Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Симбиотические гены как инструмент поиска и модификации клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Симбиотические гены как инструмент поиска и модификации клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала"

На правах рукописи

ИВАНОВА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

СИМБИОТИЧЕСКИЕ ГЕНЫ КАК ИНСТРУМЕНТ ПОИСКА И МОДИФИКАЦИИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ДИКОРАСТУЩИХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ ЮЖНОГО УРАЛА

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 / НОЯ 2014

005555806

Уфа-2014

005555806

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской

академии наук

Научный руководитель:

Баймиев Андрей Ханифович

Доктор биологических наук, доцент

Официальные оппоненты:

Маркушева Татьяна Вячеславовна Доктор биологических наук, профессор

Руководитель группы генетики микроорганизмов ФГБУН Института биологии Уфимского научного центра РАН

Топунов Алексей Федорович Зав. лабораторией биохимии азотфиксации и

Доктор биологических наук метаболизма азота Института биохимии им.

А.Н.Баха РАН

Ведущая организация:

ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г.Саратов

Защита диссертации состоится «<<7 » декабря 2014 г. в «-/? » часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН по адресу: Уфа, пр. Октября, 71 и на сайте ИБГ УНЦ РАН: ibg.anrb.ru

e-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан МАЙ^г. 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Бикбулатова С.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Клубеньковые бактерии (ризобии) - грамотрицательные микроорганизмы, обладающие свойством фиксировать атмосферный азот в симбиозе с бобовыми растениями. Способность к симбиотической азотфиксации позволила ризобиям стать одной из наиболее изучаемых и широко используемых в практике групп микроорганизмов. Формируемые на их основе высокоэффективные инокулянты применяются для получения высоких урожаев бобовых растений без внесения в почву экологически небезопасных минеральных удобрений (Тихонович, Проворов, 2004).

На сегодняшний день исследование бобово-ризобиального симбиоза невозможно без изучения генетического контроля этого процесса со стороны обоих партнеров. Понимание генетической системы симбиоза дает возможность направленно повышать его эффективность, а также создавать новые симбиотические комплексы (Тихонович и др., 2005). В настоящее время большие успехи достигнуты в исследовании симбиотических генов (¡гу/и-генов) клубеньковых бактерий (Fisher, Long, 1992; Fisher, 1994; Denarie, 1996), наличие которых является основным условием включения бактерий в группу ризобий. Они локализованы либо в специфических симбиотических геномных компартментах в составе крупных плазмид, либо в пределах хромосомных островков, ограниченных IS-подобными элементами, благодаря чему часто бывают вовлечены в процессы горизонтального переноса генов (ГПГ). Данный процесс является неотъемлемой частью эволюции бобово-ризобиальных взаимоотношений (Freiberg et al., 1997; Bailly et al., 2007; Estrella et al., 2009; Marchetti et al., 2010) и зачастую приводит к появлению штаммов с измененной хозяйской специфичностью или к приобщению новых видов микроорганизмов к группе клубеньковых бактерий (Sullivan et al., 1995; Chen et al., 2000; Nandasena et al., 2006; Andam et al., 2007; Barcellos et al., 2007; Zaneveld et al., 2008; Zhao et al., 2008).

У ризобий, в отличие от свободноживущих азотфиксаторов, регуляция экспрессии jjw-генов осуществляется не только внешними факторами (в основном, кислородом), но и растением-хозяином, что не позволяет им фиксировать азот вне растения. Учитывая тот факт, что за активацию всей системы азотфиксации у клубеньковых бактерий отвечает продукт всего лишь одного гена, появляется возможность искусственно изменять его регуляцию и, по

сути, изменять азотфиксирующий статус ризобий, придавая им способность фиксировать азот ex planta. Данная способность существенно расширит границы применения клубеньковых бактерий в качестве биоудобрений.

Цель работы - исследование филогении svm-генов клубеньковых бактерий бобовых умеренного климата и анализ возможности их использования для идентификации и модификации ризобий. Задачи исследования:

1. Исследовать филогению луот-генов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала и провести ее сравнительное сопоставление с филогенией генов 16SpPHK данных бактерий.

2. Оценить вклад горизонтального переноса ¿jw-генов в генетическое разнообразие клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала.

3. Исследовать возможность использования iy/и-генов в качестве маркеров для идентификации клубеньковых бактерий.

4. Исследовать возможность создания штаммов клубеньковых бактерий с измененной регуляцией экспрессии генов нитрогеназного комплекса.

