Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой

Задорина, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой"

□03457785

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М В ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

на правах рукописи

ЗАДОРИНА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

Бноразнообразие дназотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой

03 00 07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

,2 ДЕК Я®

Москва. 2008

003457785

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Центре "Биоинженерия" РАН

Научным руководитель: кандидат биологических наук,

Булыгииа Евгения Станиславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горленко Владимир Михайлович

кандидат биологических наук Манучарова Наталья Александровна

Ведущая организация: РГАУ Московская сельскохозяйственная академия

(МСХА) имени К. А. Тимирязева

Защита состоится 23 декабря 2008 года в 15 ч 30 мин на заседании Диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени В.М. Ломоносова.

Автореферат разослан " ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Н.Ф. Пискункова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Азот — элемент, который, как никакой другой лимитирует ресурсы питательных веществ в экосистемах. Биологическая фиксация атмосферного азота представляет собой уникальный процесс, осуществление которого в различных биогеоценозах происходит исключительно за счет метаболической активности прокариот. При этом особую роль играет этот процесс в экстремальных местах обитания, а также в агросистемах, обеспечивая значительную часть азотного питания сельскохозяйственных культур даже в условиях применения азотных удобрений.

Несмотря на огромный интерес исследователей к изучению различных аспектов азотфиксации, до сих пор малоизученными остаются вопросы, связанные с количественной оценкой, пространственным распределением диазотрофов по экосистемам, видовым составом азотфиксирующих прокариот. С появлением современных молекулярно-биологических подходов возможности изучения почвенных диазотрофных сообществ значительно расширились, тем не менее высокие финансовые затраты, часто сопутствующие таким исследованиям, и связанная с этим необходимость использования приемов, упрощающих анализ, все еще не позволяют более полно проводить такие работы. Так, одним из самых мощных молекулярно-биологических методов оценки разнообразия микробных сообществ является анализ библиотек клонов функциональных генов, в частности генов нитрогеназного комплекса, к которым относится ген ш/Н. Однако при использовании этого метода в большинстве работ применяется либо анализ заведомо небольших выборок традиционным объемом в 100 клонов, либо стратегия скрининга клонов, основанная на рестрикции и других приемах. Такие упрощения далеко не всегда отражают реальное разнообразие микроорганизмов in situ, особенно при анализе сложных микробных сообществ. В этой связи представляется весьма ценным проведение исследований, в которых метод клонирования генов нитрогеназного комплекса использовался бы без упрощающих анализ приемов. В настоящее время такие работы практически отсутствуют.

Поскольку изучение биоразнообразия азотфиксирующих микроорганизмов в различных природных экосистемах относится к важнейшим задачам микробной экологии, то проведение работ по оценке внутренней структуры диазотрофных сообществ и выявлению доминирующих микробных популяций азотфиксаторов в почвах с различной антропогенной нагрузкой является очень актуальным. Несомненно, такие исследования представляют ключевое звено на пути к пониманию основных закономерностей функционирования процесса азотфиксации. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось проведение оценки биоразнообразия почвенных диазотрофов методом клонирования фрагментов гена nijH на примере

естественной экосистемы торфяного болота и ризосфер биотехнологических (БР) и контрольных растений (КР) картофеля.

Задачи исследования состояли в следующем:

1) Оценить биоразнообразие диазотрофов в образце торфяной почвы естественной экосистемы болота "Сосвятское" с помощью метода клонирования гена Ы]Н.

2) Оценить биоразнообразие диазотрофов в образцах почв, отобранных из ризосфер БР и КР картофеля, с помощью анализа библиотек клонов фрагментов гена т]Н.

3) Сравнить структуры диазотрофных сообществ торфяной почвы и сельскохозяйственной почвы. Научная новизна работы. Впервые исследовано биоразнообразие диазотрофов в торфяной почве с помощью непосредственного анализа библиотеки фрагментов гена пЦН без использования процедур предварительного скрининга клонов. Установлено, что видовое богатство азотфиксирующих микроорганизмов в торфе было существенно выше, чем считалось раньше; и для покрытия всего разнообразия диазотрофов в этой экосистеме необходим размер библиотеки, превышающий традиционно используемое количество в 100 клонов. Впервые исследована структура диазотрофных сообществ почв, отобранных из ризосфер БР и КР картофеля, с помощью анализа библиотеки клонов фрагментов гена тн/Н. Показано, что разнообразие диазотрофов в ризосфере картофеля было значительно ниже по сравнению с торфяной почвой. Достоверных различий в структурах микробных сообществ почв, отобранных из ризосфер БР и КР картофеля, выявлено не было.

Практическая значимость работы. На примере модельной системы диазотрофного сообщества торфяной почвы показано, что традиционного объема выборки в 100 клонов не всегда достаточно для исследования разнообразия диазотрофов в экосистеме. На примере диазотрофного сообщества агроэкосистемы установлено, что для получения более полной информации о видовом составе микробного сообщества необходим анализ нескольких библиотек. Полученные нами данные существенно расширяют представление о таксономическом разнообразии азотфиксирующих микроорганизмов в кислой торфяной и пахотной почвах. Кроме того, результаты, полученные в ходе оценки биоразнообразия азотфиксаторов в ризосферах БР и КР, в целом расширяют представления о влиянии трансгенных растений на почвенные микробные сообщества и могут использоваться в качестве необходимой базы для сравнения с результатами последующих исследований, направленных на дополнение, проверку и уточнение полученных в наших исследованиях данных.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 11 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2007),

Международной научно-практической конференции "Биотехнология: вода и пищевые продукты" (Москва, 2008), XLVI Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, 2008) и на IV семинаре "Использование нанотехнологий в агропромышленном комплексе" (Москва, 2008). Публикации. Основные материалы, обсуждаемые в диссертации, опубликованы в 2 статьях и 4 тезисах конференций. 2 статьи приняты к печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 135 страницах машинописного текста и включают 28 рисунков и 10 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Литературный обзор", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Материалы и методы исследования", "Результаты и обсуждения"), "Выводы" и "Список литературы", который содержит 26 отечественных и 211 иностранных наименования.

Место проведения работы ч сотрудничество. Работа проводилась в Центре "Биоинженерия" РАН. Образцы почвы ризосфер БР и КР картофеля, а также их физико-химическая характеристика, были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории грибных болезней картофеля и овощных культур Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии РАСХН (ВНИИФ). Образцы кислой торфяной почвы сфагнового болота п. Сосвятское (Тверская обл., Россия), а также их физико-химическая характеристика, были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН (ИНМИ). Определение последовательностей нуклеиновых кислот фрагментов гена иг/Н было выполнено в сотрудничестве с к.б.н. Колгановой Т.В., разработка специфических праймерных систем - при содействии к.б.н. Булыгиной ЕС. Автор выражает глубокую благодарность всем упомянутым участникам данной работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. Рендомизированный образец кислой торфяной почвы был отобран в ноябре 2005 г. из центральной части олиготрофного болота "Сосвятское" (Западно-Двинская полевая станция Института лесоведения РАН; Тверская обл.), покрытого растительным сообществом, состоящим из Sphagnum sp., Oxycoccus quadripetalus и Carex rostrata. Образцы отбирали асептически в виде блоков объемом 200 см3 с глубины 10-20 см, показавшей наибольшую нитрогеназную активность. Величина рН почвенных образцов составляла 3.9, влажность - около 92%.

В работе также были использованы образцы почв, отобранные из ризосферы трех контрольных и трех биотехнологических сортов картофеля ("Луговской", "Чародей", "Голубизна"), несущих ген тауматина (ГанП), придающего устойчивость к основным грибным

болезням. Физико-химическая характеристика образцов почв представлена в таблице 1. Схема расположения контрольных и опытных делянок на экспериментальном поле представлена на рисунке 1. Распределение делянок на поле носило случайный характер. Размер каждой делянки составлял 2 м2. Выращивание картофеля проводилось на сертифицированном МВКГИД РФ полевом участке ВНИИ фитопатологии. Семенные клубни трансгенных линий и контролем были предоставлены Центром "Биоинженерия" РАН. Дата посадки картофеля - 23 мая, уборка - 12 сентября. Агротехнические мероприятия по уходу за опытными растениями включали: зяблевую вспашку, весновспашку, предпосадочную нарезку борозд, внесение органоминеральных удобрений в дозе 200 кг/га, прополку, окучивание и полив растений. От колорадского жука растения в период вегетации дважды обрабатывали инсектицидами "Актара" (0,06 кг/га) и "Конфидор". Количество обработок определялось сложившимися метеорологическими условиями, благоприятными для развития вредителя. Расход рабочей жидкости - из расчета 400 л/га (данные предоставлены ВНИИ фитопатологии РАСХН, г. Большие Вяземы, Московская область).

Выделение ДНК. Для получения препаратов ДНК из почвенных образцов использовали разработанный нами метод (Запороженко и др., 2006).

ПЦР. Для амплификации фрагментов гена niJH были использованы разработанная в нашей лаборатории ранее система праймеров (F1 и R6) и протокол проведения реакции (Марусина и др., 2001). Амплификацию фрагментов гена 16S рРНК (626 п.н.) с целью последующего проведения DGGE, осуществляли с использованием слегка модифицированных нами праймеров (Muyzer et al., 1993,1998а):

341F 5'- CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC CCT CCT ACG GGAGGC AGCAG-3'

907R 5'- CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT - 3'

M = C:A,R = G:A, везде 1:1 Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: буфер для полимеразы (67 мМ Трис-HCl, pH 8.8; 17 мМ (NH^SCU; 1.5 мМ MgCb), по 5 нмоль каждого из dNTP, по 12.5 пмоль прямого и обратного праймеров, около 25 нг ДНК-матрицы и 1.5 ед. ДНК-полимеразы Smart7ö<j (5 ед/мкл, Диалат ЛТД, Россия). Для проведения ПЦР использовали температурно-временной профиль, описанный Шефером и Мюйзером (Schäfer and Muyzer, 2001) для соответствующей группы праймеров. После проведения реакции амплификации полученные ПЦР-фрагменты разделяли в акриламидном геле в условиях градиента денатурирующих агентов (DGGE).

Таблица 1. Физико-химическая характеристика почв*

Дата отбора почвенного образца Глубина Стадия развития растения на момент отбора почвенной пробы Количество растений картофеля на делянке; шт. .а 00 Содержание, % Влажность почвы;%

Название материала отбора образцов почв;см О с с 5 н песок глина т о с X о.

1. сорт "Луговской", контроль I 08.09.06 г. 5-7 10 21 48 6,4 27

2. сорт "Луговской", трансгенные растения I № 15,677309 08.09.06 г. 5-7 ■х. о. о ю В 10 н и X X X 5 21 48 6,4 27

3. сорт "Голубизна", контроль I 08.09.06 г. 5-7 с; о ^ и X 10 У и а: о. 21 48 6,4 27

4. сорт "Голубизна", трансгенные растения I №5, 135315 08.09.06 г. 5-7 я м 4) X Я 10 В е: 21 48 6,4 27

5. сорт "Чародей", контроль I 08.09.06 г. 5-7 V а. о О О и о 10 у о с о со 21 48 6,4 27

б. сорт "Чародей", трансгенные растения I № 12 (1), 103306 08.09.06 г. 5-7 с? о С 10 X е- 21 48 6,4 27

* - Данные предоставлены ВНИИФ РАСХН

Сорт "Луговской", контроль

Сорт "Луговской", трансгенные растения

Сорт "Голубизна", контроль

Сорт "Голубизна", трансгенные растения

Сорт "Чародей", / контроль

Сорт "Чародей", " трансгенные растения

Рис. 1. Схема расположения контрольных и опытных делянок на экспериментальном поле (по данным, предоставленным ВНИИФ РАСХН).

Очистка ПЦР-фрагментов. Продукты ПЦР очищали от посторонних примесей при помощи электрофореза в 0.8% легкоплавкой агарозе с применением набора реактивов "Wizard PCRPreps" (Promega, США).

Клонирование ПЦР-Фпагментов. Выделенные ПЦР-фрагменты клонировали в компетентных клетках Escherichia coli DH10/? с использованием наборов реактивов "pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems" (Promega, США). Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с помощью набора "Wizard MiniPrep" (Promega, США).

