Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH

Слободова, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH"

на правах рукописи

Стободова Наталья Валерьевна

ИЗУЧЕНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ ПРОКАРИОТ КИСЛЫХ ТОРФЯНЫХ ПОЧВ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ mJH

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006

Работа выполнена в Центре «Биоинженерия» РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, ст.н.с.

Е.С. Булыгина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.М. Горленко

кандидат биологических наук И А. Берг

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт фитопатологии (ВНИИФ) РАСХН

Защита состоится 24 октября 2006 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 в ауд. М-1 Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Адрес диссертационного совета: 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, стр. 1, корп. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 24 сентября 2006 г.

Ученый се1фетарь

диссертационного совета </ /асЛ—^ Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микробные сообщества являются важнейшими компонентами различных экосистем и играют решающую роль в метаболизме органической материи и в биогеохимической трансформации элементов, включая процесс фиксации атмосферного азота. Азотфиксация - главное звено в цикле азота, так как именно этот процесс лимитирует все остальные этапы превращения азота в биогеохимическом цикле. Способность к биологическому связыванию атмосферного азота присуща только представителям мира прокариот. Азотфиксирующие микроорганизмы присутствуют практически во всех экосистемах и способствуют их обогащению связанными формами азота. При этом распределение таких прокариот по различным экоценозам неоднородно и до сих пор еще мало изучено.

Одной из преобладающих наземных экосистем в бореальной зоне Евразии и Северной Америки являются кислые торфяные болота. Они занимают свыше 3% общей земной поверхности, а в России болота и заболоченные бореальные почвы распространены более чем на 20% территории (ЛеёузЬ е1 а1., 2006). При этом данные экосистемы играют значительную биосферную и средообразующую роль, являясь, в частности, резервуарами связанных форм углерода и азота. Хотя в последние десятилетия интерес исследователей к проблеме фиксации азота в болотных экосистемах возрос, микробиология этого процесса еще очень мало изучена. Известно только, что азотфиксирующие микроорганизмы в торфяных почвах содержатся в значительном количестве, а исследований, посвященных определению биоразнообразия диазотрофов в болотных почвах и выявлению их азотфиксирующего потенциала, до настоящего времени не проводилось.

Для анализа природных микробных популяций в последнее время широко применяют методы молекулярной экологии. При этом выявление микроорганизмов, выполняющих определенную функциональную роль в экосистеме, проводят с помощью детектирования генов-маркеров. Метод, основанный на сравнительном анализе последовательностей генов пЦН, стал наиболее популярным для исследования биоразнообразия азотфиксирующих сообществ. Ген лгун кодирует один из компонентов нитрогеназы, являющейся ключевым ферментом азотфиксации. Этот подход, в отличие от метода, основанного на анализе нуклеотидных последовательностей генов 168 рРНК,

позволяет достаточно полно определить видовой состав сообщества, обладающего азотфиксирующим потенциалом. Использование гена ит/Н для анализа диазотрофных микробных сообществ имеет ряд преимуществ, основным из которых является достаточно большая база данных, содержащая уже более 9000 последовательностей.

Таким образом, изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот в различных природных экосистемах относится к важнейшим задачам микробной экологии. При этом именно современные молекулярно-биологические подходы, обладающие высокой разрешающей способностью, позволяют проводить наиболее полный анализ разнообразия микроорганизмов в природных сообществах. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось проведение анализа биоразнообразия азотфиксирующих прокариот микробных консорциумов болотных почв с помощью методов молекулярной экологии.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Разработка эффективного и быстрого метода выделения пригодной для ПЦР-анализа тотальной ДНК из различных почвенных сообществ.

2. Определение первичных последовательностей генов т]Н фототрофных микроорганизмов, не представленных в базе данных.

3. Сравнение эффективности анализа последовательностей генов п1)Н и других методов для изучения биоразнообразия микробных сообществ.

4. Применение анализа последовательностей генов иг/Н для изучения состава азотфиксирующего сообщества торфяной болотной почвы.

Научная новизна работы. Разработан универсальный экспресс-метод выделения ПЦР-пригодной ДНК, позволяющий получать препараты из почв, существенно различающихся по своим физико-химическим характеристикам, в том числе с низкими значениями рН и богатых органическими веществами.

Впервые проведено исследование разнообразия азотфиксирующих микроорганизмов кислой торфяной болотной почвы с помощью анализа генов т)Н. Показано наличие микроорганизмов, относящихся к а-, у- и б-Протеобактериям, группе аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ), зеленых серных бактерий. Впервые в кислых торфяных почвах выявлены микроорганизмы, близкие к родам Аго$р'1гИ1ит и ОзсШосЫапз, что расширяет список мест их обитания.

По результатам работы в базу GenBank депонированы 25 последовательностей генов ni/H, принадлежащих различным микроорганизмам, и проведен их сравнительный анализ. Показано, что некоторые последовательности генов ni/H неидентифицированных микроорганизмов, представленные в базе данных GenBank, относятся к фотосинтезирующим бактериям.

Практическая значимость работы. Разработанный метод в силу своей универсальности может применяться при проведении сравнительного анализа биоразнообразия микроорганизмов, обитающих в различных типах почв.

Расширение базы данных последовательностей генов ni/H. позволит создавать более специфичные зонды для выявления и мониторинга конкретных групп микроорганизмов, их количественной оценки. Депонированные последовательности описанных микроорганизмов позволят проводить более точный анализ состава микробных сообществ.

Полученные результаты расширяют представление о таксономическом разнообразии азотфиксирующих бактерий в кислых торфяных почвах. ■ Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 9 Международном симпозиуме по азотфиксации (Левен, Бельгия, 2002), 8 Международном симпозиуме по биогеохимии болотных почв (Тент, Бельгия, 2003), представлены на б Европейской конференции по азотфиксации (Тулуза, Франция, 2004) и Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, Россия, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов в сборниках работ российских и зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 150 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков, 16 таблиц, 1 диаграмму. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования", "Результаты и обсуждение"), "Выводы" и "Список литературы", который содержит 26 отечественных и 253 иностранных наименования.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись: 25 штаммов различных микроорганизмов, 3 метанотрофные накопительные культуры (SB26, SB31, SB31A), а также образцы кислой торфяной почвы сфагнового болота п. Сосвятское (Тверская обл., Россия) любезно предоставленные сотрудниками лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ) и кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ.

Выделение ДНК. Из биомассы микроорганизмов ДНК выделяли по модифицированному методу Бирнбойма-Доли (Birnboim and Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США). Для получения препаратов ДНК из почвенных образцов использовали два различных подхода: (1) щелочной лизис клеток непосредственно в почвенных образцах, (2) лизис бактериальных клеток, очищенных от других почвенных компонентов.

ПЦР-амплиФикация. Получение ПЦР-фрагментов генов 16S рРНК проводили с использованием универсальных праймеров: 11F, 519R, 1492R (Lane, 1991). Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: буфер ДНК полимеразы (67мМ Трис-HCl, рН 8,8; 17 мМ (NH^SC^; 2 mM MgCl2), по 6 нмоль каждого из dNTP, 20-50 нг ДНК-матрицы, по 6,25 пмоль прямого и обратного праймеров и 1,5 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Для получения ПЦР-фрагментов генов nifH были использованы разработанные ранее в нашей лаборатории праймеры F1 и R6 (Марусина и др., 2001). Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: буфер ДНК полимеразы (67мМ Трис-HCl, рН 8,8; 17 мМ (NH4)2S04); 1,5 мМ MgCl2, по 5 нмоль каждого из dNTP, по 6.25 пмоль прямого и обратного праймеров, 20-50 нг ДНК-матрицы, 1,25 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия).

Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1 мкг/мл), при напряженности поля б В/см2, и документировали с помощью системы BioDoc Analyzer II (Biometra, Германия).

Очистка фрагментов ПЦР в агарозе. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0.8% легкоплавкой агарозе с применением набора PCR-Preps (Promega, США).

Клонирование ПЦР-фрагментов. Выделенные ПЦР-фрагменты клонировали в векторе pGEM-T (Promega, США). Продуктами дотирования трансформировали компетентные клетки Escherichia coli штамм DH5a. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили при помощи набора Wizard MiniPrep (Promega, США), согласно рекомендациям производителя.

Секвенирование ПДР-фрагмснтов. Секвенирование проводили по методу Сенгера (Sanger et.al., 1977). Плазмиды со вставкой секвенировали с универсальных плазмидных праймеров SP6 и Т7. Для секвенирование ПЦР-фрагментов генов nifil использовали те же праймеры, что и при амплификации.

Для проведения секвенирования использовали набор "Silver Sequencing" (Promega, США) согласно рекомендациям фирмы-производителя, с незначительными модификациями. Электрофорез проводили на приборе SQ3 Sequencer, (Hoefer, США) в 7%-ном полиакриламидном геле толщиной 0,19 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7М мочевины). Последовательность нуклеотидов в ДНК считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемерис и др., 1999).

Анализ полученных последовательностей. Поиск близкородственных последовательностей в базе GenBank проводили с помощью программного пакета BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST'). Транслирование нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorggorf.html'). Множественное выравнивание

последовательностей - с помощью пр01раммы CLUSTAL W 1.75 (Thompson et al., 1994) (http://www.genebee.msu.su/clustan.

Построение дендрограмм осуществляли с помощью программы TREECON Windows (Van de Peer and Wacher, 1994). Генетические расстояния (D) при построении дендрограмм по данным анализа транслированных последовательностей фрагментов генов ni}H рассчитывали по формуле Таджима-Нея (Tadjima and Nei, 1984):

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка экспресс-метода получения препаратов ДНК из почвенных образцов. .

При использовании молекулярно-биологических методов выделение ДНК является первым и в большинстве случаев определяющим этапом, так как от качества и количества полученных препаратов ДНК во многом зависит результат всех дальнейших исследований. Выделение ДНК из почвы, в отличие от других природных сообществ, осложнено высоким содержанием органических веществ, в частности гуминовых кислот, которые ингибируют проведение ГПДР. При этом для сравнительного анализа состава почвенных микробных сообществ представляется логичным использовать единый метод выделения ДНК, который позволит получать препараты из различных типов почв.

Первой стадией выделения ДНК является лизис клеток, его можно проводить как непосредственно в почвенном образце, так и после получения фракции бактериальных клеток. Первоначально мы использовали метод прямой экстракции нуклеиновых кислот из почвенного образца. Однако при таком методе вместе с ДНК выделяется большое количество гуминовых кислот, и получение ПЦР-пригодных препаратов требует, как правило, дальнейшей длительной и многоступенчатой очистки. Так как нашей задачей было отработать быстрый и универсальный метод выделения ДНК, от такого подхода было решено отказаться, и выделение ДНК проводили через стадию получения бактериальных клеток. При этом для получения фракции бактериальных клеток из почвенных образцов использовали четыре буфера (рис. 1).

Первый буфер (ТЕ; 30 мМ Тпв-НО, 10 мМ ЕВТА) наиболее часто применяют при выделении ДНК. Фосфатный буфер (№ 2) способствует десорбции клеток с почвенных частиц. Третий и четвертый буферы представляют собой буфер ТЕ с добавлением поливинилполипирролидона (РУРР) и додецилсульфата натрия (ЭОЭ) или цетилтриметиламмония бромида (СТАВ), которые способствуют удалению гуминовых кислот.

Для выделения ДНК из клеток, отмытых на предыдущей стадии от загрязняющих веществ, был выбран метод щелочного лизиса с последующей очисткой препаратов на ионообменных смолах. Эффективность такой процедуры очистки подтверждена многолетней практикой работы лаборатории с широким кругом прокариот.

Образец почвы

Отмывка клеток буферными растворами

1 ъ

Буфер 2

0,12MNa2HP04 рН 8,0

Буфер 3

ТЕ + 0,1М NaCl 1% PVPP, 2% SDS

Буфер 4

TE+l,5MNaCl, 1% СТАВ

Получение микробной фракции

Щелочной лизис клеток с последующей преципитацией белков и клеточного дебриса с помощью ацетата калия

Дополнительная очистка образцов на смоле Wizard MaxiPreps

Количественный и качественный контроль выделенной ДНК спектрофотометрически и с помощью ПЦР

Рисунок 1. Схема получения препаратов ДНК через стадию выделения фракции бактериальных клеток с помощью четырех различных буферных растворов.

Метод относительно нетрудоемок, не требует больших временных затрат, а получаемые препараты ДНК пригодны для дальнейшего ПДР-анализа.

Количественные и качественные характеристики препаратов ДНК, полученных с помощью различных буферных растворов из трех образцов почв, представлены в таблице I.

Таблица 1. Характеристики препаратов ДНК, выделенных из микробных сообществ различных типов почв с помощью четырех буферных растворов.