Научная новизна работы. Показано, что для ризобий, вступающих в азотфиксирующий симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями Южного Урала на внутриродовом уровне характерна параллельная эволюция 5у/н-генов и генов 16SpPHK. Обнаружены единичные штаммы клубеньковых бактерий, содержащие jyw-гены бактерий других родов ризобий, что, вероятно, является результатом процесса горизонтального переноса генов. Впервые была исследована возможность применения sym-генов ризобий в качестве маркеров для быстрого обнаружения и первичной идентификации клубеньковых бактерий. Показана возможность искусственной регуляции генов нитрогеназного комплекса для получения штаммов клубеньковых бактерий, фиксирующих атмосферный азот ех planta.

Практическая значимость работы. Новые знания о филогении ¿у/п-генов клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала расширяют представление об эволюции симбиотических свойств данных бактерий, генетическом разнообразии и их специфичности при образовании симбиоза с бобовыми растениями. Исследованная возможность применения sym-

генов в качестве маркеров с целью обнаружения и идентификации ризобий может в дальнейшем облегчить изучение клубеньковых бактерий. Контролируемое влияние на экспрессию генов нитрогеназного комплекса позволит создавать штаммы ризобий, которые смогут фиксировать азот ex planta, что существенно расширит границы применения данных бактерий в качестве биоудобрений.

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018-а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290, соглашениями №№ 8115 и 8046 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.»

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 2 и 3-й школе-конференции молодых ученых Волго-Уральского региона «Биомика -наука XXI века» (Уфа, 2011 - 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Экология: традиции и инновации» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой (Саратов, 2012), Второй всероссийской молодёжной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 2 таблицами. Список литературы включает 198 источников, из них 161 работы зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы исследования. Объектами исследования служили штаммы из коллекции бактерий ИБГ УНЦ РАН, выделенные из клубеньков дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к трибам Galegeae, Hedysareae, Genisteae, Trifolieae и Loteae: караганы древовидной (Caragana arborescens Lam.), К. кустарниковой (C.frutex (L.) C.Koch), астрагала датского (Astragalus danicus

Retz.), A. рогоплодного (A. cornuîus Pall.), A. волжского (A. wolgensis Bunge), A. нутового (A. cicer L.), A. солодколистного (A. glycyphyllos L.), A. бороздчатого (A. sulcatus L.), остролодочника Ипполита (Oxytropis hippolyti Boriss.), О. волосистого (O. pilosa L.) DC.), О. яркоцветного {О. floribunda (Pall.) DC), О. казацкого (О. kasakorum Knjaz.), копеечника крупноцветкового (Hedysarum grandiflorum Pall.), К. Разумовского (Я. razoumowianum Fisch. & Helm ex DC.), эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria (Kit. ex Willd.) DC.), Э. виколистного (О. viciifolia Scop.), ракитника русского {Chamaecytisus ruthenicus (Fisch, ex Vorosch.) Klask.), дрока красильного (Genista tinctoria L.), люцерны желтой (Medicago falcata L.), клевера белого (Trifolium repens L.), лядвенца жигулевского (Lotus zhegulensis Klokov).

В экспериментах по клонированию генов применяли штаммы R. leguminosarum 1078 из коллекции ВНИИСХМ, Enterobacter sp. Е35, а также плазмиды pJN105, pTurboGFP-B. Для клонирования был использован ген, кодирующий структуру активатора транскрипции nif-тешт (nifA).

Методы исследования. Выделение высокомолекулярной бактериальной ДНК осуществляли с помощью 1% лизирующего раствора (1% Triton XI00, 1% Tween 20, 1% Chelex 100). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК выполняли на автоматическом секвенаторе GenomeLab фирмы Beckman Coulter, используя наборы для секвенирования «GenomeLab». Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы " DNASTAR, Inc." (США). Выделение плазмидной ДНК, анализ рекомбинантных клонов, клонирование амплифицированной ДНК в плазмидных векторах, расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами, подготовку компетентных клеток и их трансформацию плазмидной ДНК, электрофорез фрагментов ДНК и их элюцию из легкоплавкой агарозы выполняли по прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Для экспериментов по оценке экспрессии гена nifA, кДНК, комплементарную мРНК, получали при помощи фермента AMW-ревертазы. Определение нитрогеназной активности бактерий проводили «ацетиленовым» методом (Умаров, 1986; Минеев, 2001).

Работа выполнена частично на оборудовании ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Филогенетический анализ симбиотических генов

Симбиотические гены (¿у/я-гены) являются неотъемлемой составляющей геномов клубеньковых бактерий, характеризующиеся высокой мобильностью и подверженностью к горизонтальному переносу (ГПГ) (Ргоуогоу, УогоЬуоу, 2008). Именно наличие данных генов дает возможность относить те или иные виды бактерий к группе клубеньковых. Широкая экспансия .ууот-генов в ассоциированных с растениями бактериальных сообществах посредством ГПГ, как считается, является наиболее вероятным способом формирования современного разнообразия ризобий и проявляется в различиях филогений *у/л-генов и генов «домашнего хозяйства» (ВаШу е1 а1., 2007).

С целью исследования представленности 5>т/г-генов в геномах различных симбионтов дикорастущих бобовых растений Южного Урала, относящихся к трибам Оа^еае, Неёувагеае, Сег^еае, ТпйПеае и 1,о1еае, а также участия ГПГ в формировании разнообразия клубеньковых бактерий, нами был проведен скрининг более 300 штаммов бактерий, выделенных преимущественно из клубеньков данных растений (эндофитные клубеньковые бактерии, 162 штамма), а также из ткани корней (эндофитные бактерии, 25 штаммов) и с их поверхностей (ассоциативные бактерии, 120 штаммов).

В качестве генов-кандидатов были выбраны <гу/и-гены, кодирующие коровые части молекул, активно участвующие в становлении азотфиксирующего симбиоза: пЩ, тр), т/К, поЛС. Наличие т/Н и т/О у штаммов определяли методом ПЦР. Для амплификации данных генов были использованы универсальные олигонуклеотидные праймеры, ранее подобранные к их консервативным участкам.

Было выявлено, что .уу/я-гены присутствуют только у штаммов, выделенных из клубеньков исследуемых растений. Филогенетический анализ ¡ут+ штаммов на основе последовательностей генов 165 рРНК показал их принадлежность к пяти группам клубеньковых бактерий: МезогМюЫит, Вгас/угЫгоЫит, БтогЫхоЫит, ШгоЫит и РИуПоЬааегшт (рис. 1).

5.8.

A05(2) (Lotus zhegulensis) A10(2) (Lotus zhegulensis) BKBOHil (Oxytropis hippolity) A05(3) (Lotus zhegulensis)

Mesortiizobium tianshanense Mesortiizobium mediterraneum Mesorhizobium huakuii Mesortiizobium plurifarium 2-2 (Astragalus danicus) BKBOPi7 (Oxytropis pilosa) Mesorhizobium loti Mesorhizobium ciceri 2-1 (Astragalus danicus) 12-1 (Hedysarum razoumovianum)

12-2 (Hedysarum razoumovianum)

13-1 (Hedysarum grandiflorum) 13-2 (Hedysarum grandiflorum) Mesorhizobium alhagi

D1 (Oxytropis floribunda) C2A (Chamaecytisus ruthenicus) C2B (Chamaecytisus ruthenicus) Phyllobacterium ifriqiyense Phyllobacterium bourgognense Phyllobacterium brassicacearum Phyllobacterium sp. strain BKBGT13 Phyllobacterium myrsinacearum Phyllobacterium leguminum Sinorhizobium melilotl AO9 (Medicago falcata) Sinorhizobium fredii Sinorhizobium terangae Rhizobium etli Rhizobium leguminosarum A08 (8) (Trifollum repens) Rhizobium gallicum Rhizobium mongolense Agrobacterium rhizogenes Rhizobium tropici Agrobacterium sp. BKBLPu7 Agrobacterium sp. BKBLPu14 Agrobacterium tumefaciens 4-2 (Genista tinctoria) 20-2A (Genista tinctoria) 20-2B (Genista tinctoria) C1 (Chamaecytisus ruthenicus) ' |11B (Hedysarum razoumovianum]] " Bradyrhizobium elkanii Bradyrhizobium japonicum

У A

У }

Б В

УГ

д

4 2 0

Nucleotide Substitutions (хЮО)

Рисунок 1. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа генов 16SpPHK. Штаммы, входящие в группу А филогенетически близки к роду Mesorhizobium, в группу Б — Phyllobacterium, в группу В — Sinorhizobium, Г — Rhizobium и в группу Д — Bradyrhizobium. Жирным шрифтом отмечены последовательности 16SpPHK некоторых исследованных нами штаммов микроорганизмов (в скобках указаны виды растений, из клубеньков которых были получены данные штаммы).

Таким образом, было показано, что наличие луи-генов является характерной чертой микроорганизмов, относящихся только к группе клубеньковых бактерий и, несмотря на показанную возможность их горизонтального переноса (ВагсеИов й а1„ 2007; МагсЬсШ, 2010), а также тесный контакт между ризосферными микроорганизмами, «хаотичного блуждания» ^/и-генов между ризобактериями обнаружено не было.

В дальнейшем у штаммов, в составе генома которых были обнаружены эут-гены, были секвенированы последовательности т]~Н и тр и был проведен их сравнительный анализ с уже известными аналогичными последовательностями, депонированными в Международном банке нуклеотидных последовательностей ОепВапк.

Было установлено, что исследованные лут-гены как по т]Н, так и по п¡Д) генам образуют 4 близкородственные группы: штаммы, входящие в группу А филогенетически близки к'роду МезогЫюЫит, группу В - БтогЫюЫит, группу Г - КЫюЫит и группу Д - ВгадугЫюЫит (рис. 2). В случае с т/Л в один кластер входят как последовательности бактерий рода БтогЫгоЫит, так и ШаоЫит, что, вероятно, говорит о том, что по данному гену дивергенция у этих бактерий еще не произошла (рис. 3).

16.4-

12-2 (Hedysarum razoumovianum) DI (Oxytropis floribunda)

12-1 (Hedysarum razoumovianum) | 13-1 (Hedysarum grandiflorum)

13-2 (Hedysarum grandiflorum) {11В (Hedysarum razoumovianum)!

_Mesorhizobium loti

A10 (2) (Lotus zhegulensis) Mesortiizobium tianhanense

_г Mesorhizobium ciceri

A 05 (2) (Lotus zhegulensis) Mesorhizobium mediterraneum 2-1 (Astragalus danicus) 2-2 (Astragalus danicus) BKBOHH (Oxytropis hippolity) BKBOHi7 (Oxytropis pilosa) Mesorhizobium plurifarium _| Argobaderium sp. 8KBLPu14 Argobacterium sp. BKBLPu7 Rhizobium galiicum Rhizobium ieguminosarum A 03 (8) (Trifolium repens) Rhizobium tropici J~~ Sinorhizobium meliloti A 09 (Medicago falcata) Sinorhizobium fredii Sinorhizobium terangae C1 (Chamaecytisus ruthenicus) Bradyrhizobium elkanii 20-2B (Genista tinctoria) 4-2 (Genista tinctoria) 20-2A (Genista tinctoria) Bradyrhizobium sp. RSA3

16 14 12 10 8 6 4 2 0 Nucleotide Substitutions (x100) Рисунок 2. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа генов nifH. Штаммы, входящие в группу А филогенетически близки к роду Mesorhizobium, в группу В — Sinorhizobium, Г -Rhizobium и в группу Д — Bradyrhizobium. Жирным шрифтом отмечены последовательности генов nifH некоторых исследованных нами штаммов микроорганизмов (в скобках указаны виды растений, из клубеньков которых были получены данные штаммы).

ÎMesorhizobium sp. BKBOPÎ7 (Oxytropis pilosa) D1 (Oxytropïs floribunda) ^ Mesorttizobium amorphae Mesorhizobîum septentrionale Mesortiizobiumtianshanense 2-1 (Astragalus danicus) 2-2 (Astragalus danicus) BKBOHil (Oxytropis hippolity) ...r~ Mesorfiizobium sp.

A10 (2) (Lotus zhegufensis) —13-2 (Hedysarum grandiflorum) 13-1 (Hedysamm grandiflorum) 12-2 (Hedysarum razoumovianum)

........12-1 (Hedysarum razoumovianum)

111B (Hedysarum razoumovianum) | " Rhizobium leguminosarum bv. trifolii A 08 (8) (Trifolium repens)

Sinorhizobîum melüoä ' Rhizobium sp. Rhizobium tropici ' 20-2A (Genista tinctoria) 4-2 (Genista tinctoria) C1 (Chamaecytisus ruthenicus) 20-2B(Genlsta tinctoria) Bradyrtiizobiumsp.

A

В.Г

34.0-

' Bradyrhizobium liaoningense Bradyrhizobîum elkanii j

Д

30

5 0

25 20 15 10 Nucleotide Substitutions (хЮО) Рисунок 3. Филогенетическое древо клубеньковых бактерий, построенное на основе сравнительного анализа генов nifD. Штаммы, входящие в группу А филогенетически близки к роду Mesorhizobium, в группу В - Sinorhizobium, Г -Rhizobium и в группу Д - Bradyrhizobium. Жирным шрифтом отмечены последовательности генов nifD некоторых исследованных нами штаммов микроорганизмов (в скобках указаны виды растений, из клубеньков которых были получены данные штаммы).

Наличие генов пос1С и т/К у зут+ штаммов также определяли методом ПЦР. В связи с относительно высокой вариабельностью пойС и т/К у ризобий, к последовательностям данных генов были подобраны по 4 пары родоспецифичных праймеров, т.е. подобранных к последовательностям пос1С и т/К преимущественно обнаруживаемых у бактерий родов МезогЫгоЫит, ВгсиЛугШгоЫит, Б'тогЫгоЫит и ЯЫгоЫит. Анализ штаммов проводили с использованием всех их вариантов.

В ходе исследования было обнаружено, что ожидаемый продукт амплификации нарабатывается только в том случае, когда происходит совпадение филогенетической принадлежности взятых в анализ бактерий и филогении генов пос1С и т/К, к которым были подобраны праймеры для ПЦР (рис. 4).

А

1000 п.н. 500 п.н. 100 п.н.

Б

1000 п.н. 500 п.н. 100 п.н.

ГЩ:

Рисунок 4. Электрофореграммы ПЦР-анализов ДНК штаммов ризобий на наличие в составе их генома последовательностей генов А - пос!С ВгсчЗугЫгоЫит, Б - т/К МевогЫюЫит. 1,2- ЯЫгоЫит эр.; 3, 5, 13, 14 -Вгаф/гЫгоЫит зр.; 6, 7, 9, 10 - ЗтогЫгоЫит эр., 4, 8, 11, 12 - МеяогЫюЫит эр. М - 100 п.н. маркер.

Учитывая полученные ранее в нашей лаборатории данные по симбионтам бобовых растений трибы Угаеае, где также была показана совместная эволюция 5>ти-генов и генов 165рРНК у бактерий рода ЯЫюЫит (Баймиев и др., 2011), можно предположить, что для клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых умеренного климата характерна, преимущественно, параллельная эволюция ъут-генов и генов «домашнего хозяйства».

Но были обнаружены и исключения. Так, было выявлено, что у штамма 11В, полученного из клубенька копеечника Разумовского (Недувагит гаюиточьапит), наблюдается несовпадение по филогении вут-генов и генов 168рРНК. Данный штамм по последовательности гена 168рРНК близок к Вгас!угЫгоЫит (рис. 1,

выделен квадратом), но содержит nifHnnifD гены, имеющие большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium (рис. 2, рис. 3, выделены квадратом). Если учесть, что основными симбионтами у копеечника Разумовского являются бактерии рода Mesorhizobium, то можно предположить, что штамм 11В приобрел sym-геиы бактерий Mesorhizobium посредством ГПГ, что придало ему способность вступать в симбиоз с этим растением.

К особому случаю также можно отнести ситуацию со штаммами, относящимися к роду Phyllobacterium, которые нами были идентифицированы только в клубеньках ракитника русского (Chamaecytisus ruthenicus). По последовательностям iyw-генов они оказались близки к Bradyrhizobium (рис. 1). Ранее в нашей лаборатории подобные бактерии также были найдены в клубеньках эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria), караганы древовидной (Caragana arborescens), караганы кустарниковой (Caragana frutex), чины Гмелина (Lathyrus gmelinii), причем iy/я-гены были обнаружены только у микроорганизмов, полученных из клубеньков караганы древовидной (Mesorhizobium) и чины Гмелина (Rhizobium). Подобные результаты были показаны и в работах других авторов (Lei et al„ 2008; Bromfield et al„ 2010). Таким образом, для бактерий рода Phyllobacterium характерно наличие .уда-генов разной филогенетической принадлежности, что не свойственно для других родов клубеньковых бактерий, в связи с чем можно предположить, что Phyllobacterium активно участвует в процессе ГПГ syrn-ттоъ.

Обобщая все вышеперечисленные данные можно отметить, что для клубеньковых бактерий бобовых растений умеренного климата в основном характерна параллельная эволюция sym-тенов и генов «домашнего хозяйства», в ходе, которой условно образовались 4 эффективные комбинации .yw-генов и бактерий. Представителей данных групп можно назвать основными клубеньковыми бактериями, к которым, по нашим данным, относятся Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium. Также в популяции клубеньковых бактерий встречаются случаи ГПГ sym-генов, которые иногда приводят к формированию нетипичных для определенных видов бобовых растений штаммов ризобий.

Маркеры для поиска клубеньковых бактерий на основе симбиотических генов

Первым этапом исследования клубеньковых бактерий является получение чистой культуры данных микроорганизмов. Поскольку полной стерилизации поверхности клубенька бывает трудно достичь, то на питательной среде также могут вырастать бактерии, не являющиеся клубеньковыми, и отличить их по фенотипическим признакам от искомых ризобий бывает практически невозможно. Учитывая те факты, что ¿ути-гены представлены в геномах только клубеньковых бактерий и их наличие является обязательным условием, а также то, что их можно условно объединить, по нашим данным, в 4 близкородственные группы, которые параллельно эволюционировали с бактериями родов МезогЫгоЫит, Вгас1угЫ2оЫит, БтогМгоЫит и ЯЫгоЫит, нами было проведено исследование по возможности использования общих уу/я-генов в качестве маркеров для обнаружения и первичной родовой идентификации ризобий.

Для первичного скрининга микроорганизмов на принадлежность их к группе клубеньковых бактерий предложено использовать в качестве маркеров гены т/Н и т/О, для амплификации которых подобраны универсальные олигонуклеотидные праймеры к их консервативным участкам. Далее с целью определения вероятной родовой принадлежности ризобий предлагается применять более вариабельные гены пос1С и т/К, с использованием праймеров, специфичных для каждого отдельного рода клубеньковых бактерий (рис. 5).

Рисунок 5. Электрофореграмма ПЦР-анализа ДНК штаммов клубеньковых бактерий с использованием праймеров, подобранных к гену nodC\ А - Rhizobium sp., Б - Sinorhizobium sp., В - Mesorhizobium sp., Г - Bradyrhizobium sp. 1 -Rhizobium sp. из клубеньков Vicia crâcca, 2 - Sinorhizobium sp. из клубеньков Melilôtus âlbus, 3 - Mesorhizobium sp. из клубеньков Hedysarum grandiflorum, 4 -Bradyrhizobium sp. из клубеньков Genista tinctôria, 5 - отрицательный контроль без генетического материала.

Данная тест-система была опробована на микроорганизмах, полученных из клубеньков эспарцета песчаного (Onobrychis arenaria) (35 штаммов) и астрагала нугового (Astragalus cicer) (30 штаммов). Было установлено, что 63 штамма из 65 в своем составе содержат гены niftf и niJD и, следовательно, с высокой вероятностью относятся к группе клубеньковых бактерий. Кроме того, nodC и nifK гены имеют филогенетическое родство с аналогичными генами бактерий рода Mesorhizobium. В дальнейшем с целью выявления филогенетической принадлежности исследуемых микроорганизмов, были амплифицированы и секвенированы гены их 16SpPHK. Было обнаружено, что в основном, как и следовало ожидать, sym+ бактерии филогенетически принадлежат к роду Mesorhizobium, за исключением 2 штаммов, выделенных из клубеньков эспарцета песчаного, которые по последовательностям гена 16SpPHK филогенетически являются родственными с бактериями рода Ralstonia, относящимися к р. протеобактериям. Ранее данный род микроорганизмов уже был описан как представитель группы клубеньковых бактерий, но только как симбионт тропических растений (Chen et. al., 2001). В нашем случае наличие у выявленных нами штаммов Ralstonia iy/и-генов, родственных таковым у Mesorhizobium, позволяет предположить, что данные бактерии приобрели способность образовывать клубеньки на корнях эспарцета песчаного за счет ГПГ.

Кроме того, 2 штамма, в составе геномов которых не было обнаружено sym-генов, по последовательностям гена 16SpPHK оказались филогенетически близки к родам Pseudomonas и Enterobacter, которые не относятся к группе клубеньковых бактерий.

Исходя из полученных результатов, можно отметить, что тест-система, основанная на использовании ^от-гснов ризобий в качестве маркеров для поиска штаммов, способных вступать в азотфиксирующий симбиоз с бобовыми растениями, является весьма удобным инструментом поиска и предварительной идентификации клубеньковых бактерий. Это особенно важно в случае, когда необходимо проверять большое количество образцов, поскольку данный подход не требует больших затрат, связанных с секвенированием, и дает возможность первично оценить полученные образцы.

Получение штамма ризобии с конститутивной экспрессией генов нитрогеназного комплекса

С точки зрения практического использования ризобий в качестве ростостимулирующих бактерий в сельском хозяйстве, большой интерес вызывает возможность искусственной индукции генов нитрогеназного комплекса у штаммов Rhizobium ex planta. За активацию всей системы азотфиксации у клубеньковых бактерий отвечает продукт всего лишь одного гена nifA, изменение регуляции которого может привести к изменению транскрипционного статуса генов самой нитрогеназы.

С этой целью нами была получена плазмидная конструкция, несущая ген nifA ризобии под регуляцией конститутивного промотора.

В качестве основы для конструкции был использован вектор pTurboGFP-B (Evrogen). С помощью подобранных нами олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции ВатШ., был амплифицирован из тотальной ДНК R. leguminosarum 1078 ген nifA. В дальнейшем ампликон nifA R. leguminosarum, а также плазмида pTurboGFP-B были обработаны эндонуклеазой рестрикции ВатШ, что привело к образованию липких концов амплификата и линеризации плазмиды, что облегчило дальнейшее клонирование ПЦР-продукта в вектор под управление сильного конститутивного промотора фага Т5. Попадание клонируемого фрагмента в рамку считывания данного промотора было осуществлено за счет дизайна праймера.

Так как плазмида pTurboGFP-B содержит ColEl регион, позволяющий ей реплицироваться преимущественно в К coli, в созданную нами плазмидную конструкцию был добавлен репликон плазмиды широкого круга хозяев, а именно плазмиды pBBRl, выделенной из Bordetella bronchiseptica штамма S87 (Antoine, Locht, 1992; Elzer et al., 1995). Фрагмент ДНК, соответствующий pBBRori, был встроен в исследуемую конструкцию по сайту рестрикции Mscl

Таким образом, был получен плазмидный вектор pTurboGFP-BnifApBBRIori, содержащий в своем составе ген nifA под управлением сильного конститутивного промотора фага Т5 (рис. 6). В дальнейшем данный вектор с помощью метода электропорации был трансформирован в штамм R. leguminosarum 1078.

pTurboGFP-B \ BamHI 4,1 kb

Amp % у Amp

Turbo GFP

Пигировамив

Gm pJNIOS

6kb

Амплификация

1 pTurboGFP-B I

V___

J

Рисунок 6. Стратегия клонирования гена nifA в плазмиде pTurboGFP

Для того, чтобы предварительно удостовериться в экспрессионной активности гена т/А в полученной конструкции, рекомбинантный штамм Л. ^иттозагит 1078 был подвергнут ОТ-ПЦР анализу (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). В ходе данного эксперимента была показана наработка мРНК гена т/А, что говорит о наличии транскрипционной активности этого гена в рекомбинантном штамме (рис. 7).

Рисунок 7. ОТ-ПЦР анализ транскрипционной активности гена т/А в клетках рекомбинантных бактерий. М - 100 п.н. маркер; 1 -ПЦР-продукт гена т/А тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий; 2 - ОТ-ПЦР-продукт гена т/А рекомбинантных бактерий; 3 - ПЦР тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий после обработки ДНКазой.

С целью выявления индукции нитрогеназного комплекса у рекомбинантного штамма Я. к^ттозагит 1078 «ацетиленовым» методом была определена его нитрогеназная активность. Было обнаружено, что благодаря конститутивной экспрессии гена т/А у данного штамма появилась способность фиксировать атмосферный азот в свободноживущем состоянии.

Хотя нитрогеназная активность у полученного рекомбинантного штамма (3,1 мкг Ы2/мл/ч) оказалась близка к таковой у свободноживущего диазотрофа (.РаетЬасШиз сЫтет15) (по нашим измерениям 3,5 мкг Ы2/мл/ч) (рис. 8), главным результатом в данном опыте является подтверждение возможности искусственной регуляции нитрогеназного комплекса клубеньковых бактерий, что открывает большие перспективы для создания различных ростостимулирующих микробиологических препаратов на основе ризобий.

ннннняв

Л / I

Я4ЯШ

Tj 35 55 ~

Рисунок 8. Хроматограммы анализа нитрогеназной активности бактерий. А. Свободноживущий азотфиксатор Paenibacillus chimensis; Б. Рекомбинантный штамм R. leguminosarum 1078.

Однако необходимо при этом понимать, что процесс фиксации атмосферного азота требует затрат большого количества энергии, и бактерии в естественных условиях с искусственно измененным азотфиксирующим статусом будут, скорее всего, неконкурентоспособны. Данный факт также был отмечен и в работе других исследователей (An et al„ 2007). Поэтому нами был проведен эксперимент по исследованию возможности разделения двух событий (конститутивной экспрессии гена nifA и процесса азотфиксации) на разных штаммах микроорганизмов.

Для конститутивной экспрессии nifA был выбран штамм Enterobacter sp. Е35, который является ассоциативным симбионтом для многих видов растений и не содержит симбиотические гены. В дальнейшем в него была трансформирована созданная нами генно-инженерная конструкция pTurboGFP-BnifApBBRIori. Полученный рекомбинантный штамм культивировали совместно с диким штаммом R. leguminosarum и в последующем для этой смеси также была определена нитрогеназная активность.

Интересным оказался тот факт, что при совместном культивировании рекомбинантного штамма Enterobacter sp. Е35 с R. leguminosarum дикого типа, у последнего также наблюдается нитрогеназная активность, хотя и чуть меньшая (2,6 мкг Ы2/мл/ч), чем у рекомбинантной R. leguminosarum (3,1 мкг Иг/мл/ч) (рис. 9).

Рисунок 9. Хроматограммы анализа нитрогеназной активности бактерий. А. Рекомбинантный штамм R. leguminosarum; Б. Смесь бактерий рекомбинантного штамма Enterobacter sp. и R. leguminosarum дикого типа

В данном случае механизм индукции нитрогеназного комплекса является предметом для дальнейших исследований. Но тот факт, что запуск нитрогеназного комплекса клубеньковых бактерий может осуществляться за счет наработки белка NifA в других бактериях, делает возможным создание бинарных препаратов биоудобрений, где каждый составляющий штамм препарата по отдельности не будет терять своих конкурентоспособных свойств. Также данный механизм индукции дает возможность получать различные комбинации микроорганизмов, а также мобилизировать нитрогеназную активность аборигенных штаммов ризобий.

Таким образом, нами была продемонстрирована принципиальная возможность искусственной активации нитрогеназного комплекса R. leguminosarum ex planta за счет изменения регуляции гена nifA, продукт которого играет ключевую роль в запуске процесса азотфиксации при симбиотическом взаимодействии ризобий с растением-хозяином.

Известно, что клубеньковые бактерии играют огромную роль в биологическом круговороте азота в природе. Они являются самыми эффективными азотфиксаторами и, вступая в симбиоз с бобовыми растениями, способны полноценно обеспечивать своих макросимбионтов минеральным азотом, фиксированным из атмосферы. Однако в свободноживущем состоянии у данных бактерий азотфиксирующей активности не наблюдается. Кроме того, клубеньковые бактерии также способны формировать ассоциативные симбиозы со многими видами экономически значимых небобовых растений. В данном случае они выступают в роли ростостимулирующих бактерий (PGPR - plant growth promoting rhizobacteria), которые оказывают различные благоприятные воздействия на рост растений (Dey et al., 2004; Herman et al., 2008). Поэтому

20

придание ризобиям способности фиксировать азот при их ассоциативном взаимодействии с растениями позволит создавать новые биологические удобрения, что является весьма актуальным в свете мировой тенденции экологизации сельскохозяйственного производства.

выводы

1. Показана параллельная эволюция симбиотических генов и генов «домашнего хозяйства» у клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала.

2. У исследованных клубеньковых бактерий выявлены 4 близкородственные группы iym-генов, филогения которых совпадает с филогенией бактерий родов Rhizobium, Mesorhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium.

3. Обнаруженные единичные штаммы клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала, у которых было показано несовпадение филогении симбиотических генов и генов IÔSpPHK, вероятно возникли вследствие горизонтального переноса ¿jw-генов.

4. Продемонстрирована возможность использования симбиотических генов в качестве маркеров для идентификации клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых растений Южного Урала.

5. Показана принципиальная возможность индукции нитрогеназного комплекса ex planta у штамма Rhizobium leguminosarum 1078 за счет искусственной наработки в клетке регуляторного белка NifA.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. Баймиев Ан. X. Филогенетический анализ симбиотических генов клубеньковых бактерий растений рода Lathyrus (L.) (Fabaceae) / Ан. X. Баймиев, Е. С. Иванова, К. Г. Птицын, О. В. Чубукова, Ал. X. Баймиев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2011. -№ 4. _ с. 14-17.

2. Иванова Е. С. Симбиотические гены клубеньковых бактерий и влияние их горизонтального переноса на видовой состав микросимбионтов бобовых растений / Е. С. Иванова, Ан. X. Баймиев, Р. И. Ибрагимов, Ал. X. Баймиев // Вестник Башкирского университета. -2011,- №4. - С. 1210-1213.

3. Баймиев Ан. X. Генетическая характеристика клубеньковых бактерий дикорастущих бобовых Южного Урала / Ан. X. Баймиев, Е. С. Иванова, К. Г. Птицын, А. А. Белимов, В. И. Сафронова, Ал. X. Баймиев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2012. - № 1. - С. 29-34.

4. Баймиев Ан. X. Анализ влияния ризосферных бактерий Phyllobacterium sp. штамма СА8 на урожайность бобовых культур / Ан. X. Баймиев, Е. С. Иванова, Р. С. Гуменко, О. В. Чубукова, Ал. X. Баймиев // Известия Самарского научного центра РАН. - 2013. - №3(5). - С. 1559-1562.

Материалы конференций

5. Иванова Е. С. Филогения симбиотических генов клубеньковых бактерий бобовых растений умеренной зоны / Е. С. Иванова, Ан. X. Баймиев, Ал. X. Баймиев // II Всероссийская школа-конференция молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика-наука XXI века». - Уфа. - 2011. - С. 48-49.

6. Иванова Е. С. Филогенетический анализ симбиотических генов ризобий бобовых растений Южного Урала / Е. С. Иванова, Ан. X. Баймиев // Всероссийская конференция молодых ученых «Экология: традиции и инновации».

- Екатеринбург. - 2012. - С. 60-62.

7. Иванова Е. С. Филогенетическое исследование клубеньковых бактерий растений рода Astragalus, произрастающих на территории Южного Урала / Е. С. Иванова, Ан. X. Баймиев // Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой».

- Саратов. - 2012. - С. 32.

8. Иванова Е. С. В клубеньках Onobrychis arenaria обнаружены микроорганизмы, относящиеся к |3-протеобактериям / Е. С. Иванова, Р. С. Гуменко, Ан. X. Баймиев // III Всероссийская школа-конференция молодых ученых Волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». Уфа. - 2012. С. 46-47.

Отпечатано с готового оригинал - макета на собственной полиграфической базе ИСЭИ УНЦ РАН 450054, РБ, г. Уфа, пр. Октября, 71 Тел: (8-347) 235-55-33, факс: (8-347) 235-55-44 Заказ № 17. Подписано в печать 30.10.2014 г. Формат 60x84, 1/16. Бумага типа «Снегурочка» Гарнитура «Times». Усл. печ. л. 00,85 Уч.-изд. л. 01,44 Тираж 100 экз.