Секвеиирование. Секвенирование проводили с использованием универсального плазмидного праймера SP6 и набора реактивов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Нуклеотидные последовательности определяли на автоматическом секвенаторе DNA Analyzer 3730 (Applied Biosystems, США).

Анализ полученных последовательностей. Предварительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов гена nijН проводили с помощью программного пакета BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Транслирование нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программы ORF Finder (http.//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Редактирование и выравнивание последовательностей проводили с помощью пакета программ

BioEdit fhttp://iwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htrnll. Нуклеотидные последовательности, сходство между которыми было больше 95%, объединяли в одну группу (сиквенсный тип). Филогенетические деревья были построены на основании транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов гена nijН с помощью алгоритма "neighbor-joining", реализованного в пакете программ TREECONW (van de Peer and Wachter, 1994). Статистическая оценка достаточности размера библиотеки клонов. Для достоверного анализа структуры диазотрофных сообществ достаточность размера библиотеки клонов оценивали с помощью построения кривых зависимости математического ожидания количества сиквенсных типов в случайной выборке из библиотеки от размера выборки. Расчет проводили с помощью программного обеспечения Analytic Rarefaction (http://www.uga.edu/~strata/software/Software.html1. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез. ПЦР-фрагменты разделяли в 6%-ном полиакриламидном геле (отношение содержания акриламида к бис-акриламиду 37,5:1) в денатурирующем градиенте 40-65% (100%-ный денатурант содержал 7 М мочевину и 40%-ный формамид), в однократном трис-ацетатном буфере в течение 17,5 ч при 60°С и напряжении 100 В. Окрашенный бромистым этидием гель документировали с помощью системы BioDoc Analyze II (Biometra, Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка биоразнообразня диазотрофов в образце торфяной почвы естественной экосистемы верхового болота

Интерес к изучению микробных сообществ торфяных почв болотных экосистем обусловлен с одной стороны их значительной экологической ролью в биосфере, в частности, в глобальных геохимических циклах таких биогенных элементов, как углерод и азот; с другой стороны -возрастающим значением торфа для нужд сельского хозяйства. В настоящее время совсем немного известно о диазотрофных сообществах таких биогеоценозов, между тем именно этой группе прокариот принадлежит огромное значение в обеспечении растений и микроорганизмов доступными формами азота, который как никакой другой элемент лимитирует ресурсы питательных веществ в таких экстремальных экосистемах. Поскольку работ, посвященных изучению азотфиксации в торфяных почвах единицы (Дорошенко и др., 2007), и в основном они основаны на использовании традиционных микробиологических методов, в наших исследованиях мы применили один из самых чувствительных и информативных методов молекулярной биологии — анализ библиотеки фрагментов гена nijН.

1.1. Анализ библиотек клонов. Для проведения молекулярного анализа состава диазотрофного сообщества в образцах кислой торфяной почвы сфагнового торфяного болота (п. Сосвятское, Тверская область) была использована суммарная ДНК, выделенная из почв, отобранных с глубины 10-20 см, показавшей наибольшую нитрогеназную активность. Первоначально нами была создана и проанализирована библиотека традиционным объемом в 100 клонов, содержащих вставку фрагментов гена niJH нужной длины. Данный размер выборки используется в большинстве исследований по изучению разнообразия микробных сообществ различных экосистем (Stackebrandt et al., 1999). Однако насколько адекватно такое количество клонов отражает полное разнообразие микроорганизмов в той или иной экосистеме - это один из сложных вопросов молекулярной экологии. В результате проведенного анализа первой библиотеки нами было выявлено 37 сиквенсных типов диазотрофов в анализируемом образце торфяной почвы. Данные сиквенсные типы проявили сходство с представителями различных групп микроорганизмов, включая Alphaproteobacteria (17 сиквенсных типов), Gammaproteobacteria (8 типов) и Deltaproteobacteria (4 типа), Opitutae (1 тип), Chlorobea/Clostridia (5 типов), а также Bacilli (2 типа). Выявленное нами количество сиквенсных типов свидетельствовало о значительном видовом богатстве азотфиксирующих микроорганизмов в торфяной почве, в противовес данным, имевшимся ранее (Кравченко и Дорошенко, 2003; Слободова, 2006). Кроме того, было очевидно, что традиционного объема выборки было недостаточно для полного охвата всего разнообразия диазотрофов в этой экосистеме. Поэтому, на втором этапе нашего эксперимента мы расширили первую библиотеку еще на 100 клонов. В результате такого расширения нами было обнаружено 34 сиквенсных типа диазотрофов, причем 19 из них совпали с результатами анализа первой библиотеки, а 15 были новыми и по результатам Blast-анализа были отнесены к представителям таких филогенетических групп как Alphaproteobacteria (6 сиквенсных типов), Betaproteobacteria (1 тип), Gammaproteobacteria (2 типа) и Deltaproteobacteria (1 тип), Opitutae (1 тип), Chlorobea/Clostridia (3 типа), а также Methanomicrobia (1 тип). В целом, анализ 200 клонов позволил выявить 52 сиквенсных типа диазотрофов в образце торфяной почвы (рис. 2); причем каждый из них был представлен небольшим числом клонов. Таким образом, в анализируемой библиотеке не наблюдалось доминирования какого-либо сиквенсного типа.

Основную долю диазотрофного сообщества в анализируемом нами образце торфяной почвы составляли микроорганизмы, относящиеся к классу Alphaproteobacteria (около 57% клонов из всей библиотеки). Доминирование бактерий данного класса также отмечалось ранее при изучении кислого сфагнового болота Томской области с помощью анализа рибосомальных генов (Dedysh et al., 2006).

и Gamma/Alphaproteobacteria 3%

□ Gammap rot ео bacteria

11S ш Betaproteobacteria

■ Chlorobea/Clostridia Э%

□ Bacilli 10%

■ Archaea 1%

И Opitutae 6%

□ Alphaproteo bacteria

57%

Рис. 2. Соотношение филогенетических групп диазотрофов, основанное на количестве клонов, выявленных в образце торфяной почвы верхового болота "Сосвятское".

Таксономическая принадлежность некоторых выявленных последовательностей, близких к Alphaproteobacteria, была нами определена на уровне рода. Так, аминокислотные последовательности фрагментов гена niJH двух сиквенсных типов диазотрофов оказались наиболее близкими к представителям бактерий рода Methylocystis (уровень идентичности аминокислотных последовательностей - 97-98%). Наличие в торфяной почве верхового болота микроорганизмов, близких к представителям метанотрофов с сериновым циклом ассимиляции одноуглеродных соединений, не раз отмечалось в других работах (Dedysh et al., 2006). Более того, присутствие азотфиксирующих метанотрофных бактерий II типа {Mes. echinoides, Mes. minimus) было установлено ранее в метанокисляющих накопительных культурах (Slobodova et al., 2006), полученных из образцов почв того же самого места болота "Сосвятское". Три сиквенсных типа проявили практически одинаковый уровень идентичности с последовательностями некоторых представителей ризобий (95-96%) и метанотрофов (95-97%), поэтому провести их более точную идентификацию не представилось возможным. Пять сиквенсных типов были близкими с некоторыми представителями ризобий (идентичность - 95-94%), фототрофных пурпурных несерных бактерий порядка Rhodospirillales (95-94%) и факультативно анаэробных бактерий порядка Sphingomonadales (95%). Образование устойчивых ассоциаций некоторых представителей порядка Rhodospirillales с метанотрофными бактериями в торфяной почве болота "Сосвятское" было продемонстрировано ранее нашими коллегами (Дорошенко и др., 2006), которые выделили в чистую культуру и описали новые штаммы Azospirillum lipoferum. Обнаруженные в нашем исследовании представители, видимо, являются еще неописанными микроорганизмами,

достаточно близкими к роду Azospirillum, а также к некоторым представителям ризобий и сфингобактерий.

Одиннадцать сиквенсных типов, выявленных нами в торфяной почве, обнаружили наибольшее сходство с представителями порядка Rhizobiales (идентичность 95-98%). Более точная идентификация этих микроорганизмов была невозможна вследствие практически одинакового уровня сходства последовательностей данных сиквенсных типов с последовательностями микроорганизмов, относящихся к родам Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Xanthobacter. Наличие представителей ризобий в торфе не вызывает удивления, поскольку не раз отмечалось, что некоторые культуры данных бактерий могут быть устойчивы к кислой среде (Емцев и Мишустин, 2006).

Два сиквенсных типа были отнесены к представителям родов Methylocapsa (98%) и Beijerinckia (98%). Микроорганизмы этих двух родов близки как по уровню гомологии последовательностей 16S рРНК (96.2%) (Dedysh et al., 2002), так и по уровню идентичности аминокислотных последовательностей гена rtiJW. Аэробные бактерии рода Beijerinckia ранее уже детектировались в заболоченных территориях с помощью традиционных микробиологических методов (Головченко и др., 1993). К тому же, исходно бактерии этого рода были выделены из кислых тропических почв Малайзии (Емцев и Мишустин, 2006). Что касается Methylocapsa, то представители этого рода, способные расти в кислых условиях среды, исходно были выделены из верхового болота Томской области (Dedysh et al., 2002). Поэтому выявленные в наших исследованиях микроорганизмы, близкие к представителям вышеописанных родов, не вызывают удивления.

Для одного сиквенсного типа удалось определить его принадлежность к представителям Betaproteobacteria. Тот факт, что мы не смогли провести точную идентификацию многих клонов, вероятно, свидетельствует о том, что в исследуемом микробном сообществе кислой торфяной почвы присутствуют различные виды до сих пор не описанных бактерий. С другой стороны, также возможно, что часть анализируемых клонов относится к известным видам микроорганизмов, последовательности фрагментов гена nijH которых пока еще не представлены в банке данных.

Из представителей класса Gammaproteobacteria нами были выявлены клоны, которые с высокой степенью достоверности можно отнести к Methylobacter bovis (идентичность — 100%). Присутствие в торфяной почве представителей метанотрофных бактерий I типа, близких к этому роду отмечалось и в других работах (Morris et al., 2002), однако нам не встречались данные по детекции обнаруженного нами вида в почвах верховых болот. Последовательности трех сиквенсных типов проявили сходство как с представителями класса Gammaproteobacteria, так и Alphaproteobacteria. Остальные 6 сиквенсных типов оказались наиболее близки с представителями

различных родов из Gammaproteobacteria, однако низкий уровень идентичности (85-89%) не позволил провести более точную идентификацию. Наличие большого количества неидентифицируемых микроорганизмов, входящих в этот класс, отмечалась ранее и в других работах (Слободова, 2006).

Аналогично было невозможно достаточно точно идентифицировать большинство клонов, которые по сходству аминокислотных последовательностей были отнесены к классам Deltaproteobacteria, Opitutae, Chlorobea/Clostridia и Bacilli. Из представителей Deltaproteobacteria нам удалось точно выявить лишь один сиквенсный тип, близкий к роду Syntrophobacter (идентичность - 93%). Два других сиквенсных типа проявили низкий уровень идентичности (8588%) с представителями родов Desulfovibrio/Syntrophobacter. Четыре сиквенсных типа оказались близкими с представителями класса Opitutae, однако более точная их идентификация также не представилась возможной.

Восемь сиквенсных типов проявили низкий уровень сходства (80-87%) с представителями родов Prosthecochloris, Pelodictyon, Chlorobium и Clostridium. Отсутствие близкого родства сиквенсных типов с идентифицированными организмами класса Chlorobea также отмечалось в другой работе (Слободова, 2006). В отношении класса Bacilli следует отметить, что некоторые микроорганизмы, обнаруженные нами, также ранее детектировались в кислых почвах другими исследователями. Так, представители факультативно анаэробных азотфиксирующих бактерий рода Paenibacillus были обнаружены в торфяном болоте Западной Сибири (Popova, 1961). Что касается выявленных в нашем исследовании представителей, близких к роду Methanosarcina (92-93% сходства), то согласно данным литературы археи, близкие к данному виду детектировались в торфяной почве болот Великобритании (Nercessian et al., 1999).

Таким образом, в ходе нашего исследования по оценке биоразнообразия диазотрофного сообщества торфяной почвы верхового болота нами было выявлено существенное видовое богатство азотфиксирующих микроорганизмов, большинство последовательностей фрагментов гена niJH которых еще не представлены в банке данных и возможно принадлежат пока еще неописанным прокариотам.

1.2. Статистический анализ. Проведенная нами статистическая оценка размера библиотеки клонов для достоверного анализа структуры диазотрофного сообщества показала, что для полного охвата разнообразия диазотрофов в исследуемом образце торфа не было достаточно размера выборки даже почти в 200 клонов (рис. 3). Кроме того, в результате анализа экстраполяции кривой нами было отмечено, что для полноценного покрытия всего биоразнообразия азотфиксирующих микроорганизмов в исследуемой экосистеме необходимо использование как минимум 500 клонов.

50 -

4 *

5 л

56 i

таг*

0 4

А библиотека фрагментов гена пИН,

представленная 171 клоном О библиотека фрагментов гена пИИ, представленная 96 клонами

# библиотека фрагментов гена пЩ представленная 75 клонами

50 100

Количество клонов

150

200

Рис. 3. Кривые зависимости количества сиквенсных типов диазотрофов в случайной выборке из библиотеки от размера этой выборки (графики построены с учетом химерных последовательностей).

1.3. Анализ дназотрофного сообщества с помощью специфичных праймепов. Для

дополнительного подтверждения недостаточности размера нашей библиотеки для анализа биоразнообразия диазотрофов в экосистеме торфяного болота, мы провели исследование на основе стратегии применения группоспецифичных праймерных систем.

Ранее нашими коллегами из ИНМИ с помощью иммунофлуоресцентного анализа было показано присутствие в метанотрофных накопительных культурах, выделенных из болота "Сосвятское", представителей рода Methylomonas (Слободова и др., 2006). Следует отметить, что при исследовании образцов почв, отобранных из того же самого места верхового болота, мы не смогли обнаружить данного представителя метанотрофов I типа. Поэтому для выявления этих микроорганизмов в образце тотальной ДНК анализируемого нами сообщества мы использовали специфичную для этой группы бактерий праймерную систему (рис. 4). Анализ клонированных фрагментов, полученных с помощью данных праймеров, выявил 2 сиквенсных типа, один из которых проявил 100%-ную идентичность с Methylobacter bovis, а другой - с Methylomonas methanica.

Рис. 4. Амплификация фрагментов гена т/Н с использованием праймеров, специфичных для метанотрофов I типа, на препарате ДНК, выделенной из торфа. Стрелкой указан целевой фрагмент. Цифрами обозначены: 1 - маркер молекулярной массы ДНК (100 Ьр); 2, 3 - суммарная ДНК, выделенная из торфа; 4 - Ме1Иу1оЪааег \inelandii (положительный контроль); 5 - контроль в отсутствии ДНК-матрицы.

Подобная работа была проделана и для бактерий класса СЫогоЯех1, наличие которых было показано в почве болота "Сосвятское" ранее (Слободова, 2006), но в ходе нашего исследования не было обнаружено представителей, близких к роду ОзсШосМопз. При использовании праймеров, специфичных для данных микроорганизмов, нами также было показано их наличие в торфяной почве (рис. 5).

339 п.н.

-,1 2 3 4 5 К- MQ

Рис. 5. Амплификация фрагментов гена nifii с использованием праймеров, специфичных для рода Oscillochloris на ДНК, выделенной из торфа. А - в качестве матрицы использована суммарная ДНК, выделенная из торфа (5 повторностей); Б - в качестве матрицы использованы ПЦР-фрагменты гена ni]Н, полученные с помощью универсальных праймеров F1-R6.

Стрелкой указан целевой фрагмент. М - маркер молекулярной массы ДНК. К- - Bacillus Hcheniformis (отрицательный контроль). MQ - контроль в отсутствии ДНК-матрицы. Цифрами обозначены положительные контроли: I - ДНК Oscillochloris sp. А19; 2 - ДНК Oscillochloris trichoides DG6; 3 - ДНК Oscillochloris sp. KR; 4 - ДНК Oscillochloris sp. R; 5 - ДНК Oscillochloris sp. C6.

Таким образом, проведенный анализ подтвердил, что для полноценного изучения биоразнообразия диазотрофного сообщества торфяной почвы использование размера библиотеки даже в два раза превышающей традиционный объем выборки в 100 клонов недостаточно.

2. Оценка биоразнообразия диазотрофов в образцах почв, отобранных из ризосфер контрольных и биотехнологических растений картофеля

В исследованиях, касающихся изучения биоразнообразия микробных сообществ с помощью клонирования функциональных генов помимо вопроса репрезентативности клональных выборок, все больший интерес приобретает проблема неопределенности количества библиотек для более точной интерпретации получаемых данных. Поскольку торфяная почва, в силу выявленного большого разнообразия, оказалась неудобным модельным объектом, вопрос о том насколько адекватно одна библиотека отражает разнообразие диазотрофов в определенной экосистеме, мы попытались решить, исследовав диазотрофное сообщество экосистемы, подвергнутой антропогенному воздействию.

Интерес к изучению агросистем обусловлен достаточной их бедностью микробным разнообразием, и в тоже время малой степенью изученности структур диазотрофовных сообществ сельскохозяйственных почв с помощью современных молекулярно-биологических методов. Поскольку биологическая фиксация азота играет основопологающую роль в поддержании плодородия почв и урожайности растений, а знание биоразнообразия азотфиксаторов в таких системах все еще ограничено, для проведения наших исследований была выбрана агросистема картофельного поля, на котором выращивались БР и КР. В связи с тем, что вопрос биобезопасности БР до сих пор является актуальным, дополнительной задачей перед нами стояло проведение оценки возможного влияния трансгенного картофеля, устойчивого к фитофторозу, на структуру диазотрофных сообществ почвы. В нашей работе основной упор был сделан на определение последовательностей фрагментов гена шуН абсолютно всех включенных в анализ клонов, а не отдельных представителей, определенных в результате предварительного скрининга клонов. В исследованиях по оценке биоразнообразия диазотрофов пахотной почвы такой анализ был проделан впервые.

2.1. Анализ на основе денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Для нашего эксперимента были использованы образцы почв, отобранные из ризосфер трех контрольных и трех трансгенных сортов картофеля ("Чародей", "Голубизна", "Луговской"), несущих ген тауматина (ТаиИ), придающего устойчивость к грибным болезням.

Первая часть наших экспериментов была связана с проведением предварительного анализа сложности микробных сообществ исследуемой агросистемы с помощью денатурирущего

градиентного гель-электрофореза (ОвОЕ) суммарного амплификата фрагментов гена 168 рРНК. Этот метод позволяет быстро проводить качественную оценку, как сложности анализируемых сообществ, так и различий между их доминантными составляющими (Моутэсак е1 а1., 2007).

Для всех экспериментальных образцов почв нами были получены профили ОСвЕ, каждый из которых содержал как минимум 20 дискретных полос (рис. 4).

Рис. 4. DGGE-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК почвенных микробных сообществ из ризосфер экспериментальных растений. А — электрофореграмма суммарных амплификатов фрагментов гена 16S рРНК; В - схематическое изображение DGGE-профилей. Цифрами обозначены: 1 - сорт "Чародей", биотехнологические растения, 2 - сорт "Чародей", контроль, 3 — сорт "Голубизна", биотехнологические растения, 4 — сорт "Голубизна", контроль, 5 -сорт "Луговской", биотехнологические растения, 6 — сорт "Луговской", контроль, 7 -положительный контроль, Thermoanaerobacter siderophilus', 8 — положительный контроль, Heliobacterium sulfidofilumт strain BR4.

В результате анализа не было выявлено различий в количестве полос, небольшая разница была отмечена в их интенсивности; однако этот факт вполне может быть следствием возможных ограничений техники ПЦР, лежащей в основе используемого метода. Отсутствие существенных различий в профилях может отражать как естественное сходство структур микробных сообществ исследуемых почв, так и являться следствием ограничений метода DGGE.

В целом, в результате DGGE-анализа нами была выявлена невысокая степень сложности микробных сообществ в данной агросистеме. Поэтому на следующем этапе нашей работы для проведения оценки биоразнообразия диазотрофов мы создали и проанализировали шесть библиотек клонов фрагментов гена niJH.

2.2. Анализ библиотек клонов. Для всех экспериментальных образцов почв в пяти повторностях нами были получены ПЦР-фрагменты гена nifli требуемой длины - около 450 п.н. (рис. 5). Данные фрагменты были использованы для создания библиотек клонов. Для всех образцов почв нами было получено примерно по 100 клонов. На основании сходства нуклеотидных последовательностей все клоны были сгруппированы в 11 различных групп диазотрофов (сиквенсных типов). Таким образом, в почвах KP и БР сорта "Чародей" было выявлено по 2 сиквенсных типа диазотрофов, "Голубизна" - 5 сиквенсных типов в случае ризосферы KP и 8 в случае ризосферы БР, а "Луговской" — 4 и 7 сиквенсных типов, в случае ризосфер контрольных и опытных растений, соответственно. Последующий анализ данных сиквенсных типов был проведен с помощью построения филогенетических деревьев на основе транслированных последовательностей фрагментов гена nijН (рис. 6). Исходя из дендрограммы видно, что в целом структура диазотрофного сообщества ризосферы картофеля была представлена небольшим количеством видов микроорганизмов, что согласуется с литературными данными в области оценки разнообразия азотфиксаторов в культивируемых почвах (Poly et al., 2001). Так же следует отметить, что, несмотря на внесение удобрений и различные обработки почвы, выявленная в наших исследованиях структура диазотрофов, включающая небольшое количество обнаруженных сиквенсных типов, была представлена широким кругом филогенетических групп: Alpha-, Gamma-, Gamma/Betaproteobacteria и Deltaproteobacteria, Opitutae/Deltaproteobacteria, Clostridia, Bacilli, a также Methanomicrobia (Archaea).

Нами было показано, что в образцах почв KP и БР сорта "Чародей" обнаружены одни и те же сиквенсные типы диазотрофов - ST1 и ST2. Низкий уровень сходства (84-87%) последовательностей данных сиквенсных типов с последовательностями известных микроорганизмов не позволил сделать однозначного заключения относительно их принадлежности к конкретному роду, скорее всего в данном случае можно говорить только о классе Bacilli как таковом. Согласно литературным данным различные представители рода Paenibacillus и Bacillus достаточно часто обнаруживаются в сельскохозяйственных почвах, и ризосфера БР картофеля при этом не является исключением (Lottmann et al., 1999). Некоторые штаммы Paenibacillus durus продуцируют вещества, подавляющие вредителей и патогенов, способствуя росту растений (Seidin et al., 1998; Gardener, 2004). Поэтому, наличие данных микроорганизмов в значительном количестве в сельскохозяйственной почве, в какой-то степени может служить признаком

благополучия агросистемы. То, что в двух вышеуказанных образцах почвы были обнаружены одни и те же сиквенсные типы диазотрофов, вполне оправдано, так как экспериментальные делянки данного сорта располагались на поле в непосредственной близости.

1 ig т Г|

450 ил.

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 М

М 1 2 3 45 6 7 8 9 10 11 12 13 М

Рис. 5. Амплифицированные фрагменты гена п(/Н на ДНК, выделенной из почв экспериментальных участков (А - сорт картофеля "Луговской"; В — сорт картофеля "Голубизна"; С - сорт картофеля "Чародей"). Стрелками указан целевой фрагмент. М — маркер молекулярной массы ДНК (100 Ьр). Цифрами обозначены: 1,2, 3, 4, 5 - ДНК, выделенная из ризосферы KP; 6, 7, 8, 9, 10 - ДНК, выделенная из ризосферы БР;

11 - ДНК Methylobacler vinelandii (положительный контроль);

12 - ДНК Bacillus thuringiensis (отрицательный контроль);

13 - контроль в отсутствии ДНК-матрицы.

0.1

100

ЧТ1 (73)1 ЧК1 (59) ГТ2 (11) I ^ ГК2(2) ( ЛТ2 (7) ЛК2(9) J ЛТ1 (86) 1 ЛК1 (12)

ГТ1 (72) 18Т2 ГК1 (06) Г ЧГ2(32) ЧК2(40) J

Рае пгЬааЛиз тд^яйепяз

-йммбаайыа ¿лтз

- Ме1ку1осуЯ2€ рапи^

-я«.«).....Эг8тз

881~~

57 й

&пог1й&Ь1ШП ^есШ Ккш&итзр.

ол #1 екгоососсит

<м.1„. \\brio {НахоЬ'Офкгсиз -—» —ОесМототопаз агота&са

ГТб (2) \ ОТ

Моагсиз ¿р. ГТ5 (б) ЛТЗ(5)

Ме&уюЬайег Ьоух I оте ЛКЗ (12) Г

■ Мейгу1оЬас1ег ГК5 (К) )

5 ]-..................АпаеющхоЪасит яр.

99 р—- Ре1оЬасЬ г рготопкия [р" СкоЪаск г 1&Деу1 л-Пг" СкоЬасиг игатшжге&ьсть ^

'-ГП(2)

............— С?а51п&ит ра&ипапит

Оека1ососсо1&5 е1кепо£*пез

п-

»¡5

ЬпЬоркоЬаскг /итагожскт цЬ ОйогоЫпт, Ишсо1а *Ре1о&&уоп 1и1ео1ит —РгойкесоМопз иьЬпо/отн ОрИиЪасеае Ьас1епит ЛТ5<1)

5Т7

^ вто

}.!5Т9

IЛК4 (2) ГТ8 (1)

ЗупЬгоркотдпаз и>о1£е1

521

-ЛТ7 (1)

. а,РВ

► т-га

8-РВ

ГК4(:.

ГТЗ(4) ГЮ(3)

Ме1кап.сй2тс171а ЬатЬп.

ЬАеймпозатапа асейжгапх

ШШФ ^ю

Рис. 6. Филогенетическое дерево, построенное на основе транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов гена п(/Н. Масштаб соответствует 10 заменам на 100 аминокислотных остатков (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в процентах), определенная с помощью Ьоо1з1гар-анализа 2000 альтернативных деревьев. Обозначения сиквенсных типов: ЧК - сорт "Чародей", контроль; ЧТ -сорт "Чародей", трансгенные растения; ЛК - сорт "Луговской", контроль; ЛТ - сорт "Луговской", трансгенные растения; ГК - сорт "Голубизна", контроль; ГТ - сорт "Голубизна", трансгенные растения. В скобках указано количество клонов. БТ - общее обозначение идентичных сиквенсных типов. РВ - Рго1еоЬас1епа.

Анализ клонов из образцов почвы KP и БР сорта "Голубизна" выявил совпадение большинства сиквенсных типов: это ST1 и ST2, а также ST5, ST8 и ST9. Сиквенсный тип ST5 оказался идентичным с Methylobacter bovis (уровень сходства 100%). Наличие в пахотной почве метанотрофов I типа неоднократно отмечалось в работах других авторов (Кравченко и др., 2005). Преобладание среди метанотрофов I типа представителей родов Methylobacter и Methylomonas отмечалось на рисовых полях (Mohanty et al.., 2006), а непосредственное присутствие Methylobacter bovis - в почвах, удобренных компостом или минеральными удобрениями (Bykova et al., 2007). В этой связи, обнаруженный в нашем исследовании представитель метанотрофов I типа не вызывает удивления. Сиквенсные типы ST8 и ST9 оказались внутри так называемого кластера 111 (Zehr et al., 2003), включающего в себя последовательности генов nißi некоторых облигатно анаэробных микроорганизмов, относящихся к Clostridia, Deltaprotcobactcria, Spirochaetes, зеленым серным бактериям и археям. Более точная идентификация этой группы клонов не представляется возможным из-за низкого уровня сходства последовательностей (85-89%).

Три сиквенсных типа (ST4, ST6, ST10) были обнаружены только в ризосфере БР сорта "Голубизна", и отсутствовали в контрольных образцах. Данные сиквенсные типы были представлены всего одним или двумя клонами и составляли, таким образом, минорную (не превышающую 2%) долю сообщества, выявление которой для данного объема исходной выборки вполне маловероятно. Поэтому достоверность их отсутствия в контроле очень мала. Следует отметить, что наличие небольшой разницы в составе диазотрофных сообществ между ризосферами БР и KP может объясняться и эффектом удаления экспериментальных делянок друг от друга. Вполне возможно, что в данном случае мы действительно имели дело с разными сообществами, отличающимися в минорных компонентах. Сиквенсный тип ST4 (2 клона) оказался наиболее близок к представителям двух классов - Gamma- и Betaproteobacteria (уровень сходства составлял 93-94% с различными представителями этих классов). Сиквенсный тип ST6 (2 клона) достаточно достоверно можно отнести к роду Geobacter (95% сходства), представители которого неоднократно обнаруживались в почве рисовых полей (Hori et al., 2007), a ST10 образовал общий кластер с представителями рода Methanosarcina (83% сходства), которые также являются обычными обитателями почв, причем отмечалось, что регулярное применение органических удобрений способствует уменьшению разнообразия архей в сторону доминирования метаногенов Methanoculleus и Methanosarcina (Gattinger et al., 2007).

Для сорта "Луговской" также было отмечено совпадение большинства сиквенсных типов диазотрофов в образцах почв из-под KP и БР: это ST1, ST2, ST5, и ST10. Как и при исследовании ризосферы картофеля сорта "Голубизна", в образцах почвы из-под БР сорта "Луговской" было выявлено наличие дополнительных трех сиквенсных типов - ST3, ST7, ST11, — которые

отсутствовали в контроле, и были представлены единичными клонами. При этом сиквенсный тип ST3 образовал единый кластер с представителями ризобий (96-97% сходства), часто обнаруживающихся в пахотной почве (Palmer and Young, 2000). Сиквенсный тип ST7 оказался наиболее близким к Opitutaceae bacterium TAV2, (уровень сходства 89%), представители которых часто выявлялись в различных почвах, a Opitutus terrae исходно был выделен из почвы рисового поля (Chin et al., 2001). Сиквенсный тип ST11 (1 клон) с очень низким уровнем сходства (62%-69%) образовал общий кластер с представителями класса Clostridia.

В целом ризосферы БР всех трех сортов картофеля включали в себя все разнообразие диазотрофов, которое встречалось в ризосферах соответствующих сортов контрольных растений. Но для почв, отобранных из-под БР, все же наблюдалось наличие большего разнообразия диазотрофов по сравнению с контролем. Интересно отметить, что структуры сообществ азотфиксаторов в ризосферах всех трех сортов KP картофеля различалась между собой. Так, у сортов "Голубизна" и "Луговской" сообщества оказались более разнообразными, чем у сорта "Чародей", что проявилось в появлении дополнительных групп, одна из которых включала до 11% клонов. Между тем контрольные сорта "Голубизна" и "Луговской" тоже отличались между собой, однако это отличие было минорным (до 4% клонов). Подобные результаты были получены Миллинг с соавторами (Milling et al., 2004), в работе которых отмечалась разница в структурах микробных сообществ между ризосферами двух нетрансгенных сортов картофеля. Что касается БР, то подобным образом разнообразие азотфиксаторов в ризосферах сортов "Голубизна" и "Луговской" было выше по сравнению с третьим сортом "Чародей", а структура диазотрофных сообществ в ризосферах БР сортов "Голубизна" и "Луговской" различалась между собой в минорных компонентах.

Соотношение представителей различных групп диазотрофных микроорганизмов, выявленных нами в пахотной почве представлено в таблице 2. Видно, что одна библиотека адекватно отражала разнообразие диазотрофов в анализируемой агросистеме только на уровне доминирующих членов сообщества. Использование в работе нескольких библиотек позволило провести более полный анализ микробного разнообразия за счет учета минорных представителей. Так же, исходя из таблицы 2 видно, что различия в составе диазотрофных сообществ почв, отобранных из ризосфер KP и БР, были не выше, чем различия между контролями всех трех сортов.

Таблица 2. Соотношение (% от общего количества клонов в каждой библиотеке) представителей различных групп диазотрофов, выявленных в почвах экспериментальных участков

Филогенетическая группа Растения*

ЧК ЧТ ГК ГТ ЛК ЛТ

Bacilli (Paenibacillus) 100 100 87 81 87 89

Alphaproteobacteria (Rhizobium/Bradyrhizobium) 0 0 0 0 0 1

Gamma- и Betaproteobacteria (Azotobacter/Dechloromonas) 0 0 0 2 0 0

GammaproteobacteriafMef/ij/ofcacter,) 0 0 8 6 11 5

Deltaproteobacteria (Geobacter) 0 0 0 2 0 0

Op itutae/Del taproteobacteria 0 0 5 8 0 1

Methanomicrobia (Melhanosarcina) 0 0 0 1 2 3

Clostridia (Syntrophomonas) 0 0 0 0 0 1

* ЧК - сорт "Чародей", контроль; ЧТ - сорт "Чародей", трансгенные растения; ЛК - сорт "Луговской", контроль; ЛТ - сорт "Луговской", трансгенные растения; ГК - сорт "Голубизна", контроль; ГТ - сорт "Голубизна", трансгенные растения.

2.3. Статистический анализ. В результате аналитического расчета нами было показано, что все основные сиквенсные типы были охвачены нашими библиотеками. Что касается, миноров, которые не были нами выявлены в контрольных образцах почв из-под растений сортов "Голубизна" и "Луговской", то возможно, с увеличением числа анализируемых клонов они были бы нами обнаружены, но для этого потребовалось бы значительное расширение библиотек.

Таким образом, в случае анализа экосистемы, подвергнутой антропогенному воздействию, объем выборки в 100 клонов оказался репрезентативным, отражая небольшое разнообразие диазотрофов в образцах пахотной почвы. Анализ шести библиотек, построенных для образцов почв, отобранных из разных мест сельскохозяйственного участка, показал высокий уровень подобия результатов на уровне доминирующих членов популяции. Наблюдаемые небольшие вариации в видовом составе микроорганизмов, скорее всего, объясняются сортовыми особенностями растений картофеля. В целом, использование в работе шести библиотек позволило получить более полные сведения о видовом составе диазотрофных микроорганизмов анализируемой агросистемы и сделало эти результаты более достоверными.

s г

2 ï

h î г

40 60 Количество КЛОМ «

с.

20 40 60 80 100 120 Количество тон оа

ЦП"1"

Количество кленов

4.5 4 3.5 ■

3 2.5 ■ 2 1.8 1

0.5 -0

100 120

40 60 80

Количестве кленов

ипп1".....

40 60 80 100 120 Количество клонов

£IÏJHS1".....

20 40 60 80 100 120

К отчество клонов

Рис. 7. Кривые зависимости математического ожидания количества сиквенсных типов в случайной выборке из библиотеки от размера этой выборки. Буквами обозначены: библиотеки клонов фрагментов гена ni)H для ризосфер БР картофеля сортов "Чародей" (А), "Голубизна" (С), "Луговской" (Е); а также для ризосфер КР картофеля сортов "Чародей" (В), "Голубизна" (D), "Луговской" (F).

3. Сравнение структур диазотрофных сообществ торфяной почвы и сельскохозяйственной почвы

Продводя сравнение результатов, полученных для обеих экосистем, стоит еще раз отметить, что торфяная почва, которая традиционно считалась бедной диазотрофами, отличалась существенным разнообразием азотфиксаторов по сравнению с пахотной почвой. В отличие от образца торфяной почвы, в котором все сиквенсные типы были представлены небольшим числом клонов, в ризосферах БР и КР картофеля было обнаружено преимущественное доминирование представителей, близких к роду РаетЬасШиз. Также стоит отметить различия на уровне крупных таксономических групп: если в образце почвы естественной экосистемы верхового болота главным

образом были представлены микроорганизмы класса Alphaproteobacteria, то в ризосфере агросистемы лидирующее положение занимали представители класса Bacilli.

Таким образом, полученные на основании наших исследований данные вносят важный вклад в понимание внутренних структур почвенных микробных сообществ азотфиксаторов в экосистемах с различной антропогенной нагрузкой. Наши результаты могут способствовать выделению и описанию новых микроорганизмов, а также применяться в дальнейших комплексных исследованиях микробных сообществ азотфиксирующих прокариот в болотных экосистемах и агроценозах. Более того, полученные нами результаты показывают необходимость дальнейших исследований по изучению разнообразия почвенных азотфиксаторов в экосистемах торфяных болот, поскольку исходя из наших исследований видно, что видовой потенциал диазотрофов в данных экосистемах чрезвычайно высок.

1. Впервые исследовано биоразнообразие диазотрофов торфяной почвы с помощью анализа библиотеки фрагментов гена nijН без использования предварительного скрининга клонов. Показано наличие 52 сиквенсных типов диазотрофов с преимущественным преобладанием представителей класса Alphaproteobacteria. Установлено, что традиционного размера библиотеки в 100 клонов недостаточно для полного покрытия разнообразия диазотрофов в данной экосистеме.

2. Впервые исследована структура диазотрофных сообществ почв, отобранных из ризосфер контрольных и биотехнологических растений картофеля, с помощью анализа библиотеки клонов фрагментов гена nifii. Установлено наличие 11 сиквенсных типов диазотрофов в данной агросистеме с доминированием представителей класса Bacilli. Показано, что одна библиотека адекватно отражает разнообразие диазотрофов в агросистеме только на уровне доминантных членов сообщества.

3. Достоверных различий в структурах диазотрофных сообществ между ризосферами биотехнологических и контрольных растений картофеля выявлено не было.

ВЫВОДЫ:

Список работ по материалам диссертации:

1. Запороженко Е.В. (Задорина), Слободова Н.В., Булыгина Е С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв. Микробиология. - 2006. - Том 75, №1. - С. 127-134.

2. Булыгина Е.С., Задорина Е.В., Кузнецов Б.Б. Исследование структуры диазотрофного сообщества пахотной почвы. Аграрная наука. -2008. -№4. -С. 13-15.

3. Задорина Е.В., Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Скрябин К.Г. Оценка влияния картофеля, устойчивого к фитофторозу, на структуру бактериальных сообществ почвы. Прикладная биохимия и микробиология . -2009. -Т. 45. -№1. (принята к печати).

4. Задорина Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Колганова Т.В., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Оценка применения метода клонирования для изучения разнообразия почвенных диазотрофов. Микробиология. -2009. -№ 2, февраль (принята к печати).

5. Задорина Е.В., Слободова Н.В., Колганова Т.В., Кравченко И.К., Булыгина Е С., Кузнецов Б.Б. Изучение состава азотфиксирующего микробного сообщества сфагнового болота с помощью анализа генов nifll. 11 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 29 окт-2 ноября 2007 г. Сборник тезисов. С. -36-37.

6. Задорина Е.В., Булыгина Е.С. Применение анализа библиотек клонов для изучения влияния биотехнологического картофеля на состав диазотрофного сообщества сельскохозяйственной почвы. Международная научно-практическая конференция "Биотехнология: вода и пищевые продукты". Москва, 11-13 марта 2008 г. Материалы конференции, С. 203.

7. Задорина Е.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. Использование DGGE-анализа для оценки влияния биотехнологического картофеля на структуру бактериальных сообществ почвы. XLVI Международная научная студенческая конференция. Новосибирск, 26-30 апр 2008 г. Материалы конференции, С. 65.

8. Задорина Е.В., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б. Оценка применения анализа библиотек клонов фрагментов гена nijН для изучения разнообразия почвенных диазотрофных сообществ. XIII Международная экологическая студенческая конференция "Экология России и сопредельных территорий". Новосибирск, 24 - 26 окт 2008 г. Материалы конференции, С. 117.

Подписано в печать 12.11.2008

Печать трафаретная

Заказ № 1163 Тираж: 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., (499) 788-78-56 \vww.auloreferat г и

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Задорина, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Азотфпксирующие микроорганизмы.

1.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота.

1.2. Азотфикаторы и сельское хозяйство.

1.3. Некоторые аспекты строения и регуляции нитрогеназного комплекса.

1.4. Ген ш'/Н. как молекулярный маркер для детекци и идентификации диазотрофов.

Глава 2. Методы исследования почвенных микробных сообществ.

2.1. Традиционные микробиологические методы исследования.

2.2. Биохимические методы исследования.

2.2.1. Определение активности почвенных ферментов и почвенного дыхания.

2.2.2. Изучение физиологического профиля сообщества.

2.2.3. Анализ жирных кислот фосфолипидов.

2.2.4. Изучение функциональной активности микроорганизмов.

2.3. Молекулярно-биологические методы исследования.

2.3.1. Методы определения содержания гуанина и цитозина.

2.3.2. ДНК реассоциация и гибридизация нуклеиновых кислот.

2.3.3. Методы, основанные на ПЦР.

2.3.3.1. Анализ с помощью градиентного гель-электрофореза.

2.3.3.2. Анализ на основе рестриктазной обработки ПЦР-фрагментов.

2.3.3.3. ПЦР со специфичными праймерами.

2.3.3.4. Методы RISA, RAPD и DAF.

2.3.4. Методы, основанные на анализе первичных последовательностей нуклеиновых кислот.

2.3.4.1. Подход на основе анализа генов рРНК.

2.3.4.2. Подход на основе анализа функциональных генов.

2.3.5. Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований.

2.3.5.1. Выделение нуклеиновых кислот.

2.3.5.2. Ограничения полимеразной цепной реакции.

2.3.5.3. Ограничения метода клонирования.

2.3.5.4. Ограничения анализа ДНК-фингерпринта.

2.3.5.5. Ограничения методов in situ гибридизации.

2.4. Статистические методы анализа.

Глава 3. Азотфиксация в болотных экосистемах.

Глава 4. Биотехнологические растения.

4.1. Производство биотехнологических растений в Мире.

4.2. Роль биотехнологических растений в практике сельского хозяйства.

4.2.1. Растения, устойчивые к фитопатогенным грибам и бактериям.

4.2.2. Растения, устойчивые к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам.

4.2.3. Растения, противостоящие неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

4.3. Биобезопасность генетически модифицированных растений.

4.3.1. Нормативные правовые акты в области оценки биобезопасности генетически модифицированных организмов.

4.3.2. Основные виды рисков и оценка биологической опасности биотехнологических растений.

4.3.3. Мониторинг изменений в структуре микробных сообществ почв при оценке риска биотехнологических растений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Материалы и методы исследования.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов.

5.3. Амплификация исследуемых генов.

5.3.1. Амплификация фрагментов гена 16S рРНК с использованием праймеров, специализированных для DGGE.

5.3.2. Амплификация фрагментов гена шУН.

5.3.2.1. ПЦР с использованием универсальных праймеров.

5.3.2.2. ПЦР с использованием специфичных для представителей рода Oscillochloris праймеров.

5.3.2.3. ПЦР с использованием специфичных праймеров для детекции представителей метанотрофных бактерий типа 1.

5.4. Очистка ПЦР-фрагментов.

5.5. Клонирование ПЦР-фрагментов.

5.5.1. Приготовление компетентных клеток.

5.5.2. Лигирование.

5.5.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК.

5.5.4. Выделение плазмидной ДНК.

5.6. Секвенирование.

5.7. Анализ полученных последовательностей.

5.8. Статистический анализ.

5.9. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

Глава 6. Оценка биоразнообразия дназотрофов в образце торфяной почвы естественной экосистемы верхового болота.

6.1. Выделение ДНК и амплификация фрагментов гена nifil.

6.2. Анализ библиотек клонов фрагментов гена niJH.

6.3. Статистический анализ.

6.4. Анализ диазотрофного сообщества с помощью специфичных праймеров.

6.4.1. Проверка специфичности системы праймеров для представителей рода Oscillochloris и ее применение в исследовании торфяной почвы.

6.4.2. Проверка специфичности системы праймеров для представителей родов Methylobacter и Methylomonas, и ее применение в исследовании торфяной почвы.

Глава 7. Оценка биоразнообразия диазотрофов в образцах почв, отобранных из ризосфер контрольных и биотехнологичеекпх растений картофеля.

7.1. Выделение ДНК и амплификация генов nifН и 16S рРНК.

7.2. DGGE-анализ суммарного амплификата фрагментов гена 16S рРНК.

7.3. Анализ клонов фрагментов гена niJH.

7.4. Статистический анализ.

Глава 8. Сравнение структур диазотрофных сообществ торфяной почвы и ризосферы картофеля.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой"

Азот является важнейшим биогенным элементом, круговорот которого занимает особое место в системе геохимических циклов в биосфере. Несмотря на большие количества молекулярного азота в атмосфере данный элемент, как никакой другой лимитирует ресурсы питательных веществ в различных природных экосистемах, т.к. его доступность для всех живых организмов определяется деятельностью лишь ограниченного круга прокариот.

Интерес к изучению биологической фиксации азота обусловлен уникальной ролью диазотрофных сообществ в обеспечении плодородия почв, урожайности растений, а также функционирования экосистем в целом. Поэтому исследования по изучению различных аспектов азотфиксации в микробной экологии занимают высокий приоритет.

В последнее время особое внимание исследователей привлекают диазотрофные прокариоты экстремальных природных мест обитаний и агросистем, поскольку понимание формирования и функционирования микробных сообществ в данных биогеоценозах предстает в качестве необходимой базы для развития идей по активному регулированию процесса биологической фиксации азота в различных экосистемах.

С появлением молекулярно-биологических методов сфера изучения сообществ азотфиксирующих прокариот значительно расширилась, за счет возможности выявления микроорганизмов, находящихся в неактивных формах, трудно поддающихся культивированию или некультивируемых вовсе. Однако большие материальных затраты, часто сопутствующие таким исследованиям, и связанная с этим необходимость использования приемов, упрощающих молекулярный анализ, все еще не позволяют более полно подходить к изучению дизотрофньтх сообществ.

Так, одним из наиболее мощных молекулярно-биологических методов изучения микробных сообществ является анализ библиотек клонов функциональных генов, в частности генов нитрогеназного комплекса, к которым относится ген nijW. Однако в большинстве исследований при использовании данного подхода применяется либо анализ заведомо небольших выборок традиционным объемом в 100 клонов, либо стратегия скрининга клонов, основанная на рестрикции и других приемах. Такие упрощения далеко не всегда адекватно отражают реальное разнообразие микроорганизмов in situ, особенно при анализе сложных микробных сообществ. В этой связи представляется весьма ценным проведение работ, в которых метод клонирования генов нитрогеназного комплекса использовался бы без упрощающих анализ приемов. Кроме того, особый интерес представляют сопутствующие эксперименты по статистической оценке репрезентативности клональных библиотек. В настоящее время в отношении анализа функциональных генов такие работы практически отсутствуют.

Поскольку изучение биоразнообразия азотфиксирующих микроорганизмов в различных природных экосистемах относится к важнейшим задачам микробной экологии, то проведение работ по оценке внутренней структуры диазотрофных сообществ и выявлению доминирующих микробных популяций азотфиксаторов в почвах с различной антропогенной нагрузкой является очень актуальным. Несомненно, такие работы представляют ключевое звено на пути к пониманию основных закономерностей функционирования процесса азотфиксации в различных биогеоценозах.

Цель настоящей работы заключалась в проведении оценки биоразнообразия азотфиксирующих прокариот в торфяной и сельскохозяйственной почвах с помощью метода клонирования гена nifil.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

1. Оценить биоразнообразие диазотрофов в образце торфяной почвы естественной экосистемы болота "Сосвятское" с помощью метода клонирования гена nifil.

2. Оценить биоразнообразие диазотрофов в образцах почв, отобранных из ризосфер биотехнологических и контрольных растений картофеля, с помощью анализа библиотек клонов фрагментов гена nifil.

3. Сравнить структуры диазотрофных сообществ торфяной почвы и сельскохозяйственной почвы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

АТФ, АДФ — аденозинтрифосфорная/аденозиндифосфорная кислота ГМ - генетическая модицикация

ГЦ — молярное содержание суммы гуанина и цитозина в процентах от общего количества оснований ДНК

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота иРНК, рРНК, тРНК - информационная/рибосомальная/транспортная рибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СТАВ - цетнлтриметиламмонийбромид, цетавлон

ТАЕ-буфер - буфер, содержащий Трис, ацетат и ЭДТА

Трис - триоксиметиламинометан

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ARDRA - анализ рестрикции амплнфицированной рибосомальной ДНК

CLPP - физиологические профили сообществ

DAF - фингерпринтинг на основе амплификации ДНК

DGGE - денатурирующий градиентный гель-электрофорез dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфат

FAME - анализа профилей метиловых эфиров жирных кислот

IPTG - изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозид

OUT - оперативная таксономическая единица

PLFA - анализ профилей жирных кислот фосфолипидов

PR(s) - белки, связанные с патогенезом

PVPP - поливинилполипиролидон

RAPD - случайно амплифицированная полиморфная ДНК RFLP - анализ полиморфизма длины фрагментов рестрикции RIPs - рибосомоинактивирующие белки

RISA - анализ полиморфизма длин участков между рибосомальными генами SDS - додецилсульфат натрия

SSCP - полиморфизм конформаций одноцепочечных ДНК TGGE - температурный градиентный гель-электрофорез TLPs - тауматин-подобные белки

T-RFLP - анализ полиморфизма длин терминальных фрагментов рестрикции X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-В-галактопиранозид

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Задорина, Елена Владимировна

выводы

1. Впервые исследовано биоразнообразие диазотрофов торфяной почвы с помощью анализа библиотеки фрагментов гена nijft без использования предварительного скрининга клонов.

- Показано наличие 52 сиквенсных типов диазотрофов с преимущественным преобладанием представителей класса Aiphaproteobacteria.

Установлено, что традиционного размера библиотеки в 100 клонов недостаточно для полного покрытия разнообразия диазотрофов в данной экосистеме.

- Установлено наличие 11 сиквенсных типов диазотрофов в данной агросистеме с доминированием представителей класса Bacilli.

Показано, что одна библиотека адекватно отражает разнообразие диазотрофов в агросистеме только на уровне доминантных членов сообщества.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Задорина, Елена Владимировна, Москва

1. Белова С.Э., Панкратов Т.А., Дедыш С.Н. Бактерии рода Burkholderia как типичный компонент микробного сообщества сфагновых болот // Микробиология. -2006.-Т. 75.-№ 1.-С. 100-117.

2. Берцова Ю.В., Демин О.В., Богачев А.В. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azutobacter vinelandii II Успехи биологической химии. 2005. - Т. 45. -С. 205-234.

3. Биеньковски П., Титлянова А., Диттвалд Э., Шибарева С. Изменение элементного состава фитомассы сфагновых мхов в процессе торфообразования // Вестник ТГПУ. 2008. - Вып. 4. - С. 30-34.

4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589 с.

5. Головченко А.В., Добровольская Н.Г., Инишева Л.И. Структура и запасы микробной биомассы в олиготрофных торфяниках южно-таежнон подзоны Западной Сибири // Почвоведение. 2002. - № 12. - С. 1468-1473.

6. Головченко А.В., Добровольская Т.Г., Звягинцев Д.Г. Микробиологические основы оценки торфяника как профильного почвенного тела // Вестник ТГПУ. 2008. -Вып. 4. - С. 46-53.

7. Головченко А.В., Полянская Л.М., Добровольская Т.Г., Васильева Л.В., Чернов И.Ю., Звягинцев Д.Г. Особенности пространственного распределения и структуры микробных комплексов болотно-лесных экосистем // Почвоведение. 1993. -№ 10. - С. 78-89.

8. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. Учебное пособие для студентов ВУЗов. М.: МАКС Пресс, 2005.-88 с.

9. Ю.Дорошенко Е.В., Булыгина Е.С., Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кравченко И.К. Выделение и характеристика азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum из почвы сфагнового болота // Микробиология. — 2007. Т. 76. - № 1. - С. 107—115.

10. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология: учебник для вузов. 6 изд., испр. — М.: Дрофа, 2006.-444 с.

11. Запороженко Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв // Микробиология. 2006. - Т.75. - С. 127-134.

12. Зименко Т.Г. Микроорганизмы, превращающие азотсодержащие соединения торфяных почв // в кн. Микробные ценозы торфяных почв и их функционирование (под ред. Мишустина) Мн.: Наука и техника, 1983. - 181 с.

13. Игнатов В.В. Биологическая фиксация азота // Соросовский образовательный журнал, 1998. -№ 9. -С. 28-33.

14. Кеппен О.И., Лебедева Н.В., Трошина О.Ю., Родионов Ю.В. Нитрогеназная активность нитчатой фототрофноп зеленой бактерии // Микробиология. 1989. — Т. 58.-Вып. З.-С. 520-521.

15. Кравченко И.К., Дорошенко Е.В. Азотфиксирующая активность торфяной почвы верхового болота // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 1. - С. 111-116.

16. Лутова Л.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6. - № 10. - С. 10-17.

17. Марусина А.И., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П., Кравченко И.К., Гальченко В.Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов mJH различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. - Т. 70. - С.86-91.

18. Оценка биобезопасности генно-инженерно-модифицированных растений / Методические указания (временные). М.: Экспертный совет Минпромнауки России по вопросам биобезопасности, 2002. - 24 с.

19. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. 2-е изд., перераб. и доп.: Учебник для вузов.- СПб.: Изд-во СПбГТУ, 2002. 522 с.

20. Слободова Н.В. Изучение биоразнообразия азотфиксируюгцих прокариот кислых торфяных почв на основе анализа последовательностей генов я//Н: Автореф. дис. . .канд. биол. наук. М., 2006. - 24 с.

21. Умаров М.М. Современное состояние и перспективы исследований микробной азотфиксации // Перспективы развития почвенной биологии. М.: Изд-во МГУ, 2001.-С. 47-56.

22. Acosta-Martinez V., Tabatabai М.А. Enzyme activities in a limed agricultural soil // Biol. Fertil. Soils. 2000. - V. 31. - P. 85-91.

23. Ahrenholtz I., Harms K., De Vries J., Wackernagel W. Increased Killing of Bacillus subtilis on the Hair Roots of Transgenic T4 Lysozyme-Producing Potatoes // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - № 5. P. - 1862-1865.

24. Aleem A., Isar J., Malik A. Impact of long-term application of industrial wastewater on the emergence of resistance traits in Azotobacter chroococcum isolated from rhizospheric soil //Biores. Technol. 2003,- V. 86. -№ 1. - P. 7-13.

25. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual Microbial Cells without Cultivation // Microbiol. Rev. 1995. -V. 59.-№ l.-P. 143-169.

26. Barton H.A., Taylor M.R., Pace N.R. Molecular Phylogenetic Analysis of a Bacterial Community in an Oligotrophic Cave Environment // Geomicrobiol. J. 2004. - V. 21. — P.11-20.

27. Baumgarte S., Tebbe C.C. Field studies on the environmental fate of the Cryl Ab Bt-toxin produced by transgenic maize (MONSIO) and its effect on bacterial communities in the maize rhizosphere // Mol. Ecol. 2005. - V. 14. - № 8. - P. 2539-2551.

28. Blackwood C.B., Buyer J.S. Evaluating the physical capture method of terminal restriction fragment length polymorphism for comparison of soil microbial communities // Soil Biol. Biochem. 2007. - V. 39. - P. 590-599.

29. Blackwood C.B., Buyer J.S. Soil Microbial Communities Associated with Bt and Non-Bt Corn in Three Soils // J. Environ. Qual. 2004. - V. 33. - № 3. - P. 832-836.

30. Bochner B. "Breathprints" at the microbial level // ASM Am. Soc. Microbiol. News. -1989.-V. 55.-№ 10.-P. 536-539.

31. Bossio D.A., Scow K.M. Impacts of Carbon and Flooding on Soil Microbial Communities: Phospholipid Fatty Acid Profiles and Substrate Utilization Patterns // Microb. Ecol. 1998. - V. 35. - P. 265-278.

32. Boyd W.L. and Boyd J.W. Presence of Azotobacter Species in Polar Regions // J. Bacterid. 1962. - V. 83. - P. 429^130.

33. Breiteneder H. Thaumatin-like proteins a new family of pollen and fruit allergens // Allergy.-2004.-V. 59.-№5.-P. 479-481.

34. Breza-Boruta В., Paluszak Z. Changes in population of selected bacteria in the rhizosphere of potato under different farming systems // EJPAU, Agronomy. 2003. - V. 6. — № 2. — P 1-12.

35. Bruns A., Cypionka H., Overmann J. Cyclic AMP and Acyl Homoserine Lactones Increase the Cultivation Efficiency of Heterotrophic Bacteria from the Central Baltic Sea // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. -№ 8. - P. 3978-3987.

36. Buchmann N. Biotic and abiotic factors controlling soil respiration rates in Picea abies stands 11 Soil Biol. Biochem. 2000. - V. 32. - P. 1625-1635.

37. Buckley D.H., Schmidt T.M. The Structure of Microbial Communities in Soil and the Lasting Impact of Cultivation // Microb. Ecol. 2001. - V. 42. - P. 11-21.

38. Burgmann H., Widmer F., von Sigler W., Zeyer J. New Molecular Screening Tools for Analysis of Free-Living Diazotrophs in Soil // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. № 1.-P. 240-247.

39. Bykova S., Boeckx P., Kravchenko I., Galchenko V., van Cleemput O. Response of CH4 oxidation and methanotrophic diversity to NH4+ and CH4 mixing ratios // Biol. Fertil. Soils. 2007. - V. 43. - P. 341-348.

40. Chin K.-J., Liesack W., Janssen H. Opitutus terrae gen. nov., sp. nov., to accommodate novel strains of the division ' Verrucomicrobia'' isolated from rice paddy soil // Intern. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - V. 51. - P. 1965-1968.

41. Choo Q.-C., Samian M.R., Najimudin N. Phylogeny and Characterization of Three nifR-Homologous Genes from Paenibacillus azotofixans II Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. -№ 6. - P. 3658-3662.

42. Church M.J., Short C.M., Jenkins B.D., Karl D.M. Zehr J.P. Temporal Patterns of Nitrogenase Gene (ni/H) Expression in the Oligotrophic North Pacific Ocean // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - № 9. - P. 5362-5370.

43. Connon S.A., Giovannoni S.J. High-Throughput Methods for Culturing Microorganisms in Very-Low-Nutrient Media Yield Diverse New Marine Isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - № 8. - P. 3878-3885.

44. Cowgill S.E., Bardgett R.D., Kiezebrink D.T., Atkinson H.J. The effect of transgenic nematode resistance on non-target organisms in the potato rhizosphere // J. Appl. Ecol. -2002. V. 39. - № 6. - P. 915-923.

45. Crosby L.D., Criddle S. Understanding Bias in Microbial Community Analysis Techniques due to rrn Operon Copy Number Heterogeneity // BioTechniques. 2003. -V. 34,-№4.-P. 1-9.

46. Dixon R., Kahn D. Genetic regulation of biological nitrogen fixation // Nat. Rev. Microbiol. 2004. - V. 2. - P. 621-631.

47. Dunfield K.E., Germida J.J. Diversity of bacterial communities in the rhizosphere and root interior of field-grown genetically modified Brassica napus II FEMS Microbiol. Ecol.-2001.-V. 38.-P. 1-9.

48. Dunfield K.E., Germida J.J. Impact of Genetically Modified Crops on Soil- and Plant-Associated Microbial Communities // J. Environ. Qual. 2004. - V. 33. - № 3. - P. 806815.

49. Dunfield K.E., Germida J.J. Seasonal Changes in the Rhizosphere Microbial Communities Associated with Field-Grown Genetically Modified Canola (Brassica napus) H Appl. Environ. Microbiol. -2003. V. 69.-№ 12.-P. 7310-7318.

50. Ferris M.J., Ward D.M. Seasonal Distributions of Dominant 16S rRNA-Defined Populations in a Hot Spring Microbial Mat Examined by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis//Appl. Environ. Microbiol.- 1997.-V. 63.-№4.-P. 1375-1381.

51. Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., le Gall F., Jeannin P., Nesme X., Simonet P. Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - № 12. - P. 5409-5420.

52. Gabor E.M., de Vries E.J., Janssen D.B. Effcient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods // FEMS Microbiol. Ecol. 2003. - V. 44.-P. 153-163.

53. Garbeva P., van Veen J.A., van Elsas J.D. Predominant Bacillus spp. in Agricultural Soil under Different Management Regimes Detected via PCR-DGGE // Microb. Ecol. 2003. -V. 43.-P. 302-316.

54. Gardener McSpadden B.B. Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp. in Agricultural Systems // Phytopathology. 2004. - V. 94. - № 11. - P. 1252-1258.

55. Garland J.L., Mills A.L. Classification and Characterization of Heterotrophic Microbial Communities on the Basis of Patterns of Community-Level Sole-Carbon-Source Utilization // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - № 8. - P. 2351-2359.

56. Green S.J., Inbar E., Michcl F.C. Jr., Hadar Y., Minz D. Succession of bacterial communities during early plant development: transition from seed to root and effect of compost amendment. // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - № 6. - P. 39753983.

57. Green S.J., Michel F.C. Jr., Hadar Y., Minz D. Similarity of bacterial communities in sawdust- and straw-amended cow manure composts // FEMS Microbiol. Lett. 2004. -V.233.-P. 115-123.

58. Gregory L.G., Karakas-Sen A., Richardson D.J., Spiro S. Detection of genes for membrane-bound nitrate reductase in nitrate-respiring bacteria and in community DNA // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 183. - № 2. - P. 275-279.

59. Gremion F., Chatzinotas A., Kaufmann K., von Sigler W., Harms H, Impacts of heavy metal contamination and phytoremediation on a microbial community during a twelvemonth microcosm experiment // FEMS Microbiol. Ecol. 2004. - V. 48. - № 2. - P. 273-283.

60. Griffiths B.S., Geoghegan I.E., Robertson W.M. Testing genetically engineered potato, producing the lectins GNA and Con A, on non-target soil organisms and processes // J. Appl. Ecol.-2000.-V. 37.-№ l.-P. 159-170.

61. Griffiths B.S., Ritz K., Ebblewhite N., Dobson G. Soil microbial community structure: Effects of substrate loading rates // Soil Biol. Biochem. 1998. - V. 31. - № 1. - P.145-153.

62. Kallmann J., Quadt-ITallmann A., Miller W.G., Sikora R.A., Lindow S.E. Endophytic Colonization of Plants by the Biocontrol Agent Rhizobium etli G12 in Relation to Meloidogyne incognita Infection 11 Phytopathology. 2001. - V.91. - № 4. - P. 415-422.

63. Hamer D.H., Thomas C.A. Molecular Cloning of DNA Fragments Produced by Restriction Endonucleases Sail and BamI // Proceedings of the National Academy of Scienccs of the United States of America. 1976. - V. 73. - № 5. - P. 1537-1541.

64. Hartmann M., Widmer F. Community Structure Analyses Are More Sensitive to Differences in Soil Bacterial Communities than Anonymous Diversity Indices // Appl. Environ. Microbiol.-2006.-V. 72.-№ 12.-P. 7804-7812.

65. He J., Xu Z., Hughes J. Molecular bacterial diversity of a forest soil under residue management regimes insubtropical Australia // FEMS Microbiol. Ecol. 2006. - V. 55. -P. 38-47.

66. Hoffmann-Sommergruber К. Pathogenesis-related (PR)-proteins identified as allergens // Biochemical Society Transactions. 2002. - V. 30. - part 6. - P. 930-935.

67. Holmes A. J., Costello A., Lidstrom M. E., Murrell J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related // FEMS Microbiol. Lett. 1995.-V. 132.-№ 3. - P. 203-208.

68. Hopkins D.W., MacNaughton S.J., O'Donnell A.G. A dispersion and differential centrifugation technique for representatively sampling microorganisms from soil // Soil Biol. Biochem. 1991. - V. 23. - № 3. - P. 217-225.

69. Howard J.В., Rees D.C. Structural Basis of Biological Nitrogen Fixation // Chem. Rev. 1996. - V. 96. - P. 2965-2982.

70. Ibekwe A.M., Papiernik S.K., Gan J., Yates S.R., Yang C.-H., Crowley D.E. Impact of Fumigants on Soil Microbial Communities // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V. 67. - № 7. - P. 3245-3257.

71. Igarashi R.Y., Seefeldt L.C. Nitrogen Fixation: The Mechanism of the Mo-Dependent Nitrogenase // Crit. rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. - V. 38. - P. 351-384.

72. Ikeda S., Ytow N., Ezura H., Minamisawa K., Fujimura T. Soil microbial community analysis in the environmental risk assessment of transgenic plants // Plant Biotechnology.- 2006a. -V. 23.-№ l.-P. 137-151.

73. Ikenaga M., Asakawa S., Muraoka Y., Kimura M. Bacterial communities associated with nodal roots of rice plants along with the growth stages: Estimation by PCR-DGGE and sequence analyses // Soil Sci. Plant Nutr. 2003. - V. 49. - № 4. - P. 591-602.

74. Ishii К., Fukui M., Takii S. Microbial succession during a composting process as evaluated by denaturing gradient gel electrophoresis analysis // J. Appl. Microbiol. — 2000. V. 89. - № 5. - P. 768-777.

75. Izquierdo J.A., Nusslein K. Distribution of Extensive nijR Gene Diversity Across Physical Soil Microenvironments // Microb. Ecol. 2006. - V. 51. - № 4. - P. 441-452.

76. James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops // IS AAA Briefs. -ISAAA: Ithaca, NY. 2005. - №. 34. - pp. 58.

77. James C. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops // ISAAA Briefs. -ISAAA: Ithaca, NY. 2007. - №. 37. -pp. 23.

78. James C. Global Status of Transgenic Crops in 1997 // ISAAA Briefs. ISAAA: Ithaca, NY. - 1997. - №. 5. - pp. 31.

79. James J.В., Sherman T.D., Devereux R. Analysis of Bacterial Communities in Seagrass Bed Sediments by Double-Gradient Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of PCR-Amplified 16S rRNA Genes // Microb. Ecol. 2006. - V. 52. - P. 655-661.

80. Jenkinson D.S. The impact of humans on the nitrogen cycle, with focus on temperate arable agriculture // Plant and Soil. 2001. - V. 228. - P. 3-15.

81. Jung S., Park S., Kim D., Kim Seung Bum. Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Bacterial Community Profiles in the Rliizosphere of crylAC-carrying Brassica тара subsp. pekinensis II J. Microbiol. — 2008. V. 46. - № 1. - P. 1215.

82. Kaneko R., Kitabatake N. Structure-Sweetness Relationship in Thaumatin: Importance of Lysine Residues // Chem. Senses. 2001. - V. 26. - № 2. - P. 167-177.

83. Kirk J.L., Beaudette L.A., Hart M., Moutoglis P., Klironomos J.N., Lee H., Trevors J.T. Methods of studying soil microbial diversity // J. Microbiol. Methods. -2004.-V. 58.-P. 169-188.

84. Kolb S., Knief C., Stubner S., Conrad R. Quantitative Detection of Methanotrophs in Soil by Novel pmoA-Targeted Real-Time PCR Assays // Appl. Environ. Microbiol. -2003. V. 69. - № 5. - P. 2423-2429.

85. Krsek M., Wellington E.M.H. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil // J. Microbiol. Methods. 1999. -V. 39.-№ l.-P. 1-16.

86. Kumaraswamy R., Kuenen J.G., Kleerebezem R., van Loosdrecht M.C., Muyzer G. Structure of microbial communities performing the simultaneous reduction of Fe(II)EDTA.N02" and Fe(III)EDTA" // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. - V. 73. -№4.-P. 922-931.

87. Kuzyakov Y., Larionova A.A. Root and rhizomicrobial respiration: A review of approaches to estimate respiration by autotrophic and heterotrophic organisms in soil // J. Plant Nutr. Soil Sci. 2005. - V. 168. - № 4. - P. 503-520.

88. Leff L., Dana J.R., McArthur J.V., Shimkets L.J. Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - № 3. -P.1141-1143.

89. Liu В., Zeng Q., Yan F., Xu H., Xu Ch. Effects of transgenic plants on soil microorganisms // Plant and Soil. 2005. - V. 271. -№ 1-2. - P. 1-13.

90. Lottmann J., Heuer H., Smalla K., Berg G. Influence of transgenic T4-lysozyme-producing potato plants on potentially beneficial plant-associated bacteria // FEMS Microbiol. Ecol. 1999. - V. 29. - P. 365-377.

91. Mader P., Fliessbach A., Dubois D., Gunst L., Fried P., Niggli U. Soil Fertility and Biodiversity in Organic Farming // Science. 2002. - V. 296. - P. 1694-1697.

92. Marschner P., Crowley D., Yang C.H. Development of specific rhizosphere bacterial communities in relation to plant species, nutrition and soil type // Plant and Soil.- 2004. — V. 261.-P. 199-208.

93. Martinez-Toledo M.V., Gonzalez-Lopez J. de la Rubia Т., Ramos-Cormenzana A. Isolation and characterization of Azotobacter chroococcum from the roots of Zea mays I I FEMS Microbiol. Lett. 1985. - V. 31.-№ 4. - P. 197-203.

94. Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S., Chaussod R., Germon J.C., Soulas G., Catroux G. DNA Extraction from Soils: Old Bias for New Microbial Diversity Analysis Methods // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - № 5. - P. 2354-2359.

95. McDonald I. R., Murrell J. C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -№ 8. - P. 3218-3224.

96. McDonald I.R., Radajewski S., Murrell J.C. Stable isotope probing of nucleic acids in methanotrophs and methylotrophs: A review // Organic Geochemistry. — 2005. — V. 36.-№5.-P. 779-787.

97. McDonald I.R., Upton M., Hall G., Pickup R.W., Edwards C., Saunders J.R., Ritchie D.A., Murrell J.C. Molecular Ecological Analysis of Methanogens and Methanotrophs in Blanket Bog Peat // Microb. Ecol. 1999. - V. 38. - P. 225-233.

98. Mehta M.P., Butterfield D.A., Baross J.A. Phylogenetic Diversity of Nitrogenase (ni/H) Genes in Deep-Sea and Hydrothermal Vent Environments of the Juan de Fuca Ridge // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 2. - P. 960-970.

99. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L., Ghiorse W.C. Evaluation and Optimization of DNA Extraction and Purification Procedures for Soil and Sediment Samples // Appl. Environ. Microbiol. 1999. -V. 65. - № 11. - P. 4715-4724.

100. Milling A., Smalla K„ Maidl F.X., Schloter M., Munch J.C. Effects of transgenic potatoes with an altered starch composition on the diversity of soil and rhizosphere bacteria and fungi // Plant and Soil. 2004. - V. 266. - № 1-2. - P. 23-39.

101. Mohanty S.R., Bodelier P.L.E. , Floris V., Conrad R. Differential effects of nitrogenous fertilizers on methane-consuming microbes in rice field and forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72. - № 2. - P. 1346-1354.

102. Mondini C., Insam H. Community level physiological profiling as a tool to evaluate compost maturity: a kinetic approach // Eur. J. Soil Biol. 2003. - V. 39. - P. 141-148.

103. Morris S.A., Radajewski S., Willison T.W., Murrell J.C. Identification of the Functionally Active Methanotroph Population in a Peat Soil Microcosm by Stable-Isotope Probing // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - № 3. - P. 1446-1453.

104. Mulder C., Wouterse M., Raubuch M., Roelofs W., Rutgers M Can Transgenic Maize Affect Soil Microbial Communities? // PLoS Comput. Biol. 2006. - V. 2. - № 9. -P. 1165-1172.

105. Muyzer G. Genetic fingerprinting of microbial communities ~ present status and future perspectives // Methods of Microbial Community Analysis. 1999. - P. 10.

106. Muyzer G., Smalla K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology // Antonie van Leeuwenhoek. 1998b. - V. 73. - P. 127-141.

107. Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini M.T., Landi L., Pietramellara G., Renella G. Microbial diversity and soil functions // Eur. J. Soil Sci. 2003. - V. 54. - P. 655-670.

108. Nercessian D., Upton M., Lloyd D., Edwards C. Phylogenetic analysis of peat bog methanogen populations // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 173. - P. 425-429.

109. Nishijima Т., Toyota K., Mochizuki M. Predominant Culturable Bacillus Species in Japanese Arable Soils and Their Potential as Biocontrol Agents // Microbes Environ. -2005.-V. 20,-№ 1.-P. 61-68.

110. Novinscak A., Surette C., Allain C., Filion M. Application of molecular technologies to monitor the microbial content of biosolids and composted biosolids // Water Sci Technol. 2008. - V. 57. - № 4. - P. 471-477.

111. O'Callaghan M., Gerard E.M., Waipara N.W., Young S.D., Glare T.R., Barrell P.J., Conner A.J. Microbial communities of Solanum tuberosum and magainin-producing transgenic lines // Plant and Soil. 2004. - V. 266. - № 1 -2. - P. 47-56.

112. Oger P., Mansouri H., Dessaux Y. Effect of crop rotation and soil cover on alteration of the soil microflora generated by the culture of transgenic plants producing opines // Mol. Ecol. 2000. - V. 9. - P. 881-890.

113. Oger P., Petit A., Dessaux Y. Genetically engineered plants producing opines alter their biological environment // Nature Biotechnology. 1997. - V. 15. - P. 369-372.

114. Ogram A., Sayler G.S., Barkay T. The extraction and purification of microbial DNA from sediments // J. Microbiol. Methods. 1987. - V. 7. - Is. 2-3. - P. 57-66.

115. Overmann J. and Tuschak C. Phylogeny and molecular fingerprinting of green sulfur bacteria // Arch Microbiol. 1997. - V. 167. - № 5. - P. 302-309.

116. Pace N.R. A Molecular View of Microbial Diversity and the Biosphere // Science.- 1997. V. 276. - P. 734-740.

117. Palmer K.M., Young J.P.W. Higher Diversity of Rhizobium leguminosarum Biovar viciae Populations in Arable Soils than in Grass Soils // Appl. Environ. Microbiol.- 2000. V. 66. - № 6. - P. 2445-2450.

118. Persley G.J., Siedow J.N. Applications of Biotechnology to Crops: Benefits and Risks // CAST, Issue Paper. 1999. -№ 12. - P. 1-8.

119. Perucci P. Enzyme activity and microbial biomass in a field soil amended with municipal refuse // Biol. Fertil. Soils. 1992. - V. 14. - P. 54-60.

120. Piceno Y.M., Noble P.A., Lovell C.R. Spatial and Temporal Assessment of Diazotroph Assemblage Composition in Vegetated Salt Marsh Sediments Using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis // Microb. Ecol. 1999. - V. 38. - P. 157-167.

121. Poly F., Ranjard L., Nazaret S., Gourbiere F., Monrozier L.J. Comparison of nifi-l Gene Pools in Soils and Soil Microenvironments with Contrasting Properties // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. -№ 5. - P. 2255-2262.

122. Popova L.S. Aerobic Forms of Clostridium polymyxa from Peat Bog and Podzolic Soils // Izv, Akad. Nauk SSSR, Ser. Biol. 1961. - №. 3. - P. 98-118.

123. Prieme A., Sitaula J.I.B., Klemedtsson A.K., Bakken L.R. Extraction of methane-oxidizing bacteria from soil particles // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - V. 21. - № 1. -P. 59-68.

124. Prosser J.I. Molecular and functional diversity in soil micro-organisms // Plant and Soil. -2002. V. 244. - P. 9-17.

125. Qiu X., Wu L., Huang H., McDonel P.E., Palumbo A.V., Tiedje J.M., Zhou J. Evaluation of PCR-Generated Chimeras, Mutations, and Heteroduplexes with 16S rRNA Gene-Based Cloning // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - № 2. - P. 880-887.

126. Radajewski S., McDonald I.R., Murrell J.C. Stable-isotope probing of nucleic acids: a window to the function of uncultured microorganisms // Current Opinion in Biotechnology. 2003. - V. 14. - P. 296-302.

127. Rai S.N., Gaur A.C. Characterization of Azotobacter spp. and effect of Azotobacter and Azospirillum as inoculant on the yield and N-uptake of wheat crop // Plant and Soil. 1988. - V. 109. - P. 131-134.

128. Ranjard L., Poly F., Nazaret S. Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques: application to soil environment // Res. Microbiol. -2000. V. 151.-P. 167-177.

129. Reiter В., Burgmann H., Burg K., Sessitsch A. Endophytic nijH gene diversity in African sweet potato // Can. J. Microbiol. 2003. - V. 49. - № 9. - P. 549-555.

130. Reysenbach A.-L., Giver L.J., Wickham G.S., Pace N.R. Differential Amplification of rRNA Genes by Polymerase Chain Reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1992.-V. 58.-№ 10. - P. 3417-3418.

131. Roose-Amsaleg C.L., Garnier-Sillam E., Harry M. Extraction and purification of microbial DNA from soil and sediment samples // Appl. Soil Ecol. 2001. - V. 18. - P. 47-60.

132. Rosch C., Mergel A., Bothe H. Biodiversity of Denitrifying and Dinitrogen-Fixing Bacteria in an Acid Forest Soil // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 68. - № 8.-P. 3818-3829.

133. Rotthauwe J. H., Witzel K. P., Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 12. -P. 4704-4712.

134. Ryan M.G., Beverly E.L. Interpreting, measuring, and modeling soil respiration // Biogeochemistry. 2005. - V. 73. - P. 3-27.

135. Saano A., Kaijalainen S., Lindstroem K. Inhibition of DNA immobilization to nylon membrane by soil compounds // Microbial Releases. 1993. - V. 2. - № 3. - P. 153-160.

136. Saengkerdsub S., Anderson R.C., Wilkinson H.H., Kim W.-K., Nisbet D.J., Ricke S.C. Identification and Quantification of Methanogenic Archaea in Adult Chicken Ceca // Appl. Environ.Microbiol. 2007. - V. 73. -№ 1. - P. 353-356.

137. Saito A., Ikeda S., Ezura H., Minamisawa K. Microbial Community Analysis of the Phytosphere Using Culture-Independent Methodologies // Microbes and Environments. 2007. - V. 22. - № 2. - P. 93-105.

138. Sambrook J. Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

139. Saxena D., Stotzky G. Insecticidal toxin from Bacillus thuringiensis is released from roots of transgenic Bt corn in vitro and in situ II Soil Biol. Biochem. 2000. - V. 33.-№ 9.-P. 1225-1230.

140. Schabereiter-Gurtner C., Saiz-Jimenez C., Pinar G., Lubitz W., Rolleke S. Altamira cave Paleolithic paintings harbor partly unknown bacterial communities // FEMS Microbiol. Lett. 2002a. - V. 211. - № 1. - P. 7-11.

141. Schafer H., Muyzer G. Denaturing gradient gel electrophoresis in marine microbial ecology // Marine Microbiology. Methods in Microbiology. Ed. J.H. Paul. -London: Acad. Press., 2001. -V. 30. P. 425-468.

142. Schmalenberger A., Tebbe C.C. Bacterial community composition in the rhizosphere of a transgenic, herbicide-resistant maize (Zea mays) and comparison to its non-transgenic cultivar Bosphore II FEMS Microbiol. Ecol. 2002. - V. 40. - № 1. - P. 29-37.

143. Schneegurt M.A., Dore S.Y., Charles F. Kulpa Jr. Direct Extraction of DNA from Soils for Studies in Microbial Ecology // Curr. Issues Mol. Biol. 2003. - V. 5. - P. 1-8.

144. Schwencke J., Caru M. Advances in Actinorhizal Symbiosis: Host Plant- Frankia Interactions, Biology, and Applications in Arid Land Reclamation. A Review // Arid Land Research and Management. 2001. - V. 15. - № 4. - P. 285-327.

145. Sebastianelli A., Sen Т., Bruce I.J. Extraction of DNA from soil using nanoparticles by magnetic bioseparation // Lett Appl Microbiol. — 2008. V. 46. - № 4. -P. 488-491.

146. Sessitsch A., Hackl E., Wenzl P., Kilian A., Kostic Т., Stralis-Pavese N., Sandjong B.T., Bodrossy L. Diagnostic microbial microarrays in soil ecology // New Phytologist. 2006. - V. 171. - P. 719-736.

147. Sessitsch A., Kan F.Y., Pfeifer U. Diversity and community structure of culturable Bacillus spp. populations in the rhizospheres of transgenic potatoes expressing the lytic peptide cecropin В // Appl. Soil Ecol. 2003. - V. 22. - № 2. - P. 149-158.

148. Shaffer B.T., Widmer F., Porteous L.A., Seidler R.J. Temporal and Spatial Distribution of the nifil Gene of N2 Fixing Bacteria in Forests and Clearcuts in Western Oregon // Microb. Ecol. 2000. - V. 39. - P. 12-21.

149. Sharma S., Aneja M.K., Mayer J., Munch J.C., Schloter M. Characterization of Bacterial Community Structure in Rhizosphere Soil of Grain Legumes // Microb. Ecol. -2005a.-V. 49.-P. 407-415.

150. Sharma S., Aneja M.K., Mayer J., Munch J.C., Schloter M. Diversity of Transcripts of Nitrite Reductase Genes (nirK and nirS) in Rhizospheres of Grain Legumes // Appl. Environ. Microbiol. 2005b. - V. 71. -No 4. - P. 2001-2007.

151. Siciliano S.D., Germida J.J. Taxonomic diversity of bacteria associated with the roots of field-grown transgenic Brassica napus cv. Quest, compared to the non-transgenic

152. B.napus cv. Excel and B.rapa cv. Parkland // FEMS Microbiol. Ecol. 1999. - V. 29. -№ 3. - P. 263-272.

153. Stackebrandt E„ Pukall R., Ulrichs G., Rheims H. Analysis of 16S rDNA clone libraries: Part of the big picture // Methods of Microbial Community Analysis. 1999. -P. 1-7.

154. Steffan R.J., Goksoyr J., Bej A.K., Atlas R.M. Recovery of DNA from Soils and Sediments // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54. - №> 12. - P. 2908-2915.

155. Stevenson B.S., Eichorst S.A., Wertz J.T., Schmidt T.M., Breznak J.A. New Strategies for Cultivation and Detection of Previously Uncultured Microbes // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - № 8. - P. 4748-4755.

156. Steward G.F., Zehr J.P., Jellison R., Montoya J.P., Hollibaugh J.T. Vertical Distribution of Nitrogen-Fixing Phylotypes in a Meromictic, Hypersaline Lake // Microb. Ecol. 2004. - V. 47. - P. 30-40.

157. Tebbe C.C., Vahjen W. Interference of humic acid and DNA extraction directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and yeast // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - № 8. - P. 2657-2665.

158. Theron J., Cloete Т.Е. Molecular Techniques for Determining Microbial Diversity and Communiry Structure in Natural Environments // Critical Reviews in Microbiology. 2000. - V. 26. - № 1. - P. 37-57.

159. Throback I.N., Johansson M., Rosenquist M., Pell M., Hansson M., Hallin S. Silver (Ag+) reduces denitrification and induces enrichment of novel ///УК genotypes in soil // FEMS Microbiol. Lett. 2007. - V. 270. - P. 189-194.

160. Tolli J., King G. M. Diversity and structure of bacterial chemolithotrophic communities in pine forest and agroecosystem soils // Appl. Environ. Microbiol. 2005. -V. 71.-№12.-P. 8411-8418.

161. Torsvik V., Goksoyr J., Daae L.F. High diversity in DNA of soil bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - № 3. - P. 782-787.

162. Wei X.D., Zou H.L., Chu L.M., Liao В., Ye C.M., Lan C.V. Field released transgenic papaya affects microbial communities and enzyme activities in soil // Plant Soil. 2006. - V. 285. - P. 347-358.

163. Wei-xiang Wu, Qing-fu Ye, Hang Min, Xue-jun Duan, Wen-ming Jin. Bt-transgenic ricc straw affects the culturable microbiota and dehydrogenase and phosphatase activities in a flooded paddy soil // Soil Biol. Biochem. 2004. - V. 36. - № 2.-P. 289-295.

164. Widmer F. Assessing Effects of Transgenic Crops on Soil Microbial Communities // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2007. - V. 107. - P. 207-234.

165. Widmer F., Shaffer B.T., Porteous L.A., Seidler R.J. Analysis of nifH Gene Pool Complexity in Soil and Litter at a Douglas Fir Forest Site in the Oregon Cascade Mountain Range // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - V. 65. - № 2. - P. 374-380.

166. Woese C.R. Bacterial Evolution // Microbiological Reviews. 1987. - V. 51. - № 2.-P. 221-271.

167. Yeager C.M., Northup D.E., Grow C.C., Barns S.M., Kuske C.R. Changes in Nitrogen-Fixing and Ammonia-Oxidizing Bacterial Communities in Soil of a Mixed Conifer Forest after Wildfire // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. - № 5. - P. 2713-2722.

168. Zehr J.P., Jenkins B.D., Short S.M., Steward G.F. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison // Environmental Microbiology. 2003. - V. 5. - № 7. p. 539-554.

169. Zelles L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review // Biol. Fertil. Soils. 1999. -V. 29.-P. 111-129.

170. Zhou J., Bruns M.A., Tiede J.M. DNA recovery from soils for diverse composition // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - № 2. - P. 316-322.

Информация о работе

Задорина, Елена Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биоразнообразие диазотрофов почв с различной антропогенной нагрузкой - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы