основание инозин. Кроме того была применена трехстадийная схема ПЦР.

2.2. Тестирование разработанной системы праймеров на препаратах ДНК, выделенных из азотфнкснруюншх бактерий с известной первичной структурой генов пН~Н.

Для первоначальной проверки выбранной системы праймеров и оптимизации условий проведения ПЦР были использованы препараты ДНК, выделенные из микроорганизмов, для которых ранее было показано наличие функции азотфиксации и определены нуклеотидные последовательности генов т/Н. Кроме того, эти микроорганизмы принадлежат к отдаленным филогенетическим таксонам, относящимся к двум полцарствам прокариот: эубактериям и археям. В качестве негативного контроля при этом использовали препараты ДНК бактерий, не обладающих способностью фиксировать молекулярный азот и принадлежащих к видам Е.соИ и B.thuringiensis.

Рис. 2. ПЦР на препаратах ДНК различных азотфиксирующих бактерий с применением праймеров F1-R6.

1-маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler ЮОЬр (Fermentas), 2- Sinorhizobium meliloti, Ъ-Rhizobium trifolii, 4- Azotobacter vinelandii, 5- Azotobacter chroococcum, 6-Nostoc sp., 7- Nostoc sp., 8- Xanthobacter autotrophicus, 9- Beijerinckia indica subsp. indica, 10- Methanosarcina lacustera, 11- Escherihia coli, 12- Bacillus thuringiensis, 13-контрольная ПЦР в отсутствие матрицы, 14- маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler lOObp(Fermentas).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 3. ПЦР на препаратах ДНК различных азотфиксирующих бактерий с применением праймеров F2-R6.

1-маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler ЮОЬр (Fermentas), 2- Sinorhizobium meliloti, Ъ-Rhizobium trifolii, 4- Azotobacter vinelandii, 5- Azotobacter chroococcum, 6-Nostoc sp., 7- Nostoc sp., 8- Xanthobacter autotrophicus, 9- Beijerinckia indica subsp. indica, 10- Methanosarcina lacustera, 11- Escherihia coli, 12- Bacillus thuringiensis, 13-контрольная ПЦР в отсутствие матрицы, 14- маркер молекулярной массы ДНК GeneRuler lOObp(Fermentas).

Как видно из приведенных фотографий (рисунки 2, 3), фрагменты генов nifH выявлены у всех включенных в эксперимент азотофиксаторов, причем интенсивность полос варьирует при использовании различных пар праймеров (F1-R6 и F2-R6). Так, при использовании первой пары праймеров, выход продукта амплификации для Sinorhizobium MeHIolti, Rhizobium trifolii и Nostoc (Anabaenaj sp.PCC7120 был существенно выше, чем для Xanthobacter aulotrophicus. При использовании пары праймеров F2-R6 картина амплификации меняется на противоположную. Таким образом, с использованием этой взаимодополняющей системы праймеров удается амплифицировать ген nifH у широкого круга представителей прокариот.

Для дополнительного подтверждения того, что полученные амплификаты действительно являются фрагментами генов nifH, было проведено прямое секвенирование ПЦР-фрагментов для Nostoc (Anabaenaj sp.PCC7120 и Sinorhizobium melilotti, последовательности генов nifH которых представлены в GenBank под номерами М55229.1 и AF012326.1, соответственно. Обнаружена более чем 95% гомология между секвенированными нами и депонированными последовательностями, что подтверждает, что полученные ПЦР-фрагменты соответствуют генам nifH. Таким образом, эти пары праймеров являются взаимодополняющими и образуют единую универсальную систему, которая эффективно выявляет гены азотофиксации nifH как у эубактерий так и у архей.

2.3. Выявление генов nifH v азотфиксирующнх микроорганизмов ролов Beiierinckia. Xanthobacter. Methanosarcina.

Разработанная система праймеров была применена для определения нуклеотидных последовательностей фрагментов гена nifH азотфиксирующнх эубактерий и архей, для которых данные о первичной структуре этих генов отсутствовали. Проведен сиквенс ПЦР фрагментов и 5 клонов Beijerinckia indica АТСС 9093, ПЦР фрагментов и 2 клонов Xanthobacter aulotrophicus DSMZ 432 и 4 клонов Methanosarcina lacustera. Нуклеотидные последовательности клонов одного вида отличались между собой в пределах ошибки сиквенса (не более 1%). Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности ПЦР и клонированных фрагментов генов nifH были депонированы в базу данных GenBank. Соответствующие номера указаны в разделе «Материалы и методы исследований». Сравнительный анализ

полученых последовательностей с последовательностями базы данных GenBank показал их принадлежность к семейству генов nifH.

2.4. Исследование группы метанокнсляюших бактерий на наличие гена nifH.

Группа метанотрофных бактерий, играющая важную роль в биогеохимических процессах, представляет собой интересный объект для исследований возможности фиксировать молекулярный азот, так как до сих пор этот вопрос остается открытым. С помощью разработанной системы были исследованы представители рода Methylocystis, для которых показана способность к азотофиксации, и родов Methylococcus, Methylomonas, Melhylobacter, для которых эта способность находится под вопросом. Было вьивлено наличие генов nifH у всех исследованных штамммов метанотрофных бактерий и определены нуклеотидные последовательности ПЦР фрагментов гена nifH у «Methylomonas rubra» штамм 23, «Methylobacter vinelandii» штамм 87, «Melhylobacter bovis» штамм 89, «Melhylobacter chroococcum» штамм 90, Methylococcus capsulatus штамм 113 и клонированных фрагментов гена nifH у Methylocystis echinoides штамм 2, «Methylocystis pyriformis» штамм 14, «Methylocystis minimus» штамм 41, Methylomonas methanica штамм 68.

Анализ полученных последовательностей показал их принадлежность к семейству генов nifH, что свидетельствует о присутствии данного гена в геноме исследованных бактерий. Этот факт не является строгим доказательством того, что данные микроорганизмы действительно способны фиксировать молекулярный азот, однако дает почву для дальнейших исследований.

2.5. Филогенетический анализ полученных последовательностей фрагментов гена nifH метанотрофных бактерий.

Для оценки степени сходства полученных de novo нуклеотидных последовательностей генов nifH с последовательностями, представленньми в базе данных GenBank, был проведен филогенетический анализ. С этой целью, наряду с исследуемыми последовательностями, были использованы нуклеотидные последовательности генов nifH микроорганизмов из всех возможных филогенетических групп, а также нуклеотидные последовательности генов nifH альтернативной и ванадиевой нитрогеназы. Филогенетические деревья были построены с использованием методов Neighbor-joining и Parsimony. Для оценки устойчивости

топологических элементов применялся bootstrap-анализ, включавший 500 циклов построений.

Как видно из рисунков 4 и 5, общая топология деревьев совпадает с литературными данными и в общих чертах согласуется с анализом по последовательностям 16S рРНК. Различия в топологии приведенных на рисунках 4 и 5 деревьев объясняются особенностями используемых алгоритмов, однако кластеры соответствующие основным филогенетическим группам, а также ванадиевой и альтернативной нитрогеназам, сохраняются в обоих случаях.

Оба дерева демонстрируют, что фрагменты генов nifH «Methylocystis minimus» штамм 41, Beijerinckia indica АТСС 9093, Xanlhobacter autotrophicus DSMZ 432 образуют единый кластер с генами nifH представителей a-подгруппы протеобактерий, что не противоречит данным анализа 16S рРНК.

Аналогичная картина наблюдается для генов nifH «Methylomonas rubra» штамм 23, «Methylobacter vinelandii» штамм 87, «Melhylobacler bovis» штамм 89, «Methylobacter chroococcum» штамм 90 Methylomonas methanica штамм 68, которые и поданньм нашего анализа и анализа 16S рРНК относятся к у-подгруппе протеобактерий.

Исключение составляет лишь штамм «Methylocystis pyriformis» , который по данным анализа 16S рРНК относятся к a-подгруппе протеобактерий. Однако определенная нами последовательность гена nifH относится к у-подгруппе протеобактерий. Этот факт требует более тщательных исследований, а также проверки этого штамма на чистоту, что не входило в рамки данного исследования.

Кроме того, проведенный филогенетическиий анализ выявил принадлежность клонированного фрагмента гена nifH Methylocystis echinoides штамм 2 к кластеру ванадиевой нитрогеназы. Данный кластер включает два точно идентифицированных ванадиевых гена nifH для Azotobacter vinelandii и Azotobacter chroococcum, а также последовательности генов nifH Synechococcus sp.H Vibrio diazotrophicus, для которых нет точных данных о типе нитрогеназного опрерона. Этот кластер сохраняется при использовании различных алгоритмов построения филогенетических деревьев. Это, видимо, объясняется принадлежностью всех этих последовательностей, включая последовательность фрагмента гена nifH Methylocystis echinoides, к ванадиевой нитрогеназе.

4-BaciHus azoioßxans v-1.0

—1.0 Paenibacillus azotoßxans

a-Paenibacillus poly тух a

*—Anabaena variabilis 4—1.0

+—1.0 +-Anabaena azollac

1.0 I-Fischerella UTEX1903

i 4-Xenococcus sp. * VhCyanothece ATCC51142

-Cloeothece sp.

+-0.5 i i

! Í

*—Frankia alni *-Frankia sp.

ч-anfH Rodobacter capsulatus

•ь-anfH Azotobacter vinelandii

-Chlorobium tepidum

4-Desulfonema limicola

*—Desulfobacter curvatus

4-Methanosarcina lacustera -L0

*~Methanosarcina barkeri

+-0.5 +—0.5 !

-Paenibacillus macerans -Pseudomonas stutzeri

+—1.0

t

-Marichromatium purpuratum

■*-,Klebsiella pneumoniae '

+-L0

—LO -HiKlebsiella pneumoniae

и-Vibrio natriegens

*-«Methylobacter chroococcum» штамм 90 ! 4-vMethylobacter vinelandii» штамм 87 ! *-vMethylobacter bovis» штамм 89 ^-«Л/еthy lосу st is pyriformis» штамм 14 *-<<Metliylomonas rubrum» штамм 23 +-Methylomonas methanica штамм 68

-Azotobacter vinelandii

•i-Synechococcus sp. ~

'! 4—Vibrio diazotrophicus

i +-Methylocystis echinoides штамм 2

+-vnfH Azotobacter vinelandii -1.0

ч-vnfH Azotobacter chroococcum

-1.0

-Thiobacillus ferrooxidans

+-Herbaspirillum seropedicae

и-Rhizobium trifolii

4—1.0

! ! +-Rhizobium meliloti -LO +-1.0 „ , ,

! +~Rodobacter capsulatus

-Acetobacter diazotrophicus

4-«Methylocystis minimus» штамм 41 4-Beijerinckla indica

-Xaníhobacíer autotrophics

-Azospirillum brasilense

Грнм-положительны

tбактерии с низким Г+Ц составом

Цнанобактери

Грам-лоложнтельные

бактерии с высоким Г+Ц составом

Альтернативная ннтрогеназа

U-подгруппа лоотеобактеонй

Архебактернн

У»п од группа протеобактер

Ванадиевая liiiTporcnaia

СС-подгруппа протеобактернй

Рис.4. Неукорененное филогенетическое дерево построенное с помощью метода neighbor-joining на основе фрагментов генов nifH. Отображены ветви с устойчивостью более 50%. Жирным шрифтом выделены все определенные de novo фрагменты генов nifH.

+—Rhizobium trifolii

-l.o л—Rhizobium meliloti

\-aMethylocystis minimus» штамм 41

-Beljerinckia indica

и—Rodobacter capsulatus +—1.0

! 4—Acetobacter dlazotrophicus ! *—Azospirillum bras dense

4-,1.0

и—Xanthobacter autotrophicus

и—Herbaspirillum seropedicae

и—Thiobacillus ferrooxidans

и—Anabaena variabilis 1—1.0

-l.o Anabaena azoilae -I-Fischerella UTEX19

+—Xenococcus sp. ~lSÍ-Cyanothece ATCC51142 —Gloeothece sp.

-Paenibacillus azotofixans

4—Paenibacillus polymyxa 4—,Bacillus azotofixans

^—«Methylobacter chroococcum» штамм 90 ! h—vMethylobacter vinelandii» штамм 87 ! и—«Л/ethy lob a cter bovis» штамм 89 ■¡—«Methylocystis pyri/ormis» штамм 14 +~Methylomonas methanica штамм 68 4—Methylomonas rubra" штамм 23 и—Klebsiella pneumoniae -0.7 '+—Klebsiella pneumoniae

-Vibrio natriegens

4—Pseudomonas stutzeri —1.0

h—Marichromatium pur pur at um

-Azotobacter vinelandii

и—vnfH Azotobacter vinelandii -1.0

H—vnfH Azotobacter chroococcum

4-Synechococcus sp

1.0

! —ЛIethylocystis echinoules штамм 2 и—Vibrio dlazotrophicus

—Frankia sp. —Frankia alni

4—Methanosarcina lacustera

4—1.0

■ь-0.7 4—Methanosarcina barker i

I ! —

1.Ó i-Paenibacillus m acerans

\ 4—anfH Rodobacter capsulatus i—anfH Azotobacter vinelandii -Desulfonema limicola

—Desulfobacter curvatus -Chlorobium tepidum

(Х-подгруппа протеобактернй

Цианобактерии

Грам-

положительные

бактерии с нкъким Г+Ц составом

У-подгруппа протеобактернй

Ванадиевая интрогеназа

Грам-

п ол ожнтел ь н ы е

бактерии с высоким Г+Ц составом

Архебактерии

Альтернативная нитрогеназа

О-подгруппа протеобактерий

Рис.5. Неукорененное филогенетическое дерево построенное с помощью метода parsimony на основе фрагментов генов nifH. Отображены ветви с устойчивостью более 50%. Жирным шрифтом выделены все определенные de novo фрагменты генов nifH.

Выводы.

1. Разработана система универсальных олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов nifll у различных таксономических групп микроорганизмов.

2. Показана эффективность разработанной системы при выявлении генов nifii у широкого круга прокариот.

3. Определенны и депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности генов nifii азотфиксирующих бактерий родов Xanthobacter, Beijerinckia, Methanosarcina, для которых ранее была продемонстрирована способность к азотофиксации, но данные о наличии и нуклеотидном составе этих генов отсутствовали.

4. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов nifH метанотрофных бактерий рода Methylocystis, для которых ранее была показана способность к азотофиксации, и родов Methylococcus, Methylomonas, Methylobacter, для которых способность к азотофиксации находится под вопросом.

5. Проведен филогенетический анализ полученных последовательностей фрагментов генов nifii, который подтвердил данные анализа 16S рРНК о таксономической принадлежности этих микроорганизмов к соответствующим филогенетическим группам.

6. С помощью филогенетического анализа показана принадлежность одного из клонированых фрагментов гена nifH Methylocystis echinoides (штамм 2) к семейству ванадиевой нитрогеназы, что предполагает наличие ванадиевого оперона в геноме данной бактерии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для исследований в области молекулярной экологии азотофиксирующих микроорганизмов/ Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. и др.// Электронный журнал "Исследовано в России",-2000.-№83.-С. 1153-1158 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2000/083.pdf

2. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nifH различных таксономических групп прокариот/ Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. и др. // Статья принята в печать. Микробиология 2001.