Тундровая, торфяио-глеевая почва (Воркута, февраль 2004)

буфер I буфер 2 буфер 3 буфер 4

А260/А280 1,80+0,21 1,92±0,30 1,97±0,21 1,69±0,27

Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 2,10+0,09 0,60±0,07 1,50±0,09 1,50±0,10

Серая лесная, суглинистая почва смешанного леса (Московская обл., г. Пущино, ноябрь 2003)

буфер 1 буфер 2 буфер 3 буфер 4

А260/А280 1,74±0,26 1,38±0,22 1,63±0,20 1,61±0,32

Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 1,90±0,10 2,00+0,10 1,40±0,10 2,90±0,05

Торфяная почва (Тверская обл., п. Сосвятское, октябрь 2003)

буфер 1 буфер 2 буфер 3 буфер 4

А260/А280 1,35±0,57 1,28±0,46 1,53±0,38 1,57±0,59

Кол-во ДНК на 1 г почвы, мкг 0,18±0,06 0,21±0,06 0,17±0,05 0,23 ±0,06

Все полученные препараты были проверены на пригодность к ПЦР-анализу и были использованы для получения как практически полной ПЦР-копии гена 16S рРНК (1481 п.н.), так и его фрагмента (508 п.н.) (рис. 2).

А. м

481 п.н. Я ш» ■ " щ jf М «я ф

508 п.н. fjiiwi. ММЙи 1

1 2 3 i 5 6 7 В Э 10 11 12 13 И 15 1 J 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Б. 481 п.н. 8 » iiii'^M к - NjlP"!» 1 508 п.н. 9 ^ ¡ii frf gj Kb.-:''. , ' : ft

■ . ■ .

1 2 3 4 5 S 7 8 9 10 11 12 1314 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

в.

481 п.н.

508 n.a

1 2 3 4 5 6 7~8 SM 0 11121314 15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15

Рисунок 2. Амплификация фрагментов генов I6S рРНК на препаратах ДНК, выделенных различными методами из микробных бактериальных сообществ: А - торфяно-глеевой почвы (г. Воркута); Б - серой лесной почвы (г, Пущино, Московская обл.); В - торфяной почвы (п. Сосвятское, Тверская обл.). Стрелкой указан целевой фрагмент (слева - размер фрагмента 1481 п.н., справа - 508 п.н.). Цифрами обозначены: 1 -маркер молекулярной массы ДНК; 2,3,4 - ДНК, выделенная способом 1; 5,6,7 - ДНК, выделенная способом 2; 8,9,10 - ДНК, выделенная способом 3; 11,12,13 - ДНК, выделенная способом 4; 14 - ДНК Escherichia coli (положительный контроль); 15 - Контроль в отсутствии ДНК матрицы.

В результате сопоставления этих данных со степенью чистоты препаратов ДНК (соотношение А26()/Ам0; в чистых препаратах >1,75) и выходом ДНК из 1 г почвы для дальнейшей работы был выбран способ 3 как наиболее оптимальный. Он был дополнительно протестирован на образцах 7 типов почв, существенно отличающихся по своим физико-химическим характеристикам и полученным как из интактных природных экосистем, так и из мест с повышенной антропогенной нагрузкой. Анализ результатов показал, что выбранным способом (№ 3) удается получить препараты ДНК приемлемой чистоты (соотношение А^м/Аш варьировало от 1,47 до 1,97) для всех 10 проанализированных типов почв, включая торфяную и торфяно-глеевую почвы, выделение ДНК из которых осложнено низкими значениями величин рН (3.9 и 5.0, соответственно) и высоким содержанием органических веществ. В результате проведения амплификации было показано, что препараты ДНК, полученные с помощью буфера 3, пригодны для получения ПЦР-фрагментов как частичного, так и практически полного гена 16Б рРНК (рис. З).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1Б 17

Б.

508 п.н. S ** Ш

1 2 3 4 5 6 7 Е 9 10 11 12 1314 15 15 17

Рисунок 3. Амплификация фрагментов генов 16S рРНК на препаратах ДНК, выделенных способом 3 из бактериальных сообществ различных типов почв. Стрелкой указан целевой фрагмент. А - размер фрагмента 1481 п.н., Б - размер фрагмента 508 п.н. Цифрами обозначены: 1-маркер молекулярной массы ДНК; 2, 3 - ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Жирона, Испания); 4, 5 - ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Гистель, Бельгия); 6, 7 - ДНК, выделенная из супесчаной пахотной почвы (Беллем, Бельгия); 8, 9 - ДНК, выделенная из супесчаной аллювиальной почвы (Стелленбош, ЮАР); 10 - ДНК, выделенная из суглинистой пахотной почвы (Пущино, Моск. обл.); 11 - ДНК, выделенная из суглинистой лесной почвы (Жирона, Испания); 12 -ДНК, выделенная из тундровой, торфяно-глеевой почвы (Воркута); 13 - ДНК, выделенная из торфяной почвы (п. Сосвятское, Тверская обл.); 14 - ДНК, выделенная из суглинистой лесной почвы (Пущино, Моск. обл.); 15 - ДНК, выделенная из суглинистой луговой почвы (Пущино, Моск. обл.); 16 - ДНК Escherichia coli (положительный контроль); 17 - Контроль в отсутствии ДНК матрицы.

2. Изучение последовательностей генов /нУН v различных микроорганизмов.

В исследованиях различных природных диазотрофных сообществ всегда обнаруживается большое количество неидентифицируемых прокариот. Это в значительной степени обусловлено ограниченностью базы данных для культивируемых микроорганизмов. Расширение базы данных последовательностей генов nifii для культивируемых азотфиксаторов способствует более полной идентификации микроорганизмов при исследовании природных сообществ. База данных последовательностей генов nifii для ряда групп аноксигенных фототрофных бактерий была невелика, тогда как эти прокариоты очень широко распространены в природе и имеют высокое экологическое значение. На начало нашего исследования фототрофные микроорганизмы, относящиеся к группе у-Протеобакгерий в базе данных GenBank были представлены единственной последовательностью фрагмента гена nifii Marichromatium purpuratum. Последовательности генов nifii 1руппы АНФБ вообще отсутствовали, несмотря на то, что у представителей рода Oscillochlorïs была отмечена способность к азотфиксации (Кеппен, 1989). В данном исследовании были определены последовательности генов rtifii 21 представителя фототрофных микроорганизмов, находящихся в коллекциях ИНМИ и кафедры микробиологии МГУ. Среди этих бактерий были представители 4 родов а-Протеобакгерий (Phaeospirillum, Rhodoblastus, Rhodoplanes, Rhodovulum), 5 родов у-Протеобакгерий (Âllochromatium, Thiocapsa, Ectothiorhodospira, Thiorhodospira, Halorhodospira), a также представитель ß-Протеобактерий из рода Rubrivivax. Кроме того, впервые были получены последовательности генов nifii Ose. trichoides (штаммы KP, Р, Dg6) из группы АНФБ.

Сравнительный анализ полученных последовательностей показал, что некоторые ранее неидентифицированные клоны из природных сообществ, представленные в базе данных GenBank, относятся к фототрофным бактериям.

3. Сравнение молекулярных, серологических и микроскопических методов для характеристики микробных сообществ.

Очень часто исследования природных микробных сообществ проводят с использованием какого-либо одного молекулярного ДНК-маркера. Однако изучение сложных природных систем требует комплексного подхода, поэтому при исследовании

состава модельного микробного сообщества мы использовали несколько методов: микроскопический, иммунологический и молекулярный, с целью сравнения их эффективности,

В качестве модельного объекта исследования нами были выбраны 3 метанокисляющие накопительные культуры (8В26, БВ31, 8В31А), выделенные из торфяной почвы верхового болота Сосвятское. Все культуры обладали растворимой метанмонооксигеназой (рММО) (нафталеновый тест). Культура 8В31 обладала интенсивным розово-оранжевым пигментом, тогда как у культуры 8В26 такая пигментация отсутствовала. Культура 8В31А - производная культуры вВЗ 1, утратившая пигментацию. Преимуществом накопительной культуры для исследования такого рода является то, что в ней искусственно ограничено количество компонентов по сравнению с естественным природным сообществом. Это позволяет проводить более точный анализ состава сообщества. Данная работа была проведена совместно с коллегами из ИНМИ.

3.1. Микроскопический и серологический анализ. При проведении электронно-микроскопического анализа по признаку наличия хорошо развитых внутриклеточных мембран в одной накопительной культуре (8В26) было выявлено присутствие только метанотрофов II типа, а в двух других (8В31 и вВ31А) - I и II типов. Таким образом, этот анализ позволил сделать предварительное заключение о составе исследуемых сообществ.

Для иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) были использованы видоспецифичные сыворотки, и по результатам проведенного исследования (Слободова и др., 2006) удалось не только выявить присутствие метанотрофов I и II типов, но и провести их видовую диагностику (табл. 2). Так, в культуре 8В26 было установлено наличие метанотрофов только II типа: МеЛу1а'тив ЫсУювропит и \iethylocystis echinoid.es. В культурах 5В31 и 8В31А были обнаружены метанотрофы как I, так и II типа: Ms. ШсУюзрогшт, МеИгу1ососсиз саряиШиз и МегкуЬтопсн теМатса были выявлены в культуре 8ВЗ1, а Ш. ¡гюЪохропит и Мс. сар$и1аш - в культуре 8ВЗ1 А.

3.2. Молекулярный анализ. Молекулярный анализ проводили независимо по двум типам функциональных генов - ртоА и т/Я. Метанмонооксигеназа (ММО) является ключевым ферментом окисления метана метанотрофами. В настоящее время выявлены две ферментные системы: растворимая (зММО) и мембраннсвязанная (рММО). рММО,

в отличие от sMMO, присутствует во всех известных метанотрофах, кроме Methylocella (Dedysh et al., 2000). Наиболее часто в экологических исследованиях используют анализ последовательностей гена ртоА, кодирующего 27 kDa субъединицу рММО (Holmes et al., 1995), и в нашей работе мы также использовали этот ген для анализа. Результаты исследования генов ртоА в целом согласуются с данными, полученными методом ИФА. С помощью анализа генов ртоА представители рода Methylocystis были выявлены во всех накопительных культурах, а рода Methylomonas - только в SB31. Однако, в отличие от результатов ИФА, Me. capsulatus в культуре SB31А обнаружен не был.

Присутствие генов нитрогеназного комплекса, в том числе гена nifH, было показано для представителей метанотрофов I и II типов, что позволило нам использовать этот ген в качестве молекулярного маркера (Булыгина и др., 2002). На момент исследования в базе данных GenBank последовательности генов nîfll для представителей родов Methylocella и Methylocapsa отсутствовали. Нами были определены последовательности фрагментов генов nifti. у Methylocella palustris К2а и Methylocapsa acidiphila В2, что позволило выявить присутствие Methylocella palustris в накопительных культурах и провести, соответственно, более точный анализ состава сообщества.

Суммарно для трех накопительных культур было получено 176 клонов, содержащих вставку фрагментов генов nifH. Результаты анализа генов nifH в целом согласуются с данными, полученными серологическим методом и исследованием генов ртоА. Анализ полученных клонов показал, что часть из них оказалась наиболее близкой к метанотрофам II типа из рода Methylocystis (98-99% сходства транслированных аминокислотных последовательностей). В накопительной культуре SB26 клон 2б-4п проявил наибольшее сходство с Mes. echinoides (99% сходства транслированных аминокислотных последовательностей), а клоны 26-Зп и 2б-5п - с Mes. minimus (98 и 99% сходства, соответственно). На дендрограмме, построенной на основе транслированных последовательностей генов nifti, все эти клоны образовали компактный кластер с Mes. minimus и Mes. echinoides (рис. 4). В накопительной культуре SB31 клоны 31-5п и 31А-1п обнаружили наибольшее сходство с Methylocella palustris (100 и 97% сходства транслированных аминокислотных последовательностей, соответственно).

0.1

~ клон 31-4п " клон 31-211 — клон 31-1п клон 31А-2п клон 31-6п клон 26-1D — клон 26-2п 77 Г Methylocystis minimus 41 —||клон 2б-5п 541| клон 26-Зп

55 т клон26-4п

Methylocystis echinoides 2 Bradyrhizobium elkanii 9? Г~ Methylocapsa acldiphila B2 Beijerinckia indica J Methylocystis sp.LW2 liAMethylocystis sp.LW5

Methylocystis methanolicus 10 '8J Methylosinus trichosporium 74

-—I Methylosinus trichosporium OB3B

Methylosinus sporium 22 Methylococcus capsulatus 115 Metfylococcus capsulatus 1! 4 p Methylocystisparvus 93

j-Methylocella silvestris BL2

72 (J клон 31-5n

: T-клон31А-1п

' Methylocella palustris K2A 9i f~~ клон 31-3n N "'" Rhizobium phaseoli 6HJ Azospirillum lipoferum 92 Azospirillum brasilense — Methylomonas methanica S1T ■I—P- Methylomonas rubra 23

MRthvInmnnnx methnnica 6R

»Of Methylobacter bovis 98 —П" Methylobacter marinus A45 5lr Methylobacter vinelandii 87 61 Methylobacter chroococcum 90

Paentbacillus polymyxa

ш »

Рисунок 4. Дендрограмма, построенная на основе анализа транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов генов т]Н.

Последовательности, полученные в данной работе, выделены жирным шрифтом. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «Ьоо1з1гар»-анализа 500 альтернативных деревьев.

На дендрограмме эти клоны образовали общий кластер с Мегку1осв11а ра1шШз, а клон 31-Зп группировался с АгозргШит ЬгагИепзгз (97% сходства транслированных аминокислотных последовательностей) и ЛЫгоЬшт рЬахеоИ (95% сходства).

В целом результаты, полученные четырьмя методами, дополняют друг друга (табл. 2). Некоторые различия могут быть объяснены несколькими причинами. Во-первых, согласно данным трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), доля метанотрофов I типа в накопительных культурах была довольно низкой.

Эти результаты согласуются с анализом библиотеки клонов гена ртоА, в которой последовательности, близкие к МеЛу1отопа$, составляли менее 4%. Возможно, именно низкая численность метанотрофов I типа явилась причиной того, что нам не удалось обнаружить бактерии рода МеЛуЬтопая с помощью анализа генов л//Н и МеЛуЬсоссиз с помощью анализа генов т/Н и ртоА. Кроме того, высокая степень вырожденности использованных праймеров и разница в эффективности работы праймерной системы на различных матрицах ДНК также могут искажать конечные результаты. И, наконец, хотя перекрестные реакции и видовая специфичность антител были проверены и подтверждены на чистых коллекционных культурах, иммунные характеристики метанотрофов в природных объектах могут отличаться.

Таким образом, ТЭМ позволяет выявлять особенности ультратонкой структуры клеток и может давать на этой основе предварительную количественную оценку исследуемого сообщества, однако не позволяет проводить идентификацию микроорганизмов даже на уровне семейства. ИФА дает важную информацию о составе сообщества, но его применение ограничивается наличием соответствующих сывороток. Молекулярные методы, хотя и обладают высокой разрешающей способностью, но также зависят от целого ряда факторов, влияющих на конечный результат. Критическими являются: эффективность выбранного метода выделения ДНК, результативность работы праймерной системы, наличие гена-мишени у исследуемых микроорганизмов (в нашем случае отсутствие ртоА у МеЖу1осе11а не позволило обнаружить данную бактерию в исследованных накопительных культурах).

Ограниченность базы данных также часто не позволяет проводить идентификацию микроорганизмов, о чем свидетельствует большое число последовательностей генов «некультивируемых» или неидентифицированных

микроорганизмов. Следовательно, только параллельное использование нескольких экспериментальных подходов позволяет получить наиболее полные данные о составе исследуемого сообщества.

Таблица 2. Сравнение результатов анализа состава накопительных культур, полученных

с помощью различных методов.

Культура ТЭМ ИФА Анализ генов pmo\ Анализ генов niJH

SB26 Метанотрофы И типа Methylosinus trichosporlum; Methylocystis echinoides Methylocystis echinoides Methylocystis echinoides, Methylocystis minimus; Methylocystis spp.

SB31 Метанотрофы I и II типов Methylosinus trichosporium; Methylococcus capsvlatus; Methylomonas methanica Methylocystis echinoides; s Methylomonas methanica Methylocystis echinoides, Methylocystis minimus; Methylocella palustris

SB31A Метанотрофы I и II типов Methylosinus trichosporium; Methylococcus capsulatus Methylocystis echinoides Methylocystis echinoides, Methylocystis minimus; Methylocella palustris

4.Анализ диазотрофного сообщества кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота.

До сих пор практически отсутствуют работы, посвященные определению биоразнообразия диазотрофов в кислых болотных почвах и выявлению их азотфиксирующего потенциала. Нами было изучено разнообразие азотфиксаторов в образцах кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота (п. Сосвятское, Тверская область) с помощью анализа последовательностей гена п{/Н и проведено сравнение наших результатов с данными ИФА, полученными коллегами из ИНМИ. Для молекулярного анализа состава диазотрофного сообщества суммарная ДНК была выделена из образцов торфа, взятых с глубины 10-20 см, на которой была показана наибольшая азотфиксирующая активность (Кравченко и Дорошенко, 2003). С использованием универсальных праймеров и Й.6 было получено и проанализировано

136 клонов, содержащих вставку генов nifii. Эти клоны были разделены на 25 различных групп (сиквенс-типов) и был проведен поиск близкородственных последовательностей в базе данных GenBank. В результате этого анализа мы смогли определить таксономическую принадлежность ряда выявленных последовательностей на уровне рода.

Так, транслированные аминокислотные последовательности генов nifH диазотрофов сиквенс-типа SB-1 были наиболее близкими с аналогичной последовательностью гена nifH ацидофильной метанотрофной бактерии Methyloceîla palustris (98% уровень гомологии). На дендрограмме представители этого сиквенс-типа образовали общий кластер с данным микроорганизмом. Сиквенс-тип SB-2 был близким к представителям рода Azospirillum (уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей - 95%). Для кислых торфяных почв этот факт был отмечен впервые и послужил основой для выделения в чистую культуру и описания нашими коллегами из ИНМИ (Дорошенко и др., 2006) новых штаммов Azospirillum lipoferum. Сиквенс-типы SB-3, SB-4, SB-5 оказались довольно близки между собой (уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей - 92-97%). На дендрограмме (рис. 5) они образовали отдельный кластер внутри группы а-Протеобактерий. Сиквенс-тип SB-6 оказался наиболее близким к представителям рода Methylocystis из группы метанотрофных бактерий II типа (93% гомологии транслированных аминокислотных последовательностей). Транслированные аминокислотные последовательности генов nifii сиквенс-типа SB-7 были близки к аналогичным последовательностям генов nifii представителей рода Bradyrhizobium (99% гомологии). На дендрограмме эта группа клонов и представители данного рода образовали общий кластер.

Сиквенс-типы SB-8 — SB-13 образовали отдельный кластер внутри группы у-Протеобактерий, наиболее близкий к представителям метанотрофов I типа из рода Methylobacter. Однако, достаточно низкий уровень гомологии (83-88%) между транслированными аминокислотными последовательностями клонов и аналогичными последовательностями представителей различных родов из у-Протеобактерий не позволяет их точно идентифицировать. Вероятно, в исследуемом микробном сообществе кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота присутствует несколько

различных видов до сих пор не описанных бактерий. Возможно также, что часть этих клонов относится к известным видам, последовательности генов ni fil которых пока не представлены в базе данных. Ранее с помощью ИФА, (И.К. Кравченко, устное сообщение), в данном микробном сообществе было показано присутствие метанотрофных бактерий I типа в незначительном количестве (4-5% от общего количества прокариот). Как и в случае минорных компонентов в накопительных культурах, мы также не смогли выявить этих бактерий, тем более что, по мнению ряда исследователей, предел чувствительности молекулярных подходов составляет около 5% (Bodrossy et al., 2003). Это еще раз подтверждает необходимость параллельного использования нескольких методов для исследования микробных популяций.

Довольно часто при анализе природных микробных сообществ диазотрофов обнаруживается большое количество неидентифицируемых микроорганизмов, входящих именно в у-подкласс Протеобактерий. Это было отмечено при изучении ризосферы риса (Ueda et al., 1995) и различных почвенных сообществ, а среди азотфиксаторов океана неидентифицируемые микроорганизмы, принадлежащие у-Протеобактериям вообще составляют основной филогип (Zehr et al., 1998; Bird et al., 2005). В нашем исследовании мы также не смогли точно идентифицировать ни один клон из группы у-Протеобактерий.

Сиквенс-тип SB-14 оказался близким к представителю 5-Протеобактерий Pelobacter propionicus из семейства Geobacteraceae (степень сходства между транслированными аминокислотными последовательностями составила 96%). На дендрограмме SB-14 и P. propionicus образовали общий кластер.

Сиквенс-типы SB-15 и SB-16 обнаружили наибольшее сходство с представителями группы АНФБ из рода Oscilhchloris. Присутствие таких микроорганизмов в кислой торфяной почве (pH 3.5-4.2) было показано, нами впервые. Уровень гомологии между транслированными аминокислотными последовательностями генов ni/H Ose. trichoides и других известных азотфиксаторов составляет менее 74%, поэтому высокий уровень гомологии между сиквенс-типами SB-15, SB-16 и Ose. trichoides (97%) с большой долей вероятности может свидетельствовать о присутствии данного микроорганизма в исследуемом микробном сообществе. Дополнительное исследование, проведенное в нашей лаборатории, подтвердило присутствие в данном местообитании микроорганизмов, близких к роду Oscillochloris.

|92r Methylocystis echinoides ' Methylocystis minimus

¡Jr- Bradyrhixobium japonicum Bradyrhizobium elkanii 97 »— Beijerinckia indica J Methylocapsa acidiphila

-Methvlocvstis methanolicus

|— Metkylococcus capsulatus Methylocella silvestris SB-1

Methylocella palustris Aiospirillum lipoferum Azospirillum brasilense

Glucortacetobacter diazotrophicus 79 '-Rhtzobium sp.NGR234

■SB-4

- SB-3

■ SB-5

■ SB-6

Halorhodospira abdelmalekii Halorhodospira halochloris »00 I Meihyhmonas methanica Methylomonas rubra

Klebsiella pneumoniae 1 Azotobacter chroococcum Ectothiorhodospira vacuolata Thiocapsa roseopersicina Methylobacier chroococcum /tob.

100 I Mpj

J Me.

iJF11

n1-Ectot

Methylobacier bovis

Methylobacier psychrophillus

SB-8

- SB-» SB-10 SB-ll 97 r SB-13 SB-12

Geobacter metallireducens

• SB-14

Pelobacter propionicus

a ftSB"15

,„ i-T" Oscillochloris trichoides R

_¡Sil L. SB-16

Oscillochloris trichoides Dg6

- SB-2S 98 [- SB-18 l-SB-17

■ Desulfcrvibrio vulgaris

} }

Pelodictyon luteum Chlorobium tepidum Chlorobium sp.Macesta

Prosthecochloris vibrioformis 95 I— SB-20 SB-19

I ^SB-

4_5I(— SB-21 I 84 I

Desulfovibrio gigas SB-23

Ьч

■ SB-22

a-PB

4-PB

6-PB

АНФБ

e P

III

-Methanosarcina barkeri

Рисунок 5. Дендрограмма, построенная на основе сравнительного анализа транслированных

последовательностей фрагментов генов nljH. Клоны, полученные в данном исследовании, выделены

жирным шрифтом. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным

расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с

помощью «bootstraps-анализа 500 альтернативных деревьев.

Представители остальных 9 сиквенс-типов (БВ-П - 8В-25) оказались близки к азотфиксаторам, относящимся к так называемому кластеру 3 (геЬг е1 а!., 2003). Этот кластер включает последовательности генов пЩ отдаленных групп микроорганизмов, большинство из которых строгие анаэробы (сульфатредуцирующие микроорганизмы, зеленые серные прокариоты, клостридии). Все полученные в нашем исследовании сиквенс-типы из кластера 3 не обнаружили близкого родства с идентифицированными микроорганизмами, уровень гомологии транслированных аминокислотных последовательностей составил менее 90%. Кроме того, уровень гомологии последовательностей полученных клонов в большинстве случаев был одинаков с аналогичными последовательностями, как представителей группы зеленых серных микроорганизмов, так и представителей рода ОезиУоу'Лпо. Этот факт уже был отмечен и другими авторами при исследовании различных диазотрофных природных сообществ (иес!а е1 а1., 1995; ОЫеита е1 а1., 1999; гаш е1 а1., 2000; МасОгевог е1 а!., 2001). Микроорганизмы из данного кластера, видимо, очень широко распространены в анаэробных или микроаэробных экологических нишах разных природных сообществ, однако точно идентифицировать их пока не представляется возможным.

Таким образом, в ходе нашего исследования мы выявили в образцах кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота значительное разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов, принадлежащих к различным филогенетическим группам. Полученные данные противоречат распространенному мнению о невысоком биоразнообразии микробных сообществ кислых торфяных почв и могут способствовать выделению и описанию новых микроорганизмов, а также применяться в дальнейших комплексных исследованиях болотных сообществ.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод выделения ПЦР-пригодных препаратов ДНК из почв, существенно различающихся по своим физико-химическим характеристикам, в том числе с низкими значениями рН и богатых органическими веществами.

2. Существенно расширена база данных последовательностей генов т/Н для ряда фототрофных микроорганизмов, и проведен их филогенетический анализ. По результатам анализа можно предположить, что некоторые нуклеотидные последовательности генов п\/Н некультивируемых микроорганизмов, представленные в базе данных СепВапк, принадлежат фотосинтезирующим микроорганизмам.

3. На примере модельной системы метанотрофных накопительных культур показано, что результаты анализа генов т/Н могут быть использованы для оценки биоразнообразия смешанных культур. Однако только одновременное использование нескольких методов позволяет получить более полные данные о составе исследуемых сообществ.

■ 4. Впервые исследовано биоразнообразие азотфиксирующих.прокариот в микробном сообществе кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота. Впервые в

■■ -кислой торфяной почве показано присутствие микроорганизмов, близких к ОхсИ1осЫог1$ и АгозртИит.

5. На примере выявления АгояртИит в микробном сообществе торфяной почвы показано, что данные ПЦР-диагностики позволяют уверенно предсказывать наличие тех или иных прокариот в микробном сообществе.

Список работ по материалам диссертации:

1. Запороженко Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв. Микробиология. 2006. 75 (1), 127-134.

2. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кеппен О.И., Кузнецов Б.Б., Ивановский Р.Н. Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и nifH. Микробиология. 2006. 75 (2), 235-244.

3. Слободова Н.В., Колганова Т.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К. Сравнительная характеристика метанотрофных накопительных культур с помощью серологических и молекулярных методов. Микробиология. 2006. 75 (3), 397-403.

4. Sizova M.V., Panikov N.S., Spiridonova Е.М., Slobodova N.V., Tourova T.P. Novel facultative anaerobic acidotolerant Telmatospirillum siberiense gen. nov. sp. nov. isolated from mesotrophic fen. Syst Appl Microbiol. 2006 Jul 27 (в печати).

5. Slobodova N., Boulygina E., Kuznetsov В., Kravchenko I. Diazotrophic diversity of acid peat soil microbial communities. 6th European Nitrogen Fixation Conference. Toulouse, France, July 24-27,2004, p. 109 (Abstracts).

6. Слободова H.B., Булыгина E.C., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Молекулярно-биологический анализ азотфиксирующих бактерий торфяной болотной почвы. Международная конференция «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения». Апатиты, Россия, 31 августа-3 сентября 2004 г. Материалы конференции, ч.2, стр.30.

7. Slobodova N.. Kolganova Т., Boulygina Е., Kuznetsov В., Tourova Т., Kravchenko I. Complex analysis of methanotrophs diversity in mixed cultures isolated from Sphagnum peat bog. 8th International Symposium on Biogeochemistry of Wetlands. Gent, Belgium, Sept 14-17, 2003, p. 30 (Abstracts).

8. Ushakova N.A., Tourova T.P., Slobodova N.V. The gut bacteria of monogastric vertebrate herbivores, participating in cellulose destruction during the nitrogen

deficiency. 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, Sept 1-5,2002, p.163 (Abstracts). 9. Slobodova N., Boulygina E., Kuznetsov В., Tourova Т., Marusina A., Kravchenko I. The application of universal niffl primers for analysis of N2-fixing bacteria. 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, Sept 1-5,2002, p.48 (Abstracts).

Подписано в печать 18.09.2006. Формат 60 х 84 1/16 Объем 1,5 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 151 Отпечатано СЮО«СПП»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слободова, Наталья Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ:.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Почва как среда обитания микроорганизмов.

Глава 2. Методы исследования сообществ почвенных микроорганизмов.

2.1. Традиционные микробиологические методы исследования.

2.1.1. Методы иммунодиагностики.

2.2. Молекулярные методы исследования сообществ.

2.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК.

2.2.2. ДНК реассоциация.

2.2.3. Методы на основе секвенирования нуклеиновых кислот.

2.2.4. Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦР-анализа.

2.2.4.1. ГГЕ-анализ.

2.2.4.2. Молекулярный фингерпринтинг на основе рестриктазной обработки фрагментов.

2.2.4.3. Модификации ПЦР-анализа со специфичными зондами и праймерами.

2.2.4.4. ПЦР со случайными праймерами.

2.2.5. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.

2.3 Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований.

2.3.1. Выделение ДНК.

2.3.2. Ограничения ПЦР анализа.

2.3.3. Ограничения использования ДГЕ-анализа.

2.3.4. Ограничения рестрикционного анализа.

2.3.5. Ограничения методов in situ гибридизации.

2.4. Системный подход в исследованиях микробных сообществ.

2.4.1. Анализ состава жирных кислот.

2.4.2. Определение физиологического профиля сообщества (Biolog).

2.4.3. Анализ проб со стабильными изотопами.

2.4.4. Методы клонирования тотального генома сообщества.

2.4.5. Анализ функциональных генов.

Глава 3. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов.

3.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота.

3.2. Строение и регуляция нитрогеназного комплекса.

3.3. Гены нитрогеназного комплекса.

3.4. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов в природных экосистемах.

3.5. Краткая характеристика аноксигенных фотосинтезирующих микроорганизмов.

3.6. Некоторые аспекты проблемы фиксации азота в болотных экосистемах. 46 Заключение.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Объекты исследования.

2. Получение препаратов ДНК.

2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов.

2.2 Получение препаратов ДНК из почвенных образцов.

2.2.1. Прямая экстракция нуклеиновых кислот из почвенных образцов.

2.2.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов через стадию выделения бактериальных клеток.

3. ПЦР-амплификация.

3.1. Амплификация генов 16S рРНК.

3.2. ПЦР со специфичными праймерами к гену nifH.

4. Очистка фрагментов ПЦР в агарозе.

5. Клонирование ПЦР-фрагментов.

5.1. Приготовление компетентных клеток.

5.2. Лигирование.

5.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК.

5.4. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК.

5.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК.

6. Секвенирование.

6.1. Меченые праймеров.

6.2. Постановка реакции секвенирования и форез.

7. Анализ полученных последовательностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1 Разработка экспресс-метода выделения ДНК из почвенных образцов.

1.1. Метод прямой экстракции нуклеиновых кислот из почвенного образца.

1.2. Получение препаратов ДНК через стадию выделения фракции бактериальных клеток.

2. Изучение последовательностей генов mfH различных представителей аноксигенных фототрофов и близких к ним микроорганизмов.

2.1. Выявление и анализ последовательностей фрагментов генов nifHy аноксигенных фототрофных микроорганизмов.

2.2. BLAST-анализ полученных последовательностей генов nifH.

3.1. Микроскопический и серологический анализ.

3.2. Молекулярный анализ.

4. Анализ диазотрофного сообщества кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота.

ВЫВОДЫ:.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH"

Микробные сообщества являются фундаментальными компонентами различных экосистем, и играют решающую роль в метаболизме органической материи и в биогеохимической трансформации элементов, включая процесс фиксации атмосферного азота. Существуют различные методы для изучения состава микробных сообществ. Традиционные подходы, основанные на культивировании микроорганизмов, имеют ряд ограничений и не позволяют в полной мере оценить биоразнообразие прокариот, составляющих данное микробное сообщество. В последнее время все чаще для анализа состава микробных сообществ используют молекулярно-экологические методы, которые позволяют избежать трудоемкой стадии предварительного культивирования организмов и делают возможным не только идентификацию микроорганизмов без культивирования, но и выявление бактерий, находящихся в неактивных формах.

Среди таких методов наиболее популярным является исследование микробных сообществ с помощью анализа последовательностей генов 16S рРНК, полученных амплификацией тотальной ДНК сообщества. Этот метод позволяет достаточно полно определить видовой состав сообщества, однако не устанавливает функциональную роль каждой филогенетической группы. Если возникает задача изучения какого-либо функционального свойства микробного сообщества, то проводят анализ последовательностей конкретных функциональных генов. В случае исследования азотфиксирующего потенциала наиболее часто используют гены nifi\, кодирующие Fe-белок нитрогеназы, ключевого фермента азотфиксации В ряде работ, в том числе выполненных в нашей лаборатории, было показано, что анализ последовательностей генов niJH, может быть успешно применен для исследования, как различных групп азотфиксирующих микроорганизмов, так и природных диазотрофных сообществ.

Азотфиксация - главное звено в цикле азота, так как именно этот процесс лимитирует все остальные этапы превращения азота в биогеохимическом цикле. Способность к биологическому связыванию атмосферного азота присуща только представителям мира прокариот. Микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, присутствуют практически во всех экосистемах. Однако распределение таких прокариот по различным биоценозам неоднородно и до сих пор недостаточно исследована их роль в биогеохимическом цикле азота наземных экосистем.

Фиксация азота атмосферы дает этим микроорганизмам возможность развиваться в местах, бедных соединениями азота или не содержащими их вовсе, и обогащать окружающую среду его связанными формами. К природным системам, где микробиологическая фиксация азота является единственным источником поступления в почву азотных соединений, доступных для растений и микроорганизмов, относятся почвы верховых олиготрофных болот (Verhoeven et al., 1996).

Кислые торфяные болота занимают свыше 3% общей земной поверхности и являются одной из преобладающих наземных экосистем в бореальной зоне Евразии и Северной Америки (Dedysh et al., 1998). Такая протяженность определяет их значимое участие в глобальных циклах биогенных элементов. Однако, несмотря на столь важную роль болотных экоценозов, их микробное разнообразие и в частности разнообразие азотфиксирующих прокариот все еще остается слабо изученным.

Поскольку именно процесс фиксации молекулярного азота играет ведущую роль в создании и поддержании азотного статуса биосферы Земли, изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот в различных природных экосистемах относится к одной из важнейших задач современной науки. Познание основных закономерностей процесса азотфиксации, возможно, позволит перейти к его активному регулированию и рациональному использованию природных экосистем, что, несомненно, станет большим достижением практической микробиологии.

Цель и задачи исследования:

Целью данной работы являлось изучение разнообразия азотфиксаторов в кислой торфяной почве сфагнового верхового болота на основании сравнительного анализа последовательностей генов niJH.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

2. Определение первичных последовательностей генов nifti фототрофных микроорганизмов, не представленных в базе данных.

3. Сравнение эффективности анализа последовательностей генов niJH и других методов для изучения биоразнообразия микробных сообществ.

4. Применение анализа последовательностей генов mJH для изучения состава азотфиксирующего сообщества торфяной болотной почвы.

Список сокращений, использованных в работе:

АНФБ - аноксигенные нитчатые фототрофные бактерии ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия ПВПГТ (PVPP) - поливинилполипирролидон ПЦР (PCR) - полимеразная цепная реакция

ТАЕ-буфер - буфер, содержащий в совей основе Трис-ацетат и EDTA

ТЕ-буфер - буфер, содержащий в совей основе Трис и EDTA

ЦТАБ (СТАВ) - цетилтриметиламмонийбромид, цетавлон

ЭДТА (EDTA) - этилендиаминтетраацетат

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота;

ГЦ - содержание гуанина и цитозина в процентах/моль к общей массе ДНК; RAPD - randomly amplified polymorphic DNA;

RFLP - restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длины фрагментов рестрикциии);

Трис-HCl - трис (гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид;

АТФ - аденозинтрифосфат;

IPTG - р-Д-тиогалактопиранозид;

X-GAL - Х-галактоза;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ПНК - полинуклеотидкиназа;

АДФ - аденозинтрифосфат; dNTP - деоксинуклеотидтрифосфат;

NJ - neighbor-joining (метод ближайшего связывания);

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Слободова, Наталья Валерьевна

Выводы:

2. Существенно расширена база данных последовательностей генов nift\ для ряда фототрофных микроорганизмов, и проведен их филогенетический анализ. По результатам анализа можно предположить, что некоторые нуклеотидные последовательности генов nifti некультивируемых микроорганизмов, представленные в базе данных GenBank, принадлежат фотосинтезирующим микроорганизмам.

3. На примере модельной системы метанотрофных накопительных культур показано, что результаты анализа генов nifti могут быть использованы для оценки биоразнообразия смешанных культур. Однако только одновременное использование нескольких методов позволяет получить более полные данные о составе исследуемых сообществ.

4. Впервые исследовано биоразнообразие азотфиксирующих прокариот в микробном сообществе кислой торфяной почвы сфагнового верхового болота. Впервые в кислой торфяной почве показано присутствие микроорганизмов, близких к Oscillochloris и Azospirillum.

5. На примере выявления Azospirillum в микробном сообществе торфяной почвы показано, что данные ПЦР-диагностики позволяют уверенно предсказывать наличие тех или иных прокариот в микробном сообществе.

Заключение

С помощью молекулярно-биологических методов можно получать данные, позволяющие как проводить идентификацию прокариот, так и изучать их эволюционные взаимоотношения. Применение данных методов в микробной экологии дает более полную информацию о составе микробного сообщества. Наиболее перспективным подходом для исследований в области молекулярной экологии является изучение разнообразия функциональных генов, позволяющее выявлять микроорганизмы, выполняющие определенную функцию в данной экосистеме.

В последнее время все больше возрастает интерес к проблеме микробиологической фиксации азота в связи с перспективностью его использования для нужд сельского хозяйства и промышленности. Несмотря на большую экологическую и практическую значимость азотфиксации, неясными остаются такие вопросы, как соотношение активно метаболизирующих и покоящихся форм, видовое разнообразие азотфиксаторов в различных природных экосистемах.

В целом остается еще много вопросов, касающихся экологии диазотрофов в болотных экоценозах. Применение новейших молекулярно-биологических методов совместно с традиционными подходами позволит в полной мере оценить биоразнообразие диазотрофов в таких уникальных природных экосистемах и, возможно, приблизит исследователей к решению одной из важнейших проблем современной микробной экологии почв: о выявлении связей между активностью и направленностью почвенных процессов и структурой микробных сообществ, их осуществляющих. В связи

48 с этим изучение биоразнообразия азотфиксирующего микробного сообщества кислых торфяных почв, а также выявление генов нитрогеназного комплекса у уже описанных микроорганизмов весьма актуально.

Объекты и методы исследования.

1. Объекты исследования

Объектами исследования служили штаммы микроорганизмов из коллекции лаборатории Классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ), коллекции кафедры Микробиологии Биологического факультета МГУ. Список микроорганизмов приведен в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слободова, Наталья Валерьевна, Москва

1. Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Турова Т.П., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. Изучение нуклеотидных последовательностей генов nijН у представителей метанотрофных бактерий // Микробиология, 2002.- Т. 71.-С. 1-9.

2. Вомперский С.Э., Иванов А.И., Цыганова О.П., Валяева Н.А., Глухова Т.В., Дубинин А.И., Глухов А.И., Маркелова JI.P. Заболоченные органогенные почвы и болота России и запас углерода в торфах // Почвоведение, 1994.- Т. 12.- С. 26-34.

3. Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология, в печати.

4. Запороженко А.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв // Микробиология, 2006.-Т. 75.-№ 1.-С. 127-134.

5. Кравченко И.К., Дорошенко Е.В. Азотфиксирующая активность торфяной почвы верхового болота//Микробиология, 2003,- Т. 72.- № 1.- С. 111-116.

6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв,- М.: Изд-во МГУ, 1983.- 248 с.

7. Вомперский С.Э. Азотфиксация в лесных биогеоценозах.- М.: Наука, 1987.- 150 с.

8. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии.- М.: ГЕОС, 2001.- 500 с.

9. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий.- М.: Мир, 1982.- 288 с.

10. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию: Учебное пособие,- М.: Книжный дом «Университет», 2001.- 256 с.

11. Зименко Т.Г. Микроорганизмы, превращающие азотсодержащие соединения торфяных почв // в кн. Микробные ценозы торфяных почв и их функционирование (под ред. Мишустина).- Мн.: Наука и техника, 1983.- 181 с.

12. Калакуцкий JI.B., Парийская А.Н. Азотфиксирующие симбиозы актиномицетов с растениями // Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1982.- Т.2.- С. 255-265.

13. Кеппен О.И., Лебедева Н.В., Трошина О.Ю., Родионов Ю.В. Нитрогеназная активность нитчатой фототрофной зеленой бактерии // Микробиология, 1989.- Т. 58,- С. 520-521.

14. Клевенская И.Л. Олигонитрофильные микроорганизмы почв Западной Сибири.-Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1974.- 220 с.

15. Клевенская И.Л. Структура ценозов несимбиотических гетеротрофных диазотрофов и активность азотфиксации в различных почвах // в кн. Биологическая фиксацияазота (под ред. Шумного В.К., Сидоровой К.К.).- Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1991.- 271 с.

16. Кондратенко Г.П., Николенко Ю.И., Безрукова Л.В., Нестеров А.И., Гальченко В.Ф. Идентификация метанотрофных бактерий методом иммунофлуоресценции // Микробиология, 1981.- Т.50.- С. 320-325.

17. Львов Н.П. Новые свободноживущие азотфиксирующие микроорганизмы // Изв. АН СССР. Сер. Биол., 1963.- №2.- С. 272-282.

18. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов nijН различных таксономических групп прокариот // Микробиология, 2001.- Т.70.-№1.- С. 86-91.

19. Мисник А.Г. Торф как среда обитания микроорганизмов // в кн. Микробные ценозы торфяных почв и их функционирование (под ред. Мишустина).- Мн.: Наука и техника, 1983.- 181 с.

20. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Биологическая фиксация атмосферного азота.-М.: Наука, 1968.- 531 с.

21. Родионов Ю.В., Лебедев Н.В. Регуляция азотофиксации свободноживущих бактерий//Успехи микробиологии, 1987.- Т.21.- С. 151-175.

22. Справочник биохимика. Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. М.: Мир, 1991. - 544 с.

23. Штина Э.А. Азотфиксация у синезеленых водорослей // Экология и физиология синезеленых водорослей.- М.: Наука, 1965.- С. 160-177.

24. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация.- М.: Изд-во МГУ, 1986.- 132 с.

25. Чемерис А.В., Ахунов Э.Д., Вахитов В.А. Секвенирование ДНК.- М.: Наука, 1999.-С. 199-204.

26. Achenbach L.A., Carey J., Madigan M.T. Photosynthetic and Phylogenetic Primers for Detection of Anoxygenic Phototrophs in Natural Environments // Appl-Environ Microbiol, 2001.- V.67.- № 7.- P. 2922-2926.

27. Aerts R. Climate, leaf litter chemistry and leaf litter decomposition in terrestrial ecosystems: a triangular relationship // Oikos, 1997.- № 79.- P. 439-449.

28. Aerts R., De Caluwe H. Nutritional and plant-mediated controls on leaf litter decomposition of Car ex species // Ecology, 1997.- № 78.- P. 244-260.

29. Aerts R., van Logtestijn R.S.P., Karlsson P.S. Nitrogen supply differentially affects litter decomposition rates and nitrogen dynamics of sub-arctic bog species // Oecologia, 2005.

30. Aerts R., Wallen В., Maimer N. Growth limiting nutrients in Sphagnum-dominated bogs subject to low and high atmospheric nitrogen supply // Journal of Ecology 80, 1992.- № l.-P. 131-140.

31. Affourtit J., Zehr J.P., Paerl H.W. Distribution of nitrogen-fixing microorganisms along the Neuse river estuary, North Carolina // Microb Ecol, 2001.- № 41.- P. 114-123.

32. Aldous A. Nitrogen retention by Sphagnum mosses: responses to atmospheric nitrogen deposition and drought // Canadian Journal of botany 80, 2002.- № 7.- P. 721-731.

33. Amann R., Glockner F-O., Neef A. Modern methods in subsurface microbiology: in situ identification of microorganisms with nucleic acid probes // FEMS Microbiol Rev, 1997.-№20,- P. 191-196.

34. Amann R.L., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol Rev, 1995.- V.59.- P. 143169.

35. Bagwell C.E., La Rocque J.R., Smith G.W., Poison S.W., Friez M.J., Longshore J.W., Lovell C.R. Molecular diversity of diazotrophs in oligotrophic tropical seagrass bed communities // FEMS Microbiol Ecol, 2002.- № 39.- P. 113-119.

36. Basilier K., Granchall U., Stenstrom T. Nitrogen fixation in wet minerotrophic moss communities of a subarctic mire // Oikos, 1978,- V. 31№ 2.- P. 236-240.

37. Becker S., Boger P., Oehlmann R., Ernst A. PCR bias in ecological analysis: a case study for quantitative Taq nuclease assays in analyses of microbial communities // Appl Environ Microbiol, 2000.- № 66.- P. 4945-4953.

38. Beimfohr C., Krause A., Amann R., Ludwig W., Schleifer K.H. In situ identification of lactococci, enterococci, and streptococci // Syst Appl Microbiol, 1993,- № 16.- P. 450456.

39. Bej A.K., Perlin M., Atlas R.M. Effect of introducing genetically engineered microorganisms on soil microbial community diversity // FEMS Microbiol Ecol, 1991.-V. 86.- P. 169-176.

40. Berg В., Matzner E. Effect of N deposition on plant litter and soil organic matter in forest systems // Environmental Rev, 1996.- № 5.- P. 1-25.

41. Berthelet M., Whyte L.G., Greer C.W. Rapid, direct extraction of DNA from soils for PCR analysis using polyvinylpolypyrrolidone spin columns// FEMS Microbiol Lett, 1996,-V. 138.-№ l.-P. 17-22.

42. Bird С., Martinez J.M., 0,Donnell A.G., Wyman M. Spatial distribution and transcriptional activity of an uncultured clade of planktonic diazotrophic y-Proteobacteria in the Arabian sea // Appl Environ Microbiol, 2005.- V. 71.- P. 2079-2085.

43. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucl Acids Res, 1979.- V. 7.- P. 1513-1523.

44. Bishop P.E., Premakumar R., Dean D.R., Jacobsen M.R., Chisnell J.R., Rizzo T.M., Kopczynski J. Nitrogen fixation by Azotobacter vinelandii strains having deletions in structural genes for nitrogenase // Science, 1985.- P. 92-94.

45. Bochner B. Breathprints at the microbial level //ASM News, 1989.- № 55.- P. 536-539.

46. Bodrossy L., Stralis-Pavese N., Murrell J.C., Radajewski S., Wellharter A., Sessitsch A. Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs // Environ Microbiol, 2003.- V. 5.- P. 566-582.

47. Boison G., Mergel A., Jolkver H., Bothe H. Bacterial life and dinitrogen fixation at a gypsum rock // Appl Environ Microbiol, 2004.- № 70.- P. 7070-7077.

48. Bossio D.A., Scow K.M., Gunapala N., Graham K.J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles // Microb Ecol, 1998.- № 36.- P. 1-12.

49. Bowden W.B. The biogeochemistry of nitrogen in fresh-water wetlands // Biogeochemistry, 1987.- V. 4.- P. 313-348.

50. Braun S., Proctor L., Zani S., Mellon M.T., Zehr J.P. Molecular evidence for zooplankton-associated nitrogen-fixing anaerobes based on amplification of the nifH gene // FEMS Microbiol Ecol, 1999.- № 28,- P. 273-279.

51. Breen A., Rope A. F., Taylor D., Loper J. C., Sferra P. R. Application of DNA amplification fingerprinting (DAF) to mixed culture bioreactors // J Ind Microbiol, 1995.-№ 14.- P. 10-15.

52. Bryantseva I., Gorlenko V.M., Kompantseva EI, Imhoff JF, Suling J, Mityushina L. Thiorhodospira sibirica gen. nov., sp. nov., a new alkaliphilic purple sulfur bacterium from a Siberian soda lake // Int J Syst Bacteriol, 1999.- V. 49.- № 2.- P. 697-703.

53. Britschgi Т. В., Giovannoni S. J. Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing // Appl Environ Microbiol, 1991.-№57.- P. 1707-1713.

54. Bruns A., Cypionka H., Overmann J. Cyclic AMP and acyl homoserine lactones increase the cultivation efficiency of heterotrophic bacteria from the Central Baltic Sea // Appl Environ Microbiol, 2002.- № 68.- P. 3978-3987.

55. Buchholz-Cleven B.E., Rattunde В., Straub K. Screening for genetic diversity of isolates of anaerobic Fe (II) -oxidizing bacteria using DGGE and whole-cell hybridization // Syst Appl Microbiol, 1997.- № 20.- P. 301-309.

56. Burgess B.K., Lowe D.J. Mechanism of molybdenum nitrogenase // Chem Rev, 1996.- № 96.-P. 2983-3012.

57. Btirgmann H., Widmer F., Von Sigler W., Zeyer J. New molecular screening tools for analysis of free-living diazotrophs in soil // Appl Environ Microbiol, 2004.- № 70.- P. 240-247.

58. Burns J. A., Zehr J.P., Caponel D.G. Nitrogen-Fixing Phylotypes of Chesapeake Bay and Neuse River Estuary Sediments // Microb Ecol, 2002.- № 44,- P. 336-343.

59. Bussmann I., Pester M., Brune A., Schink B. Preferential cultivation of type II methanotrophic bacteria from litoral sediments (Lake Constance) // FEMS Microbiol Ecol, 2004.-V. 47.-P. 179-189.

60. Button D. K., Schut F., Quang P., Martin R., Roberston B. R. Viability and isolation of marine bacteria by dilution culture: theory, procedures, and initial results // Appl Environ Microbiol, 1993.-№59.- P. 881-891.

61. Cantera J.J. L., Kawasaki H., Seki T. The nitrogen-fixing gene (ni/H) of Rhodopseudomonas palustris a case of lateral gene transfer // Microbiology, 2004.- V. 150.- P. 2237-2246.

62. Chapman R.C., Hemond, H.F. Dinitrogenfixation by surface peat and Sphagnum in an ombrotrophic bog // Canadian Journal of Botany 60, 1982,- № 5.- P. 538-543.

63. Chen Y.B., Dominic В., Mellon M.T., Zehr J.P. Circadian rhythm of nitrogenase gene expression in the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. Strain IMS 101 // J Bacteriol, 1998.-№ 180.- P. 3598-3605.

64. Connon S.A., Giovannoni S.J. High-throughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates // Appl Environ Microbiol, 2002,-№68.- P. 3878-3885.

65. Crowder A.A., Pearson M.C., Grubb P.J., Langlois P.H. Biological flora of the British isles. Drosera L. // Journal of Ecology, 1990.- V. 78.- P. 233-267.

66. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.V. Acidophilic methanotrophic communities from Sphagnum peat bog// Appl Environ Microbiol, 1998.- V. 64.- P. 922-929.

67. Dedysh S.N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S., Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl Environ Microbiol, 2006.- V. 72.- № 3.- P. 2110-2117.

68. DeLong E.F., Wickham G.S., Pace N.R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells // Science, 1989.- V. 10.- P. 1360-1363.

69. Derry A.M., Staddon W.J., Kevan P.G., Trevors J.T. Functional diversity and community structure of micro-organisms in three arctic soils as determined by sole-carbon-source-utilization // Biodivers Conserv, 1999.- № 8.- P. 205-221.

70. Devereux R., Kane M.D., Winfrey J., Stahl D.A. Genus- and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulfate-reducing bacteria // Syst Appl Microbiol, 1992.- № 15.- P. 601-608.

71. Distel D.L., Lane D.J., Olsen G.J., Giovannoni S.J., Pace В., Pace N.R., Stahl D.A., Felbeck H. Sulfur-oxidizing bacterial endosymbionts: analysis of phylogeny and specificity by 16S rRNA sequences//J Bacteriol, 1988.- V. 6.- P. 2506-2510.

72. Dojka M.A., Harris J.K., Pace N.R. Expanding the known diversity and environmental distribution of an uncultured phylogenetic division of bacteria // Appl Environ Microbiol, 2000.-V. 4.- P. 1617-1621.

73. Doolittle W.F. Lateral genomics // Trends Cell Biol, 1999.- V. 12.- P. 5-8.

74. Dubiley S., Kirillov E., Mirzabekov A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers // Nucleic Acids Res, 1999.- V. 27.- P. 19-24.

75. Dunbar J., Takala S., Barns S.M., Davis J.A., Kuske C.R. Levels of bacterial community diversity in four arid soils compared by cultivation and 16S RNA gene cloning // Appl Environ Microbiol, 1999.-№. 65.- P. 1662-1669.

76. Durrant M.C. An atomic-level mechanism for molybdenum nitrogenase. Part 1. Reduction ofdinitrogen// Biochemistry, 2002.-№41.- P. 13934-13945.

77. Duyvis M.G., Mensink R.E., Wassink H., Haaker H. Evidence for multiple steps in the presteady-state electron transfer reaction of nitrogenase from Azotobacter vinelandii // Biochim Biophys Acta, 1997,- № 1320.- P. 34-44.

78. Ellis R.J., Morgan P., Weightman A.J., Fry J.C. Cultivation-dependent and -independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil // Appl Environ Microbiol, 2003.- V. 6,- P. 3223-3230.

79. Ellis R.J., Thompson I.P., Bailey M.J. Metabolic profiling as a means of characterizing plant-associated microbial communities // FEMS Microbiol Ecol, 1995.- № 16.- P. 9-18.

80. Eller G., Frenzel P. Changes in activity and community structure of methane-oxidizing bacteria overgrowth period of rice //Appl Environ Microbiol, 2001.- V. 67.- P. 2395-2403.

81. Embley T.M., Finlay B.J., Brown S. RNA sequence analysis shows that the symbionts in the ciliate Metopus contortus are polymorphs of a single methanogen species // FEMS Microbiol Lett, 1992.- № 97.- P. 57-62.

82. Fani R., Gallo R., Lio P. Molecular evolution of nitrogen fixation: the evolutionary history of the nijD, nijK, niJE, and ш/N genes // J Mol Evol, 2000.- № 51.- P. 1-11.

83. Farrelly У., Rainey F. A., Stackebrandt E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species // Appl Environ Microbiol, 1995.-№ 61.- P. 2798-2804.

84. Ferris M.J., Ward D.M. Seasonal distribution of dominant 16S rRNA-defined populations in a hot spring microbial mat examined by denaturing gradient gel electrophoresis // Appl Environ Microbiol, 1997,-№63.- P. 1375-1381.

85. Ferris M.J., Muyzer G., Ward D.M. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial community // Appl Environ Microbiol, 1996.- № 62.- P. 340-346.

86. Fisher S., Lerman L. // Proc Natl Acad Sci,1983.- V. 80.- P. 1579-1583.

87. Fjellbirkeland A., Torsvik V, Ovreas L. Methanotrophic diversity in an agricultural soil as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis profiles of pmoA, mxaF and 16S rDNA sequences//Antonie Van Leeuwenhoek, 2001.- V. 79.-№ 2.- P. 209-217.

88. Frostergard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X., Simonet P. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils // Appl Environ Microbiol, 1999.- V. 65,- P. 5409-5420.

89. Galchenko V.F. Ecology of methanotrophic bacteria in aquatic ecosystems // Physisol Gen Biol Rev, 1995.- V.9.-P. 1-92.

90. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level-sole-carbon-source utilization // Appl Environ Microbiol, 1991.-№ 51.- P. 2351-2359.

91. Garland J.L. Patterns of potential С source utilization by rhizosphere communities // Soil Biol Biochem, 1996.-№ 28.- P. 223-230.

92. Garrity G.M., Holt J.G. Phylum BV1. Chloroflexi phy. nov. // Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edn / Eds. Boone D.R., Castenholz R.W., Garrity G.M. New York, Berlin, Heidelberg: Springer, 2001.- P. 427-446.

93. Gich F., Garcia-Gil J., Overmann J. Previously unknown and phylogenetically diverse members of the green nonsulfur bacteria are indigenous to freshwater lakes // Arch Microbiol, 2001.-V. 177.- P. 1-10.

94. Grayston S.J., Griffith G.S., Mawdsley J.L., Campbell C.D., Bardgett R.D. Accounting for variability in soil microbial communities of temperate upland grassland ecosystems // Soil Biol Biochem, 2001.-№ 33.- P. 533-551.

95. Guschin D.Y., Mobarry В., Prudnikov D., Stahl D.A., Ritmann B.E., Mirzabekov A.D. Oligonucleotide microchips as genosensors for determinative and environmental stadies in microbiology // Appl Environ Microbiol, 1997.- V. 65.- P. 2397-2402.

96. Hadrys H., Balick M., Schierwater B. Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology // Mol Ecol, 1992.- № 1.- P. 55-60.

97. Hageman R.V., Burris RH. Nitrogenase and nitrogenase reductase associate and dissociate with each catalytic cycle // Proc Natl Acad Sci USA, 1978.- № 75.- P. 26992702.

98. Halbleib С. M., Ludden P.W. Regulation of biological nitrogen fixation // J Nutr, 2000.-№ 130,- P. 1081-1084.

99. Hales B.A., Edwards C., Ritchie D.A., Hall G., Pickup R.W., Saunders J.R. Isolation and identification of methanogen-specific DNA from blanket bog peat by PCR amplification and sequence analysis // Appl Environ Microbiol, 1996.- V. 62.- P. 668-675.

100. Hamelin J., Fromin N., Tarnawski S., Teyssier-Cuvelle S., Aragno M. nifH gene diversity in the bacterial community associated with the rhizosphere of Molinia coerulea, an oligonitrophilic perennial grass // Environ Microbiol, 2002.- № 4.- P. 477-481.

101. Hanada S., Takaichi S., Matsuura K., Nakamura K. Roseiflexus castenholzn gen. nov., sp. nov., a thermophilic, filamentous, photosynthetic bacterium that lacks chlorosomes // Int J Syst Evol Microbiol, 2002.- V. 52.- P. 87-193.

102. Hardy R.W., Knight E.Jr., D'Eustachio A.J. An energy-dependent hydrogen-evolution from dithionite in nitrogen-fixing extracts of Clostridium pasteurianum // Biochem Biophys Res Commun, 1965,- № 20.- P. 539-544.

103. Hattori Т., Mitsui H., Haga H., Wakao N., Shikano S„ Gorlach K., Kasahara Y., El-Beltagy A., Hattori R. Advances in soil microbial ecology and the biodiversity // Antonie Leeuwenhoek, 1997.- № 72.- P. 21-28.

104. Hemond H.F. The nitrogen budget of Thoreau's Bog // Ecology, 1983.- V. 64.- P. 99-109.

105. Hennecke H., Kaluza K., Thony В., Fuhrmann M., Ludwig W., Stackebrandt E. Concurrent evolution of nitrogenase genes and 16S ribosomal-RNA in Rhizobium species and other nitrogen-fixing Bacteria // Arch Microbiol, 1985,- № 142.- P. 342-348.

106. Hobbie S.E., Vitousek P.M. Nutrient limitation of decomposition in Hawaiian forests // Ecology, 2000.-№ 81.- P. 1867-1877.

107. Holben W.E., Jansson J.K., Chelm B.K., Tiedje J.M. DNA probe method for the detection of specific microorganisms in the soil bacterial community // Appl Environ Microbiol, 1988.- V. 54,- P. 703-711.

108. Holmes D.E., Nevin K.P., Lovley D.R. Comparison of 16S rRNA, niffi, recA, gyrB, rpoB and fusA genes within the family Geobacteraceae fam. nov. // Int J Syst Evol Microbiol, 2004.- V. 54.- P. 1591-1599.

109. Hopkins D.W., MacNaughton S.J., O'Donnell A.G. A dispersion and differential centrifugation technique for representatively sampling microorganisms from soil // Soil Biol Biochem, 1991.- V. 23.- P. 217-225.

110. Huang P.M., Bollag J.-M. Minerals-organics-microorganisms interactions in the soil environment // In: Structure and Surface Reactions of Soil Particles (eds. P.M. Huang, N. Senesi, J.-M. Bollag), 1998.- John Wiley & Sons, New York.- P. 3-39.

111. Hugenholtz P., Goebel B.M., Pace N.R. Impact of culture-independent studies on the emerging phylogenetic view of bacterial diversity // J Bacteriol, 1998.- № 180.- P. 47654774.

112. Ibekwe A.M., Kennedy A.C. Fatty acid methyl ester (FAME) profiles as a tool to investigate community structure of two agricultural soils // Plant Soil, 1999.- № 206.- P. 151-161.

113. Igarashi R.Y., Seefeldt L.C. Nitrogen fixation: The mechanism of the Mo-dependent Nitrogenase // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2003.- № 38.- P. 351-384.

114. Imhoff J.F. True marine and halophilic anoxygenic phototrophic bacteria // Arch Microbiol, 2001.- V. 176.- P. 243-254.

115. Imhoff J.F., Suling J. The phylogenetic relationship among Ectothiorhodospiraceae. A reevaluation of their taxonomy on the basis of 16S rDNA analysis // Arch Microbial, 1996.- V. 165.- P. 106-113.

116. Imhoff J.F., Truper H.G. Marine sponges as habitats of anaerobic phototrophic bacteria // Microb Ecol, 1976.-№ 3.- P. 1-9.

117. Ivanovsky R.N. Calvin cycle in a green mesophilic filamentous bacterium Oscillochloris trichoides strain DG6 // In EMBO Workshop on Green and Heliobacteria, Nyborg, Denmark, 1993, August 16-19, Abstracts, p. 42.

118. Jacobitz S., Bishop J. Regulation of nitrogenase-2 in Azotobacter vinelandii by ammonium, molybdenum, and vanadium // Bacteriol, 1992.- № 12.- V. 174.- P. 38843888.

119. Jenkins B.D., Steward G.F., Short S.M., Ward B.B., Zehr J.P. Fingerprinting diazotroph communities in the Chesapeake Bay by using a DNA macroarray // Appl Environ Microbiol, 2004.- V. 3.- № 70,- P. 1767-1776.

120. Johnsen K., Jacobsen C.S., Torsvik V., Serensen J. Pesticide effects on bacterial diversity in agricultural soils a review // Biology and Fertility of Soils, 2001.- № 33,- P. 443-453.

121. Kalmbach S., Manz W., Szewzyk U. Isolation of new bacterial species from drinking water biofilms and proof of their in situ dominance with highly specific 16S rRNA probes // Appl Environ Microbiol, 1997.- № 6.- P. 4164-4169.

122. Kelly J.J., Haggblom M. Tate R.L. Changes in soil microbial communities over time resulting from one time application of zinc: a laboratory microcosm study // Soil Biol Biochem, 1999.- №31.- P. 1455-1465.

123. Kent A.D., Smith D.J., Benson B.J. Triplett E.W. Web-based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities // Appl Environ Microbiol, 2003.- V. 11.- № 69.- P. 6768-6776.

124. Keppen O.I., Krasilnikova E.N. The activity of tricarboxylic acid cycle enzymes in Oscillochloris trichoides И Mikrobiologiya, 1995.- V. 64.- P. 714-715.

125. Kern M., Kamp P.B., Paschen A., Masepohl В., Klipp W. Evidence for a regulatory link of nitrogen fixation and photosynthesis in Rhodobacter capsulatus via HvrA // J Bacteriol, 1998.-№ 180.- P. 1965-1969.

126. Kessler P.S., Blank C., Leigh J.A. The nif gene operon of the methanogenic archaeon Methanococcus maripaludis И J Bacteriol, 1998.- № 180.- P. 1504-1511.

127. Kim К., Zhang Y.P., Roberts G.P. Correlation of activity regulation and substrate recognition of the ADP-ribosyltransferase that regulates nitrogenase activity in Rhodospirillum rubrum IIJ Bacteriol, 1999.-№ 181.- P. 1698-1702.

128. Kirchhof G., Schloter M., Apmus В., Hartmann A. Molecular microbial ecology approaches applied to diazotrophs associated with non-legumes // Soil Biol Biochem, 1997.- V. 29.- P. 853-862.

129. Koerselman W., De Caluwe H., Kieskamp W.M. Denitrification and dinitrogen fixation in two quaking fens in the Vechtplassen area, The Nederlands // Biogeochemistry, 1989.-V.8.- P. 153-172.

130. Kolb S., Knief C., Stubner S., Conrad R. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays // Appl Environ Microbiol, 2003.- V. 69.-№ 5.- P. 2423-2429.

131. Krey R., Puhler A., Klipp W.A. Defined amino acid exchange close to the putative nucleotide binding site is responsible for an oxygen-tolerant variant of the Rhizobium meliloti NifA protein // Mol Gen Genet, 1992.- V. 3.- № 234.- P. 433-441.

132. Krsek M., Wellington E.M.H. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil // J Microbiol Methods, 1999.- № 39.- P. 1-16.

133. Kuhry P., Vitt D.H. Fossil carbon/nitrogen ratios as a measure of peat decomposition // Ecology, 1996.-V. l.-№77.- P. 271-275.

134. Kurnikov I.V., Charnley A.K., Beratan D.N. From ATP to electron transfer: Electrostatics and Free-Energy Transduction in nitrogenase // J Phys Chem Biol, 2001.- № 105.- P. 5359-5367.

135. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic Acid Techniques in Bacterial systematics (Eds. Stackebrandt E., Goodfellow M., Chichester, UK: John Wiley & Sons), 1991.- P. 115-177.

136. Leff L., Dana J.R., McArthur J.V., Shimkets L.J. Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments // Appl Environ Microbiol, 1995.- V. 61.- P. 1141-1143.

137. Li Y., Vitt D.H. Patterns of retention and utilization of aerially deposited nitrogen in boreal peatlands // Ecoscience, 1997.- V. 1.- № 4.- P. 106-116.

138. Liesack W., Weyland H., Stackrbrandt E. Potential risk of gene amplifycation by PCR as determined by 16S rDNA analysis of a mixed-culture of strict barophilic bacteria // Microb Ecol, 1991.- V. 21.- P. 191-198.

139. Loomis W.D., Battaile J. Plant phenolic compounds and the isolation of plant enzymes // Phytochemistry, 1966.- № 5.- P. 423-428.

140. Lovell C.R., Piceno Y.M., Quattro J.M., Bagwell C.E. Molecular analysis of diazotroph diversity in the rhizosphere of the smooth cordgrass, Spartina alternijlora II Appl Environ Microbiol, 2000.- V. 66.- № 9.- P. 3814-3822.

141. Lyons E.M., Thiel T. Characterization of niJB, mJS, and mjU genes in the cyanobacterium Anabaena variabilis. NiJB is required for the vanadium-dependent nitrogenase // J Bacteriol, 1995.-V. 177.-№6.- P. 1570-1575.

142. MacGregor B.J., Van Mooy В., Baker B.J., Mellon M., Moisander P.H., Paerl H.W. Microbiological, molecular biological and stable isotopic evidence for nitrogen fixation in the open waters of Lake Michigan // Environ microbiol, 2001,- № 3,- P. 205-219.

143. MacNaughton S.J., O'Donnell A. G., Embley Т. M. Permeabilization of mycolic acid containing actinomycetes for in situ hybridization with fluorescently labeled oligonucleotide probes // Microbiology, 1994.- № 140.- P. 2859-2864.

144. Madigan M., Cox S.C., Stegeman R.A. Nitrogen fixation and nitrogenase avtivities in members of the family Rhodospirillaceae И J. Bacteriol., 1984,- V. 157.- № 1.- P. 73-78.

145. Madigan M. T. Microbiology of nitrogen fixation in photosynthetic bacteria // In Anoxygenic photosynthetic bacteria (ed. Blankenship R.E., Madigan M.T., Bauer C.E.) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1995.- P. 915-928.

146. Malik K.A., Clous D. Xanthobacter Jlavus, a new species nitrogen-fixing hydrogen bacteria // Int J Syst Bacteriol, 1979.- V. 29.- № 24.- P. 283-287.

147. Malik M., Kain J., Pettigrew C., Ogram A. Purification and molecular analysis of microbial DNA from compost // J Microbiol Methods, 1994.- № 20.- P. 183-196.

148. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.H. Phylogenetic oligodeoxynucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions // System Appl Microbiol, 1992,- № 15.- P. 593-600.

149. McCaig A.E., Grayston S.J., Prosser J.I., Glover L.A. Impact of cultivation on characterisation of species composition of soil bacterial communities // FEMS Microb Ecol, 2001.- № 35.- P. 37-48.

150. McDonald I.R., Hall G.H., Pickup R.W., Murrell J.C. Methane oxidation potentials and preliminary analysis of methanotrophs in a blanket bog using molecular ecology techniques//FEMS Microbiol Ecol, 1996.- V. 21.- P. 197-211.

151. Mehta M.P., Butterfield D.A., Baross J.A. Phylogenetic Diversity of Nitrogenase (nifH) Genes in Deep-Sea and Hydrothermal Vent Environments of the Juan de Fuca Ridge // Appl Environ Microbiol, 2003,- V. 69.- № 2.- P. 960-970.

152. Mergel A., Schmitz O., Mallmann Т., Bothe H. Relative abundance of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in layers of a forest soil // FEMS Microbiol Ecol, 2001.- V. 36.-№ 1.- P. 33-42.

153. More M.I., Herrick J.В., Silva M.C., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment // Appl Environ Microbiol, 1994.- № 60.- P. 1572-1580.

154. Mortenson L.E. Ferredoxin and adenosine triphosphate (ATP) requirements for N fixation in cell-free extracts of Clostridium pasterianum // Proc Nat Acad Sci USA, 1964.- № 52.-P. 272-279.

155. Murray A.E., Hollibaugh J.T., Orrego C. Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two California estuaries compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA fragments //Appl Environ Microbiol, 1996.- № 62.- P. 2676-2680.

156. Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini M.T., Landi L., Pietramellara G., Renella G. Microbial diversity and soil functions // European Journal of Soil Science, 2003.- V. 54.-№4.- P. 655-670.

157. Nordbakken J.F., Ohlson M., Hogberg P. Boreal bog plants: nitrogen sources and uptake of recently deposited nitrogen // Environmental Pollution, 2003.- V. 126.- P. 191-200.

158. Normand P., Bousquet J. Phylogeny of nitrogenase sequences in Frankia and other nitrogen-fixing microorganisms // J Mol Evol, 1989.- № 29.- P. 436-447.

159. Ogram A., Sayler G.S., Barkay T. The extraction and purification of microbial DNA from sediments // J Microbiol Methods, 1987.- № 7.- P. 57-66.

160. Ohkuma M., Noda S., Kudo T. Phylogenetic diversity of nitrogen fixation genes in the symbiotic microbial community in the gut of diverse termites // Appl Environ Microbiol, 1999.- V. 11.- № 65.- P. 4926-4934.

161. Ohkuma M., Noda S., Usami R., Horikoshi K., Kudo T. Diversity of nitrogen fixation genes in the symbiotic intestinal microflora of the termite Reticulitermes speratus // Appl Environ Microbiol, 1996.- № 62.- P. 2747-2752.

162. Olsen G.J., Lane D.J., Giovannoni S.J., Pace N.R., Stahl D.A. Microbial ecology and evolution: a ribosomal RNA approach // Ann Rev Microbiol, 1986.- № 40.- P. 337-365.

163. Olson J.B., Steppe T.F., Litaker R.W., Paerl H.W. N2-Fixing Microbial Consortia Associated with the Ice Cover of Lake Bonney, Antarctica // Microb Ecol, 1998.- V. 36.-№3.- P. 231-238.

164. Pace N.R. A molecular view of microbial diversity and the biosphere // Science, 1997.- V. 276.- P. 734-740.

165. Parkes R.J. Analysis of microbial communities within sediments using biomarkers // In: Ecology of microbial communities (eds. Flatscher M., Gray T.M.G., Johns G.) Cambridge University Press, London, 1987.-P. 147-177.

166. Parkin T.B. Soil microsites as a source of denitrification variability // Soil Science Society of America Journal, 1987.- №51.- P. 1194-1199.

167. Pedersen K., Arlinger J., Ekendahl S., Hallbeck L. 16S rRNA gene diversity of attached and unattached bacteria in boreholes along the access tunnel to the Aspo hard rock laboratory, Sweden // FEMS Microbiol Ecol, 1996.- № 19.- P. 249-262.

168. Peters J.W., Fisher K., Dean D.R. Nitrogenase structure and function: a biochemical-genetic perspective // Annu Rev Microbiol, 1995.- V. 49.- P. 335-366.

169. Petersen S.O., Nielsen Т.Н., Frostegard A., Olesen Т. O2 uptake, С metabolism and denitrification associated with manure hot-spots // Soil Biology and Biochemistry, 1996.-№28.- P. 341-349.

170. Piceno Y.M., Noble P.A., Lovell C.R. Spatial and temporal assessment of diazotroph assemblage composition in vegetated salt marsh sediments using denaturing gradient gel electrophoresis analysis // Microb Ecol, 1999.- № 38.- P. 157-167.

171. Poly F., Monrozier L.J., Bally R. Improvement in the RFLP procedure for studying the diversity of nifii genes in communities of nitrogen fixers in soil // Res Microbiol, 2001.-V. 152.- № 1.-P. 95-103.

172. Poly F., Ranjard L., Nazaret S, Gourbiere F., Monrozier L.J. Comparison of mfi\ gene pools in soils and soil microenvironments with contrasting properties // Appl Environ Microbiol, 2001.- V. 67.- № 5.- P. 2255-2262.

173. Post W.M., Emanuel W.R., Zinke P.J., Stangenberger A.G. Soil carbon pools and world life zones //Nature, 1982.- № 298.- P. 156-159.

174. Postgate J. Nitrogen fixation // Inst Biol Stud Biol L: Arnold, 1978.- № 92,- P. 40.

175. Poulsen L.K., Ballard G., Stahl D.A. Use of rRNK fluorescence in situ hybridization for measuring the activity of single cells in young and established biofilms // Appl Microbiol, 1993,- V. 59.- P. 1354-1360.

176. Prakash R.K., Schilperoort R.A., Nuti M.P. Large plasmids of fast-growing rhizobia: homology studies and location of structural nitrogen fixation (nij) genes // J Bacteriol, 1981.-№ 145.- P. 1129-1136

177. Prieme A., Sitaula J.I.B., Klemedtsson A.K., Bakken L.R. Extraction of methane-oxidizing bacteria from soil particles // FEMS Microbiol Ecol, 1996.- V. 21.- P. 59-68.

178. Proctor L.M. Nitrogen-fixing, photosynthetic, anaerobic bacteria associated with pelagic copepods//Aquat Microb Ecol, 1997.-№ 12.-P. 105-113.

179. Puhler A., Klipp W. Biology of inorganic nitrogen and sulfur // Ed. A. Trebst В., Heidelberg // Springer Verlag1981.- № 4.- P. 276-286.

180. Radajewski S., Inesson Ph., Parekh N.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology // Nature, 2000.- № 403.- P. 646-649.

181. Radajewski S., Webster G., Reay D.S., Morris S.A., Ineson Ph., Nedwell D.B., Prosser J.I., Murrell J.C. Identification of active methylotroph populations in acidic forest soil by stable-isotope probing// Microbiology, 2002.- № 148.- P. 2331-2342.

182. Rainey F.A., Ward N., SlyL.I., Stackebrandt E. Dependence on the taxon composition of clone libraries for

183. Raymond J., Siefert J.L., Staples C.R., Blankenship R.E. The natural history of nitrogen fixation // Mol Biol Evol, 2004.- V. 21,- № 3.- P. 541-554.

184. Reysenbach A.L., Wickham G.S., Pace N.R. Phylogenetic analysis of the hyperthermophilic pink filament community in Octopus Spring, Yellowstone National Park // Appl Environ Microbiol, 1994.- V. 60,- P. 2113-2119.

185. Reysenbach A.L., Giver L.J., Wickham G.S., Pace N.R. Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction // Appl Environ Microbiol, 1992.- V. 58.- P. 3417-3418.

186. Roling W.F.M., van-Breukelen В., Groen J. Analysis of microbial leachate polluted aquifer using physiological profiling and 16S // Microb Ecol, 2000.- № 40.- P. 177-188.

187. Roll J.T., Shah V.K., Dean D.R., Roberts G.P. Characteristics of NIFNE in Azotobacter vinelandii strains: implications for the synthesis of the iron-molybdenum cofactor of dinitrogenase // J Biol Chem, 1995.- № 270.- P. 4432-4437.

188. Rosch C., Mergel A., Bothe H. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil // Appl Environ Microbiol, 2002,- № 68.- P. 3818-3829.

189. Rosello-Mora R., Amann R. The species concept for procariotes // FEMS Microbiol Rev, 2001,-№25.- P. 39-67.

190. Rosswall Т., Granhall U. Nitrogen cycling in a subarctic ombrotrophic mire // Ecological Bulletines, 1980.- № 30.- P. 209-234.

191. Saano A., Kaijalainen S., Lindstrom K. Inhibition of DNA immobilization to nylone membrane by soil compounds // Microb, 1993.- V. 2.- P. 153-160.

192. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science, 1988.- № 239,- P. 487-491.

193. Sait M., Hugenholtz P., Janssen P. H. Cultivation of globally distributed soil bacteria from phylogenetic lineages previously only detected in cultivation-independent surveys // Environ Microbiol, 2002.- № 4.- P. 654-666.

194. Sambrook J., Fritsch E.F., Manniatis Molecular cloning: a laboratory manual // Ed.: C. Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

195. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc Natl Acad Sci USA, 1977.- V. 84.- P. 5463-5467.

196. Seewaldt E., Schleifer К., Bock E., Stackebrandt E. The close phylogenetic relationship of Nitrobacter and Rhodopseudomonas palustris //Arch Microbiol, 1982.- № 131.- P. 287290.

197. Sessitsch, Weilharter A., Gerzabek M.H., Kirchmann H., Kandeler E. Microbial population structures in soil particle size fractions of a long-term fertilizer field experiment // Appl Environ Microbiol, 2001.- № 67.- P. 4215-4224.

198. Shaffer B.T., Widmer F., Porteous L.A., Seidler R.J. Temporal and Spatial Distribution of the mfi\ Gene of N(2) Fixing Bacteria in Forests and Clearcuts in Western Oregon // Microb Ecol, 2000.- V.39.-№ 1.- P. 12-21.

199. Short S.M., Zehr J.P. Quantitative analysis of niJW genes and transcripts from aquatic environments // Methods Enzymol, 2005.- № 397,- P. 380-394.

200. Siemann S., Schneider K., Drottboomt M., Muller A. The Fe-only nitrogenase and the Mo nitrogenase from Rhodobacter capsulatus II Eur J Biochem, 2002.- № 269.- P. 1650-1661.

201. Smalla K., Creswell N., Mendoca-Hagler L.C., Wolters A., van Elsas J.D. Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplification // J Appl Bacteriol, 1993.-№ 74.- P. 78-85.

202. Spring S., Amann R., Ludwig W, Schleifer K-H., van Gemerden H., Petersen N. Dominating role of an unusual magnetotactic bacterium in the microaerophilic zone of a freshwater sediment// Appl Environ Microbiol, 1993.- № 59.- P. 2397-2403.

203. Stackebrandt E., Liesack W., Goebel B.M. Bacterial diversity in a soil sample from a subtropical Australian environment as determined by 16S rDNA analysis // FASEB J, 1993.-№7.- P. 232-236.

204. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward-Rainey N. Anoxygenic phototrophy across the phylogenetic spectrum: current understanding and future perspectives // Arch Microbiol, 1996.- № 166.- P. 211-223.

205. Stahl D.A., Lane D.J., Olsen G.J., Pace N.R. Characterization of a Yellowstone hot spring microbial community by 5S ribosomal RNA sequences // Appl Environ Microbiol, 1985.-№49.- P. 1379-1384.

206. Steffan R.J., Goksoyr J., Bej A.K., Atlas R.M. Recovery of DNA from soils and sediments // Appl Environ Microbiol, 1988.- № 54.- P. 2908-2915.

207. Steppe T.F., Paerl H.W. Potential ^-fixation by sulfate-reducing bacteria in a marine intertidal microbial mat // Aquat Microb Ecol, 2002.- № 28.- P. 1-12.

208. Steward G.F., Jenkins B.D., Ward B.B., Zehr J.P. Development and testing of a DNA macroarray to assess nitrogenase (niJW) gene diversity // Appl Environ Microbiol, 2004.-V. 70.-№3.-P. 1455-1465.

209. Stokes H.W., Holmes A.J., Nield B.S., Holley M.P., Nevalainen K.M., Mabbutt B.C., Gillings M.R. Gene cassette PCR: sequence-independent recovery of entire genes from environmental DNA // Appl Environ Microbiol, 2001.- V. 67.- № 11.- P. 5240-5246.

210. Stotzky G. Soil as an environment for microbial life // In: Modern Soil Microbiology (eds van Elsas J.D., Trevors J.T., Wellington E.M.H.), Marcel Dekker, New York, 1997.- P. 120.

211. Tajima F., Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences // Mol Biol Evol, 1984.- V. 1,- P. 269-285.

212. Tan Z.Y., Wang E.T., Peng G.X., Zhu M.E., Martinez-Romero E., Chen W.X. Characterization of bacteria isolated from wild legumes in the north-western regions of China // Int J Syst Bacteriol, 1999.- № 49.- P. 1457-1469.

213. Taroncher-Oldenburg G., Griner E.M., Francis C.A., Ward B.B. Oligonucleotide microarray for the study of functional gene diversity in the nitrogen cycle in the environment // Appl Environ Microbiol, 2003.- V. 69.- № 2.- P. 1159-1171.

214. Tebbe C.C., Vahjen W. Interference of humic acid and DNA extraction directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and yeast // Appl Environ Microbiol, 1993.- V. 59.- P. 2657-2665.

215. Theron J., Cloete Т.Е. Molecular techniques for determining microbial diversity and community structure in natural environments // Critical Reviews in Microbiology, 2000.-V. 26.-№ 1.- P. 37-57.

216. Thiel T.J. Characterization of genes for an alternative nitrogenase in the cyanobacterium Anabaena variabilis IIJ Bacteriol, 1993.- V. 175.-№ 19.- P. 6276-6286.

217. Thiel Т., Lyons E.M., Erker J.C., Ernst A. A second nitrogenase in vegetative cells of a heterocyst-forming cyanobacterium // Proc Natl Acad Sci USA, 1995.- № 92.- P. 93589362.

218. Tibbies B. J., Rawlings D.E. Characterization of nitrogen-fixing bacteria from a temperate saltmarsh lagoon, including isolates that produce ethane from acetylene // Microb Ecol, 1994.-№27.- P. 65-80.

219. Torsvik V., Ovreas L. Microbial diversity and function in soil: from genes to ecosystems // Current Opinion in Microbiology, 2002.- V. 3.- № 5.- P. 240-245.

220. Tsai Y.L., Olson B.H. Detection of low numbers of bacterial cells in soils and sediments by polymerase chain reaction // Appl Environ Microbiol, 1992.- № 58.- P. 754-757.

221. Tsein H.C., Hanson R.S. Solube methane monooxygenase component В gene probe for identification of methanotrophs that rapidly degrade trichloroethylene // Appl Environ Microbiol, 1992.- V. 58.- P. 953-960.

222. Tunnicliffe V. Hydrothermal vent communities of the deep-sea // American Scientist, 1992,-№80,- P. 336-349.

223. Ueda Т., Suga Y., Yashiro N., Matsuguchi T. Remarkable N2-fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolutionary analysis of nifii gene sequences // J Bacteriol, 1995.-№ 177.- P. 1414-1417.

224. Vecherskaya M.S., Galchenko V.F., Sokolova E.N., Samarkin V.A. Activity and species composition of aerobic methanotrophic communities in tundra soils // Curr Microbiol, 1993.-V. 27.- P. 181-184.

225. Verhoeven J.T.A., Koerselman W., Meuleman A.F.M. Nitrogen- or phosphorous-limited growth in herbaceous, wet vegetation: relations with atmospheric inputs and management regimes // Trends in Ecology and Evolution, 1996.- V. 12.- №11.- P. 494-497.

226. Wang S., Chen J., Johnson J.L. The presence of five ш/H-like sequences in Clostridium pasteurianum: sequence divergence and transcription properties // Nucleic Acids Res, 1988,-№ 16.- P. 439-454.

227. Ward D.M., Weller R., Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in natural community // Nature (London), 1990.- V. 345.- P. 63-65.

228. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R., Ruff-Roberts A.L. Ribosornal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature // Adv Microb Ecol, 1992.- № 12.- P. 219-286.

229. Waughman G.J. Investigations of nitrogenase activity in rheotrophic peat // Can J Microbiol, 1976.- V. 22.- P. 1561-1566.

230. Welsh D.T. Review: Nitrogen fixation in seagrass meadows: Regulation, plant-bacteria interactions and significance to primary production // Ecol Lett, 2000.- № 3.- P. 58-71.

231. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. Analysis of nijti gene pool complexity in soil and litter at a Douglas fir forest site in the Oregon cascade mountain range // Appl Environ Microbiol, 1999.- V. 65.- № 2.- P. 374-380.

232. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol Rev, 1987.- V. 51.- P. 221-271.

233. Woese C.R., Debrunner-Vossbrinck В., Oyaizu H., Stackebrandt E., Ludwig W. Gram-positive bacteria: possible photosynthetic ancestry // Science, 1985.- № 229.- P. 762-765.

234. Woese C.R., Gutell R., Gupta R., Noller H.F. Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids // Microbiol Rev, 1983.- V. 47.- P. 621669.

235. Wang G.C-Y., Wang Y. The frequency of chimeric molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S rRNA genes from different bacterial species // Microbiology, 1996.-№ 142.- P. 1107-1114.

236. Yeager C.M., Northup D.E., Grow C.C., Barns S.M., Kuske C.R. Changes in nitrogen-fixing and ammonia-oxidizing bacterial communities in soil of a mixed conifer forest after wildfire // Appl Environ Microbiol, 2005.- V. 71.- № 5.- P. 2713-2722.

237. Young C.C., Burghoff R.L., Keim L.G., Minak-Bernero V., Lute J.R., Hinton S.M. Polyvinylpyrrolidone-agarose gel electrophoresis purification of polymerase chane reaction-amplifiable DNA from soil // Appl Environ Microbiol, 1993.- V. 50.- P. 19721974.

238. Young Y.P.W. Classification of nitrogen fixing organisms // In Biological nitrogen fixation (eds. Stacy G., Burris R.H., Evans H.Y.), Chapman and Hall, New York, 1990.-P. 1-21.

239. Zani S., Mellon M.T., Collier J.L., Zehr J.P. Expression of nijH Genes in Natural Microbial Assemblages in Lake George, New York, Detected by Reverse Transcriptase PCR // Appl Environ Microbiol, 2000.- V. 66.- № 7.- P. 3119-3124.

240. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M., Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison // Environ Microbiol, 2003.-№ 5.- P. 539-554.

241. Zehr J.P., Mellon M., Braun S., Litaker W., Steppe Т., Paerl H.W. Diversity of heterotrophic nitrogen fixation genes in a marine cyanobacterial mat // Appl Environ Microbiol, 1995.- V. 61.- P. 2527-2532.

242. Zehr J.P., Mellon M.T., Zani S. New nitrogen-fixing microorganisms detected in oligotrophic oceans by amplification nitrogenase (nijH) genes // Appl Environ Microbiol, 1998.-№64.- P. 3444-3450.

243. Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review // Biol Fertil Soils, 1999.- № 29.-P. 111-129.

244. Zhou J., Bruns M.A., Tiede J.M. DNA recovery from soils of diverse composition // Appl Environ Microbiol, 1996.- V. 62.- P. 316-322.

Информация о работе

Слободова, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов nifH - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы